Monsieur Le Professeur

Marian Petre

Madame Le Professeur

Je Souhaite Également Remercier Magalie

Christophe Cathy

Carlos Régulo

Llarena Hernández

Michèle L Largeteau

Anne-Marie Farnet

Nathalie Minvielle

Catherine Regnault-Roger

Jean-Michel Savoie

Carlos R Llarena Hernández

Nathalie Ferrer

Catherine Regnault- Roger

Régulo Carlos Llarena-Hernández
email: regulo-carlos.llarena-hernandez@inra.bordeaux.fr

Phenotypic variability in cultivars and wild strains of Agaricus brasiliensis and Agaricus subrufescens

Keywords: Mycelial growth, Compost colonization, Yield, Morphology Agaricus brasiliensis, Agaricus blazei, cultivar, wild strain, harvest

REMERCIEMENTS

Cette thèse n'appartient pas qu'à moi, puisque plusieurs personnes ont contribué directement ou indirectement à ce travail. Ces années passées en France furent parmi les meilleures de ma scolarité, en grande partie grâce à tous ceux qui m'ont accompagné au cours de ces trois dernières années.

C'est un plaisir de remercier les personnes qui généreusement ont partagé leur temps et leurs connaissances avec moi :

Je tiens en premier lieu à remercier vivement Madame Michèle Largeteau pour avoir accepté de co-diriger ce travail de recherche et s'être rendu disponible tout au long de ces trois années que ce soit pour un avis ou un conseil en matière de rédaction.

Je remercie également à Madame le Professeur Catherine Regnault-Roger, co-directrice de la thèse, pour ses conseils avisés sur le procès de ma formation comme docteur, et ses conseils en matière de rédaction.

Je tiens à remercier

Merci encore à Anne-Marie Farnet du laboratoire de Marseille, où j'ai été merveilleusement accueilli (sur le plan scientifique et social) lors de mon stage pendant un mois. Merci à tous, et tout particulièrement à Fred, Anne Seline. Je me réjouis que la collaboration engagée ait pu aboutir à une publication.

Je remercie toute l'équipe de MycSA pour m'avoir accueilli pendant plus de 3 ans. J'ai beaucoup appris et partagé d'excellents moments dans les couloirs et la salle de café. J'exprime toute ma reconnaissance à mes collègues du laboratoire qui sont déjà parti de MycSA, Aude, Laura, Laurie, Pilar, Sébastien, Adeline, Jawad, Aurélia, Guillaume et Yann, pour leur patience dans les leçons de français, pour les soirées, et surtout pour leur soutien comme amis.

Je souhaite également remercier tous les collègues avec qui j'ai pu interagir à MycSA, Ccori, Mathilde, Enric, Lea, Bettina, Marie Victoire, Manuella et Banafshe, pour leurs amitié, pour leurs aides, leurs sourires et pour l'agréable ambiance de travail.

A Linda, ma mycologue favorite, pour ton aide précieuse dans le domaine taxonomique, et les conversations rigolotes autour de la science. Et parce qu'avec toi le séjour en Thaïlande a été beaucoup plus agréable.

Finalement, la réalisation de ce travail a été possible grâce au financement d'une bourse par le Conseil National de Science et Technologie (CONACyT-Mexique) que je remercie.

Biologie, caractérisation chimique et activités antioxydantes du champignon comestible et médicinal Agaricus subrufescens

RESUME

Récemment, Agaricus subrufescens est devenu un champignon d'intérêt de par ses propriétés médicinales. Sa production commerciale s'est développée dans des pays tropicaux à partir de matériaux locaux. Cependant, les données disponibles dans la littérature ne concernent que des cultivars qui sont génétiquement similaires. Notre étude sur un ensemble de cultivars et de souches sauvages a conduit à une meilleure connaissance de la biologie de l'espèce.

Biology, chemical characterization and antioxidant activities of the culinary medicinal mushroom Agaricus subrufescens

SUMMARY

Agaricus subrufescens is becoming a mushroom of interest because of its medicinal properties. Commercial production had developed in tropical countries using local materials.

However, data available in the literature referred to cultivars that are genetically similar. Our study of a set of cultivars and wild strains led to a better understanding of the biology of the species. Contrary to cultivars, wild strains exhibited a high level of genetic polymorphism.

High phenotypic variability was identified in mycelial growth, productivity and morphology.

Chemical analyses by solid-state 13 C NMR and antioxidant activities showed that the wild strains as well as the cultivars proved a valuable source of functional food to prevent cardiovascular diseases, cancers and diabetes. Using cultivation substrate produced for A. bisporus and modifying cultivation conditions allowed fruiting of A. subrufescens, then increase in strain yield and optimization of agronomic traits of interest. Wild material with good antioxidant activity and high productivity was identified. The evaluation of intercontinental hybrids showed the possibility to transfer traits of interest to offspring. A. subrufescens could be proposed to French mushroom growers as an alternative to Agaricus bisporus during the summer season.

Keywords: Antioxidant, biodiversity, cultivation, quality.

SOMMAIRE

Introduction

Le nombre d'espèces de champignons estimé actuellement sur la planète est de 150 000, dont, seulement 10% environ sont connus au niveau scientifique [START_REF] Hawksworth | Mushrooms: the extent of the unexplored potential[END_REF]. Plus de 3000 champignons sont définis comme des espèces comestibles majeures (prime edible species), parmi lesquels une centaine seulement sont, ou ont été, cultivés commercialement, et une dizaine parmi les 100 le sont à l'échelle industrielle. La production mondiale de champignons comestibles cultivés était de 24 000 milliers de tonnes en 2009 [START_REF] Chang | The role of culinary-medicinal mushrooms on human welfare with a pyramid model for human health[END_REF] et elle est en constante augmentation depuis une vingtaine d'années.

La première raison de l'accroissement de la consommation est une combinaison de leur valeur comme aliment et de leurs propriétés médicinales ainsi que leur utilisation comme neutraceutiques (suppléments alimentaires). Le marché mondial était d'environ 36 000 milliards de dollars en 2006, dont 16 000 milliards pour les champignons médicinaux [START_REF] Chang | The role of culinary-medicinal mushrooms on human welfare with a pyramid model for human health[END_REF].

Les projets d'amélioration des champignons s'adressent d'abord aux demandes des producteurs, pour lesquels des critères comme le rendement, la conservation après récolte et la résistance aux maladies sont parmi les plus importants. Cependant, les consommateurs et l'industrie alimentaire ont des intérêts différents tels que la qualité des traitements en cours de culture et post récolte, le goût, la valeur nutritionnelle, et la teneur en composés bioactifs. Ce dernier critère prend de l'importance ces dernières années.

Selon la littérature, les champignons médicinaux possèdent des propriétés antioxydantes, de piégeage de radicaux libres et de détoxification, et de nombreux effets thérapeutiques tels que des activités anti-tumorales, antivirales, antibactériennes, antiparasitaires, antifongiques, antidiabétiques, anti-hypercholestérolémie, hépatoprotectrices, stimulatrices du système immunitaire, protectrices du système cardiovasculaire [START_REF] Didukh | Medicinal value of species of the family Agaricaceae Cohn (higher Basidimycetes) current stage of knowledge and future perspectives[END_REF][START_REF] Gao | Cancer prevention and treatment by Ganoderma, a mushroom with medicinal properties[END_REF][START_REF] Sullivan | Medicinal mushrooms and cancer therapytranslating a traditional practice into Western medicine[END_REF][START_REF] Wasser | Therapeutic effects of substances occurring in higher basidiomycetes mushrooms: A modern perspective[END_REF][START_REF] Wasser | Medicinal Mushroom science: History, current status, future trends, and unsolved problems[END_REF][START_REF] Zhang | Antitumor polysaccharides from mushrooms: a review on their isolation process, structural characteristics and antitumor activity[END_REF].

Plusieurs espèces de champignons sont connues pour leur intérêt thérapeutique. La majorité des champignons médicinaux appartiennent à des espèces non comestibles, et un grand nombre d'entre eux montrent un gout amer et piquant, spécialement ceux qui appartiennent aux Polyporaceae, qui sont utilisés comme médicament en Chine depuis les temps ancestraux. Des espèces non comestibles à potentiel médical, tel que Ganoderma lucidum, Trametes versicolor et Inonotus obliquus, sont très piquantes et/ou peu digestes. Ces champignons sont utilisés sous forme d'extrait, d'infusion ou de poudre. Ceux qui sont de bons comestibles portent le nom de 'champignons culinaires médicinaux' (culinary-medicinal mushrooms) (Reis et al., 2011).

Le genre Agaricus est composé d'espèces très connues, récoltées ou cultivées, dont l'intérêt n'est pas seulement alimentaire. Agaricus sylvaticus [START_REF] Percario | Antioxidant activity of edible blushing wood mushroom, Agaricus sylvaticus Schaeff. (Agaricomycetideae) in vitro[END_REF],

Agaricus bisporus, et surtout Agaricus subrufescens (Kozarski et al., 2011 ;[START_REF] Wasser | Therapeutic effects of substances occurring in higher basidiomycetes mushrooms: A modern perspective[END_REF][START_REF] Chang | The role of culinary-medicinal mushrooms on human welfare with a pyramid model for human health[END_REF] font partie des champignons culinaires médicinaux.

Cependant, la biodiversité à l'intérieur du genre est peu connue, que ce soit au niveau inter spécifique ou intra spécifique.

Agaricus subrufescens est un nouveau champignon cultivé, développé surtout en conditions tropicales, ce qui peut représenter une opportunité pour les producteurs d'Agaricus bisporus dans les régions tempérées pendant la saison chaude. Toutefois, sa culture est souvent artisanale et demande encore à être améliorée. La connaissance de la biodiversité à l'intérieur de l'espèce est nécessaire pour une amélioration des caractères agronomiques et de la qualité comme aliment fonctionnel.

Dans ce contexte notre objectif est d'une part cognitif, contribuer à la connaissance de la biologie d'A. subrufescens avec un atout, une collection renfermant des souches d'origines sauvages, et d'autre part à but appliqué, l'adaptation de la culture en régions tempérées.

Après une revue de l'état de l'art, nous indiquerons les axes de notre étude, les résultats acquis en discutant leurs limites avant de poser les perspectives pour mieux valoriser les souches identifiées comme ayant le meilleur potentiel agronomique et neutraceutique.

Chapitre 1. Revue bibliographique

Agaricus subrufescens a fait l'objet de nombreuses publications dans les 10 dernières années à cause de ses qualités thérapeutiques et médicinales. Ces publications sont ciblées sur l'identification de molécules d'intérêt, sur ses propriétés comme aliment fonctionnel et sur les procédés de production soit du mycélium, soit des sporophores (culture). Un état de l'art concernant les cultivars est donné dans l'article 1 (page 31). Les données bibliographiques se rapportant à des souches sauvages ainsi que les apports plus récents sur les cultivars et des renseignements complémentaires sont présentés dans ce chapitre.

