Véronique Vidal

David

Keywords: Acide abscissique, antioxydants, ascorbate, déficit hydrique, oxyde nitrique, tomate Abscissic acid, antioxidant, ascorbate, nitric oxide, tomato, water stress

Remerciemetns

Je tiens tout d'abord à remercier mes Directeurs de thèse, Félicie Lauri-Lopez et Laurent Urban, pour la qualité de leur encadrement et leur disponibilité pendant ces trois ans et demi. Ce manuscrit n'aurait pu être réalisé sans leurs conseils et leurs corrections.

Merci Félicie de m'avoir fait confiance pour mon stage de master 2 ou j'ai eu le plaisir de travailler avec Mathieu Lechaudel et Jacques Joas. Stage qui m'a conforté dans l'idée de continuer dans la recherche. Je te remercie d'autant plus que tu avais réitéré ta confiance et moi en me confiant la conduite de ce travail de thèse. Travailler avec toi fut très enrichissant à tout les niveaux aussi bien humainement que professionnellement. Je te remercie pour toutes les techniques auxquelles tu m'as formée malgré ton emploi du temps très chargé. Je te remercie également pour ta grande disponibilité quand je débarquais dans votre bureau avec toutes mes données et nombreuses questions. Merci pour ces moments de science passionnants et enrichissants. Merci Laurent d'avoir accepter de co-diriger cette thèse. Je te remercie également pour le temps que tu m'as accordé notamment et de m'avoir permis de profiter de tes connaissances. Un grand merci a tout les deux pour tout ce que vous m'avez apporté et surtout pour votre patience. Je tiens aussi à remercier Huguette Sallanon de m'avoir donné l'opportunité de réaliser ce travail de thèse dans son équipe, et de m'avoir soutenu et conseillé pour différentes manips notamment pour la microscopie à fluorescence et pour mon déplacement au Pays-Bas. Je vous remercie d'avoir cru en notre projet et de nous avoir toujours soutenus. Je remercie également Messieurs Mondher Bouzayen et Pierre Baldet d'avoir accepté d'être rapporteurs de cette thèse ainsi que Madame Rebeca Stevens et Messieurs Luc Bidel et Emmanuel Baudouin d'avoir acceptés d'être examinateurs de cette thèse. Un grand merci à Capucine Massot et Hélène Gautier qui furent les premières à m'accueillir au sein d'un laboratoire de recherche et transmis le virus de la recherche. Un grand merci également à Florence Léautier (Flo) et Emmanuelle Arnoux (Manu) pour le côté administratif de cette thèse et à Franck Lacroix (Francky) et Véronique Vidal pour le côté matériel. Je vous ai bien embêté avec mes listes à rallonge de commande à passer souvent en urgence. Merci pour votre accueil toujours chaleureux. Merci à Claude Chamary notre ancien gardien qui a du supporter mes départs tardifs du bureau durant ses derniers mois de travail (vive la retraite cloclo). Sans oublier notre Rolande internationale qui venait souvent prendre des nouvelles de ses petits thésards. Je remercie le Professeur Mohammed El Maataoui pour sa disponibilité et pour tous ses conseils. Merci pour tout ce temps que vous m'avez accordé pour les observations de microscopie à fluorescence. Travailler avec vous a été un réel plaisir aussi bien intellectuellement que humainement. En licence vous faisiez parti de ces profs qui m'ont donné l'envie de continuer dans le domaine végétale et travailler avec vous a été un réel privilège et honneur. Merci également à Emilie Roussel pour son excellent travail de stage qui m'a permis d'optimiser ces deux mois d'été au combien important. Un grand merci pour le travail accompli par Kim Rimbault. Merci pour ton implication dans ce travail, pour toutes ces heures passées devant la paillasse pour la validation des puces. Mes remerciements vont aussi à mes ancien collègues co-locataire de bureau pour ces moments de franche rigolades; ces matinées à suer et à grelotter grâce a notre super co-gestion de la clim. Je vous remercie également pour les discussions pas toujours scientifiques mais ô combien intéressantes. Toutes nos grandes discussions qui finissaient généralement par des schémas sur notre super tableau. Merci pour ces échanges tellement riches de part nos horizons souvent si éloignés. Que de bon souvenirs durant ces années passées à vos cotés sans oublié "nos repas de thésards et de stagiaires". Ainsi grand merci à Madj, Phrutya, Ousama, Hilarion, Chayma et Kim. Spéciale dédicace pour tout les stagiaires que j'ai eu le plaisir de côtoyer durant ces années, notamment Jean-Baptiste (j'ai pensé au p:-)), Meredith, Thalia, Ursula merci pour votre bonne humeur et nos grandes discussions scientifique. Je tiens aussi à remercie nos prédécesseurs thésards, Claire la rebelle et Benjamin pour m'avoir si bien accueilli dans leur bureau et aider à me familiariser avec le fonctionnement des locaux. Je te remercie d'autant plus Claire car j'ai eu le plaisir de travailler avec toi notamment pour la préparation des TP. Le travail avec toi est plaisant car efficace et qu'est-ce qu'on a bien rigolé. Je remercie aussi les différents thésards avec qui j'ai pu échanger, et qui m'ont permis de relativiser l'état d'avancement de mon travail : Laure (forf-girl), Jean-François, Solène et Céline. Vive les journées de formation CIES!!! MERCI Sandrine, ma Sandrinette, notre super technicienne. mon petit soleil, toujours souriante même dans les moments durs. Je te remercie pour ta gentillesse et ta patience à mon égard. Travailler avec toi fut vraiment agréable, ta réactivité et efficacité m'ont toujours épaté, j'espère que tu n'aura pas d'autre thésards casse pieds comme moi de si tôt. "Sandrinette tu sais ou je pourrais trouver ceci, Sandrinette tu pourras venir nous aider à 3h du matin pour disséquer des tomates ou alors passer des heures devant l'ordinateur pour la microscopie" et j'en passe. Et aussi un énorme merci pour le temps que tu a passé à relire mon manuscrit et corriger mes nombreuses fautes. Sandrinette ne va pas sans Mellaman (Saad), que dire appart un énorme merci pour tout. Merci d'avoir supporté mes horaires tardifs, merci pour ces fous rires, ta disponibilité et surtout merci ta présence. Je remercie également tous ceux qui n'ayant pas directement participé à la thèse, ont contribué à sa réalisation de part leurs conseils et soutiens : David Roux, Jawaad Aarouf, Florence Charles et

Liste des abréviations

Introduction général

Contexte de la thèse La tomate représente des enjeux économiques et agronomiques majeurs. En effet, au niveau mondial, la surface cultivée en tomate est d'environ 4.6 millions d'hectares et la production s'élève à près de 161,7 millions de tonnes (FAO, 2012). La tomate se place au premier rang des fruits et légumes produits et consommés dans le monde, consommation en constante augmentation chaque année et atteint 21 kg/an/personne. De ce fait, la tomate est devenu un organisme modèle pour l'étude de nombreux processus biologiques comme le développement et la maturation ainsi que pour l'étude des interactions plante-environnement.

De plus, la tomate est caractérisée par sa richesse en antioxydants (le lycopène, le β-carotène et la vitamine C), connus pour leurs implications dans la lutte contre les maladies cardiovasculaires, certains cancers et d'autres maladies liées au vieillissement.

L'acide ascorbique (AsA) se présente sous trois formes : une forme réduite l'ascorbate (AsC) et deux formes oxydées, le radical monodehydroascorbate (MDHA) et le dehydroascorbate (DHA). Dans la plupart des fonctions cellulaires, l'ascorbate agit en tant que donneur d'électrons pour des réactions d'oxydo-réduction. Cependant, il peut aussi agir directement en éliminant les espèces réactives de l'oxygène (ERO) produites par le métabolisme cellulaire. Les ERO causent des dommages oxydatifs important en interagissant avec des macromolécules telles que les protéines, les lipides ou l'ADN. L'ascorbate, en piégeant les ERO, préviendrait ainsi des maladies cardiaques (athérosclérose), des inflammations chroniques et des maladies neurodégénératives (maladies d'Alzheimer et de Parkinson) puisqu'elle joue un rôle dans la protection des cellules contre le stress oxydatif (Poiroux-Gonord et al., 2010). La vitamine C est non seulement essentielle pour l'Homme mais elle est aussi vitale pour les végétaux qui la synthétisent. L'ascorbate joue un rôle important dans les processus physiologiques des plantes en agissant également en tant qu'antioxydant contre les ERO produites essentiellement lors du dysfonctionnement du métabolisme cellulaire (photosynthèse, respiration, …), résultant généralement d'un stress environnemental tel que la sécheresse, le froid ou encore l'ozone. En effet, chez les végétaux, l'ascorbate est capable d'éliminer des espèces radicalaires de l'oxygène et notamment le peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2 ) en faisant intervenir une enzyme particulière spécifique du règne végétal l'ascorbate peroxydase (APX). Cette réaction d'oxydo-réduction conduit à la formation de DHA et/ou de MDHA qui seront à leur tour réduits en ascorbate par la monodehydroascorbate réductase (MDHAR), la dehydroascorbate réductase (DHAR) et la glutathion réductase (GR). Ce recyclage est une fonction essentielle pour la cellule végétale car il permet de lutter contre les ERO produits dans la cellule, et de contrôler de l'accumulation de l'ascorbate.

Suite au réchauffement climatique, la sécheresse est un phénomène environnemental qui va augmenter en fréquence, intensité et distribution géographique (Smith et al., 2009). La sécheresse influence fortement la croissance et le développement des végétaux. Les conséquences de la sécheresse sont généralement considérées comme négatives car ses effets sur la conductance stomatique et la photosynthèse induisent une diminution de la productivité des cultures. Cependant, le stress n'a pas que des cotés négatifs. En effet, il a été démontré que le stress en général et plus précisément, un déficit hydrique modéré, pouvait positivement influencer le métabolisme secondaire des fruits et légumes avec des bienfaits potentiels pour les consommateurs. La concentration de métabolites secondaires tels que les vitamines ou les polyphénols peut augmenter chez les végétaux lorsque ces derniers font face à des contraintes environnementales (Murshed R, 2008a(Murshed R, , 2013a)). En réponse au déficit hydrique, le plant de tomate subit un stress oxydatif et le système antioxydant du fruit de tomate est activé (Murshed et al., 2013b). On observe en effet une augmentation des teneurs en ascorbate et une augmentation des activités des enzymes détoxifiantes telles que la SOD et la Catalase mais également de celles du cycle d'Haliwell-Asada (APX, DHAR, MDHAR). Ce système antioxydant permet l'adaptation du fruit à la contrainte oxydative et il est mis en place en réponse au déficit hydrique. Ces résultats ont conduit à des questionnements sur les mécanismes mis en place dans les réponses de défense face à un stress hydrique. Notamment, sur l'existence d'un signal "stress" pouvant provenir des parties végétatives (feuilles ou racines) en réponse au déficit hydrique et transféré au fruit pour mettre en place les systèmes de défense avant qu'il ne subisse le stress. Les candidats susceptibles de ces signaux, l'oxyde nitrique (NO), l'acide abscissique (ABA) et le peroxyde d'hydrogène (H2O2) semblent être de bons candidats.

Objectifs de la thèse L'objectif du travail qui a été effectué durant mon doctorat a été d'étudier l'implication du NO dans la réponse des fruits au déficit hydrique et son role dans l'induction des systèmes antioxydants des fruits. Le plan de recherche suivi pour répondre à mes objectifs a été le suivant :

1. Déterminer si un déficit hydrique induit rapidement la mise en place des systèmes de défense dans le fruit et provoque la synthèse de NO (voir chapitre 3-1). La détection de NO a été réalisée par microscopie à fluorescence en utilisant la nouvelle sonde NO, la NO 550 (détection, mise au point pendant le doctorat) et par spectrométrie laser à cascade quantique (QCL) au Pays Bas (Radbound University).

2. Vérifier si le NO est responsable de la mise en place de la réponse antioxydante du fruit en interaction avec l'ABA et H 2 O 2 (à des doses correspondant à la quantité détectée dans les fruits soumis au déficit hydrique). Une approche pharmacologique a été mise en place sur des fruits de tomates mis en culture sur milieu nutritif liquide Murashige and Skoog (voir Chapitre III-2).

3. Identifier d'autres gènes induits par NO dans le fruit de tomate. Pour cela, nous avons utilisé de puces à ADN (Agilent, technique bicolor), où nous avons mis en évidence les gènes induits après 4h de traitement au NO (Chapitre III-3).

Plan de la thèse

Ce manuscrit est organisé en 6 chapitres principaux. Le chapitre I est une synthèse bibliographique du sujet traité durant ma thèse. L'objectif de cette synthèse est de présenter en particulier: les systèmes de défense antioxydants (enzymatique et non enzymatique) mis en place en réponse aux stress abiotiques, un état des connaissance sur l'oxyde nitrique, une molécule de signalisation importante. Cette revue bibliographique est complétée pour certains points particuliers dans les introductions des articles.

Le chapitre II expose le matériel et les principales méthodes utilisées pour mener mes travaux expérimentaux Nous verrons successivement le matériel végétal et ses conditions de cultures et d'application des stress, aussi des descriptions des méthodes utilisées pour caractériser les effets du stress, quantifier l'ascorbate et étudier l'expression des gènes. Enfin sera présenté le protocole mis au point pour le dosage de H 2 O 2 , présenté sous la forme d'un article publié dans American Journal of Analytical Chemistry.

Les résultats de mes recherches (chapitre III) sont présentés sous la forme de trois sous chapitres indépendants. Le chapitre III-1 décrit sous la forme d'un article, les effets du mercure sur les paramètres oxydatifs et les systèmes antioxydants dans les feuilles et les fruits de tomate d'une part et sur la production d'oxyde nitrique d'autre part.

Le chapitre III-2 présente les effets de l'acide abscissique, l'H 2 O 2 et l'oxyde nitrique sur le fonctionnement des systèmes antioxydants, cette dernière partie est également rédigée sous la forme d'un article soumis à Journal of Plant Physiology Enfin, le chapitre III-3, présente l'étude transcriptomique réalisée pour rechercher les gènes cibles du NO et les gènes induit par le déficit hydrique au travers du NO.

Enfin, une discussion générale des travaux présentés et des perspectives viennent conclure ce manuscrit.

En réponse à une contrainte saline ou hydrique, le plant de tomate subit un stress oxydatif et le système antioxydant du fruit de tomate est activé (Murshed et al, 2013). On observe alors, une augmentation des teneurs en vitamine C et une augmentation des activités des enzymes détoxifiantes tels que la SOD et la Catalase mais également de celles du cycle d'Haliwell-Asada (APX, DHAR, MDHAR) dépendant du stade physiologique du fruit et de l'intensité du stress. Par ailleurs, il a été montré que cet ensemble d'enzymes est également induit dans des fruits dont les symptômes et marqueurs de stress ne sont pas détectables alors que les feuilles subissent un stress oxydatif avéré (Murshed et al, 2013). Ceci pouvait suggérer d'une part que le système antioxydant est suffisant pour maintenir les stress oxydant du fruit ou qu'un signal " stress " pouvait être induit dans les parties végétatives (feuilles ou racines) en réponse au traitement et transféré au fruit pour mettre en place les systèmes de défense avant qu'il ne subisse le stress. Parmi ces signaux, l'oxyde nitrique (NO) et le peroxyde d'hydrogène semblent être de bons candidats.

Chapitre I :

Synthèse bibliographique

Synthèse bibliographique 1.Les plantes face à leur environnement : adaptation à des conditions parfois stressantes

Les végétaux peuvent être confrontés à des changements de leurs conditions environnementales qui vont être néfastes pour leur développement. Ces conditions si elles sont défavorables, peuvent avoir des conséquences allant de la baisse de rendement jusqu'à la perte complète des récoltes. On parle de situation de "stress" lorsques ces facteurs externes sont capables d'induire un effet potentiellement nuisible sur les organismes vivants mais peut également être utilisée pour décrire l'effet nuisible lui-même.. On distingue respectivement les stress de types biotiques et abiotiques (bios = vie en grec) selon qu'ils sont dus à des organismes vivants (insectes, virus, bactéries..) ou à d'autres facteurs (sécheresse, froid, métaux lourds..). (Figure 1).

Un des principaux effets de ces conditions de stress est l'augmentation de la production d'espèces réactive de l'oxygène (ERO) au sein des plantes. Les ERO peuvent être des radicaux, mais aussi des molécules non radicalaires et leur nature instable les rendent particulièrement réactif et sont capables de provoquer des dégâts cellulaires importants. L'oxygène (O 2 ) est un élément indispensable à la vie des organismes aérobies. Ces organismes utilisent l'oxygène pour oxyder les substrats riches en carbone et en hydrogène ou pour synthétiser les substrats carbonés dans le cas des végétaux. Ces processus s'accompagnent de la formation d'intermédiaires radicalaires très réactifs connus sous le nom espèces réactives de l'oxygène (ERO). Les ERO sont des molécules contenant de l'oxygène mais dont la réactivité est bien supérieure à celle de la molécule d'O2. Dans les conditions optimales de croissance des végétaux, de nombreux processus biochimiques métaboliques produisent des ERO. Le système de transport d'électrons lié à la photosynthèse est la source majeure de formes réactives de l'oxygène dans les tissus végétaux [START_REF] Asada | THE WATER-WATER CYCLE IN CHLOROPLASTS: Scavenging of Active Oxygens and Dissipation of Excess Photons[END_REF]. L'existence de ces formes réactives apparaît comme une conséquence inévitable du fonctionnement de ce système de transport d'électrons. Dans les cellules végétales, l'activation de l'oxygène peut également se produire dans d'autres compartiments et organites : mitochondries, peroxysomes, réticulum et parois cellulaires. La réduction de l'oxygène quadruplet, qui donne de l'eau, est la dernière étape réactionnelle du transport d'électrons dans la mitochondrie ; elle est catalysée par la cytochrome oxydase. En marge de ce métabolisme normal de l'oxygène, l'anion superoxyde, le peroxyde d'hydrogène et des radicaux hydroxyles peuvent être les produits du métabolisme propre des mitochondries [START_REF] Elstner | Oxygen Activation and Oxygen Toxicity[END_REF]. Le tableau 1 présente les différents ERO et la figure 2 présente les principaux effets de ces derniers. . Cet ion est protoné immédiatement en H2O2 dans les conditions de pH physiologique, compte tenu du pKa très élevé de H 2 O 2 .

Radical hydroxyle (OH . )

-Il résulte de la fission homolytique de la liaison O-O dans la molécule de peroxyde d'hydrogène. -Sa concentration intracellulaire est en général très faible, mais elle peut atteindre des taux très supérieurs localement, en particulier dans les mitochondries et les peroxysomes L'oxygène singulet ( 1 O2) -L'oxygène singulet ( 1 O2) est une autre espèce oxygénée très réactive. C'est une molécule à l'état excité qui peut réagir avec différents accepteurs d'électrons pour produire des peroxydes. Il est formé lors de réductions photochimiques et de thermolyse des endoperoxydes.

Tableau 1 : Principales espèces réactives de l'oxygène et leurs spécificités.

Stress oxydant

Les stress environnementaux comme la sécheresse, la salinité, la présence de métaux lourds, la chaleur, le froid, la toxicité des ions, ainsi que les stress biotiques (l'infection fongique et dommages causés par les insectes) induisent la production d'ERO générant alors un stress oxydant à l'origine de changements dans le fonctionnement cellulaire et tissulaire.

Le stress oxydant est défini comme un désequilibre entre les prooxydants et les antioxydants, en faveur des premiers, conduisant à des dommages potentiels (Sies, 1997b). Lorsque la quantité d'espèces réactives de l'oxygène (ERO) générée dépasse les capacités antioxydantes de l'organisme, la toxicité des ERO s'exprime par de nombreux aspects, et en particulier par la perturbation de nombreux processus physiologiques comme la photosynthèse (Sies, 1997b;[START_REF] Wheeler | The biosynthetic pathway of vitamin C in higher plants[END_REF]Langebartels et al., 2002). Cette toxicité s'explique par la réactivité des ERO, en particulier celle du radical hydroxyle (OH . ), envers les macromolécules biologiques. Le stress oxydant chez les végétaux a fait l'objet de très nombreuses revues bibliographiques Chapitre I : Synthèse bibliographique (Bartosz, 1997;Bolwell et Wojtaszek, 1997;Van Breusegem et al., 2001;Potters et al., 2002;Schutzendubel et Polle, 2002;Blokhina et al., 2003;Apel et Hirt, 2004;Foyer et Noctor, 2005a;Pitzschke et al., 2006;Wormuth et al., 2007) et de plusieurs livres (Inze et Montagu, 2001;Smirnoff et al., 2005).

Systèmes enzymatiques

Superoxyde dismutases (SOD)

Les plantes possèdent trois types de SOD qui contiennent des groupements prosthétiques et renferment des métaux différents : du fer (FeSOD), du manganèse (MnSOD) ou du cuivre et du zinc (CuZnSOD). Localisation :

MnSOD -principalement dans la matrice de la mitochondrie (del [START_REF] Río | Mitochondrial and peroxisomal manganese superoxide dismutase: differential expression during leaf senescence[END_REF], matrice des glyoxysomes [START_REF] Sandalio | Intraorganellar Distribution of Superoxide Dismutase in Plant Peroxisomes (Glyoxysomes and Leaf Peroxisomes)[END_REF], peroxysomes des cellules foliaires [START_REF] Rodríguez-Serrano | Peroxisomal membrane manganese superoxide dismutase: characterization of the isozyme from watermelon (Citrullus lanatus Schrad.) cotyledons[END_REF].

FeSOD -stroma des chloroplastes [START_REF] Asada | The water-water cycle as alternative photon and electron sinks[END_REF], matrices des peroxysomes et des mitochondries [START_REF] Droillard | Isozymes of Superoxide Dismutase in Mitochondria and Peroxisomes Isolated from Petals of Carnation (Dianthus caryophyllus) during Senescence[END_REF], fraction cytosolique des racines nodulées [START_REF] Moran | Functional Characterization and Expression of a Cytosolic Iron-Superoxide Dismutase from Cowpea Root Nodules[END_REF].

CuZnSOD -sous forme libre dans le cytosol [START_REF] Bowler | Superoxide Dismutase in Plants[END_REF], les peroxysomes ou l'apoplaste [START_REF] Corpas | Copper-zinc superoxide dismutase is a constituent enzyme of the matrix of peroxisomes in the cotyledons of oilseed plants[END_REF]. Une CuZnSOD est également liée à la membrane du thylakoïde au niveau du PSI [START_REF] Ogawa | Attachment of CuZn-Superoxide Dismutase to Thylakoid Membranes at the Site of Superoxide Generation (PSI) in Spinach Chloroplasts: Detection by Immuno-Gold Labeling After Rapid Freezing and Substitution Method[END_REF].

Catalase (CAT)

Elle catalyse la dismutation de deux molécules de peroxyde d'hydrogène en 2 molécules d'eau et une molécule de dioxygène (Willekens et al., 1995).

H 2 O 2 + H 2 O 2 → O 2 + 2H 2 O
Localisation : dans les peroxysomes [START_REF] Mullen | Identification of the peroxisomal targeting signal for cottonseed catalase[END_REF][START_REF] Petrova | Dual targeting of yeast catalase A to peroxisomes and mitochondria[END_REF],

Glutathion peroxydase (GPX)

Catalyse la réduction du peroxyde d'hydrogène 2GSH+H 2 O 2 →GSSG + 2H 2 O Localisation : Paroi cellulaire, mitochondrie et chloroplastes [START_REF] Navrot | Plant Glutathione Peroxidases Are Functional Peroxiredoxins Distributed in Several Subcellular Compartments and Regulated during Biotic and Abiotic Stresses[END_REF] SYSTEME ASADA-FOYER-HALLIWELL : Ascorbate peroxydase (APX) L'APX catalyse la réduction du peroxyde d'hydrogène en utilisant l'ascorbate comme co-substrat. 2ASA+H 2 O 2 →MDHA + 2H 2 O Localisation : dans tous les compartiments cellulaires, dans le cytosol et dans l'apoplaste, sous forme soluble ou liée aux membranes [START_REF] Asada | THE WATER-WATER CYCLE IN CHLOROPLASTS: Scavenging of Active Oxygens and Dissipation of Excess Photons[END_REF](Asada, , 2006;;[START_REF] Foyer | Tansley Review No. 112[END_REF]Mittler, 2002).

Dehydroascorbate réductase (DHAR)

Dehydroascorbate + 2GSH → ascorbate + GSSH Cytosol [START_REF] Dalton | Subcellular Localization of Oxygen Defense Enzymes in Soybean (Glycine max [L.] Merr.) Root Nodules[END_REF], chloroplastes (Hossain and Asada, 1984;Hossain et al., 1984), mitochondries [START_REF] Jimenez | Evidence for the presence of the ascorbate-glutathione cycle in mitochondria and peroxisomes of pea leaves[END_REF] et peroxysomes [START_REF] Jimenez | Evidence for the presence of the ascorbate-glutathione cycle in mitochondria and peroxisomes of pea leaves[END_REF])

Monodehydroascorbate réductase (MDHAR)

La MDHAR appartient à une famille multigénique : 6 chez Arabidopsis et 3 chez la tomate Monodehydroascorbate + NADPH + H + → ascorbate+ NADP + Cytosol [START_REF] Dalton | Subcellular Localization of Oxygen Defense Enzymes in Soybean (Glycine max [L.] Merr.) Root Nodules[END_REF], chloroplastes (Hossain and Asada, 1984;Hossain et al., 1984), mitochondries [START_REF] Jimenez | Evidence for the presence of the ascorbate-glutathione cycle in mitochondria and peroxisomes of pea leaves[END_REF] et peroxysomes [START_REF] Jimenez | Evidence for the presence of the ascorbate-glutathione cycle in mitochondria and peroxisomes of pea leaves[END_REF] Glutathion réductase (GR) GSSH + NADPH + H + → 2GSH + NADP + Cytosol [START_REF] Dalton | Subcellular Localization of Oxygen Defense Enzymes in Soybean (Glycine max [L.] Merr.) Root Nodules[END_REF], chloroplastes (Hossain and Asada, 1984;Hossain et al., 1984), mitochondries [START_REF] Jimenez | Evidence for the presence of the ascorbate-glutathione cycle in mitochondria and peroxisomes of pea leaves[END_REF] et peroxysomes [START_REF] Jimenez | Evidence for the presence of the ascorbate-glutathione cycle in mitochondria and peroxisomes of pea leaves[END_REF] Systèmes non enzymatiques Localisation : cytosol, vacuole, chloroplastes et mitochondries [START_REF] Noctor | Glutathione in plants: an integrated overview[END_REF], apoplaste ???

La vitamine E Le terme de vitamine E désigne un groupe de composés lipophiles possédant l'activité biologique de l'α-tocophérol. La vitamine E un antioxydant clé dans la protection de l'intégrité des membranes, en particulier celles des chloroplastes. Il protège également les pigments photosynthétiques, participant ainsi à la protection de l'appareil photosynthétique. Majoritairement présent dans les plastes [START_REF] Munné-Bosch | The Function of Tocopherols and Tocotrienols in Plants[END_REF].

Les polyphénols antioxydants

La majorité des polyphénols antioxydants appartiennent aux familles des flavonoïdes, de tanins ellagiques et de tannins hydrolysables, acides phénoliques et coumarines Principalement présent au niveau des parois cellulaires, vacuoles, mais aussi en plus faible concentration au niveau du noyau et de la membrane plasmique.

Les caroténoïdes

Ils jouent le rôle de pigments accessoires de l'antenne collectrice des photosystèmes. En dehors de cette implication dans le processus photosynthétique, les caroténoïdes associés au PSII ou à l'antenne collectrice, participent à la protection de l'appareil photosynthétique contre les ERO. Présent essentiellement dans les chloroplastes et chromoplastes [START_REF] Fanciullino | Carotenoid responses to environmental stimuli: integrating redox and carbon controls into a fruit model[END_REF].

La vitamine C

Elle peut réagir directement avec des ERO tels que l'oxygène singulet ( 1 O 2 ) et les radicaux d'hydroxyle (OH -) [START_REF] Asada | Ascorbate peroxidase -a hydrogen peroxide-scavenging enzyme in plants[END_REF]. Présent dans tous les tissus végétaux à l'exception de ceux des graines sèches. [START_REF] Franceschi | l-Ascorbic Acid Is Accumulated in Source Leaf Phloem and Transported to Sink Tissues in Plants[END_REF][START_REF] Hancock | Synthesis of L-ascorbic acid in the phloem[END_REF]. [START_REF] Gara | Ascorbate synthesis and ascorbate peroxidase activity during the early stage of wheat germination[END_REF]. On retrouve l'AsC en plus forte concentration dans les feuilles que dans les fruits où il peut atteindre des concentrations allant de 10 à 300 mM [START_REF] Smirnoff | Ascorbate biosynthesis and function in photoprotection[END_REF].

Synthèse de l'ascorbate chez les végétaux

Bien qu'il existe une seule voie de synthèse de vitamine C dans le règne animal, on peut en compter quatre chez les végétaux [START_REF] Agius | Engineering increased vitamin C levels in plants by overexpression of a D-galacturonic acid reductase[END_REF][START_REF] Lorence | myo-Inositol Oxygenase Offers a Possible Entry Point into Plant Ascorbate Biosynthesis[END_REF][START_REF] Wheeler | The biosynthetic pathway of vitamin C in higher plants[END_REF][START_REF] Wolucka | GDP-Mannose 3′,5′-Epimerase Forms GDP-L-gulose, a Putative Intermediate for the de Novo Biosynthesis of Vitamin C in Plants[END_REF]. De ces voies, la voie D-mannose/L-galactose (L-Gal) aussi connue comme la voie de Smirnoff-Wheeler est la principale [START_REF] Wheeler | The biosynthetic pathway of vitamin C in higher plants[END_REF]. Les trois premières étapes ne sont pas spécifiques à la voie de biosynthèse de l'ascorbate, elles sont impliquées dans des voies qui participent au métabolisme primaire du Le L-galactose est ensuite converti par la L-galactose déshydrogénase en L-galactono-1,4lactone. La dernière étape de la voie de biosynthèse de l'ascorbate proposée par [START_REF] Wheeler | The biosynthetic pathway of vitamin C in higher plants[END_REF] est catalysée par la L-galactono-1,4-lactone déshydrogénase, qui convertit la Lgalactono-1,4-lactone en ascorbate (Figure 3). 4). ). Le NO . peut être converti en ion nitrosium (NO + ) et en anion nitroxyl (NO -). Le NO est un radical lipophile qui peut diffuser à travers les membranes plasmiques et le cytoplasme à la vitesse de 50 µm s -1 avec une solubilité de 1.9 mM (Shamsul [START_REF] Hayat | Nitric Oxide in Plant Physiology[END_REF]. La durée de vie du NO est d'environ 10 secondes [START_REF] Pfeiffer | Nitric oxide: chemical puzzles posed by a biological messenger[END_REF]. Ainsi le NO peut parcourir une distance de 500µm dans les tissus.

Synthèse du NO

Dans les cellules animales, le NO peut être produit par l'action de l'oxyde nitrique synthase (NOS) en présence de L-Arginine, d'oxygène et de NADPH (voie non encore découverte chez les végétaux). NO peut aussi être synthétisé de façon non enzymatique par la réduction de NO 2 -à pH acide dans les parois cellulaires [START_REF] Bethke | Apoplastic Synthesis of Nitric Oxide by Plant Tissues[END_REF]. Le NO peut aussi être un produit dérivé de la dénitrification, de l'assimilation de nitrate et/ou de la respiration nitrate [START_REF] Wojtaszek | Nitric oxide in plants: To NO or not to NO[END_REF]. L'ion ammonium NH [START_REF] Wojtaszek | Nitric oxide in plants: To NO or not to NO[END_REF] (Figure 5). Cependant la source majeure de NO semble provenir de la nitrate réductase NADPH dépendante [START_REF] Kaiser | Nitrate Reductase and Nitric Oxide[END_REF][START_REF] Meyer | Is nitrate reductase a major player in the plant NO (nitric oxide) game?[END_REF][START_REF] Rockel | Regulation of nitric oxide (NO) production by plant nitrate reductase in vivo and in vitro[END_REF][START_REF] Yamasaki | An alternative pathway for nitric oxide production in plants: new features of an old enzyme[END_REF]. Chez Arabidopsis thaliana, la NR est codée par 2 gènes Nia1 et Nia2, Nia2 assurant 90% de l'activité totale de la NR [START_REF] Wilkinson | Identification of the Arabidopsis CHL3 gene as the nitrate reductase structural gene NIA2[END_REF]. Elle peut aussi catalyser la réduction de nitrite en NO via la réaction suivante :

La NR représente une source importante de NO pour la plante, comme le démontre la très faible synthèse de NO chez les doubles mutants nia [START_REF] Gupta | Inhibition of aconitase by nitric oxide leads to induction of the alternative oxidase and to a shift of metabolism towards biosynthesis of amino acids[END_REF].. Différents paramètres affectent la production de NO par la NR. La synthèse de NO par la NR nécessite des concentrations faibles en nitrate et fortes en nitrite, car la constante d'affinité de la NR pour le nitrite est relativement élevée (Km nitrite = 100µM) alors que le nitrate peut agir en tant qu'inhibiteur compétitif efficace de part sa faible constante de dissociation (Ki = 50 µM) [START_REF] Rockel | Regulation of nitric oxide (NO) production by plant nitrate reductase in vivo and in vitro[END_REF]. Ceci est confirmé par l'accumulation de NO dans les lignées antisens de nitrite réductase (NiR) [START_REF] Morot-Gaudry-Talarmain | Nitrite accumulation and nitric oxide emission in relation to cellular signaling in nitrite reductase antisense tobacco[END_REF].

