Serge Gangloff
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B Travaux De

SECOND STAGE POST- Recherche Du

Stage Post-Doctoral

Genetique Analyse

L A De

Stimulee Recombinaison

En L'absence De Top3

Etude

Top3∆ 3 Isolement

D E Suppresseurs

Extrageniques De

L A Mutation

Nulle Top3∆

C Travaux De

Instabilite L'

N E Chromosomique

Peut

Elle Seule

Expliquer Le Defaut De Sporulation

Sont Pas

Responsables De L'absence De Sporulation

Empeche L'absence De Top3

Cellules Les

L A De Franchir

Les Premiere

Mutants

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Responsable Est

Defaut Du

Meiotique

Top3 7 L'absence De Sgs1

N E Supprime

Pas Efficacement L'absence De Top3

D Travaux Recents

Introduction Generale

Helicases Des

Sgs1

Iii Interpretations

Travaux

Cdbs Ne

Des Lesions

Spontanees Frequentes

D Conclusions

D E Ce

Travail E Perspectives

COMMUNICATIONS A DES CONFERENCES I. INVITATIONS II. BILAN DES ACTIVITES

recQ gene. These results imply that Sgs1 creates a deleterious topological substrate that Top3 preferentially resolves. The interaction of the Sgs1 helicase homolog and the Top3 topoisomerase is reminiscent of the recently described structure of reverse gyrase from Sulfolobus acidocaldarius, in which a type I DNA topoisomerase and a helicase-like domain are fused in a single polypeptide.

Rothstein, R., and Gangloff, S. (1995). Hyper-recombination and Bloom's syndrome: microbes again provide clues about cancer. Genome Research 5, 421-426. Gangloff, S., Zou, H., and Rothstein, R. (1996). Gene conversion plays the major role in controlling the stability of large tandem repeats in yeast. EMBO Journal 15, 1715-1725. The genomic stability of the rDNA tandem array in yeast is tightly controlled to allow sequence homogenization and at the same time prevent deleterious rearrangements. In our study, we show that gene conversion, and not unequal sister chromatid exchange, is the predominant recombination mechanism regulating the expansion and contraction of the rDNA array. Furthermore, we found that RAD52, which is essential for gene conversion, is required for marker duplication stimulated in the absence of the two yeast type I topoisomerases. Our results have implications for the mechanisms regulating genomic stability of repetitive sequence families found in all eukaryotes.

Gangloff, S., de Massy, B., Arthur, L., Rothstein, R., and Fabre, F. (1999). The essential role of yeast topoisomerase III in meiosis depends on recombination. EMBO Journal 18, 1701-1711. Yeast cells mutant for TOP3, the gene encoding the evolutionary conserved type I-5' topoisomerase, display a wide range of phenotypes including altered cell cycle, hyper-recombination, abnormal gene expression, poor mating, chromosome instability and absence of sporulation. In this report, an analysis of the role of TOP3 in the meiotic process indicates that top3Delta mutants enter meiosis and complete the initial steps of recombination. However, reductional division does not occur. Deletion of the SPO11 gene, which prevents recombination between homologous chromosomes in meiosis I division, allows top3Delta mutants to form viable spores, indicating that Top3 is required to complete recombination successfully. A topoisomerase activity is involved in this process, since expression of bacterial TopA in yeast top3Delta mutants permits sporulation. The meiotic block is also partially suppressed by a deletion of SGS1, a gene encoding a helicase that interacts with Top3. We propose an essential role for Top3 in the processing of molecules generated during meiotic recombination. DNA helicases are involved in many aspects of DNA metabolism, including transcription, replication, recombination and repair. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, the absence of the Sgs1 helicase results in genomic instability and accelerated ageing (1)(2)(3)(4). In human cells, mutations in orthologues of SGS1 lead to Bloom (BS). Werner (WS) or Rothmund-Thomson (RTS) syndromes, which are rare, autosomal recessive diseases characterized by genetic instability associated with cancer predisposition (5)(6)(7).

Although data concerning these human diseases are accumulating, there is still no clear idea of the function of the proteins involved. Here we show that sgs1 Delta mutants are deficient in DNA repair and are defective for induced recombination events that involve homologous chromosomes. The role of homologous recombination is further evidenced in haploid cells in which both Sgs1p and Srs2p are absent. Yeast SRS2 encodes another DNA helicase involved in the maintenance of genome integrity (8)(9)(10). Our data suggest that some defects observed in BS. WS or RTS are the consequence of unrestrained recombination. In budding yeast, loss of topoisomerase III, encoded by the TOP3 gene, leads to a genomic instability phenotype that includes slow growth, hyper-sensitivity to genotoxic agents, mitotic hyper-recombination, increased chromosome missegregation, and meiotic failure. Slow growth and other defects of top3 mutants are suppressed by mutation of SGS1, which encodes the only RecQ helicase in S. cerevisiae. SGS1 is epistatic to TOP3, suggesting that the two proteins act in the same pathway. To identify other factors that function in the Sgs1-Top3 pathway, we undertook a genetic screen for non-sgs1 suppressors of top3 defects. We find that slow growth and DNA damage sensitivity of top3 mutants are suppressed by mutations in RAD51, RAD54, RAD55, and RAD57. In contrast, top3 mutants show extreme synergistic growth defects with mutations in RAD50, MRE11, XRS2, RDH54, and RAD1. We also analyzed recombination at the SUP4-o region, showing that in a rad51, rad54, rad55 or rad57 background, top3 £G does not increase recombination to the same degree as in a wild type strain. These results suggest that the presence of the Rad51 homologous recombination complex in a top3 background facilitate creation of detrimental intermediates by Sgs1. We present a model wherein Rad51 helps recruit Sgs1-Top3 to sites of replicative damage.

Fabre, F., Chen, A., Heyer, W-D. and Gangloff, S. ( 2002) Alternate pathways involving Sgs1/Top3, Mus81/Mms4 and Srs2 prevent formation of toxic recombination intermediates from single-strand gaps created by DNA replication (submitted) Toxic recombination events can be detected in vegetative Saccharomyces cerevisiae cells through negative growth interactions between certain combinations of mutations. For example, mutations affecting both the Srs2 and Sgs1 helicases result in poor growth, a phenotype suppressed by mutations in genes that govern early stages of recombination. Here we identify a new such interaction involving double mutations affecting Sgs1 or Top3 and Mus81 or Mms4. We also find that the primary DNA structures that initiate these toxic recombination events cannot be double-strand breaks (DSBs) and thus are likely to be single-strand DNA (ssDNA). We postulate that replication stalling causes ssDNA, which can be processed by two competing mechanisms: recombination and non-recombination gap-filling. Binding of the recombination proteins to ssDNA would initiate recombination with the sister chromatid. Functions involved in preventing toxic recombination would then act to either process the intermediate structure or to channel it back into the gap-filling route. We propose a model in which Sgs1/Top3 and Mus81/Mms4 perform alternative functions to process recombination intermediates, while Srs2 acts to reverse recombination structures.

Mémoires

D.E.A.: "Clonage moléculaire du gène codant pour l'aconitase mitochondriale de Saccharomyces cerevisiae" Juillet 1985, Université Aix-Marseille II Doctorat: "Isolement et caractérisation du gène nucléaire codant pour l'aconitase mitochondriale de Saccharomyces cerevisiae: Etudes préliminaires sur la régulation de son expression" Janvier 1990, Université Aix-Marseille II. La recombinaison génétique entre séquences répétées est l'un des mécanismes principaux gouvernant l'évolution des familles multigéniques [START_REF] Edelman | Arrangement and evolution of eukaryotic genes[END_REF], et de nombreux remaniements chromosomiques résultent d'une altération dans ce système. Un nombre croissant de maladies humaines causées par des réarrangements délétères entre séquences répétées a été mis en évidence ces dernières années. Parmi les maladies les plus courantes se trouvent l'hémophilie sévère de type A [START_REF] Lakich | Inversions disrupting the factor VIII gene are a common cause of severe haemophilia A[END_REF], l'hypercholestérolémie [START_REF] Lehrman | Duplication of seven exons in LDL receptor gene caused by Alu-Alu recombination in a subject with familial hypercholesterolemia[END_REF] ainsi qu'un nombre grandissant de désordres neurologiques caractérisés par une amplification de régions contenant des triplets répétés. C'est le cas pour le syndrome du chromosome X fragile [START_REF] Fu | Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox[END_REF], la dystrophie musculaire myotonique [START_REF] Fu | An unstable triplet repeat in a gene related to myotonic muscular dystrophy[END_REF][START_REF] Harley | Expansion of an unstable DNA region and phenotypic variation in myotonic dystrophy[END_REF], l'atrophie musculaire spinale et bulbaire [START_REF] Caskey | Triplet repeat mutations in human disease[END_REF][START_REF] Spada | Androgen receptor gene mutations in X-linked spinal and bulbar muscular atrophy[END_REF] ou la maladie de Huntington [START_REF] Group | A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. The Huntington's Disease Collaborative Research Group[END_REF].

