Béatrice Eymin

Sylvie Gazzeri

Christian Brambilla

Elisabeth Brambilla
email: elisabeth.brambilla@ujf-grenoble.fr

Pr Elisabeth Brambilla

Distinct pattern of E2F1 expression in human lung tumours: E2F1 is upregulated in small cell lung carcinoma

Keywords: carcinogenesis, cell cycle, E2F1, expression, lung tumour

The transcription factor E2F1 is a key component of cell cycle that acts to transactivate genes required for S phase entry. Thus, it plays an important role in cellular proliferation, oncogenesis and differentiation. In order to investigate its potential implication in human lung carcinogenesis, we studied E2F1 protein expression by western blotting and immunohistochemistry in a series of 58 human lung tumours of all histological types. We showed that E2F1 product was overexpressed in 92% (24/26) of small cell lung carcinoma (SCLC) and in 50% (5/10) of large cell neuroendocrine carcinoma (LCNEC) whereas it was undetectable in 90% (10/11) of adenocarcinoma and 82% (9/11) of squamous carcinoma when compared to corresponding normal lung. No amplification was found but an increase in E2F1 mRNA expression was detected in 75% (18/24) of SCLC overexpressing E2F1 product. In these tumours and in contrast with NSCLC, upregulation of E2F1 product was associated with its nuclear accumulation and with overexpression of several of its target-genes. Moreover, E2F1 overexpression in NE lung tumours was significantly associated with a high KI67 index (p<0.0001) as well as a Bcl-2:Bax ratio > 1 (p<0.001). Overall, these results demonstrate a distinct pattern of E2F1 expression in human lung tumours and suggest that its deregulation could be involved in the carcinogenesis of SCLC.

Introduction

E2F1, a critical regulator of cell cycle progression, was the first identified member of a family of transcription factors generically referred to as E2F (Nevins, 1992). This protein plays a pivotal role in G 1 to S phase transition by transactivating specific targetgenes (Dyson, 1998;Helin, 1998 for review). The majority of E2F1-regulated genes encode proteins involved in DNA replication and/or in S phase progression such as DNA polymerase α, thymidine kinase (TK), dihydrofolate reductase (DHFR), Mini Chromosome Maintenance 2 to 7 (MCM), cdc6, cyclin A and cyclin E, cdc2, c-myc and E2F1 itself (DeGregori et al., 1995;Helin, 1998). E2F1 function is tightly regulated during cell cycle by the product of the retinoblastoma tumour suppressor gene (pRb). In G 1 , unphosphorylated pRb represses the transactivating activity of E2F1/DP1 heterodimeric complexes [START_REF] Flemington | Proc.Natl.Acad.Sci.USA[END_REF]Weintraub et al., 1995;Zhang et al., 1999). In late G 1 , phosphorylation of pRb by cyclin-dependent kinases (cdk) induces its dissociation from E2F1/DP1 heterodimers and progression into S phase (Mittnacht, 1998). In late S, cyclin A/cdk2 complex binds to E2F1 and phosphorylates DP1, thereby inactivating E2F1/DP1 activity.

Ectopic expression of E2F1 induces DNA synthesis in quiescent immortal rodent cells (Johnson et al., 1993;[START_REF] Qin | Proc.Natl.Acad.Sci.USA[END_REF][START_REF] Shan | [END_REF][START_REF] Shan | Proc.Natl.Acad.Sci.USA[END_REF], confers neoplastic properties to immortalized cells [START_REF] Degregori | Proc.Natl.Acad.Sci.USA[END_REF], and increases tumorigenesis in transgenic mice that lack p53 function [START_REF] Pierce | Proc.Natl.Acad.Sci.USA[END_REF]. Moreover, old transgenic mice overexpressing E2F1 developp spontaneous tumours in a variety of tissues [START_REF] Pierce | [END_REF]. Altogether, these results confer oncogenic properties to E2F1.

Paradoxically, mice lacking E2F1 also developp lymphoma or pulmonary adenocarcinoma suggesting that E2F1 can function as a tumour suppressor (Field et al., 1996;Yamasaki et al., 1996), probably via its ability to induce p53-dependent or independent apoptosis [START_REF] Wu | Proc.Natl.Acad.Sci.USA[END_REF][START_REF] Degregori | Proc.Natl.Acad.Sci.USA[END_REF]Phillips et al., 1999). Thus, the ability of E2F1 to promote cell cycle progression and tumour growth or apoptosis and tumour suppression might be tissue-specific.

Human lung cancers are divided into two different sub-classes based on the 1999 WHO classification of lung cancer [START_REF] Travis | WHO International Histological Classification of Tumours: Histological Typing of Lung and Pleural Tumours[END_REF]: (1) non small cell lung carcinoma (NSCLC) that include squamous carcinoma, adenocarcinoma and large cell carcinoma;

(2) neuroendocrine (NE) lung tumours that include carcinoid (typical and atypical), large cell neuroendocrine carcinoma (LCNEC) and small cell lung carcinoma (SCLC), the last one being the most aggressive lung tumours. Pathways involving p53 and pRb tumour suppressor genes are frequently deregulated during lung tumorigenesis. p53 is inactivated in 70% of human lung tumours either by missense [START_REF] Chiba | [END_REF]Brambilla et al., 1993) or null mutations [START_REF] Gazzeri | [END_REF]. pRb pathway is differentially disrupted in NSCLC and high grade NE tumours. Whereas loss of pRb protein expression (through mutations and/or loss of transcription) occurs in 85% of SCLC and LCNEC (Gouyer et al., 1998), pRb function is abolished in 85% of NSCLC either through loss of p16 INK4a protein expression [START_REF] Xu | [END_REF]Gazzeri et al., 1998), and/or cyclin D1 overexpression (Brambilla et al., 1997). As E2F1 is one key component of these two pathways (O'Connor et al., 1995[START_REF] Bates | p14 ARF links the tumour suppressors RB and p53[END_REF]Kowalik et al., 1998), any alterations affecting them, especially pRb inactivation, are thought to deregulate its activity. However, since E2F1 activation could contribute to either proliferation or apoptosis depending on the tissular context, the consequences of pRb inactivation on E2F1 expression and activity might differ during tumorigenesis according to each category of tumour.

E2F1 was poorly analyzed in lung tumours [START_REF] Demuth | [END_REF]Volm et al., 1998). To get further into its putative role in lung carcinogenesis, we studied E2F1 protein expression and mRNA in a series of 58 lung tumours of all histological types, in comparison with normal lung tissue. To assess E2F1 transactivating activity in each tumour category, we also studied the expression level of several of its known targetgenes. Our results identify a distinct pattern of E2F1 expression between NSCLC and SCLC and suggest that E2F1 upregulation and hyperactivity could contribute to the carcinogenesis of SCLC.

Results

Distinct pattern of E2F1 expression in human lung tumours

E2F1 protein expression was studied on a panel of 58 lung tumour tissue samples by western-blotting using two monoclonal antibodies (Table 1, Figure 1). E2F1 product was undetectable in all normal lung tissues studied (Figure 1A) and poorly detectable in 2/11 (18%) squamous carcinoma and 1/11 (9%) adenocarcinoma (Figure 1B & 1C). In contrast, when compared to normal lung, a significative overexpression of E2F1 was observed in 24/26 (92%) small cell lung carcinoma and 5/10 (50%) large cell NE carcinoma (Table 1, Figure 1D). Same results were obtained with the two anti-E2F1 antibodies used. Overall, E2F1 product was overexpressed in 29 of 36 (81%) NE lung carcinoma whereas it was undetectable in our conditions in 19 of 22 (87%) NSCLC. Immunohistochemical (IHC) analysis was performed using KH95 monoclonal antibody on 47 cases of this series where a frozen block was available. When compared to normal lung cells, overexpression of E2F1 was observed in 26/30 (86%) high grade NE tumors and in only 1/17 (6%) NSCLC, demonstrating that our unability to detect E2F1 protein by western blotting in NSCLC was not linked to a high proportion of contaminating stromal cells. IHC results were consistent with those of western blotting in 91% (43/47) of cases (Table 1, Figure 2). Four cases displayed discordance: in 3 of them where necrosis was intense, E2F1 staining was positive using IHC analysis whereas Western analysis was negative. In the last case, a faint band was observed by Western blot but tumour cells were negative in IHC analysis. Taken together, our results demonstrated a distinct pattern of E2F1 protein expression in human lung tumours.

Subcellular distribution of E2F1 in human lung tumours

As subcellular localization of E2F members could influence their activity, their interaction with target-genes as well as their degradation by the ubiquitin-proteasome pathway (Hateboer et al., 1996;Hofmann et al., 1996;[START_REF] Lindeman | Proc. Natl. Acad. Sci. USA[END_REF]Vigo et al., 1999), we next investigated the subcellular distribution of E2F1 in lung tumours on whole imprint preparations using indirect immunofluorescence in addition to classical immunohistochemistry revealed with peroxydase on tissue sections. Twenty of the 58 samples included in this study comprising 1 normal lung tissue, 5 SCLC and 5 LCNEC that overexpressed E2F1 product, 5 squamous carcinoma and 5 adenocarcinoma that expressed undetectable level of E2F1 by western blotting were analyzed. In all NSCLC tested, E2F1 product was never detected in the nucleus of tumour cells (Figure 3B).

Absence of nuclear staining was confirmed by counterstaining with Hoechst. However, we observed a faint E2F1 cytoplasmic staining in many NSCLC cells (Figure 3B) when compared to negative control. In contrast, all SCLC cells exhibited a strong nuclear staining thereby confirming overexpression of E2F1 in these set of tumours (Figure 3C).

Neither normal lung cells (Figure 3A) nor stromal cells exhibited nuclear staining, although the last cells might display some cytoplasmic staining. Same results were obtained using IHC analysis (see Figure 2).

Overexpression of E2F1 is associated with increased E2F1 mRNA transcripts

We next investigated if E2F1 protein upregulation in SCLC could be the consequence of E2F1 gene amplification and/or increase in E2F1 gene transcription.

Using Southern blotting, we did not detect any amplification of E2F1 gene in all SCLC tested when compared to normal lung tissues (data not shown). Analysis of E2F1 mRNA was performed by Northern blotting in the 24 SCLC overexpressing E2F1 protein. High levels of E2F1 transcripts were detected in 18 of those tumours (75%) when compared to normal lung tissues where E2F1 transcripts were undetectable using this technique (Figure 4). In the 6/24 remaining cases, E2F1 transcriptional level was undetectable as in normal lung despite high level of E2F1 protein expression.

Overexpression of E2F1 correlates with upregulation of some of its target-genes

To further analyze E2F1 activity in lung tumours, we studied by western blot analysis the expression of several well-known E2F1-target genes. When compared to normal lung tissues (Figure 5A), high levels of cyclins A and E, cdc2 and DHFR products were detected in 22/24 (90%) SCLC and 5/5 (100%) LCNEC that overexpressed E2F1 (Figure 5B). In one case (4%) SCLC, cyclin A was undetectable despite overexpression of other target-genes. In contrast, expression of these four proteins was weak in 17/19 (95%) NSCLC that exhibited undetectable E2F1 product (Figure 5C & 5D). Again, in 3/11 (27%) squamous lung carcinoma, cyclin A was slightly detectable despite low level of E2F1 expression (Figure 5D; lanes 9-11) suggesting that additional factors might regulate its expression in this subset of tumour. Taken together, these results indicated that upregulation of E2F1 protein expression in SCLC was associated with overexpression of some E2F1-targets genes.