Le nitrite nécessaire pour la production de NO ne s'accumule pas dans les cellules sous des conditions de lumière optimale pour la photosynthèse, car il est transformé en ammonium par le NiR (Sakihama et al., 2002). En absence de lumière, [START_REF] Yamasaki | An alternative pathway for nitric oxide production in plants: new features of an old enzyme[END_REF] ont démontré que l'activité de la NR pouvait basculer vers la production de NO au dépend du NAD(P)H, illustré dans la figure 6. [START_REF] Uchida | Effects of hydrogen peroxide and nitric oxide on both salt and heat stress tolerance in rice[END_REF], induit la germination et la croissance racinaire de jeunes plants de lupin jaune (Kopyra and Gwóźdź, 2003) et augmente la croissance et le poids sec chez le maïs (Zhang et al., 2006b).

Le NO est impliqué également dans la défense contre les rayonnements UV-B. Chez la pomme de terre un traitement au NO avant un traitement aux UV-B augmente l'activité des enzymes antioxydantes et le développement des tubercules de pomme de terre (Shi et al., 2005). De même, dans des feuilles de jeunes pousses de maïs, il a été démontré que le NO pouvait agir en synergie avec les ERO pour induire la production d'éthylène comme une réponse de défense face aux UV-B [START_REF] He | The role and the interrelationship of hydrogen peroxide and nitric oxide in the UV-B-induced stomatal closure in broad bean[END_REF]. Le NO interviendrait aussi lors de stress thermique comme le démontre [START_REF] Yay | Nitric Oxide in plants. Occurence, function and use[END_REF] qui révèle une surproduction de NO chez la luzerne suite à une courte période de stress thermiques. L'utilisation du NO pour protéger les plantes d'un stress thermique a fait l'objet d'un brevet montrant qu'un prétraitement au NO augmentait la tolérance de plantules de maïs, de tomate et de blé au froid [START_REF] Lamattina | Method of enhancing the metabolic function and the growing conditions of plants and seeds[END_REF]. Un traitement au NO peut également réduire les effets de métaux lourds chez le végétaux comme le suggèrent les travaux de [START_REF] Kopyra | Nitric oxide stimulates seed germination and counteracts the inhibitory effect of heavy metals and salinity on root growth of Lupinus luteus[END_REF] [START_REF] Singh | Nitric oxide (as sodium nitroprusside) supplementation ameliorates Cd toxicity in hydroponically grown wheat roots[END_REF].

Des études sur l'adaptation des plantes face à la sécheresse ont révélé une surproduction de NO dans des plants de petit pois et de tabac soumis à un déficit hydrique (Garcı á-Mata and Lamattina, 2001;[START_REF] Leshem | The characterization and contrasting effects of the nitric oxide free radical in vegetative stress and senescence of Pisum sativum Linn foliage[END_REF]. Depuis, de nombreuses études ont été menées sur l'implication de cette molécule dans le stress hydrique. Il a été ainsi montré que l'application de NO exogène augmente la tolérance au stress hydrique chez les feuilles et plantules de blé en induisant la fermeture stomatique et ainsi limitant la transpiration (Garcı á-Mata and Lamattina, 2001). Ces effets ont été annulés par l'application d'un piégeur de NO le 2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide (cPTIO). Dans des feuilles de maïs, l'augmentation de l'activité des enzymes antioxydants telles que la SOD, l'APX et la GR, induite par un stress hydrique a été supprimée par l'application d'inhibiteur de la NR. Ces résultats suggèrent premièrement une implication du NO dans l'induction de l'activité de ces enzymes et deuxièmement une production potentielle de NO à partir de la NR (Sang et al., 2008a). L'acide abscissique, impliquée notamment dans la fermeture stomatique [START_REF] Mittelheuser | Stomatal Closure and Inhibition of Transpiration induced by (RS)-Abscisic Acid[END_REF], est l'une des premières phytohormones synthétisées au cours d'un déficit hydrique. Il a de plus été démontré que ce dernier n'agissait pas seul dans la médiation de la fermeture stomatique mais en collaboration avec le peroxyde d'hydrogène et le NO. En effet Kwak et al., (2003) et Bright et al., (2006) révèlent une activation des NADPH oxydases par l'ABA, qui conduit à une production d'ERO et notamment de H 2 O 2 . Le H 2 O 2 ainsi produit activerait la production de NO au travers de la NR, qui à son tour activerait des protéines kinases activées par des agents mitogènes (MAPK) qui conduisent à la fermeture stomatique (Figure 7). Le déficit hydrique induit la perte de turgescence des cellules ce qui provoque la synthèse de l'acide abscissique (ABA (Corpas 2004;Neill et al. 2008). L'ABA joue un rôle important dans le mouvement stomatique permettant de limiter les pertes en eau par évapotranspiration (Schroeder et al., 2001a;Kwak et al., 2008). De nombreux travaux ont porté sur le rôle de l'ABA au niveau de la cellule de garde (MacRobbie, 1998;Assmann and Wang, 2001;Hossain et al., 2011). La fermeture du stomate résulte d'une réduction de la pression de turgescence au niveau des cellules de garde occasionnée par un efflux d'ions K + et d'anions (Cl -, malate...), par la conversion du saccharose en amidon, de composés osmotiquement inactifs ou par l'efflux d'eau (MacRobbie, 1998). Les canaux ioniques de la cellule de garde constituent donc des acteurs essentiels dans le contrôle des mouvements stomatiques. La perception de l'ABA au niveau de la cellule de garde entraine une augmentation de la concentration cellulaire en calcium via l'activation de canaux calciques entrants et une activation de canaux anioniques sortants de types S (pour Slow Anion Channel). L'efflux massif d'anions conduit à la dépolarisation de la membrane plasmique et à l'activation de canaux potassiques sortants, dont le canal GORK (Becker et al., 2003;Hosy et al., 2003;Sirichandra et al., 2009) alors que l'augmentation de la concentration cellulaire en calcium entraine l'inactivation des canaux potassiques entrants (encore appelés K+ Inward Rectifiyng Channels) KAT1, KAT2 , AKT1 ou AKT2 (Pilot et al., 2001;Leonhardt et al., 2004;Ivashikina et al., 2005;Kwak et al., 2008). L'efflux de potassium ainsi généré entraine une sortie d'eau, et la perte de turgescence des cellules de garde conduit alors à la fermeture de stomates (Schroeder et al., 2001b;MacRobbie, 2006).

L'ABA et le NO sont impliqués dans un nombre important de processus physiologiques dans la plante, allant de la croissance racinaire [START_REF] Zhang | ABA promotes quiescence of the quiescent centre and suppresses stem cell differentiation in the Arabidopsis primary root meristem[END_REF] jusqu'au mouvement stomatique (Neill et al., 2002). Des études suggèrent que la production de NO induite par l'ABA conduisant à la fermeture stomatique se ferait sous l'influence de H 2 O 2 par l'activation de NADPH oxydases (RBOHD et RBOHF) (Bright et al., 2006). Une étude chez le maïs a aussi révélé qu'une augmentation de la production de H 2 O 2 sous l'influence d'ABA résultait en une surproduction de NO et que ce dernier induisait une activation des protéines kinases de type MAPK) et la surexpression ainsi que l'activité d'enzymes antioxydantes (Zhang et al., 2007). Dans une étude plus récente, il a aussi été démontré que l'ABA et le NO impliqué dans la médiation de la réponse de l'ABA au travers de la signalisation NO [START_REF] Zhang | Increased abscisic acid levels in transgenic tobacco over-expressing 9 cis-epoxycarotenoid dioxygenase influence H2O2 and NO production and antioxidant defences[END_REF]. Ce mécanisme a aussi été décrite chez le chiendent (Cynodon dactylon) où il a été démontré que le NO se présentait en aval du H 2 O 2 lors de l'induction de la SOD et la CAT (Lu et al., 2009). Cependant d'autres voies de signalisation peuvent être impliquées. Par exemple, le système calcium/calmoduline dont l'activité a été détecté à la fois en amont et en aval de la production du NO par l'ABA et le H 2 O 2 (Sang et al., 2008b). Plus récemment, il a été suggéré que le NO pouvait influencer la sensibilité des cellules végétales face à l'ABA grâce à de triple mutants présentant de faible teneur en NO (Lozano-Juste and [START_REF] Lozano-Juste | Nitric oxide modulates sensitivity to ABA[END_REF].

Les graines présentaient une forte dormance, une augmentation de la germination et une hypersensibilité à l'ABA lors de la fermeture stomatique. Il a aussi été démontré que l'ABA et le NO étaient impliqués dans l'adaptation à la radiation UV-B dans des feuilles de Maïs. En effet, des mutants déficients en ABA (viviparous 14: vp14) présentaient une plus forte sensibilité à la radiation et un apport exogène en ABA pouvait limiter les dommages (Tossi et al., 2009). L'augmentation de la teneur en H 2 O 2 et NO bien que notable était plus faible chez les mutants et leur accumulation fût restaurée suite à une application d'ABA. Les auteurs ont conclu que l'UV-B déclenchait une augmentation en ABA, accompagnée d'une surproduction de NO, limitant les dommages cellulaires (Hancock et al., 2011).

Interactions entre le NO et l'acide jasmonique et l'acide salycilique

Le NO peut agir sur la médiation d'apoptose au travers de la cytokinine (Neill et al., 2003). Il a aussi été démontré que l'auxine favorisait la synthèse de NO dans les racines de plants de concombre Cucumis sativus [START_REF] Pagnussat | Nitric Oxide and Cyclic GMP Are Messengers in the Indole Acetic Acid-Induced Adventitious Rooting Process[END_REF]. Cependant l'interaction entre le NO et l'éthylène lors de la maturation et la sénescence des tissus végétaux suggère une action antagoniste des deux gaz (del [START_REF] Río | Nitric oxide and nitric oxide synthase activity in plants[END_REF]Lamattina et al., 2003;[START_REF] Leshem | Evidence for the function of the free radical gas --nitric oxide (NO-) --as an endogenous maturation and senescence regulating factor in higher plants[END_REF]. Chen, et Jeng 2003;Huang et al. 2004). Des plants mutants nahG pour SA traités avec du NO montrent une surexpression des gènes impliqués dans la production de JA, suggérant l'intervention de SA dans la régulation de la synthèse de JA par NO (Wendehenne, Jörg Durner, et Klessig 2004).

Les

Rôle du NO dans le contrôle de l'activité des protéines:

S-nitrosylation

Dans la cellule, le NO peut réagir avec des thiols réduits pour former des Snitrosothiols (RSNO). Cette réaction est plus connue sous le nom de nitrosylation ; Snitrosylation dans le cas des protéines et N-nitrosylation pour les acides aminés. La réaction du NO avec le glutathion (GSH) pour donner le S-nitrosoglutathion (GSNO) représente une réaction biologique très importante. La S-nitrosylation consiste en la liaison du NO avec un groupement cystéine d'une protéine. Cette réaction peut affecter la fonction de cette dernière (Figure 8). Ainsi le NO peut intervenir dans des régulations post-transcriptionelles au travers de la S-nitrosylation [START_REF] Lindermayr | Proteomic Identification of S-Nitrosylated Proteins in Arabidopsis[END_REF]. La S-nitrosylation permet aussi au NO de se déplacer dans les végétaux. Etant plus stable, les RSNO ne réagissent pas avec l'oxygène à la différence du NO . , très réactif, qui forme des peroxynitrites. Ainsi sa durée de vie passe de quelques secondes à quelques heures. Cette réaction étant réversible, le NO peut être libéré après une relativement longue distance [START_REF] Baudouin | Nitric Oxide Signalling in Plants[END_REF].

La nitration de la tyrosine

La nitration de la tyrosine consiste en l'addition d'un groupement NO 2 à la tyrosine libre ou attachée à une chaine polypeptidique. Cette réaction est due à l'action du peroxynitrite sur la chaine aromatique de la tyrosine pour donner la 3-nitrotyrosine (Figure 9). La tyrosine nitrosylée est habituellement utilisée chez l'homme comme marqueur pathologique ou marqueur de stress nitrosatif. Plusieurs études ont démontrées que la nitrotyrosine pouvait aussi être utilisée comme marqueur de stress nitrosatif chez les végétaux (Francisco J Corpas, 2009;[START_REF] Gong | Nitric oxide mediates inactivation of glutathione S-transferase in suspension culture of Taxus cuspidata during shear stress[END_REF][START_REF] Rubbo | Protein and lipid nitration: Role in redox signaling and injury[END_REF][START_REF] Saito | Peroxynitrite Generation and Tyrosine Nitration in Defense Responses in Tobacco BY-2 Cells[END_REF][START_REF] Morot-Gaudry-Talarmain | Nitrite accumulation and nitric oxide emission in relation to cellular signaling in nitrite reductase antisense tobacco[END_REF]. Depuis longtemps cette réaction a été considérée comme étant irréversible mais de récentes études ont démontré que la dénitrification de la tyrosine pouvait se faire de façon enzymatique ou non enzymatique [START_REF] Abello | Protein Tyrosine Nitration: Selectivity, Physicochemical and Biological Consequences, Denitration, and Proteomics Methods for the Identification of Tyrosine-Nitrated Proteins[END_REF][START_REF] Astier | Nitric Oxide-Dependent Posttranslational Modification in Plants: An Update[END_REF]Vandelle and Delledonne, 2011). En plus de sa fonction de marqueur de stress, il a été démontré que la nitration de la tyrosine peut avoir un effet stimulant ou inhibant sur la protéine cible. Par exemple, la MnSOD et la glutathion s-transferase sont inhibées par cette réaction [START_REF] Quijano | Reaction of Peroxynitrite with Mn-Superoxide Dismutase: ROLE OF THE METAL CENTER IN DECOMPOSITION KINETICS AND NITRATION[END_REF] alors que l'activité de la cytochrome c augmente [START_REF] Cassina | Cytochrome c Nitration by Peroxynitrite[END_REF]. De plus la nitration de la tyrosine peut intervenir dans l'activation et le transport de protéines kinases C [START_REF] Balafanova | Nitric oxide induces nitration of PKC facilitating translocation via enhanced RACK2 interactions: A novel mechanism of NO-triggered activation of PKC[END_REF].

Nitrosylation métallique

En plus de la S-nitrosylation et de la nitration de la tyrosine, il existe une troisième modification post-transcriptionelle qui peut être induite par le NO. Celle-ci implique la liaison du NO avec le métal de transition d'une métalloprotéine (Figure 10). Un des meilleurs exemples de nitrosylation métallique est l'activation de la guanylate cyclase (enzyme héminique avec un atome de fer lié à des atomes d'azote) dans le système animal [START_REF] Ignarro | Nitric Oxide Biology and Pathobiology[END_REF]. Cette activation provoque la transformation de la guanosine triphosphate (GTP) en guanosine monophosphate cyclique (GMPc). Chez les végétaux, la GMPc est reconnu comme étant un intermédiaire dans un grand nombre de processus induit par le NO, comme le développement racinaire [START_REF] Pagnussat | Nitric Oxide and Cyclic GMP Are Messengers in the Indole Acetic Acid-Induced Adventitious Rooting Process[END_REF], la respiration mitochondriale [START_REF] Wang | Nitric oxide increases mitochondrial respiration in a cGMPdependent manner in the callus from Arabidopsis thaliana[END_REF], le fonctionnement des nodules [START_REF] Keyster | Endogenous NO levels regulate nodule functioning: Potential role of cGMP in nodule functioning?[END_REF] et les réponses de défense [START_REF] Durner | Defense gene induction in tobacco by nitric oxide, cyclic GMP, and cyclic ADP-ribose[END_REF]. Cependant, la régulation de la GMPc par la nitrosylation métallique n'a pas été entièrement élucidée chez les végétaux. Barrosob 2004). Les principales méthodes utilisées jusque-là sont la chromatographie gazeuse et la spectrométrie de masse (Neill et al., 2003). la mesure par spectrophotométrie reposant Chapitre I : Synthèse bibliographique sur la conversion de l'oxyhémoglobine en méthémoglobine [START_REF] Orozco-Cardenas | Nitric Oxide Negatively Modulates Wound Signaling in Tomato Plants[END_REF], la spectrométrie photoacoustique laser [START_REF] Yay | Non-invasive photoacoustic spectroscopic determination of relative endogenous nitric oxide and ethylene content stoichiometry during the ripening of strawberries Fragaria anannasa (Duch.) and avocados Persea americana (Mill.)[END_REF], spectrométrie de résonance paramagnétique électronique [START_REF] Caro | Nitric oxide decreases superoxide anion generation by microsomes from soybean embryonic axes[END_REF]Corpas, 2004;Corpas et al., 2004b;Corpas et al., 2001;[START_REF] Pagnussat | Nitric Oxide Is Required for Root Organogenesis[END_REF], l'électrode à oxyde nitrique [START_REF] Leshem | The characterization and contrasting effects of the nitric oxide free radical in vegetative stress and senescence of Pisum sativum Linn foliage[END_REF][START_REF] Yamasaki | Inhibitory Effects of Nitric Oxide on Oxidative Phosphorylation in Plant Mitochondria[END_REF] et la chemiluminescence (del [START_REF] Río | Mitochondrial and peroxisomal manganese superoxide dismutase: differential expression during leaf senescence[END_REF][START_REF] Morot-Gaudry-Talarmain | Nitrite accumulation and nitric oxide emission in relation to cellular signaling in nitrite reductase antisense tobacco[END_REF].

Pour des approches microscopiques, l'utilisation du 4,5-diaminofluorescéine diacétate (DAF-2 DA) en tant que sonde fluorescente est devenue une technique très répandue dans la détection de NO chez les végétaux (Corpas, 2004;[START_REF] Nakatsubo | Direct evidence of nitric oxide production from bovine aortic endothelial cells using new fluorescence indicators: diaminofluoresceins[END_REF]. Cette sonde permet une détection en temps réel de NO avec une bonne résolution spatiale [START_REF] Foissner | In vivo imaging of an elicitor-induced nitric oxide burst in tobacco[END_REF]Gould et al., 2003;Lamattina et al., 2003). généralement par le trioxyde de chrome (CrO 3 ). Ainsi, le dosage de NO par la réaction de Griess est une méthode de dosage indirecte (Figure 12). Le NO 2 peut être de nouveau oxydé en nitrate NO 3 mais ce dernier ne produit pas un colorant azoïque et la cinétique de l'oxydation de NO 2 est tellement lente qu'elle est considérée comme insignifiante. ), NO 2 -réagit avec sulfanilamide to pour donner un réactif diazoïque intermédiaire qui ensuite réagit avec l'éthylènediamine naphtyl (NED) pour donner le colorant azoïque final qui est quantifié par son absorbance à 540nm. B Installation mise en place par [START_REF] Vitecek | Measuring NO Production by Plant Tissues and Suspension Cultured Cells[END_REF] pour mesurer le NO dégagé par les plantes. Source [START_REF] Mur | Methods of nitric oxide detection in plants: A commentary[END_REF].

(iii) Résonance de spin électronique Le principe de la résonance de spin électronique (RSE), aussi connu sous le nom de résonance paramagnétique électronique (RPE) est basé sur la propriété des électrons nonappariés à absorber, puis réémettre l'énergie d'un rayonnement électromagnétique lorsqu'ils sont placés dans un champ magnétique (Figure 13). L'électron possède un mouvement de [START_REF] Weaver | Spin trapping nitric oxide from neuronal nitric oxide synthase: A look at several iron-dithiocarbamate complexes[END_REF]. La limite de détection du RSE est de l'ordre du pmol [START_REF] Weaver | Spin trapping nitric oxide from neuronal nitric oxide synthase: A look at several iron-dithiocarbamate complexes[END_REF]. (iv) Electrode de détection du NO La chemiluminescence présente une limite de détection excellente, de l'ordre de 20-50 pmol (Byrnes et al., 1996). Cette technique demande peu d'équipement et est très largement utilisée par les végétalistes pour la détection de NO (Figure 14). 15). La concentration de NO est déterminée en mesurant la lumière absorbée par l'échantillon. La limite de détection est de 0.5 ppb par seconde. Avant les mesures, le système est calibré par un mélange de 100 ppb NO dans de l'azote (N 2 ) (Mandon et al., 2012). (viii) Sonde NO 550

Le NO 550 est une sonde fluorescente récemment synthétisée (Yang et al., 2010). Les expérimentations ont été menées sur la variété de tomate Micro-Tom. Il s'agit d'une variété de type déterminé, qui a l'avantage d'être de petite taille (10-20 centimètres) et qui a un cycle de développement rapide (70-90 jours) [START_REF] Meissner | A new model system for tomato genetics[END_REF](Meissner et al., , 2000 ; ;Scott et Harbaugh, 1989).

Le Les traitements appliqués :

1. Six fruits en contact avec 0.5 mM nitroprussiate de sodium (SNP) un donneur efficace d'oxyde nitrique (NO).

2. Six fruits en contact avec 0.05 mM nitroprussiate de sodium (SNP).

3. Six fruits en contact avec 0.5 mM SNP + 1mM 2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5

tetramethylimidazoline-l-oxyl-3-oxide (cPTIO), un piègeur de NO.

4. Six fruits en contact avec 0.05 mM SNP + 1mM cPTIO, 5. Six fruits en contact avec MS + 1 mM cPTIO (C + cPTIO).

6. Six fruits en contact avec 0.1 mM d'acide abscissique (ABA).

7. Six fruits en contact avec 0.1 mM d'acide abscissique + 1 mM cPTIO (ABA + cPTIO).

8. Six fruits en contact avec 0.5 mM de peroxyde hydrogène (H 2 O 2 ).

9. Six fruits en contact avec 0.5 mM de peroxyde hydrogène + 1 mM cPTIO (H 2 O 2 + cPTIO).

10. Six fruits uniquement en contact du milieu nutritif MS (Contrôle).

Toutes les solutions ont été préparées avec du milieu MS. Un contact permanent entre la solution nutritive et les pédicelles a été assuré durant toute la durée de l'expérimentation. Après 4 heures, 8

heures, 12 heures et 24 heures. Suite aux différents traitements, les tissus nécessaires à l'étude microscopique sont prélevés sur les fruits. Ensuite, ils ont été plongés dans de l'azote liquide et stockés à -80°C. L'expérimentation a été répétée trois fois.

Analyses

Paramètres hydriques :

Ψ feuille : Le potentiel hydrique des feuilles des plantes témoins et stressées a été mesuré en utilisant une chambre à pression selon la méthode de Scholander et al. (1965).

Ψ fruit : Le potentiel hydrique des fruits a été mesuré à l'aide d'un HR-33T Point de rosée microvolt mètre, connecté à des C-52 chambres (Wescor Inc, Logan, Utah, USA).

FΨ O : Le potentiel osmotique des fruits a été mesuré en utilisant un nanoosmomètre (VAPRO, Vapor Pressure Osmometer, WESCOR).

FW : La masse de matière fraîche des feuilles et des fruits a été déterminée juste après la récolte.

DW : La masse de matière sèche a été mesurée après séchage de la matière fraîche à 100 ° C pendant 72 h.

WC : La teneur en eau a été déterminée à partir des masses fraîches (FW) et sèches (DW) selon l'équation : WC = [FW-DW] / FW × 100.

La teneur en matière sèche est calculée selon l'équation : TMS = (DW × 100) / FW.

Activité du photosystème II :

L'émission de la fluorescence de la chlorophylle a, permet l'évaluation de l'activité du

Teneur en MDA :

Pour la mesure de la peroxydation des lipides dans les fruits et les feuilles, le test de l'acide thiobarbiturique (TBA), qui détermine la teneur en MDA en tant que produit final de la peroxydation lipidique (Murshed et al., 2008a), a été utilisé. De la poudre congelée de fruits ou de feuilles (150 mg) est homogénéisée dans 1 mL de TCA 0,1% (p:v) solution. L'homogénat est centrifugé à 12 000 g pendant 15 min, puis 500 µl de surnageant est ajouté à 1 ml de TBA 0,5% (p:v) dans du TCA 20% (p:v) dans un tube à vis. Le mélange est incubé à 100°C pendant 30 min. Ensuite, la réaction est arrêtée dans un bain de glace. Les tubes sont légèrement agités et 200 µL de chaque tube sont placés en triplicat dans une microplaque de 96 puits. L'absorption est lue à 532 nm dans un lecteur micro-plaque (PowerWave HT Microplate Spectrophotometer de BioTek). La valeur d'absorption non-spécifique à 600 nm est aussi lue puis soustraite et la concentration du complexe MDA-TBA (pigment rouge) est calculée à partir du coefficient d'extinction de 155 mM -1 .cm -1 .

Quantification de l'oxyde nitrique par laser à cascade quantique (QCL) :

La production de NO a été suivie par un spectromètre laser à cascade quantique (QCL) développé dans le laboratoire Life Science Trace Gas Facility de l'université de Radbound au Pays

Bas (Mandon et al., 2012). Le détecteur inclut un QCL, une cellule multipass et un détecteur de lumière à température ambiante. La longueur d'onde d'émission du laser a été choisie afin de correspondre au mieux à l'absorption ro-vibrationnel du NO. Le laser a un rendement de 10 mW et est maintenue à -25°C par un refroidisseur peltier. Le NO à quantifier est absorbé par le système dans une cellule multipass au rythme de 1 L/h. La concentration de NO est déterminée en mesurant la lumière absorbée par l'échantillon. La limite de détection est de 0.5 ppbv par seconde. Avant les mesures, le système est calibré par un mélange de 100 ppbv NO dans de l'azote (N 2 ).

Localisation du NO par microscopie à fluorescence :

Des segments de tissus de 10 mm × 4 mm × 4 mm ont été réalisés à partir des tissus étudiés.

Ils ont été mis à incuber pendant 1h à 25°C à l'obscurité avec 10 µM de NO 550 (Yang et al., 2010) préparé dans 10 mM Tris HCl, pH 7.

Activités enzymatiques antioxydants :

Les activités enzymatiques de la superoxyde dismutase (SOD), de la catalase (CAT), de l'ascorbate peroxydase (APX), de la monodehydroascorbate reductase (MDHAR), de la dehydroascorbate reductase (DHAR) et de la glutathion réductase (GR) ont été déterminées selon le protocole mis au point au laboratoire par Murshed et al ( 2008).

Extraction des enzymes :

Les protéines ont été extraites par homogénéisation de 0,20 à 0,25 g de poudre congelée de fruits dans 1 mL de 50 mM tampon MES/KOH, pH6.0, et qui contient : 40 mM KCl, 2 mM CaCl 2 et 1 mM d'ascorbate (AsA). L'homogénat a été centrifugé à 16000 g, pendant 15 min, à 4° C, et l'activité enzymatique du surnageant est immédiatement mesurée (Murshed et al., 2008b). La concentration en protéines de chaque échantillon a été dosée par la méthode de Bradford (1976).

Détermination des activités enzymatiques:

Toutes les activités enzymatiques ont été déterminées par réactions cinétiques, avec un volume final de 200 µl, excepté la SOD (1000 µl) à 25 ° C (Murshed et al., 2008b).

APX : Milieu réactionnel composé de tampon phosphate de potassium à 50 mM (pH 7.0); d'AsA à 0,25 mM, de 10 µL d'extrait enzymatique et d'H 2 O 2 à 5 mM. L'activité a été déterminée en mesurant la disparition de l'ascorbate à 290 nm pendant 5 minutes et calculée à partir du coefficient d'extinction de 2.8 mM -1 . cm -1 (Murshed et al., 2008b).

DHAR : Milieu réactionnel composé de tampon HEPES à 50 mM (pH 7,0), d'EDTA à 0,1 mM, de glutathion réduit (GSH) à 2,5 mM, de DHA à 0.2 mM et de 10 µL d'extrait enzymatique.

L'activité a été déterminée en mesurant l'augmentation de la vitesse de réaction à 265 nm pendant 5 minutes, et calculée à partir du coefficient d'extinction de 14,0 mM -1 . cm -1 (Murshed et al., 2008b).

MDHAR : Milieu réactionnel composé de tampon HEPES à 100 mM (pH 7,6), d'AsA à 2,5 mM, de NADH à 0,25 mM, de 20 µL d'extrait enzymatique et de 0,4 unité d'ascorbate oxydase (AO).

L'activité a été déterminée en mesurant la diminution de la vitesse de réaction à 340 nm, pendant 5 minutes, et calculée à partir du coefficient d'extinction de 6.22 mM -1 . cm -1 (Murshed et al., 2008b).

GR : Milieu réactionnel composé de tampon HEPES à 50 mM (pH 8,0), d'EDTA à 0,5 mM, de NADPH à 0,25 mM, de 30 µL d'extrait enzymatique et de glutathion oxydé (GSSG) à 0,5 mM.

L'activité a été déterminée en mesurant la diminution de la vitesse de réaction à 340 nm pendant 5 minutes, et calculée à partir du coefficient d'extinction de 6.22 mM -1 . cm -1 (Murshed et al., 2008b).

CAT : Milieu réactionnel composé de tampon phosphate de potassium à 50 mM (pH 7,0), Nous avons 3 conditions réalisées chacune en quadruplicats donc 12 échantillons :

1. Quatre fruits en contact avec 0.05 mM nitroprussiate de sodium (SNP) un donneur efficace d'oxyde nitrique (NO).

2. Quatre fruits mis en condition de stress hydrique par un traitement avec du polyéthylène glycol (PEG) 10%.

3. Quatre fruits uniquement en contact avec le milieu nutritif MS (Contrôle).

A la fin des traitements, les fruits ont été broyés dans de l'azote liquide et stockés à -80°C. Une fois les ARN des 12 échantillons extraits, ils ont été envoyés à l'institut de génétique et de biologie

Validation des analyses transcriptomiques par qPCR en temps réel

Synthèse des ADNc par reverse transcription :

La rétrotranscription des ARNm a été réalisée avec le kit Reverse Transcriptase Core Kit TM (Eurogentec) en suivant scrupuleusement les instructions du fabricant, (120 ng ARN total). Trois séries de rétrotranscription ont été réalisées, les cDNA obtenus ont été regroupés, et homogénéisés.

Enfin, ces cDNA, dilués de moitié, ont constitué la matrice de travail et ont été conservés à -80°C.

Amplification de gènes par réaction de polymérisation en chaine en temps réel (qPCR)

La validation des résultats obtenus par la puce à ADN a été réalisée par une amplification en temps réel qPCR de 6 gènes d'intérêts, normalisés avec deux gènes de référence Sand (SGN- Quatre réplicats biologiques et trois réplicats techniques ont été réalisés pour cette expérimentation.

Etapes préliminaires permettant de normaliser l'étude qPCR

Selon le guide de MIQE [START_REF] Bustin | The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments[END_REF][START_REF] Derveaux | How to do successful gene expression analysis using real-time PCR[END_REF] -Préparation des ARN dans un même volume, mêmes conditions pour la reverse transcription -Matrice de même volume et concentration pour les réactions de qPCR (12 ng/µl) -Amorces vérifiées par la réalisation d'une courbe de fusion "melting curve" -Sélection de gènes de référence pour l'interprétation des résultats et vérification de leur stabilité par le logiciel GenNorm (http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/) et Normfinder. ((E cible ) ∆Ct cible (témoin-traité) ) / ((E ' ref ) ∆Ct ref (témoin-traité) )

Choix des amorces spécifiques pour la PCR en temps réel

Où E et E' sont respectivement, les efficacités d'amplification du gène cible et du gène de référence et Ct, le nombre de cycles auquel la fluorescence atteint une valeur seuil fixée par l'appareil.

Analyses statistiques :

Les résultats sont exprimés par des moyennes avec erreur standard (± SE). Les tests statistiques ont été réalisés avec le logiciel R 2.12. échantillons biologiques en triplicatas avec blancs, contrôle et gamme étalon.