H. Communications à des conférences

A mon arrivée dans le laboratoire du Dr. Rothstein, un crible visant à isoler des gènes impliqués dans la suppression de la recombinaison mitotique entre séquences répétées venait de conduire à l'isolement chez la levure Saccharomyces cerevisiae du gène TOP3. Le produit de traduction du gène TOP3 présente 40% de similarité avec les topoisomérases bactériennes de type I (TopA et TopB). En revanche, Top3 ne partage aucune homologie avec les topoisomérases de type I ou II mises en évidence jusque-là chez la levure ou chez un autre eucaryote [START_REF] Wallis | A hyperrecombination mutation in S. cerevisiae identifies a novel eukaryotic topoisomerase[END_REF]. Top3 relaxe uniquement l'ADN surenroulé négativement, par opposition aux topoisomérases de type I eucaryotes qui relaxent aussi l'ADN positivement surenroulé [START_REF] Kim | Identification of the yeast TOP3 gene product as a single strand-specific DNA topoisomerase[END_REF]. J'ai décidé d'étudier le rôle de TOP3 dans le maintien de la stabilité des séquences réitérées dans le génome. Pour mener à bien ce projet, j'ai développé de multiples approches:

Une étude du rôle des gènes impliqués dans la réparation de l'ADN sur la stimulation de la recombinaison en l'absence de Top3 Une étude des mécanismes moléculaires altérés en l'absence de Top3 Une analyse génétique classique avec isolement de suppresseurs Une recherche de protéines qui interagissent avec Top3 1. Analyse génétique de la recombinaison stimulée en l'absence de TOP3 a) Dans l'ADN ribosomique Chez S. cerevisiae, l'ADN ribosomique (ADNr) constitue un système modèle pour étudier le contrôle génétique de la stabilité des séquences répétées. Il est composé d'une succession de 100 à 200 répétitions en tandem d'une unité de base de 9,2 kb (Cf. Figure 1) exclusivement localisée sur le chromosome XII [START_REF] Petes | Yeast ribosomal DNA genes are located on chromosome XII[END_REF]. Il est ainsi facile d'y insérer un marqueur d'auxotrophie et de mesurer la fréquence à laquelle ce dernier est perdu au cour des divisions mitotiques (Gangloff et al., 1994a;[START_REF] Szostak | Unequal crossing over in the ribosomal DNA of Saccharomyces cerevisiae[END_REF]. cerevisiae [START_REF] Christman | Mitotic recombination in the rDNA of S. cerevisiae is suppressed by the combined action of DNA topoisomerases I and II[END_REF]. La fréquence de perte de marqueur d'auxotrophie dans l'ADNr chez les mutants top3 est cependant beaucoup plus élevée que pour les mutants top1 ou top2. En outre, l'absence simultanée de TOP1 et de TOP3 résulte en une élévation synergique de la fréquence de perte de marqueur, ce qui indique que ces deux enzymes sont capables d'exercer des fonctions communes. J'ai ensuite testé les effets des gènes impliqués dans la réparation de l'ADN sur la fréquence de recombinaison stimulée en l'absence de TOP3. L'absence de RAD1, impliqué dans la phase d'incision du mécanisme de réparation par excisionresynthèse [START_REF] Yang | Molecular cloning and nucleotide sequence analysis of the Saccharomyces cerevisiae RAD1 gene[END_REF] n'affecte que modérément la fréquence de recombinaison des mutants top3 dans l'ADNr. En revanche, la présence de RAD52 [START_REF] Petes | The Molecular & Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces: Genome Dynamics, Protein Synthesis and Energetics[END_REF], le gène central de la recombinaison chez la levure, est indispensable pour observer l'hyper-recombinogénicité des mutants top3.

b) Entre ARNt dupliqués présents au locus SUP4

J'ai également analysé les effets de top3 dans un système où les séquences dupliquées sont les longues répétitions terminales des éléments transposables Ty (appelées séquences delta) dispersées et non pas répétées en tandem autour d'un ARN de transfert capable de supprimer des mutations "ocre" [START_REF] Rothstein | Concerted deletions and inversions are caused by mitotic recombination between delta sequences in Saccharomyces cerevisiae[END_REF].

Dans ce système (Cf.

Etude des mécanismes moléculaires conduisant à une augmentation de la recombinaison dans les mutants top3∆ a) Au niveau de l'ADNr

La perte du marqueur d'auxotrophie inséré dans l'ADNr peut s'expliquer de plusieurs façons: par recombinaison inégale entre chromatides soeurs, par recombinaison intra-chromatidienne, par conversion génique, par glissement lors de la réplication [START_REF] Fletcher | Possible loss of length conservation and reciprocity during recombination or conversion in tandem arrays[END_REF] ou par un mécanisme de "Single Strand Annealing" (SSA) au cours duquel une dégradation exonucléolytique (5'->3') dégrade les simple brins de chaque côté de la cassure double brin, découvrant ainsi des régions complémentaires qui peuvent s'apparier et être ligaturées après élimination par Rad1/Rad10 [START_REF] Bardwell | Yeast DNA recombination and repair proteins Rad1 and Rad10 constitute a complex in vivo mediated by localized hydrophobic domains[END_REF][START_REF] Tomkinson | Yeast DNA repair and recombination proteins Rad1 and Rad10 constitute a single-stranded-DNA endonuclease[END_REF] des simple brins non appariés (Figure 3). Ces résultats ont donné lieu à un article: Gangloff, S., Zou, H., and Rothstein, R. (1996). Gene conversion plays the major role in controlling the stability of large tandem repeats in yeast.

EMBO Journal 15, 1715-1725.

b) Au niveau du locus SUP4-o

Des travaux effectués antérieurement au laboratoire ont montré l'existence de sept classes de recombinants associées avec une délétion de SUP4-o [START_REF] Rothstein | Concerted deletions and inversions are caused by mitotic recombination between delta sequences in Saccharomyces cerevisiae[END_REF]. Les différentes classes de délétion peuvent être produites par conversion génique ou par un mécanisme de SSA. En l'absence du gène RAD1, une classe majoritaire de recombinants est obtenue. Cette classe est générée par un événement de conversion génique entre les séquences dupliquées les moins divergentes, et ne nécessite pas l'activité endonucléase du complexe formé par Rad1 et Rad10 [START_REF] Bardwell | Yeast DNA recombination and repair proteins Rad1 and Rad10 constitute a complex in vivo mediated by localized hydrophobic domains[END_REF][START_REF] Tomkinson | Yeast DNA repair and recombination proteins Rad1 and Rad10 constitute a single-stranded-DNA endonuclease[END_REF]. En l'absence des gènes du groupe Une analyse de suppresseurs spontanés du phénotype de croissance ralentie a permis d'isoler 25 suppresseurs, qui appartiennent tous au même groupe de complémentation et ont été appelés sgs1 (slow growth suppressor). Ces suppresseurs de la croissance ralentie suppriment également la morphologie altérée des mutants top3 et l'expression inappropriée de BAR1. En revanche, sgs1 élève par lui-même la fréquence de recombinaison entre séquences répétées et est épistatique par rapport à top3. Enfin, une délétion de sgs1 est capable de supprimer l'incapacité de sporuler des mutants top3, un désordre que seule la surproduction chez la levure de la topoisomérase bactérienne TopA était capable de compenser.

Isolement de peptides interagissant avec Top3

Pour isoler des peptides qui interagissent avec Top3, j'ai mis au point une méthode de "double-hybride" dans laquelle l'étape de co-transformation a été remplacée par une simple réaction de copulation qui permet de cribler la banque pour de multiples interactions simultanément. Grâce à ce système, j'ai isolé un peptide qui active spécifiquement la transcription de deux gènes rapporteurs en présence d'un produit de fusion entre Top3 et le domaine de Gal4 qui se lie à l'ADN [START_REF] Bendixen | A yeast mating-selection scheme for detection of protein-protein interactions[END_REF].

L'analyse génétique d'une souche portant une partie de la séquence ainsi isolée intégrée au locus chromosomique par recombinaison homologue a révélé que le gène ainsi identifié est fortement lié à la mutation sgs1, le suppresseur extragénique de la croissance ralentie des mutants top3. Ce gène a été cloné et identifié à SGS1 par un test de complémentation de fonction (Gangloff et al., 1994a).

L'analyse de la séquence de Sgs1 indique que cette protéine de 164 KDa est constituée de deux domaines. L'un interagit avec Top3 et possède deux régions riches en acides aminés acides capables d'activer la transcription des gènes rapporteurs dans le système du double-hybride. L'autre domaine est très homologue à l'ADN hélicase RecQ d'Escherichia coli, impliquée dans la voie de recombinaison caractérisée par RecF [START_REF] Umezu | Escherichia coli RecQ protein is a DNA helicase[END_REF], et à la protéine RECQL identifiée par génétique reverse chez l'homme [START_REF] Puranam | Cloning and characterization of RECQL, a potential human homologue of the Escherichia coli DNA helicase RecQ[END_REF]. Une séquence nucléique de Caenorhabditis elegans obtenue lors du projet de séquençage de cet organisme peut également être traduite en un produit présomptif homologue à Sgs1.