Agaricus subrufescens

Positionnement taxonomique, description et cycle de vie

Le champignon a été décrit pour la première fois par C.H. Peck en 1982 aux Etats Unis où il était cultivé aux XIX ème et XX ème siècles (Kerrigan, 2005). Il est connu dans la littérature tout d'abord sous le nom d'Agaricus blazei Murrill (sensus Heinemann). Ces dernières années, plusieurs articles ont montré que ce nom était incorrect et deux noms ont été proposés, Agaricus subrufescens Peck (Kerrigan, 2005) et Agaricus brasiliensis Wasser et al. [START_REF] Wasser | Is a widely cultivated culinary-medicinal Royal Sun Agaricus (the Himematsutake mushroom) indeed Agaricus blazei Murrill[END_REF]. Récemment, Wisitrassameewong et al. (2012b) Le champignon pousse de manière naturelle au Brésil [START_REF] Iwade | Cultivation of kawariharatake (Agaricus blazei Murill)[END_REF] comme saprophyte. D'après plusieurs articles, il a été découvert dans la ville brésilienne de Piedade, dans l'Etat brésilien de São Paulo, en 1960 par un producteur et chercheur nommé Furumoto, qui l'a envoyé au Japon en 1965 pour la recherche et l'identification de substances possédant une activité anti tumorale (Mizuno, 1995). Ce champignon a été identifié comme

Agaricus blazei Murrill par un scientifique belge, le Dr Heinemann, en 1967(Mizuno, 1995) et a reçu le nom commun de Himematsutake au Japon, tandis qu'au Brésil il a été nommé le « champignon Piedade » du nom de la ville où il a été découvert. Plus tard, il est connu sous le nom de champignon médicinal, ou champignon du soleil ® (Cogumelo do Sol ® en portugais)

au Brésil, et Royal Sun Agaricus ® dans d'autres pays. Après la mort de M. Furumoto, la culture d'A. blazei a été abandonnée et c'est seulement en 1990 qu'elle a été relancée à la suite de l'intérêt d'industriels japonais qui ont renvoyé au Brésil des souches d'A. blazei du Japon où elles avaient été utilisées dans des études sur l'activité antitumorale [START_REF] Fujimiya | Selective tumoricidal effect of soluble proteoglucan extracted from the basidiomycete Agaricus blazei Murill, mediated via natural killer cell activation and apoptosis[END_REF][START_REF] Fujimiya | Peroral effect on tumor progression of soluble beta-(1, 6)-glucans prepared by acid treatment from Agaricus blazei Murr. (Agaricaceae, higher Basidiomycetes)[END_REF][START_REF] Itoh | Blazein of a new steroid isolated from Agaricus blazei Murrill (himematsutake) induces cell death and morphological change indicative of apoptotic chromatin condensation in human lung cancer LU99 and stomach cancer KATO III cells[END_REF]Kawagishi et al., 1989a ;[START_REF] Kawagishi | Cyto-toxic steroids from the mushroom Agaricus-blazei[END_REF][START_REF] Osaki | Antimutagenic and bactericidal substances in the fruit body of a basidiomycete Agaricus blazei[END_REF].

Plusieurs descriptions qui font référence au champignon cultivé mentionnent un chapeau de couleur brun doré (Figure 1.1), de 7 à 9 cm de diamètre, un pied blanc « comme la neige », souvent élargi à la base, des lamelles (matures) brun chocolat foncé et des basidiospores brun chocolat (5x4 µm). La longueur du pied et le diamètre du chapeau sont à peu près égaux (type campestroïde) [START_REF] Wasser | Is a widely cultivated culinary-medicinal Royal Sun Agaricus (the Himematsutake mushroom) indeed Agaricus blazei Murrill[END_REF]Firenzuoli et al., 2008 ;Pokhrel et Ohga, 2007). D'après d'autres auteurs, la morphologie du champignon est assez variable. La forme du chapeau varie de cubique à largement convexe. Le voile est élastique et reste généralement attaché à la marge du chapeau lors de l'expansion, tandis que la couche inférieure se décompose en un grand nombre de petits flocons cotonneux, ce qui constitue une caractéristique assez constante de l'espèce (Figure 1.2).

Malgré l'importance économique du champignon, son cycle de vie n'est pas bien connu. Le mycélium fertile de quatre cultivars brésiliens montre de rares anses d'anastomose, et une grande variabilité a été observée dans le diamètre et la longueur des hyphes [START_REF] Dias | Cytological studies of Agaricus brasiliensis[END_REF]. La taille hétérogène des spores pourrait s'expliquer par la présence d'un nombre variable de basides bi-, tri-et tetra-sporées chez des spécimens sauvages et cultivés d'A. subrufescens, qui est considéré comme une espèce amphithallique [START_REF] Heinemann | Agarici Austroamericani VIII. Agariceae des régions intertropicales d'Amérique du Sud[END_REF]Kerrigan, 2005). Un hybride a été obtenu entre une souche développée à partir du matériel génétique du Brésil et un isolat de Californie (Kerrigan, 2005) [START_REF] Callac | El genero Agaricus. In "Cultivo, Mercadotecnia e inocuidad Alimenticia de Agaricus bisporus[END_REF][START_REF] Callac | Evidence for outcrossing via the Buller phenomenon in a substrate simultaneously inoculated with spores and mycelium of Agaricus bisporus[END_REF].

Habitat et répartition géographique

Agaricus subrufescens est un champignon décomposeur de litières, qui pousse naturellement bien dans les sols riches en débris lignicoles, dans les bois mixtes, en bordure de forêts et dans les pâturages riches en débris et bois en décomposition mélangés avec du fumier animal (Firenzuoli et al., 2008 ;Pokhrel et Ohga, 2007 ;Horm et Ohga, 2008). Il est souvent présent dans les habitats domestiqués ou semi perturbés, y compris des tas de feuilles (Kerrigan, 2005). Il pousse naturellement dans les régions montagneuses de la forêt tropicale atlantique dans le sud de l'état de São Paulo, au Brésil. La littérature signale d'autres zones de production que le Brésil. Il est présent aux Etats-Unis, de la Floride à la Californie du Sud [START_REF] Colauto | Genetic characterization of isolates of the basidiomycete Agaricus blazei by RAPD[END_REF][START_REF] Fukuda | Genetic variation in cultivated strains of Agaricus blazei[END_REF]. Il a été trouvé à l'état sauvage en Israël, à Taïwan et Hawaï (Kerrigan, 2005). En se basant sur des caractères morphologiques, [START_REF] Sabir | Studies on taxonomy of fleshly fungi ( Agaricus spp.) of Changa Manga forest[END_REF] ont rapporté une collecte d'A. subrufescens dans les forêts de Changa Manga, au Pakistan, pendant les mois de mousson. [START_REF] Rishikesh | Some wild edible mushrooms of Siang valley: Arunachal Pradesh[END_REF] a trouvé le champignon associé à des arbres forestiers dans la vallée de Siang, Arunachal Pradesh, en Inde. En Thaïlande,

A. subrufescens pousse dans les forêts avec Bambuseae sp., Dipterocarpus sp. et Samanea saman (Wisitrassameewong et al., 2012a). Des champignons récoltés sur des tas de feuilles de bambou près de la ville de Bihu, dans la province de Zhejiang, en Chine, ont été identifiés comme étant A. subrufescens sur des bases morphologiques et la séquence ITS [START_REF] Song | Identification of an Agaricus subrufescens strain from Zhejiang Province, China[END_REF]. Le champignon se développe aussi dans les régions tempérées. Il est signalé la première fois en Espagne par Arrillaga et Para (2006). Il a été trouvé dans la forêt de Bercuit, dans le Braban wallon, en Belgique, sur un tas de feuilles, à côté de Coprinus lagopus, Agrocybe rivulosa et Volvariella gloiocephala [START_REF] Ghyselinck | Contribution à la connaissance des champignons du Brabant wallon[END_REF], et en France, sur un compost d'herbes, dans une clairière (Guinberteau, comm. pers.). Dû à sa capacité à produire des fructifications à une température autour de 26 °C, A. subrufescens est considéré comme un Agaricus tropical ayant migré vers les zones tempérées [START_REF] Zhao | Major clades in tropical Agaricus[END_REF]. Jusqu'à présent, très peu de mycologues ont prospecté pour ce champignon, aussi, sa répartition géographique est probablement plus étendue.

Zones de production commerciale et marché

La culture des champignons comestibles médicinaux est devenue une alternative économique intéressante au cours des dernières années, principalement en raison de l'augmentation de la demande et de leur valeur sur le marché. La caractéristique de la culture d'A. subrufescens est de valoriser des déchets agricoles et agro-industriels locaux dans des petites entreprises familiales [START_REF] Guzman | El Cultivo de los Hongos Comestibles con especial atención a especies tropicales y subtropicales en esquilmos y residuos agro-industriales[END_REF]. Les zones de production commerciales tonnes de champignons déshydratés [START_REF] Tomizawa | Genetic variability of mushroom isolates Agaricus blazei using markers rapd[END_REF]. Ces études montrent que les conditions diffèrent (composition du milieu de culture, temps d'incubation) pour la production de biomasse et celle de neutraceutiques ou de substances à effet médicinal [START_REF] Fan | Effect of nutritional and environmental conditions on the production of exo-polysaccharide of Agaricus brasiliensis by submerged fermentation and its antitumor activity[END_REF][START_REF] Gao | Optimization of polysaccharide and ergosterol production from Agaricus brasiliensis by fermentation process[END_REF].

Les conditions de stockage de ce champignon et les problèmes liés à sa conservation à basses températures sont présentés brièvement dans l'article 1. En effet, A. subrufescens est la seule espèces dans le genre Agaricus qui est connue pour ne pas supporter une longue conservation à 4 °C ou à des températures inférieures (Kerrigan, 2005 ;[START_REF] Wasser | Is a widely cultivated culinary-medicinal Royal Sun Agaricus (the Himematsutake mushroom) indeed Agaricus blazei Murrill[END_REF].

Dans le cas d'A. bisporus, il est possible de conserver à long terme, dans l'azote liquide (-196 °C), du mycélium développé sur des grains de seigle traités avec du diméthylsulfoxyde (DMSO) sans perte des caractéristiques agronomiques (San [START_REF] Antonio | Liquid nitrogen preservation of Agaricus bisporus (Lange) Sing. spawn stocks[END_REF] Par ailleurs, un système de conservation utilisant du riz colonisé par du mycélium dans de l'eau à température ambiante avec un taux de 100% de viabilité des souches après un an de stockage a été proposé par [START_REF] Maia | Low-cost and low maintenance preservation of Agaricus brasiliensis cultures[END_REF].

Mode de culture d'A. subrufescens

Que ce soit pour la production de champignons frais destinés à l'alimentation ou pour celle de champignons séchés utilisés pour l'obtention de poudre (production de neutraceutiques), la culture d'A. subrufescens est effectuée en milieu solide.

La culture commerciale des champignons comestibles peut s'effectuer sur une large gamme de déchets agro-industriels : sciure de bois, papier, paille de céréales, bagasse de canne à sucre, pulpe de café, feuilles de bananier, déchets d'agave, pulpe de soja [START_REF] Miranda-Gern | Cultivation of Agaricus blazei on Pleurotus spp. spent substrate[END_REF][START_REF] Salmones | Comparative culturing of Pleurotus spp. on coffee pulp and wheat straw: biomass production and substrate biodegradation[END_REF], fumiers de bovins, d'équidés, de volailles, de porcs et d'autres animaux domestiques, pailles de blé ou de riz, coton, bois [START_REF] Chang | A new look at cultivated mushrooms[END_REF].

Le choix du substrat est généralement déterminé par la disponibilité régionale en matériaux de base.

En général au Brésil, les techniques et les paramètres spécifiques à la culture d'A. subrufescens sont définis empiriquement sur la base de la culture d'A. bisporus (Eira, 2003 ;[START_REF] Mantovani | Effect of the addition of nitrogen sources to cassava fiber and carbon-to-nitrogen ratios on Agaricus brasiliensis growth[END_REF]. Cependant, en raison des différences écologiques entre les pays d'origine de ces deux espèces, il est encore nécessaire de développer une technologie propre pour la culture d'A. subrufescens puisque son rendement est toujours très faible comparé à celui d'A. bisporus [START_REF] Siqueira | Cultivation of Agaricus blazei Murrill ss. Heinemann using different soils as source of casing materials[END_REF]. Par exemple, le rendement d'A. subrufescens au Brésil est autour de 3 à 25% du substrat humide (3 à 25 kg/100 kg) selon le système de culture (Eira, 2003).