Relationships between E2F1, p53, pRb and hp14 ARF status in lung carcinoma

Status of p53, pRb and hp14 ARF had been previously analyzed in this series of tumours (Brambilla et al., 1993;[START_REF] Gazzeri | [END_REF]Gazzeri et al., 1998a;Gazzeri et al., 1998b;Gouyer et al., 1998). In these tumours, pRb function was inactivated, either by loss-of-function mutations or p16 INK4a loss and/or cyclin D1 overexpression in 29/36 (80%) NE tumours and 18/22 (82%) NSCLC respectively. However, we did not find any correlation between the status of E2F1 and pRb inactivation in all tumours studied (data not shown). There was no inverse nor direct correlation linking E2F1 and hp14 ARF or p53 expression in any histological tumour class. However, we noticed that overexpression of E2F1 was frequently associated with inactivation of hp14 ARF [as detected by negative immunostaining (Gazzeri et al., 1998b)] (20/36, 69%) and/or of p53 [as indicated by p53positive immunoreactivity [START_REF] Gazzeri | [END_REF]] (18/36, 50%) in NE lung tumours (Table 2).

Correlation between E2F1 , KI67 and Bcl-2:Bax levels in human lung carcinoma

In human lung tumours, E2F1 might mediate either apoptosis or cellular proliferation depending on the context. Thus, we finally investigated in each tumoral subtype, the relationships between E2F1 protein expression, the well-known proliferative index KI67 (Gerdes et al., 1984) and the equilibrium of two main factors of cell susceptibility to apoptosis, Bcl-2 and Bax (Brambilla et al., 1996). KI67 proliferative index was significantly higher in NE lung tumours when compared to NSCLC (44 ± 19 versus 21 ± 13; p<0.0001; Table 3). Furthermore, a high KI67 index correlated with overexpression of E2F1 product in all histological subtypes (p<0.0001).

Susceptibility to apoptosis was investigated through IHC analysis of both Bcl-2 and Bax products. Indeed, we had previously demonstrated that a Bcl-2:Bax ratio > 1 correlated with a lower apoptotic index in NE lung tumours (Brambilla et al., 1996). We showed that Bcl-2 mean score was significantly higher in NE lung tumours when compared to NSCLC (202 ± 109 versus 41 ± 54; p<0.0001; Table 3). Furthermore, a Bcl-2:Bax ratio > 1 was significantly associated with NE phenotype (p<0.001) and E2F1 overexpression (p<0.001) whereas NSCLC exhibited a Bcl-2:Bax ratio < 1 and low level of E2F1 product (Table 3). Overall, these results strongly suggest that E2F1 overexpression in high grade neuroendocrine lung tumours might mediate cellular proliferation rather than apoptosis.

Discussion

We have investigated E2F1 protein expression in a series of 58 human lung tumours and demonstrated that NSCLC and NE carcinoma displayed distinct pattern of E2F1 expression. Whereas E2F1 product was undetectable by western blot analysis and IHC in nearly all NSCLC analyzed, it was upregulated in high grade NE lung tumours. As we previously showed that pRb function was invalidated (either by mutations or loss of p16 INK4a and/or cyclin D1 overexpression) in 80% of all lung tumours tested in this study (Gazzeri et al., 1998a;Gouyer et al., 1998), our present data suggest that inactivation of pRb pathway does not predict deregulated levels of E2F1 expression, at least during lung tumorigenesis.

To get clues onto the mechanism of E2F1 upregulation in SCLC, we analyzed DNA amplification and mRNA expression. Although amplification was not found, we detected an increase in E2F1 mRNA expression in the majority of those tumours overexpressing E2F1 protein. An increase in E2F1 transcription normally occurs in late G 1 in response to growth stimuli [START_REF] Sherr | [END_REF] but can also be detected in response to oncogenic stimuli such as myc (Leone et al., 1997). Moreover, E2F1 has been reported to stimulate its own transcription (Johnson et al., 1994;Neuman et al., 1994). These data and the present study suggest that, in SCLC, deregulated oncogenic signals could induce a primary increase of E2F1 gene transcription further amplified by protein accumulation.

Interestingly, some tumours exhibited a high E2F1 protein level despite absence of mRNA overexpression. E2F1 protein level is tightly controlled by ubiquitin-proteasome mediated proteolysis [START_REF] Campanero | Proc. Natl. Acad. Sci. USA[END_REF][START_REF] Vandel | [END_REF] and association with pRb has been shown to protect E2F1 from degradation (Hateboer et al., 1996;Hofmann et al., 1996). Since pRb was lost in 80% of the NE tumours studied, E2F1 accumulation in these tumours is probably not the result of protection by pRb. Additionally, the protein p45 SKP2 was recently shown to directly interact with E2F1 and to negatively regulate its stability [START_REF] Marti | [END_REF]Wade-Harper and Elledge, 1999). We have studied p45 SKP2 protein expression by IHC in our series of tumours but we could not find any correlation between p45 SKP2 and E2F1 expression (data not shown). Thus, it remains to elucidate if accumulation of E2F1 in SCLC could be associated with a defect in its proteolysis.

We observed E2F1 accumulation in the nuclei of SCLC tumoral cells that was consistent with the expression of an active E2F1 product (de la Luna et al., 1996;Allen et al., 1997) and found a strong correlation between the expression of E2F1 and several of its target-genes including cyclins A and E. Interestingly, in SCLC overexpressing E2F1, we also detected heterodimeric complexes between E2F1 and DP1 or E2F1 and mdm2 (data not shown). Since E2F1 transactivating activity is highly enhanced upon dimerization with DP1 (Wu et al., 1995) and binding of mdm2 (Martin et al., 1995), our results highly suggest that E2F1 is not only upregulated but also transcriptionally active in SCLC. In contrast and interestingly, absence of E2F1 nuclear staining correlated with weak level of E2F1 target-genes expression in NSCLC. Thus, despite loss of pRb repression, free E2F1 product might be transcriptionally inactive in this subset of tumors.

Therefore, what might be the biological consequences of E2F1 expression in lung carcinogenesis? During tumorigenesis, E2F1 has been implicated both as an oncogene (Johnson et al., 1993;[START_REF] Qin | Proc.Natl.Acad.Sci.USA[END_REF][START_REF] Pierce | Proc.Natl.Acad.Sci.USA[END_REF][START_REF] Pierce | [END_REF] or a tumour suppressor gene (Field et al., 1996;Yamasaki et al., 1996;[START_REF] Pierce | [END_REF] depending on the context and on its ability to induce cell proliferation and/or p53-dependent orindependent apoptosis. In lung tissues, we noticed that E2F1 protein expression displayed opposite patterns between NSCLC and SCLC making attractive the possibility that this protein could play a distinct role during tumorigenesis of these two tumour subsets. Since E2F1 knock-out mice developp pulmonary adenocarcinoma (Field et al., 1996), its inactivation in NSCLC could contribute to a defective apoptosis of tumoral cells.

Conversely, unbalance between apoptosis and cell proliferation could be implicated in the tumorigenesis of SCLC. In this subset of tumour, we observed a correlation between E2F1 expression and KI67 proliferative index suggesting that E2F1 might be involved in their high proliferative pattern. In contrast, the ability of E2F1 to induce apoptosis might be counteracted. Consistent with this, we previously showed that p53 is inactivated and/or hp14 ARF lost in most SCLC (Gazzeri et al., 1998b) and although statistically not significant, a correlation between E2F1 overexpression and p53 inactivation and/or hp14 ARF loss was detected in SCLC. As E2F1 can induce p53-dependent apoptosis via its ability to transactivate hp14 ARF [START_REF] Bates | p14 ARF links the tumour suppressors RB and p53[END_REF], inactivation of p53 or hp14 ARF could give an advantage to the proliferative effects of E2F1 versus its pro-apoptotic functions.

Moreover, as we observed that high grade neuroendocrine lung tumours including SCLC expressed a Bcl-2:Bax ratio > 1 (Brambilla et al., 1996 and this study), Bcl-2 could further inhibit the apoptosis of SCLC tumor cells overexpressing E2F1 and contribute to their proliferation. According to this, sensitivity of oesophageal cancer cells to E2F1mediated apoptosis was recently related to differential expression of Bcl-2 family member proteins (Yang et al., 2000).

Overall, our data identify a distinct pattern of E2F1 protein expression in human lung tumours and demonstrate its upregulation in SCLC, the most proliferative and aggressive lung tumours. In these tumours, E2F1 could therefore act as an oncogene being an essential actor of uncontrolled cellular proliferation, for example by counteracting the negative effects of cyclin-cdk inhibitors. This could explain why these tumours are so actively proliferative despite their high content in p16 INK4a (Kelley et al., 1997; data not shown) and p27 Kip1 products (Yatabe et al., 1998;data not shown). These findings have obvious conceptual implications in the promising strategic therapy targeting E2F1 function. They should aim at neutralizing E2F1 production in SCLC in order to inhibit their proliferation and inducing its expression in NSCLC in order to restitute apoptosis.

Material and methods

Tissue samples

Tissue samples were taken at surgical resection of lung tumours or node metastases at mediastinoscopy. They were immediately frozen and kept at -80°C until use. They consisted of 11 squamous carcinoma; 11 adenocarcinoma; 10 LCNEC and 26 SCLC according to the 1999 WHO international histological classification of lung tumours [START_REF] Travis | WHO International Histological Classification of Tumours: Histological Typing of Lung and Pleural Tumours[END_REF]. 300 cells count. Bcl-2 and Bax immunostaining were performed as previously described (Brambilla et al., 1996) using a Bcl-2 monoclonal antibody from Dako (1/100) and a Bax polyclonal antibody N-19 from Santa-Cruz (1/200). Scores of immunostaining were calculated by multiplying the percentage of labeled cells with the intensity (1+, 2+, 3+) of staining for a total score gain from 0 to 300. The Bcl-2/Bax ratio was established by dividing the 2 total scores.

Indirect immunofluorescence

Whole imprint preparations were performed by gentle pressing tumoural frozen tissue to silane-coated glass slides, air dried and stored at -80°C until use. Slides were treated for 10 min at room temperature in ice-cold nuclei isolation buffer [5 mM HEPES (pH 8), 50 mM KCl, 10 mM MgSO 4 , and 3 mM DTT], incubated at -20°C during 10 min in nuclei isolation buffer supplemented with 0.25% Triton 100X, washed twice with PBS and fixed for 5 min in acetone at -20°C. After fixation, slides were washed, saturated and incubated overnight with primary antibody (anti-human E2F1, Ab-4, 1/200) at 4°C. After three PBS washes, slides were exposed to Alexa TM 488 goat anti-mouse-IgG (H+L) conjugate (2 mg/ml; 1/500, Interchim, Montluçon) for 30 min at room temperature and washed twice in PBS. Normal mouse IgG at the same concentration as the primary antibody served as a negative control. The slides were counterstained with Hoechst and preparations were observed using an Olympus microscope (20x magnification), captured by a Coolview CCD camera (Photonic Science) and digitally saved using Visilog. The images were further processed by using Photoshop (Adobe).

Western-blot analysis

Tissues samples were lysed in ice-cold lysis buffer [5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 100mM

Tris (pH 8), 0.5% Na deoxycholate, 0.5% NP40, 0.5% SDS, 0.1% aprotinin, 2 µg/ml leupeptin, 2 µg/ml pepstatin, and 1 mM PMSF] for 30 min and centrifugated (30 min, 15 000g). In order to ensure appropriate detection, a molecular weight marker was loaded onto each gel. Proteins (40 µg) were denatured in Laemmli buffer [60 mM Tris HCl (pH 6.8), 20% glycerol, 10% ß-mercaptoethanol, 4.6% SDS, and 0.003% bromophenol blue], separated by 10-12% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel (SDS-PAGE) and electroblotted on PVDF membrane (Hybond P, Amersham, Les Ulis, France). The membrane was then incubated for 2-3 h at room temperature with primary Ab in 2% nonfat milk TPBS, washed three times, incubated with horseradish peroxydase-conjugated goat anti-mouse or anti-rabbit Abs (Jackson ImmunResearch Laboratories , West Grove, PE) for 30 min and revealed using enhanced chemoluminescence detection kit (ECL; Amersham).