Introduction

Hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) is commonly produced in plants during normal physiological processes and in response to stress situations [START_REF] Foyer | Understanding Oxidative Stress and Antioxidant Functions to Enhance Photosynthesis[END_REF]. The quantitative determination of hydrogen peroxide is important in numerous studies since H 2 O 2 is involved in oxidative cellular damages as well as in signalling processes [2] [3]. Owing to its importance, numerous methods and kits have been developed based on spectrophotometry, chemiluminescence [START_REF] Lu | A Modified Chemiluminescence Method for Hydrogen Peroxide Determination in Apple Fruit Tissues[END_REF], enzymatic method [5] and electrochemistry [START_REF] Liu | A Real-Time Electrochemical Technique for Measurement of Cellular Hydrogen Peroxide Generation and Consumption: Evaluation in Human Polymorphonuclear Leukocytes[END_REF]. However, some of these methods are very expensive. Several years ago, an economic colorimetric method has been described for the determination of H 2 O 2 [START_REF] Velikova | Oxidative Stress and Some Antioxidant Systems in Acid Rain-Treated Bean Plants: Protective Role of Exogenous Polyamines[END_REF] and it is widely used in the field of plant biology [START_REF] Sengupta | Interdependence of Plant Water Status with Photosynthetic Performance and Root Defense Responses in Vigna radiata (L.) Wilczek under Progressive Drought Stress and Recovery[END_REF]- [START_REF] Nounjan | Exogenous Proline and Trehalose Promote Recovery of Rice Seedlings from Salt-Stress and Differentially Modulate Antioxidant Enzymes and Expression of Related Genes[END_REF]. This method is based on potassium iodide (KI) oxidation by H 2 O 2 in acidic medium according to the following equations:

22 2 2 2I 2H H O I 2H O -+ + + →+ 2 3 II I --

+→

When hydrogen peroxide is added to colorless solution of potassium iodide (KI), the iodide ions ( I -) are slowly oxidized in iodine (I 2 ). In presence of iodide, iodine reacts to form triiodide ( 3 I -) resulting in a yellowish solution. Therefore hydrogen peroxide could be quantified by spectrophotometric method by following 3 Iabsorption. In the method described by [START_REF] Velikova | Oxidative Stress and Some Antioxidant Systems in Acid Rain-Treated Bean Plants: Protective Role of Exogenous Polyamines[END_REF], H 2 O 2 determination relies on absorbance at 390 nm. However, the triiodide absorbs at 285 and 350 nm as presented in Figure 1(a). Although the peak observed at 285 nm presents greater sensitivity, the peak at 350 nm has been used in this study. Indeed plant tissues show important absorption at 285 nm, which can interfere with the assay (Figure 1(b), Figure 1(c)). Plant extracts have a colour background to take into account and contain molecules that interfere with H 2 O 2 determination. Commonly, metabolite determination is made through two major steps: extraction of molecules from tissue and quantification of molecule of interest from this extract. However using the two-step protocol, H 2 O 2 might be destroyed by ascorbic acid, which is an efficient H 2 O 2 scavenger [START_REF] Noctor | Ascorbate and Glutathione: Keeping Active Oxygen under Control[END_REF], during extraction step and may be underestimated or cannot be quantified at all (Ta ble 1(a)). So, we proposed an alternative one-step method.

Materials and Methods

The protocol is as follows: tomato fruits were harvested, immediately frozen in liquid nitrogen, ground and the powder stored at -80˚C until H 2 O 2 determination assay. Frozen powder (150 mg) was directly homogenized with 1 ml of solution containing 0.25 ml Trichloroacetic acid (TCA) (0.1% (w:v)), 0.5 ml KI (1 M) and 0.25 ml potassium phosphate buffer (10 mM, pH adapted to studied tissue) at 4˚C for 10 min (one-step buffer: extraction and colorimetric reaction combined). At the same time, for every sample, a control was prepared with H 2 O instead of KI for tissue coloration background. Good care was taken to protect samples and solutions from light. The homogenate was centrifuged at 12,000 × g for 15 min at 4˚C. 200 μL of supernatant from each tube were placed in UV-microplate wells and left to incubate at room temperature (20˚C -22˚C) for 20 min. Samples and blanks were analyzed in triplicate. A calibration curve obtained with H 2 O 2 standard solutions prepared in 0.1% TCA was used for quantification (Figure 1(a)). The microplate reader used is a Power Wave HT microplate spectrophotometer from BioTek (France) equipped with an internal temperature incubator and shaker for kinetic and spectrum analysis. We used the KC4 data software to check the reader and to analyze reactions. To optimize the protocol, assays have been done by modifying pH of phosphate buffer. As shown in Figure 2(a), tomato fruit extracts exhibited maximum absorbance at 350 nm in 10 mM potassium phosphate buffer solution at pH 8. For tomato leaves the most efficient buffer for the reaction was at pH 5.8 (Figure 2(c)). The kinetic of the reaction was not modified by the modification of the buffer pH as shown in Figure 2(b) and Figure 2(d).

In addition, the influence of the ratio of tomato exocarp to "one-step buffer" was made in order to select the ratio that resulted in maximal H 2 O 2 determination (Ta ble 1 (b)). The best ratio adapted to our sample was found to be between 150 and 200 mg for 1 ml of buffer. Recovery assays with 20 nmol/ml H 2 O 2 made to complete the method revealed 100% recovery in 100, 150 and 200 mg. In order to confirm the efficiency of our assay, we compared the H 2 O 2 contents in fruits (30 days after anthesis) and mature leaves from control plants and plants exposed to HgCl 2 (5 ppm) for 24 h, using the new protocol. The results are presented in Ta ble 1 (c).

Conclusion

This optimized spectrophotometric method based on a one-step buffer (extraction and reaction) is suitable and to the overproduction of reactive oxygen species (ROS) (Apel and Hirt, 2004;Mittler, 2002).

Excessive ROS cause lipid peroxidation and enzyme inactivation, resulting in cell damage [START_REF] Halliwell | Reactive Species and Antioxidants. Redox Biology Is a Fundamental Theme of Aerobic Life[END_REF]. Fortunately plants possess antioxidant defense systems to minimize excessive levels of ROS to protect them against oxidative damages. The enzymatic scavenging system is composed of superoxide dismutase (SOD), the first line of defense against ROS [START_REF] Gomez | Regulation of calcium signalling and gene expression by glutathione[END_REF], catalase (CAT) (Willekens et al., 1995) and the enzymes of the ascorbate-glutathione cycle (ascorbate peroxidase, monodehydroascorbate reductase, dehydroascorbate reductase and glutathione reductase) (Asada, 2006). Antioxidant compounds such as ascorbate, glutathione, α-Chapitre 3-1 : Le mercure induit la synthèse de NO et ABA et l'activation du système de défense antioxydant dans le fruit de tomate 61 tocopherol, phenolic compounds and carotenoids can act directly as free radical scavengers and also play important roles in detoxification [START_REF] Foyer | Redox Homeostasis and Antioxidant Signaling: A Metabolic Interface between Stress Perception and Physiological Responses[END_REF]. The induction of antioxidant systems and compounds constitutes a part of plants' strategies to cope with adverse conditions, as demonstrated by several works [START_REF] Grene | Oxidative Stress and Acclimation Mechanisms in Plants[END_REF]Mittler, 2002;Murshed R, 2008a;[START_REF] Suzuki | Reactive oxygen species and temperature stresses: A delicate balance between signalling and destruction[END_REF]. As exposed by [START_REF] Fanciullino | Carotenoid responses to environmental stimuli: integrating redox and carbon controls into a fruit model[END_REF], the production of ROS associated with stress can directly or indirectly exert a positive effect on the secondary metabolism of plants. Such a mechanism could be exploited even for fruit crops that represent a major source of phytochemicals (Davey et al., 2000), including ascorbate, which is essential for humans, who have lost the capacity to synthesize this compound.

Poiroux-Gonord et al. (2013) observed in citrus that photooxidative stress in leaves can influence the antioxidant metabolism as well as the primary and secondary metabolisms in nearby fruits, thereby increasing the concentration of carotenoids. The observation of (Poiroux-Gonord et al., 2013) raises the question of the involved signalling mechanisms. Signal transmission among plant organs has emerged recently as an important issue in plant physiology, and several important mechanisms have been unveiled (Baudouin, 2011;[START_REF] Baxter | ROS as key players in plant stress signalling[END_REF][START_REF] Kachroo | Systemic signaling during plant defense[END_REF]Mittler et al., 2011;Møller and Sweetlove, 2010;Neill et al., 2002a;Raghavendra et al., 2010;[START_REF] Suzuki | Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling[END_REF]. In this study, we focused specifically on i) Nitric oxide (NO), because NO is a major effector of the antioxidant response and, moreover, interacts with ABA (Hancock et al., 2011) and ii) Abscisic acid (ABA), because ABA is a major component of the response of plants to

water stress and has a demonstrated role in the regulation of antioxidant enzymes (Bellaire et al., 2000). The mechanism of the induction of antioxidant enzymes by ABA has been well documented;

several studies suggest that ABA induces the production of other signalling molecules, such as (Bright et al., 2006;Kwak et al., 2003) and NO, which in turn mediate the enhancement of antioxidant enzyme activities in addition to numerous other physiological processes in plants (Hancock et al., 2011;Lamattina et al., 2003;Neill et al., 2008;Wendehenne et al., 2004;Wendehenne et al., 2001;Zhang et al., 2007). NO, a reactive nitrogen species, has attracted considerable attention in the last decade. NO is believed to act as a signalling molecule that mediates the responses to both biotic and abiotic stresses in plants (Mur et al., 2013;Neill et al., 2008;Wendehenne et al., 2004;Wendehenne et al., 2001). Several studies suggest that NO plays an important role in protecting plants from oxidative stress (Beligni and Lamattina, 1999;Correa-Aragunde et al., 2008;Garcı á-Mata and Lamattina, 2001;Martin et al., 2009;Tossi et al., 2009). Corpas, 2009;Neill et al., 2003).

H 2 O 2
Our objective was to test the hypothesis that either ABA or NO is involved in the short-term response of tomato fruits to a water deficit. A rapid water deficit was achieved by inhibiting root water transport using mercuric chloride (HgCl 2 ) and collecting measurements early in the morning when the transpirational pull is minimal and the water transport is attributable to root pressure (Lopez et al., 2003;Maggio and Joly, 1995a). HgCl 2 blocks most aquaporins and rapidly inhibits root conductivity and, consequently, water uptake and radial water flow [START_REF] Javot | Role of a Single Aquaporin Isoform in Root Water Uptake[END_REF][START_REF] Zhang | Inhibition of Water Channels by HgCl2 in Intact Wheat Root Cells[END_REF]. Accordingly, the initial effects of HgCl 2 could be very similar to those experienced by plants during drought (Maggio and Joly, 1995b;[START_REF] Zhang | Inhibition of Water Channels by HgCl2 in Intact Wheat Root Cells[END_REF]. We measured the plant water status and enzymes of the antioxidant systems activity in leaves and fruits.

This study presents the first results demonstrating that water deficit may positively influence the antioxidant system in tomato fruits in the absence of symptoms of water stress. This study also provides evidence of the involvement of NO in the observed effect of water stress on the antioxidant system in fruits.

Materials and methods

Plant growth and treatments

Tomato (Solanum lycopersicum L, cv. Micro-tom) culture was conducted as previously described (Murshed et al., 2013a). The controlled growth chamber conditions were a 16/8 h light/dark cycle, a photosynthetic photon flux density (PPFD) of 300 µmol. m -2 .s -1 , a relative humidity of 60 ± 5% and a day/night temperature of 25/20°C. At the time of anthesis, the flowers were tagged to determine the fruit age in order to ensure treatment and harvest at the mature green (MG) stage. Two hours after the beginning of the light period, mercury treatments (0, 2, 5 and 10 ppm) were applied to 3-month-old plants. Root water transport involves aquaporins, which have water channel activity and facilitate radial water flow. After 24 and 48 h of treatment, the mature leaves close to the tomato bunch, pedicels and MG fruit pericarps (40 DAF fully developed green fruit) were collected, immediately frozen in liquid nitrogen, ground and stored at -80°C. The leaf water potential (Ψ leaf ) was measured using a pressure chamber according to [START_REF] Scholander | Sap Pressure in Vascular Plants: Negative hydrostatic pressure can be measured in plants[END_REF]. The fruit water potential (Ψ fruit ) was measured using a water potential system (PSΨPRO™) (Wescor Inc., Logan, Utah, USA) attached to C-52 chambers. The fruit osmotic potential (FΨ O ) was measured using a NanoOsmometer (VAPRO, Vapor Pressure

Leaf and fruit water parameters

Osmometer, WESCOR). The mature green fruits and mature leaves close to the tomato bunch were collected 2 h after sunrise for these measurements. The fresh weight (FW) was determined immediately after harvest. The dry weight (DW) was measured after drying at 70°C for 72 h. The tissue water contents (TWC) were determined as TWC = [FW-DW]/FWx100.

Leaf chlorophyll a fluorescence transients-JIP test

Leaf chlorophyll a (Chla) fluorescence transients were measured on dark-adapted (30 min) mature leaves close to fruit bunches using a Handy Plant Efficiency Analyzer (Handy-PEA, Hansatech Ltd, UK). The fluorescence OJIP parameters, which allowed us to evaluate the impact of the water stress on the photosynthetic apparatus were calculated automatically according to (Strasser et al., 2010) (Supporting Information, Table S1).

Determination of the ascorbate and dehydroascorbate contents

The total ascorbate (AsA plus DHA) and dehydroascorbate (DHA) contents were determined from 150-mg samples according to (Murshed et al., 2013a, b).

Determination of antioxidant enzyme activities

The protein extraction was performed according to (Murshed et al., 2008). The enzymatic activities of APX, DHAR, MDHAR, GR, SOD and CAT were measured as described by (Murshed et al., 2008;Murshed et al., 2013a). The proteins were quantified using Bradford's method (1976).

Determination of the hydrogen peroxide content

The leaf, pedicel and pericarp H 2 O 2 levels were determined using the protocol of [START_REF] Velikova | Oxidative Stress and Some Antioxidant Systems in Acid Rain-Treated Bean Plants: Protective Role of Exogenous Polyamines[END_REF] adapted for the leaf, pedicels and fruit pericarps as follows:

Determination of lipid peroxidation

To determine the level of lipid peroxidation, the thiobarbituric acid (TBA) test, which determines the malonyldialdehyde (MDA) content, was used according to (Murshed et al., 2013a).

Determination of abscisic acid content.

The free ABA content was determined using the Phytodetek competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (Agdia, Elkhart, In, USA) following manufacturer's instructions.

Frozen tissue powder (100 mg) was homogenized in 1 mL TBS buffer solution for 10 min at 4°C.

After centrifugation (15,000 x g, 15 min, 4°C), the supernatants were diluted 20-fold in TBS buffer and analyzed for free ABA. light that is absorbed by the sample with a detection limit of 0.5 ppbv. Before acquiring the measurements, the system was calibrated with a standard of 100 ppbv NO in N 2 . QCL allows a sensitivity of 0.8 ppbv in 1 s. The main advantage of this NO detection system is the possibility for long-term automated operation and low ventilation rate over the sample (max. 5 L/h), which is required in plant biology.

The measurements were collected 24 h before and after the beginning of the drought treatments using 3 mature green tomato fruits per plant from 3 different plants. The plants that were irrigated with water served as controls for this experiment.

Measurements were also collected from sodium nitroprusside (SNP) prepared in Murashige and Skoog basal medium (MS) with the objective of determining the correct concentration needed to emit NO close to the level that is emitted by the tomato plants. The measurements were performed for 24 h (16 h/8 h day/night cycle) under cool, white fluorescent lamps supplying 300 µmol photons.m -2 .s -1 .

NO imaging by fluorescence microscopy

To localize the in situ NO production, we used a fluorescence microscopy technique with an NO-specific probe. After each treatment, regular sections of approximately 10 mm x 4 mm x 4 mm were excised from the pericarps, placentas, pedicels, stems and mature leaves with the midrib. These tissues were incubated in the dark at 25°C in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing 10 µM of the specific membrane-permeable NO 550 probe (Yang et al., 2010) for 1 hour. The sections were then rinsed twice in the buffer solution, and free-hand sections were collected with a razor blade under subdued light. The sections were mounted in 50% glycerol in PBS (v:v) on microscope slides (Corpas et al., 2004), coverslipped and immediately examined under epifluorescence using a

Leica DMR light microscope equipped with an I3 filter (blue light excitation at 450-490 nm;

emission 520 nm). The sections that were incubated in 10 mM Tris-HCl alone served as negative controls. All of the images were captured using a Leica DFC300 FX digital camera at x20, and 3 different sections were analyzed from each fruit or leaf ensuring a 9-fold repetition per treatment.

The linear levels were adjusted in every image using the public domain Java image-processing program ImageJ 1.43 version (Maryland, USA) (Patakas et al., 2010).

Effects of exogenous NO on antioxidant enzymes

Fruits at the mature green stage (MG) were harvested from non-stressed plants between 9 and 10 a.m., and the pedicel of each fruit was placed in MS solution containing 4%

Chapitre 3-1 : Le mercure induit la synthèse de NO et ABA et l'activation du système de défense antioxydant dans le fruit de tomate 66 sucrose. We ensured that the pedicel was in close contact with the culture medium. The cultures were kept at 25/20°C for 24 h for adaptation under cool white fluorescent lamps providing 300 µmol photons.m -2 .s -1 . The following day, two hours after the start of the light cycle in the culture chamber, different treatments were applied to the fruits through the pedicel. All of the compounds that were tested in this trial were supplied in a MS solution. The concentration of SNP that was used in this assay corresponds to the maximal NO that was detected by the QCL analyzer, which corresponds to approximately 12 ppb with an SNP concentration of 0.5 mM as shown in fig 1.

-6 fruits were treated with 0.5 mM SNP, an efficient NO donor, to follow the action of NO;

-6 fruits were treated with 0.5 mM SNP + 1 mM 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5

tetramethylimidazoline-l-oxyl-3-oxide (cPTIO), an NO scavenger;

-6 fruits were treated with 1 mM 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5 tetramethylimidazoline-l-oxyl-3-oxide (cPTIO); and -6 control fruits were maintained in an MS solution.

Statistical analysis

The experiment was repeated three times, and the values that are presented are the mean derivatives of the three experiments. Each result is expressed as a mean with the standard error (± SE). The statistical significance was determined by heteroscedastic two-tailed Student's t-test (P<0.05) using the "R" 2.12.2 statistical software (www.cran.rproject.org).

RESULTS

Leaf and fruit water parameters

To investigate whether the inhibition of the morning water flow affected the water parameters of the plants, the fruit and leaf water potential were determined. For the control plants and plants under drought conditions, the fruit water potential (Ψ fruit ), fruit osmotic potential (FΨ O )

and fruit water content (FWC) remained unchanged (at P<0.05). The drought treatments induced a significant decrease only in the leaf water potential (Ψ leaf ) , and this decrease was correlated with the HgCl 2 concentrations (Table 1).

Leaf chlorophyll a fluorescence transients-JIP test

The chlorophyll a fluorescence transients (OJIP transients) were used to evaluate the damage of the leaf photosynthetic apparatus under water deficit during the treatment. As shown in

Quantum cascade laser (QCL)-based NO detection

The short-term water deficit induced an overproduction of NO in tomato leaves and fruits compared to that of the controls 24 h after the beginning the experiment, as shown in Fig. 1A-B. Both organs presented a gradual increase in NO emission with a significant burst in the middle of the dark period after the induction of the water stress. The NO production was higher during the night period. The presented results are those of the intermediate 5 ppm HgCl 2 treatment.

NO detection and localization by fluorescence microcopy

The involvement of NO in the plant response to water deficit was also investigated using fluorescence microscopy using the new NO probe NO 550 . In fruits, a generalized increase in green fluorescence has been detected in water stressed plants. Red fluorescence was detected in the chlorophyll-rich mature green fruits as in the leaves, stems and pedicels. Only certain cell types exhibited higher green fluorescence. We noticed a significant increase in the fluorescence in the outer epidermal cells of the pericarps [Fig. 2A(i

H 2 O 2 and MDA accumulation

Although short-term water deficit did not affect the water parameters of the fruits, we evaluated the oxidative stress in tomato plants. Therefore, we determined the H 2 O 2 contents, lipid peroxidation and the antioxidant status of fruits, pedicels and leaves.

In the fruit pericarps, a 133% increase in the H 2 O 2 content was observed between the controls and the 2-and 5-ppm-treated plants with no significant difference between the latter two.

However, a less significant increase was observed in the 10-ppm-treated pericarps, but the level was still 53% higher than that of the controls after 24 h (Table 3). After 24 h of treatment, the membrane lipid peroxidation levels remained constant in the fruit pericarp.

In the fruit pedicels that were exposed for 24 h, the 2, 5 and 10 ppm treatments increased the H 2 O 2 content by 91%, 172% and 227 %, respectively, compared to that of the controls. Regarding the MDA content, a 28% increase was observed with the 2 ppm treatment, and up to a 100% increase was observed in the 5 and 10 ppm treatments.

The H 2 O 2 content in the leaves was not significantly affected by the 2 ppm HgCl 2 exposure (at P<0.05) after 24 h. A 25% increase in the H 2 O 2 content was observed in the leaves of the plants that were treated with 5 and 10 ppm HgCl 2 (Table 3). After 24 h of treatment, the membrane lipid peroxidation levels remained constant in the fruits and leaves.

Chapitre 3-1 : Le mercure induit la synthèse de NO et ABA et l'activation du système de défense antioxydant dans le fruit de tomate

Antioxidant system in the fruit pericarps after rapid water deficit

In mature green fruits, the AsA and DHA concentrations were not affected by every water deficit treatment in the plants that were treated for 24 h (Table 4).

The AsA concentration of the leaves and fruit pedicels increased at all Hg concentrations except in the leaves of the plants that were treated by 2 ppm HgCl 2 for 24 h (Table 4). The DHA concentration in the leaves decreased at all Hg concentrations in the plants that were treated for 24 h (Table 4). In the fruit pedicels, the DHA concentration increased at all concentrations of Hg except at 2 ppm HgCl 2 in the plants that were treated for 24 h. The fruits from the drought-stressed plants exhibited increased SOD, CAT and APX activities under water deficit (Fig. 7A-B). The MDHAR, DHAR and GR activities also increased in every water deficit treatment (Fig. 7C-D).

ABA contents in the tomato plants after rapid water deficit.

As presented in (Fig. 8), the ABA content in the pericarps of the fruits increased by 33% during the water deficit treatments compared to that of the controls. In the pedicels, a twofold increase in the ABA concentration was measured in the plants under water deficit. In the leaves, the ABA content also increased significantly following water deficit compared to that of the controls.

Antioxidant system in the fruit pericarps after exogenous NO application

Compared to that of the control (C), the 0.5 mM SNP treatments caused an up to 14-fold increase in the APX activity after 4, 8, 12 and 24 h of treatment. The fruits that were treated with 0.5 mM SNP + 1 mM cPTIO (SNP + cPTIO) also had an increased APX activity after 4, 8 and 24 h. The C + cPTIO treatment presented an APX activity that was similar to that of the controls (refer to fig 9 .). The MDHAR activity in the fruits that were treated with 0.5 mM SNP increased after 4, 8

and 24 h. The SNP + cPTIO treatments presented a higher MDHAR activity than that of the controls after 4, 8, 12 and 24 h. The C + cPTIO treatments caused a decrease after 4 h and no significant difference for the remaining periods (refer to Fig. 9). The DHAR activity increased up to 12-fold compared to that of the C in the 0.5 mM SNP treatment after 4, 8, 12 and 24 h. The fruits that were in contact with SNP + cPTIO also had a higher DHAR activity after 4, 8 and 24 h of treatment. The C + cPTIO treatments displayed a similar DHAR activity as that of the control fruits (refer to Fig. 9). Ascorbate, the substrate for APX, also significantly decreased during the NO treatments, and the DHAR and MDHAR activities reached such high levels that the dehydroascorbate content was no longer detectable in those samples (table 5).

DISCUSSION

A rapid water deficit was achieved by mercury treatment

One of the challenges of this study was to create a rapid water stress to observe a short-term response, i.e., before complex adaptive mechanisms can set in. This issue is of paramount importance as far as NO is concerned because NO participates in many mechanisms. This challenge was overcome by blocking aquaporins and, consequently, the water flux due to root pressure using different concentrations of HgCl 2 early in the morning when the transpirational pull is minimal (Lopez et al., 2003;Maggio and Joly, 1995a). As shown here, a significant decrease in the water flux and leaf water potential Ψ leaf after 24 h of treatment was observed, suggesting that leaves were subjected to HgCl 2 -induced water deficit (Table 1). An analysis of photosystem II based on chlorophyll a OJIP transients did not present any change induced by the water deficit (Table 2).

These results suggest that the applied water deficit was so rapid that the photosynthetic apparatus was not affected. Furthermore, the fruit water potential (Ψ fruit ), fruit osmotic potential (FΨ O ) and fruit water content (FWC) were also not affected (Table 1).

The fruits were not directly affected by the water deficit but showed enhanced antioxidant activities

Oxidative damages in plant cells may occur as a consequence of the accumulation of ROS [START_REF] Foyer | Redox Homeostasis and Antioxidant Signaling: A Metabolic Interface between Stress Perception and Physiological Responses[END_REF]. The malonyldialdehyde (MDA) and H 2 O 2 concentrations were measured in the leaves, pedicels and fruit pericarps as indicators of oxidative stress (Mittler, 2002). We found that the water deficit increased the H 2 O 2 contents in the leaves, fruit pedicels and pericarps after 24 h (Table 2). However, the increase in the H 2 O 2 concentration that was observed in the fruit pericarps did not affect the lipid peroxidation, which remained constant. The modification of oxidative status could be explained by the increase in the activities of the antioxidant enzymes catalase and ascorbate peroxidase in the pericarp, which were able to limit the oxidative damage.

Furthermore, the absence of mercury in the fruits (data not shown) suggests that the activation of an antioxidative defense in the fruit is not a consequence of mercury cell contamination but arguably of the HgCl 2 -associated water deficit.

Water deficit induced an over production of NO in the fruits and leaves during the dark period

QCL-based detection revealed increased NO production during the night period both in the leaves and fruits, with a higher induction after water deficit. The increased production of NO in the absence of light could be explained by the capacity of nitrate reductase (NR) to produce NO in the Chapitre 3-1 : Le mercure induit la synthèse de NO et ABA et l'activation du système de défense antioxydant dans le fruit de tomate 83 presence of high nitrite concentrations in photosynthetic organisms as first demonstrated by (Sakihama et al., 2002). The reduction of nitrite by nitrite reductase (NiR) to ammonium ions (NH 4 + ) requires the reduced form of ferredoxin, which is provided by the photosynthetic electron transport system. Therefore, nitrite is not present in the cells at high concentrations under light conditions when photosynthesis produces the reducing equivalents. Therefore, the reduced production of NO during the light period could be explained by rapid nitrite consumption due to the NiR activity. The detection of NO in the chloroplasts [ Fig 2 A (vii).] further supports a possible chloroplastic source of NO.

Overproduction of NO was detected in tomato fruits, leaves and pedicels by fluorescence microscopy

Nitric oxide, one of the key reactive nitrogen species, is involved in various physiological and biochemical processes and plays a prominent role in the activation of various environmental stress responses in plant species [START_REF] Delledonne | Reactive oxygen intermediates modulate nitric oxide signaling in the plant hypersensitive disease-resistance response[END_REF]. We chose to follow its production using fluorescence microscopy and quantum cascade laser-based detection. We used the NO 550 probe instead of the widely used DAF-2-DA for fluorescence microscopy due to several problems with the latter, particularly including the oxidation of DAF-2-DA by ROS, which produces a free radical that can directly react with NO [START_REF] Jourd | Increased nitric oxide-dependent nitrosylation of 4,5-diaminofluorescein by oxidants: implications for the measurement of intracellular nitric oxide[END_REF]. Furthermore, other molecules, such as ascorbate and DHA, interact with DAF to produce fluorescent products (Zhang et al., 2002). NO 550 also has the advantage of a much higher specificity that is achieved via the assembly of the chromophore/fluorophore of the probe only upon contact with NO. Finally, NO 550 is completely pH-independent, which represents a significant advantage given the range of pH that is exhibited across different organs and cell compartments (Yang et al., 2010).

In and Fig 5 D(ii)] as previously described by (Gould et al., 2003). The trichomes are involved in the emission of isoprenes, terpenes, alkanes, alkenes, alcohols, esters, carbonyls and acids under normal [START_REF] Kesselmeier | Biogenic Volatile Organic Compounds (VOC): An Overview on Emission, Physiology and Ecology[END_REF][START_REF] Lin | Surface disposition and stability of pest-interactive, trichome-exuded diterpenes and sucrose esters of tobacco[END_REF][START_REF] Zador | The Biosynthesis of a Novel Nicotine Alkaloid in the Trichomes of Nicotiana stocktonii[END_REF]. As the trichomes are among the first organs known to respond to a biotic stress, namely during insect attack (Lin et al., 1987), our results suggest that the trichomes could also respond to abiotic stress and do so more specifically via an overproduction of NO. The presence of NO in guard cells [Fig. 6 E (iii)] has been reported in several studies, where NO was shown to be involved in their function along with other signalling molecules, such as ABA and H 2 O 2 (Bright et al., 2006;Corpas, 2004;García-Mata and Lamattina, 2003;Garcı á-Mata and Lamattina, 2002;Neill et al., 2002b).

Mechanisms that may explain the NO protective action against oxidative damage have been widely reported. First, NO might directly detoxify ROS, such as superoxide radicals, to form peroxynitrite, which is less reactive, thereby limiting cellular damage (Martinez et al., 2000).

Second, NO could function as a signalling molecule that activates cellular antioxidant enzymes (Huang et al., 2002;Shi et al., 2005). Contradictory data are present in the literature about NO action on antioxidant enzymes. NO has inhibitory effects on APX and CAT in tobacco leaves (Clark et al., 2000;[START_REF] Pinto | Hydrogen peroxide, nitric oxide and cytosolic ascorbate peroxidase at the crossroad between defence and cell death[END_REF], while it overexpresses different APX isoforms and induces their activities in barley seedlings and soybean roots nodules (Chen et al., 2010;[START_REF] Keyster | Nitric oxide increases the enzymatic activity of three ascorbate peroxidase isoforms in soybean root nodules[END_REF]. Furthermore, NO has a positive impact on SOD activity under NaCl stress in leaves [START_REF] Fan | Effects of exogenous nitric oxide on growth, active oxygen species metabolism, and photosynthetic characteristics in cucumber seedlings under NaCl stress[END_REF]. The enzymes DHAR, which is involved in the ascorbate cycle, and CAT also show an increase in activity after NO treatment under Fe deficiency [START_REF] Ding | Exogenous Nitric Oxide Alleviated the Inhibition of Photosynthesis and Antioxidant Enzyme Activities in Iron-Deficient Chinese Cabbage (Brassica chinensis L.)[END_REF]. An increase in the ascorbate levels in rice and sunflower leaves was also reported by [START_REF] Hsu | Cadmium toxicity is reduced by nitric oxide in rice leaves[END_REF] and Laspina et al. (2005) after NO application.

Rapid water deficit increased the ABA concentration

The increase in the ABA concentration in the leaves (Fig 8) is consistent with the literature.

It has been repeatedly shown that ABA is involved as a secondary messenger capable of inducing antioxidant defenses under water deficit (Chinnusamy et al., 2008;Christmann et al., 2007;Hubbard et al., 2010;Kim et al., 2010). The ABA concentration may also increase in the fruit pedicels and pericarps and play an important role during osmotic stress in plants [START_REF] Anderson | Differential Gene Expression in Chilling-Acclimated Maize Seedlings and Evidence for the Involvement of Abscisic Acid in Chilling Tolerance[END_REF]Bellaire et al., 2000;[START_REF] Bueno | Expression of antioxidant enzymes in response to abscisic acid and high osmoticum in tobacco BY-2 cell cultures[END_REF]Chinnusamy et al., 2008;Hubbard et al., 2010;Jiang and Zhang, 2001;Kim et al., 2010;[START_REF] Prasad | Acclimation, Hydrogen Peroxide, and Abscisic Acid Protect Mitochondria against Irreversible Chilling Injury in Maize Seedlings[END_REF]. Moreover, it was recently established that NO and ABA are closely associated in numerous plant functions as reviewed by (Hancock et al., 2011) (Bright et al., 2006;[START_REF] Desikan | ABA, hydrogen peroxide and nitric oxide signalling in stomatal guard cells[END_REF]Neill et al., 2002c). As reviewed in (Yu et al., 2014), it has been suggested that after water stress, ABA accumulates, leading to the activation of NADPH oxidases, namely RBOHD and RBOHF (respiratory burst oxidase homolog D and F, respectively), resulting in ROS production (Bright et al., 2006;Kwak et al., 2003). The H 2 O 2 that is generated by this oxidative burst is thought to stimulate NO synthesis via the enzyme nitrate reductase (NR) [START_REF] Desikan | A new role for an old enzyme: Nitrate reductasemediated nitric oxide generation is required for abscisic acid-induced stomatal closure in Arabidopsis thaliana[END_REF], possibly requiring Arabidopsis thaliana nitric oxideassociated protein 1 (AtNOA1) (Bright et al., 2006). NO has been proposed to activate mitogen activated protein kinase (MAPK) signalling cascades, inducing stomatal closure (Zhang et al., 2007). The activation of MAPK by NO can also upregulate the expression of genes encoding antioxidant enzymes as proposed by (Lamattina et al., 2003) and (Lu et al., 2009).

Water deficit induced an enhancement of the antioxidant enzymes in the tomato fruits

Because the susceptibility to oxidative stress is a function of the overall balance between the production of oxidants and the antioxidant mechanisms [START_REF] Foyer | Photooxidative stress in plants[END_REF], we analyzed the activity of antioxidant enzymes and the ascorbate content in the fruits that were harvested from plants that were submitted to water deficit treatments. After 24 h, an increase in the SOD activity in the treated fruits was observed at all of the HgCl 2 concentrations compared to that of the control fruits (Fig. 7A). This increase in the SOD activity may be considered circumstantial evidence for the enhanced production of ROS in the fruit cells. The increase in the CAT activity (Fig. 7B) is consistent with the requirement to eliminate the H 2 O 2 that is produced by the enhanced SOD activity during drought treatments.