Il existe peu de travaux sur la culture d'A. subrufescens à grande échelle.

Actuellement, le mode de culture se développe encore (Zied et Minhoni, 2009). La culture est basée sur celle d'A. bisporus (Eira, 2003 ;[START_REF] Minhoni | Cultivo de Agaricus blazei Murril ss[END_REF] en ce qui concerne la composition du substrat, sa préparation (par compostage) comportant une phase finale de conditionnement appelée pasteurisation, et les différentes étapes du processus (inoculation, incubation, ajout de la terre de couverture permettant la fructification) (Figure 1.1), sauf la température de fructification qui doit se situer entre 20 et 30 °C pour A. subrufescens (Almeida Amazonas et [START_REF] Almeida Amazonas | Brazilian mushroom Agaricus brasiliensis: science, health and knowledge[END_REF] tandis qu'A. bisporus fructifie autour de 17 °C [START_REF] Dias | Truths and myths about the mushroom Agaricus blazei[END_REF]. La culture de ce champignon dans différents pays, à partir de substrats et de mélanges de gobetage locaux est décrite dans le paragraphe 'Mushroom cultivation' de l'article 1.

D'autre part, la littérature montre beaucoup de différences dans l'estimation du rapport C/N à obtenir lors de la préparation du substrat de culture. Le rapport C/N initial du compost est important, mais aussi la source d'azote qui agit significativement sur la production d'A. subrufescens [START_REF] Minhoni | Cultivo de Agaricus blazei Murril ss[END_REF].Tandis que [START_REF] Zaghi | Carbon-to-nitrogen ratios for Agaricus brasiliensis on the axenic method[END_REF] [START_REF] Almeida Amazonas | Brazilian mushroom Agaricus brasiliensis: science, health and knowledge[END_REF][START_REF] Siqueira | Biological efficiency of Agaricus brasiliensis cultivated in compost with nitrogen concentrations[END_REF][START_REF] Minhoni | Cultivo de Agaricus blazei Murril ss[END_REF]. Par comparaison avec les composts qui sont utilisés couramment par les producteurs brésiliens (C/N de 25-30/1 et N s /Nu de 1/1,5), les composts avec un C/N plus élevé et un N s /Nu de 1,5/1 ont tendance à être plus productifs (Kopytowski Filho et Minhoni, 2004). Ceci peut s'expliquer par le fait que l'urée est plus rapidement transformée en azote assimilable et ammoniac par les microorganismes du substrat, entrainant une perte d'azote importante pendant le compostage, tandis que l'azote apporté par le soja reste disponible pour le champignon. Récemment, [START_REF] Siqueira | Biological efficiency of Agaricus brasiliensis cultivated in compost with nitrogen concentrations[END_REF] ont signalé qu'une teneur initiale en azote de 1% à 1,5% doit être utilisée pour optimiser le substrat destiné à la production d'A.

subrufescens.

Les travaux menés sur la culture d'A. bisporus ont montré que la microflore présente dans le substrat influence grandement le développement mycélien du champignon cultivé. La phase II du compostage (pasteurisation) favorise le développement de germes thermophiles conduisant à un compost sélectif pour A. bisporus [START_REF] Ross | The significance of thermophilic fungi in mushroom compost preparation[END_REF][START_REF] Sharma | Mushroom (Agaricus bisporus) compost quality factors for predicting potential yield of fruiting bodies[END_REF]. Une analyse microbiologique d'un compost développé à partir de matériaux comme certains résidus de la canne à sucre a montré une quantité importante de microorganismes thermophiles présents dans le compost pour A. bisporus, mais aussi la présence de pathogènes comme Enterobacter agglomerans, Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae [START_REF] Ferreira-Silva | Microbial diversity in a bagasse-based compost prepared for the production of Agaricus brasiliensis[END_REF]. [START_REF] Bilay | Influence of thermophilic fungi Humicola insolens on the growth of Agaricus brasiliensis (A. blazei). Mushroom biology and mushroom products[END_REF] Bien que les pertes de récoltes varient en fonction de la sensibilité des souches de champignon et de l'agressivité de P. tolaasii, la maladie pose un sérieux problème dans les cultures commerciales d'A. bisporus mais aussi de Pleurotus ostreatus [START_REF] Nguyen | Characterization of bacteriophage Pto-bp6g, a novel phage that lyses Pseudomonas tolaasii causing brown blotch disease in mushrooms[END_REF].

La bactérie peut être présente sous forme pathogène produisant une toxine (la tolaasine) et non pathogène ne produisant pas de toxine [START_REF] Olivier | Study of a bacterial disease of mushroom caps[END_REF]. La forme pathogène peut être mise en évidence par confrontation de la bactérie avec Pseudomonas reactans sur milieu B de King (Figure 1.4). Une réaction se produit entre un composé synthétisé par P. reactans, le WLIP (White Line Inducible Principle), et la tolaasine, ce qui génère une ligne blanche entre les deux colonies [START_REF] Goor | Phenotypic and genotypic diversity of Pseudomonas tolaasii and white line reacting organisms isolated from cultivated mushroom[END_REF].

P. tolaasii provoque des taches brunes sur les sporophores d'A. bisporus (Rainey et al., 1992) entraînant des pertes en culture pouvant atteindre 40%. La bactérie est responsable de taches jaunes chez P. ostreatus (Figure 1.5).

P. tolaasii (tolaasine) Pseudomomas reactans

Ligne blanche 1.1.7.2. La moisissure verte due à Trichoderma Les moisissures sont des compétiteurs plus efficaces que les champignons cultivés pour utiliser les nutriments du substrat et le coloniser. Elles peuvent produire des métabolites secondaires toxiques, des enzymes extracellulaires, ainsi que divers composés organiques volatiles qui peuvent réduire considérablement ou même bloquer entièrement la production commerciale [START_REF] Hatvani | The first report on mushroom green mould disease in Croatia[END_REF]. La moisissure verte, causée par différentes espèces de Trichoderma spp., est un grave problème pour les producteurs de champignons à travers le monde. Chez P. ostreatus, la moisissure verte est causée par Trichoderma pleurotum et T. pleuroticola [START_REF] Gea | First report of Trichoderma pleurotum on oyster mushroom crops in Spain[END_REF][START_REF] Hatvani | The first report on mushroom green mould disease in Croatia[END_REF]. Par contre, chez A. bisporus, les plus grosses pertes sont dues à Trichoderma aggressivum f. europaeum (anciennement Th2) et T. aggressivum f. aggressivum (Th4) respectivement responsables de la maladie en Europe et en Amérique du Nord (Figure 1.6 ;[START_REF] Ospina-Giraldo | Phylogenetic relationships of Trichoderma harzianum causing mushroom green mold in Europe and North America to other species of Trichoderma from world-wide sources[END_REF]Mamoun et al., 2000 ;[START_REF] Samuels | Trichoderma species associated with the green mold epidemic of commercially grown Agaricus bisporus[END_REF]. Ces dernières années, des pertes considérables dans les champignonnières d'Europe Centrale ont été causées par T. aggressivum f. europaeum [START_REF] Hatvani | Green mold diseases of Agaricus and Pleurotus spp. are caused by related but phylogenetically different Trichoderma species[END_REF]. Cette moisissure se développe essentiellement pendant l'incubation des cultures d'A. bisporus. Elle entre en compétition avec l'Agaric pour l'utilisation des nutriments et colonise le compost. Les zones de compost contaminées deviennent rapidement vertes du fait de la sporulation de T. aggressivum (Figure 1.7 ;[START_REF] Rinker | Trichoderma disease: progress toward solutions[END_REF][START_REF] Largeteau-Mamoun | Green mold disease: Adaptation of Trichoderma harzianum Th2 to mushroom compost[END_REF]. Aucun sporophore ne pousse dans la zone contaminée, et ceux situés à la périphérie peuvent être recouverts par la moisissure.

Récemment, Andrade et al. (2011) ont inoculé des isolats de Trichoderma sp. dans deux types de compost pendant les premiers jours après le lardage. Ils ont observé un effet négatif sur le rendement d'A. subrufescens en présence de cet antagoniste. -glucane contenu dans la paroi cellulaire d'A. subrufescens -1,3-glucanase chez l'agent de lutte biologique Trichoderma harzianum [START_REF] Carneiro | Agaricus blazei as a substrate for the production of beta-1,3-glucanase by Trichoderma harzianum Rifai[END_REF].

Des applications concernent l'industrie des cosmétiques. Agaricus subrufescens figure parmi les espèces utilisées actuellement ou bientôt autorisées pour la fabrication de cosmétiques à action neutraceutique, comme du shampoing maintenant la vitalité du cheveu, des crèmes pour la lutte contre le vieillissement de la peau et sa revitalisation [START_REF] Hyde | Fungi-an unusual source for cosmetics[END_REF].

Les champignons médicinaux 1.2.1. Propriétés médicinales

Les champignons sont consommés depuis fort longtemps pour leur qualité nutritiveils sont pauvres en lipides, sans cholestérol et constituent une excellente source de protéinesmais certains le sont aussi pour leurs propriétés médicinales. Depuis plus de 2000 ans, les champignons médicinaux sont utilisés en Chine comme suppléments alimentaires ou médicaments [START_REF] Chang | A 40-year journey through bioconversion of lignocellulosic wastes to mushrooms and dietary supplements[END_REF]. Depuis plusieurs années il y a un intérêt industriel accru pour des composés, nommés par [START_REF] Chang | Mushroom nutriceuticals[END_REF] 'neutraceutiques fongiques', qui peuvent être extraits du mycélium ou du sporophore de ces champignons.

Les molécules avec des propriétés antitumorales pour l'homme les plus abondantes chez les champignons sauvages sont les sesquiterpènes, tri-terpenoides, glucanes et glycoprotéines (Ferreira et al., 2009a). Certains des composés les plus efficaces dans les champignons sont les (1,3) (1,6)--glucanes qui ont été signalés comme inhibiteurs de la croissance tumorale par stimulation du système immunitaire par l'activation des macrophages, par la voie de balance des populations de cellules T helper et des effets ultérieures sur des cellules tueuses naturelles (NK), et aussi par la production de cytokines [START_REF] Hetland | The mushroom Agaricus blazei Murill elicits medicinal effects on tumor, infection, allergy, and inflammation through its modulation of innate immunity and amelioration of TH1/TH2 imbalance and inflammation[END_REF].

D'autres travaux ont mis en évidence le rôle des polysaccharides avec des sucres --glucanes. [START_REF] Borchers | The immunobiology of mushrooms[END_REF]. Ces polysaccharides de champignons, à effet stimulateur du system immunitaire, commencent à être évalués comme composés adjuvants de traitement du cancer aux côtés de traitements conventionnels [START_REF] Standish | Trametes versicolor mushroom immune therapy in breast cancer[END_REF] [START_REF] Wasser | Therapeutic effects of substances occurring in higher basidiomycetes mushrooms: A modern perspective[END_REF].

Propriétés antitumorales et antidiabétiques d'Agaricus subrufescens

Agaricus subrufescens a été utilisé comme champignon médicinal depuis longtemps. [START_REF] Kawagishi | Fractionation and antitumor activity of the water-insoluble residue of Agaricus blazei fruiting bodies[END_REF] a été le premier à séparer un composé actif contre le cancer à partir de sporophores. Depuis ce temps, de nombreux travaux ont été réalisés sur les propriétés médicinales du champignon. Plusieurs revues ont fait une large révision sur ce sujet et montrent une activité antitumorale d'A. subrufescens (Wasser, 2002[START_REF] Wasser | Medicinal Mushroom science: History, current status, future trends, and unsolved problems[END_REF]Firenzuoli et al. 2008 ;Oliveira Lima et al., 2011 ;[START_REF] Ramberg | Immunomodulatory dietary polysaccharides: a systematic review of the literature[END_REF].