Récemment, le gène humain défectueux responsable du syndrome de Bloom a été isolé [START_REF] Ellis | The Bloom's syndrome gene product is homologous to RecQ helicases[END_REF], et l'analyse de sa séquence a révélé qu'il correspond vraisemblablement à Sgs1.

Ces résultats ont donné lieu à trois publications:

C. Travaux de recherche du second stage post-doctoral

En Septembre 1996, j'ai rejoint le laboratoire du Dr. Francis Fabre à l'Institut Curie où j'ai poursuivi les travaux que j'ai démarré aux Etats Unis. L'étude que j'ai prolongée concerne l'incapacité de sporulation et l'instabilité chromosomique liée à l'absence de Top3 dans les cellules diploïdes. Mes travaux antérieurs ont montré que l'absence du gène TOP3 conduit à une expression altérée de certains gènes, à une très forte instabilité du génome et à un cycle cellulaire fortement perturbé. Dans cette étude, les causes du seul phénotype "terminal" des mutants dépourvus de Top3 sont analysées en s'appuyant sur les résultats obtenus sur les cellules en croissance végétative.

L'instabilité chromosomique ne peut à elle seule expliquer le défaut de sporulation

Des observations antérieures ont montré que les cellules diploïdes homozygotes pour la délétion du gène TOP3 se comportent comme si elles étaient le siège de pertes fréquentes d'un chromosome III. En effet, la perte de l'un de ces chromosomes se traduit à la fois par l'impossibilité de sporuler, et par la capacité de se croiser avec une souche haploïde en raison de la perte de l'information sexuelle MATa ou MATa portée par l'un ou l'autre des chromosomes III. L'utilisation d'une souche portant le gène centromérique LEU2 sauvage sur l'un des chromosomes III m'a permis de mesurer la fréquence à laquelle ce chromosome est perdu dans une population au moment de l'induction de la méiose. Dans de telles conditions, moins d'une cellule diploïde sur mille a perdu le chromosome portant le gène LEU2, ce qui suggère que la majorité des mutants diploïdes contient les loci MATa ou MATa nécessaires à l'entrée en méiose. L'étude de l'instabilité chromosomique par un test génétique basé sur la couleur des colonies [START_REF] Hieter | Mitotic stability of yeast chromosomes: a colony color assay that measures nondisjunction and chromosome loss[END_REF] m'a également permis de préciser que l'absence de la topoisomérase Top3 conduit à une augmentation d'un facteur 20 à la fois de la perte de chromosomes et de la non disjonction liée à une mauvaise ségrégation lors de l'anaphase (Cf. Tableau 1). Quoique très élevée, cette instabilité chromosomique ne peut pas seule expliquer la complète absence de sporulation chez ces mutants en termes de fréquence et de nombre de chromosomes.

Génotype

Fréquence de mauvaise ségrégation Total Non disjonction Perte de chromosome TOP3 / TOP3

1.45 x 10 -4 3.0 x 10 -4 4.45 x 10 -4 top3 / top3 35 x 10 -4 43 x 10 -4 78 x 10 -4

Tableau 1 : Ségrégation des chromosomes chez les mutants top3 2. Un défaut d'activation transcriptionnelle des gènes inducteurs de la méiose ne sont pas responsables de l'absence de sporulation J'ai analysé l'implication de l'expression de certains gènes essentiels à l'entrée en méiose et ai montré que le défaut de sporulation n'est pas lié à un déficit de stimulation transcriptionnelle de ces gènes inducteurs [START_REF] Mitchell | Positive control of sporulationspecific genes by the IME1 and IME2 products in Saccharomyces cerevisiae[END_REF][START_REF] Sia | Stimulation of later functions of the yeast meiotic protein kinase Ime2p by the IDS2 gene product[END_REF][START_REF] Smith | Genetic evidence for transcriptional activation by the yeast IME1 gene product[END_REF][START_REF] Smith | Role of IME1 expression in regulation of meiosis in Saccharomyces cerevisiae[END_REF], puisque la surexpression des gènes IME1 et IME2 sous le contrôle d'un promoteur inductible, qui normalement forcent les cellules à accomplir le programme méiotique, ne confère pas la capacité de sporuler aux cellules mutantes (Cf. Tableau 2).

Génotype

La recombinaison est responsable du défaut méiotique

Etant donné qu'une absence de résolution des structures de recombinaison entre chromosomes homologues lors de la méiose I conduit à un défaut de sporulation [START_REF] Rose | Segregation of recombined chromosomes in meiosis I requires DNA topoisomerase II[END_REF], nous avons également examiné le devenir des cellules top3 dans un contexte où la recombinaison n'est pas initiée. Chez S. cerevisiae, il existe une mutation, spo11, qui abolit l'initiation de la recombinaison, et par conséquent la formation d'intermédiaires topologiques qui doivent être résolus avant d'effectuer la méiose II [START_REF] Bruschi | Enhancement of spontaneous mitotic recombination by the meiotic mutant spo11-1 in Saccharomyces cerevisiae[END_REF][START_REF] Esposito | Molecular mechanisms of recombination in Saccharomyces cerevisiae: testing mitotic and meiotic models by analysis of hypo-rec and hyper-rec mutations[END_REF][START_REF] Klapholz | The role of the SPO11 gene in meiotic recombination in yeast[END_REF][START_REF] Malone | Relationships between a hyper-rec mutation (REM1) and other recombination and repair genes in yeast[END_REF][START_REF] Wagstaff | Meiotic exchange within and between chromosomes requires a common Rec function in Saccharomyces cerevisiae[END_REF]. Ces mutants spo11 sont capables de former des produits de méiose diploïdes viables (dyades) lorsqu'une deuxième mutation qui élimine la ségrégation réductionnelle, spo13, est également présente dans la souche (Klapholz and Esposito, 1980a;[START_REF] Klapholz | Recombination and chromosome segregation during the single division meiosis in SPO12-1 and SPO13-1 diploids[END_REF][START_REF] Wang | Developmental regulation of SPO13, a gene required for separation of homologous chromosomes at meiosis I[END_REF]. L'utilisation de souches isogéniques homozygotes pour des mutations dans TOP3, SPO11 et SPO13 a permis de récupérer des produits méiose viables (Cf. Tableau 2). L'observation que les triple mutants top3 spo11 spo13 produisent des spores viables suggère que la fonction de Top3 est nécessaire après le déclenchement de la recombinaison, à un stade plus avancé du processus méiotique. Ce résultat indique également qu'en l'absence de recombinaison, la fonction de Top3 n'est plus essentielle en méiose (cf. Figure 7). La nécessité de résoudre au moins un de ces intermédiaires par méiose peut rendre compte du rôle essentiel de Top3 uniquement dans ce cycle de développement.

L'absence de Sgs1 ne supprime pas efficacement l'absence de

Top3

Tous les phénotypes mitotiques liés à l'absence de Top3 identifiés jusque là sont supprimés lorsque Sgs1 n'est pas présente. Une hypothèse simple expliquant une totale absence de sporulation en l'absence de Top3 consiste à attribuer à l'hélicase Sgs1 un rôle dans l'établissement d'une structure qui ne peut être résolue que par l'action de Top3. La prédiction de ce modèle implique que lorsque cette structure n'est pas créée, la fonction de Top3 n'est plus essentielle. Au cours de l'étude de l'absence de Sgs1 lors de la méiose, seule une très faible production de spores (correspondant à 1/1000ème du sauvage) a été observée. De plus, nous avons remarqué que les souches diploïdes mutantes pour SGS1 présentent un défaut méiotique qui se traduit par un retard de 48 heures dans l'apparition de tétrades associé à une diminution de la production d'asques d'un facteur 3 à 4 (cf. Figure 8).

Tableau 3 : Phénotype mutant des orthologues eucaryotes de Sgs1

Dans le cadre de l'isolement de suppresseurs extragéniques d'une délétion de la topoisomérase de type I-5' Top3, j'ai isolé et cloné SGS1, un gène codant pour une protéine dont la région consensus correspondant à son domaine hélicase est très similaire à la protéine RecQ d'E. coli [START_REF] Gangloff | The yeast type I topoisomerase Top3 interacts with Sgs1, a DNA helicase homolog: a potential eukaryotic reverse gyrase[END_REF]. La protéine RecQ est une ADN hélicase, elle-même impliquée dans une voie alternative de recombinaison définie par RecF [START_REF] Umezu | Escherichia coli RecQ protein is a DNA helicase[END_REF]. Récemment, des homologues de Sgs1 ont été isolés chez Schizosaccharomyces pombe [START_REF] Murray | Role of Schizosaccharomyces pombe RecQ homolog, recombination, and checkpoint genes in UV damage tolerance[END_REF][START_REF] Stewart | rqh1+, a fission yeast gene related to the Bloom's and Werner's syndrome genes, is required for reversible S phase arrest[END_REF], Caenorhabditis elegans et Homo sapiens. Chez l'homme, cinq homologues ont été identifiés. Le premier, RecQ1, a été isolé par génétique inverse grâce à son activité hélicase [START_REF] Puranam | Cloning and characterization of RECQL, a potential human homologue of the Escherichia coli DNA helicase RecQ[END_REF][START_REF] Seki | Molecular cloning of cDNA encoding human DNA helicase Q1 which has homology to Escherichia coli RecQ helicase and localization of the gene at chromosome 12p12[END_REF].