The activity of APX, which is able to scavenge the H 2 O 2 that is produced by SOD and is involved in the ascorbate-glutathione cycle, also increased during water stress (Fig. 7B). This increase in the APX activity with the water deficit treatments agrees with the observations of mung beans by [START_REF] Shaw | Effects of mercury and cadmium on the activities of antioxidative enzymes in the seedlings ofPhaseolus aureus[END_REF] related to the role of APX in the detoxification of H 2 O 2 . The increase in the activities of SOD, CAT and APX in the fruits of tomato plants that were grown under water stress provides circumstantial evidence for the tolerance mechanisms that were developed by the plant.

The increase in the CAT and APX activities in the fruits may indeed contribute to lowering the H 2 O 2 and consequently MDA contents in the fruits. The APX detoxification involves the enzymes MDHAR, DHAR and GR [START_REF] Ishikawa | Progress in manipulating ascorbic acid biosynthesis and accumulation in plants[END_REF]. We observed that the MDHAR activity increased markedly (Fig. 7C), suggesting that the AsA regeneration by MDHAR increases as a consequence of water deficit. The DHAR activity was higher in the fruits that were treated with each HgCl 2 concentration than that of the control fruits (Fig. 7D), suggesting that the water deficit stimulates with what is known about the functioning of the ascorbate-glutathione cycle, glutathione reductase, which regenerates GSSH into reduced glutathione (GSH), presents an increased activity as a consequence of water stress (Fig. 7D). Furthermore, our observations indicate that antioxidant enzymes are the first line of defense during a rapid water deficit and that AsA participates in longer adaptation mechanisms as indicated by (Murshed et al., 2013).

In conclusion, in this study, we demonstrated an overproduction of NO and ABA in tomato fruits in response to a rapid water deficit. We also noticed changes in the oxidative parameters (H 2 O 2 and MDA contents) and in the antioxidant systems, enzymatic (SOD, APX, MDHAR, DHAR, GR and CAT) and non-enzymatic (AsA and DHA), with the short-term water deficit. These results indicate that water deficit quickly caused a change in oxidative status in the tomato plants.

Modification of antioxidant enzyme system in the fruits indicates that NO and/or ABA signalling pathways could participate to maintain fruit ROS homeostasis. This hypothesis has been partly confirmed by the increase in the activities of the antioxidant enzymes that are involved in ascorbate recycling after exogenous NO application. However, further study involving exogenously applied ABA or even H 2 O 2 may help shed additional light on this complex signalling network. Table S1 : Listing of the JIP-test parameters used in the present study with explanations and formulae calculated using data extracted from the fluorescence transient.

Introduction

Environmental stresses may positively affect plants physiology by stimulating their defence mechanisms (Fujita et al., 2006;Murshed R, 2008a;[START_REF] Tattini | Differential accumulation of flavonoids and hydroxycinnamates in leaves of Ligustrum vulgare under excess light and drought stress[END_REF]. Many studies have been conducted on this particular topic with the objective of enhancing global plant metabolism and ultimately crop production (Beckers and Conrath, 2007;Conrath et al., 2002). Survival under stressful conditions depends on the plant's ability to perceive the stimulus, generate and transmit a signal in order to induce various chemical and physiological changes (Bohnert and Jensen, 1996;Métraux et al., 1990;[START_REF] Ksak | Gene Expression and Signal Transduction in Water-Stress Response[END_REF]. The first evidence of a systemic signalling during an abiotic stress was presented by (Karpinski et al., 1999) in Arabidopsis thaliana during a photooxidative stress. This hypothesis was also supported by (Poiroux-Gonord et al., 2013) who observed that antioxidant metabolism, and both the primary and secondary metabolisms are influenced in the pulp of orange fruits when photooxidative stress is imposed to nearby leaves.

Furthermore we observed in a previous study that a rapid water deficit was capable of inducing water stress symptoms in tomato leaves without affecting the water status of fruits (under review). Oxidative stress symptom like lipid peroxidation was observed in all organs with the exception of fruits and they presented enhanced activity of antioxidant enzymes as well as increased concentrations in NO, ABA and H 2 O 2 . Here, we hypothesize that the stimulation of antioxidant mechanisms in fruit pericarp from drought-stressed plants involves at least one of these molecules. So far, ROS (especially H 2 O 2 ) have emerged as being the best candidate in the mediation of such signals (Mittler et al., 2011) but recently other molecules like abscisic acid (ABA) and nitric oxide (NO) have emerged as potent stress sensors and coordinators of stress responses (Baudouin, 2011;Hancock et al., 2011;Lu et al., 2009;Raghavendra et al., 2010). Furthermore besides H 2 O 2 and O 2 -, ABA (Tuteja, 2007b) and NO (Corpas et al., 2001) were also found to play important roles in the mediation of antioxidant responses to both biotic and abiotic stresses in plants.

In addition to causing or exacerbating cellular damage, ROS can act as ubiquitous signal molecules in higher plants, either directly or indirectly, through the shifts in redox status they provoke. ROS are indeed central components in stress responses. ROS accumulation is sensed as an alarm signal that initiates preemptive defense responses. ROS serve an important signalling function, providing information about changes in the external Chapitre 3-2 : ABA, H 2 O 2 et NO influent sur les systèmes de défense antioxydants de fruits détachés de tomate 107 environment (Foyer and Shigeoka, 2011). There is compelling evidence about the biological activity of ROS and more specifically of H 2 O 2 as a signal molecule in plants (Dat et al., 2000;Overmyer et al., 2003;Hung et al., 2005). Available information suggests that H 2 O 2 directly regulates the expression of numerous genes, some of which are involved in plant defenses, including those encoding antioxidant enzymes and modulators of H 2 O 2 production (Kovtun et al., 2000), as well as of signaling proteins such as kinase, phosphatase, and transcription factors (Møller and Sweetlove, 2010;Mubarakshina et al., 2010).

ABA is a plant stress hormone and an important signalling molecule that plays a plethora of roles in regulating plant adaptive responses to various environmental stresses [START_REF] Cutler | Abscisic Acid: Emergence of a Core Signaling Network[END_REF]. ABA participates in diverse physiological and developmental processes from the whole plant (Zhang and Davies, 1991) to the cellular level [START_REF] Ksak | Gene Expression and Signal Transduction in Water-Stress Response[END_REF]. It has been suggested that the stress-induced up-regulation of antioxidant enzyme activity involves both an ABA-dependent and an ABA-independent pathway (Bellaire et al., 2000). Although the mechanism of induction of antioxidant enzymes by ABA has not yet been elucidated, several studies suggest that ABA induces the production of other signalling molecules such as H 2 O 2 and NO, which in turn stimulates the activity of antioxidant enzymes (Jiang and Zhang, 2003;Zhang et al., 2007;Zhang et al., 2006a;Zhou et al., 2005).

NO is a molecule which has attracted much attention during the last decade. It is believed to act as a signal molecule mediating responses to both biotic and abiotic stresses in plants (Mur et al., 2013;Neill et al., 2008;Wendehenne et al., 2004;Wendehenne et al., 2001). Several studies suggest that NO plays a role in protecting plants from oxidative stress (Beligni and Lamattina, 1999;Correa-Aragunde et al., 2008;Garcı á-Mata and Lamattina, 2001;Martin et al., 2009;Tossi et al., 2009). Given the essential role of NO in stress adaptation, it is likely that this highly reactive and diffusible gaseous molecule affects the transcription of numerous genes related to defence [START_REF] Addicott | History and introduction[END_REF]Polverari et al., 2003).

Furthermore NO can also directly interact with H 2 O 2 and O 2 -with the effect of producing the lesser reactive peroxynitrite (Neill et al., 2003). Furthermore, peroxynitrite may behave as a potent modulator of signal transduction pathways by influencing the activity of tyrosinenitrated proteins (Vandelle and Delledonne, 2011).

Plants cannot escape and have to adapt to water shortage. Responses vary from rapid physiological adjustments allowing for temporary survival, to long-term biological adaptations. Enhancement of antioxidant enzymes associated with the ascorbate cycle, namely water stress. In this study we are dealing with rapid physiological responses and the involvement of specific signalling molecules. A pharmacological study using detached tomato fruits was conducted to determine involvement of NO, ABA and H 2 O 2 . We targeted fruits because as exposed by [START_REF] Fanciullino | Carotenoid responses to environmental stimuli: integrating redox and carbon controls into a fruit model[END_REF], the production of reactive oxygen species associated with stress can directly or indirectly exert a positive effect on the secondary metabolism of plants. Such a mechanism could be exploited even for fruit crops which represent a major source of phytochemicals (Davey et al., 2000), including ascorbate which is essential to humans who have lost the capacity to synthetize it.

Materials and Methods

Plant material and growing conditions

Culture of tomato fruits

Fruits at the mature green stage (MG) were harvested between 9 and 10 a.m. and the pedicel of each fruit was put in a Murashige and Skoog basal medium (MS) containing 4 % sucrose. We ensured that the pedicel was in close contact with the culture medium. The cultures were placed at 25/20°C for 24h for adaptation, under cool white fluorescent lamps providing 300 µmol photons.m -2 .s -1 . The following day, two hours after the start of the light cycle in the culture chamber, different treatments were applied to the fruits through the pedicel. All the compounds tested in this trial were supplied in a MS solution. Preliminary tests have been conducted to choose doses close to natural physiological concentrations. For each condition, MG fruits were harvested from 6 different plants randomly distributed in the green house, and after treatment immediately frozen in liquid nitrogen and ground. The powder was stored at -80°C. Pericarp tissue of the harvested fruits was obtained by removing the locule tissues and seeds. Fruits used for microscopic investigations were immediately examined after the different treatments.

Determination of ascorbate and dehydroascorbate contents

Total ascorbate (AsA + DHA) and dehydroascorbate (DHA) contents were measured following the method of (Murshed et al., 2013a, b). A 0.25 g sample of frozen tomato fruit powder was homogenized in 1 mL of cold 6 % (w/v) trichloroacetic acid (TCA). The homogenate was centrifuged at 16000 × g for 15 min at 4 °C. The supernatant was used for total ascorbate and AsA determination.

Determination of antioxidant enzyme activities

Protein extraction was performed according to (Murshed et al., 2008). Frozen fruit powder (250 mg) was homogenized at 4°C in 1 ml of 50 mM MES/ KOH buffer (pH 6.0), containing 40 mM KCl, 2 mM CaCl 2 , and 1 mM AsA. The homogenate was centrifuged at 16 000 g for 15 min at 4°C, and the supernatant was used immediately for enzyme activity assays. Proteins were quantified using Bradford's method (1976). °C, using a micro-plate reader. APX, DHAR and MDHAR activities were measured as described by (Murshed et al., 2008).

Determination of hydrogen peroxide content

Frozen powder (150 mg) was directly homogenized with 1 ml of solution containing 0.25 ml trichloroacetic acid (TCA) (0.1% (w:v)), 0.

Determination of abscisic acid content

Free ABA content was determined using the Phytodetek competitive Enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) kit (Agdia, Elkhart, In, USA). We followed the manufacturer's instructions. Frozen tissue powder (100 mg) was extracted with 1 mL TBS buffer solution for 10 min in ice and centrifuged at 15000 x g for 15 min at 4°C. Then, the supernatants were diluted in TBS buffer and analysed for free ABA using the immunological ABA assay.

NO imaging by fluorescence microscopy

After the different treatments, regular pieces of about 10 mm x 4 mm x 4 mm were taken from the pericarp. Tissue pieces were incubated in the dark at 25°C for 1 hour in 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) containing 10 µM of the specific membrane permeable NO 550 probe (Yang et al., 2010). The tissue pieces were then rinsed twice in the buffer solution and free hand sections were taken with a razor blade under subdued light. The sections were mounted (Corpas, 2004), and immediately examined under epifluorescence using a Leica DM2000 light microscope, equipped with a I3 filter (blue light excitation at 450-490 nm; emission 520 nm). Sections incubated in 10 mM

Tris-HCl alone served as negative controls. All images were captured using a Leica DF300X digital camera at ×20 and three different sections were analysed for each fruit or leaf (n = 9).

Linear levels were adjusted in all images using a public domain Java image processing program ImageJ 1.43 version (Maryland, USA) (Patakas et al., 2010).

Quantum cascade lasers (QCL) based detection

NO production was followed using a Quantum cascade laser (QCL) based sensor (Mandon et al., 2012) developed at the Radbound University (Life Science Trace Gas Facility) in the Netherlands. The sensor includes a QCL emitting 5 µm light, a multipass-cell and a room-temperature light detector. The emission wavelength of the laser was chosen to probe a strong ro-vibrational absorption line of NO. The laser is maintained at -25°C by a

Peltier cooler and delivers a continuous output power of 10 mW. The gas sample to analyse is suck by the system into the multipass-cell at a flow rate of 1 l/h. In the cell, the sample is interacting with the light producing multiple reflexions in order to increase the interaction distance to 76 m. The concentration of NO is determined by measuring the amount of light absorbed by the sample with a detection limit of 0.5 ppbv. Before measurements, the system was calibrated with a standard of 100 ppbv NO in N 2 .

The measurements were performed for 24 h (16 h/8 h day/night cycle) under cool white fluorescent lamps supplying 300 µmol photons.m -2 .s -1 . Measurements were performed on 0.05mM SNP, 0.5mM SNP and SNP + cPTIO treatments conditioned in MS solution with the objective of measuring the production of NO by 0.05 mM SNP compared to 0.5 mM SNP.

Statistical analysis

All data presented represent means of 6 repetitions by treatment. Measurements were repeated 3 times. The results are expressed as means ± standard error (SE). Statistical significance was determined by heteroscedastic two tailed Student t-test (P<0.05) using "R" 2.12.2 statistical software (www.cran.rproject.org). To detect NO by fluorescence microscopy, we have chosen to use NO 550 probe instead of the widely used DAF-2-DA because of several problems assigned to the latter.

Results and discussion

More specifically, the oxidation of DAF-2-DA by ROS may result in the production of a free radical that can directly react with NO [START_REF] Jourd | Increased nitric oxide-dependent nitrosylation of 4,5-diaminofluorescein by oxidants: implications for the measurement of intracellular nitric oxide[END_REF]. Furthermore other molecules like ascorbate and DHA were also shown to interact with DAF to give fluorescent products (Zhang et al., 2002). NO 550 has also the advantage of showing a much higher specificity than DAF-2-DA, which results from the fact that the chromophore and fluorophore of the probe assemble only upon contact with NO. Finally NO 550 is completely pH-independent which represents a significant advantage given the range of pH exhibited in different organs or even cell compartments (Yang et al., 2010). We observed an increase of fluorescence in the outer and inner epidermal cells of the pericarp after treatments with ABA and H 2 O 2 compared to the controls (refer to figure 7A-B). A noticeable increase in fluorescence was also observed around vascular tissues and parenchyma cells after ABA and H 2 O 2 treatments (refer to figure 7C). The placental tissues and columella also displayed an increase in fluorescence at the level of the inner epidermal cells and vascular tissues in presence of ABA and H 2 O 2 (refer to figure 7D-E). In all cases H 2 O 2 treatments caused a more important increase in fluorescence than ABA. In presence of cPTIO in addition to ABA or H 2 O 2 a noticeable decrease in fluorescence was observed in all these regions. A close relationship was revealed between ABA, H 2 O 2 and NO. Recent studies have shown that during water deficit, the overproduction of ABA may result in the activation of NADPH oxidases increasing H 2 O 2 production which may ultimately activate nitrate reductase enzymes responsible of NO production (Yu et al., 2014). To explain our observations, it may be hypothesized that H 2 O 2 induced greater NO production by acting directly on NR compared to ABA which has to pass through a supplemental step through the activation of NADPH oxidases.

Ascorbate recycling is positively influenced by NO treatment

NO, one of the key reactive nitrogen species, is involved in various physiological processes and plays a prominent role in the activation of various environmental stress responses in plant species (Delledonne et al., 2001). NO can counteract oxidative damage and has a protective effect against a large range of stressful conditions (Beligni andLamattina, 2001, 2002;Lin et al., 2011). Two mechanisms that may explain NO protective action against oxidative damage have been widely reported. Firstly, NO might detoxify ROS directly, such as superoxide radicals, to form peroxynitrite, which is less toxic and thus less damaging to cells (Martinez et al., 2000). Secondly, NO acts as a signalling molecule, which activates cellular antioxidant enzymes (Baudouin, 2011;Huang et al., 2002;Shi et al., 2005).

Treatments with the NO donor (SNP) resulted in an increase in APX, MDHAR and DHAR activity (figures 2-4). This observation is in agreement with earlier observations showing that exogenous supply of NO provides resistance to a large range of abiotic stresses (Delledonne et al., 2001;Singh et al., 2009). A sharp increase, up to 18 times, in APX activity was detected after NO treatments. The most substantial increase was measured in the middle of the light period, after 8 hours of treatment, and it gradually decreased until 24 hours (figure 2(i)).

This sequential response to NO is consistent with the observations made by (Agrawal et al., 2003) on APX2 gene in rice seedlings (OSAPX2). The activation of APX by NO was further confirmed by the marked decrease in H 2 O 2 content we observed after 8 and 12 hours of NO treatment. Ascorbate, the substrate for APX, also significantly decreased during NO treatments and DHAR and MDHAR activities reached such high levels that dehydroascorbate content was not detectable in those samples. Our observation is consistent with similar observations of a stimulating effect of NO on APX activity made in barley seedlings and sunflower leaves exposed to Cadmium Chloride (CdCl 2 ) (Chen et al., 2010;Laspina et al., 2005). Nevertheless our observations stay in contrast with the observations of (Clark et al., 2000) who observed an NO-associated decrease in APX activity in tobacco plants. MDHAR activity was also strongly influenced by NO and followed the same trend than APX (figure 2(a)) and DHAR enzyme activity increased up to 12 times, when compared to C, with nitric oxide treatment. Our results are in agreement with those of [START_REF] Xie | Carbon monoxide enhances salt tolerance by nitric oxide-mediated maintenance of ion homeostasis and up-regulation of antioxidant defence in wheat seedling roots[END_REF] who also found a stimulating effect of NO on MDHAR and DHAR activities. The lower activity of all three enzymes in fruits treated with SNP + cPTIO (NO donor and scavenger simultaneously) and the observation that the activities returned to normal level in MS + cPTIO supports the hypothesis that NO enhances the up regulation of antioxidant enzymes (figures 2(a), 3(a) and 4(a)).

By contrast to H 2 O 2 , NO did not affect ABA content in detached fruits

As no significant difference in the ascorbate recycling between the two SNP concentrations was observed, only 0.05mM SNP was applied in the experiment with the objective of reaching reach NO concentrations normally present in plant tissues in response to water deficit (personal communication). As shown in figure 5(a) 0.05mM SNP and SNP + cPTIO had no significant impact on ABA content in the fruits. Fruits treated with exogeneous ABA presented higher ABA concentrations confirming the entry of the hormone [figure 1 breakdown and the stimulation of the activity of antioxidant enzymes. This is consistent with the idea that up-regulation of antioxidant enzyme activities by stress may be controlled by an ABA-dependent signal transduction pathway and that this pathway is regulated by ROS concentration (Bellaire et al., 2000) and namely through the activation of NAPDH oxidases (Yu et al., 2014). Within the same line of thinking, it has been suggested that ABA may act, among others, by generating oxidative stress in plant cells. ABA can indeed be at the origin of an increase in the production of superoxide ions (O2 .-) (Jiang and Zhang, 2001) and H2O2 (Guan et al., 2000).

H 2 O 2 positively impacted antioxidant enzymes

The capacity of H 2 O 2 to act as an intracellular signaling molecule is illustrated by its role in the systemic response of plants to excess light (Karpinski et al., 1999), pathogens (Bolwell, 1999) and physical damage (Orozco-Cárdenas et al., 2001). H 2 O 2 acts as a stress signal at low concentrations and has a proven role in modulating gene expression (Mittler et al., 2011;Møller and Sweetlove, 2010). For instance, it has been observed that exogenous application of H 2 O 2 together with ABA increases chilling tolerance in mung beans (Yu et al., 2003). In acclimation studies conducted by (de Azevedo Neto et al., 2005), it has been found that addition of H 2 O 2 to the nutrient solution results in increased salt tolerance in maize 3 (c), 4 (c)]. We eventually observed an important increase in NO production in the presence of H 2 O 2 through microscopic observations using the fluorescent probe NO550 (refer to figure 7A-E). This strongly supports the hypothesis that H 2 O 2 serves as the early transduction molecule that switches "on"

antioxidants in response to environmental stress. The H 2 O 2 -induced up-regulation of antioxidant enzyme activity was not only rapid, it was also sustained for 24 hours [figure 2 (c), 4(c)].

In this study we have shown that there is a close interaction between signalling molecules; NO, ABA and H 2 O 2 , in the maintenance of fruit homeostasis namely through the activation of antioxidant enzymes involved in ascorbate recycling (APX, MDHAR and DHAR). Additional research is required for elucidating the mechanism of each pathway with more details. The first part of this study is currently being carried out by our team through a microarray experiment with detached fruits treated with NO and under water deficit. (a) 0.5 mM SNP, 0.05 mM SNP, MS + 1 mM cPTIO and 0.5 mM SNP + 1 mM cPTIO for 4h, 8h, 12h and 24h.

(b) 0.1 mM ABA, MS + 1 mM cPTIO and 0.1 mM ABA + 1 mM cPTIO for 4h, 8h, 12h and 24h.

(c) 0.5 mM H 2 O 2 , MS + 1 mM cPTIO and 0.5 mM H 2 O 2 + 1 mM cPTIO for 4h, 8h, 12h and 24h.

Values are expressed as means with standard error (± SE) and different letters indicate significant differences according to heteroscedastic two tailed Student t-test (P<0.05). Le sous chapitre 3-3 présente les résultats préliminaires de l'analyse transcriptomique de la réponse de fruits de tomates détachés après un traitement à l'oxyde nitrique et à un déficit hydrique.

Nos précédentes études indiquent qu'au cours d'un déficit hydrique rapide, le système antioxydant dans les fruits peut être induit même en absence de symptôme de stress hydrique dans ces derniers. Nous avons également montré que le NO est induit en réponse au déficit hydrique et qu'il pourrait participer au maintien du statut redox dans les fruits de tomate.

L'objectif de la présente étude était de déterminer les gènes induits par NO dans les fruits de tomates d'une part et par le déficit hydrique d'autre part afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la signalisation NO dans le fruit en réponse au stress. ydrique travers de la surexpression de la tomato P69 au cours d'attaques de pathogènes [START_REF] Jordá | A Genomic Cluster Containing Four Differentially Regulated Subtilisin-like Processing Protease Genes Is in Tomato Plants[END_REF][START_REF] Vartapetian | A plant alternative to animal caspases: subtilisin-like proteases[END_REF]. Le monoterpène synthase 1 (MTS1) a été surexprimé de façon égale dans les deux traitements. Cette enzyme est impliqueé dans la voie de synthèse de terpénoïdes qui sont impliqués dans un nombre important de fonctions physiologiques. Les terpénes entrent dans la composition de certains phytohormones tels que les gibbérellines (GAs), l'ABA, les strigolactones et les cytokinines [START_REF] Chen | The family of terpene synthases in plants: a mid-size family of genes for specialized metabolism that is highly diversified throughout the kingdom[END_REF]. Les terpènes sont aussi la première ligne de défense des végétaux contre les attaques de d'herbivores et de pathogènes [START_REF] Miller | Insect-Induced Conifer Defense. White Pine Weevil and Methyl Jasmonate Induce Traumatic Resinosis, de Novo Formed Volatile Emissions, and Accumulation of Terpenoid Synthase and Putative Octadecanoid Pathway Transcripts in Sitka Spruce[END_REF].

Résultats et discussion

Sand et Ef comme gène de référence

La précision et fiabilité des résultats obtenus par la mesure de l'expression de gènes en qPCR en temps réel nécessite, de prendre diverses précautions lors des étapes de pré et poste mesures listées dans le guide MIQE [START_REF] Bustin | The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments[END_REF]. Parmi elles, le choix d'un gène de référence stable pour calculer la mesure relative de l'expression de gènes d'intérêt apparait être un prérequis indispensable afin d'éviter les erreurs d'interprétation des résultats pouvant être liés à des biais d'expérimentations (Vandelsomple et al., 2002 ;[START_REF] Bustin | The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments[END_REF].

Dans ces conditions cinq gènes de références potentiels ont été évalués : 2 gènes de références Les résultats d'expression en temps réel des gènes de référence obtenus dans les différentes conditions de l'expérimentation ont été soumis à 2 logiciels de traitements de données GeNorm (Vandesompele et al., 2002a) et Normfinder [START_REF] Andersen | Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets[END_REF] [START_REF] Brunner | Validating internal controls for quantitative plant gene expression studies[END_REF][START_REF] Hruz | RefGenes: identification of reliable and condition specific reference genes for RT-qPCR data normalization[END_REF]. De plus l'utilisation d'un seul gène de référence a souvent été critiquée du fait du peu de stabilité des gènes de références et de la grande source d'erreur générée par l'utilisation d'un seule gène de référence non validé (de l'ordre de 3 fois dans 25 % des cas voir 6 fois dans 10 % des cas) (Vandesompele et al., 2002b Les résultats expérimentaux sont discutés dans le texte qui suit afin de mettre en évidence les stratégies de réponse au stress oxydant provoqué par un déficit hydrique chez les fruits de tomate.

Un des défis de cette étude, était de provoquer un stress hydrique rapide afin de pouvoir suivre la réponse de la plante avant que les mécanismes adaptatifs ne se mettent en place. Ce critère nous semblait d'importance capitale car le NO ainsi que l'ABA participent dans un grand nombre de mécanisme biologique chez les végétaux [START_REF] León | Diverse functional interactions between nitric oxide and abscisic acid in plant development and responses to stress[END_REF]. Ce défi a été relevé en inhibant l'activité des aquaporines avec du chlorure de mercure (HgCl 2 ), et par conséquence l'absorption et le flux d'eau assurés par la poussée racinaire (Lopez et al., 2003;Maggio and Joly, 1995) [START_REF] Rockel | Regulation of nitric oxide (NO) production by plant nitrate reductase in vivo and in vitro[END_REF]. A l'obscurité, l'activité de la nitrite réductase responsable de la réduction du nitrite, est fortement amoindrie à cause du manque de ferrédoxine apporté par la photosynthèse. L'augmentation de la production de NO pourrait s'expliquer par l'accumulation de nitrite qui est essentiel pour la NR dans la production de NO (Sakihama et al., 2002). Qui plus est la détection de NO au niveau chloroplastique par microscopie à fluorescence supporte d'avantage cette source potentielle de NO. L'étude microscopique de nos échantillons nous a aussi révélé la présence de NO au niveau des faisceaux vasculaires, ce qui va dans le sens de (Corpas et al., 2004a) Corpas et al., (2004) qui suggère une signalisation à longue distance par le NO au travers des vaisseaux conducteurs. Nous avons aussi détecté une induction de NO dans les cellules des trichomes, qui sont parmi les premiers à répondre à des attaques d'insectes (Lin et al., 1987) suggérant une possible intervention de ces derniers également au cours de stress hydrique.

Nous avons aussi noté une surproduction de NO dans les cellules de garde où il a été démontré que le NO agissait en synergie avec l'ABA et le H 2 O 2 dans leurs fonctionement (Bright et al., 2006;García-Mata and Lamattina, 2003;Neill et al., 2002). Au cours de notre étude, nous avons constaté une forte augmentation de l'activité des enzymes antioxydantes suite à un traitement au NO. Cependant, il y a des données contradictoires dans la littérature sur l'effet du NO. Clark et al., (2000) et [START_REF] Pinto | Hydrogen peroxide, nitric oxide and cytosolic ascorbate peroxidase at the crossroad between defence and cell death[END_REF] déclarent que le NO a un effet inhibiteur sur l'activité de l'APX et la CAT chez le tabac alors que Chen et al.,(2010) et [START_REF] Keyster | Nitric oxide increases the enzymatic activity of three ascorbate peroxidase isoforms in soybean root nodules[END_REF] indiquent le contraire chez des plantules de blé et des nodules de Soja. L'augmentation de la concentration d'ABA dans les feuilles suite au traitement de déficit hydrique, est en accord avec de précédentes études (Chinnusamy et al., 2008;Christmann et al., 2007;Hubbard et al., 2010;Kim et al., 2010). Il est maintenant établi que le NO et l'ABA sont intimement liés dans un nombre important de fonctions physiologiques chez les végétaux (Hancock et al., 2011) L'utilisation de mutants nitrate réductase, nia, pourrait être utile afin de confirmer l'implication de cette enzyme dans la synthèse du NO. Le cultivar Micro-Tom présente l'avantage de posséder une quantité relativement importante de mutants [START_REF] Carvalho | Convergence of developmental mutants into a single tomato model system: 'Micro-Tom' as an effective toolkit for plant development research[END_REF]. Ces mutants pourraient permettre de mieux comprendre les interactions existantes entre le NO, et les phytohormones et aider dans le déchiffrement de la voie de biosynthèse du NO. De plus, étant donné la précision de détection de la méthode mise en place par l'équipe du Trace Gas Facility de l'Université de Radbound, il serait intéressant de retourner faire des mesures de NO sur ces mutants et sur une autre variété de tomate commerciale.

L'analyse du transcriptome montre que le NO induit très peu de gènes dans le fruit de tomate. La régulation par le NO étant majoritairement de nature post transcriptionnelle, il serait intéressant de poursuivre les travaux pour identifier les protéines régulées par le NO via la nitrosylation et nitratation par une analyse protéomique en interaction avec l'ABA et H 2 O 2 . Ces dernières pourraient être complétées par une analyse transcriptomique de nouvelle génération ("nextgeneration sequencing technologies", [START_REF] Metzker | Sequencing technologies -the next generation[END_REF]); un outil qui pourrait s'avérer particulièrement puissant pour les analyses d'expression compte tenu de la connaissance du génome de la tomate (International Tomato Sequencing Project, http://solgenomics.net/). Toutes ces études pourraient apporter des réponses sur le mécanisme de signalisation par le NO (son transport, ces cibles et son mode d'action). L'acide abscissique, l'éthylène, le statut oxydatif et les conditions environnementales jouent un rôle clé dans la maturation des fruits climactériques. Etant donné que l'oxyde nitrique interagit avec ces quatre composantes, on peut se demander quel est le rôle de l'oxyde nitrique dans le contrôle de la maturation des fruits. Cet axe de recherche est à développer chez la tomate et d'autres fruits modèles et pourra contribuer à l'amélioration de la gestion de la maturation des fruits en post-récolte.

Etant donné que nous avons noté une forte augmentation de la concentration en NO pendant la nuit en réponse au déficit hydrique, il serait intéressant de déterminer plus en détail son origine (localisation cellulaire, enzyme impliquée...) pendant cette période. Pour cela, il serait d'abord judicieux de valider l'implication de la nitrate réductase en suivant son activité en réponse aux traitements et ceci pendant les phases obscures et lumineuse de la photopériode.

L'utilisation de mutants nitrate réductase, nia, pourrait être utile afin de confirmer l'implication de cette enzyme dans la synthèse du NO. Le cultivar Micro-Tom présente l'avantage de posséder une quantité relativement importante de mutants [START_REF] Carvalho | Convergence of developmental mutants into a single tomato model system: 'Micro-Tom' as an effective toolkit for plant development research[END_REF]. Ces mutants pourraient permettre de mieux comprendre les interactions existantes entre le NO, et les phytohormones et aider dans le déchiffrement de la voie de biosynthèse du NO. De plus, étant donné la précision de détection de la méthode mise en place par l'équipe du Trace Gas Facility de l'Université de Radbound, il serait intéressant de retourner faire des mesures de NO sur ces mutants et sur une autre variété de tomate commerciale.

L'analyse du transcriptome montre que le NO induit très peu de gènes dans le fruit de tomate. La régulation par le NO étant majoritairement de nature post transcriptionnelle, il serait intéressant de poursuivre les travaux pour identifier les protéines régulées par le NO via la nitrosylation et nitratation par une analyse protéomique en interaction avec l'ABA et H 2 O 2 . Ces dernières pourraient être complétées par une analyse transcriptomique de nouvelle génération ("nextgeneration sequencing technologies", [START_REF] Metzker | Sequencing technologies -the next generation[END_REF]); un outil qui pourrait s'avérer particulièrement puissant pour les analyses d'expression compte tenu de la connaissance du génome de la tomate (International Tomato Sequencing Project, http://solgenomics.net/). Toutes ces études pourraient apporter des réponses sur le mécanisme de signalisation par le NO (son transport, ces cibles et son mode d'action).