Les extraits d'A. subrufescens peuvent être cytotoxiques pour les cellules tumorales in vitro et inhiber la croissance de cellules leucémiques par induction de l'apoptose [START_REF] Jin | Bcl-2 and caspase-3 are major regulators in Agaricus blazei induced human leukemic U937 cell apoptosis through dephoshorylation of Akt[END_REF], laquelle inhibe directement la croissance in vitro de cellules tumorales [START_REF] Kim | Comparison of free amino acid, carbohydrates concentrations in Korean edible and medicinal mushrooms[END_REF] et al., 1994 ;Kawagishi et al., 1989b). Les polysaccharides des champignons sont connus comme préventifs de l'oncogenèse. Ils ont montré une activité antitumorale indirecte contre plusieurs types de tumeurs et préventive contre les métastases tumorales [START_REF] Kimura | Isolation of an antiangiogenic substance from Agaricus blazei Murill: Its antitumor and antimetastatic actions[END_REF]. La fraction majeure polysaccharidique des extraits d'A. subrufescens correspond aux -glucanes [START_REF] Ohno | Antitumor beta glucan from the cultured fruit body of Agaricus blazei[END_REF][START_REF] Peter-Valence | Chemical characterization of the biomass of an edible medicinal mushroom, Agaricus subrufescens, via Solid-State 13 C NMR[END_REF] crédités de la plupart des activités antitumorales et des effets antimutagènes en partie en raison de leurs propriétés antioxydantes [START_REF] Camelini | Structural characterization of beta-glucans of Agaricus brasiliensis in different stages of fruiting body maturity and their use in nutraceutical products[END_REF]Firenzuoli et al., 2008 ;Mizuno, 1995 ;Oliveira Lima et al., 2011)

Le stress oxydant

La littérature fournit de nombreux travaux sur les propriétés antioxydantes d'extraits de plusieurs champignons sauvages (comestibles ou non) et cultivés (Barros et al., 2008 ;[START_REF] Choi | Effect of Pleurotus ferulae extracts on viability of human lung cancer and cervical cancer cell lines[END_REF][START_REF] Dubost | Quantification of polyphenols and ergothioneine in cultivated mushrooms and correlation to total antioxidant capacity[END_REF]Huang et Mau, 2006 ;Jayakumar et al., 2011 ;[START_REF] Lee | New antioxidant polyphenols from the medicinal mushroom Inonotus obliquus[END_REF][START_REF] Mau | Antioxidant properties of methanolic extracts from Grifola frondosa, Morchella esculenta and Termitomyces albuminosus mycelia[END_REF][START_REF] Reis | Antioxidant properties and phenolic profile of the most widely appreciated cultivated mushrooms: A comparative study between in vivo and in vitro samples[END_REF]Savoie et al., 2008).

Mécanismes d'action

Les [START_REF] Savoie | Reactive oxygen species and the strategy of antioxidant defence in mushrooms[END_REF].

Le stress oxydant peut être défini comme tout déséquilibre entre la production et la détoxification de ROS [START_REF] Hekimi | Taking a "good" look at free radicals in the aging process[END_REF]. Il provoque l'augmentation du nombre de radicaux libres, principalement sous la forme de ROS qui jouent un rôle important dans les pathologies humaines. La production non contrôlée de radicaux libres a été reliée à plus d'une centaine de maladies, y compris plusieurs types de cancers et le diabète, entre autres (Ferreira et al., 2009) [START_REF] Hekimi | Taking a "good" look at free radicals in the aging process[END_REF].

Un régime riche en antioxydant est supposé aider l'organisme à lutter contre les maladies et le vieillissement. Une fois produits, la plupart des radicaux libres sont neutralisés par des défenses cellulaires de type antioxydant (enzymes et molécules non enzymatiques). La conservation de l'équilibre entre la production de radicaux libres et les défenses par action d'antioxydants est une condition essentielle pour le fonctionnement normal de l'organisme (Ferreira et al, 2009). Bien que presque tous les organismes soient équipés de systèmes de défense de type antioxydant et de systèmes de réparation pour les protéger contre les dommages oxydatifs, ces systèmes sont souvent insuffisants pour empêcher complètement le stress oxydant induit par les dommages.

Par conséquent, des compléments antioxydants ou des produits naturels contenant des composés bioactifs peuvent être utilisés pour aider à réduire les dommages oxydatifs chez l'être humain (Kanter, 1998). L'effet bénéfique des fruits et légumes est bien connu. L'effet défensif de leurs antioxydants naturels est lié à trois groupes majeurs : les vitamines, les phénols et les caroténoïdes. L'acide ascorbique et les phénols sont des antioxydants hydrophiles, tandis que les caroténoïdes sont des antioxydants liposolubles [START_REF] Halliwell | Vitamin C: Antioxidant or pro-oxidant in vivo?[END_REF].

Les champignons sont également des sources d'antioxydants particulièrement intéressantes comme aliments fonctionnels ou neutraceutiques.

Les systèmes de défenses antioxydants

La fonction première des propriétés antioxydantes est de protéger les cellules contre les dommages provoqués par les ROS. Le système de défense des champignons comprend à la fois des enzymes qui détoxifient les ROS (superoxyde dismutase, catalase, peroxydases) et des antioxydants (glutathion, ascorbate, pigments et composés phénoliques, proline), [START_REF] Belozerskaya | Reactive oxygen species and the strategy of antioxidant defense in fungi: A review[END_REF]. Le potentiel antioxydant d'un composé peut être attribué à plusieurs caractéristiques, mais les plus importantes sont le piégeage et la réduction de radicaux libres, la catalyse par chélation d'ions de métaux de transition, l'inhibition de la peroxydation lipidique [START_REF] Kumar | Antioxidant and antimicrobial activities of Bauhinia racemosa L. stem bark[END_REF]. Des extraits alcooliques de champignons se sont révélés être d'efficaces pièges de radicaux superoxyde.

Indicateurs de l'activité antioxydante

Une grande variété de méthodes d'évaluation in vitro de la capacité de piégeage de radicaux ont été développées. Différentes molécules de synthèse sont utilisées, comme l'acide 2,2'-azibinobis-3-ethylbenzotiazoline-6-sulfonic (ABTS), le [START_REF] Villano | Radical scavenging ability of polyphenolic compounds towards DPPH free radical[END_REF] en raison de leur stabilité, leur simplicité et leur reproductibilité [START_REF] Kitts | Antioxidant properties of a North American ginseng extract[END_REF].

La capacité de réduction d'un composé peut servir d'indicateur significatif de son potentiel d'activité antioxydante [START_REF] Meir | Determination and involvement of aqueous reducing compounds in oxidative defense systems of various senescing leaves[END_REF]. Les propriétés réductrices d'une substance sont généralement associées à la présence de réductones [START_REF] Duh | Antioxidant activity of burdock (Arctium lappa Linne): Its scavenging effect on free-radical and active oxygen[END_REF] telles que l'acide ascorbique (un fort agent réducteur) connu pour exercer une action antioxydante par la rupture de la chaine de radicaux libres par le don d'un atome d'hydrogène. Le pouvoir réducteur chez les champignons pourrait être dû à leur capacité de donneur d'hydrogène [START_REF] Shimada | Antioxidative properties of xanthan on the autoxidation of soybean oil in cyclodextrin emulsion[END_REF]. P. ostreatus présente une bonne activité antioxydante in-vivo en réduisant l'intensité de la peroxydation lipidique et en augmentant l'activité enzymatique et le niveau des antioxydants non-enzymatiques. Les principes antioxydants tels que l'acide ascorbique, l' -tocophérol, le -carotène et des composés flavonoïdes (rutine et chrysine) identifiés dans l'extrait de ce champignon peuvent contribuer aux effets observés (Jayakumar et al., 2011).

Conclusion

Le principal intérêt d'A. subrufescens dans la littérature porte principalement sur ses propriétés médicinales. Cependant, cette revue bibliographique met aussi l'accent sur la variabilité de l'espèce, la composition et les propriétés chimiques du champignon, les aspects de la culture en pays tropical (qui ne sont pas transposables en pays tempérés), la qualité postrécolte. A partir de cet état de l'art nous pouvons définir les objectifs de notre travail. -Etude de la variabilité génétique par microsatellites pour la détermination du polymorphisme.

Ces informations concernent principalement les cultivars originaires du

-Evaluation des souches in vitro avec incubation à différentes températures afin de déterminer la température optimale et létale pour la croissance mycélienne.

-Comparaison de l'aptitude à la colonisation et à la fructification lors de cultures sur un compost commercial.

-Détermination de la variabilité morphologique des sporophores.

-Etude sur l'interaction in vitro et in vivo d'A. subrufescens face à des pathogènes.

Le deuxième axe consiste à rechercher des conditions de culture facilement adaptables par les champignonnistes européens, c'est-à-dire le plus proche possible de celle utilisée pour cultiver le champignon de couche Agaricus bisporus. Une étude préliminaire a montré qu'A. subrufescens est capable de fructifier à 23-25°C sur le substrat produit pour la culture commerciale d'A. bisporus, avec un gobetage commercial enrichi en sable (Callac, com. pers.). L'ajout de sable a été décidé d'après des observations de terrain sur les zones de récolte des souches sauvages (Guinberteau, com. pers.). Ces conditions de culture servent de Cette étude est présentée dans le chapitre 6.

Les réponses attendues à partir des voies d'approches choisies devraient permettre :

d'apporter de nouvelles connaissances sur la biologie d'A. subrufescens, en particulier du fait de l'analyse de souches sauvages, Avant utilisation des micro-organismes, l'aptitude de la moisissure à sporuler est vérifiée sous loupe binoculaire, et la fluorescence de P. tolaasii est vérifiée sous lumière UV, en plus de la production d'une ligne blanche en présence de P. reactans, ces deux propriétés étant indicatrices de la production de toxine par la bactérie.

-

Culture d'A. subrufescens

Préparation du blanc

Le blanc (ou semence) est produit sur des grains de seigle fournis par la société

Le substrat de culture

Le substrat utilisé pour la culture d'A. subrufescens est un compost préparé pour la production commerciale du champignon de Paris (Agaricus bisporus) par la société Renaud, Pons, France. Les principaux ingrédients pour le processus de compostage sont la paille de blé et le fumier de cheval. Le compostage est réalisé en salle (indoor). La composition moyenne du substrat est donnée dans l'article 3, chapitre 4. La teneur en eau est comprise entre 69 et 71%.

Les paramètres de culture

Dans un premier temps, toutes les souches sont cultivées à petite échelle, en barquette contenant 500 g de compost (Figure 3. [START_REF] Bowcock | High-resolution of human evolutionary trees with polymorphic microsatellites[END_REF].

Génotypage des souches

Croissance mycélienne 3.4.1. Développement mycélien in vitro

La croissance mycélienne d'A. subrufescens sur milieu gélosé (Figure 3.6) est mesurée à différentes températures (22,25,28,30,[START_REF] Ribeiro | Comparative study of phytochemicals and antioxidant potential of wild edible mushroom caps and stipes[END_REF]35,38 Pour la préparation d'extraits bruts, 150 mg de substrat de culture lyophilisé sont mélangés avec 4 ml de tampon phosphate (0,05 mol l - La valeur de densité optique obtenue pour le témoin a été soustraite de celle des échantillons. [START_REF] Dias | Truths and myths about the mushroom Agaricus blazei[END_REF][START_REF] Eira | Cultivation technology for medicinal mushroom Agaricus blazei (Agaricus brasiliensis)[END_REF].