Northern Blot Analysis

Total RNA was extracted according to the method of Chomczynski and Sacchi (Chomczynski and Sacchi, 1987). 10 µg of total RNA were fractionated by electrophoresis in 1% agarose-formaldehyde gels and transferred onto a nylon membrane (Hybond N, Amersham). Equivalent RNA loading was verified by ethidium-bromide staining of gels before transfer onto membranes. A Bam H1-1.35-kb full lenght human E2F1 cDNA fragment (kindly provided by Dr. K. Helin, Milan) was used as a probe and was radiolabeled using the random primed DNA labeling kit (Roche Diagnostics). The membranes were prehybridized and hybridized in 50% formamide, 5X Denhardt's solution, 50 mM phosphate buffer (pH 6.5), 5X SSC, 0.1% SDS, and 2.5 µg/ml salmon sperm DNA for 42 h at 42°C. The most stringent final wash was for 20 min at 56°C in 0.2X SSC, and 0.1% SDS. Membranes were exposed for autoradiography at -80°C for at least 3 days.

Aknowledgements

Legends to figures

  This work was supported by grants from the Association pour la Recherche sur le Cancer, from the Comité Départemental de la Ligue contre le Cancer de l'Isère and from the Groupement des Entreprises Francaises dans la Lutte contre le Cancer. B.E. was supported by INSERM (Poste Accueil).

Figure 1 .

 1 Figure 1. E2F1 expression in normal lung tissues, small cell lung carcinoma (SCLC) and

Figure 2 .

 2 Figure 2. E2F1 immunostaining of lung cancer tissue on frozen sections using anti-E2F1

Figure 3 .

 3 Figure 3. Indirect immunofluorescence study of E2F1 subcellular localization. E2F1

Figure 4 .

 4 Figure 4. Expression of E2F1 transcripts by northern blot analysis. Some representative

Figure 5 .

 5 Figure 5. E2F1, cyclin A, cyclin E, DHRF and cdc2 protein expressions in normal lung

Antibodies

Monoclonal antibodies (mAbs) included anti-cdc2p34 (sc-54, Santa-Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-cyclin E (clone HE12, Euromedex, Souffelweyersheim), anti-DHFR (Dihydrofolate Reductase; clone 49, Transduction Laboratories, Lexington, KY) and two anti-human E2F1 (clone Ab-4, Neomarkers and clone KH95, Pharmingen).

Rabbit polyclonal antibodies included anti-actin (20-33, Sigma-Aldrich, L'Isle d'Abeau) and anti-cyclin A (C-22, sc-160, Santa-Cruz).

Immunohistochemistry (IHC)

E2F1, KI67, Bcl-2 and Bax immunostaining were performed on frozen sections. For E2F1 immunostaining, two monoclonal E2F1 antibodies KH95 (Santa-Cruz; 1/100) and Ab-4 (Neomarkers; 1/50; data not shown) were used. Three step immunohistochemical method was applied on 5 µm thick frozen sections taken in the immediate vicinity of samples used for western-blot and immunoprecipitation studies. After E2F1 primary antibodies, the secondary antibody was anti-mouse (1/1250) and third step was ABC complex (Streptavidin-Biotin peroxidase; Dako). Cases were recovered as positive when at least 20% of tumour cells showed obvious nuclear staining. Only nuclear staining was considered to assess immunoreactivity. Cytoplasmic staining was never considered in the assessment of E2F1 expression. It was observed in addition to nuclear staining in a subset of squamous carcinoma and adenocarcinoma. Normal lung cells, lymphocytes and vessels were all negative. KI67 immunostaining was performed using a mouse monoclonal antibody from Immunotech (1/100). KI67 percentage of positive cells was established on


1 Что пишет Арнольд В брошюре 2002 года Что такое математика [START_REF] Арнольд | такое математика?[END_REF] Владимир Игоревич Арнольд пишет:

Математическая строгость часто оказывается труднопреодолимым препятствием даже и для хороших математиков. Следующий пример заимствован из замечательной классической книги Р. Куранта и Г. Роббинса Что такое математика? (недавно переизданной на русском языке).

Речь идет о применении топологии. Пусть на катящейся по горизонтальному рельсовому пути платформе установлена перпендикулярно рельсам закрепленная горизонтальная ось, над которой возвышается способный вращаться вокруг этой оси перевернутый маятник (стержень).

Утверждается, что каков бы ни был заданный закон движения платформы (в течение промежутка времени от нуля до единицы), начальное положение маятника можно выбрать так, что он в конечный момент времени не будет горизонтален (Хасслер Уитни).

Авторы доказывают это так. Если исходное положение маятника горизонтально лежачее, вперед по ходу, то таким оно и останется. Если же исходное положение горизонтально лежачее, но назад по ходу, то и это сохранится.

Рассмотрим теперь произвольное начальное положение. Конечное положение определяется начальным. Эта непрерывная функция принимает оба значения вперед и назад . По теореме топологии она принимает и промежуточные значения, что и требовалось доказать.

Некоторое время назад мне передали просьбу от проф. Роббинса (Курант к тому времени уже умер) постараться исправить это ошибочное доказательство . Дело в том, что никакой непрерывной функции конечное состояние при данном начальном состоянии тут сразу не видно: ее нужно еще точно определить (с каким-то учетом влияния возможных ударов о платформу), и нужно доказать ее непрерывность. Я слышал, что американские математики, пытавшиеся всё это сделать, написали (неизвестное мне) сочинение с ошибочными промежуточными утверждениями и доказательствами, так что вопрос о маятнике и сегодня, видимо, остается открытым1 .

Арнольд возвращается к этому вопросу в 2009 году в другой брошюре, Математическое понимание природы. Очерки удивительных физических явлений и их понимания математиками (с рисунками автора) [START_REF] Арнольд | Математическое понимание природы[END_REF], где пишет:

На горизонтальных рельсах стоит платформа, на которой укреплена перпендикулярно рельсам горизонтальная ось вращения перевёрнутого маятника , который может свободно вращаться в (параллельной рельсам) вертикальной плоскости. Платформа движется по закону x = f (t) (где f гладкая на отрезке [0, T ] функция времени). Доказать, что существует такое начальное состояние маятника α(0) = ϕ, dα dt (0) = 0, что он не упадёт на платформу за всё время T её движения.

Решение (Куранта). Если ϕ = 0, то α(t) = 0 всегда, и если ϕ = π, то α(t) = π при всех t.

Из непрерывной зависимости решения (гладкого) дифференциального уравнения от начального условия ϕ заключаем, по теореме о промежуточном значении, что между начальными условиями α(0) = 0 и α(0) = π существует такое значение α(0) = ϕ, что α(t) при 0 t T заключено строго между 0 и π, так что маятник не падает.

Замечание. Многие возражали против этого (ошибочного) доказательства, так как, даже если бы была определена непрерывная функция α( • , T ), начального положения ϕ, из её отличия от нуля и π при начальном условии • = ϕ не следует отличие угла α от 0 и от π во все промежуточные значения моменты времени, 0 < t < T .

Вероятно, можно было бы рассмотреть разумное обобщение рассуждений Куранта, в котором значения функции α(ϕ,t) определены естественным продолжением после моментов удара о платформу (где α(ϕ, t)=0 или π). Но в литературе такое обобщение отсутствует, и строгое доказательство приведённой гипотезы Куранта неизвестно.

Различные возражения к различным попыткам обосновать вывод Куранта опубликовали Дж. Литтлвуд и другие (например, некоторые из контрпримеров к одному из таких обоснований оказались недействительными, если скорость df /dt меньше скорости света).

Но я не видел разумного анализа этой задачи с учётом ударов. Описанная теорема была помещена Курантом в замечательный элементарный учебник: Курант и Роббинс Что такое математика? , со ссылкой на Уитни.

Попытки разобраться в этом деле (в связи с подготовкой переиздания книги Куранта и Роббинса) показали, что тут довольно забавная и запутанная история с участием известных математиков.

Что написано у Куранта и Роббинса

Первое издание книги Что такое математика? Куранта и Роббинса [START_REF] Courant | What is Mathematics? An elementary approach to ideas and methods[END_REF] вышло на английском языке в 1941 году. В 1947 году вышел его русский перевод под редакцией В. Л. Гончарова, сделанный по первому и второму английским изданиям (1941 и 1943).

Действительно, обсуждаемая Арнольдом задача рассматривается в разделе VI.6.2 (2-е издание, с. 352; 3-е издание, с. 347). Авторы пишут (приводим текст по русским изданиям, которые в этой части практически не отличаются друг от друга, разве что небольшой отмеченной ниже стилистической правкой, несколькими запятыми и обозначением угла α на рисунке): * 2. Применение к одной механической проблеме. Мы закончим эту главу рассмотрением одной, на первый взгляд трудной, механической проблемы, которая, однако, решается очень просто посредством соображений, связанных с непрерывностью. (Проблема была предложена Г. У и т н и.) Предположим, что поезд на протяжении некоторого конечного промежутка времени проходит прямолинейный отрезок пути от станции A до станции B. Вовсе не предполагается, что движение происходит с постоянной скоростью или с постоянным ускорением. Напротив, поезд может двигаться как угодно: с ускорениями, с замедлениями; не исключены даже мгновенные остановки или частично даже движение в обратном направлении, прежде чем в итоге поезд придет на станцию B. Но так или иначе движение поезда на протяжении всего временнóго промежутка считается известным заранее; другими словами, считается заданной функция s = f (t), где s расстояние поезда от станции A, а t время, отсчитываемое от момента отправления поезда. К полу одного из вагонов прикреплен на шарнире тяжелый стержень, который без трения может вращаться вокруг оси, параллельной осям вагонов, вперед и назад от пола до пола. (Мы допускаем, что, прикоснувшись к полу, он в дальнейшем останется на нем лежать, если ему не случится подпрыгнуть снова.) [(If it does touch the floor, we assume that it remains on the floor henceforth; this will be the case if the rod does not bounce.)

α = 0 • или углу α = 180 • . Свойства функции f (x) таковы: она задана в ин- тервале 0 x 180 • , непрерывна в нем, и притом f (0) = +1, f (180) = -1.
Отсюда, по теореме Больцано, следует, что при каком-то промежуточном значении x (0 • < x < 180 • ) должно выполняться равенство f (x) = 0. А это противоречит тому, что функция f (x) может принимать только значения +1 и -1. Значит, приходится отвергнуть сделанное допущение, согласно которому стержень упадет на пол при каком угодно начальном его положении.

Совершенно ясно, что приведенное доказательство носит чисто теоретический характер, потому что не дает решительно никаких указаний на то, как определить искомое положение стержня. Вместе с тем, даже если бы такое положение и могло быть вычислено теоретически с абсолютной точностью, практически оно было бы бесполезно вследствие своей неустойчивости. Так, например, в предельном случае, если поезд неподвижен в течении всего путешествия , решение совершенно очевидно: x = 90 • ; но всякий, кто пытался уравновесить иголку в стоячем положении на гладкой горизонтальной поверхности, понимает, насколько это решение практически нереально. Тем не менее с математической точки зрения приведенное доказательство имеет неоспоримый интерес.