M61914

Threonine deaminase (Td

  Chla* = Chlorophylle a excitée Chlb = Chlorophylle b CuZnSOD = SOD à cuivre et à zinc DAA = Jours après anthèse DAF = Jours après floraison DHA = Dehydroascorbate DHAR = Dehydroascorbate Reductase DKG = acide 2,3-diketoglutonique ERA = Espèces Réactives de l'Azote ERO = Espèces Réactives de l'Oxygène FAD = Flavine Adénine Dinucléotide oxydée FADH2 = Flavine Adénine Dinucléotide réduite FeSOD = SOD à fer GalLDH = L-galactono-1,4-lactone déshydrogénase GME = GDP-D-Mannose-3,5-épimérase GMP = GDP-D-Mannose pyrophosphorylase GR = Glutathion Réductase GSH = Glutathion réduit GSSG = Glutathion oxydé L . = radical lipidique LH = acide gras polyinsaturé LOO . = lipoperhydoxyle LOOH = Hydroxyperoxyde lipidique LOX = Lipoxygénase MDA = Malondialdehyde MDHA = Monodéhydroascorbate MDHAR = Monodéhydroascorbate réductase MnSOD = SOD à manganèse NADP = Nicotinamide Adenine Dinucléotide phosphate NADPH = Nicotinamide Adenine Dinucléotide réduite phosphate NBT = Nitro Blue Tétrazolium NO = Oxyde nitrique NOX = NADPH Oxydase PCR : Réaction de polymérisation en chaîne PSI= Photosystème I PSII = Photosystème II RT = Transcription inverse -SH = groupement thiol (ou sulfhydrile)

Figure 1

 1 Figure 1 Principaux stress environnementaux

-

  radicalaire superoxyde (O2 . -) n'est pas très réactif mais constitue un des radicaux précurseurs pouvant être activés en autres espèces plus réactives. -Résulte de la capture d'un électron par la molécule d'O2 lors de réactions endergoniques. -Peut aussi être produit lors de réactions d'oxydation enzymatiques ou spontanées. Formé par dismutation de l'anion superoxyde et par addition d'un second électron sur l'anion superoxyde en donnant l'ion peroxyde O 2 2-

Figure 2

 2 Figure 2 Principaux effets des espèces réactives de l'oxygène

  carbone. La première étape utilise comme substrat le D-glucose-6-phosphate qui est converti par la glucose phosphate isomérase en D-fructose-6-phosphate. La seconde réaction consiste en l'isomérisation du fructose-6-phosphate en D-mannose-6-phosphate par la mannose-6phosphate isomérase. L'étape suivante catalysée par la phosphomannose mutase converti le D-mannose-6-phosphate en D-mannose-1-phosphate. Puis la conversion du D-mannose-1-P en GDP-D-mannose, catalysée par la GDP-D-mannose pyrophosphorylase. La réaction suivante, catalysée par la GDP-D-Mannose-3,5-épimérase conduit à l'épimérisation du GDP-D-mannose en GDP-L-galactose. Il est important de noter que suite à la synthèse du GDP-Lgalactose deux intermédiaires ont été identifiés, le L-galactose-1-phosphate et le L-galactose.

Figure 3

 3 Figure 3 Schéma décrivant les voies de biosynthèse de l'acide L-ascorbique et leur connection possibles chez les plantes (réaction 1-13) et chez les animaux (réaction 14-23) 1: glucose phosphate isomérase, 2: Phosphomannose isomérase, 3: Phosphomannose mutase, 4: GDP-mannose pyrophosphorylase, 5: GDP-mannose-3-5-épimérase, 6: GDP-galactose pyrophosphatase, 7: Galacose-1-P phosphatase, 8: L-galactose déhydrogénase, 9: L-galactono-1,4-lactone déhydrogénase, 10: méthyl estérase, 11: D-galacturonate réductase, 12: aldono-lactonase, 13: myo-inositol, 14: phosphoglucomutase, 15: UDPglucose pyrophosphorylase, 16: UDP-glucose déhydrogénase, 17: acide UDP-glucuronique pyrophosphatase, 18: acide glucuronique réductase, 19: D-glucuronolactonase, 20: acide L-glucuronique réductase, 21: gulono-1,4-lactone hydrolase, 22: L-gulono-1,4-lactone oxydase, 23: Non enzymatique. Le point d'interrogation indique que l'enzyme de cette réaction n'est pas encore connue. Source https://www.bordeaux.inra.fr/umr619/ukG2_area_02.htm

Figure 4 .

 4 Figure 4. Schéma décrivant l'intervention de l'acide ascorbique dans l'élimination de H 2 O 2 et les enzymes impliquées dans son recyclage.

Figure 5

 5 Figure 5 Schéma décrivant les sources potentielles de l'oxyde nitrique d'après (Wojtaszek, 2000), orange sources chimique, vert sources bacterienne et bleu sources enzymatique.

Figure 6

 6 Figure 6 Schéma décrivant (a) la production d'ammonium dans le chloroplaste par la nitrite réductase en condition de lumière. (b) la production du NO par la nitrate réductase, en présence d'excès de nitrite et en absence de lumière au niveau chloroplastique d'après Sakihama et al. (2002).

Figure 7 :

 7 Figure 7 : Interaction entre ABA, H 2 O 2 et le NO dans l'induction de la fermeture stomatique d'après Yu et al. (2014). RBOHF et RBOHD: respiratory burst oxidases F et D, NR: nitrate réductase.

  Figure11)[START_REF] Freschi | Nitric oxide and phytohormone interactions: current status and perspectives[END_REF].

Figure 8

 8 Figure 8 Interactions possible entre le NO et les phytohormomes. (A) En agissant sur les facteurs de transcription. (B) Par modification post-transcriptionelle des protéines. (C) en agissant directement sur les phytohormones[START_REF] Freschi | Nitric oxide and phytohormone interactions: current status and perspectives[END_REF]

Figure 9

 9 Figure 9 Représentation schématique de la formation du complexe S-Nitrosothiol suite à la réaction entre le résidu cystéine d'une protéine et le NO.

Figure 10

 10 Figure 10 Représentation schématique de la nitration de la tyrosine pour donner la 3-nitrotyrosine.

Figure 11 1 . 3 . 4 .

 11134 Figure 11 Représentation schématique de la nitrosylation métallique

Figure 12

 12 Figure 12 Méthode de détection de NO par la réaction de Griess, A L'oxyde nitrique (NO) est oxydé par du trioxyde de chrome en nitrite (NO 2 -

Figure 13

 13 Figure 13 Dispositif nécessaire pour la détection de NO par la résonance de spin électronique (RSE) ou résonance paramagnétique électronique (RPE).

Figure 14

 14 Figure 14 Détection de NO par chemiluminescence d'après (Mur et al., 2011), PMT: tube photomultiplicateur.

Figure 15

 15 Figure 15 Détection de NO par spectromètre laser à cascade quantique (QCL) d'après[START_REF] Cristescu | Laser-based systems for trace gas detection in life sciences[END_REF]

Figure 16

 16 Figure 16 Détection de NO par la sonde à fluorescence DAF-2-DA, (a) équation de la réaction pour donner le composé fluorescent triazolofluorescéine et (b) résultat obtenu avec la sonde dans du tissu du péricarpe de fruit de tomate au stade vert mature.

Figure 17 Figure 18

 1718 Figure 17 Caractéristique du NO 550 avec (A) Absorption maximale de la sonde après excitation, (B) Corrélation entre la concentration de NO et l'intensité de fluorescence et (C) Cinétique de la réaction entre le NO et la sonde. D'après(Yang et al., 2010)

Tableau 3 2 . 4 . 3 . 2 :

 32432 photosystème II. Cette mesure a été réalisée à l'aide d'un Handy Plant Efficiency Analyser (Handy-PEA, Hansatech Ltd, UK). Avant les mesures, les feuilles sont pré-adaptées à l'obscurité en plaçant des pinces sur ces dernières en position fermée pendant 30 minutes (n= 9 par traitements. La fluorescence est induite par une lumière rouge de 600 w/m 2 produite par trois diodes placées dans la tête de mesure. Cette tête de mesure est placée sur les pinces, et immédiatement après les 30 min d'adaptation à l'obscurité, la pince est mise en position ouverte et la mesure est effectuée.L'acquisition des données à la longueur d'onde de 730 nm se fait pendant une seconde : toutes les 10 µs pendant les deux premières millisecondes et ensuite chaque milliseconde. Les paramètres OJIP ont été calculés d'après(Strasser et al., 2010) et présentés dans le tableau ci-dessus :

4 .

 4 Ensuite, les segments ont été rincés à deux reprises dans du tampon Tris HCl. Pour chaque traitement, des segments de tissues ont été mis à incuber dans 10 mM Tris HCl, pH 7.4 pendant 1h à 25°C à l'obscurité, comme témoins négatifs. De fines sections ont été réalisées à main levée à partir des segments, sous lumière tamisée. Les sections ont été déposées entre lame et lamelle dans 50% glycérol/PBS (v/v). Les lames ont été montées sur un microscope (Leica DM2000) équipé de filtres I3 (excitation à 450-490 nm; émission 520 nm). Les images ont été prises avec une caméra digitale Leica DF300X. Trois différentes sections ont été analysées par fruit, et 3 fruits ont été utilisés par traitement.. Les images ont ensuite été analysées avec le logiciel image J 1.43 (Maryland, USA).

d'H 2 O 2 à 2 . 4 . 9 . 1 . 2 . 5 . 2 .

 222491252 15 mM, et de 20 µL d'extrait enzymatique, selon la méthode adaptée de Aebi(1984).L'activité a été déterminée en mesurant la diminution de la vitesse de réaction à 240 nm et calculée à partir du coefficient d'extinction de 43.6 M -1 . cm -1 . SOD : L'activité a été déterminée selon la méthode modifiée deDhindsa et al. (1981) dans un milieu réactionnel de 1000 µl composé de tampon phosphate de potassium à 50 mM (pH 7,8), de méthionine à 13 mM, de nitro bleu tétrazolium (NBT) à 75 µM, de d'EDTA à 0,1 mM, de 10 µL d'extrait enzymatique et de riboflavine à 2 µM. Les tubes ont été légèrement agités et trois aliquotes de 200 µL de chaque tube ont été placés dans une plaque de 96 puits. Chaque plaque contenait également 0.3, 0.6, 0.9, 1.2, 1.5 et 1.8 U de SOD commerciale (from bovine liver, Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) pour générer une courbe d'étalonnage. Les plaques ont ensuite été placées sous une lumière blanche (Horizon, Model Apollo, Lincolnshire, IL, USA) pendant 5 min afin de produire l'anion superoxyde par photooxydation de la riboflavine. Puis l'absorbance a été lue à 560 nm dans un lecteur micro-plaque. La SOD dans l'extrait inhibe la réduction photochimique de NBT en bleu formazan. L'activité a été calculée en unités de SOD à partir de la courbe d'étalonnage. Détermination des teneurs en Ascorbate et dehydroascorbate :Les concentrations d'ascorbate réduit (AsA) et de dehydroascorbate (forme oxydée) (DHA) ont été déterminées selon le protocole deKampfenkel et al. (1995) modifié pour une détermination en micro-plaque(Murshed et al., 2008a). AsA et DHA ont été extraits par l'homogénéisation de 100 mg de poudre congelée de fruits ou de feuilles dans 1 mL de 6% TCA (p:v). L'homogénat est centrifugé à 16000 g pendant 15 min à 4°C. Les surnageants ont été utilisés pour la détermination de l'ascorbate total (AsA + DHA) et AsA. Pour la détermination de l'ascorbate total, 10 µL de l'extrait ont été ajoutés à 10 µL de 10 mM DL-Dithiothreitol (DTT) et 20 µL de tampon phosphate 0,2 mM (pH 7,4). Après 15 min d'incubation à 42° C, 10 µL de N-Ethylmaleimide (NEM) 0,5% (p:v) ont été ajoutés. Après 1 min d'incubation à température ambiante, 150 µL d'un réactif préparé juste avant l'utilisation en mélangeant 50 µL de 10% (p:v) TCA, 40 µL de 42% (v:v) de l'acide orthophosphorique (H 3 PO 4 ), 40 µL de 4% (p:v) 2.2bipyridyl dissous dans l'éthanol (70%) et 20 µL de 3% (p:v) de chlorure ferrique est rajouté. Après incubation à 42° C pendant 40 min, l'absorbance est lue à 525 nm dans un lecteur micro-plaque. Pour la détermination de l'AsA, la même réaction a été utilisée, en remplaçant le DTT et le NEM par du tampon phosphate (0,2 M, pH 7,4). La concentration de DHA a été estimée à partir de la différence entre l'ascorbate total et l'AsA. Chaque plaque contient également du L-acide ascorbique commercial pour générer une courbe d'étalonnage. Extraction des ARN totaux : Les ARN totaux ont été extraits à partir 100 mg de poudre congelée avec le kit RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) selon les instructions du fabricant. Le tampon RLT a été utilisé pour les fruits et le tampon RLC pour les feuilles et pédoncules. La quantité d'ARN extraits a ensuite été évaluée en mesurant la densité optique (DO) à 260 nm à l'aide d'un spectrophotomètre NanoVue TM plus. Afin de vérifier l'intégrité des ARN, une électrophorèse en gel d'agarose à 1% a été effectuée. Trois extractions indépendantes des ARN totaux ont été effectuées pour chaque traitement ou stade de développement et les extraits ont été stockés à -80 ° C. Puces à ADN Pour chaque traitement, quatre fruits au stade vert mature ont été récoltés à partir de quatre plants différents de façon aléatoire dans la serre. Le pédicelle de chaque fruit est immédiatement plongé dans une solution nutritive Murashige and Skoog (MS) contenant 4% de sucrose. Les fruits ont ensuite été mis en adaptation pendant 24 h dans une chambre de culture maintenue à 25 ± 2° C pendant la journée et 20 ± 2° C pendant la nuit avec une photopériode de 16h/8h jour/nuit et une humidité relative de 60 ± 5 %. L'intensité lumineuse de 400 µmol.m -2 .s -1 était assurée par des tubes fluorescents neutres. Un jour après la récolte, les différents traitements ont été appliqués aux fruits détachés. Les traitements ont été appliqués 2 heures après le début du cycle jour dans les chambres pendant 4 heures comme décrit précédemment.

- 5 - 5 - 5 -

 555 moléculaire et cellulaire (IGBMC) à Strasbourg pour la réalisation et l'analyse du transcriptome de tomate en conditions témoin, de déficit hydrique et de traitement NO. Chaque échantillon a été co-hybridé avec une référence commune à tous les 'arrays' qui était constituée d'un pool de l'ensemble de nos 12 ARN en quantité égale. Le protocole utilisé pour le marquage des échantillons était "Two-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis-Low Input Quick Amp Labeling" version 6.5, May 2010. Le protocole utilisé pour la lecture des lames sur un scanner C d'Agilent, était Agilent G3_GX_2Color (scan resolution : 3 µm, Tiff : 20 bit). Les images ont été analysées dans Feature Extraction avec le protocole GE2_1010_Sep10. Paramètres de filtrage utilisés : -P value ttest NOvsTM < 0.05 -P value ttest SHvsTM < 0.05 Niveau de surexpression NO vs TM > 1.Niveau de surexpression SH vs TM > 1.Niveau de sousexpression NO vs TM < 0.Niveau de sousexpression SH vs TM < 0.5 Les séquences des gènes sélectionnés ont été comparées à la base de données GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), en réalisant un blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), afin de déterminer leurs fonctions. Cette étape fut très importante car le génome de la tomate a été sequencé après la réalisation de notre analyse transcriptomique. Les séquences présentant au moins 40 % de recouvrement, une p-value <0.05, et un score maximum d'identité ont été choisies.

  U316474) et ef (X53043) préalablement choisi comme étant les plus stables dans nos conditions d'expérimentation, en utilisant le kit " Mesa green qPCR MasterMix plus" (Eurogentec). Le volume réactionnel de 25 µL, contient : 15 ng d'ADNc matrice, 200 nM d'amorces spécifiques (sens et antisens), 12.5 µl de tampon réactionnel contenant : des dNTPs, dont dUTP, la Meteor taq DNA polymerase, du MgCl 2 (4 mM finale), du Sybr® green I, un stabilisateur et de la fluorescéine, et 10µl d'eau ultrapure stérile. Les réactions de qPCR (thermocycler, Mastercycler®ep realplex) sont réalisées selon le programme suivant : dénaturation 95°C à 5 min ; 60 cycles [dénaturation : 95°C, 15 sec ; hybridation : température variable selon les amorces, 20 sec ; élongation : 72°C, 40 sec]. Une étape de courbe de fusion " melting curve " est également ajoutée afin de vérifier la spécificité du produit d'amplification pour chaque réaction. Les produits d'amplification ont également été déposés sur gel d'agarose 1% afin de s'assurer de la taille des amplicons obtenus.

2 . 5 . 3 . 2

 2532 Des amorces spécifiques des gènes (sens et antisens) de 19 à 25 nucléotides ont été réalisées sur les séquences nucléotidiques correspondant aux gènes d'intérêt et de référence. En particulier, les amorces ont été réalisées afin de prendre en compte la portion de séquence nucléotidique utilisée comme sonde pour les puces à ADN. Les règles classiques de réalisation d'amorces ont été utilisées: pourcentage de résidus G et C d'environ 50 %, température d'hybridation des oligonucléotides à la matrice d'ADN, Tm 60°C +/-2 (validée par un test de gradient de températures), pas de séquences répétées de nucléotides, ni de séquences palindromiques. Afin de vérifier la qualité des amorces, le logiciel Netprimer (http://www.premierbiosoft.com/netprimer/) et DNA man® ont été utilisés permettant de détecter d'éventuelles formations d'épingle à cheveux, de dimère d'amorces et de calculer la Tm. Quantification relative de l'expression des gènes L'expression relative du gène d'intérêt a été normalisée à l'aide de deux gènes de référence préalablement sélectionnés (Sand et Ef) selon le rapport (Pfaffl. 2001):

Figure 1 (

 1 b) and Figure1(c) show no difference between the reaction spectra from tomato fruit and leaf extracts with KI or not. The purpose of this work was to optimize the iodometric assay for plant tissues.

Figure 1 .

 1 Figure 1. (a) Absorption spectra of 3 I -ions resulting from hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) reaction with potassium iodide (KI 1 M) using different H 2 O 2 concentrations in 0.1% TCA. Inset shows calibration curve with slopes for hydrogen peroxide quantification measured at 350 and 390 nm at pH 7; (b) Absorption spectra of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) reaction with potassium iodide (KI 1 M) in 0.1% TCA at pH 7 with Velikova et al. (2000) method. Fruit: Fruit homogenate in presence of KI. Fruit control: Fruit homogenate in absence of KI. Each value represents mean ± standard deviation; (c) Absorption spectra of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) reaction with potassium iodide (KI 1 M) in 0.1% TCA at pH 7 with Velikova et al. (2000) method. Leaves: Leaf homogenate in presence of KI. Leaves control: Leaf homogenate in absence of KI. Each value represents mean ± standard deviation.

Figure 2 .

 2 Figure 2. (a) Absorption spectra of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) reaction with potassium iodide (KI 1 M) in fruits in 0.1% TCA at pH 5.8, pH 7 and pH 8. Highlighting better absorbance of fruit samples at pH 8 together with an absence of pH interference in background tissue coloration. Each value represents mean ± standard deviation; (b) Reaction kinetic of reaction between hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) and potassium iodide (KI 1 M) at pH 8 showing end of reaction after 20 min; (c) Absorption spectra of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) reaction with potassium iodide (KI 1 M) in leaves in 0.1% TCA at pH 5.8, pH 7 and pH 8. Highlighting better absorbance of leaf samples at pH 5.8 together with an absence of pH interference in background tissue coloration. Each value represents mean ± standard deviation; (d) Reaction kinetic of reaction between hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) and potassium iodide (KI 1 M) at pH 5.8 showing end of reaction after 20 min.

3 - 1 :

 31 Furthermore, NO can also directly interact with ROS, such as H 2 O 2 and O 2 -, with the effect of producing the less-reactive peroxynitrite, thus limiting oxidative damages; however, the latter can Chapitre Le mercure induit la synthèse de NO et ABA et l'activation du système de défense antioxydant dans le fruit de tomate 62 also interfere with the tyrosine residues in proteins, inducing post-transcriptional changes and modifying the enzyme activity (Francisco J

Chapitre 3 - 1 :

 31 Le mercure induit la synthèse de NO et ABA et l'activation du système de défense antioxydant dans le fruit de tomate 63

Chapitre 3 - 1 :

 31 Le mercure induit la synthèse de NO et ABA et l'activation du système de défense antioxydant dans le fruit de tomate 64 Frozen powder (150 mg) was homogenized with 1 mL of freshly prepared solution containing 0.25 mL trichloroacetic acid (TCA) (0.1% (w:v)), 0.5 mL KI (1 M) and 0.25 mL potassium phosphate buffer (10 mM, pH 8 for the fruits and pH 5.8 for the leaves and pedicels) at 4°C for 10 min (one-step buffer: extraction and colorimetric reaction combined). Every sample had a control with KI replaced by H 2 O that was run in parallel to subtract the natural tissue coloration background. The homogenate was centrifuged at 12,000 × g for 15 min at 4°C, and 200-µL aliquots of the supernatant were placed in UV-microplate wells and left to incubate at room temperature (20 -22°C) for 20 min. The plate was briefly vortexed, and the absorbance readings were taken at 350 nm in a microplate reader (PowerWave HT Microplate Spectrophotometer from BioTek). The samples and blanks were analyzed in triplicate. The sample H 2 O 2 content was determined using the standard curve after removing the background value.

3 - 1 :

 31 NO quantification by quantum cascade laser (QCL)-based detection NO production from the fruits and leaves of mature tomato plants was quantified using a quantum cascade laser (QCL)-based sensor(Mandon et al., 2012) that was developed at the Radbound University (Life Science Trace Gas Facility) in The Netherlands. The sensor includes a QCL-emitting 5-µm light, a multipass cell and a room-temperature light detector. The emission wavelength of the laser was selected to probe a strong ro-vibrational absorption line of NO. The laser was maintained at -25°C by a Peltier cooler and delivered a continuous output power of 10 mW. The gas sample for analysis is sucked by the system into the multipass cell at a flow rate of 1 l/h. In the cell, the sample interacts with the light-producing multiple reflections to increase the interaction distance to 76 m. The concentration of NO is determined by measuring the amount of Chapitre Le mercure induit la synthèse de NO et ABA et l'activation du système de défense antioxydant dans le fruit de tomate 65

a

  Values are the mean (± S.E.) of five replicates, and different letters within columns indicate significant differences (P<0.05).

Figure 1 :

 1 Figure 1: Nitric Oxide production in (A) fruits and (B) leaves of tomato plants exposed to water deficit followed by quantum cascade lasers (QCL) based detection. NO content is expressed in ppb and each points corresponds to 50 smoothing points.

  ) and A(ii)] alongside with the vascular tissues[compare Fig. 2A(iii) and A(iv)] and the inner epidermal cells[compare Fig. 2A(v) and A(vi)]. A green fluorescence was also observed in the parenchyma cells around those areas. Spots of green fluorescence were visible in the chloroplasts of the inner epidermal cells [Fig. 2A(vii); arrows]. The placental tissues and columella also responded positively to the water deficit treatments, with the more distinguishable increase in the placental epidermal cells [compare Fig. 3B(i) and B(ii)] and vascular tissues [compare Fig. 3B(iii) and B(iv)] and a spread of green fluorescence in the surrounding parenchyma cells. Sections from the pedicels show an increase in green fluorescence in the epidermal and underlying cells as well as in the trichomes in the treated plants [compare Fig. 4C(i) and C(ii)]. In the vascular tissue, no significant difference in fluorescence was detected [compare Fig. 4C(iii) and C(iv)]. In the stem tissues, a significant enhancement in green fluorescence was observed in the epidermal cells with a boost at the level of the trichomes in those plants under water deficit [compare Fig. 5D(i) and D(ii)]. However, the vascular region did not exhibit an increase in green fluorescence in the treated plants [compare Fig. 5D(iii) and D(iv)]. An overall increase in fluorescence was observed in the leaf blade sections in the plants under water deficit compared to the control plants. The regions showing particularly higher fluorescence were the lower epidermal cells [compare Fig. 6E(i) and(ii)] and vascular tissues [compare Fig. 6E(iv) and E(v)]. We also noticed an intense fluorescence in the stomatal guard cells [Fig. 6E(iii); arrow] and a slight increase in the palisade mesophyll cells. The negative controls without the fluorochrome exhibited only natural autofluorescence: green fluorescence in lignified cells and red fluorescence in chlorophyll (Supplemental data Fig. S1-S5).

Figure 2 :

 2 Figure2: Nitric Oxide production revealed by epifluorescence microscopy through 10 µM NO 550 probe in fruit pericarp (A) from tomato plants treated with 5 ppm HgCl2 and 0 ppm HgCl2 (control). A(i), (ii) outer epidermis, A(iii), (iv) vascular tissue, A(v), (vi) inner epidermis of the pericarp, and A(vii) a high magnification of the region of the inner epidermal cells showing fluorescing chloroplasts (arrows). Each image represents the green (left), red (center) and the sum of both color channels (right) in order to highlight the distribution of the green fluorescence in the different organs. Linear levels were adjusted in all images using ImageJ 1.43 version. E : Epidermis, P : Parenchyma, VT : Vascular tissue.

Figure 3

 3 Figure 3 Nitric Oxide production revealed by epifluorescence microscopy through 10 µM NO 550 probe in (B) columella and placental tissue of tomato plants treated with 5 ppm HgCl 2 and 0 ppm HgCl 2 (control). B (i), (ii) placenta epidermis, B (iii), (iv) vascular tissue. Each image represents the green (left), red (center) and the sum of both color channels (right) in order to highlight the distribution of the green fluorescence in the different organs. Linear levels were adjusted in all images using ImageJ 1.43 version. E : Epidermis, P : Parenchyma, VT : Vascular tissue.

Figure 4

 4 Figure 4 Nitric Oxide production revealed by epifluorescence microscopy through 10 µM NO 550 probe in pedicels (C) from tomato plants treated with 5 ppm HgCl 2 and 0 ppm HgCl 2 (control). C(i), C(ii) outer epidermis, C(iii), C(iv) vascular tissues. Each image represents the green (left), red (center) and the sum of both color channels (right) in order to highlight the distribution of the green fluorescence in the different organs. Linear levels were adjusted in all images using ImageJ 1.43 version. E : Epidermis, TC : Trichomes or glandular hairs and VT : Vascular tissue.

Figure 5 :

 5 Figure 5: Nitric Oxide production revealed by epifluorescence microscopy through 10 µM NO 550 probe in the stem (D) from tomato plants treated with 5 ppm HgCl 2 and 0 ppm HgCl 2 (control). D(i), B(ii) outer epidermis, D(iii), D(iv) vascular tissues. Each image represents the green (left), red (center) and the sum of both color channels (right) in order to highlight the distribution of the green fluorescence in the different organs. Linear levels were adjusted in all images using ImageJ 1.43 version. E : Epidermis, C : Cortex, TC : Trichomes or glandular hairs and VT : Vascular tissue.

Figure 6 :

 6 Figure 6: Nitric Oxide production revealed by epifluorescence microscopy through 10 µM NO 550 probe in the leaf tissues (E) from tomato plants treated with 5 ppm HgCl 2 and 0 ppm HgCl 2 (control). E(i), E(ii) lower epidermis of the lead blade, E(iii) represents a zoom(x2) of stomatal guard cells presented in E(ii) and E(iv), E(v) vascular tissue. Each image represents the green (left), red (center) and the sum of both color channels (right) in order to highlight the distribution of the green fluorescence in the different organs. Linear levels were adjusted in all images using ImageJ 1.43 version. E : Epidermis, M : Mesophyll and VT : Vascular tissue.

Figure 7 :

 7 Figure 7: Activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX) monodehydroascorbate reductase (MDHAR), dehydroascorbate reductase (DHAR) and glutathione reductase (GR) in mature green pericarp (Mature green, fruit age was between 35 and 40 DAF), of control plants (C) and plants treated by 2, 5, and 10 ppm of HgCl 2 for 24 hours. Values are the mean (± S.E.) of five replicates, and different letters indicate significant differences according to Student t-test (P<0.05).

Figure 9 :

 9 Figure 9: Activity of ascorbate peroxidase (APX), monodehydroascorbate reductase (MDHAR), dehydroascorbate reductase (DHAR) in mature green pericarp (Mature green, fruit age was between 35 and 40 DAF), of control plants (C) and plants treated by 0.5 mM SNP, 0.5 mM SNP + 1 mM cPTIO and C + 1 mM cPTIO for 24 hours. Values are the mean (± S.E.) of 6 replicates, and different letters indicate significant differences according to Student t-test (P<0.05).

  our study, fluorescence microscopy revealed the presence of NO in the inner and outer epidermal cells and vascular tissues of the fruit pericarps. Furthermore, green fluorescent spots showed chloroplastic NO in the inner epidermal cells [Fig 2 A (vii)]. These results suggest that NO was produced in the fruits, possibly from a chloroplastic source. Regarding the placental tissue and the columella region, NO was detected in and around the vascular and epidermal cells [Fig 3]. The presence of NO in and around vascular tissues supports the hypothesis ofCorpas et al., (2004), who postulated long distance signalling by NO and its potential implication in cell expansion. In the pedicel and stem sections, NO was mainly present in the epidermal cells and trichomes[Fig 4 C(ii)

Chapitre 3 - 1 :

 31 Le mercure induit la synthèse de NO et ABA et l'activation du système de défense antioxydant dans le fruit de tomate 84 physiological and stressful conditions

Chapitre 3 - 1 :

 31 Le mercure induit la synthèse de NO et ABA et l'activation du système de défense antioxydant dans le fruit de tomate 86 the conversion of DHA back to AsA via the action of DHAR. In addition, this result would suggest that the AsA and glutathione pools are well coupled through the mediation of DHAR. Consistent

Chapitre 3 - 1 :Figure S2 :

 31S2 Figure S2 : Negative control of Nitric Oxide production revealed by epifluorescence microscopy in absence of NO 550 probe in (B') columella and placantal tissue of tomato plants treated with 5 ppm HgCl 2 and 0 ppm HgCl 2 (control). B'(i), (ii) placenta epidermis, B'(iii), (iv) vascular tissue. Each image represents the green (left), red (centre) and the sum of both color channels (right) in order to highlight the distribution of the green fluorescence in the different organs. Linear levels were adjusted in all images using ImageJ 1.43 version. E : Epidermis, P : Parenchyma, VT : Vascular tissue.

Figure S3 :

 S3 Figure S3 : Negative control of Nitric Oxide production revealed by epifluorescence microscopy in absence of NO 550 probe in pedicels (C') from tomato plants treated with 5 ppm HgCl 2 and 0 ppm HgCl 2 (control). C'(i), C'(ii) outer epidermis, C'(iii), C'(iv) vascular tissues. Each image represents the green (left), red (centre) and the sum of both color channels (right) in order to highlight the distribution of the green fluorescence in the different organs. Linear levels were adjusted in all images using ImageJ 1.43 version. E : Epidermis, VT : Vascular Tissue.

Figure S4 :

 S4 Figure S4 : Negative control of Nitric Oxide production revealed by epifluorescence microscopy in absence of NO 550 probe in the stem (D') from tomato plants treated with 5 ppm HgCl 2 and 0 ppm HgCl 2 (control). D'(i), D'(ii) outer epidermis, D'(iii), D'(iv) vascular tissues. Each image represents the green (left), red (centre) and the sum of both color channels (right) in order to highlight the distribution of the green fluorescence in the different organs. Linear levels were adjusted in all images using ImageJ 1.43 version. E : Epidermis, C : Cortex, TC :Trichomes or glandular hairs and VT : Vascular Tissue.

Figure S5 :

 S5 Figure S5 :Negative control of Nitric Oxide production revealed by epifluorescence microscopy in absence of NO 550 probe in the leaf tissues (D') from tomato plants treated with 5 ppm HgCl 2 and 0 ppm HgCl 2 (control). D'(i), D'(ii) lower epidermis of the lead blade and D'(iv), D'(v) vascular tissue. Each image represents the green (left), red (centre) and the sum of both color channels (right) in order to highlight the distribution of the green fluorescence in the different organs. Linear levels were adjusted in all images using ImageJ 1.43 version. E : Epidermis, M : Mesophyll, VT : Vascular tissue.

FluxChapitre 3 - 2 .