Activités antioxydantes

Ainsi, A. subrufescens pourrait être une option saisonnière pour les producteurs de champignons dans les pays occidentaux où la production est effectuée en salles climatisées.

Les champignonnistes pourraient économiser de l'énergie en produisant ce champignon pendant l'été, en raison de ses exigences de températures de fructification (23 -29 °C) qui sont plus élevées que celles d'A. bisporus (16 -18 °C).

Il est nécessaire de développer une technologie appropriée pour cultiver ce champignon car son niveau de production est encore très faible par rapport à celui d'A. bisporus [START_REF] Siqueira | Cultivation of Agaricus blazei Murrill ss. Heinemann using different soils as source of casing materials[END_REF]. Par conséquent, plusieurs projets de recherche ont été développés au Brésil afin de trouver de meilleurs procédés de compostage et matériaux pour le substrat et la terre de couverture [START_REF] Colauto | Alternative to peat for Agaricus brasiliensis yield[END_REF][START_REF] Rocha Cavalcante | Cultivation of Agaricus blazei in the environmental protection area of the Baturite region under three types of casing soils[END_REF][START_REF] Silva | Isolation and identification of bacteria present in the casing layer utilized in the cultivation of the mushroom Agaricus blazei Murril[END_REF][START_REF] Siqueira | Cultivation of Agaricus blazei Murrill ss. Heinemann using different soils as source of casing materials[END_REF]. Mais ces projets ont été mis en oeuvre avec des matériaux locaux (par exemple la bagasse de canne à sucre et la pulpe de café pour le substrat, des sols pour le gobetage) qui ne sont pas disponibles en Europe.

L'étude bibliographique a montré qu'A. subrufescens a été découvert dans une région particulière du Brésil puis a été envoyé au Japon où l'identification de propriétés antitumorales a retenu l'attention d'industriels pour ce champignon (Mizuno, 1995). La culture industrielle, principalement pour l'importation, a alors commencé au Brésil et ce pays est considéré comme le plus grand producteur de ce champignon [START_REF] Dias | Truths and myths about the mushroom Agaricus blazei[END_REF]. Plusieurs auteurs ont cherché à déterminer la diversité génétique de différentes souches d'A. subrufescens utilisées par les producteurs [START_REF] Colauto | Genetic characterization of isolates of the basidiomycete Agaricus blazei by RAPD[END_REF][START_REF] Fukuda | Genetic variation in cultivated strains of Agaricus blazei[END_REF]Neves et al., 2005;[START_REF] Tomizawa | Genetic variability of mushroom isolates Agaricus blazei using markers rapd[END_REF] Plusieurs paramètres de culture ont été évalués :

-des facteurs environnementaux (lumière, choc froid et variation ou non de la température pendant la période de fructification),

-des paramètres techniques agronomiques (pourcentage de semence, composition et quantité de gobetage).

Les résultats attendus devraient permettre de proposer des conditions de culture facilement utilisables en pays tempérés ainsi que des souches adaptées à ces paramètres culturaux. Elles sont représentatives de la variabilité génétique observée avec l'ensemble des souches.

Résultats et discussion

Leur variabilité phénotypique est présentée dans l'article 3. La souche CA918, récoltée tardivement, n'a été utilisée que pour les études de pathologie décrites dans le chapitre 5.

2. Variabilité phénotypique

L'étude sur la variabilité phénotypique (température optimale et létale pour la croissance mycélienne, aptitude à coloniser le substrat de culture, rendement et précocité en culture à petite échelle, morphologie des sporophores) est présentée dans les articles 2 et 3.

Optimisation de la culture

Les différents paramètres analysés pour optimiser la culture d'A. subrufescens dans des conditions applicables en France sont présentés dans l'article 2 (pourcentage de blanc, effet de la lumière et d'un choc froid sur la fructification) et dans l'article 4 (quantité et nature du gobetage, variations de température pendant la fructification).

INTRODUCTION

Edible mushrooms are appreciated for their gastronomic, nutritional and medicinal values. The mushroom cultivated in Brazil, formerly known as Agaricus blazei Murrill, is widely used and studied for its medicinal and/or therapeutic properties [1]. Several works have been published to clarify its taxonomic status [2][3][4][5][6], and two new species names were proposed, Agaricus brasiliensis and Agaricus subrufescens. Kerrigan [2] considers A. brasiliensis Wasser et al. and A. blazei Murrill to be synonomous with A. subrufescens as they interbreed and produce fertile offspring. Wasser [3,4] claimed that they are different species and proposed A. brasiliensis for the medicinal mushroom. Currently many publications refer to the Brazilian cultivar as A. brasiliensis and it is believed to originate from Brazil [7]. Wild mushrooms referred to as A. subrufescens have been found in the wild in California, Israel, Taiwan and Hawaii [2,6], Mexico and European countries. These mushrooms are not currently cultivated at commercial scale, but recent work performed by Moukha et al. (this issue) proved that wild strains of A. subrufescens can show medicinal properties.

Several studies describe specific techniques and parameters for cultivating the Brazilian commercial strains [8][9][10][11][12][13][14] but substrates, casing materials and procedures are adapted for tropical countries. Brazilian strains have been reported to have a high genetic similarity [15][16][17][18] and a typical morphology [3,19,20].

Our target was to assess phenotypic variability among currently cultivated Brazilian strains and wild strains of A. subrufescens from various origins. We also wanted to identify individuals giving good yields when cultivated using substrates and procedures similar to those used for Agaricus bisporus production in France. With this aim, we evaluated both groups of strains for: i) mycelium growth rate at different temperatures, ii) mycelium efficiency to colonize the substrate, and iii) morphology, time to fruiting and yield under various cultivation conditions.

MATERIALS AND METHODS

Fungal material. Twenty five strains from the "Collection du Germoplasm des Agarics à Bordeaux" (CGAB), including 14 cultivars, the Brazilian strain ATCC 76739, 9 wild A. subrufescens and a hybrid between ATCC 76739 and a French A. subrufescens were evaluated in this study (Table 1). The strains were preserved in tubes on compost extract medium submerged with mineral oil. Before being used for the experiments, the strains were sub-cultured on malt agar (MEA) medium (pH 5.75) for 20 days at 25°C.

Cultivars

Wild strains Origin

Radial mycelial growth. Inoculum plugs (7 mm diameter) were removed from edge of 20-dayold cultures and placed at the centre of Petri dishes filled with MEA medium. The strains were grown in the dark for 14 days at 25°C, 28°C, 30°C, 32°C and 35°C. Three replications per strain were made for each treatment. Radial mycelial growth was estimated by two perpendicular measurements of the colony diameter. The linear growth period common to all strains (d5 to d10) was identified from the kinetics of radial growth and used to calculate the mycelial growth rate (mm day -1 ). At the end of the experiment (d14), the strains of the 35°C treatment were changed to 25°C and measurements were performed as previously described.

Compost. The substrate used to assess mycelial colonization and mushroom yield was commercial compost prepared for A. bisporus cultivation, and provided by Renault SA, Pons, France.

Ability of mycelium to colonize commercial compost. Small crates were filled with 150 g of compost and the whole surface of the substrate was covered with mycelium of the studied strains on agar medium (content of three Petri dishes per crate). After 21 days of incubation at 25°C and 85% humidity, the substrate was freeze-dried and colonization by the mycelium was estimated by measuring H 2 O 2 as described by Savoie et al. [21]. Compost samples from 12 cultivars, ATCC 76739 and four wild strains of A. subrufescens were analysed, with 2 replicates per strain.

Small scale cultivation. Crates filled with 500 g of compost were inoculated as described for compost colonization. After incubation for 20 days at 25°C and 85% humidity, a casing layer (1/3 limestone, 1/3 peat, 1/3 thin sand) was added, and the crates were left under the same environmental condition for a 7-day post-incubation period. To initiate fruiting, the room temperature was maintained at 22-25°C with 95-97% humidity and low CO 2 concentration. Time to fruiting was calculated as the time period between casing and the first pick of mushrooms. The number and fresh weight of the fruiting bodies were recorded for up to 65 days after casing. Nineteen strains (12 cultivars, ATCC 76739, 5 wild strains of A. subrufescens and the hybrid) were cultivated in duplicate in a completely randomised design experiment. Yield data are mean values of the total weight of biomass produced per kilogram of substrate.

Medium scale cultivation. The substrate (8 kg) was inoculated with 2% spawn and incubated at 25 °C, 85 % humidity, for 15 days. Standard conditions for casing, post-incubation, fruiting conditions, and collection of data were as described above. Fourteen strains (8 cultivars, ATCC 76739 and 5 wild strains of A. subrufescens) randomly chosen among those screened in the small scale experiment were cultivated in a completely randomised design experiment with four replicates per strain.

Effect of climatic and biological factors. Strains were cultivated on 8 kg substrate according to standard conditions, except where otherwise stated. The experiments were performed according to a completely randomised design with four replicates per strain. Light and cold shock: At the end of post-incubation, three strains (ATCC 76739, CA 487 and the hybrid) were submitted to four different treatments, namely A: 12 h light / 24h, cold shock (4 h at 18 °C twice a week); B: 12 h light / 24h, no cold shock; C: no light, cold shock (4 h at 18 °C twice a week); D: no light, no cold shock. Spawn rate: Spawning at 1% and 2% were compared for their effect on the time to fruiting and biomass production for three Brazilian cultivars (CA561, CA565 and CA 570), ATCC 76739 and A. subrufescens CA 487.

Data representation and statistical analyses. The box-plot representation [22] was used to show data distribution for radial mycelial growth. The Cramer-Von Mises's and Kolmogorov-Smirnov's non parametric tests were performed to compare data distributions.

Data recorded for time to fruiting, biomass production and mean weight were analysed using ANOVA followed by Duncan's test to identify statistical differences. The Pearson coefficient was calculated to find correlations between treatments.

RESULTS AND DISCUSSION

Mycelial growth rate. When all Brazilian cultivars were considered as a whole, no significant differences were observed between the distributions of radial growth rates at 25, 28 and 30 °C. A significant move toward slower growth rates was observed at 32°C, and to a greater extent, at 35 °C. Similar results were obtained with the group of wild strains. Although distributions at 28 and 30 °C did not differ significantly, growth rate data for the wild isolates tended to be highest at 30 °C (Fig. 1). At each temperature, except for 30°C and 35°C the distributions for the group of cultivars and the group of wild strains differed significantly. The fastest growth rates were observed among the cultivars and the slowest among the wild strains. The mycelial growth rates of the Brazilian strain ATCC 76739 were in the range of those observed for the cultivars, whatever the incubation temperature, whilst those of the hybrid differed from the cultivar distributions. x : ATCC 76739, o : hybrid. Within a same group of strains, growth rate distributions with a same letter did not differ significantly at p = 0.05.

In the treatment at 35°C, the cultivar CA 574 failed to grow, 4 cultivars had nonsignificant growth ranging from 0.23 to 0.90 mm d -1 , and the others showed poor to medium growth rates ranging from 1.47 to 4.37 mm d -1 . The wild strains were more severely affected by incubation at 35 °C. Three strains failed to grow, four strains had non-significant growth ranging from 0.10 to 0.53 mm d -1 , and three others showed poor growth rates of 1.17 -1.50 mm d -1 . The only one with a medium growth of 3.47 mm d -1 was outside the distribution (Table 2 and Fig. 1). Neves et al. [16] reported that all but one of six strains provided by spawn makers, or isolated from fruiting bodies collected in Brazilian mushroom farms, showed optimal growth temperatures of 28 or 30 °C. More recently, Colauto et al. [8] observed that five strains can develop mycelium at temperatures between 22 and 34 °C. The temperatures tested in our experiments did not enable us to identify optimal growth temperatures for the cultivars but we found that 25-30 °C was suitable for their mycelial development; this is in accordance with the observations described above. The growth rate of the Brazilian ATCC 76739 did not differ from the cultivars whilst the wild A. subrufescens strains tended to grow better at 30 °C. * Within a column, data followed by a same letter did not differ at p = 0.05.