Математические подробности

Проявив занудство (возможно, с элементами бурбакизма), легко восполнить пробелы в изложении Куранта и Роббинса. Но сначала скажем подробнее, в чём состоят эти пробелы (используя базовые сведения об обыкновенных дифференциальных уравнениях).

Движение стержня описывается дифференциальным уравнением (одномерным, второго порядка). Неизвестной функцией является зависимость угла α от времени. Сила, действующая на стержень, складывается из силы инерции (связанной с движением поезда) и силы тяжести. Вместе с силами реакции стержня, позволяющими ему лишь вращаться вокруг оси, они определяют угловое ускорение стержня. Начальное условие говорит, что изначально стержень неподвижен (угловая скорость равна нулю), образуя угол α с горизонтом.

Теорема о непрерывной зависимости решения дифференциального уравнения от начальных условий гарантирует, что значение решения в конце пути поезда (как и в произвольный момент момент времени) является непрерывной функцией от начальных условий. Проблема, отмеченная Арнольдом, состоит в том, что прямо так сослаться на теорему нельзя. Если мы, следуя Куранту и Роббинсу, считаем, что после касания пола стержень прилипает к нему, то в этот момент дифференциальное уравнение уже не описывает процесс (и вообще ускорение бесконечно, а скорость имеет разрыв, когда стержень с ненулевой скоростью ударяется о пол). Можно убрать пол и рассмотреть движение на всей окружности возможных положений стержня. Тогда уравнение сохраняет силу всегда, но (как правильно отмечает Арнольд) из того, что в конце движения стержень вертикален (или находится в каком-то ином положении выше горизонтали), не следует, что он в процессе движения не опускался ниже горизонтали. Кто знает может быть, он даже сделал несколько оборотов, перед тем как вернуться в вертикальное положение.

Как восполнить эти пробелы? Будем, как и предлагалось, рассматривать уравнение на всей окружности (считая, что стержень не ударяется о пол, а может проделать целый оборот). Кроме того, мы можем считать, что задан закон движения платформы при всех t 0 (некоторая гладкая функция), и достаточно доказать, что существует начальное условие, при котором решение на всей полуоси t 0 остаётся в верхней полуплоскости (в интервале ±π/2 от верхнего положения). Здесь стоит отметить, что стандартные результаты про гладкое уравнение на компактном многообразии гарантируют, что при любом начальном условии решение продолжается на всю полупрямую t 0.

Начальное положение в верхней полуплоскости (с нулевой скоростью) будем называть левым (правым), если исходящая из него траектория пересекает горизонтальную полуплоскость первый раз слева (соответственно справа). Понятие первого раза определено корректно (если вообще есть пересечение с горизонтальной плоскостью): множество моментов горизонтального положения замкнуто, и среди них есть первый (точная нижняя грань этого множества ему принадлежит). Этот первый момент может быть либо левым, либо правым. Получаем два множества L и R начальных положений.

Заметим, что оба множества L и R непусты. В самом деле, функция f (t) в окрестности нуля имеет ограниченную вторую производную, и потому сила инерции, действующая на маятник, ограничена. Следовательно, если начальное положение маятника достаточно близко к горизонтальному, то силы инерции недостаточно, чтобы противодействовать гравитации, и маятник начнёт двигаться вниз и пересечёт горизонталь (с той стороны, где он находился изначально).

Осталось показать, что оба множества L и R открыты, и затем воспользоваться связностью интервала (0, π). Почему, скажем, множество L открыто? Пусть α 0 некоторый элемент L, и α(t) соответствующее решение. Пусть τ первый момент горизонтального положения, тогда α(τ ) = π. На интервале [0, τ ] расстояние от α(t) до другого горизонтального положения (α = 0) отделено от нуля, поэтому при всех достаточно близких начальных условиях по теореме о непрерывной зависимости (решения как функции от начального условия и момента времени) решение не попадает в правое горизонтальное положение на промежутке [0, τ ]. По той же теореме при достаточно близких к α 0 начальных условиях решение будет близко к π в момент времени τ . Поскольку ускорение тележки ограничено в окрестности отрезка [0, τ ] (и вообще на любом конечном отрезке), то отсюда следует, что при достаточно близких к α 0 начальных условиях решение либо уже пересечёт горизонталь слева, либо окажется в таком положении, где это неминуемо. Поэтому эти близкие положения все лежат в L, что и требовалось доказать. точная верхняя грань углов θ из S. Тогда θ 0 не входит в S, и из начального положения θ 0 стержень не упадет налево. Если же он упадет направо, то он сделает это и для всех θ, несколько меньших θ 0 ; однако это неверно, так как некоторые (в действительности все) из этих θ принадлежат S. Таким образом, из положения θ 0 стержень никогда не упадет. А для некоторого, достаточно малого угла вокруг θ 0 он не упадет в течение двух недель.

Поучительно рассмотреть, почему из этого рассуждения не вытекает, что стержень, соответствующим образом установленный в начальный момент, не будет отклоняться, скажем, более чем на 0,5 • от исходного положения. * Это рассуждение моментально убеждает математика. Из всех возможных вариантов избранный мною представляется наиболее подходящим для объяснения любителю. [This argument is instantly convincing to the mathematician. Of possible variants the one chosen seems best suited to be interpreted to the amateur.]

[Далее Литлвуд предлагает вариант такого более подробного истолкования для любителей . Для начала он обсуждает понятие точной верхней грани, мы пропускаем этот кусок.] Предположим, что в начальный момент стержень находится в состоянии относительного покоя и образует угол θ с левой горизонталью; назовем это начальным положением θ . Рассмотрим множество S начальных положений θ, из которых стержень рано или поздно упадет налево. Если это происходит с ним при каком-нибудь θ, то то же самое будет иметь место для для всех достаточно близких по обе стороны начальных положений; любое положение θ, принадлежащее к S, находится, следовательно, внутри целого сектора значений θ, принадлежащих к S (на математическом языке: S открыто ). Этот интуитивный факт, на котором все основано, имеет место при весьма общих условиях, уточнять которые нет необходимости. [This intuitive fact, on which everything turns, depends on very slight assumptions, and we need not try ro state them in detail.] Пусть θ 0 будет т. в. г. [точной верхней гранью] множества S. Тогда θ 0 не будет элементом S, так как в противном случае значения θ, находящиеся справа от θ 0 и достаточно близкие к нему, также принадлежали бы к S, и θ 0 не могло бы быть в. г. [верхней гранью] множества S. Итак, стержень при начальном положении θ 0 не упадет налево. Но, с другой стороны, если он упадет направо, то он будет падать направо и при всех достаточно близких начальных положениях θ слева от θ 0 (принцип открытости ), так что никакое из этих начальных положений не может быть элементом S; но это означает, что θ 0 может быть сдвинуто влево, оставаясь при этом в. г. S, что противоречит свойству (2) т. в. г. [минимальности]. Следовательно, из исходного положения θ 0 стержень никогда не упадет. А из достаточно малого сектора вокруг θ 0 он не упадет в течении двух недель.

Аналогичный результат верен и при замене обычного шарнира сферическим (позволяющим стержню наклоняться во все стороны). Но в этом случае нам пришлось бы ссылаться уже на значительно более сложную теорему о неподвижной точке (КР, стр. 335) [в оригинале ссылка на с. 321 английского издания].

Ни здесь, ни в другом месте книги Литлвуд не объясняет, каким образом получена оценка длины интервала углов, позволяющего стержню не падать в течение двух недель (1 : 10 10 5 ). Также не очень понятно, на какого гения намекает Литлвуд (Уитни?). Можно ещё отметить, что рассуждение (начиная с утверждения об открытости, принятого без доказательства), проведено весьма отчётливо и тут трудно к чемунибудь придраться даже педанту.

Изменение текста Курантом и Роббинсом

Дополнительную путаницу в истории вопроса создаёт различие в текстах разных изданий Куранта и Роббинса [START_REF] Courant | What is Mathematics? An elementary approach to ideas and methods[END_REF]. Мы уже приводили русский перевод, который во всех изданиях следует первому английскому изданию 1941 года. И хотя в английских изданиях текст про задачу Уитни был позже изменён (в издании 1948 года он уже другой), русский текст в последующих переизданиях остался практически неизменным несмотря на заверения А. Н. Колмогорова в предисловии ко второму русскому изданию, что перевод был выправлен и пополнен по последнему английскому (1948) и немецкому (1962) изданиям . Тот же самый изменённый текст был вопроизведён в переиздании 1996 года с участием Стьюарта (о комментариях которого смотри ниже). Приводим для справки этот изменённый текст (потому что часть критики Арнольда и других авторов может относиться к нему).

[Формулировка задачи и комментарии к ней оставлены почти без изменений. Начиная с абзаца К счастью. . . , изменённый текст выглядит так:] Paradoxical as this assertion might seem at first sight, it can be proved easily once one concentrates on its essentially topological character.

No detailed knowlegde of the laws of dynamics is needed; only the following simple assumption of the physical nature need be granted: The motion of the rod depends continuously on its initial position. Let us characterize the initial position of the rod by the initial angle x which it makes with the floor, and by y the angle which the rod makes with the floor at the end of the journey, when the train reaches the point B. If the rod has fallen to the floor we have either y = 0 or y = π. For a given initial position x the end position y is, according to our assumption, uniquely determined as a function y = g(x) which is continuous and has the values y = 0 for x = 0 and y = π for x = π (the latter assertion simply expressing that the rod will remain flat on the floor if it starts in this position). Now we recall that g(x), as a continuous function in the interval 0 x π, assumes all the values y, e.g. for the value y = π/2, there exists a specific value of x such that g(x) = y; in particular, there exists an initial position for which the end position of the rod at B is perpendicular to the floor. (Note: in this argument it should not be forgotten that the motion of the train is fixed once for all.)

Of course, the reasoning is entirely theoretical. If the journey is of long duration or if the train schedule, expressed by s = f (t), is very erratic, then the range of the initial positions x for which the end position g(x) differs from 0 or π will be exceedingly small, as is known to anyone who has tried to balance a needle upright on a plate for an appreciable time. Still, our reasoning should be of value even to a practical mind inasmuch as it shows how qualitative results in dynamics may be obtained by simple arguments without technical manipulation.

Разница с первоначальным вариантом изложения (см. русский перевод выше) состоит в том, что раньше предлагалось предположить, что стержень всегда падает и рассмотреть функцию с двумя значениями на всех начальных положениях. Непрерывность этой функции означает, что прообразы этих значений открыты, то есть множество тех начальных углов, когда стержень падает влево (или вправо), открыто. Теперь же утверждается безо всяких предположений, что конечное положение стержня (при движении с прилипанием к горизонтали) будет непрерывно зависеть от начальных условий. Это тоже верно, но требует чуть более сложного обоснования (ссылки на теорему о непрерывной зависимости от начального условия тут мало, потому что рассматриваемый вариант движения с прилипанием не соответствует никакому дифференциальному уравнению). Это обоснование также опирается на отмеченный нами выше ключевой факт: попадание в малую зону у горизонтали уже гарантирует скорое попадание на горизонталь (и прилипание), и включает в себя доказательство открытости зон прилипания как часть.

Мне не удалось найти точный момент замены текста (и уж тем более никаких объяснений мотивов такого удачного ухудшения , если воспользоваться выражением Литлвуда из [START_REF] Littlewood | A Mathematician's Miscellany[END_REF]). Дополнительную путаницу создаёт и то обстоятельство, что перепечатка текста Куранта и Роббинса про задачу Уитни (с заголовком The lever of Mahomet видимо, с намёком на одноимённый гроб) в хрестоматии Ньюмана [9] в 1960 году, много позже издания 1948 года с новым текстом, следует оригинальному изданию 1941 года (почему не знаю).