 32 of specific energy expressed by the reaction center (RC) Observed rate of QA reduction (TR0/RC) or (M0/VJ) = (ABS/ RC) (Fv/Fm) Rate of electron transport beyond QA ˉ (ET0/RC) or (TR0/RC) (1 -VJ) = (TR0/RC) (ET0/TR0) Rate of photon absorption (ABS/RC) = (TR0/RC) / [(Fm -F0) /Fm] Rate of heat dissipation (DI0/RC) = (ABS / RC) -(TR0 / RC) Efficiencies (or flux ratios) Maximum efficiency with which an absorbed photon results in QA reduction (TR0/ABS) or (TR0/RC) / (ABS/RC) = (Fm-F0) / Fm Efficiency with which an absorbed photon results in electron transport beyond QA ˉ (ET0/ABS) = (ET0/RC) / (ABS/ RC) Density of reaction centers per chlorophyll Functional reaction centers per cross-sectional leaf area (RC/ABS) = (RC/TR0) (TR0/ABS) Performance index Compound function of light energy absorption, efficiency of QA reduced and conversion energy to electron transport (PIabs) = [RC/ABS] [(TR0/ABS) / (F0/Fm)] [(ET0/TR0) / VJ] Ensemble l'acide abscissique, le peroxyde d'hydrogène et le NO influent sur les systèmes de défense antioxydants de fruits détachés de tomate (Solanum lycopersicum L, CV Microtom) Ce sous chapitre présente, sous forme d'un article soumis au Journal of Plant Physiology, les travaux menés sur l'implication de molécules signal telles que le NO, l'ABA et l'H 2 O 2 dans l'induction des antioxydants impliqués dans le recyclage de la vitamine C. Dans le chapitre précédent, nous avons démontré qu'un déficit hydrique induit par le mercure pouvait influencer les systèmes antioxydants dans des fruits exempts de symptôme de stress. Nous avons aussi constaté une forte induction de molécules signal telles que le NO, l'ABA ou encore l'H 2 O 2 au cours de ces traitements. Ces résultats nous ont suggéré une implication possible de ces molécules dans la transmission d'un signal des parties végétatives présentant des symptômes de stress vers les fruits, afin de permettre à ces derniers de se protéger. Pour tester cette hypothèse, nous avons adopté une approche pharmacologique sur des fruits de tomate détachés dans des milieux contenant, de l'ABA, de l'H2O2 , un donneur d'oxyde nitrique le SNP et un piégeur de NO, le cPTIO seul ou en présence des autres molécules. Nous avons par la suite suivi les activités des enzymes de recyclage de la vitamine C, ainsi que la concentration de cette dernière dans les fruits ayant subi différents traitements. Dans ces mêmes fruits, nous avons aussi dosé l'ABA et le H2O2. La production du NO a été déterminée par microscopie à fluorescence. Nous avons alors noté une augmentation de NO dans le péricarpe et la zone placentaire des fruits traités avec de l'ABA et du H 2 O 2 . Les fruits traités avec du H 2 O 2 présentaient à chaque fois une plus forte augmentation de la production de NO. Après l'addition de cPTIO aux traitements, une diminution significative de NO a été détectée dans les fruits. Les activités des enzymes antioxydantes impliquées dans le recyclage de l'ascorbate (APX, DHAR et MDHAR) ont été positivement affectées par les traitements avec le donneur de NO, et nous avons noté, par rapport au traitement témoin, une augmentation d'activité jusqu'à 18 fois supérieures pour l'enzyme APX. Etant donné qu'il n'y avait pas de différence dans l'induction des enzymes antioxydantes pour les deux concentrations de SNP, nous avons choisi de tester uniquement l'effet de la concentration de 0.05 mM SNP sur la teneur en ABA et H 2 O 2 .Cette dose a aussi été choisi afin de se rapprocher au plus près de la teneur en NO de type signalisation, potentiellement présente au sein des tissus végétaux. De tous les traitements appliqués, la teneur en ABA a été affectée uniquement par les traitements H 2 O 2 et H 2 O 2 + cPTIO, où une diminution de cette teneur a été mesurée. Le traitement ABA a induit une diminution en H 2 O 2 après 8 et 12 heures de traitement, sans impacter l'activité de l'APX. Toutefois, le traitement ABA a induit une augmentation de l'activité du MDHAR et DHAR, la teneur en AsA et DHA. Nous avons aussi constaté une diminution significative de l'ABA suite au traitement H 2 O 2 . Ce dernier a aussi induit une augmentation des activités des enzymes APX, MDHAR et DHAR. Au travers de cette étude, nous avons démontré qu'il existait une forte interaction entre les différentes molécules signal NO, ABA et H 2 O 2 dans le maintient du statut redox dans les fruits de tomate. Ce contrôle implique notamment les enzymes de recyclage de la vitamine C, qui jouent un rôle très important pour lutter contre les ERO produites dans la cellule, et également pour le contrôle de l'accumulation de la vitamine C.

Chapitre 3 - 2 :

 32 ABA, H 2 O 2 et NO influent sur les systèmes de défense antioxydants de fruits détachés de tomate 108 APX, MDHAR and DHAR forms part of transient changes experienced by plants during

  treated with 0.5mM and 0.05mM sodium nitroprusside (SNP), an efficient NO donor, in order to follow the action of NO; -6 fruits treated with 0.5mM SNP + 1mM 2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5 tetramethylimidazoline-l-oxyl-3-oxide (cPTIO), an NO scavenger; -6 fruits treated with 0.05mM SNP + 1mM cPTIO; -6 fruits treated with MS + 1mM cPTIO (C + cPTIO); -6 fruits treated with 0.1 mM abscisic acid (ABA) ; -6 fruits treated with 0.1 mM abscisic acid + 1 mM cPTIO (ABA + cPTIO); -6 fruits treated with 0.5 mM hydrogen peroxide (H 2 O 2 ); -6 fruits treated with 0.5 mM hydrogen peroxide + 1 mM cPTIO (H 2 O 2 + cPTIO); -6 fruits were dipped in MS nutritive solution for control.

Chapitre 3 - 2 :

 32 ABA, H 2 O 2 et NO influent sur les systèmes de défense antioxydants de fruits détachés de tomate 110 All enzyme activities were determined in IN ? 200 µL volume kinetic reactions at 25

Chapitre 3 - 2 :

 32 ABA, H 2 O 2 et NO influent sur les systèmes de défense antioxydants de fruits détachés de tomate 113

1 OFigure 2 :

 12 Figure 1: (a) Nitric oxide measured SNP + 1 mM cPTIO and MS solu detached fruits with pedicels dippe treatments for 4h, 8h, 12h and 24h. 0.5 mM H 2 O 2 and 0.5 mM H 2 O 2 + 1

Figure 3 :Figure 4 :Figure 5 :Figure 6 :Figure 7 A:Figure 7 BFigure 7 CFigure 7 DFigure 7 EChapitre 3 - 3 .

 34567777733 Figure 3: Activity of monodehydroa 35 and 40 DAF).(a) 0.5 mM SNP, 0.05 mM SNP, MS (b) 0.1 mM ABA, MS + 1 mM cPTIO (c) 0.5 mM H 2 O 2 , MS + 1 mM cPT expressed as means with standard er heteroscedastic two tailed Studen

Figure 2

 2 Figure 2 Distribution des 92 surexprimés par le traitement

  classiques actine, act (FJ532351) et le facteur d'élongation, Ef (X53043) ; et 3 nouveaux gènes Tip41 (SGN-U321250), Sand (SGN-U316474) et Cac (SGN-U314153) issus de la banque Sol Genomics Network (SGN) et préalablement testés par (Exposito-Rodriguez et al., 2008) Exposito-Rodriguez et al,. (2008) dans le cadre d'une étude sur le développement des tomates.

Figure 7

 7 Figure 7 Stabilité des gènes de références.

Perspectives

  Lors du déficit hydrique provoqué par l'arrêt du flux d'eau racinaire, la feuille subit un stress oxydatif et une chute de son potentiel hydrique. Les fruits ne présentent pas de différence de potentiel hydrique, cependant, on observe une augmentation de l'activité du système antioxydant et une production de NO. Nous avons ici initié l'étude de la signalisation en réponse au stress oxydatif induit par le déficit hydrique chez les fruits de tomate du cultivar Micro-Tom. Nous nous sommes particulièrement intéressés aux systèmes antioxydants, enzymatiques et non-enzymatiques. Nos travaux ont mis en évidence le rôle majeur joué par l'oxyde nitrique lors du stress et dans le maintien du statut oxydatif et son implication dans la régulation des enzymes du recyclage de la vitamine C et non dans sa synthèse. Sachant que le recyclage de la vitamine C peut contrôler sa concentration dans le fruit, un traitement au NO en post-récolte pourrait être utilisé pour améliorer sa qualité nutritionnelle. Etant donné que nous avons noté une forte augmentation de la concentration en NO pendant la nuit en réponse au déficit hydrique, il serait intéressant de déterminer plus en détail son origine (localisation cellulaire, enzyme impliquée...) pendant cette période. Pour cela, il serait d'abord judicieux de valider l'implication de la nitrate réductase en suivant son activité en réponse aux traitements et ceci pendant les phases obscures et lumineuse de la photopériode.

  Un autre rôle important du GSH dans la régulation des ERO est son implication dans la régénération de l'ascorbate.

	Le glutathion (GSH)
	Le GSH peut directement réduire l'H 2 O 2 mais également d'autres ERO, des hydroperoxydes
	organiques et des peroxydes lipidiques
	H 2 O 2 + 2 GSH → GSSG + 2 H 2 O
	ROOH + 2 GSH → ROH + GSSG + H 2 O

  pour ses nombreuses vertus pour la santé humaine. Elle renforce et protège le système immunitaire, aide à lutter contre les radicaux libres, permet de réduire les risques de maladies cardiovasculaires et participe aussi au bon fonctionnement du système nerveux. Du point de vue structural, l'AsA est l'une des vitamines les plus simples, elle est associée à un sucre en C6, le 1-4 Aldono lactone. On la retrouve souvent sous la forme d'ascorbate (AsC) après qu'elle ait perdu un atome d'hydrogène. L'ascorbate qui est la forme réduite de la vitamine C s'oxyde facilement en monodehydroascorbate (MDHA) son radical, qui lui-même peut s'oxyder en dehydroascorbate (DHA). Ainsi, on retrouve souvent la vitamine C sous ces trois formes aussi bien chez les hommes que chez les plantes. A l'exception des graines sèches, on peut trouver l'ascorbate dans tous les tissues végétaux (De

Tableau 2 : Principaux antioxydants enzymatiques et non enzymatiques chez les végétaux 1.2. L'Acide ascorbique L'acide ascorbique (AsA) est le nom donné pour désigner la vitamine C. Cette vitamine hydrosoluble est la plus abondante chez les végétaux et suscite l'intérêt de nombreux scientifiques, notamment

1.2.3. Recyclage de l'ascorbate et le maintien du statut redox

L'ascorbate peut réagir directement avec des ERO telles que l'oxygène singulet ( 1 O 2 ), les radicaux d'hydroxyle (OH -) et indirectement avec le H 2 O 2 par le biais de l'ascorbate peroxydase (APX)

[START_REF] Asada | Ascorbate peroxidase -a hydrogen peroxide-scavenging enzyme in plants[END_REF]

. Dans les deux cas, l'AsC se retrouve oxydé en monodehydroascorbate (MDHA) qui est instable et se disproportionne relativement rapidement en dehydroascorbate (DHA). Le maintien du pool d'ascorbate réduit est assuré par un ensemble d'enzymes plus communément connues sous le nom d'enzymes du cycle ascorbate-glutathion. Ces enzymes sont notamment la monodehydroascorbate reductase (MDHAR) qui est responsable de la réduction de la MDHA en AsC et la dehydroascorbate reductase (DHAR) responsable quant à elle de la réduction de la DHA en AsC. La première étant directement dépendante de NADPH et la dernière indirectement au travers du glutathion réductase qui est NADPH dépendante. Cependant il y a des situations où l'AsC n'est pas totalement recyclé et le DHA est alors dégradé en Acide 2,3-Diketogulonique (Bode et al., 1990) et en oxalate et thréonate (Fry, 2004)(Figure

1.3.2. Le NO et les stress abiotiques chez les végétaux : Interactions ABA, H 2 O 2 et NO

	Chez les plantes, plusieurs études ont montré que le NO était impliqué dans un nombre
	important de stress aussi bien biotiques que abiotiques. Notamment, un traitement au NO
	augmente la tolérance face au stress salin chez de jeunes plants de riz

  peut interagir directement avec la voie du JA en aval de la synthèse de JA et en amont de la synthèse de H 2 O 2 . En accord avec cette possibilité, des donneurs de NO réduisent ou retardent la production de H 2 O 2 induit par JA suite à une blessure chez la patate douce (Jih,Chen, et Jeng 2003). De plus, il a été démontré que suite à un traitement au JA ou après une blessure, qu'il y a une production de NO dans les cellules épidermiques de la patate douce et d'A. thaliana et que l'application de NO exogène induisait tous les gènes requis pour la biosynthèse de JA (Jih,

En 2002 Orozco-Cardenas and Ryan (Orozco-Cardenas, 2002)

ont démontré que le NO bloquait la production de H 2 O 2 induit par l'acide jasmonique (JA) dans les feuilles de tomates Solanum lycopersicum. Plusieurs points mettent en évidence une relation entre le NO et l'acide salicylique (SA) dans la défense des plantes. L'application de NO sur des feuilles de tabac et d'Arabidopsis thaliana provoque une augmentation de SA endogène (Jörg Durner, Wendehenne, et Klessig 1998)

(Huang et al. 2004

). Chez le tabac, cette augmentation induit l'expression des gènes PR (pathogenesis related) et implique l'induction du gène de la PAL (phenylalanine ammonia lyase). De plus, des piégeurs de NO atténuent la résistance systémique acquise induite par SA. Chez le tabac transgénique, le gène bactérien nahG qui code l'enzyme salicylate hydroxylase, responsable de la dégradation de SA, supprime les effets des donneurs de NO. Ces derniers, normalement réduisent les lésions causées par le virus de la mosaïque du tabac. Ces résultats suggèrent une action synergétique du NO et de SA.

Récemment, il a été suggéré que le NO jouait un rôle dans la voie de signalisation de JA lors de réponses à un stress mécanique. Chez la tomate, la synthèse de H 2 O 2 et de gènes de défense après une blessure est inhibée par le NO

[START_REF] Orozco-Cardenas | Nitric Oxide Negatively Modulates Wound Signaling in Tomato Plants[END_REF]

. Cette inhibition est indépendante de SA qui est antagoniste à l'action ou la synthèse de JA. Ainsi, face à une blessure le NO

  1.3.3. Le NO et les modifications post traductionnellesLa perception de signal NO et son mode de transmission n'ont pas encore été entièrement vérifiés(Hancock et al., 2011). Cependant il a été démontré que le NO pouvait interagir avec une vaste gamme de protéines, via la modification directe de leur structure. Au travers de la modification chimique des protéines cibles, le NO peut altérer leurs activités et fonctions cellulaires, menant en fin de compte à la transmission d'un message. Ce radical peut exercer ses fonctions via la modification post-traductionnelle de protéines possédant des métaux de transition, des résidus cystéines ou tyrosines stratégiques(Stamler et al., 1992). Ce processus, appelé nitrosation ou nitration, suivant le mécanisme mis en jeu, est associé à la

	forte réactivité de NO dans les contextes biologiques et contribue à l'activation ou à
	l'inhibition des protéines concernées. Parmi les modifications post-traductionnelles
	impliquant le NO, la modification covalente de résidus de cystéine par le processus connu
	sous le nom de S-nitrosylation paraît comme étant un mécanisme relativement important dans
	la médiation de la signalisation NO. Ces trois mécanismes sont décrits plus en détail ci-
	dessous.

2.2. Conditions et application des différents traitements :

	Au moment de l'anthèse, les fleurs ont été marquées afin de déterminer de l'âge de fruits. Les
	fruits ont été récoltés deux heures après le début de la photopériode, période où le flux d'eau est
	encore assuré uniquement par la poussée racinaire, indépendamment de l'évapotranspiration. Pour les
	différentes expérimentations, les fruits ont été récoltés au stade vert mature (35-40 jours après
	anthèse). Six fruits par traitement ont été récoltés à partir de différents plants de façon aléatoire dans
	la serre afin de limiter les biais dus à l'exposition à la lumière et à la température.
	Un déficit hydrique contrôlé et rapide a été réalisé en utilisant du mercure pour bloquer le flux
	semis des graines a été réalisé sur du papier filtre stérile humide et placé à l'abri de la d'eau par le xylème vers le fruit et les feuilles. Après 24h de traitement, on agit essentiellement sur la
	lumière. A l'émergence des deux feuilles cotylédonaires, les germinations ont été placées dans une poussée racinaire qui diminue fortement en inhibant une partie des aquaporines. Le traitement
	chambre de culture maintenue à 25 ± 2° C pendant la journée et 20 ± 2° C pendant la nuit avec une mercure a été appliqué, par irrigation avec des solutions de HgCl 2 de manière à obtenir des
	photopériode de 16h/8h jour/nuit et une humidité relative de 60 ± 5 %. L'intensité lumineuse de 300 concentrations de 2, 5 et 10 ppm de Hg par pot. Les plants témoins ont été arrosés avec de l'eau.
	µmol.m -2 .s -1 était assurée par des tubes fluorescents neutres. Les prélèvements des fruits, pédoncules, feuilles et tiges des plantes stressées et témoins (six
	Quinze jours après le semis des graines, le repiquage des jeunes plantules (stade deux feuilles plantes de chaque traitement) ont été effectués 24 et 48 heures après l'application des différentes
	vraies) a été effectué dans des terrines contenant du terreau. Les plantes, âgées de 30 jours, ont doses de mercure. Les fruits ont été récoltés au stade de développement vert mature (35-40 jours
	ensuite été repiquées dans des pots en plastique (4 litres, 21 cm hauteur x 17.5 cm diamètre), après anthèse) et vidés de leur contenu loculaire. Ensuite, ils ont été congelés dans de l'azote liquide
	contenant du terreau. Les pots ont été placés dans une serre en verre orientée Nord-Sud. La et stockés à -80°C. L'expérimentation a été répétée trois fois. Une fois récoltés, les tissus nécessaires
	température était d'environ 28° C pendant la journée et 18° C pendant la nuit, la photopériode de 16 à l'étude microscopique sont prélevés sur les différents organes.
	heures de lumière et 8 heures d'obscurité, l'humidité relative de 60-70 % et l'intensité lumineuse de
	400 µmol.m -2 .s -1 . Des lampes au sodium ont été utilisées pour assurer un éclairage palliatif pour
	porter la photopériode à 16 heures.
	Les plantes ont été fertilisées hebdomadairement avec un engrais universel dont la
	composition en macronutriments est de 6% azote total dont 2.1% azote nitrique ou nitrate (NO 3	-),
	1.4% azote ammoniacal ou ammonium (NH 4	+ ) et 2.5% azote uréique (CO (NH 2 ) 2) , 6% d'anhydrique
	phosphorique (P 2 O 5 ) et micronutriment 0.01% Bore (B), 0.002% cuivre (Cu), 0.05 fer (Fe), 0.02%
	Manganèse (Mn), 0.001% Molybdate (MO), 0.0125% Zinc (Zn). Les plantes ont été arrosées
	quotidiennement à la capacité au champ.
	Les bourgeons axillaires végétatifs ont été systématiquement enlevés au cours de
	l'expérimentation. Un ébourgeonnage de la première inflorescence a été effectué afin d'éviter
	l'apparition de petits fruits. La culture a été protégée contre les aleurodes Trialeurode vaporariorum,
	les acariens Tetranychus cinnabarinus et les thrips Frankliniella occidentalis par un filet de
	protection anti insectes (BIOTHRIPS 346) de chez texinov Agrotextiles mis en place dans la serre.

2.3. Culture des fruits détachés et traitements:

	Six fruits au stade vert mature ont été récoltés sur six plants différents de façon aléatoire dans
	la serre. Le pédicelle de chaque fruit est immédiatement plongé dans la solution nutritive
	« Murashige and Skoog » (MS) contenant 4% de sucrose. Les fruits ont ensuite été préadaptés
	pendant 24 h dans une chambre de culture maintenue à 25 ± 2° C pendant la journée et 20 ± 2° C
	pendant la nuit avec une photopériode de 16h/8h jour/nuit avec une humidité relative de 60 ± 5 %.
	L'intensité lumineuse de 400 µmol.m -2 .s -1 était assurée par des tubes fluorescents. Après 24h, les
	différents traitements ont été appliqués aux fruits détachés directement dans la solution nutritive. Les
	traitements ont été appliqués 2 heures après le début du cycle jour dans les chambres.

Table 1 :

 1 Séquences des amorces spécifiques des gènes cibles. Tailles des fragments amplifiés par PCR et numéro d'accession sont également indiqués. NO(+) : traitement NO, WD : déficit hydrique

	Expression	Description			Séquence (5' 3')	Taille	N°Accession
	puce						amplicon bp
	NO(+)	Monogalactosyl		sens	CGA GTT CAC GTC TTC ATT TTC A	216	AK320909
		diacylglycerol synthase 2	antisens	C CGA CTA ACC AAG GAT CGG
	NO(+)	13 lipoxygenase		sens	TCG GAG AAA TTG AAG GAA CTT G	225	AK246936
					antisens	AG GAC CTA TTA GTA CAT TTG GGT AGC
	NO(+)	3-ketoacyl CoA thiolase	sens	CGA GGG GAT GCT GTA GAT GA	224	AK322858
					antisens	AAC AGG ACT TCC CTT CCA TTG
	NO et WD	Agmatine			sens	AGA CAA CTT GCC CAC CTT CAA	162	AK327374
	(+)	coumaroyltransferase		antisens	TC CCT TGC GCT TAG CAA TG
	NO(+)	Acetylornithine deacetylase	sens	GCC AAA GCT ACT GAA GAG GTT G	263	AK328079
					antisens	ACG AAC ATT GAG ATG GAT GCT
	WD (+)	(OPR1) 12-oxophytodienoate	sens	CGA GCT GAT CTT GTT GCG	271	AK324415
		reductase 1			antisens	GGG CAT GAG TAT TAT TGG GAG T
	WD (+)	(OPR3) 12-oxophytodienoate	sens	G GCA CAA GGT GAT GCT GAT	250	BT014368
		reductase 3			antisens	TG CCC AAC AAA ATC AGG TTT
	NO(+)	Basic	Blue	Protein	sens	GGC GGT GAA TAA AGG TGG T	223	GO372888
		(Plantacyanin)		antisens	A CCA ACA TAG GTG ACA CAT GAT AGA

2 (www.cran.rproject.org)

. Dans un premier temps, un test de Tukey a été réalisé pour détecter des différences statistiques parmi les traitements. Dans un second temps, la différence statistique entre deux traitements a été effectuée par le test t de Student (p<0.05). Pour les analyses des puces à ADN, le test de Student a été utilisé (p<0.05) afin d'identifier les gènes changeant de façon significative entre les groupes.

Amélioration de la technique de mesure du peroxyde d'hydrogène par spectrométrie.

  La section 2.7 présente, sous la forme d'un article accepté dans le journal "Americal Journal of Analytical Chemistry", les travaux réalisés pour améliorer le dosage du peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2 ) par une technique de spectrométrie proposée par[START_REF] Velikova | Oxidative Stress and Some Antioxidant Systems in Acid Rain-Treated Bean Plants: Protective Role of Exogenous Polyamines[END_REF], très utilisée en biologie végétale. Suite aux difficultés auxquelles nous avons été confrontés lors du dosage du peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2 ), nous avons étudié dans le détail cette méthode de dosage. Cette technique comprend le suivi, par spectrométrie, de l'apparition du triiode (I 3 ), produit de la réaction de l'iode avec H 2 O 2 . Au cours de cette étude, nous nous sommes rendus compte que la longueur d'onde utilisée n'était pas la plus adaptée pour suivre la cinétique de cette réaction. En effet, la plus forte absorption a été détectée à 350 nm et non à 390 nm. Cependant, le dosage de H 2 O 2 restait impossible pour certains échantillons de fruits et de feuilles, même après modification de la longueur d'onde (passage de 390 nm à 350 nm).

Une étude plus approfondie a permis de mettre en avant que le pH de la réaction dépendait de l'organe étudié. Effectivement, un meilleur signal a été détecté à pH 8 pour les fruits et à pH 5.8 pour les feuilles. De plus, cette étude a révélé l'importance de prendre en compte la coloration naturelle des tissus. En effet, nous avons constaté que la coloration naturelle des tissus influence grandement les résultats et peut induire une surestimation de la teneur en H 2 O 2 . Afin de remédier à ce problème, nous conseillons l'utilisation de contrôles sans réactif (KI), dans le but de pouvoir soustraire la coloration naturelle des tissus à celle de la réaction.

Résumé

Dans cette étude nous présentons une optimisation d'une technique colorimétrique pour le dosage du peroxyde d'hydrogène en utilisant l'iodure de potassium (KI). Notre méthode est basée sur l'utilisation d'un tampon unique pour l'extraction et la réaction. Cette technique évite la dégradation du H 2 O 2 par des antioxydants lors de l'extraction et l'utilisation de contrôle sans KI permet d'éliminer la coloration naturelle des tissus. Le pH du tampon réactionnel a aussi été modifié car nous avons noté que l'efficacité de la réaction dépendait du pH d'un organe à l'autre. Avec cette méthode peu coûteuse, il est possible d'analyser 12

Table 1 .

 1 (a) H 2 O 2 concentration measured in absence and presence of 1 nmole ascorbic acid added before KI or together with KI; (b) Influence of the ratio of tomato tissue to buffer on hydrogen peroxide concentration. Statistical significance was determined with student t-test (p < 0.05) with "R" 2.12.2 statistical software (www.cran.rproject.org); (c) Hydrogen peroxide content in fruits and leaves of tomato plants treated or not with HgCl 2 using the optimized protocol. Statistical significance was determined by student t-test (p < 0.05) with "R" 2.12.2 statistical software (www.cran.rproject.org).

	(a)

O 2 concentration (nmole) Measured H 2 O 2 concentration (nmole)

		1 nmol ASA added before KI (c)	1 nmol ASA added together with KI
	0	0.00 ± 0.00	0.00 ± 0.01
	1	0.00 ± 0.00	0.82 ± 0.04
	2	0.00 ± 0.00	1.78 ± 0.13
	3	0.32 ± 0.00	2.68 ± 0.13
	4	1.46 ± 0.09	3.65 ± 0.03
	5	2.43 ± 0.03	4.44 ± 0.06
	6	3.33 ± 0.01	5.75 ± 0.10
		(b)
	mg FW/ml		H 2 O 2 (nmol/g)
	50		491.20 ± 18.74 a
	100		528.86 ± 0.61 a
	150		612.10 ± 17.53 b
	200		584.33 ± 12.45 a
	250		377.96 ± 15.78 c
		(c)
	Organ	Treatment	H 2 O 2 (nmol/gFW)
		Control	77.16 ± 9.07 a
	Fruits	5 ppm HgCl 2	175.73 ± 5.79 b
		Control	472.57 ± 8.73 a
	Leaves	5 ppm HgCl 2	836.97 ± 9.85 b

Le mercure induit la synthèse de NO et ABA et l'activation du système de défense antioxydant dans le fruit de tomate

  2 O 2 , le MDA et la teneur en AsA ont été mesurés. Les activités des enzymes antioxydantes SOD, CAT, APX, MDHAR, DHAR et GR ont été suivies. Nous avons constaté une augmentation de la teneur en H 2 O 2 dans tous les organes des plantes soumises aux traitements HgCl 2 . Seule la concentration en MDA dans le péricarpe des fruits

	Le chapitre 3-1 présente, sous forme d'un article soumis dans le journal "Journal of
	Experimental Botany", les travaux réalisés dans le but de déterminer si l'oxyde nitrique est
	impliqué dans la réponse du fruit à un déficit hydrique rapide et contrôlé appliqué au plant de
	tomate. Suite aux précédente études réalisées par l'équipe (Murshed R, 2008a; Murshed et al.,
	2013a, b) sur l'impact des stress hydriques et salins sur les systèmes antioxydants, nous nous
	sommes intéressés à cette molécules signal et à l'acide abscissique. Cette étude a également pour

reliable for the determination of H 2 O 2 in different plant tissues. Indeed, this method allows overcoming interference of soluble antioxidant and color background. With this inexpensive microplate method, it is possible to Chapitre 3-1.

objectif de déterminer si la mise en place du système de défense est liée à un phénomène adaptatif ou à une réponse précoce du fruit, au stress subit par l'appareil végétatif. Le déficit hydrique a été provoqué par l'inhibition de l'activité des aquaporines avec du chlorure de mercure (HgCl 2 ). Le traitement a été appliqué deux heures après le début de la photopériode, et les mesures ont été effectuées 24h après. A l'initiation de la photopériode, l'absorption et le flux d'eau dans la plante sont essentiellement assurés par la poussée racinaire, avec une contribution négligeable de la transpiration

[START_REF] Javot | Role of a Single Aquaporin Isoform in Root Water Uptake[END_REF] Lopez et al., 2003; Maggio and Joly, 1995)

. L'inhibition des aquaporines par le HgCl 2 a permis d'atteindre des conditions de stress hydrique rapide. Le NO et l'ABA jouent un rôle important dans la réponse au stress hydrique chez les végétaux. En effet, il est maintenant clairement établi que l'ABA intervient dans la fermeture stomatique afin de réduire l'évapotranspiration lors d'un manque d'eau ressenti par les végétaux. Cependant, des études ont démontré que ce dernier pouvait aussi induire l'activation d'enzymes antioxydantes au cours de périodes stressantes pour la plante

(Bellaire et al., 2000)

. L'oxyde nitrique, à qui de nombreuses études chez les végétaux ont été consacrées durant ces quinze dernières années, est fortement lié aux conditions dites de stress. De plus, il a été montré qu'il pouvait exister une forte relation entre ces deux molécules

(Hancock et al., 2011)

. Les indicateurs hydriques (potentiel hydrique, potentiel osmotique et teneur en eau), le H après le déficit hydrique n'a pas changé. Suite aux traitements, Les activités des enzymes antioxydantes ont augmenté significativement dans les fruits des plants soumis aux traitements durant 24h. Nous avons aussi constaté un accroissement de la teneur en ABA dans les feuilles et les Chapitre 3-1

: Le mercure induit la synthèse de NO et ABA et l'activation du système de défense antioxydant dans le fruit de tomate 58

  pédicelles. Le taux de NO émis par les feuilles et les fruits est plus important chez les plants soumis au déficit hydrique, avec de plus fortes valeurs pendant la nuit. Nos observations démontrent que le déficit hydrique cause synthèse de NO et une altération rapide du statut redox dans les plants de tomate. De plus, la modification du système antioxydant dans les fruits indique que le NO et/ou l'ABA pourrait participer au maintien du statut redox dans les fruits. Cette étude indique qu'au cours d'un déficit hydrique, le système antioxydant dans les fruits peut être activé, même en l'absence de symptômes de déficit hydrique dans ces derniers (les potentiels hydrique et osmotiques, les teneurs en MDA, en AsA ne sont pas affectées par les traitements). Au travers d'une approche pharmacologique, nous confirmons également, que le NO est impliqué dans l'activation des enzymes antioxydantes dans les fruits.

	Chapitre 3-

1 : Le mercure induit la synthèse de NO et ABA et l'activation du système de défense antioxydant dans le fruit de tomate 59 Hindering root pressure stimulates NO and ABA synthesis along with antioxidant defense systems in tomato fruits (Solanum lycopersicum L, cv. Micro-Tom)

  The activities of antioxidant enzyme: superoxide dismutase and catalase, as well as the activities of the enzymes of ascorbate-glutathione cycle were investigated. Water deficit treatments induced a decline in predawn leaf water potential (Ψ leaf ) and other parameters of water status of fruits, leaves and fruit pedicels of treated plants remained unaffected. H 2 O 2 concentration increased in leaves and fruit pedicels and pericarp of treated plants while we observed no lipid peroxidation of the membranes in those organs except in the pedicels. Antioxidant enzymes activities increased

	Running title : Rapid water deficit stimulates NO and ABA synthesis and antioxidant defense systems in
	tomato fruits.
	Authors: Sanders JUNGLEE	1,4 , Ramzi MURSHED 1,2 , Laurent URBAN 1 , Sandrine LAURENT	1 , Mohamed EL MAÂTAOUI	1 , Julien
	MANDON	3 , Huguette SALLANON 1 , Simona M. CRISTESCU 3 , Félicie LOPEZ-LAURI	1 .
	Addresses:

1 Laboratoire de Physiologie des Fruits et Légumes, UMR QualiSud, Université d'Avignon et des Pays du Vaucluse, Avignon, France. 2 Current address: Department of Horticulture, Faculty of Agriculture, Damascus University, Damascus, Syria 3 Life Science Trace Gas Facility, Radboud University Nijmegen, Heijendaalseweg 135, 6525 AJ Nijmegen, The Netherlands 4 Corresponding Author

Abstract

The effects of a rapid water deficit obtained by mercury treatments on water status, hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) and malonyldialdehyde (MDA) contents and the total ascorbate pool size were studied in leaves, fruit pedicels and pericarps of tomato (Solanum lycopersicum L. cv. Micro-Tom). significantly as a consequence of mercury treatments. Abscissic acid (ABA) concentration increased in the leaves and pedicel except in the fruit pericarp. An increase in nitric oxide (NO) production was also observed in different organs. Our observations indicate that water deficit Chapitre 3-1

: Le mercure induit la synthèse de NO et ABA et l'activation du système de défense antioxydant dans le fruit de tomate Introduction

Drought, one of the most important environmental factors influencing plant growth and development, will increase in frequency, intensity and geographic expanse as a consequence of global climate change

(Smith et al., 2009)

. Drought is generally considered negative because it is believed that the associated decreases in stomatal conductance and net photosynthesis will necessarily result in a decrease in crop production. Fortunately, there are not only bad news associated with stress. It has been suggested that stress in general, and moderate drought in particular, could be exploited to positively influence the secondary metabolism of fruits and vegetables, potentially benefitting consumers in terms of the concentrations of phytochemicals, i.e., vitamins and other compounds that exert protective effects against cardiovascular diseases, metabolic diseases, neurodegenerative diseases and cancers

(Poiroux-Gonord et al., 2010)

.