Jusqu'à présent, aucune pathologie n'a pu être associée à un défaut de cette hélicase. Une déficience dans le deuxième de ces homologues (BLM) est responsable du syndrome de Bloom (BS) [START_REF] Ellis | The Bloom's syndrome gene product is homologous to RecQ helicases[END_REF], une maladie génétique récessive rare caractérisée par une déficience immunitaire, un faible poids à la naissance, une spermatogenèse anormale et une très forte prédisposition au développement précoce de toutes les formes de cancer [START_REF] Bloom | Congenital telangiectatic erythema resembling lupus erythematosus in dwarfs[END_REF]. Au niveau cytologique, les cellules des patients présentent des niveaux élevés de mutations somatiques, de cassures chromosomiques et d'échanges entre chromatides soeurs [START_REF] German | Bloom syndrome: a mendelian prototype of somatic mutational disease[END_REF]. Plus récemment, un troisième homologue humain de l'hélicase Sgs1 a été isolé par clonage positionnel [START_REF] Yu | Positional cloning of the Werner's syndrome gene[END_REF]. L'absence de cet homologue (WRN) entraîne le syndrome de Werner (WS), une maladie génétique récessive rare caractérisée par l'apparition précoce des signes du vieillissement. Les cellules somatiques de ces patients sont le siège d'une fréquence élevée de mutations, et développent des remaniements chromosomiques à des fréquences très élevées. Dernièrement, deux nouveaux membres humains de la famille des hélicases de type RecQ ont été isolés [START_REF] Kitao | Cloning of two new human helicase genes of the RecQ family: Biological significance of multiple species in higher eukaryotes[END_REF]. Certaines mutations dans l'un d'entre eux, RecQ4, conduisent au Syndrome de Rothmund-Thomson (RTS) [START_REF] Kitao | Mutations in RECQL4 cause a subset of cases of Rothmund-Thomson syndrome[END_REF], une maladie rare caractérisée elle aussi par une instabilité génétique élevée et une prédisposition au cancer. Le gène RECQ5 donne naissance par épissage à trois produits alternatifs dont l'un, RecQ5b, interagit avec les orthologues humains de Top3. A ce jour, aucune pathologie n'a été associée à une mutation dans ce gène [START_REF] Shimamoto | Human RecQ5 beta, a large isomer of RecQ5 DNA helicase, localizes in the nucleoplasm and interacts with topoisomerases 3 alpha and 3 beta[END_REF], (cf: Tableaux 3, 4 et 5). [START_REF] Rothstein | Hyper-recombination and Bloom's syndrome: microbes again provide clues about cancer[END_REF].

L'homologie de séquence peptidique entre Blm, Wrn, Rqh1 et Sgs1 s'étend au-delà des motifs hélicase, contrairement à ce qui est observé avec RecQ, RecQ1, RecQ4 ou RecQ5. Ces quatre protéines possèdent également des groupements d'acides aminés acides dans leur région N-terminale (Figure 9) qui, dans le cas de Sgs1 et de BLM, sont capables d'activer l'expression d'un gène rapporteur dans un système de double-hybride. La région carboxy-terminale contient un motif à doigt de zinc dégénéré qui suggère que ces protéines pourraient posséder une activité de fixation à l'ADN ou d'activation de la transcription [START_REF] Foucault | Characterization of a new BLM mutation associated with a topoisomerase II alpha defect in a patient with Bloom's syndrome[END_REF][START_REF] Morozov | A putative nucleic acid-binding domain in Bloom's and Werner's syndrome helicases[END_REF]. De plus, il a été récemment montré que l'extrémité C-terminale de Sgs1 et de Blm interagit avec Rad51 [START_REF] Wu | Potential role for the BLM helicase in recombinational repair via a conserved interaction with RAD51[END_REF]. (Sinclair and Guarente, 1997;Sinclair et al., 1997). A ce jour, peu d'informations précises concernant la fonction de ces gènes sont disponibles, et une première partie de mon travail a consisté à utiliser la levure S. cerevisiae pour effectuer des approches génétiques pour comprendre l'implication de SGS1 dans le métabolisme des acides nucléiques.

Rôle de Sgs1 dans la réparation de l'ADN par recombinaison

Les levures mutées pour le gène SGS1 présentent une instabilité génétique caractérisée notamment par des fréquences élevées d'échanges entre chromatides soeurs (phénotype partagé avec les cellules "Bloom") et par une ségrégation anormale des chromosomes homologues [START_REF] Gangloff | The yeast type I topoisomerase Top3 interacts with Sgs1, a DNA helicase homolog: a potential eukaryotic reverse gyrase[END_REF][START_REF] Watt | Sgs1: a eukaryotic homolog of E. coli RecQ that interacts with topoisomerase II in vivo and is required for faithful chromosome segregation[END_REF].

Par ailleurs, les données montrant que l'expression de SGS1 est maximale en phase S [START_REF] Spellman | Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization[END_REF]

Etude de l'interaction des hélicases Sgs1 et Srs2

Une autre hélicase de levure, Srs2, qui ne possède pas d'orthologue connu dans les cellules de mammifères, est également impliquée dans le maintien de la stabilité du génome. Plusieurs observations suggèrent que le gène SRS2 pourrait également être impliqué pendant la phase de réplication de l'ADN : les mutants srs2 présentent des taux élevés de recombinaison spontanée [START_REF] Rong | The hyper-gene conversion hpr5-1 mutation of Saccharomyces cerevisiae is an allele of the SRS2/RADH gene[END_REF]; tout comme SGS1, SRS2 est fortement exprimé en phase S [START_REF] Heude | Regulation of the Saccharomyces cerevisiae Srs2 helicase during the mitotic cell cycle, meiosis and after irradiation[END_REF], et la protéine possède de fortes homologies de séquence avec les protéines Rep, UvrD et PcrA [START_REF] Aboussekhra | RADH, a gene of Saccharomyces cerevisiae encoding a putative DNA helicase involved in DNA repair. Characteristics of radH mutants and sequence of the gene[END_REF], des hélicases bactériennes elles-mêmes impliquées dans la réplication et la réparation. In vitro, il a été montré que les hélicases Sgs1 et Srs2 possèdent la même polarité 3' ® 5' [START_REF] Lu | Human homologues of yeast helicase[END_REF][START_REF] Rong | Purification and characterization of the SRS2 DNA helicase of the yeast Saccharomyces cerevisiae[END_REF], il était donc tentant de spéculer que les activités de ces protéines puissent au moins partiellement se substituer l'une à l'autre.

Afin de tester une éventuelle redondance de fonction, des double-mutants sgs1 srs2 ont été construits en croisant des simple-mutants de signe sexuel opposé.

Les cellules diploïdes sont mises à sporuler, et les tétrades sont disséquées (Figure 12a). Parmi les spores haploïdes, certaines portent les délétions de SGS1 et de SRS2. Ces cellules double mutantes présentent une faible vitesse de croissance liée à une mort stochastique des cellules [START_REF] Gangloff | Homologous recombination is responsible for cell death in the absence of the Sgs1 and Srs2 helicases[END_REF], un résultat en accord avec un rôle compensatoire de ces deux hélicases lors de la réplication. Se pose alors la question concernant le rôle exact de ces hélicases. Plusieurs possibilités coexistent. Elles pourraient : (i) ouvrir l'hélice en amont de la fourche de réplication (ii) jouer un rôle dans la terminaison de la réplication en interaction éventuelle avec des topoisomérases (iii) empêcher la formation de structures secondaires de l'ADN qui bloqueraient la réplication (iv) avoir un rôle dans la réinitialisation de la synthèse après un arrêt de la réplication (v) être impliquées dans les événements de recombinaison formés au cours de la réplication.