Разъяснения Бромана

В 1957 году на 13 Скандинавском математическом конгрессе в Хельсинки Арне Броман сделал доклад, опубликованный в 1958 году [START_REF] Broman | A mechanical problem by H[END_REF]. В этой публикации, со ссылкой на Куранта и Роббинса, формулируется задача Уитни (с требованием доказать, что существует начальное положение, при котором в конце пути стержень будет вертикальным). Приводится решение по Куранту и Роббинсу (в изменённом варианте, с непрерывной зависимостью от начального положения без предположения об обязательном падении).

Далее автор отмечает, что However, the physical assumption in the solution of Courant -Robbins seems a bit hazardous , и делает сноску к этому предложению: In saying this, we do not intend to criticize the interesting and well-written book by Courant and Robbins. They have included the problem to get an application of the mentioned theorem on continuous functions. После этого автор переходит к обоснованию непрерывности этой самой функции. Сначала он удаляет ограничения на горизонтали: We now remove for a while the stops for the rod in the horizontal position so that the rod can revolve all around the point O. Then the final angle β, considered as a function β = β(α) of the initial angle α, is obviously defined and continuous for all real α. Таким образом, можно утверждать, что найдётся начальное условие, при котором свободный от горизонтальных ограничений стержень окажется по окончании пути в верхнем положении. Но (как и указывал Арнольд), этого мало нужно дополнительно, чтобы стержень всегда оставался в верхней полуплоскости.

Чтобы восполнить этот пробел в рассуждении, Броман замечает, что первое же приближение к горизонтали на достаточно малое расстояние влечёт её пересечение, и рассматривает множество начальных условий, при которых такое пересечение имеет место слева или не имеет места вовсе, но конечное положение находится слева от вертикали. Он устанавливает, что это множество открыто (опираясь на сделанное замечание), и отсюда выводит требуемый результат.

Наконец, в последнем разделе своей статьи он замечает, что если поезд после приезда в B навсегда останавливается, то существует такое начальное положение, при котором стержень никогда не коснётся пола (это замечание было уже у Куранта и Роббинса в качестве упражнения).

В качестве примечания 9 Броман приводит немного другое рассуждение (со ссылкой на М. Тидемана): в нём дифференциальное уравнение модифицируется так, чтобы стержень, коснувшись пола, продолжал двигаться вниз и не мог сделать полного оборота, но с сохранением достаточной гладкости для применения теоремы о непрерывной зависимости от начальных условий.

Критика Постона и её пересказ Стьюартом

С 1958 года и до 1976 года казалось, что недоразумения с задачей Уитни исчерпаны, и те, кого (вопреки надежде Литлвуда) исходное рассуждение не убеждает, могут обратиться к разъяснениям Бромана. По крайней мере, я не видел никаких публикаций в этот период, авторы которых требовали бы дополнительных разъяснений или выдвигали возражения.

Однако в 1976 году появилась статья Постона в малодоступном издании [START_REF] Poston | Au courant with differential equations[END_REF]. Мне не удалось добыть её текста, но о её содержании можно судить по краткому пересказу самого Постона в его другой статье (см. примечание к описанию статьи [START_REF] Poston | Au courant with differential equations[END_REF]): Certainly there are instances where continuous systems beget discontinuity -indeed, an interesting case where Courant and Robbins [START_REF]What Is Mathematics? An Elementary Approach to Ideas and Methods[END_REF] appeal inappropriately to the Intermediate Value Theorem is analysed in [START_REF] Davis | Christopher Zeeman medal award lecture[END_REF] (где [START_REF] Davis | Christopher Zeeman medal award lecture[END_REF] эта самая малодоступная заметка [START_REF] Poston | Au courant with differential equations[END_REF]), и по подробному пересказу в издании Куранта и Роббинса 1996 года [START_REF] Courant | What is mathematics? An elementary approach to ideas and methods[END_REF]. Это издание вышло с изменениями Стьюарта точнее сказать, не с изменениями (поскольку основная часть книги была воспроизведена по предыдущим изданиям), а с дополне-ниями. Одно из этих дополнений (с. 505 и далее) посвящено задаче Уитни. Стьюарт пишет:

There is one place where arguably Courant and Robbins made a mistake, although by adding further conditions is it possible to save their argument. Paradoxically, the flaw in their proof is most easily detected if we employ the topological approach to dynamics that their argument was intended to advocate.

[Далее следует пересказ условия задачи Уитни и решения, опирающегося (после изменений, о которых мы говорили) на непрерывную зависимость конечного положения от начального условия. После этого Стьюарт пишет:]

The difficulty is that the continuity assumption made in the above discussion is arguably not justified. The problem is not the intricacies of Newton's laws of motion, but those "absorbing boundary conditions": if the rod hits the floor, then it stays there. In order to see why the boundary conditions cause trouble, we introduce a topological picture of the possible motions of the system. This approach, known as as phase portrait, goes back to Poincaré. The idea is to draw a kind of space-time diagram of the motion, not just for a single initial position of the rod, but for many different positions-in principle, all of them. The position of the rod is an angle between 0 • and 360 • , and we can graph this in the horizontal direction (see Fig. 294). Let time run in the vertical direction. Note that the left and right hand edges of this picture should be identified because 0 • = 360 • : conceptually, the rectangle is rolled into a cylinder. Now, the path is space and time of the angle that determines the position of the rod forms some curve that runs up the cylinder -what Albert Einstein called a "world-line". Different initial angles lead to different curves. The laws of dynamics show that these curves vary continuously-provided the boundary conditions are not enforced. Without these conditions the rod is free to turn a full 360 • -there is no floor to prevent it turning all the way round. A possible history is shown in Fig. 294a, and here the final position does depend continuously upon the initial position.

However, when the absorbing boundary conditions are put back (Fig. 294b), the final position need not depend continuously on the initial one. Curves that just graze the left-hand boundary can swing all the way over to the right. Indeed, in this particular picture all initial conditions end up on the floor: contrary to what Courant and Robbins claim, there is no choice that keeps the rod off the floor throughout the motion.

This error in Courant and Robbins' reasoning was first pointed out by Tim Poston in 1976, but it is still not widely known. The continuity assumption can be resuscitated by imposing extra con[s]traints on the motion, for example a perfectly level track, no springs on the train, and so forth. But it seems more instructive, as an exercise in the application of topology to dynamics, to understand why the absorbing boundary conditions destroy continuity.

С математической точки зрения Стьюарт пишет правильно: действительно, добавление поглощающих границ нарушает непрерывность, и действительно в предположении о том, что поезд движется горизонтально и не имеет рессор, непрерывность может быть обоснована. Примерно такой же (но чуть менее подробный) текст можно найти в книге Стьюарта [START_REF] Stewart | Set and Math: Enigmas and Conundrums[END_REF], где он, однако, не упоминает о том, что в предположениях Куранта и Роббинса непрерывность несложно доказать, а говорит лишь, что the continuity assumption is not justified (и приводит тот же рисунок траекторий без граничных условий и с ними).

Однако и то верно, что у Куранта и Роббинса эти дополнительные предположения были сделаны, а утверждение о непрерывности (для этого, а не более общего случая) было сформулировано без обоснования (и это было явно указано). То, что для негоризонтального пола (поглощающих границ под произвольным углом) утверждение будет неверно, отмечал ещё Литлвуд (абзац Поучительно рассмотреть в приведённой выше цитате). В такой ситуации говорить об ошибке в рассуждении Куранта и Роббинса , как это делают Стьюарт и Постон (см. его цитату в [START_REF] Work | Review by: Leonard Gillman[END_REF]), кажется несколько чрезмерным.

Похоже, что впоследствии и сам Стьюарт пришёл к такому заключению. По крайней мере, такое впечатление создаётся при чтении отчёта о его лекции в 2009 году [START_REF] Davis | Christopher Zeeman medal award lecture[END_REF]: Professor Stewart's lecture, entitled The Strange Case of the Courant -Robbins Train, centered around a problem that he said had been bothering him for 40 years. It concerns a train and how its motion, and the influence of gravity, would affect a rod pivoted on the floor. In their 1941 book What is Mathematics? Richard Courant and Herbert Robbins asked if it were possible to place the rod in such a position that, if it is released when the train starts, it will not fall to the floor during the entire journey. Although this appears to be a complex problem in mechanics, they asserted that the answer is a simple yes and avoided the complexities of mechanics using a simple application of the concept of continuity. With his trademark geniality and witty presentation skills, Professor Stewart carefully guided the audience through his concern: does the concept of continuity actually apply in this situation? By considering boundary conditions and floors of railway carriages which slanted towards the middle, he showed that in fact Courant and Robbins were correct to assume continuity in the particular case where the carriage has a flat floor although the proof of continuity actually does require a careful analysis of the underlying mechanics. But this is not always the case for other shaped floors.

Рецензии на новое издание

Выход нового издания книги Куранта и Роббинса с дополнениями Стьюарта был замечен рецензентами. В 1998 году в Americal Mathematical Monthly была опубликована рецензия Леонарда Гиллмана [START_REF] Work | Review by: Leonard Gillman[END_REF]. В ней приводится формулировка задачи и излагаются возражения Стьюарта со ссылкой на Постона. (Гиллману, в отличие от меня, удалось получить текст статьи Постона [START_REF] Poston | Au courant with differential equations[END_REF] ему его прислал Мартин Гарднер!) Реакция Постона Гиллману тоже кажется чрезмерной (он отмечает, что Poston's term is 'wrong' , p. 488); далее он, со ссылкой на Радина (Charles Radin, частное сообщение) намечает отсутствующее у Куранта и Роббинса рассуждение. Радин также использует ключевое соображение о том, что приблизившись к полу достаточно близко, стержень непременно столкнётся с ним (видимо, в тексте опечатка в знаке неравенства для t ):

First we prove: For any given physical setup and itinerary x(t), there is an > 0 such that, if H(t) < and V (t) is either zero or directed toward the floor, then H(t ) H(t) for t < t < T . This follows almost immediately from noticing that when the rod is almost at the floor, the angular acceleration of the rod produced by the bounded horizontal acceleration of the train must be smaller in magnitude that the vertical acceleration caused by gravity; the net acceleration must then be directed toward the floor, and if the angular verlocity is also directed toward the floor the conclusion follows.

Далее он объясняет (примерно так же, как и Броман), почему из этого соображения вытекает непрерывность.

В другой рецензии (Брайн Бланк [START_REF]What Is Mathematics? An Elementary Approach to Ideas and Methods[END_REF], Notices of the AMS ) рецензент с сожалением отмечает, что изменения в издании 1996 года по сравнению с предыдущими минимальны:

All the old figures are there. Even the original typesetting has been preserved -quite a welcome change from the homogenized TEX of the present. Closer inspection, however, reveals something less welcome: the new edition is by and large a photographic reproduction. I could not find even one change in it. Stewart rationalizes this in his preface: "not a single word or symbol had to be deleted from this new edition." Really? After half a century could we not have had a correction to the name of Mr. Arch medes (p. 400)?

Рецензент также упоминает критику Стьюарта и объяснения Гиллмана:

Stewart relates a challenge to the basic continuity assumption that underlies the solution given by Courant and Robbins. Ironically, that challenge itself relies on the assumption that the train can move in a way that is physically impossible, as Gillman has pointed out in his review [START_REF] Broman | A mechanical problem by H[END_REF].

(Здесь [START_REF] Broman | A mechanical problem by H[END_REF] это рецензия Гиллмана [START_REF] Work | Review by: Leonard Gillman[END_REF].)