When placed at 25°C after 14d incubation at 35°C, all the cultivars began or continued to grow. With the exception of CA 563, growth rates at 35 °C and growth rates after change to 25°C were significantly correlated (r = 0.770, p = 0.002) (Fig. 2A). However, the growth rates of cultivars at 25°C after a first incubation period at 35 °C did not correlate with the growth rates at 25°C with no pre-incubation (r = -0.491, p = 0.075; line not shown on graph) and they were always lower than those observed for direct incubation at 25°C (Fig. 2B). Similarly, ATCC 76739 developed a slower growth rate when changed from 35°C to 25 °C compared to direct incubation at 25 °C.

When placed at 25 °C after incubation at 35 °C, two of the three A. subrufescens wild strains that failed to grow at 35 °C developed no mycelium; the other strains began or continued to grow, but growth rates were not correlated to those observed at 35 °C (r = 0.170, p = 0.663; line not shown on graph) (Fig. 2A). However, there was a significant correlation (r = 0.860, p = 0.001) between growth rates of A. subrufescens wild strains at 25 °C, and growth rate at 25 °C after a first incubation at 35 °C, although mycelial development was slower in the latter treatment (Fig. 2B).

Incubation at 35°C proved that this temperature was not lethal for the cultivars, but was lethal for two wild strains. Similarly, this temperature was lethal for in vitro mycelial development of several strains of A. bitorquis [23] but only rendered inactive four strains of this species [24]. Experiments with more strains and temperature (35 °C and above) are necessary before conclusions on the lethal temperature for both Brazilian cultivars and wild A. subrufescens can be drawn. However, both groups of strains were less susceptible to high temperature than A. bisporus. Indeed, all the six A. bisporus strains tested by Lemke [24] failed to develop mycelium at this temperature. Compost colonization. Five cultivars showed high ability to colonize and transform the substrate with H 2 O 2 concentrations ranging from 217.5 to 560 nmol g -1 , whilst low concentrations (39.5 -78 nmol g -1 ) were measured in substrates colonized by the other cultivars.

A similar range of low H 2 O 2 concentrations was obtained with the A. subrufescens strains (47.5 -91.5 nmol g -1 ) and the hybrid (74 nmol g -1 ). ATCC 76739 produced a medium concentration (129 nmol g -1 ). The H 2 O 2 levels observed are in the same range to those measured for another Agaricus species, A. bisporus, producing 300 -600 nmol g -1 substrate 15 days after spawning [21]. In contrast to A. bisporus [21], neither the group of cultivars nor the group of wild strains showed a correlation between the H 2 O 2 concentration and the mushroom yield (Fig. 3), time to fruiting or sporophore mean weight (not shown). mm / day at 25 °C mm / day at 25 °C after 35 °C B compost produced for A. bisporus cultivation (Fig. 4A). The Brazilian ATCC 76739 was comparable to cultivars showing average biomass production. Agaricus subrufescens from Spain and France showed little differences in mushroom yield and were highly productive (197.5 -215.7 g kg -1 substrate). The yield of the hybrid was between those observed for its two parents (Fig. 4A).

The fourteen strains screened in medium scale experiments under the standard conditions confirmed the high variability in biomass production found in the small scale experiment. Mushroom yields at both experiment scales were significantly correlated, either for the cultivars (r=0.796, p = 0.018) or the wild strains (r = 0.870, p = 0.024) (Fig. 4B).

Four medium scale experiments confirmed that the hybrid yield (116.7 ± 32.4 g kg -1 substrate) fell between the yields of its two parents, ATCC 76739 (41.9 ± 12.2 g kg -1 ) and CA 487 (207.9 ± 47.9 g kg -1 ). Compared to other cultivated Agaricus, the productivity of the Brazilian cultivars reported in the literature is low and depends to a high degree on the strain and the cultivation conditions. Eira [1] reported yield from 3 to 25 kg of fresh mushroom /100 kg of substrate based on local material. More recently, the average production in Brazil was estimated at 8 -16% after 120 days of cultivation [25]. In this study, three cultivars showed productions between 6.5 and 8.2% after the 65-day fruiting period and would therefore be considered valuable material for cultivation using commercial compost produced for A. bisporus cultivation. The French and Spanish A. subrufescens strains and the hybrid adapted well to this substrate.

Time to fruiting.

In the small scale experiment, the time to first fruiting varied from 26 to 40 days after casing for the group of cultivars. ATCC 76739 began to fruit on day 34, and consequently did not differ from the group of cultivars for this trait. Four of the wild strains were early fruiting (19 -25 d) (Fig. 5A). The medium scale experiment confirmed these observations (Fig. 5B). The literature indicates that cultivar first flush occurs approximately 15-20 days after casing. Under our cultivation conditions, cultivars began to fruit later. However, time to primordial onset is dependent on the casing materials [26]. We used a single casing mixture, derived from that prepared for A. bisporus cultivation. The casing composition seemed suitable for A. subrufescens cultivation, but the time to first fruiting of cultivars might be improved by the use of different casing mixtures. Sporophore morphology. Under the standard cultivation conditions described above, Brazilian cultivars showed a cylindric, brownish-gold cap, as described in the literature for the cultivated strains [3,20]. The Brazilian wild strain ATCC 76739 showed the cultivar morphology, whilst the wild A. subrufescens strains exhibited different morphology. The French strain CA487 and the Spanish strain CA438-A exhibited a cream cap whilst the French strain CA643 showed a brown cap, but without the gold appearance characteristic of the Brazilian cultivars (Fig. 7). All strains bore a white stipe, and an elastic flocculent veil (Fig. 8).

B

Sporophore mean weight was used as a rough estimation of sporophore size. In the small scale experiment, the cultivars showed a wide range of sporophore mean weight (14.0 -36.6 g) whilst the wild strains produced small sporophores (11.0 -19.1 g) (Fig. 6A). This observation was confirmed with the medium scale experiment. When taken as a whole, the group of cultivars produced larger sporophores compared to the group of wild strains. The Brazilian ATCC 76739 did not differ from the cultivars (Fig. 6B). The morphological traits of mushrooms grown on the same substrate clearly separated the Brazilian cultivars and the ATCC 76739 from the wild A. subrufescens. Effect of light and cold shock. Neither the light period nor the cold shock had a significant effect (p = 0.05) on the biomass production and time to fruiting of the three strains tested (ATCC 76739, CA 487 and the hybrid). As previously observed, ATCC 76739 was later fruiting and produced less biomass but larger sporophores compared to CA 487. The time to fruiting, yield and sporophore size of the hybrid were between those of its two parents.

The literature reports the production of Brazilian cultivars in the dark [13], with light/dark photoperiod [27], under day/night periods in glasshouse [9] and outdoor [10], but no study focused on the effect of light on the mushroom yield. From our observations, it is clear that the Brazilian ATCC 76739, the A. subrufescens CA 487 and the hybrid developed perfectly in the dark. The three strains studied by Zied et al (This issue) on 3 different composts with variations in temperature during the cropping period showed the same levels of yields and time to fruiting.

Effect of spawn quantity. The time to first fruiting was significantly affected by the reduction of spawn from 2% to 1%, but the effect was highly dependent on the strain. On substrate spawned at 1%, average time between casing and first fruiting increased significantly by 5 and 8 days for CA 561 and CA 570, respectively. No significant difference was observed for the other strains (Tables 34). Despite the effect on the time to first fruiting, no significant variation in biomass production was detected in relation to spawn rate (Table 3). Spawning at 1-2% is commonly used for commercial production of Brazilian cultivars [10,13,28,29]. Spawning at 2% rate increased the yield of strain 7700 (Mycelia Co) by 26% on average, compared to yields obtained with 1% spawn, in a cultivation substrate composed of wheat straw and chicken manure [30]. Such yield improvement were not observed with the three cultivars and the two wild strains cultivated on French commercial compost based on horse manure reported here.

CONCLUSION

We evaluated 14 Brazilian cultivars, ATCC 76739 -the presumed source material of many strains cultivated in Brazil, and 9 wild strains of A. subrufescens from different geographic origins for phenotypic variability. All the studied traits (mycelium growth rate, compost colonization, time to first fruiting, yield, sporophore macro-morphology) clearly separated the cultivars and the wild A. subrufescens, whilst ATCC 76739 did not differ from the cultivars.

Significant phenotypic diversity was found among each group, cultivars and wild A. subrufescens. Several strains appear to have valuable characteristics for cultivation on commercial compost. Future work with selected strains will focus on investigating the following biological and climatic conditions: spawning at 1 % for economic consideration as this rate did not reduce yield, no light to reduce energy cost and no cold shock to limit manipulations. Different casing mixtures may improve yield of the selected strains. This species is of interest for cultivation during the warmest months in Europe to reduce energy costs,

The medicinal properties of A. subrufescens strains is also an important consideration. Detection of biomolecules in A. subrufescens (Moukha et al., this issue) and the results presented here suggest that interesting strains among wild A. subrufescens may be identified that have both medicinal properties and high yield on commercial compost for A. bisporus.

Recherche d'amélioration par création d'hybrides

Des hybrides intercontinentaux (Tableau 4.1) et européens (Tableau 4.2) ont été obtenus par P. Callac et coll. à partir de croisements entre des isolats monospores homocaryotiques issus des souches CA454 (Brésil), CA487 (France) et CA438-A (Espagne).

Les méthodes d'obtention sont décrites dans l'article 3 de ce chapitre.

Les hybrides intercontinentaux ont montré une augmentation significative du rendement en comparaison du parent brésilien, et un hybride (487-42 x 454-43) a montré le même rendement (p=0,05) que le parent français identifié comme bon producteur. Un autre critère observé est la couleur du chapeau, qui varie de crème à brun foncé chez les hybrides intercontinentaux, chez lesquels la couleur crème a été transmise à 5 hybrides. Ceci montre que chez aucun des deux parents la couleur du chapeau est un caractère récessif, contrairement à ce qui est observé chez A. bisporus où la couleur blanche est récessive [START_REF] Callac | Evidence for PPC1, a determinant of the pilei-pellis color of Agaricus bisporus fruitbodies[END_REF]

Chapitre 5. Sensibilité d'Agaricus subrufescens aux pathogènes

Ce chapitre présente la sensibilité d'A. subrufescens à des pathogènes majeurs en champignonnières et l'effet d'extraits hydrophiles du champignon sur ces micro-organismes.

Introduction

La sensibilité aux maladies est un problème majeur dans l'industrie du champignon.

Résultats

Le projet d'article 5 présente la sensibilité de trois cultivars et quatre souches sauvages

2011). T. aggressivum competes with

A. bisporus for space and nutrients (Savoie et al. 2001) and no mushroom develops in the contaminated area. Agaricus bitorquis, a species cultivated at higher temperature (24-28 °C) than

A. bisporus, is also affected by P. tolaasii [START_REF] Fletcher | Mushrooms: Pest and Disease Control[END_REF]) and shows significant reduction in yield in the presence of T. aggressivum (Sobieralski et al. 2010). Agaricus subrufescens is a fungus of hot climate and low technology systems. Temperature range of 25 to 30 °C throughout the production cycle favours the emergence of pests and diseases (Eira 2003). Trichoderma sp. is common in A. subrufescens culture beds when the compost temperature was raised above 32 °C after spawning (Kopytowski Filho et al. 2008), and in environments with deficient fresh air intake and circulation, in addition to high moisture either in the compost, casing soil, or the air [START_REF] Andrade | Productivity, biological efficiency, and number of Agaricus blazei mushrooms grown in compost in the presence of Trichoderma sp. and Chaetomium olivaceum contaminants[END_REF]. By inoculating Trichoderma sp. at spawning, Andrade et al. (2011) reduced significantly the yield of mushroom production, but the strain and the species of Trichoderma used was not specified.