Nous avons exploré génétiquement les relations pouvant exister entre la recombinaison homologue et les fonctions de Sgs1 et de Srs2. L'hypothèse d'une activité délétère des protéines de recombinaison chez le double mutant sgs1 srs2 était en effet suggérée par certaines propriétés des mutants srs2 indiquant qu'une fonction du gène SRS2 consisterait à empêcher la formation de structures de recombinaison qui, pour des raisons encore inconnues, conduisent à une létalité [START_REF] Chanet | Semidominant mutations in the yeast Rad51 protein and their relationships with the Srs2 helicase[END_REF]. Si le même type de phénomène intervient lors de la réplication chez les double mutants sgs1 srs2, l'élimination de la capacité des cellules à initier la recombinaison homologue devrait permettre aux levures mutées pour SRS2 et SGS1 de se développer normalement. Cette expérience est possible chez la levure étant donné que la recombinaison homologue n'est pas essentielle à la croissance végétative. Nous avons observé que l'abolition du gène RAD51 qui gouverne les étapes précoces de la recombinaison homologue et qui possède plusieurs orthologues humains, permet non seulement la survie de tous les triple-mutants (Figure 12b), mais restaure également des vitesses de croissance identiques à celles des cellules délétées uniquement pour RAD51, (Tableau 6). Xrs2 [START_REF] Ivanov | Mutations in XRS2 and RAD50 delay but do not prevent mating-type switching in Saccharomyces cerevisiae[END_REF][START_REF] Sugawara | Characterization of double-strand breakinduced recombination: homology requirements and single-stranded DNA formation[END_REF][START_REF] Tsubouchi | A novel mre11 mutation impairs processing of double-strand breaks of DNA during both mitosis and meiosis[END_REF]. [START_REF] Mazin | Rad54 protein is targeted to pairing loci by the Rad51 nucleoprotein filament[END_REF][START_REF] Solinger | Rad54 protein stimulates the postsynaptic phase of Rad51 protein-mediated DNA strand exchange[END_REF][START_REF] Sung | Recombination factors of Saccharomyces cerevisiae[END_REF][START_REF] Van Komen | Superhelicity-driven homologous DNA pairing by yeast recombination factors Rad51 and Rad54[END_REF] (Figure 13). [START_REF] Mullen | Requirement for Three Novel Protein Complexes in the Absence of the Sgs1 DNA Helicase in Saccharomyces cerevisiae[END_REF]. La protéine Mms4 est connue pour son implication dans la réparation des dommages de l'ADN liés au MMS [START_REF] Xiao | Mms4, a putative transcriptional (co)activator, protects Saccharomyces cerevisiae cells from endogenous and environmental DNA damage[END_REF]. Les protéines Mus81/Mms4 présentent une homologie avec les protéines de la famille des endonucléases XPF/ERCC1 [START_REF] Mullen | Requirement for Three Novel Protein Complexes in the Absence of the Sgs1 DNA Helicase in Saccharomyces cerevisiae[END_REF].

Génotype

A. Identification de gènes impliqués dans la phase tardive

Mus81 et Mms4 sont homologues respectivement aux protéines Rad1 et Rad10 de S. cerevisiae qui sont impliquées dans le mécanisme de NER [START_REF] Mullen | Requirement for Three Novel Protein Complexes in the Absence of the Sgs1 DNA Helicase in Saccharomyces cerevisiae[END_REF].

Mus81 est une protéine ubiquitaire pour laquelle un orthologue a été isolé récemment chez l'homme [START_REF] Chen | Human Mus81associated endonuclease cleaves Holliday junctions in vitro[END_REF]. En plus du domaine endonucléase, la protéine Mus81 contient deux domaines "hélices -boucle -hélices" couramment retrouvés dans les protéines impliquées dans le métabolisme de l'ADN. Le gène MUS81 a été identifié grâce à un crible double-hybride utilisant la protéine Rad54 comme "appât". Un mutant mus81 se caractérise par les phénotypes suivants : une forte sensibilité aux ultraviolets (UV) et au MMS, ainsi qu'une méiose altérée [START_REF] Interthal | MUS81 encodes a novel helix-hairpin-helix protein involved in the response to UV-and methylation-induced DNA damage in Saccharomyces cerevisiae[END_REF]. L'activité endonucléolytique du complexe Mus81/Mms4 a été mise en évidence in vitro. Les substrats préférentiels de ce complexe sont les fourches de réplication et les duplex d'ADN porteurs d'un simple brin branché se terminant par une extrémité 3'-OH sortante. L'interaction Mus81/Mms4 est indispensable à la fixation à l'ADN et à la fonction endonucléolytique du complexe hétérodimérique Mus81/Mms4 [START_REF] Kaliraman | Functional overlap between Sgs1-Top3 and the Mms4-Mus81 endonuclease[END_REF].

B. Tous les gènes de la recombinaison homologue suppriment les combinaisons létales

Nous avons ensuite voulu savoir si des délétions de RAD52, RAD54, RAD55 et [START_REF] Gangloff | Homologous recombination is responsible for cell death in the absence of the Sgs1 and Srs2 helicases[END_REF][START_REF] Heude | Regulation of the Saccharomyces cerevisiae Srs2 helicase during the mitotic cell cycle, meiosis and after irradiation[END_REF][START_REF] Schild | Suppression of a new allele of the yeast RAD52 gene by overexpression of RAD51, mutations in srs2 and ccr4, or mating-type heterozygosity[END_REF].

C. Les CDBs ne sont pas des lésions spontanées fréquentes

Etant donnée la nature spontanée des événements de recombinaison que nous analysons ainsi que les profils d'expression des gènes SGS1 et SRS2 [START_REF] Spellman | Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization[END_REF] et al., 2001;[START_REF] Sugawara | DNA length dependence of the singlestrand annealing pathway and the role of Saccharomyces cerevisiae RAD59 in double-strand break repair[END_REF]. Nous avons trouvé que l'absence de Rad59 ne modifie la vitesse de croissance ni des simple-mutants rad51∆, ni des triple-mutants rad51∆ sgs1∆ srs2∆ (Tableau 7). Ces résultats suggèrent très fortement que le BIR ou le SSA ne sont pas nécessaires pour métaboliser des intermédiaires de recombinaison en l'absence de Rad51.

Génotype relevant

Nom de la souche Doublement en min. [START_REF] Bartsch | RAD51 is required for the repair of plasmid double-stranded DNA gaps from either plasmid or chromosomal templates[END_REF].

Wild-type

FF18733 rad51 FF181079 sgs1 FF181495 srs2 FF18744 mus81 FF181659 rad59 FF181769 lig4 FF181767 rad52 FF18742 srs2 mus81 FF181661 srs2 sgs1 FF181611 rad51 sgs1 mus81 FF181667 rad51 srs2 sgs1 FF181787 rad51 srs2 sgs1 rad59 FF1806 rad52 lig4 FF181773 rad52 srs2 sgs1 FF181787 rad52 srs2 sgs1 lig4 FF181808 rad52
Ce crible permet de mettre en évidence des événements de recombinaison homologue en testant l'apparition de colonies prototrophe envers l'uracile, mais aussi de détecter les CO associés à ces événements de recombinaison en mesurant la stabilité du cette prototrophie.

Conclusions

Le

  ., Soustelle, C., and Fabre, F. (2000). Homologous recombination is responsible for cell death in the absence of the Sgs1 & Srs2 helicases. Nature Genetics 25, 192-194.

Figure 1 :

 1 Figure 1 : Organisation de l'ADNr de S. cerevisiae

  Figure 2), la fréquence de délétion de SUP4-o par recombinaison entre les différentes séquences delta est 100-fois plus élevée dans les cellules mutées pour TOP3 que dans les contrôles sauvages. Contrairement à ce qui était observé dans l'ADNr, cette stimulation est tributaire de la présence, non seulement de RAD52, mais également de RAD1 devenu nécessaire pour enlever les séquences non identiques entre les différents éléments delta.

Figure 2 :

 2 Figure 2 : Organisation du locus SUP4 de S. cerevisiae

Figure 3 :

 3 Figure 3 : Perte de marqueur inséré dans l'ADNr Les résultats des analyses moléculaires ont indiqué que les mutants top3 élèvent la fréquence de recombinaison dans l'ADNr en produisant un nombre accru de lésions qui sont réparées par conversion génique. Au cours de cette analyse, nous avons également établi que l'événement majeur contrôlant l'homogénéité des séquences en tandem est la conversion génique et non pas l'échange inégal entre chromatides soeurs comme il est encore communément admis.