После Арнольда

После публикаций книг Арнольда (который, кстати, даёт ссылку на рецензии Гиллмана и Бланка, но никак их не комментирует), интерес к задаче Уитни снова вырос, и появилось несколько сравнительно недавних публикаций [START_REF]Полехин, Примеры использования топологических методов в задаче о перевернутом маятнике на подвижном основании[END_REF][START_REF] Polekhin | An inverted pendulum with a moving pivot point: examples of topological approach[END_REF][START_REF] Zubelevich | Bounded Solutions to the System of 2-nd Order ODE and the Whitney pendulum[END_REF][START_REF] Болотин | Вариационное исчисление в целом, существование траекторий в области с границей и задача Уитни о перевернутом маятнике[END_REF][START_REF] Srzednicki | On periodic solutions in the Whitney's inverted pendulum problem[END_REF]. И. Ю. Полехин в статье 2014 года [START_REF]Полехин, Примеры использования топологических методов в задаче о перевернутом маятнике на подвижном основании[END_REF], приведя формулировку задачи Уитни из русского издания Куранта и Роббинса, пишет: Положительный ответ на этот вопрос [о начальном положении, когда стержень не коснётся пола] дается самими авторами. Тем не менее, предложенное доказательство использует предположение о том, что движение стержня зависит непрерывным образом от начальных условий. Данное предположение кажется естественным, и подобное действительно верно для широкого класса механических систем, но в случае, когда считается, что, коснувшись пола, стержень вечно остается горизонтальным, непрерывная зависимость от начальных данных становится менее очевидной. В частности, эта неполнота доказательства была отмечена Арнольдом при обсуждении данной задачи [START_REF] Арнольд | Математическое понимание природы[END_REF]. В настоящей работе приводится строгое обоснование существования решения без падений (в том числе для случая решения, определенного на бесконечном полуинтервале времени), основанное на применении топологического метода Важевского.

Здесь [START_REF] Арнольд | Математическое понимание природы[END_REF] это книга Арнольда [START_REF] Арнольд | такое математика?[END_REF]. Само рассуждение, насколько я могу судить (работ Важевского я не читал, и в изложении Полехина много формул), следует схеме Бромана и Гиллмана. Помимо этого, доказывается, что для случая периодического движения поезда существует периодическое решение для стержня, при котором он никогда не касается пола.

В английском варианте [START_REF] Polekhin | An inverted pendulum with a moving pivot point: examples of topological approach[END_REF] Полехин описывает ситуацию так:

This shortcoming of the original proof [из книги Куранта и Роббинса] was mentioned and briefly commented by Arnold in his book [Arn] which also includes short overview of the articles related to the matter. Yet detailed consideration of the issue of whether original prove [опечатка: вероятно, должно быть 'proof'] is full and correct or not is beyond the objective of the paper. In the first section, application of the topological Ważewski principle to the above problem is considered. This method allows us to prove existence of solutions without falling (even on an infinite time interval), including solutions with zero initial velocity of inverted pendulum.

Здесь [Arn]

та же книга Арнольда [START_REF] Арнольд | такое математика?[END_REF]. Полехин упоминает статьи, цитируемые Арнольдом, включая рецензии Гиллмана и Бланка, но никак не комментирует связи своего рассуждения с приводимым Гиллманом рассуждением Радина, и осторожно пишет про issue of whether original proof is full and correct or not . Статья Бромана [START_REF] Broman | A mechanical problem by H[END_REF] также не упоминается.

Есть ещё одна публикация примерно того же времени, посвящённая задаче Уитни и её обобщениям [START_REF] Zubelevich | Bounded Solutions to the System of 2-nd Order ODE and the Whitney pendulum[END_REF] её автор Олег Зубелевич, изложив условие задачи Уитни, пишет:

The authors [Курант и Роббинс] gave positive answer to this question. Their argument was informal. V. Arnold in [START_REF] Арнольд | такое математика?[END_REF] considered this problem as open. The complete solution to the problem has been given by I. Polekhin in his Ph.D. thesis (unpublished), see also [START_REF] Болотин | Вариационное исчисление в целом, существование траекторий в области с границей и задача Уитни о перевернутом маятнике[END_REF]. He solved the problem by direct application of results from [START_REF]What Is Mathematics? An Elementary Approach to Ideas and Methods[END_REF]. In this article we prove simple and general theorem which implies particularly that there are continuum never-falling solutions to Whitney's problem, we also believe that this theorem describes many other such a type effects.

Здесь [START_REF] Арнольд | такое математика?[END_REF] та же книга Арнольда 2002 года, [START_REF] Болотин | Вариационное исчисление в целом, существование траекторий в области с границей и задача Уитни о перевернутом маятнике[END_REF] публикация Полехина [START_REF] Polekhin | An inverted pendulum with a moving pivot point: examples of topological approach[END_REF], а [START_REF]What Is Mathematics? An Elementary Approach to Ideas and Methods[END_REF] статья [START_REF] Srzednicki | Fixed point results based on Ważewski method[END_REF] (где непосредственно задача Уитни не упоминается). Один из авторов последней статьи, Роман Сшедницки, в 2017 году опубликовал заметку [START_REF] Srzednicki | On periodic solutions in the Whitney's inverted pendulum problem[END_REF], в которой рассказывает об истории задачи Уитни (и из которой я узнал о существовании работы Бромана [START_REF] Broman | A mechanical problem by H[END_REF], в частности). Он пишет:

In the book "What is Mathematics?" Richard Courant and Herbert Robbins presented a solution of a Whitney's problem of an inverted pendulum on a railway carriage moving on a straight line. Since the appearance of the book in 1941 the solution was contested by several distinguished mathematicians. The first formal proof based on the idea of Courant and Robbins was published by Ivan Polekhin in 2014. Polekhin also proved a theorem on the existence of a periodic solution of the problem provided the movement of the carriage on the line is periodic. In the present paper we slightly improve the Polekhin's theorem by lowering the regularity class of the motion and we prove a theorem on the existence of a periodic solution if the carriage moves periodically on the plane.

Однако, говоря о статье Бромана [START_REF] Broman | A mechanical problem by H[END_REF], Сшедницки довольно загадочно пишет He presented a comprehensive argument supporting the Courant and Robbins' solution, although his proof lacks of formal rigor at some details не указывая, однако, что же это за такие детали. Упомянув возражения Арнольда в [START_REF] Арнольд | Математическое понимание природы[END_REF] ( At that time Arnold had still objections towards the correctness of the solution from [CR] ), он пишет: Здесь [P1] это статьи Полехина [START_REF]Полехин, Примеры использования топологических методов в задаче о перевернутом маятнике на подвижном основании[END_REF][START_REF] Polekhin | An inverted pendulum with a moving pivot point: examples of topological approach[END_REF], [BK] это статья Болотина и Козлова [START_REF] Болотин | Вариационное исчисление в целом, существование траекторий в области с границей и задача Уитни о перевернутом маятнике[END_REF], а [Zu] статья Зубелевича [START_REF] Zubelevich | Bounded Solutions to the System of 2-nd Order ODE and the Whitney pendulum[END_REF]. В статье [START_REF] Болотин | Вариационное исчисление в целом, существование траекторий в области с границей и задача Уитни о перевернутом маятнике[END_REF] (после формулировки некоторых общих результатов) упоминается задача Уитни, ситуация с которой описывается так: Утверждение о существовании движений перевернутого маятника без падений сформулировано Уитни и обсуждается в книге [START_REF] Арнольд | Математическое понимание природы[END_REF]. Доказательство основано на несуществовании ретракции отрезка на его границу. Критические замечания В. И. Арнольда [START_REF] Broman | A mechanical problem by H[END_REF] стимулировали появление полных доказательств теоремы Уитни (с указанием условий ее справедливости) [START_REF] Болотин | Вариационное исчисление в целом, существование траекторий в области с границей и задача Уитни о перевернутом маятнике[END_REF], [START_REF]What Is Mathematics? An Elementary Approach to Ideas and Methods[END_REF].

Здесь [START_REF] Арнольд | Математическое понимание природы[END_REF] это книга Куранта и Роббинса, несуществование ретракции теорема о промежуточных значениях, [START_REF] Broman | A mechanical problem by H[END_REF] книга [START_REF] Арнольд | такое математика?[END_REF], а [START_REF] Болотин | Вариационное исчисление в целом, существование траекторий в области с границей и задача Уитни о перевернутом маятнике[END_REF] и [START_REF]What Is Mathematics? An Elementary Approach to Ideas and Methods[END_REF] соответственно [START_REF]Полехин, Примеры использования топологических методов в задаче о перевернутом маятнике на подвижном основании[END_REF] и [START_REF] Zubelevich | Bounded Solutions to the System of 2-nd Order ODE and the Whitney pendulum[END_REF]. Не вполне ясно, считают ли авторы [START_REF] Болотин | Вариационное исчисление в целом, существование траекторий в области с границей и задача Уитни о перевернутом маятнике[END_REF] доказательства Бромана из [START_REF] Broman | A mechanical problem by H[END_REF] или Радина из [START_REF] Work | Review by: Leonard Gillman[END_REF] неполными и если да, то в чём их неполнота.

Fig. 294 .

 294 Fig. 294. Possible history of the moving rod for different initial conditions. (a) Without boundary conditions. (b) What happens when the boundary conditions are imposed.

Finally, in

  2014, 73 years from the announcement of the Whitney's problem, in the paper [P1] Ivan Polekhin provided a short rigorous proof of the Courant and Robbins's solution based on the Ważewski retract theorem. Other proofs were published in [BK] and [Zu].

  Стержень шарнирно прикреплён к полу железнодорожного вагона и предоставлен самому себе; тогда существует малая, но отличная от нуля, вероятность того, что он не упадет в течение двух недель: вероятность равна примерно 1 : 10 10 5 . (Поезд не предполагается идеальным : например, он отправляется со станции Кингс Кросс в 3.15, проходит через туннель, где он 5 минут стоит, а затем, после ряда дальнейших остановок, прибывает в Кембридж в 5.35. Я припоминаю, что мне сообщили, что гений, впервые задавший этот вопрос, не был в состоянии ответить на него.) [I seem to remember being told that the genius who asked the original question was unable to answer it.] Доказательство имеется в КР [имеется в виду книга Куранта и Роббинса], с. 421-423 [в русском переводе указываются страницы по русскому изданию 1947 года, в английском оригинале Литтлвуд говорит о с. 319]. * Иной способ доказательства (с разумной свободой интерпретации) состоит в следующем. Рассмотрим начальное положение стержня в относительном покое, составляющее угол θ с левым горизонтальным положением. Пусть S будет множество начальных θ, при которых стержень рано или поздно упадет налево. Основной факт при очень слабых предположениях относительно обстоятельств путешествия и взаимосвязи поезда и стержня (нам нет необходимости детально устанавливать эти предположения) состоит в том, что множество S открыто. Пусть θ 0

	4 Исторические подробности
	4.1 Пересказ Литлвуда
	Книга Куранта и Роббинса вышла в 1941 году. В 1953 году выходит книга Литлвуда
	Математическая смесь [11], которая в 1962 году была опубликована по-русски в
	переводе В. И. Левина. Литлвуд упоминает задачу Уитни, ссылаясь на Куранта и Роб-
	бинса. Приведём соответствующий кусок в русском переводе (вполне соответствующем
	оригиналу):

Дискуссия об этой задаче Х. Уитни опубликована: B. E. Blank. Book review: What is mathematics? // Notices of the Amer. Math. Soc.