Currently, there is no report comparing A. subrufescens strains for competition with T. aggressivum.

The same remark can be made about the susceptibility of the mushroom to P. tolaasii. The aim of this work was to assess the susceptibility of Brazilian cultivars and wild European strains of A. subrufescens to both pathogens.

MATERIAL AND METHODS

Agaricus subrufescens

Three strains (CA561, CA565, and CA570) were cultivars of almond mushroom from Brazil kept in the Collection of Germplasms of Agaricus in Bordeaux (CGAB), INRA, since 2007; CA438-A, CA487 and CA643 were wild European strains of the CGAB collection; CA918 was a Thai strain from the CGAB/MFLU (Mae Fah Luang University, Chiang Rai, Thailande) collection (Table 1). nitrogen. In the presence of P. reactans, the P. tolaasii strain generated the typical white line reaction characteristic of its toxin production.

Production of fruiting bodies

The substrate used to grow A. subrufescens was compost prepared for commercial production of the button mushroom, and provided by Renault SA, Pons, France. The main ingredients for composting had been wheat straw and horse manure. Composting had been performed indoor. Trays filled with 8 kg compost inoculated with 1% spawn were incubated for 15 days in a climatic chamber with 25 ± 0.5

°C in compost and 98 ± 2% relative humidity. Then, 5 cm of casing layer corresponding to 45% peat, 20% limestone, 35% fine sand (v/v/v) was added and the trays were left under the same environment conditions for a post-incubation period of seven days. After that, the climatic chamber was set at 23 ± 0.5 °C for air temperature with 97 ± 2 % humidity and 1200 ± 100 ppm CO 2 concentration.

Confrontation A. subrufescens -T. aggressivum

Inoculum was made by rolling a sterile rye grain onto the surface of a sporulating colony of T. aggressivum. Polypropylene boxes with a volume of 540 mL (Microbox, Combiness, Belgium)

were filled with 150 g of compost (batch used to produce fruiting bodies) and inoculated with 2% spawn (16 grains of A. subrufescens spawn per tray, uniformly distributed into the substrate). On one side of the box, a sterile rye grain coated with T. aggressivum spores was introduced into the compost, at 1 cm from the surface (Fig. 1). Lids with a specific air filter were added (7.44

Susceptibility to P. tolassii

The experimental design was adapted from that used by Olivier et al. (1997) to assess the susceptibility of A. bisporus to P. tolaasii. To prepare the inoculum, P. tolaasii was cultivated during 48 h at 25 °C on liquid King's medium B (King et al. 1954) and cells were suspended in sterile water.

The suspension was adjusted to 0.3 absorbance at 450 nm. Ten mushroom caps, veil closed, were arranged inside plastic boxes used as moist chamber. A 20 µL aliquot of the bacterial suspension at 0.3 absorbance (approx. 10 8 cfu mL -1 ) was placed at the surface of each cap surface. After 48 h of incubation at 20-23 °C, symptoms were rated on a scale of 0 to 3: 0 = no symptom; 0.5 = level, yellowish lesion, 1 = level, beige-yellow lesion; 1.5 = slightly sunken, beige-yellow lesion; 2 = sunken, yellow-brown lesion; 2.5 = extensive yellow-brown sunken lesion; 3 = extensive brown sunken lesions.

Hydrophilic extracts of A. subrufescens

The mycelium is produced in 1 L flasks containing 200 mL of liquid medium (cristomalt 20 g L -1 ) inoculated from liquid sub-cultures. After incubation for 20 days at 25 °C on a rotary shaker (200 rpm), the mycelium was recovered by filtration, washed with ice water, and immediately frozen at -80 °C. Frozen mycelium from 20 liquid cultures was grouped, lyophilised and ground to fine powder (< 0.1 mm). Sporophores (veil closed) were frozen at -80 °C immediately after harvest and lyophilised. Mushroom powder was obtained from 10 sporophores. The same protocol was applied to prepare extract from mycelium and mushroom powder. To obtain the hot extract, 2.5 g of powder were suspended in 50 mL of ultrapure sterile water at 65 °C and incubated at 100 °C for 1 h. After homogenization at room temperature for 6 h on a rotary shaker (30 rpm), the suspension was centrifuged for 30 min at 6000 g, 20 °C. The supernatant was collected, freeze dried and the powder was diluted in sterile water to obtain a solution at 15 mg mL -1 . The pH was adjusted to 5.0-6.0 if necessary. To obtain cold extracts, 2.5 g of powder were suspended in 50 mL of ultrapure sterile water and incubated for 1 h at room temperature with strong agitation every 15 min, then for 48 h at 4°C, 30 rpm. The solution at 15 mg mL -1 was prepared as described above. Extracts were stored at -80 °C and thawed at 36 °C for 5 min just before use. Cold and hot extracts were prepared from mycelium and sporophores of the wild strain CA487 and the cultivar CA565. The cold extract was incubated 20 min at 80 °C for deactivation of enzymes which could interfere with the FDA hydrolysis.

Effect of the mycelium hydrophilic extracts on mycelial growth of T. aggressivum

The isolate Tri B was cultivated on malt agar medium at 25 °C, in the dark to avoid sporulation. Four inoculum plugs (7 mm diam.) were cut at the edge of the colony and placed into tubes containing 960 mL of liquid medium (cristomalt, 15 g L -1 ). The medium was supplemented with either 40 µL of hydrophilic extract (sample), or 40 µL of Amphotericine Gibco™ at 2.5 µg mL -1 (commercial fungicide), or 40 µL sterile water (control without extract), each with two replicates. Control without Tri B consisted in 960 mL of liquid medium supplemented with 40 µL of hydrophilic extract. The active microbial biomass was assessed by the measurement of FDA hydrolysis activity adapted from Inbar et al. (1991). Within each replicate tubes, one received 1 mL of FDA at a concentration of 0.01 mg mL -1 in 60 mM phosphate buffer pH 7.6 (FDA), and 1 of mL 60 mM phosphate buffer pH 7.6 was added to the other tube (Buffer). Immediately (t0) and after incubation for 48 h at 25 °C (t48h), the tubes were placed at 30 ° C for 30 min, then the reaction was stopped by the addition of 1 mL of acetone. After 5 min at room temperature, the tubes were centrifuged at 11 000 rpm at 15 °C for 5 min and the supernatant collected for lecture of the absorbance at 490 nm (UVIKON, Bio-Tek Instruments). The FDA hydrolysis activity was expressed in mg equivalent of FDA hydrolysed implant -1 min -1 , following the equation:

FDA hydrolysed = [((A 490 *1/n) * (1/t)) FDA -((A 490 *1/n) * (1/t)) Buffer ] t48h -[((A 490 *1/n) * (1/t)) FDA -((A 490 *1/n) * (1/t)) Buffer ] t0
with n = number of implants, and t = incubation time at 30 °C in minutes.

Data are means of three replicates per treatment.

Effect of the sporophore hydrophilic extracts on P. tolaasii growth P. tolaasii suspension was prepared as described for the susceptibility test and adjusted to 0.3 absorbance at 450 nm. King's medium B (950 µL) was supplemented with either 50 µL of hydrophilic extract (sample), or 50 µL of antibiotic mixture providing 10 ng Clortetracyclin, 50 ng Streptomycin sulfate, 25 ng Penicillin G sodium salt at 1MU (antibiotic treatment), or 50 µL of sterile water (control). The antibiotics were purchased from Sigma-Aldricht. After incubation for 24 h at 24 ± 1 °C, the bacterial biomass was assessed by the measurement of FDA hydrolysis as described above.

Data are means of three experiments, each with two replicates per treatment.

These observations were confirmed by the ANOVAs followed by the student's test performed on measurements of sporulation surfaces. From d13 to the end of the experiment (d20), substrates spawned with the three Brazilian cultivars, CA438-A and CA487 did not differ significantly (p = 0.05) between themselves. Since d15-16, substrates inoculated with the wild strains CA643 and CA918

were significantly less contaminated than substrates contaminated with the other strains. On part B of the substrate, kinetics of sporulation surfaces did not differ markedly (not shown). At each time of measurement, substrates spawned with the seven strains showed similar surfaces with sporulating T.

aggressivum (p = 0.05) except some differences observed with CA918 since d16 (Table 2).

These observations and the percentage of surface of the substrate covered with spores (Table 2) showed that A. subrufescens is highly susceptible to T. aggressivum but identification of two wild strains less susceptible than the others suggested the possibility to find more tolerant strains in the wild. The absence of significant difference between the three cultivars might be related to their genetic homogeneity [START_REF] Llarena-Hernández | Potential of European wild strains of Agaricus subrufescens for productivity and quality on wheat straw based compost[END_REF]) which was consistent with the common origin of the present Brazilian cultivars proposed by Neves et al. (2005). For each part of the substrate, within a column, values followed by the same letter are not different at p=0.05 by the Duncan's test.

The sporulation surface was identical on parts A and B on days 13 and 14 whatever the strain of A. subrufescens present. At that time spawn run was achieved. Then the surface covered by spores of T. aggressivum was significantly extended (p<0.05) on part B compared to part A since d15 in substrates spawned with CA487 and CA643, d16 in presence of CA561 and CA565. On d17, part B showed the higher surface whatever the mushroom strain. No hypothesis was postulated to explain this observation which suggested a different behaviour compared to the stimulation of the Trichoderma sporulation observed in confrontations with A. bisporus as soon as both mycelia were in contact (Mamoun et al. 2000). Indeed, in the present study the contact between A. subrufescens and T.

aggressivum mycelia cannot occur later in part A than in part B.

Effect of hydrophilic extracts of A. subrufescens mycelium on mycelial growth of T. aggressivum

CA487 hot extract reduced significantly the growth of the pathogen whilst the cold extract was without effect. Preparations from CA565 had no effect (hot extract) or stimulated significantly (cold extract) the mycelial growth of T. aggressivum (Table 3). These observations were in accordance with the poor competitiveness of A. subrufescens against T. aggressivum observed in the confrontation experiment.

Susceptibility to P. tolassii

Lesions observed at the surface of the mushroom caps were yellowish to yellow-brown, never brown to dark brown (Fig. 3). The discolouration observed was closer to the yellowish brown to orange colour developed on Pleurotus eryngii [START_REF] González | Brown blotch caused by Pseudomonas tolaasii on cultivated Pleurotus eryngii in Spain[END_REF] than to the pale to dark brown colour reported for A. bisporus [START_REF] Soler-Rivas | Biochemical and physiological aspects of brown blotch disease of Agaricus bisporus[END_REF]. A. subrufescens belong to the group of the yellowing agaricus (the flesh becomes yellow to orange after injury and at the base of the stipe after harvest) whilst A. bisporus is a reddening agaricus. That explains the difference in the bloch colour in the two species.

Significant variability in susceptibility was observed between A. subrufescens strains but the group of wild strains did not differ from that of cultivars for the trait (Table 4). Symptoms are at low levels (score < 1.5) except for CA643 and some caps of CA565, and never extensive (no score 2.5 or 3). Based on observations in A. bisporus, it must be mentioned that strains showing no symptom in this experiment could exhibit slight symptoms in other experiments. The mushrooms analysed exhibited various cap colours (Table 1, Llarena-Hernández et al. 2011) but, contrast to observations on A. bisporus (Moquet et al. 1999), the susceptibility of A. subrufescens to P. tolaasii was not linked to cap colour. (Photo INRA, MycSA)

Table 4. Susceptibility of the A. subrufescens strains to P. tolaasii.