  d'épistasie de RAD52 (RAD50, RAD51, RAD54, RAD55 et RAD57) une catégorie différente de recombinants peut être obtenue, celle qui utilise un mécanisme de SSA pour réparer la région comprise entre deux ARNt en répétition directe. Ce résultat indique que le groupe d'épistasie de RAD52 est nécessaire pour effectuer de la conversion génique et confirme que RAD1 et RAD52 définissent des voies de recombinaison alternatives. En l'absence de TOP3, la distribution des différentes classes est identique à celle observée chez le sauvage, et seule la fréquence à laquelle ces événements surviennent est augmentée. Dans les double mutants rad1 top3, une seule classe de recombinants est obtenue, celle des mutants rad1. La relation d'épistasie de rad1 et top3 observée génétiquement est ainsi aussi reflétée au niveau moléculaire. Chez les doubles mutants rad52 top3, la fréquence de délétion des mutants rad52 est stimulée 100 fois par l'absence simultanée de TOP3, mais la seule classe de délétion observée reste celle des mutants rad52. Il ressort de cette étude moléculaire que l'absence de TOP3 conduit essentiellement à une accumulation de structures recombinogènes qui sont normalement résolues par conversion génique, un mécanisme nécessitant la présence d'un gène RAD52 fonctionnel. Dans le cas des répétitions au locus SUP4, la présence de RAD1 est également requise pour éliminer les régions simple brin non complémentaires comprises entre les séquences dupliquées. Ces travaux ont fait l'objet d'une publication : Shor, E., Gangloff, S., Wagner, M., Weinstein, J., Price, G., and Rothstein, R. (2002) Mutations in homologous recombination genes rescue top3 slow growth in Saccharomyces cerevisiae. Genetics (in Press) 3. Isolement de suppresseurs extragéniques de la mutation nulle top3∆ Les cellules de levure dépourvues du gène TOP3 présentent un phénotype pléiotrope. Les cellules se développent lentement (40% du temps de doublement d'une souche sauvage) et l'analyse par coloration au DAPI des noyaux de cellules top3 en phase exponentielle de croissance a révélé un défaut de morphologie des cellules et également un changement de distribution de ces cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire (les cellules mutantes sont ralenties lors de leur transition de la phase S vers la phase G2). En outre, les cellules de signe sexuel alpha expriment constitutivement la protéase Bar1, transcrite uniquement dans les cellules de type a et qui dégrade la phéromone alpha, empêchant ainsi la réaction de copulation. Par ailleurs, les souches diploïdes portant la mutation top3 à l'état homozygote sont incapables de sporuler. Finalement, les cellules mutées pour TOP3 sont caractérisées par une fréquence élevée de remaniements chromosomiques entre séquences dupliquées et par une perte de chromosomes dans les cellules diploïdes. Bien qu'une délétion de TOP3 ne soit pas létale, le phénotype pléiotrope du mutant indique que la réplication, la transcription et la recombinaison sont fortement altérées.

  Gangloff, S., Lieber, M. R., andRothstein, R. (1994). Transcription, topoisomerases and recombination. Experientia 50, 261-269 Gangloff, S., McDonald, J. P., Bendixen, C., Arthur, L., and Rothstein, R. (1994). The yeast type I topoisomerase Top3 interacts with Sgs1, a DNA helicase homolog: a potential eukaryotic reverse gyrase. Molecular and Cellular Biology 14, 8391-8398.[START_REF] Rothstein | Hyper-recombination and Bloom's syndrome: microbes again provide clues about cancer[END_REF]. Hyper-recombination and Bloom's syndrome: microbes again provide clues about cancer. Genome Research 5, 421-426.

  Afin de déterminer à quel stade du processus méiotique les mutants top3 sont arrêtés, j'ai examiné par microscopie à fluorescence le devenir des noyaux après marquage au 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Chez une cellule sauvage, les noyaux dédoublés apparaissent après une dizaine d'heures. Les résultats obtenus indiquent que les mutants top3 ne voient jamais leur noyau se dédoubler, contrairement aux cellules témoins qui présentent des doublets après quelques heures dans le milieu d'induction, et des quadruplets après à peine 24 heures. En outre, après 24 heures en milieu de sporulation, les cellules mutantes voient la presque totalité de leur ADN dégradé, comme en témoignent les images de fluorescence de la Figure 4.

Figure 4 :

 4 Figure 4 : Analyse de la progression méiotique par microscopie à fluorescence

Figure 5 :

 5 Figure 5 : Analyse de la présence de cassures double brin Deux approches ont été suivies pour répondre à cette question. D'une part, des expériences de "Return to Growth", et d'autre part des expériences de détection physique de molécules jointes. Ces deux approches sont basées sur l'utilisation de loci hétéroalléliques (portant un polymorphisme de restriction) au niveau desquels la recombinaison est déterminée soit par l'apparition d'une prototrophie lors d'un retour vers un régime de croissance mitotique consécutif à une incubation plus ou moins longue en milieu inducteur de CDBs, soit par la détection de molécules recombinantes caractérisées par l'apparition de nouveaux fragments de restriction.

Figure 6 :

 6 Figure 6 : Analyse de la présence de produits recombinés Alors que chez les cellules sauvages le RTG conduit à une augmentation importante des fréquences de cellules ARG+ après une incubation de quelques heures dans le milieu de sporulation, chez le mutant top3 aucune élévation n'est observée alors que les CDBs initiatrices sont présentes. Ce résultat suggère que lorsque la cassure est effectuée, la cellule ne peux plus revenir en arrière et reprendre une croissance végétative. En revanche, l'étude physique par polymorphisme de restriction du locus ARG4 indique que des molécules recombinantes sont présentes à des fréquences similaires à celles trouvées chez les témoins sauvages (Figure 6). Ces résultats indiquent que les cellules dépourvues de Top3 s'engagent dans le processus méiotique, mais sont arrêtées à un stade qui précède la première anaphase. D'autre part nos résultats montrent également que cette topoisomérase n'est pas essentielle à la formation de molécules recombinantes.

Figure 7 :

 7 Figure 7: Analyse par fluorescence du rôle de l'initiation de la recombinaison sur l'arrêt de progression en méiose

  Comme dans le cas des mutants top3, le retard est aboli en absence d'initiation de la recombinaison, ce qui indique que Sgs1 est impliqué dans le traitement d'intermédiaires de recombinaison. Ces observations permettent pour la première fois de découpler les activités de Sgs1 et de Top3 et d'attribuer à ces protéines, une fonction dans le processus de recombinaison.

Figure 8 :

 8 Figure 8 : Cinétique de formation de tétrades matures Ces résultats ont été publiés dans un article:

Figure 9 :

 9 Figure 9 : Comparaison des hélicases

Figure 10 :

 10 Figure 10 : Arbre phylogénétique

  et que la protéine se complexe avec des topoisomérases impliquées notamment dans la décaténation de molécules d'ADN répliquées, plaident en faveur d'un rôle de la protéine Sgs1 au cours de la réplication de l'ADN. Nous avons étudié le rôle de cette protéine dans la réparation de l'ADN en postulant que son activité n'est pas restreinte aux événements spontanés initiés en phase S. Si cette hypothèse est vraie, les mutants devraient présenter une sensibilité particulière aux radiations ionisantes. Les rayons g induisent dans l'ADN des cassures double-brin qui ne sont efficacement réparées chez la levure que par recombinaison homologue. Cette dernière s'effectue entre chromatides soeurs dans les cellules haploïdes et entre chromatides soeurs et chromosomes homologues dans les cellules diploïdes. En ce qui concerne les cellules haploïdes, l'effet des rayons est létal aussi bien pour les simples mutants sgs1 que pour les sauvages.Seule la sous population de cellules en phase S/G2, qui peuvent réparer les cassures de l'ADN par recombinaison entre chromatides soeurs, est résistante, et la mutation sgs1 n'affecte pas cette réparation. En revanche, les diploïdes mutés sont très sensibles à ces radiations, ce qui pourrait bien refléter une diminution de l'efficacité de recombinaison entre chromosomes homologues (Figure11a). Ce défaut est confirmé par la forte diminution de recombinaison intragénique provoquée par les rayons g (Figure11b). Ainsi, après une irradiation, Sgs1 participe d'une manière directe ou indirecte à la formation de molécules recombinantes, mais seulement lorsque les chromosomes homologues sont impliqués. Ce résultat n'est pas en contradiction avec le fait que sgs1 augmente les taux spontanés de recombinaison probablement initiés au cours de la phase S, alors qu'après irradiation les événements sont initiés dans toutes les phases du cycle cellulaire. Ceci illustre la complexité du rôle de Sgs1 dont l'absence peut, selon les cas, augmenter ou réduire les taux de recombinaison.

Figure 11 :

 11 Figure 11 : Survie et recombinaison après irradiation aux g

  de doublement et efficacité d'étalement Des résultats identiques sont observés avec les gènes RAD55 ou RAD57 homologues à RAD51 (Figure 12b et 12c). Ceci montre que le rôle des hélicases Sgs1 et Srs2 est lié à la recombinaison et non pas directement à un rôle essentiel dans la transcription de l'ARN ribosomique ou dans la réplication de l'ADN, comme il avait été précédemment suggéré[START_REF] Lee | Requirement of yeast SGS1 and SRS2 genes for replication and transcription[END_REF]. En effet, dans cette hypothèse, l'élimination de la recombinaison dans les cellules sgs1 srs2 ne restaurerait pas une croissance normale.

Figure 12 :

 12 Figure 12 : Interactions génétiques entre sgs1∆, srs2∆ et rad51∆

Figure 13 :

 13 Figure 13 : Chronologie de la recombinaison

  de la recombinaisonAfin d'identifier des gènes impliqués dans le processus tardif de maturation d'intermédiaires de recombinaison autres que SRS2, nous avons recherché des mutations en présence desquelles une délétion de SGS1 est létale et avons analysé si cette combinaison est viable en l'absence de recombinaison homologue. La première étape de ce crible nous a été facilitée par les travaux réalisés dans le laboratoire de Steve Brill qui ont débouché sur l'isolement de 6 mutants (slx1, 2, 3, 4, 5 et 8) de délétion qui sont létaux en l'absence de Sgs1 et de Top3[START_REF] Mullen | Requirement for Three Novel Protein Complexes in the Absence of the Sgs1 DNA Helicase in Saccharomyces cerevisiae[END_REF]. Nous avons construit des mutants de délétion pour chacun de ces gènes et avons confirmé leur caractère synthétique létal avec sgs1∆ et top3∆. Nous avons ensuite construit des souches diploïdes hétérozygotes à la fois pour les slx∆, sgs1∆ et rad51∆ et avons analysés les produits méiotiques par dissection de tétrades. Sur les six mutations analysées, seules deux d'entre elles étaient viables en l'absence de RAD51. Il s'agit des mutants slx2∆ et slx3∆ qui sont des allèles des gènes MUS81 et MMS4 (Figure14).