Vol. 48, No. 11. P. 1325-1329; L. Gillman. Book review: What is mathematics? // Amer. Math. Monthly. 1998. Vol. 105, No. 5. P. 485-488; J. E. Littlewood. Littlewood's miscellany. Cambridge Univ. Press, 1986. P. 32-35. (Примечание В. И. Арнольда. Видимо, в последней ссылке Арнольд имеет в виду [11].)

В английском тексте, как видим, явно указано, что стержень предполагается приклеивающимся к полу при контакте а не просто что он будет лежать на полу, если ему не случится подпрыгнуть .


Frédéric Richard Wheeler
email: rwheeler@pasteur.fr

Frédéric Veyrier
email: frederic.veyrier@iaf.inrs.ca

Catherine Werts
email: cwerts@pasteur.fr

Ivo Gomperts Boneca

Ivo Gomperts

Boneca R Wheeler

I G Boneca
email: bonecai@pasteur.fr

Peptidoglycan and Nod Receptor

Keywords: Peptidoglycan, Gram-negative, Gram-positive, Mycobacterium, Nod1, Nod2, NF-κB, Cell wall

Introduction

Peptidoglycan is a unique heteropolymer composed of glycans cross-linked by short stem peptides and is the major component of the bacterial cell wall . The glycans are built from repeating units of the disaccharide Nacetylglucosamine-β(1,4)-N-acetylmuramic acid. The stem peptides are attached to the lactyl moiety of the Nacetylmuramic acids and are composed of alternating l-and d-amino acids with the following general sequence: l-Ala, d-Glx, diamino acid (most frequently meso-diaminopimelic acid or l-lysine), d-Ala, d-Ala. The unique nature of the peptidoglycan has been co-opted during evolution by eukaryotes as a signal for the presence of bacteria in their environment. For example, invertebrates use a variety of peptidoglycan recognition proteins (PGRPs; [START_REF] Gottar | The Drosophila immune response against Gram-negative bacteria is mediated by a peptidoglycan recognition protein[END_REF][START_REF] Michel | Drosophila Toll is activated by Gram-positive bacteria through a circulating peptidoglycan recognition protein[END_REF]) to sense peptidoglycan, while mammals use the Nod-like receptors (NLRs) Nod1 and Nod2 (Girardin et al. 2003a, b). The last decade has generated much work on the structure, recognition, and specificity of these receptors (Girardin et al. 2003c). However, despite a common building block, the mature peptidoglycan is highly heterogeneous and species specific. Thus, to ascertain the biological activity of the peptidoglycan of a given species, the preparation of a highly purified peptidoglycan is required, free of other cell wall components such as lipoproteins, secondary polysaccharides, lipopolysaccharides, lipoteichoic acids, and many other components that are often species or genus specific [START_REF] Travassos | Toll-like receptor 2-dependent bacterial sensing does not occur via peptidoglycan recognition[END_REF]). Once purified, the peptidoglycan biological activity towards the peptidoglycan receptors Nod1 and Nod2 can be tested in cellular assays using luciferase reporter systems [START_REF] Travassos | Toll-like receptor 2-dependent bacterial sensing does not occur via peptidoglycan recognition[END_REF]) (Figs. 1 and2).

Protocol I: Peptidoglycan Purification

Peptidoglycan purification methods vary for different types of bacteria. As far as possible, the following is a single protocol that can be applied to all bacteria. Please read through the protocol carefully, noting additional steps that may be required for your specific application. Additionally, toxic substances are used throughout these protocols. Read MSDS and use appropriate safety precautions (e.g., hydrofluoric acid (HF) is extremely hazardous and has a high reactivity towards glass and many metals; it is stored in compatible plastic containers).

Stock buffers solutions and enzymes:

1. 8 % SDS; SDS is purchased typically as a 20 % solution. Dilute 200 ml of 20 % SDS in milli-Q (MQ) water to a final volume of 500 ml.

2.

0.5 % KOH in methanol-diethyl ether (1:1). Combine 100 ml methanol with 100 ml diethyl ether to produce a 1:1 methanol-diethyl ether solution. Dissolve 1 g of KOH in methanol-diethyl ether solution to a final volume of 200 ml.

3. 8 M LiCl; dissolve LiCl (169.56 g) in MQ water to a final volume of 500 ml.

4.

100 mM EDTA pH 8; dissolve EDTA (14.61 g) in 400 ml MQ water. EDTA dissolves at basic pH. With continual mixing, gradually add NaOH pellets until the EDTA fully dissolves. Adjust the pH to 8.0, and then add MQ water to a final volume of 500 ml.

5.

1 M MgSO 4 ; dissolve MgSO 4 (60.16 g) in MQ water to a final volume of 500 ml.

6. 1 M CaCl 2 ; dissolve CaCl 2 (55.49 g) in MQ water to a final volume of 500 ml.

7.

α-amylase (Sigma; 10 mg/ml); add 50 mg α-amylase to 5 ml MQ water. Mix thoroughly, aliquot, and store at -20 °C. 8. DNase (Sigma; 2 mg/ml); add 10 mg DNase to 5 ml MQ water. Mix thoroughly, aliquot, and store at -20 °C. 9. RNase (Sigma; 10 mg/ml); add 50 mg RNase to 5 ml MQ water. Mix thoroughly, aliquot, and store at -20 °C. 10. Trypsin (3X crystallized from Worthington; 10 mg/ml); add 50 mg trypsin to 5 ml MQ water. Mix thoroughly, aliquot, and store at -20 °C.

Protocol:

Steps 1-9 for All Bacteria • 1. Grow 500 ml liquid culture until required growth phase. Alternatively collect cells from agar plates if unable to grow in liquid media.

• 2. Chill cells rapidly in an ice-ethanol bath for 10 min.

• 3. Centrifuge cells at an appropriate speed for 30 min at 4 °C.

• 4. Resuspend the pellet in 10 ml of ice-cold MQ water. It is recommended to use ultrapure endotoxin-free water when PG is intended for immunomodulatory assays (see protocol V).

• 5. Add the suspension dropwise to 10 ml of 8 % SDS preheated to 95 °C (final SDS concentration is 4 %) in a 50 ml Erlenmeyer flask.

• 6. Incubate at 95 °C (to avoid bubbling) with constant agitation, for 4 h.

• 7. Ultracentrifuge for 30 min and discard supernatant. All ultracentrifugations are performed at 150,000×g at room temperature (RT), unless otherwise specified, as SDS precipitates at low temperature.

• 8. Wash by resuspension in MQ water at RT and ultracentrifugation as in step 7 or in 1.5 ml microfuge tubes in a micro-ultracentrifuge.

• 9. Repeat step 8 until the supernatant is free of SDS (at least seven washes). Check for the presence of SDS as described in Protocol IV.

Protocol complete for Gram-negative bacteria with PG lacking covalently attached lipoproteins, for applications that do not require ultrapure PG. Lyophilize and weigh the pellet. Store at -20 °C.

Steps 10-12 for Mycobacteria and Other Actinobacteria Only. Otherwise Go to Step 13

• 10 To hydrolyze mycolic acids by saponification, resuspend the pellet in 1 ml 0.5 % KOH in methanol-diethyl ether (1:1).

• 11. Incubate at RT for 96 h with agitation.

• 12. Wash twice by resuspension with 1 ml 100 % methanol and ultracentrifugation.

Steps 13-16 for Gram-Positive Bacteria Only. Otherwise Go to Step 17

• 13. Resuspend the pellet in 0.5 ml MQ water and transfer to 2 ml screw cap tubes with an equal volume of ≤106 μm acid-washed glass beads. For large pellets, aliquot into several tubes.

• 14. Break the cells using a cell homogenizer (e.g., FastPrep-24, MP Biomedicals) according to manufacturer protocols. Confirm cell breakage by microscopy.

• 15. Separate the broken cells from glass beads by vacuum filtration through sintered glass (ASTM 40-60 C). Apply 15 ml of MQ water to the glass beads and filter again. Transfer cell suspension to ultracentrifuge tubes.

• 16. Ultracentrifuge for 30 min at RT and discard the supernatant.

Steps 17-22 for All Bacteria

• 17. Resuspend the pellet in 50 mM Tris pH 7.0 pre-warmed to 37 °C.

• 18. Add α-amylase (100 μg/ml final) and incubate overnight at 37 °C.

• 19. Add MgSO 4 (20 mM final), DNase (10 μg/ml) and RNase (50 μg/ml) and incubate at 37 °C for 2 h.

• 20. Add CaCl 2 (10 mM final) with trypsin (100 μg/ml final) and incubate overnight at 37 °C.

• 21. Add SDS to a final concentration of 1 %. Incubate the suspension at 95 °C for 15 min with constant agitation.

• 22. Ultracentrifuge for 30 min at RT and discard the supernatant.

Steps 23-24 for Gram-Negative Bacteria Only. Otherwise Go to Step 25

• 23. Wash by resuspension in MQ water and ultracentrifugation.

• 24. Repeat step 23 until the supernatant is free of SDS (at least seven washes). Check for the presence of SDS as described in Protocol IV.

Protocol complete for Gram-negative bacteria. Lyophilize and weigh the pellet. Store at -20 °C.

Steps 25-41 for All Bacteria Excluding Gram-Negative Bacteria

• 25. Wash once by resuspension in MQ water and ultracentrifugation. Discard the supernatant.

• 26. Resuspend the pellet in 10 ml of LiCl (8 M), pre-warmed to 37 °C. Incubate for 15 min at 37 °C with constant agitation.

• 27. Ultracentrifuge the suspension for 30 min. Discard the supernatant.

• 28. Resuspend the pellet in 10 ml of EDTA pH 8 (100 mM), pre-warmed to 37 °C. Incubate for 15 min at 37 °C with constant agitation.

• 29. Ultracentrifuge the suspension for 30 min. Discard the supernatant.

• 30. Wash twice by resuspension in MQ water and ultracentrifugation. Discard the supernatant.

• 31. In an acetone-resistant tube (e.g., polyallomer), add 10 ml of acetone to the pellet and sonicate for 15 min in an ultrasonic bath. The pellet should resuspend during sonication.

• 32. Ultracentrifuge the suspension for 30 min. Discard the supernatant.

• 33. Wash twice by resuspension in MQ water and ultracentrifugation. Discard the supernatant.

• 34. Lyophilize and weigh the pellet. NB: At this stage of the purification, the PG retains labile covalent modifications such as O-acetylated groups which may be desired for analysis.

• 35. Add 1 ml of HF per 2.5 mg of pellet in polypropylene/polyallomer tubes. NB: HF is extremely hazardous. Do not attempt to use without receiving specific training on handling, disposal, and decontamination. All solutions should be maintained at 4 °C to reduce vapor.

• 36. Incubate at 4 °C for 96 h with constant stirring.

• 37. Ultracentrifuge for 30 min in a micro-ultracentrifuge at 4 °C. Discard supernatant.

• 38. Wash twice by resuspension in MQ water and ultracentrifugation. Discard the supernatant.

• 39. Wash twice by resuspension in 50 mM Tris pH 7.0 and ultracentrifugation. Discard the supernatant.

• 40. Wash once by resuspension in MQ water and ultracentrifugation. Discard the supernatant.

• 41. Lyophilize and weigh the pellet.

Protocol Complete for Gram-Positive Bacteria, Mycobacteria and Other Actinobacteria. Store at -20 °C Protocol II: Peptidoglycan Digestion by Mutanolysin

Stock buffers, solutions, and enzymes:

• 1. Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553 (Sigma; 10 mg/ml); the precise quantity of mutanolysin purchased varies between batches and is indicated on the vial. Resuspend to a final concentration of 10 mg/ml in MQ water. Mix thoroughly, then aliquot into 50 μl volumes, and store at -20 °C.