Plants cannot escape and must adapt to water shortage. Responses vary from rapid physiological adjustments allowing for temporary survival to long-term biological adaptations, such as root development. One of the first important effects of water deficit is the induction of oxidative stress in plants by interfering with electron transport in the chloroplasts and mitochondria, leading

Chapitre 3-1 : Le mercure induit la synthèse de NO et ABA et l'activation du système de défense antioxydant dans le fruit de tomate 67

Table 1 :

 1 Fruit water potential (Ψ fruit ), fruit osmotic potential (Ψ fruit ), leaf water potential (Ψ leaf ) and water content of fruits (FWC), leaves (LWC) of plants treated with 0, 2, 5 and 10 ppm of HgCl 2 for 24 and 48 hours. Values are the mean (± S.E.) of six replicates, and different letters within columns indicate significant differences according to a heteroscedastic two tailed Student t-test (P<0.05).

Table 2 ,

 2 the JIP test parameters were not significantly affected in response to the water deficit

Chapitre 3-1 : Le mercure induit la synthèse de NO et ABA et l'activation du système de défense antioxydant dans le fruit de tomate 68

  treatments. The performance index (PI), which describes the energy conservation between photons that were absorbed by PSII and the reduction of electron acceptors, did not change in any treatment.

Table 2 :

 2 Effects of Mercuric Chloride (HgCl 2 ) treatments on Solanum lycopersicum L, cv."Microtom" evaluated by parameters derived from the JIP-test from the OJIP transient exhibited by dark-adapted leaves of plants grown with 0 (control), 2, 5 and 10 ppm HgCl 2 .

	HgCl 2	Fv/Fm
	(ppm)	(TR 0 /AB)	Pi		ET 0 /ABS	ABS/RC	TR 0 /RC	ET 0 /RC	DI 0 /RC
		0.85 ±	4.72 ±	0.33 ±	0.78 ±	0.66 ±	0.259 ±	0.12 ±
	0	0.001 a	0.168 a	0.002	a	0.02	a	0.02	a	0.005	a	0.003	a
		0.85 ±	5.22 ±	0.34 ±	0.73 ±	0.62 ±	0.247 ±	0.11 ±
	2	0.002 a	0.199	a	0.003	a	0.02	a	0.02	a	0.006	a	0.003	a
		0.85 ±	4.99 ±	0.33 ±	0.75 ±	0.64 ±	0.250 ±	0.11 ±
	5	0.002 a	0.337	a	0.003	a	0.03	a	0.03	a	0.009	a	0.004	a
		0.85 ±	5.39 ±	0.34 ±	0.72 ±	0.61 ±	0.243 ±	0.11 ±
	10	0.001 a	0.346	a	0.003	a	0.03	a	0.03	a	0.009	a	0.005

a Values are the mean (± S.E.) of five replicates, and different letters within columns indicate significant differences (P<0.05).

Table 3 :

 3 H 2 O 2 (nmol. g -1 FW) and malonyldialdehyde (MDA; nmol. g -1 FW) contents in fruit pericarps, leaves and fruit pedicels of control plants (C) and plants treated with 2, 5 and 10 ppm of HgCl 2 for 24 hours. Values are the mean (± S.E.) of six replicates, and different letters within columns indicate significant differences according to a heteroscedastic two tailed Student t-test (P<0.05).

					H 2 O 2 (nml/gFW)					MDA (nmol/gFW)
		HgCl 2	Fruit	Fruit	Leaves	Fruit	Fruit	Leaves
		(ppm)	pericarps	pedicels				pericarps	pedicels
	24h	0	77.2 ±	361.2 ±	849.4 ±	34.74 ±	7.87 ±	34.04 ±
			0.7 a		31.3	a	17.6	a		5.24	a	0.19	a	0.19	a
		2	180.0 ±	688.2 ±	804.2 ±	34.37 ±	10.12 ±	33.19 ±
			21.1	b	73.1	b	34.2	a		6.83	a	0.95	b	0.95	a
		5	175.7 ±	985.2 ±	1081.7 ±	35.13 ±	15.82 ±	33.36 ±
			30.3	b	69.9	c	107.6	b	6.62	a	0.53	c	0.53	a
		10	118.3 ±	1183.5 ±	1013.5 ±	37.04 ±	15.57 ±	32.16 ±
			15.3	c	98.3	d	87.3	b		3.21	a	0.28	c	1.42

a Values are the mean (± S.E.) of five replicates, and different letters within columns indicate significant differences (P<0.05).

1 : Le mercure induit la synthèse de NO et ABA et l'activation du système de défense antioxydant dans le fruit de tomate 78

Table 4 :

 4 Ascorbate

	Organs	Hg (ppm)	AsA		DHA			(AsA) and
	Fruit pericarp 0	2.11 ± 0.07	a	0.26 ±0. 05	a	dehydroascorbate concentrations (µmol. g -1 FW) (DHA)
		2	1.82 ± 0.14	a	0.21 ± 0.03	a	and Total AsA (AsA + DHA) in fruit pericarp, pedicels and
		5	2.04 ± 0.09	a	0.26 ± 0.01	a	leaves of control plants (C) and plants treated with 2, 5 and 10
		10	2.05 ± 0.21	a	0.24 ± 0.03	a	ppm of HgCl 2 for 24 hours. Values are the mean (± S.E.) of
	Fruit pedicel	0	0.71 ± 0.02	a	1.38 ± 0.03	a	five replicates, and different
		2	1.39 ± 0.04	b	1.46 ± 0.04	a	letters within columns indicate significant differences according
		5	1.23 ± 0.06	b	1.83 ± 0.07	b	to a heteroscedastic two tailed
		10	1.18 ± 0.02	b	2.77 ± 0.5	c
	Leaf	0	2.75 ± 0.09	a	2.44 ± 0.07	a
		2	3.25 ±0.12	a	2.01 ± 0.10	b
		5	4.16 ± 0.08	b	1.40 ± 0.07	c
		10	4.36 ± 0.13	b	1.13 ± 0.08

c

Chapitre 3-1 : Le mercure induit la synthèse de NO et ABA et l'activation du système de défense antioxydant dans le fruit de tomate 79

Table 5 :

 5 Ascorbate

	5 mM SNP	C + cPTIO	SNP + cPTIO

c

: Le mercure induit la synthèse de NO et ABA et l'activation du système de défense antioxydant dans le fruit de tomate 85

. ABA and NO have synergistic effects in increasing the activities of SOD, CAT and APX in Stylosanthes guianensis. In the leaves, stomatal closure by ABA is dependent not only on H 2 O 2 but Chapitre 3-1 also on NO

  5 ml KI (1M) and 0.25 ml potassium phosphate buffer(10 mM, pH 8) at 4°C for 10 min (one-step buffer: extraction and colorimetric reaction combined). At the same time, for every sample, a control was prepared with H 2 O instead of KI for tissue coloration background. We took care to protect samples and solutions from light. The homogenate was centrifuged at 12,000 × g for 15 min at 4°C. 200 µL of supernatant from each tube was placed in UV-microplate wells and left to incubate at room temperature (20 -22°C) for 20 min. Samples and blanks were analyzed in triplicate. A

calibration curve obtained with H 2 O 2 standard solutions prepared in 0.1 % TCA was used for quantification. The microplate reader used was a PowerWave HT microplate spectrophotometer from BioTek (France) fitted with an internal temperature incubator and a shaker for kinetic and spectrum analysis. KC4 data software was used to check the reader and to analyze reactions.

Chapitre 3-2 : ABA, H 2 O 2 et NO influent sur les systèmes de défense antioxydants de fruits détachés de tomate

111 in 50% glycerol in PBS (v:v) on microscope slides

Chapitre 3-2 : ABA, H 2 O 2 et NO influent sur les systèmes de défense antioxydants de fruits détachés de tomate 112

  Fluorescence microscopy revealed an overproduction of NO after ABA and H 2 O 2 treatments

  (b)]. Abscisic acid content decreased by approximately 2 times compared to control in H 2 O 2 and H 2 O 2 + cPTIO treatments [figure 5(b)].ABA is thought to be involved as a secondary messenger in the cellular signaling process leading to the stimulation of antioxidant defenses under stress. See(Lee and Luan, 2012) for a review. In our study, we observed a significant decrease in H 2 O 2 content 8 and 12 hours after the ABA treatment [figure6(b)], whereas there was no significant impact on APX activity [figure2(ii)]. This seems consistent with the view developed by(Ye et al., 2011) who suggest that ABA may play an important role in the fine tuning of H 2 O 2 by modulating catalase genes. On the other hand, ABA treatments resulted in an increase in MDHAR and DHAR activity, and ultimately AsA and DHA contents.Interestingly we observed a significant decrease in ABA content after H 2 O 2 application. These results are in line with the observation of a stimulating role of H 2 O 2 in ABA catabolism and seed germination(Liu et al., 2010). Such observations suggest a negative feedback control of ABA by H 2 O 2 . The emerging view is that a high H 2 O 2 concentration results in ABA

Chapitre 3-2 : ABA, H 2 O 2 et NO influent sur les systèmes de défense antioxydants de fruits détachés de tomate 115 through

  the stimulation of the activities of antioxidants and the reduction of peroxidation of membrane lipids in leaves and roots. Our own observations show that treatment of fruits with H 2 O 2 results in an increase in H 2 O 2 content [figure 1 (c)], and APX activity [figure 2 (c)]. H 2 O 2 also influenced the ascorbate-glutathione cycle, which is responsible for removal of excess ROS in cells; it moreover influenced the AsA and DHA concentrations [Table 1 (c)] as well as the activities of MDHAR and DHAR [figure

Table 1 (a):

 1 Ascorbate (AsA) and dehydroascorbate (DHA) concentrations (µmol g -1 FW) in fruit pericarp of control detached fruits with pedicels dipped in MS solution(C) and treated fruits with pedicels dipped in 0.5 mM SNP, 0.05 mM SNP, MS + 1 mM cPTIO and 0.5 mM SNP + 1 mM cPTIO for 4h, 8h and 12h. Values are the mean (± S.E.) of five replicates, and different letters indicate statistical difference (P<0.05) between treatments according to heteroscedastic two tailed Student t-test.

			Ascorbate	Dehydroascorbate
			µmol/g FW	µmol/g FW
	0H	C	0.97 ± 0.03 a	0.16 ± 0.04 a
	4H	C	1.17 ± 0.03 b	0.18 ± 0.02 a
		SNP 0.05	1.07 ± 0.07 b	-
		SNP 0.5	1.12 ± 0.04 b	-
		C + cPTIO	1.28 ± 0.03 c	0.12 ± 0.02 a
		SNP 0.5 + cPTIO	1.15 ± 0.05 b	0.05 ± 0.01 b
	8H	C	1.17 ± 0.03 b	0.25 ± 0.02 c
		SNP 0.05	1.20 ± 0.08 b	-
		SNP 0.5	0.82 ± 0.04 d	-
		C + cPTIO	1.37 ± 0.03 e	0.15 ± 0.01 d

Table 1 (b):

 1 Ascorbate (AsA) and dehydroascorbate (DHA) concentrations (µmol g -1 FW) in fruit pericarp of control detached fruits with pedicels dipped in 0.1 mM ABA, MS + 1 mM cPTIO and 0.1 mM ABA + 1 mM cPTIO for 4h, 8h, 12h and 24h. Values are the mean (± S.E.) of five replicates, and different letters indicate statistical difference (P<0.05) between treatments according to heteroscedastic two tailed Student t-test.

			Ascorbate	Dehydroascorbate
			µmol/g FW	µmol/g FW
	0h	C	0.97 ± 0.03 a	0.16 ± 0.04 a
	4h	C	1.17 ± 0.03 b	0.18 ± 0.02 a
		ABA	1.41 ± 0.03 c	0.25 ± 0.02 b
		C + cPTIO	1.28 ± 0.03 d	0.12 ± 0.02 a
		ABA + cPTIO	1.19 ± 0.04 b	0.22 ± 0.02 ab
	8h	C	1.17 ± 0.03 d	0.25 ± 0.02 ab
		ABA	1.69 ± 0.03 e	0.28 ± 0.04 ab
		C + cPTIO	1.37 ± 0.03 c	0.15 ± 0.01 a
		ABA + cPTIO 1.34 ± 0.06 cd	0.15 ± 0.01 a
	12h	C	1.30 ± 0.03 d	0.09 ± 0.01 c
		ABA	1.10 ± 0.06 b	0.12 ± 0.04 a
		C + cPTIO	1.18 ± 0.02 b	0.18 ± 0.02 a
		ABA + cPTIO	1.38 ± 0.05 c	0.23 ± 0.02 ab
	24h	C	1.34 ± 0.03 cd	0.23 ± 0.03 ab
		ABA	1.39 ± 0.04 c	0.23 ± 0.01 ab
		C + cPTIO	1.51 ± 0.04 c	0.09 ± 0.00 c
		ABA + cPTIO	1.32 ± 0.06 b	0.13 ± 0.02 a

Table 1 (

 1 c): Ascorbate (AsA) and dehydroascorbate (DHA) concentrations (µmol g -1 FW) in fruit pericarp of control detached fruits with pedicels dipped in MS solution(C) and treated fruits with pedicels dipped in 0.5 mM H 2 O 2 , MS + 1 mM cPTIO and 0.5 mM H 2 O 2 + 1 mM cPTIO for 4h, 8h, 12h, 16h (middle of dark period) and 24h. Values are the mean (± S.E.) of five replicates, and different letters indicate statistical difference (P<0.05) between treatments according to heteroscedastic two tailed Student t-test.

			Ascorbate	Dehydroascorbate
			µmol/g FW	µmol/g FW
	0h	C	0.97 ± 0.03 a	0.16 ± 0.04 a
	4h	C	1.17 ± 0.03 b	0.18 ± 0.02 b
		H2O2	1.48 ± 0.07 c	0.21 ± 0.02 b
		C + cPTIO	1.28 ± 0.03 d	0.12 ± 0.02 a
		H2O2 + cPTIO	1.42 ± 0.04 c	0.23 ± 0.02 b
	8h	C	1.17 ± 0.03 d	0.25 ± 0.02 b
		H2O2	1.22 ± 0.06 d	0.31 ± 0.01 c
		C + cPTIO	1.37 ± 0.03d c	0.15 ± 0.01 a
		H2O2 + cPTIO	1.27 ± 0.03 d	0.36 ± 0.03 c
	12h	C	1.30 ± 0.03 d	0.09 ± 0.01 e
		H2O2	1.19 ± 0.06 d	0.29 ± 0.01 c
		C + cPTIO	1.18 ± 0.02 d	0.18 ± 0.02 b
		H2O2 + cPTIO	1.24 ± 0.03 d	0.37 ± 0.01 f
	24h	C	1.34 ± 0.03 d	0.23 ± 0.03 b
		H2O2	1.63 ± 0.05 e	0.22 ± 0.01 b
		C + cPTIO	1.51 ± 0.04 f	0.09 ± 0.00 e
		H2O2 + cPTIO 1.32 ± 0.09d c	0.32 ± 0.02 c

tomique de la réponse de fruits de tomates au NO et

					t à un déficit hydrique. t à un déficit hydrique.
		Miscellaneous
		5%
		Unknown
	Metaboli 22% bolism 2%	40%	Uncharacterized 25%
	ed
	Gene coding 15% ding	Transport			Defense 13%	Unknown 7%
		20%
					Phytohormone
	Signalling	Transport	interaction
		7%		4%	2%
	tion des 5 gènes sousexprimés par le traitement au NO d'après rès leur Figure 5 Distribution des d'après leur fonction. des 359 gènes sousexprimés par le traitement de déficit hydr
	Traitement NO et le déf déficit hydrique partagent 39 % de gènes de déf défense Miscellaneous Uncharacterized 11% 5% De plus l'analyse t transcriptomique de l'expression des gène ènes régulés par le
	bolism traitement NO et un déficit hy hydrique révèle que 23 gènes sont régulés pa Unknown par le traitement NO
	5% mais également par le traiteme ment hydrique. Le même profil de régulation 14% n a été observé dans
	les deux traitements avec une une sur-expression de 21 gènes et une sous--expression deux 2
	Defense 16% t une possible co-régulation de ces gènes impliq ing gènes. Ces résultats révélent un liqués dans 4 grandes
	fonctions : défense (~39 %), m , métabolisme (~30 %) et transport de l'eau (~1 ~13 %), processus de
	développement (~4 %) (Tablea leau. 1).
	Phytohormo metabolism interaction 7% rmone nse co-régulés par le NO et le stress hydrique Water transport Les gènes de défense que supporte d'autant port olism, plus le rôle important joué par ar le NO dans la mise en place de système de d e défense au cours de ction 3% conditions défavorables (Corp rpas et al., 2011; Lin et al., 2011; Xiong et a t al., 2010; Yu et al.,
	s 626 gènes surexprimés par le traitement au déficit hydrique ue d'après 2014). De façon intéressante n e nous avons noté que l'APX cytosolique (APX PX1) faisait partie de
	cette sélection. Au cours d de nos précédentes études, nous avons c contasté de fortes
	augmenations de l'activité de de l'APX induites par le NO. Cette augme mentation au niveau
	transcriptionnel, nous confirm irme l'importance du NO dans la régulation ion de cette enzyme
	antioxydante qui est de plus i s intimement lié à l'ascorbate, son substrat. P Parmi les gènes de
	défense co-régulés, nous pouvo uvons compter des subtilisine-like protéases, de des sérines protéases
	qui possèdent divers fonction ions chez les végétaux en passant du dévelop loppement jusqu'à la
	signalisation ainsi que dans ns la défense (Rautengarten C, 2005; Schal haller, 2004). Il est
	intéressant de noter que ces pr protéases sont surtout associées au stress biotiq otique, notamment au
					134 135

Table1 Expression de gènes co-régulés par les traitements NO et déficit hydrique

			tomique de la réponse de fruits de tomates au NO et t à un déficit hydrique.
	L'acide jasmonique, le NO et le t le déficit hydrique
	Function	Accession number	Description	Fold change	ttest TMvsNO	Fold Change	Ttest TMvsSH
		Au cours de cette étude de nous avons également noté une surexpressio ssion de nombreux gènes	NO/TM (log2)		SH/TM(log2)
	Water transport impliqués dans la synthèse de de l'acide jasmonique. Une partie de ces gènes es étaient induits soit par
		BG130774	Aquaporin PIP2-1-like (LOC101248037), misc_RNA	1.146	0.02	2.3	0.009
	BG131363 le NO ou le stress hydrique e (Figure 6). La synthèse de l'acide jasmoni Aquaporin PIP2-1-like (LOC101248037), misc_RNA onique est initiée par la	1.188	0.03	1.4	0.049
	BG626235 dégradation d'acides gras poly olyinsaturés par des lipoxygénases (LOXs) (W Aquaporin PIP2-1-like (LOC101247747), misc_RNA (Wasternack, 2007). Ces	0.674	0.03	0.9	0.008
	Defense acides d'acides gras polyins AI775181 insaturés peuvent provenir de la monoga Cytosolic ascorbate peroxidase 1 (APX1), mRNA, complete cds galactosyldiacylglycerol	0.662	0.03	1	0.019
	AK327374 (MGDG), un glycolipide impo portant dans la composition de la membrane ch Agmatine coumaroyltransferase-2-like (LOC101244961), mRNA chloroplastique (Cyrille	0.689	0.01	2.1	0.001
	AK326126 et al., 2011). Le traitement NO NO a aussi induit une surexpression de la 3-ke Anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase-like, transcript variant 3 (LOC101244316), mRNA ketoacyl-CoA thiolase 2	0.728	0.04	1.1	0.018
	EG553627 MTS1/ AY840091 (KAT2), la dernière enzyme d Disease resistance response protein 206-like (LOC101250552), mRNA Monoterpene synthase 1 (MTS1) mRNA, complete cds e de la voie de biosynthèse de JA (Cruz Cas astillo et al., 2004). La	1.066 1.607	0.02 0.01	0.6 1.6	0.037 0.015
	GH623050 synthèse de l'acide jasmoniqu PCF0595x184 PAMP-elicited tomato leaf cDNA 5', mRNA ique se déroule dans deux organites distinc ncts dans la cellule, le	0.894	0.04	1.5	0.018
	TA38526_4081 choroplaste et le peroxisome. D Subtilisin-like protease-like (LOC101252447), mRNA e. Dans le premier, le composé final est le 12--oxo-phytodienoic acid	1.152	0.01	0.7	0.041
		BT013554	Subtilisin-like protease-like (LOC101252733), mRNA	0.965	0.01	0.6	0.046
	XTH6/AY497477 (OPDA) et celui-ci doit être tr transporté vers le peroxisome. Ce transport es Xyloglucan endotransglucosylase-hydrolase XTH6, mRNA t est assuré par des ABC	0.616	0.01	1	0.001
	Metabolism transporter (Hayashi et al., 200 002; Zolman et al., 2001) et nous avons noté u é une forte surexpression
	DB710426 AK320876 de ce transporteur au cour du s u stress hydrique. De plus, les gène 12-oxophy Arabidopsis thaliana Sulfite exporter TauE/SafE family protein mRNA, complete cds Monothiol glutaredoxin-S1-like (LOC101250592), mRNA hytodienoate reductase 1	1.237 0.889	0.02 0.04	1.4 1.1	0.026 0.041
	AJ320056 et 3 (OPRI et OPR3) qui son ont responsables de la réduction de l'OPDA Polygalacturonase At1g48100-like (LOC101261316), mRNA A en 2S-3-oxo-2(2′[Z]-	0.804	0.03	1.2	0.001
	TA55012_4081 pentenyl)-cyclopentane-1-octa ctanoate (OPC) (Breithaupt et al., 2006), l'étap Polygalacturonase At1g48100-like (LOC101261316), mRNA tape avant l'intervention	1.26	0.04	1.9	0.002
	TPRP-F 1/ BT013052 Proline rich protein, transcript variant 2 (TPRP-F1), mRNA TPRP-F1/ BI932748 Proline rich protein, transcript variant 2 (TPRP-F1), mRNA de la KAT sont aussi positivem vement régulé durant le déficit hydrique. Ces o s observations suggèrent	2.454 1.45	0.01 < 0.01	1.5 1.2	0.033 0.019
	AK319704 que le NO participe dans la pro production de JA au cours d'un déficit hydrique Salutaridinol 7-O-acetyltransferase-like (LOC101260610), mRNA ue.	0.603	0.03	0.7	0.012
	Others
		BG127261	Pollen allergen Che a 1-like (LOC101262972), mRNA	0.74	0.03	0.9	0.011
		TA38992_4081	Uncharacterized LOC101258883 (LOC101258883), mRNA	1.139	0.03	1.3	0.046
	Figure 6 Co-expression de gènes impliqu iqués dans la voie de biosynthèse de l'acide jasmonique par le
			139

le NO et le déficit hydrique.

  afin d'établir quel(s) sont les meilleurs gènes de références adaptés aux conditions expérimentales de l'étude.Le premier logiciel a permis de classer les gènes de références selon leur stabilité d'expression, M (Fig 7). Les résultats obtenus montrent que les gènes de références Sand, Ef et Cac sont les plus stables tandis que l'actine est le gène présentant une expression peu stable dans les échantillons de l'expérimentation. Ces résultats ont été confirmés via le logiciel Normfinder où Sand a été déterminé comme étant le gène de référence le plus stable, avec une valeur de stabilité de 0.159 et l'actine le gène de référence le moins stable pour nos conditions expérimentales (0.226). Bien que classiquement utilisé dans de nombreuses études, l'actine ne doit être utilisé que lorsqu'il est stable dans l'ensemble des conditions expérimentales et doit être testé dans tout les cas afin d'éviter toutes erreurs d'interprétations. En effet il est admis depuis quelques années qu'il n'existe pas de gènes de référence universels, qui soient exprimés de façon stable, dans toutes les conditions et types de cellules étudiées

  ). Le logiciel GeNorm a permis calculer la variation par paire de l'ensemble des gènes de références étudiés. (Vn/Vn+1) et de déterminer que 2 gènes de références doivent être utilisés pour que le calcul de l'expression relative des gènes d'intérêts soit le plus fiable en se basant sur une valeur seuil de 0.15 au-dessous de laquelle il n'est pas nécessaire d'ajouter un gène de référence aux plans expérimental(Vandesompele et al., 2002b) L'analyse du transcriptome montre que le NO induit très peu de gènes dans le fruit de tomate comparé au déficit hydrique. Cependant, un nombre relativement important de ces gènes

	est impliqué dans des systèmes de défense ou encore dans des voies métabolique importantes
	comme le transports d'eau. Ce résultas restent à être valider par qPCR, travail que nous avons
	entamer et qui sera prochainement exploitable. Cette étude a aussi permis d'évaluer les gènes de
	références les plus stables : Sand, Ef et Cac respectivement et quel était le nombre optimal de
	gènes de références nécessaires pour réaliser des calculs de l'expression relative de gènes
	d'intérêt.

  . La baisse significative du flux d'eau ainsi que la chute du potentiel hydrique au niveau des feuilles, a permis de confirmer que le HgCl 2 avait bien causé un déficit hydrique. De plus l'absence de perturbation au niveau du photosystème II a confirmé que le stress hydrique n'avait pas été affecté le fonctionnement et la structure de l'appareil photosynthétique.Les teneurs en MDA et en H 2 O 2 ont servi d'indicateurs du statut oxydatif dans cette étude.Nous avons noté qu'après 24h de déficit hydrique, la concentration en H 2 O 2 avait augmentée dans les feuilles, les pédicelles et à moindre niveau dans les péricarpes des fruits entrainant une peroxydation des membranes des deux premiers organes. La protection des membranes peut être expliquée par l'augmentation de l'activité de la catalase et de l'APX que nous avons mesuré au niveau du péricarpe. De plus, l'absence de mercure dans les cellules des fruits soutient le fait que ce n'est pas une contamination au mercure qui a conduit à la mise en place du système de défense enzymatique, mais bien le déficit hydrique engendré par le blockage des aquaporines. Au cours de cette étude, nous avons non seulement détecté une surproduction de NO pendant les traitements au déficit hydrique, et notamment une sur production importante de NO pendant la nuit. Ce phénomène intéressant et la localisation de la production de NO dans les chloroplastes supportent la possible implication de la nitrate réductase (NR) dans la production de NO. En effet, il a été démontré qu'en plus de sa capacité à réduire le nitrate en nitrite, la NR pouvait aussi produire du NO

  O 2 , dans le maintient du statut redox dans des fruits détachés. Nous avons démontré la production de NO dans des fruits de tomate détachés traités avec de l'ABA et du H 2 O 2 . Une plus forte production de NO a été notée en présence de H 2 O 2 que d'ABA dans chaque fruit traité. Le mécanisme récemment décrit par(Yu et al., 2014) menant à la production de NO durant un déficit hydrique peut aider à expliquer ce phénomène. Ils mettent en avant une augmentation de la concentration d'ABA au cours d'un déficit hydrique qui conduit à une activation de NADPH oxydase résultant à une production de H 2 O 2 . Le H 2 O 2 ainsi produit activerait la production de NO au travers de la NR qui à son tour activerait des protéines kinases activées par des agents mitogènes (MAPK).Nous avons aussi révélé un fort impact du NO sur les enzymes de recyclage de l'ascorbate au cours de ce travail. Ces résultats vont dans le sens de la littérature où le NO est décrit comme un acteur important dans la mise en place de mécanismes de défense pour faire face à des conditions défavorables(Yu et al., 2014). L'augmentation de l'activité de l'APX par le NO a été confirmée par la baisse significative de H 2 O 2 , sa principale cible et de l'ascorbate son substrat, dans les fruits traités au SNP. Nous avons aussi noté une hausse telle de l'activité des enzymes MDHAR et DHAR dans ces derniers que la forme oxydée de l'ascorbate de dehydroascorbate n'était plus détectable. La participation du NO dans leur induction a été confirmée par les traitements au cPTIO où nous avons noté une baisse significative dans l'activité de ces enzymes pour atteindre le niveau des fruits non traités.

	Discussion généra énérale et conclusion
	le NO pouvait participer dans ans la synthèse de phytohormone tel l'acide ja jasmonique mais aussi
	interagir avec d'autre hormon one végétale comme l'éthylène ou l'ABA. N . Nous avons aussi pu
	démontrer que le NO pouvait it intervenir dans la régulation du déficit hydri drique non seulement en
	agissant sur l'expression de gè gène d'enzymes antioxydantes et leurs activités ités mais aussi au travers
	de la régulation des aquaporin rines. Les résultats obtenus au cours de nos d s différentes études sont
	schématisés dans la figure 19 m 9 mettant en lumière les interactions observées. es.
	. Chez la luzerne (Stylosanthes guianensis), ces deux molécules ont révélé une action synergique dans l'augmentation de l'activité des enzymes SOD, CAT et APX. Ce travail a permis de suivre les interactions entre trois molécules signal, le NO, l'ABA et teneur en H 2 O 2 suite à un traitement à l'ABA, ce qui est consistant avec les observations de (Ye et Figure 19 Schéma décrivant le lumières. Etude du déficit hydrique s t les principaux résultats obtenus au cours de ce travail de thè e sur la production du NO, de l'ABA et H 2 O 2 . Etude des thèse et les interactions mise en es effets de ces molécules signal le H 2 Le suivi de l'interaction entre les trois molécules a démontré une baisse significative de la sur fruits détachés. Etude tran ranscriptomique de l'effet du NO et du déficit hydriqu ique sur des fruits détachés.
	145