Figure 14 :

 14 Figure 14 : Dissection de souches hétérozygotes MUS81 est un gène non essentiel qui code pour une protéine de 632 acides aminés. Une interaction physique entre les protéines Mus81 et Mms4 via leurs régions C-terminale a été démontrée[START_REF] Mullen | Requirement for Three Novel Protein Complexes in the Absence of the Sgs1 DNA Helicase in Saccharomyces cerevisiae[END_REF]. La protéine Mms4 est

RAD57

  sont également capables de sauver les doubles mutants sgs1∆ ou top3∆ et mus81∆ ou mms4∆ (Figure14et Figure15). Ces résultats sont différents de ceux que nous avons obtenus avec le double-mutant sgs1∆ srs2∆. En effet, toutes les combinaisons sont viables en l'absence de n'importe lequel des gènes qui contrôlent les premières étapes de la recombinaison. De plus, bien que la suppression de la létalité soit totale, celle de la vitesse de croissance ne l'est pas indiquant un rôle pour ces différentes protéine dans un processus indépendant de la recombinaison.

Figure 15 :

 15 Figure 15 : Effet de top3∆ et des autres mutants " rad "

Figure 16 :

 16 Figure 16 : Modèle de travail

  , il est raisonnable de postuler que les lésions qui conduisent à la formation d'intermédiaires qui peuvent être pris en charge par la recombinaison homologue sont générées au cours de la réplication. La recombinaison n'est pas initiée sur de l'ADN intact, mais plutôt sur des molécules endommagées par des cassures simple ou double-chaîne ou sur des régions dont le surenroulement révèle des régions d'ADN simple-chaîne. Chez S. cerevisiae, les CDBs sont essentiellement réparées par recombinaison homologue et dépendent très fortement de la présence de Rad52. Ainsi, si des CDBs sont à l'origine des intermédiaires toxiques observés chez les double-mutants sgs1∆ srs2∆ ou sgs1∆ mus81∆, alors la suppression de la létalité en l'absence de Rad52 devrait strictement dépendre du "nonhomologous end-joining" (NHEJ), le seul autre mécanisme connu capable de sceller des CDBs.

Figure 17 :

 17 Figure 17 : Les CDBs ne sont pas fréquentes au cours du métabolisme

Figure 18 :

 18 Figure 18 : Le ralentissement des mutants rad52∆ n'est pas lié à la recombinaison

  sgs1 mus81 FF181787 Tableau 7 : Temps de génération des différents mutants L'ensemble de nos résultats appuie l'hypothèse que les CDBs n'initient pas fréquemment des événements de recombinaison au cours du métabolisme normal de l'ADN, et ne sont pas à l'origine des lésions qui conduisent à des produits toxiques pour la recombinaison en l'absence des différentes combinaisons de mutants que nous avons étudiées. Il semble donc vraisemblable que les lésions initiatrices sont des ADN simple-chaîne. D. Conclusions de ce travail L'étude décrite ci-dessus nous a conduit à l'identification des premiers gènes dont les produits interviennent tardivement au cours de la recombinaison, c'est à dire après l'étape catalysée par la protéine Rad54. Après l'étape catalysée par Rad54, la synthèse réparatrice démarre. Si cette structure n'est pas stabilisée, le brin néosynthétisé peut alors être déplacé et se rapparier avec la molécule réceptrice (Synthesis Dependent Strand Annealing ou SDSA). Il se forme alors un intermédiaire qui est le substrat préférentiel de l'endonucléase Mus81/Mms4. Au contraire, si cette structure est stabilisée, une double jonction de Holliday va se former. Cette dernière nécessite le produit des gènes Sgs1 et Top3 pour être résolue (Figure19).

Figure 19 :

 19 Figure 19 : Schéma de maturation d'intermédiaires tardifs

Figure 20 :

 20 Figure 20 : Maturation des intermédiaires chez les mutants

Figure 20 )

 20 Figure20). L'analyse de la fréquence des CO chez des mutants oblitérés pour l'une ou l'autre des voies contrôlée par ces gènes devrait nous renseigner sur les rôles des protéines sauvages dans le processus de résolution.

Figure 21 :

 21 Figure 21 : Substrat chromosomique

Figure 22 :

 22 Figure 22 : Substrat plasmidique

Department of Molecular Genetics -Beckman Research Institute of the City of Hope 22

  Saccharomyces cerevisiae is homologous to the two type I topoisomerases from E. coli" Serge Gangloff et Rodney Rothstein Yeast Genetics and Molecular Biology 23 -27 Mai 1991. San Francisco, California Présentation orale "Heterologous and Extragenic Suppressors of mutations in the yeast TOP3 gene affect pleiotropic phenotypes" Serge Gangloff et Rodney Rothstein La topoisomérase III de Saccharomyces cerevisiae est essentielle pour maturer des intermédiaires de recombinaison au cours de la méiose" Serge Gangloff, Bernard de Massy et Francis Fabre. Septembre 1995. City of Hope, California (A. Bailis) "Gene conversion plays the major role in controlling the stability of large tandem repeats in yeast"

	16 -22 Février 1999, Taos NM -USA Ecole Normale Supérieure
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	Présentation d'un poster "The two yeast type I topoisomerases maintain mitotic stability in the rDNA tandem array via different mechanisms" Serge Gangloff, Hui Zou I. Invitations
	et Rodney Rothstein The Molecular Biology Conference
	Yeast Genetics and Molecular Biology 17 -20 Septembre 1995. San Diego, California (R. Dana)
	16 -21 Août 1994. Seattle, Washington "Screening for interacting peptides by mating in yeast"
	Présentation orale "Yeast type I topoisomerase, Top3, interacts with Sgs1, a DNA
	helicase homolog: a potential eukaryotic reverse gyrase? " Serge Gangloff, John P.
	McDonald, Christian Bendixen, Lane Arthur et Rodney Rothstein
		Congrès des 3R
	3 -6 Juin 1997, Villejuif
	Présentation d'un poster "Le défaut de sporulation des cellules dépourvues du gène Department for Radiological Research -Columbia University
	TOP3 résulte d'une synthèse préméiotique anormale et d'un blocage de la division 21 Novembre 1995, New York (G. Freyer & H. Lieberman)
	réductionnelle" Serge Gangloff, Bernard de Massy et Francis Fabre "Genetic and physical interactions between topoisomerases and a helicase in yeast:
	7th International Conference on Environmental mutagens A clue to understanding Bloom's syndrome"
	7 -12 Septembre 1997, Toulouse Département de Biochimie -Commissariat à l'Energie Atomique de
	Présentation d'un poster "Sporulation defect in top3 mutants results from abnormal Saclay
	premeiotic DNA synthesis and absence of reductional segregation" 21 Janvier 1997, Gif sur Yvette (P. Thuriaux)
	Serge Gangloff, Bernard de Massy and Francis Fabre "Topoisomérases et hélicase: Maintien de la stabilité des séquences d'ADNr chez la
	levure"	Molecular Mechanisms in DNA Replication and Recombination