• 2. 100 mM sodium phosphate buffer pH 5.6 stock; combine 7.9 ml 1 M Na 2 HPO 4 with 92.1 ml 1 M NaH 2 PO 4 and add MQ water to a total volume of 950 ml. Adjust the pH to 5.6 with orthophosphoric acid and bring the final volume to 1 L. Autoclave or filter sterilize.

• 3. 0.5 M sodium borate buffer pH 9; dissolve boric acid powder (15.46 g) in 400 ml MQ water. Adjust the pH to 9 with NaOH. Adjust the final volume to 500 ml with MQ water. In the case of PGs with O-acetyl groups, adjust it to pH 8.

Protocol:

• 1. Resuspend PG to the desired concentration in MQ water.

• 2. Resuspend 200-750 μg of PG in 190 μl 12.5 mM sodium phosphate buffer (pH 5.6) and 100 μg of mutanolysin.

• 3. Incubate at 37 °C for 16 h with agitation.

• 4. Boil the samples for 10 min to stop the reaction.

• 5. Centrifuge in a microfuge for 5 min at maximum speed and transfer the supernatant to a 2 ml tube.

• 6. To reduce sugar moieties, add an equal volume of 0.5 M sodium borate buffer (pH 9.0; in the case of PGs with O-acetyl groups, use a pH 8 instead). Add sodium borohydride (10 mg/ml final) and mix thoroughly. Be careful as the reaction is effervescent.

• 7. Incubate for 15 min at RT.

• 8. Stop the reaction by slowly adding orthophosphoric acid until the solution reaches pH 2 (check by spotting 0.5 μl of the reaction onto pH paper). Be careful as the reaction is effervescent.

• 9. Centrifuge with a microfuge for 5 min at maximum speed. Supernatants may be filtered using 4 mm Acrodisc syringe filters.

• 10. Transfer the supernatant to a conical bottom glass vial suitable for HPLC.

Protocol III: Muropeptide Analysis by Reversed-Phase HPLC

Stock Buffers, Solutions, and Enzymes

All buffers for HPLC must be degassed before use. Modern HPLC systems typically include an online degassing module. Check before use. • 2. Buffer B(G-) 75 mM NaH 2 PO 4 pH 4.9 with 15 % methanol; dissolve NaH 2 PO 4 monohydrate (20.7 g) in 1.5 L of HPLC super gradient grade water. Adjust pH to 4.9, and then add water to a final volume of 1.7 L. Add 300 ml of HPLC grade methanol and mix thoroughly. Filter using 0.2 μm PVDF filters.

• 3. Buffer A(G+) 10 mM NH 4 H 2 PO 4 pH 5.6; dissolve NH 4 H 2 PO 4 (2.3 g) in 1.8 L of HPLC super gradient grade water. Adjust pH to 5.6, and then add water to a final volume of 2 L. Filter and autoclave the solution.

• 4. Buffer B(G+) 10 mM NH 4 PO 4 pH 5.6 with 30 % methanol; dissolve NH 4 H 2 PO 4 (2.3 g) in 1.2 L of HPLC super gradient grade water. Adjust pH to 5.6, and then add water to a final volume of 1.4 L. Add 600 ml of HPLC grade methanol and mix thoroughly. Filter using 0.2 μm PVDF filters.

• 5. Buffer A(Ds) 0.05 % Trifluoroacetic acid (TFA); add 1 ml of TFA to 2 L of HPLC super gradient grade water.

• 6. Buffer B(Ds) 0.05 % TFA with 50 % acetonitrile; add 1 ml of TFA to 1l of HPLC super gradient grade water, and then mix with 1 L of HPLC grade acetonitrile.

Protocol:

• 1.
Set up an HPLC system such as the LC20 Shimadzu system, equipped with a Hypersil octyldecyl silane (C18) column (4.6 × 250 mm) at 52 °C, with a flow rate of 0.5 ml/min. Muropeptides are detected at a 206 nm wavelength using, for example, a Shimadzu SPD-20A-UV-Vis detector.

• 2. Wash the storage solution (typically 80 % methanol) from the column, and then equilibrate with at least five column volumes of the appropriate buffer B then buffer A.

• 3. The gradient conditions are as follows depending on the analysis:

Protocol IV: Verification of the Absence of SDS in PG Sample

According to [START_REF] Hayashi | A rapid determination of sodium dodecyl sulfate with methylene blue[END_REF]

Stock buffers, solutions, and enzymes:

• 1. 0.7 mM phosphate buffer pH 7.2; combine 19.6 ml of 10 mM NaH 2 PO 4 with 50.4 ml 10 mM Na 2 HPO 4 . Adjust to 1 L with MQ water and autoclave.

• 2. 100× Methylene blue stock; dissolve methylene blue in MQ water to 0.5 % (w/v). Combine 1 volume of chloroform with 20 volumes of 0.5 % methylene blue. Store in the dark.

Protocol:

• 1. Dilute 100× methylene blue stock 1:100 (v/v) in 0.7 mM phosphate buffer pH 7.2.

• 2. Take 500 μl of supernatant from PG washes and mix with 250 μl of the dilute methylene blue solution. Use MQ water instead of supernatant as a negative control.

• 3. Add 1.5 ml chloroform.

• 4. Vortex for 1 min and then allow to settle for 1 min.

• 5. The unwanted presence of SDS will be indicated by a blue lower phase. SDS-free supernatant should be pink/clear.

Protocol V: NF-κB Luciferase Assay of Muropeptide Recognition by Nod Proteins

In this assay, the human epithelial cell line HEK293T, which does not express Nod2 and only minimal amounts of human Nod1, is transfected with a NF-κB-luciferase reporter construct together with Nod1 or Nod2 and βgalactosidase-expressing vectors. Muropeptides that cannot enter the cells must be co-transfected in order to stimulate the cytosolic Nod proteins, which will activate the NF-κB promotor, resulting in luciferase expression. The activities of luciferase and β-galactosidase are measured from cellular lysates in the presence of their substrates, using a luminometer and ELISA reader, respectively. Results are expressed as relative light units, normalized to the β-galactosidase activity. Control muropeptides (MurTriDap as Nod1 agonist or MDP as Nod2 agonist) and digestion buffer should be added as positive and negative controls in each assay. Each sample should be tested in triplicate, and several concentrations should be tested. In each assay, a NF-κB-luciferase control should be conducted without co-transfection of a Nod vector. As a first control of proper purification, non-digested PG should be tested for lack of TLR2 recognition [START_REF] Travassos | Toll-like receptor 2-dependent bacterial sensing does not occur via peptidoglycan recognition[END_REF]).

Stock buffers, solutions, and enzymes:

• 1. Complete DMEM medium low glucose with 5 % fetal bovine serum.

• 2. Lysis buffer; 25 mM Tris-HCl pH 8, 8 mM MgCl 2 , 1 % Triton X-100, 15 % glycerol, and 1 mM DTT added extemporaneously. Keep at 4 °C.

• 3. Luciferin stock 1 mM; dissolve 10 mg of Luciferin potassium salt in 36 ml of potassium phosphate buffer (85 ml KH 2 PO 4 1M + 95 ml K 2 HPO 4 1M) pH 7.8 (keep frozen aliquots).

• 4. Luciferin buffer; lysis buffer with 1 mM DTT, 1 mM ATP, 2 μM Luciferin.

• 5. Z buffer; 0,06 M Na 2 HPO4, 0.04 M NaH 2 PO4, 10 mM KCL, 1 mM MgSO 4 , adjusted to pH 7.

• 6. ONPG buffer; ONPG 4 mg/ml in Z buffer (keep in the dark at 4 °C).

Protocol:

• 1. HEK293T cells are seeded the day before the transfection in 24-well plates at a density of around 10 5 cells in 1 ml of complete DMEM medium.

• 2. Thirty minutes before transfection, add per well the equivalent of 0.1-10 μl of the non-digested or digested PG of interest at 5 mg/ml (nonreduced and reduced as a control since the activity towards Nod2 will be lost upon reduction) as well as control muropeptides at 100 nM.

• 3. Transfect cells when they are 30-50 % confluent. Fugene or Jet PEI transfecting reagents are commonly used. All media should be warmed to RT before use. Allow DNA/transfecting reagent complexes to form at RT for 30 min. Add carefully to the cells, since the HEK293T cells are loosely adherent.

DNA mix: Prepare a mixture of DNA corresponding, per well, to 50 ng of 5X NF-κB luciferase reporter vector (Stratagene), 25 ng of pCMV-βGal plasmid (Invitrogen), 1 ng of pcDNA3-Nod1 or pcDNA3-Nod2 expression vectors, and 225 ng of pCDNA3 plasmid in 20 μl of endotoxin-free water.

For TLR2 test, instead of Nod1 or Nod2 expressing vector, add in the DNA mixture, a TLR2 expressing vector, and complete up to 300 ng of total DNA with pCDNA3. Use Pam3cysSK4 as a positive control of TLR2 activation. TLR and Nod vectors and ligands can be purchased from InvivoGen. Several trials may be required to adjust the quantities of TLR2 or NOD expressing vectors to get proper activation upon positive control stimulation. Lyse the cells by adding 100 μl of lysis buffer in each well. Incubate 5 min at RT.

• 8. Prepare two 96-well plates, one for the measure of luciferase activity with a luminometer and a second for ELISA plate reader. For each well, transfer 10 μl of the cell lysate to both plates.

• 9. For luminometer measurements: Inject 50 μl of luciferase buffer 2 s before reading.

• 10. For β-galactosidase assay: Add one volume of ONPG buffer to four volume of Z buffer. Add 100 μl to each well. Use 10 μl of lysis buffer as a negative control. Incubate at 37 °C for 30 min. Measure at a wavelength of 420 or 450 nM.

• 1 .

 1 Buffer A(G-) 50 mM NaH 2 PO 4 pH 4.3; dissolve NaH 2 PO 4 monohydrate (13.8 g) in 1.8 L of HPLC super gradient grade water. Adjust pH to 4.3, and then add water to a final volume of 2 L. Filter using mixed cellulose ester filters and autoclave the solution.

  (a) Gram-negative-type PG and Gram-positive meso-DAPNH 2 -type PG: Use a 0-100 % buffer B linear gradient over 160 min. Buffer A(G-): 50 mM NaH 2 PO 4 pH 4.3. Buffer B(G-): 75 mM NaH 2 PO 4 pH 4.9 with 15 % methanol. (b) Other Gram-positive-type PG: Use a 0-100 % buffer B linear gradient over 280 min. Buffer A(G+): 10 mM NH 4 PO 4 pH 5.6. Buffer B(G+): 10 mM NH 4 PO 4 pH 5.6 with 30 %. methanol (c) For desalting muropeptides (prior to mass spectrometry analysis): Use a 0-50 % buffer B linear gradient over 30 min. Buffer A(Ds): 0.05 % TFA. Buffer B(Ds): 0.05 % TFA with 50 % acetonitrile.

• 4 .

 4 Transfecting solution: Prepare a mixture of 1:100 (v/v) transfection reagent in DMEM without serum, corresponding to 100 μl per well.• 5. Formation of DNA complexes with transfecting reagent: Add the transfecting solution to the DNA mix. Do not vortex. Mix by inverting the tubes. Incubate at RT for 30 min.• 6. Carefully add 120 μl of DNA complexes onto the cells. Incubate 24 h.• 7.

FiguresFig. 1

 1 Figures

Fig. 2

 2 Fig. 1 Example of a muropeptide profile of PG from the Gram-negative bacterium Helicobacter pylori (Adapted from Viala et al. 2004)