Tableau 3 Expression de gènes sur-exprimés par le déficit hydrique

					Annexes
	Signalling	). mRNA Acyl-protein thioesterase 2-like (LOC101261789). mRNA Arabidopsis thaliana phosphoglycerate mutase family protein mRNA. E3 ubiquitin-protein ligase RMA1H1-like (LOC101262152), mRNA TA49162_4081 BT013251 DB724834 AK322984 Patatin group A-3-like (LOC101245708), mRNA AI781350 Small Heat shock protein (MTSHP), mRNA AK321149 Ninja-family protein AFP1-like (LOC101268860), mRNA AK323759 Aquaporin PIP2-7-like (Aquaporin), mRNA BI206321 Calcium-dependent protein kinase 16-like (LOC101260391), mRNA AW648457 Chaperonin-like (LOC101244957), mRNA AK322333 Proline-rich protein DC2.15-like (LOC101263716), mRNA BI422058 Arogenate dehydratase/prephenate dehydratase 6, chloroplastic-like (LOC101247331), DB684196 GDSL esterase/lipase At1g28590-like (LOC101257443), mRNA BG135240 Microtubule-associated protein 6-like (LOC101261948), mRNA AK322449 PREDICTED: Solanum tuberosum heme-binding-like protein At3g10130, chloroplastic-like BG643750 Serine carboxypeptidase-like 26-like (LOC101247667), mRNA TA36189_4081 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate--homocysteine methyltransferase-like	1.69 1.40 1.45 0.80 1.00 1.30 0.93 0.83 0.61 0.92 1.32 0.80 1.60 0.90 0.70 1.30 0.70	0.04 0.01 0.02 <0.01 0.04 <0.01 <0.01 0.05 <0.01 0.04 <0.01 <0.01 0.02 0.03	0.02 0.02 < 0.01
	Phytohormone interaction Water transport Transport Siganlling Gene coding Metabolism Miscellaneous Miscellaneous Uncharacterized Defense Transport Uncharacterized Unknown Defense Phytohormone interaction Water transport Transport Gene coding Metabolism	AY497477 BT013365 AK322858 AW624950 AW932557 AW034241 AI899031 AK246936 AK320909 AK325274 BT013158 BG626235 BG130774 BG131363 TA43112_4081 AK324969 AK320719 DB710426 AK323143 DY523780 AK325198 AK322020 DB679261 BW692867 AK330046 AK320937 AK328079 TA38005_4081 AK322540 AK326126 BI924430 AK319204 GO375337 AK325683 AK321906 AI486498 AW041380 AJ320056 TA55012_4081 AK320407 AK325164 TA37634_4081 AK327017 BM408837 BE432268 AK320267 AK326904 BT013546 TA37569_4081 AK326802 GO372888 BG124171 E3 ubiquitin-protein ligase RNF149-like (LOC101265573), mRNA Xyloglucan endotransglucosylase-hydrolase XTH6 (XTH6). mRNA Auxin-induced in root cultures protein 12-like (LOC101262042). mRNA 3-ketoacyl-CoA thiolase 2. peroxisomal-like (LOC101262853). mRNA Cytokinin hydroxylase-like (LOC101249999). mRNA Cytokinin hydroxylase-like (LOC101249999). mRNA Ethylene response factor 2 (ERF2). E3 ubiquitin-protein ligase RMA1H1-like (LOC101253976). mRNA Linoleate 13S-lipoxygenase 2-1. chloroplastic-like (LOC101262081). mRNA Monogalactosyldiacylglycerol synthase 2. chloroplastic-like (LOC101263085). mRNA Ubiquitin-conjugating enzyme E2 5A-like. transcript variant 2. mRNA Polyphenol oxidase F. chloroplastic-like (LOC101259064). mRNA Aquaporin PIP2-1-like (LOC101247747). misc_RNA Aquaporin PIP2-1-like (LOC101248037). misc_RNA Aquaporin PIP2-1-like (LOC101248037). misc_RNA Amino acid permease 6-like (LOC101245454). misc_RNA Amino acid permease 6-like (LOC101245454). misc_RNA Arabidopsis thaliana Sulfite exporter TauE/SafE family protein (AT2G36630) mRNA. complete cds Arabidopsis thaliana Sulfite exporter TauE/SafE family protein (AT2G36630) mRNA. complete cds Nitrate transporter 1.3-like (LOC101253972). mRNA Peptide/nitrate transporter At3g53960-like (LOC101265786). mRNA Sodium-coupled neutral amino acid transporter 6-like (LOC101267241). mRNA Vacuolar cation/proton exchanger 3-like (LOC101254519). misc_RNA Leucine-rich repeat receptor-like protein kinase At1g35710-like (LOC101265646). mRNA Transcription factor bHLH35-like (LOC101260639). mRNA Transcription factor bHLH93-like (LOC101250473). mRNA Acetyl-CoA acetyltransferase. cytosolic 1-like (LOC101262830). mRNA Acetylornithine deacetylase-like (LOC101268129). mRNA Alcohol dehydrogenase (yfe37 gene) Alcohol dehydrogenase yfe37 protein (yfe37). mRNA Anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase-like. transcript variant 1. mRNA Anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase-like. transcript variant 4 . mRNA Beta-galactosidase STBG5 mRNA. complete cds Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex-like (LOC101257857). mRNA Glucose-6-phosphate/phosphate translocator 1. chloroplastic-like. transcript variant 2 (LOC101255219). mRNA Heparanase-like protein 1-like (LOC101258638). mRNA Mitochondrial chaperone BCS1-A-like. transcript variant 1 (LOC101264174). mRNA Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl)asparagine amidase A-like (LOC101260612). mRNA Polygalacturonase At1g48100-like (LOC101261316). mRNA Polygalacturonase At1g48100-like (LOC101261316). mRNA Polygalacturonase-like (LOC101247546). mRNA Polygalacturonase-like (LOC101255793). mRNA Pyruvate decarboxylase 1-like (LOC102594418). mRNA Pyruvate decarboxylase isozyme 1-like (LOC101246495). mRNA Pyruvate decarboxylase isozyme 2-like (LOC101247173). mRNA Pyruvate decarboxylase isozyme 2-like (LOC101247173). mRNA S-acyltransferase At1g69420-like (LOC101254385). mRNA Solanum tuberosum fumarylacetoacetase-like (LOC102600793). mRNA Solanum tuberosum rho GTPase-activating protein 3-like (LOC102597681). transcript variant X1. mRNA Aconitate hydratase. cytoplasmic-like. transcript variant 2. mRNA Adipocyte plasma membrane-associated protein-like (LOC101253341). mRNA complete cds Basic blue protein-like (plantacyanin) . mRNA AK320934 Pectinesterase 53-like (LOC101260795), mRNA AI779761 Snakin-1-like (LOC101254978), mRNA AK224857 Ninja-family protein AFP3-like (LOC101259390), mRNA BI421759 Aquaporin PIP2-4-like (LOC101258434), mRNA AK327767 CBL-interacting serine/threonine-protein kinase 14-like (LOC101254823), mRNA BG130004 Chaperonin-like (LOC101244957), mRNA TA38016_4081 Protein argonaute 2-like (LOC101249141), mRNA mRNA AK319388 ATP-dependent zinc metalloprotease ftsh-like (LOC101264625), mRNA AK324687 Glucan endo-1,3-beta-glucosidase-like protein 2-like (LOC101257693), mRNA TA51541_4081 Miraculin-like (LOC101248784), mRNA (LOC102580389), transcript variant X1, mRNA TA54439_4081 PREDICTED: Solanum tuberosum phosphoenolpyruvate carboxylase-like (LOC102599595), AK325009 Serine carboxypeptidase-like 26-like (LOC101247667), mRNA (LOC101264078), mRNA DQ056440 ACI112 protein (ACI112), mRNA TA39638_4081 Biotin carboxyl carrier protein of acetyl-CoA carboxylase-like. transcript variant 2 (LOC101263617). mRNA AI775310 Cell wall protein (LOC544097). mRNA FS193618 Cell wall protein (LOC544097). mRNA AK321887 Hop-interacting protein THI101 (LOC101055528). mRNA BG127261 pollen allergen Che a 1-like (LOC101262972). mRNA BT013052 Proline rich protein. transcript variant 1 (TPRP-F1). mRNA BI932748 Proline rich protein. transcript variant 2 (TPRP-F1). mRNA BG127002 Proline-rich protein DC2.15-like (LOC101251407). mRNA BT013974 RNA-binding protein Musashi homolog 2-like (LOC101267666). mRNA BW685140 Tonoplast intrinsic protein 4;1. complete cds. AI773289 Ubiquitin ligase activator of nfkb 1-A-like. transcript variant 2 (LOC101250130). mRNA ou cell wall protein (LOC544097). mRNA BP905429 Uncharacterized LOC101247252 (LOC101247252), mRNA TA38992_4081 Uncharacterized LOC101258883 (LOC101258883), mRNA TA41413_4081 Uncharacterized LOC101266234 (LOC101266234), misc_RNA AI486910 Uncharacterized LOC101263194 (LOC101263194), misc_RNA GO375294 Unknown Down-regulation GT167928 Thaumatin-like protein-like (LOC101266146). mRNA AK322430 Molybdate transporter 2-like (LOC101255480). mRNA EG364346 Uncharacterized LOC101257758 (LOC101257758), mRNA AI487032 Unknown AK247664 Unknown SystematicName Description AK323515 Activator of 90 kda Heat shock protein atpase homolog (LOC101256232), mRNA BP882275 Agmatine coumaroyltransferase-2-like (LOC101244961), mRNA AK327374 Agmatine coumaroyltransferase-2-like (LOC101244961), mRNA BF113983 Aluminum-induced protein (AIP) mRNA, complete cds stem specific protein TSJT1-like (LOC 101253225) AK247408 Glutaredoxin domain-containing cysteine-rich protein 1-like (LOC101252103), mRNA ES893872 Glutathione S-transferase/peroxidase (BI-GST/GPX), mRNA TA37423_4081 Glutathione S-transferase/peroxidase (BI-GST/GPX), mRNA DV104067 Heat shock cognate 70 kda protein-like (LOC101255164), mRNA TA39592_4081 Heat shock cognate 70 kda protein-like (LOC101255164), mRNA TA50993_4081 Heat shock cognate 70 kda protein-like (LOC101255164), mRNA GO372865 Heat shock factor protein HSF30-like (LOC101266046), mRNA AK325152 Peroxidase (cevi16), mRNA AK324081 Peroxidase 47-like (LOC101263035), mRNA TA47500_4081 Peroxidase 9-like (LOC101264212), mRNA AK320988 Phenylalanine ammonia-lyase-like (LOC101249824), mRNA AK328495 Polygalacturonase (XOPG1), mRNA AJ320056 Polygalacturonase At1g48100-like (LOC101261316), mRNA TA55012_4081 Polygalacturonase At1g48100-like (LOC101261316), mRNA AI772989 Snakin-2-like (LOC101245301), mRNA TA38853_4081 Solanum tuberosum 17.3 kda class II Heat shock protein-like (LOC102602952), mRNA TA49570_4081 Solanum tuberosum dirigent protein 17-like (LOC102603105), mRNA TA37091_4081 Solanum tuberosum spermine synthase-like (LOC102582757), mRNA TA38526_4081 Subtilisin-like protease-like (LOC101252447), mRNA BT013554 Subtilisin-like protease-like (LOC101252733), mRNA AK329391 Superoxide dismutase [Fe] (sodb gene) BI934081 Ninja-family protein AFP3-like (LOC101259390), mRNA GT167123 Putative abscissis acid-induced protein HVA22-like proteine-like (LOC101252452), mRNA AF096246 Ethylene-responsive transcriptional coactivator (ER24), mRNA A_96_P012211 Ethylene-responsive transcriptional coactivator (ER24), mRNA BG123944 Ricinus communis methyltransferase, putative, mRNA AK323282 E3 ubiquitin-protein ligase RHA1B-like (LOC101250533), mRNA AK327122 E3 ubiquitin-protein ligase HERC3-like (LOC101249643), mRNA BE353376 Aquaporin PIP2-7-like (Aquaporin), mRNA AW221402 Aquaporin PIP2-4-like (LOC101258434), mRNA AW626004 Aquaporin PIP-type (LOC100736527), mRNA BG626235 Aquaporin PIP2-1-like (LOC101247747), misc_RNA AK323977 Aquaporin (LOC100529106), mRNA A_96_P079109 Aquaporin PIP2-4-like (LOC101258434), mRNA TA38087_4081 Aquaporin PIP-type (LOC100736527), mRNA AK324829 CBL-interacting serine/threonine-protein kinase 7-like (LOC101264066), mRNA BG126719 CDPK-related kinase 1-like (LOC101266575), mRNA AK326794 CDPK-related kinase 5-like (LOC101248827), mRNA AK328419 Serine/threonine-protein kinase HT1-like (LOC101257779), mRNA AK326695 Serine/threonine-protein kinase HT1-like (LOC101257779), mRNA BT013410 Receptor-like protein kinase At5g18500-like(LOC101247003), mRNA GO374700 Receptor protein kinase TMK1-like (LOC101250851), mRNA TA56844_4081 Cyclin-U1-1-like (LOC101248793), mRNA AK326642 DnaJ homolog subfamily B member 11-like (LOC101246562), mRNA TA56692_4081 DnaJ homolog subfamily B member 6-like (LOC101264671), mRNA AI483393 DnaJ protein homolog (LOC101259708), mRNA AK322252 DnaJ protein homolog (LOC101259708), mRNA AK328315 Dof zinc finger protein DOF2.1-like (LOC101259641), mRNA A_96_P256637 Dof zinc finger protein DOF5.2-like (LOC101243956), mRNA BI210024 Protein argonaute 2-like (LOC101249141), mRNA AK319264 Protein LHY-like (LOC101261662), mRNA TA55118_4081 Putative BAH domain-containing protein TA45804_4081 Putative GEM-like protein 8-like (LOC101268672), mRNA AK321664 RNA polymerase sigma factor sigE, chloroplastic/mitochondrial-like, transcript variant 1 (LOC101252660), mRNA AK325213 RNA-binding protein 42-like, transcript variant 1 (LOC101250408), mRNA BE432867 Solanum tuberosum replication protein A 70 kDa DNA-binding subunit B-like AW096551 Beta-amylase 3, chloroplastic-like (LOC101259175), mRNA AI898798 Beta-amylase 3, chloroplastic-like (LOC101259175), mRNA AB218598 Calnexin-like protein (CNX61.0), mRNA GO375213 Carboxylesterase 13-like (LOC101253900), mRNA BG628336 Carboxylesterase 13-like (LOC101253900), mRNA TA53549_4081 Carboxylesterase 13-like (LOC101253900), mRNA BG128069 CDGSH iron-sulfur domain-containing protein 2-like (LOC101244055), mRNA AB359915 Glutamate decarboxylase isoform3 (GAD3), mRNA AK319584 Glutamine synthetase (gs), mRNA AK323682 Glutathione S-transferase-like (LOC101256384), mRNA TA35843_4081 Glutathione S-transferase-like (LOC101267923), misc_RNA FS200359 Glutathione transferase GST 23-like (LOC101258000), mRNA AK324229 Glyoxylate/hydroxypyruvate reductase A HPR2-like (LOC101243867), mRNA AI780698 Haloacid dehalogenase (LOC100316880), mRNA BT012718 Mitochondrial adenine nucleotide transporter ADNT1-like (LOC101268329), mRNA AK327014 Mitochondrial carnitine/acylcarnitine carrier-like protein-like (LOC101262875), mRNA mRNA BP876693 Probable cinnamyl alcohol dehydrogenase 9-like (LOC101263982), mRNA AK322534 Solanum tuberosum J domain-containing protein required for chloroplast accumulation BP903575 40S ribosomal protein S21-2-like, transcript variant 2 (LOC101254027), mRNA response 1-like (LOC102591785), mRNA TA57097_4081 Monoglyceride lipase-like (LOC101249534), mRNA AK320312 Protein DA1-related 1-like (LOC101261676), mRNA AI487343 Tryptophan synthase beta chain 2, chloroplastic-like (LOC101256422), mRNA BT013161 Adipocyte plasma membrane-associated protein-like (LOC101262624), partial mRNA TA51791_4081 Monoglyceride lipase-like (LOC101249534), mRNA BP876774 Protein phosphatase 2C 16-like (LOC101265524), mRNA AW033682 U-box domain-containing protein 3-like, transcript variant 1 (LOC101260859), mRNA AI778706 Antirrhinum majus transposon Idle-61e09b, cultivar 165E, BAC clone 165EH3_61e09 AI491144 Monoglyceride lipase-like (LOC101249534), mRNA AK326415 Protein phosphatase 2C AHG3 homolog (PP2C-2), mRNA AI487448 U-box domain-containing protein 5-like (LOC101252663), mRNA AK319892 Arabidopsis thaliana dynein light chain type 1-like protein mRNA, complete cds AK320876 Monothiol glutaredoxin-S1-like (LOC101250592), mRNA X94946 Proteinase inhibitor II (cevi57), mRNA AK322902 UDP-glucose flavonoid 3-O-glucosyltransferase 6-like (LOC101258120), mRNA AK327642 Autophagy-related protein 8C-like, transcript variant 2 (LOC101253062), mRNA TA36736_4081 Nicotiana tabacum gene for photosystem II oxygen evolving complex 23 kda polypeptide BG127531 Protochlorophyllide-dependent translocon component 52, chloroplastic-like BF098125 UDP-glucuronate 4-epimerase 3-like (LOC101245594), mRNA BT014225 BI1-like protein-like (LOC101265367), mRNA (LOC101255583), mRNA AW980071 UDP-glucuronate 4-epimerase 3-like (LOC101245594), mRNA AK319341 BIPINNATA (BIP), mRNA AW931653 Aluminum-induced protein (AIP) mRNA, complete cds stem specific protein TSJT1-like (LOC 101253225) TA44976_4081 Anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase 5-like (LOC101261193), mRNA AK319203 Anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase 5-like (LOC101261193), mRNA AK326126 Anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase-like, transcript variant 1 (LOC101244316), mRNA BI924430 Anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase-like, transcript variant 4 (LOC101244316), mRNA ES893497 Arabinogalactan peptide 14-like (LOC101246976), mRNA AK325098 Aspartic proteinase nepenthesin-1-like (LOC101254927), mRNA GO372806 Aspartic proteinase PCS1-like (LOC101262373), mRNA TA44457_4081 Aspartic proteinase PCS1-like (LOC101262373), mRNA AK322997 Bax inhibitor (BI-1), mRNA Y14809 Beta-carotene hydroxylase (crtr-b1), mRNA AW616042 Beta-galactosidase 16-like (LOC101268055), mRNA BT013139 Caffeoyl-coa O-methyltransferase 6-like (LOC101260278), mRNA DV103891 Class II small Heat shock protein Le-HSP17.6 mRNA, complete cds AK325209 CONSTANS 1 (CO1), mRNA. BP895717 Cullin-1-like (LOC101249757), mRNA AI775181 Cytosolic ascorbate peroxidase 1 (APX1), mRNA AK323084 Cysteine proteinase RD21a-like (LOC101247912), mRNA AF090115 Cytosolic class II small Heat shock protein HCT2 (HSP17.4) mRNA, complete cds EG553627 Disease resistance response protein 206-like (LOC101250552), mRNA AW218084 Heat shock protein 83-like, transcript variant 1 (LOC101260143), mRNA AK319894 Heat shock protein 83-like, transcript variant 1 (LOC101260143), mRNA BI930788 Heat shock protein 83-like, transcript variant 1 (LOC101260143), mRNA AI780273 Heat shock protein 83-like, transcript variant 2 (LOC101260143), mRNA BI934577 Heat shock protein 83-like, transcript variant 2 (LOC101260143), mRNA TA37068_4081 Heat shock protein 83-like, transcript variant 2 (LOC101260143), mRNA BG132741 Heat shock protein 90-like (LOC101254814), mRNA Y17306 Homeodomain protein (h52), mRNA BI924534 Hydroxypyruvate reductase (HPR), mRNA BG644016 Hydroxypyruvate reductase (HPR), mRNA AI773018 Hydroxypyruvate reductase (HPR), mRNA AK327271 Ipomoea batatas senescence-associated protein mRNA, complete cds GO374313 Isoflavone 2'-hydroxylase-like (LOC101268098), misc_RNA AI897849 L-aspartate oxidase 1-like (LOC101264098), mRNA TA36297_4081 Methionine rich arabinogalactan (LOC778328), mRNA AY986470 Methionine rich arabinogalactan (LOC778328), mRNA BI921309 Mitochondrial small Heat shock protein (MTSHP), mRNA GO373759 Mitochondrial small Heat shock protein (MTSHP), mRNA AY840091 Monoterpene synthase 1 (MTS1) mRNA, complete cds TA46839_4081 Nucleoredoxin 1-like (LOC101250401), mRNA DB692903 Patatin group A-3-like (LOC101245708), mRNA DB698920 Populus EST from mild drought-stressed leaves AK326169 Populus EST from mild drought-stressed leaves AK247855 Populus EST from severe drought-stressed leaves BM411207 Populus EST from severe drought-stressed opposite wood TA55960_4081 Solanum tuberosum cellulose synthase-like protein E6-like (LOC102591207), mRNA BT012735 Proline dehydrogenase (PDH), mRNA BT013418 Proline dehydrogenase 2, mitochondrial-like (LOC101268445), mRNA BG130649 Quinone oxidoreductase-like protein At1g23740, chloroplastic-like (LOC101250690), mRNA TA37651_4081 Quinone oxidoreductase-like protein At1g23740, chloroplastic-like (LOC101250690), mRNA BE462910 Quinone oxidoreductase-like protein At1g23740, chloroplastic-like (LOC101250690), mRNA TA37652_4081 Quinone oxidoreductase-like protein At1g23740, chloroplastic-like (LOC101250690), mRNA BT013014 Quinone oxidoreductase-like protein At1g23740, chloroplastic-like (LOC101250690), mRNA FS198511 RPM1-interacting protein 4-like (LOC101254747), mRNA AK329161 Salt tolerance-like protein At1g78600-like (LOC101251142), misc_RNA AK322957 Salt tolerance-like protein At1g78600-like (LOC101264380), mRNA TA36469_4081 Salt tolerance-like protein At1g78600-like (LOC101264380), mRNA BG129343 Salutaridinol 7-O-acetyltransferase-like (LOC101248087), mRNA AK319704 Salutaridinol 7-O-acetyltransferase-like (LOC101260610), 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(LOC101253993), mRNA AK321086 inositol-tetrakisphosphate 1-kinase 1-like (LOC101262819), mRNA AK247612 Phytochrome kinase substrate1-like (LOC101264929), mRNA BP881745 Inactive receptor kinase At5g67200-like (LOC101244333), mRNA BP903231 Inactive leucine-rich repeat receptor-like protein kinase At3g03770-like (LOC101246580), mRNA AK325428 Iinactive leucine-rich repeat receptor-like protein kinase At3g03770-like (LOC101246580), mRNA BG128896 Cytochrome b5-like (LOC101248404), mRNA TA49039_4081 Cytochrome P450 71A2-like (LOC101247804), mRNA AK321285 Cytochrome P450 90B1-like (CYP90B3), mRNA AK323147 Cytochrome P450 98A2-like (LOC101246092), mRNA AK326158 Cytochrome P450 98A2-like (LOC101262367), mRNA BG734621 Cytochrome P450 98A2-like (LOC101262367), mRNA AK328880 Alpha/beta fold family protein (LOC543933), mRNA FS197443 BTB/POZ and TAZ domain-containing protein 3-like (LOC101255717), mRNA AK325290 BTB/POZ domain-containing protein At3g22104-like (LOC101268292), mRNA AK327804 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Pentatricopeptide repeat-containing protein At1g31920-like (LOC101257993), mRNA AK329117 PHLOEM PROTEIN 2-LIKE A9-like (LOC101260710), mRNA AK329992 S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferase BCG_0775c-like (LOC101260430), AK327871 Xyloglucan endotransglucosylase-hydrolase XTH9 (XTH9), mRNA BI205947 Non-lysosomal glucosylceramidase-like (LOC101265793), misc_RNA mRNA AK319251 S-adenosylmethionine decarboxylase 2 (SAMDC) gene, complete cds ES897086 Xyloglucan endotransglycosylase/hydrolase 16 protein (XTH16), mRNA AK325644 Nucleoredoxin 1-like (LOC101250401), mRNA TA42535_4081 Adenosine deaminase-like protein-like (LOC101256716), mRNA AK319877 Ferric reduction oxidase 7, chloroplastic-like (LOC101246763), mRNA AW029915 Metallothiol transferase fosb-like (LOC101249440), mRNA BG130811 Phosphoenolpyruvate carboxylase, housekeeping isozyme-like (LOC101248407), mRNA TA36438_4081 S-adenosylmethionine decarboxylase proenzyme-like (LOC101260400), mRNA AK322426 Xyloglucan endotransglycosylase/hydrolase 16 protein (XTH16), mRNA AI778754 Oligopeptidase A-like (LOC101254150), mRNA AK320536 Adenylyl-sulfate reductase (LOC544267), mRNA TA37563_4081 Ferritin-2, chloroplastic-like, transcript variant 2 (LOC101260346), mRNA AK328455 Methionine gamma-lyase-like (LOC101263926), mRNA AK323891 Phosphoserine phosphatase 1-like (LOC101249322), mRNA A_96_P082314 S-adenosylmethionine decarboxylase proenzyme-like (LOC101260400), mRNA A_96_P030981 4-coumarate--coa ligase-like 10-like (LOC101251259), mRNA BT013324 Peroxisomal membrane protein 11-4-like (LOC101259820), mRNA AK320617 Aldo-keto reductase family 4 member C10-like (LOC101256514), mRNA AK324297 Flavin-containing monooxygenase FMO GS-OX-like 3-like (LOC101254810), mRNA AK325348 Micro-Tom glycosyltransferase gene, complete cds BI928029 Photosystem II 22 kda protein, chloroplastic-like (LOC101260830), mRNA A_96_P084089 S-adenosylmethionine decarboxylase proenzyme-like (LOC101260400), mRNA AW154876 4-coumarate--coa ligase-like 10-like (LOC101251259), mRNA BG127261 Pollen allergen Che a 1-like (LOC101262972), mRNA BI933656 Arogenate dehydratase/prephenate dehydratase 6, chloroplastic-like (LOC101247331), mRNA AK326318 GDP-L-galactose phosphorylase (GGP), mRNA AW623531 Micro-Tom glycosyltransferase gene, complete cds AK325903 Photosystem II 22 kda protein, chloroplastic-like (LOC101260830), mRNA AK320212 S-adenosylmethionine synthase 2-like, transcript variant 1 (LOC101247506), mRNA AK329281 4-coumarate--coa ligase-like 10-like (LOC101251259), mRNA BT013052 Proline rich protein, transcript variant 1 (TPRP-F1), mRNA TA38323_4081 GDSL esterase/lipase At1g28590-like (LOC101257443), mRNA AK326454 Microtubule-associated protein 6-like (LOC101261948), mRNA A_96_P075734 Photosystem II 22 kda protein, chloroplastic-like (LOC101260830), mRNA BP886193 Serine carboxypeptidase-like 26-like (LOC101247667), mRNA BI935243 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate--homocysteine methyltransferase-like (LOC101264078), mRNA BI932748 Proline rich protein, transcript variant 2 (TPRP-F1), mRNA	0.62 1.63 1.38 1.15 0.63 0.69 0.82 0.98 1.27 0.61 0.88 0.67 1.15 1.19 0.98 0.97 0.75 1.24 0.83 0.60 0.70 1.00 1.29 0.99 0.80 0.98 0.89 1.12 1.06 0.73 0.71 0.64 0.59 0.68 0.67 0.69 0.66 0.80 1.26 1.03 0.66 0.83 0.97 0.96 0.82 0.83 0.98 0.66 0.59 0.73 1.34 2.50 0.90 1.30 0.65 0.85 0.89 0.89 0.64 0.80 0.60 1.10 0.70 1.30 0.70 0.68 1.73 1.69 1.47 0.74 2.45 1.45 1.50 0.64 0.75 1.62 1.23 1.14 2.04 1.12 1.27 -2.07 -1.13 -1.04 -1.08 -1.6 Fold Change SH/TM log2 0.70 2.00 2.10 0.80 2.00 1.20 1.20 0.60 1.40 1.40 1.10 0.70 0.70 3.00 0.80 0.70 1.20 1.90 1.60 2.30 0.80 0.90 0.70 0.60 0.60 0.71 0.96 1.45 1.47 0.59 0.86 2.62 0.87 0.87 0.94 0.94 0.96 1.00 1.05 0.71 0.64 1.12 0.80 0.84 0.71 1.26 1.63 0.65 1.02 1.30 1.54 0.75 1.37 0.64 3.12 0.66 0.59 1.02 0.95 0.69 1.90 1.80 0.60 1.10 1.10 1.10 2.00 0.90 0.60 0.70 0.60 0.60 0.60 1.90 0.80 0.80 1.00 1.60 1.00 1.00 0.60 1.80 0.70 1.00 0.70 0.60 1.20 1.10 0.90 0.60 1.60 1.10 0.70 1.00 0.80 0.70 0.80 0.80 0.80 0.80 0.80 0.90 3.40 4.50 1.10 1.20 1.70 1.20 1.00 0.90 0.60 0.80 0.80 1.00 2.10 1.60 0.80 1.00 0.60 1.70 0.60 1.30 1.50 1.80 1.70 1.70 1.70 0.80 0.90 0.70 0.70 0.70 0.80 0.80 0.90 0.60 0.60 1.40 1.60 1.60 1.50 0.90 0.60 0.60 1.20 1.10 1.00 1.50 1.20 0.70 1.00 0.90 0.90 0.80 0.60 1.40 0.80 0.90 1.10 0.70 0.80 0.80 0.70 1.40 2.10 1.50 2.00 0.60 0.60 1.70 0.61 0.63 0.63 1.06 1.19 0.66 0.89 1.24 1.38 0.86 1.07 0.61 0.68 0.84 0.88 0.68 0.83 0.77 0.94 0.84 0.69 2.06 2.30 2.35 0.91 1.59 1.90 1.86 0.77 0.98 1.53 0.98 0.64 1.06 1.27 1.46 1.36 2.25 1.38 1.50 1.66 1.54 0.61 1.34 1.11 1.14 0.80 0.68 0.87 1.33 0.94 0.75 0.72 0.73 0.85 1.16 1.59 1.26 0.72 0.60 1.20 2.00 0.80 1.80 1.10 0.60 0.60 2.30 0.90 0.90 0.80 0.63 1.69 0.68 0.62 0.63 0.64 0.74 1.11 0.67 0.73 0.62 0.59 1.05 0.67 0.64 0.67 1.45 0.92 1.86 1.56 0.67 0.74 1.28 0.82 0.88 0.78 1.21 0.91 0.88 0.95 0.70 2.14 0.92 0.89 0.62 0.60 0.65 0.82 0.63 1.20 0.80 0.70 0.90 0.60 0.90 0.70 1.10 1.30 0.90 0.60 1.20 0.60 1.10 1.10 1.40 0.45 0.90 0.70 0.60 1.50 1.00 1.20 1.60 1.00 0.70 0.80 0.80 0.80 2.40 0.80 1.50 2.70 0.70 2.00 0.80 0.80 0.80 0.70 1.80 1.20 1.10 1.00 1.30 1.20 1.20 0.80 1.10 2.50 1.10 0.80 1.30 1.40 2.30 0.70 0.70 0.70 1.40 0.70 1.15 0.63 0.85 0.69 1.20 1.00 0.70 0.70 0.80 3.60 1.30 0.80 0.70 0.70 1.00 0.60 0.90 0.60 1.02 1.51 1.17 0.90 1.10 0.80 0.70 0.80 2.10 0.60 1.60 1.20 2.00 1.20 1.40 1.10 1.00 1.40 1.40 0.70 2.10 1.30 0.60 0.70 1.50 1.10 1.10 0.90 1.00 0.80 1.00 1.70 1.50 0.70 0.70 1.20 1.40 1.00 0.70 0.90 0.70 0.90 0.60 1.60 1.20 1.60 1.50 1.50 0.60 1.50 1.50 0.70 1.20	<0.01 <0.01 0.02 <0.01 <0.01 0.04 0.02 <0.01 0.04 0.04 0.05 <0.01 0.02 <0.01 ttest TMvsSH <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 0.01 0.01 0.04 0.05 0.03 0.01 0.04 <0.01 0.04 0.02 0.03 <0.01 <0.01 0.01 <0.01 <0.01 <0.01 0.04 0.05 0.01 <0.01 0.01 <0.01 <0.01 0.02 0.04 <0.01 0.03 0.01 0.01 0.01 <0.01 <0.01 <0.01 0.03 <0.01 0.01 0.01 0.01 0.02 <0.01 0.05 0.03 <0.01 <0.01 0.01 0.01 <0.01 <0.01 <0.01 0.03 0.04 <0.01 <0.01 <0.01 0.03 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0.01 < 0.01 0.04 0.04 0.03 0.03 0.04 0.03 0.02 0.02 0.04 0.02 0.04 < 0.01 0.03 0.04 0.04 0.03 0.02 0.01 0.01 0.01 0.01 0.02 0.04 0.05 0.05 0.03 0.05 0.01 0.02 0.02 0.03 0.01 < 0.01 < 0.01 0.04 0.01 0.01 0.04 0.03 < 0.01 0.01 0.01 0.01 0.05 0.03 0.01 0.01
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(a) (b)

al., 2011) qui suggèrent un contrôle de la teneur en H 2 O 2 au travers de la régulation de gènes de la catalase. Cependant, nous avons aussi noté une diminution de la concentration en ABA suite au traitement H 2 O 2 ce qui suggère une rétrocontrôle de la synthèse de l'ABA par ce dernier.Ainsi, à de fortes concentrations, le H 2 O 2 conduit à la dégradation de l'ABA ainsi qu'à l'activation des enzymes antioxydantes. Ces résultats sont en accord avec l'hypothèsede Bellaire et al. (2000) qui propose une voie de signalisation par l'ABA peut être coordonnée par le H 2 O 2 , notamment au travers de l'activation de NAPDH oxydases.En conclusion, les études menées au cours de cette thèse ont permis de démontrer que le NO et l'ABA sont sollicités très tôt au cours d'un déficit hydrique. Nous avons aussi montré que tous les deux mais aussi le H 2 O 2 pouvaient augmenter les activités des enzymes antioxydantes.De plus une forte relation semble exister entre ces trois molécules dans la mise en place de mécanismes adaptatifs au cours d'un déficit hydrique. Un de ces mécanismes que nous avons mis en lumière est le maintien du statut oxydatif dans les fruits au travers de la régulation d'enzymes antioxydantes impliquées dans le recyclage de l'ascorbate. L'analyse du transcriptome a permis de mettre en évidence les autres cibles de NO dans le fruit. En occurrence nous avons pu voir que

Remerciements

analyze 12 experimental samples in about 45 min all in triplicates, with blanks, controls and standard curve.

Supporting information :

Figure S1 : Negative control of Nitric Oxide production revealed by epifluorescence microscopy in absence of NO 550 probe in fruits (A') from tomato plants treated with 5 ppm HgCl2 and 0 ppm HgCl2 (control). A'(i), (ii) outer epidermis, A'(iii), (iv) vascular tissue and A'(v), (vi) inner epidermis of the pericarp. Each image represents the green (left), red (centre) and the sum of both color channels (right) in order to highlight the distribution of the green fluorescence in the different organs. Linear levels were adjusted in all images using ImageJ 1.43 version. E : Epidermis, P : Parenchyma, VT : Vascular tissue.

Nitric oxide in conjunction with

Abstract

Rapid physiological responses and the involvement of specific signalling molecules were investigated in tomato fruits (Solanum lycopersicum L. cv. Micro-Tom). A pharmacological study using detached mature green fruits was conducted to determine involvement of nitric oxide (NO), abscissic acid (ABA) and hydrogen peroxide (H 2 O 2 ).

Activity of antioxidant enzymes of ascorbate-glutathione cycle along with the total ascorbate pool size were measured. The H 2 O 2 , NO, ABA and malonyldialdehyde (MDA) contents were studied in fruit pericarps. Fluorescence microscopy revealed an overproduction of NO after ABA and H 2 O 2 treatments. Ascorbate recycling was positively influenced by NO treatment.

By contrast to H 2 O 2 , NO did not affect ABA content in detached fruits and H 2 O 2 positively impacted antioxidant enzymes. In this study we have shown that there is a close interaction between signalling molecules; NO, ABA and H 2 O 2 , in the maintenance of fruit redox homeostasis namely through the activation of antioxidant enzymes involved in ascorbate recycling (APX, MDHAR and DHAR).