II. BILAN DES ACTIVITES A. Travaux de recherche doctoraux

	hydrophobes qui s'organisent en une structure amphiphilique caractéristique des pré-
	séquences peptidiques responsables de l'acheminement vers la mitochondrie.
	L'expression du gène ACO1 est régulée par les substrats de croissance.
	En 1985, dans le cadre de mon "Diplôme d'Etudes Approfondies", j'ai démarré une Comme pour la majorité des gènes codant pour les enzymes impliquées dans la
	étude portant sur le métabolisme du glucose dans le laboratoire du Pr. G. J-M. respiration, le gène ACO1 est soumis à la répression catabolique. Cet effet est
	Lauquin à la Faculté des Sciences de Marseille-Luminy. Au cours de cette année, j'ai essentiellement exercé au niveau transcriptionnel, et se trouve amplifié lors d'une
	cloné le gène nucléaire codant pour l'aconitase mitochondriale de Saccharomyces croissance sur un milieu où le glucose et le glutamate (ou l'un de ses dérivés) sont
	cerevisiae. Ces résultats encourageants me permirent d'obtenir une allocation du présents simultanément. En revanche, la transcription d'ACO1 est stimulée lors
	Ministère de la Recherche et de la Technologie et de poursuivre cette étude pour d'une croissance sur un milieu non fermentescible. Cette augmentation de la quantité
	l'obtention d'un Doctorat. Au cours des trois années suivantes, j'ai combiné une triple de transcrits est due à la fixation des protéines activatrices Hap2 et Hap3 sur leur site
	approche biochimique, génétique et de biologie moléculaire pour d'une part aborder spécifique, l'UAS2 UP1, présent en amont de la boîte TATA du gène ACO1.
	l'étude des mécanismes qui régulent l'expression de l'aconitase mitochondriale au L'aconitase est impliquée dans le fonctionnement du cycle de Krebs au sein
	cours du métabolisme et pour d'autre part élucider les problèmes d'acheminement de de la mitochondrie, mais également dans celui du cycle du glyoxylate qui se déroule
	cette enzyme soit vers les mitochondries (cycle de Krebs), soit vers les peroxysomes dans le cytoplasme cellulaire. Les résultats préliminaires suggèrent que le gène
	(cycle du glyoxylate). ACO1 est responsable de la production des deux isoformes.
	J'ai isolé le gène codant pour l'aconitase mitochondriale de Saccharomyces Une partie de ces résultats a été publiée dans un article:
	cerevisiae (ACO1) par complémentation fonctionnelle de la mutation glu1-1. Cette Gangloff, S. P., Marguet, D., and Lauquin, G. J. (1990). Molecular cloning
	mutation est caractérisée par l'absence d'activité enzymatique aconitase et confère of the yeast mitochondrial aconitase gene (ACO1) and evidence of a
	un phénotype d'auxotrophie envers le glutamate. La région d'ADN de levure synergistic regulation of expression by glucose plus glutamate. Molecular
	responsable de la complémentation du phénotype mutant a été délimitée à une and Cellular Biology 10, 3551-3561
	portion génomique de 3,0 kb, et a été identifiée à l'ADN GLU1 par des expériences
	de liaison génétique. Un transcrit polyadénylé unique de 2,6 kb a été mis en
	évidence, et son sens de transcription déterminé par la technique d'hybridation sur
	Northern blot. Le gène ACO1 a été assigné au chromosome XII grâce à des
	expériences d'hybridation sur des chromosomes séparés par électrophorèse en
	champ pulsé. L'examen de la séquence nucléotidique du gène a révélé la présence
	d'un cadre de lecture ouvert unique pouvant être traduit en une entité protéique de
	85 685 Da. En outre, les comparaisons de séquence effectuées au niveau peptidique
	avec des oligopeptides d'aconitase de coeur de boeuf ont révélé de très fortes
	similitudes avec la protéine déduite du gène ACO1, indiquant que ce dernier
	correspond au gène de structure de l'enzyme de levure. La région amino-terminale
	de la protéine déduite est constituée par des acides aminés basiques et

B. Travaux de recherche du 1er stage post-doctoral

	J'ai rejoint le 1er février 1990 le laboratoire du Dr. Rodney Rothstein (Columbia
	University, New York) pour étudier les mécanismes qui contrôlent la recombinaison
	mitotique entre séquences répétées d'ADN.

  Gangloff, S., de Massy, B., Arthur, L., Rothstein, R., and Fabre, F. (1999).

	The essential role of yeast topoisomerase III in meiosis depends on
	recombination. EMBO Journal 18, 1701-1711.
	D. Travaux récents
	1. Introduction générale
	Le projet que je développe depuis mon intégration au CNRS s'inscrit dans la
	continuité des travaux démarrés au cours de mes stages post-doctoraux et rejoint la
	thématique travaillée depuis des années dans le laboratoire de Francis Fabre. Il
	s'agit de l'étude des mécanismes de réparation de l'ADN et plus particulièrement du
	rôle des hélicases impliquées dans ce processus. Ce projet s'inscrit également dans
	le cadre plus étendu de l'étude des mécanismes qui régulent la stabilité de
	l'information génétique dans les cellules eucaryotes.
	Caractéristiques	Blm	Wrn	Rts	Sgs1	Rqh1
		H. sapiens	H. sapiens	H. sapiens	S. cerevisiae	S. pombe
	Génétiques	Autosomique	Autosomique	Autosomique	récessif	récessif
		récessif	récessif	récessif
	Cliniques ou	Retard de	Retard de	Prédisposition	Méiose altérée	Sensibilité aux
	phénotypiques	croissance Grande	croissance Cancers non	à la néoplasie Affections de	Instabilité	radiations et aux
		variété de	épithéliaux	la peau et du	génétique	dommages de
		cancers Diabète mature	Diabète Hypogonadis mature	squelette	radiations Sensibilité aux	l'ADN
		Hypogonadis	me
		me
	Cytogénétiques	SCEs	Mosaïcisme	Réarrangeme	Non	Mitoses
		Cassures chromosomiqu	varié de translocation	nts chromosomiqu	disjonction	aberrantes
		es	(Inversions,	es		Phénotype
		Figures	translocations)			"cut"
		quadriradiales
	Mutations	Elevé	Elevé	?	Elevé	?
		(délétions)	(délétions)		(délétions)
	Recombinaison	Hyper	Hyper	Hyper	Hyper	Hyper
		recombinaison	recombinaison	recombinaison	recombinaison	recombinaison
	Réplication	Progression	Distances	?	Réplication	Redémarrage
		ralentie des	altérées entre		altérée	en phase S
		fourches	les sites			altéré
		Profil anormal	d'initiation
		des	Phase S
		intermédiaires	allongée

  L'ADN simple-chaîne ainsi formé est immédiatement protégé par la protéine RP-A, affine de cette structure. Pour qu'un événement de recombinaison puisse avoir lieu, cet ADN simple-chaîne doit être nettoyé et recouvert d'un nucléofilament protéique Rad51[START_REF] Paques | Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae[END_REF]. L'étape qui assure l'enlèvement de RP-A est catalysée par les protéines Rad51 et Rad52, ce qui permet la polymérisation d'un nucléofilament de Rad51 sur cet ADN. Des protéines accessoires sont également utilisées pour stabiliser cette structure et faciliter les étapes ultérieures de ce processus. Ce sont les produits des gènes RAD55 et RAD57. Des expériences de "double-hybride" ont montré que Rad55 interagit avec Rad51, et que Rad57 interagit avec Rad55[START_REF] Johnson | Functional differences and interactions among the putative RecA homologs Rad51, Rad55, and Rad57[END_REF]. Le nucléofilament ainsi formé est compétent pour former des joints paranémiques avec l'ADN et pour ainsi chercher des séquences homologues. La protéine Rad54, un membre de la famille Snf/Swi, est une ATPase ADN double-brin dépendante qui est impliquée dans l'ouverture de la double-hélice d'ADN, la formation d'un joint plectonémique avec le nucléofilament et dans le démarrage de la synthèse réparatrice

  modèle de résolution des intermédiaires tardifs de recombinaison que nous proposons implique les voies contrôlées par les gènes SGS1/TOP3 ou MUS81/MMS4. La voie Sgs1/Top3 peut être impliquée dans la migration et la résolution de la double jonction de Holliday qui est formée au cours de la conversion génique. La voie Mus81/Mms4 peut, quant à elle, être impliquée dans le clivage nucléolytique des structures branchées qui peuvent apparaître au cours du mécanisme de SDSA. Dans ce modèle, seule la voie Sgs1/Top3 permet la formation d'une translocation réciproque, ce qui laisse supposer un contrôle des gènes Sgs1/Top3 sur les CO. Les deux approches proposées pour comprendre le rôle de Sgs1/Top3 et Mus81/Mms4 dans la résolutions d'intermédiaires de recombinaison sont complémentaires. La première, fondée sur le substrat chromosomique, est soit spontanée, puisque la nature de la cassure induisant la recombinaison homologue est aléatoire, soit induite par des agents introduisant des dommages dans l'ADN. La deuxième s'appuie sur un substrat plasmidique et est induite par une cassure double-chaîne simulée par la linéarisation du plasmide.Le modèle de résolution des intermédiaires sur lequel est fondé cette étude concerne des événements mitotiques spontanés qui mettent essentiellement en jeu des chromatides soeurs. De tels événements ne sont malheureusement pas observables puisqu'ils conduisent à des molécules recombinantes identiques. Les approches expérimentales que nous projetons d'utiliser ont pour but de simuler de tels événements afin d'en comprendre le déroulement. Le substrat chromosomique simule bien un événement spontané, mais entre deux chromosomes différents. Le substrat plasmidique, quant à lui, nous permet de nous affranchir de l'initiation de la recombinaison puisque l'événement que nous analyserons est induit exclusivement par une cassure double-chaîne. Ces deux approches sont parfaitement indépendantes l'une de l'autre, ce qui renforcera la valeur physiologique des résultats que nous obtiendrons.

CONCLUSIONS 50IV. CITATIONS


The Genetics of Quiescence

Serge Gangloff, Benoit Arcangioli

To cite this version:

Serge Gangloff, Benoit Arcangioli. The Genetics of Quiescence. Master. France. 2021. pasteur-

The Genetics of Quiescence

Serge Gangloff Genome Dynamics Unit -Benoit Arcangioli