Strain Mean score CA438-A 0.4 CD CA487 0 D CA643 1.9 A CA918 0 D CA561 0.7 C CA565 1.3 B CA570 0 D

Effect of hydrophilic extracts of A. subrufescens sporophores on P. tolaasii growth

A significant inhibition of P. tolaasii growth was observed with all the extracts although it was low compared with the antibiotic cocktail (Table 3). The cold extracts reduced the bacterial growth by 27.1 and 35.7% and were more efficient than the hot extracts. Further investigations with more strains and partition of the extract could confirm the weak susceptibility of A. subrufescens to P. tolaasii and inform on the components reducing the development of the bacterium.

Conclusion

The susceptibility of A. subrufescens strains to two pathogens was analysed in this work. Cultivars and wild strains revealed a low susceptibility to P. tolaasii, but more strains must be screened before to extrapolate the poor susceptibility to the A. subrufescens species. Hydrophilic extracts of A. subrufescens were less effective than a commercial antibiotic as inhibitor of P. tolaasii. However, bacterial disease control seemed not of prime importance considering the results of the susceptibility test. In contrast, confrontation between A. subrufescens and T. aggressivum mycelia on compost revealed a great susceptibility of the mushroom to green mould, and the hydrophilic extracts obtained from two mushroom strains failed to reduce T. aggressivum mycelial growth. But two wild strains were significantly less susceptible to green mould than the others, and might offer a means of partial control, and their hydrophilic extracts must be tested.

Chapitre 6. Potentiel d'A. subrufescens comme source de composés bioactifs

Ce chapitre présente une analyse chimique d'A. subrufescens par résonance magnétique nucléaire du solide et l'estimation de l'activité antioxydante dans les corps fructifères.

Introduction

Depuis plusieurs années il y a un intérêt industriel accru pour des composés, nommés neutraceutiques fongiques, qui peuvent être extraits du mycélium ou du sporophore des champignons. Les -glucanes ont été reconnus comme agents anti-tumoraux [START_REF] Angeli | Beta-glucan extracted from the medicinal mushroom Agaricus blazei prevents the genotoxic effects of benzo[a]pyrene in the human hepatoma cell line HepG2[END_REF][START_REF] Borchers | The immunobiology of mushrooms[END_REF][START_REF] Chen | Medicinal importance of fungal beta-(1 -> 3), (1 -> 6)glucans[END_REF]De Silva et al., 2012 a et b ;Poncheret et al., 2006).

Dans le cas d'A. subrufescens la caractérisation de la biomasse fongique par des marqueurs chimiques, en particulier la quantité et la qualité des polysaccharides est un aspect important pour le développement de méthodes de criblage permettant d'identifier rapidement des souches ou des conditions de cultures optimisées pour la production de substances bioactives à visées thérapeutiques. La résonance magnétique nucléaire (RMN) du solide a été largement utilisée pour étudier les structures des polymères parce qu'une extraction préliminaire n'est pas nécessaire et de ce fait cette approche globale permet l'analyse d'échantillons dans leur état d'origine. Cette technique permet d'obtenir directement le rapport entre protéines et polysaccharides [START_REF] Pizzoferrato | Solidstate 13 C CP MAS NMR spectroscopy of mushrooms gives directly the ratio between proteins and polysaccharides[END_REF].

Par ailleurs, A. subrufescens est considéré comme une source naturelle de composés antioxydants différents des polysaccharides, mais à notre connaissance il n'existe pas de données disponibles sur la variabilité de ces métabolites incluant des souches sauvages d'A. subrufescens. Des études sur l'activité biologique pendant le développement des sporophores ont révélé qu'il peut y avoir des changements de l'activité anti-oxydante chez un sporophore à l'état commercial (chapeau fermé) en comparaison avec l'état mature (chapeau ouvert) (Soares et al., 2009 ;Mourao et al., 2011), mais il n'existe pas d'étude au niveau primordium.

L'objectif de ce chapitre est de révéler le potentiel de la RMN du solide pour caractériser le mycélium et les sporophores d'A. subrufescens comme source de polysacharides diversifiés et d'évaluer la variabilité du potentiel antioxydant de souches sauvages et cultivées à deux stades de développement du sporophore. There have been recent investigations on the antioxidant properties of extracts from various cultivated and wild edible species. 2-8 Among the antioxidant properties, various phenolic compounds, 3,4,9 flavonoids, ascorbic acid 3 and polysaccharides 5 are recognized as antioxidant in mushrooms.

Résultats

Agaricus subrufescens Peck is formerly known in the literature as A. blazei Murril sensu Heinemann, or Agaricus brasiliensis Wasser et al. and is also called Almond Mushroom, Himematsutake and Cogumelo do Sol. 10 The medicinal properties of the culinary-medicinal mushroom A. subrufescens are known for more than three decades and several reviews analysed its importance as functional food or for medicinal purposes. 11-14 Reactive oxygen species (ROS) are by-products of normal metabolism or are produced during stresses. They may cause extensive damage to DNA, proteins and lipids, and interfere with vital cellular functions. Complex antioxidant defense mechanisms within the organisms have evolved to limit the levels of reactive oxidants and the damage they inflict, 15 but these mechanisms are often inadequate to completely prevent oxidative stress-induced damage.

Antioxidant supplements, or natural products containing bioactive compounds, may be used to reduce oxidative damage to the human body. 16 Edible mushrooms are good candidates for purchasing such natural products. Works have been done about their antioxidant activity, but there are few published data for A. subrufescens. 17-20 The choice of the optimal stage of harvest and the part of the fruiting body containing the higher amount of bioactive compound is important to improve the use of A. subrufescens as a functional food. The content of bioactive compounds may vary within a species with differences between strains, cultivation techniques and maturity of harvest. 21 To our knowledge, no reports have been done about changes in antioxidant activity during the development of A. subrufescens from primordia to fruiting bodies. On another hand, antioxidant activity had been measured in A. subrufescens fruiting bodies with closed caps compared to mushrooms with open caps, 22,23 and between cap and stipe, 24 but all these works concerned cultivars which are suspected by Neves et al. 25 to have a common origin, based on genetic studies.

In a previous work we studied a group of Brazilian cultivars and a group of wild A. subrufescens and observed a large variability between the groups in antioxidant activity measured in fruiting bodies. 20 The aim of the present work was to identify strains and mushroom tissue with high potentials as source of antioxidant activities. Both cultivars and wild strains of A. subrufescens were cultivated on compost and antioxidant activities of methanolic extracts were analysed for clarifying whether they varied with the development stage (primordium vs fruiting body with closed cap) and the parts of the mushroom (stipe vs cap). Huang and P. Callac who crossed homokariotic single spore isolates of the Brazilian strain CA454 and the French strain CA487. CA454 is a subculture of the collection strain WC837 in PSUMCC assumed to be similar to ATCC 76739, which, according to ATCC, was originally provided by T. Furumoto, used by Mizuno et al., 26 and would be at the origin of the new cultivation of this mushroom. The three Brazilian strains and CA454 showed brownish gold caps, CA 643 brown caps, CA487, CA438-A and the hybrid light cream caps.

MATERIALS AND METHODS

A

Cultivation conditions. The substrate used to cultivate the strains was compost prepared for commercial production of the button mushroom Agaricus bisporus, and provided by Renaud SA, Pons, France. The main ingredients for composting were wheat straw and horse manure.

Composting was performed indoor. The casing soil was a mixture of 45% peat, 20% limestone, 35% fine sand; v / v / v. The eight strains were grown in trays of 0.09 m² filled with 8 kg of compost inoculated with 1% spawn. Incubation was performed at 25 °C, 85% humidity, for 15 days. After casing, the trays were left under the same environmental conditions for a 7-day post-incubation period. To initiate fruiting, the room temperature was set at 23-25 °C with 95-97% humidity and CO 2 concentration lower than 1200 ppm. Four replicates were prepared for each strain and the yields were estimated by collecting all the mushrooms produced until 65 days after casing.

Samples. Experiment 1 was performed with a single batch of compost. The mushrooms were harvested during the first flush, at two development stages: primordium (P, 10-15 mm high, before gill development) and fruiting body at commercial stage considered as stage 3 for A. bisporus. 27 The mushrooms were placed on plates on ice and immediately conditioned.

Each fruiting body was cut by the middle to obtain three types of samples: one half represent the whole fruiting body (SP), the other half was separated in stipe (S) and cap (C). Samples P were composed of 7-14 primordia, samples SP, S and C were constituted from 3-6 mushrooms each. To analyse a putative effect of the cap pigmentation on the antioxidant activities, the pileipellis was removed from caps of CA643 and CA438 using a scalpel (sample PC). The samples were immediately frozen at -80 °C and kept at this temperature until being freeze dried. In experiment 2, the culture was performed on a different batch of compost provided 9 months later by the same company and samples SP were prepared as described above.

Antioxidant activity. For A. subrufescens, methanol is considered a good extraction solvent for antioxidant activity test compared to ethanol or water. 22 Antioxidant activity was determined in methanolic extracts as radical scavenging activity on 1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl radicals (DPPH • ) and reducing power using the methods previously described in Savoie et al. 28 Freeze dried samples were ground to powder (particle diameter < 0.1 mm).

Methanolic extracts were prepared from 3 g subsamples of lyophilised powder in 100 mL of where A control and A sample are the absorbance of control without and with sample, respectively.

The reducing power was reported as the effective concentration of extract at which the absorbance was 0.25. Ascorbic acid was used as a standard.

Statistical analyses. Data were analysed by variance analyses (ANOVA) followed, when necessary, by the Duncan's test to identify statistical differences. ANOVA with contrast was performed to compare the wild strains to CA454 and the cultivars for antioxidant activities.

RESULTS

Change of antioxidant activity with the development stage

All strains but CA565 showed higher antioxidant activities in the primordia compared to the whole sporophores, although differences were not significant for CA487 ability to scavenge DPPH radicals (Table 1) and for the reducing power of CA561 (Table 2). In contrast to the other strains, CA565 exhibited a higher activity in the whole sporophore whatever the method used. The reducing power measured with ascorbic acid was 0.018 mg mL -1 .

Caps of the wild strains, CA454 and the hybrid showed higher DPPH radical scavenging activity compared to stipe whilst similar activity was measured in caps and stipes of cultivars. The reducing power in the caps was higher compared to that found in the stipes in all strains but CA561.

The type of sample showing the highest antioxidant activities was primordium for the hybrid, primordium or cap for the wild strains CA438-A and CA487, and cap for CA565. In strains CA561, CA570 and CA643, the highest radical scavenging activity was measured in the cap, but similar reducing power was found in primordium and cap. The opposite was observed with CA454.

Variability of antioxidant activity between the strains

ANOVAs with contrast showed that the group of wild strains did not differ from the group consisting of CA454 and cultivars for scavenging activity and reducing power in primordia (p = 0.355 and 0.761, respectively) and in caps (p = 0.312 and 0.772, respectively).

When compared to the other strains, the cultivars CA561 and CA565 exhibited significant higher DPPH scavenging activities in the sporophore and the stipe. Irrespective of the sample, the hybrid did not differ significantly from its parent CA487 (Table 1).

Radical scavenging activity and reducing power of the light cream strains (CA438-A, CA487 and the hybrid) were in the same range than those of the brown CA643 and the brownish gold cultivars CA561, CA565 and CA570 (Tables 12). In addition, no significant difference in DPPH scavenging activity was detected between caps with or without pileipellis (Table 3) either in the light cream strain CA438-A or in the brown strain CA643. The reducing power was reduced when the pileipellis of CA438-A was removed.

Variations in antioxidant activities in mushrooms collected in different experiments

The eight strains showed significant differences in total mushroom biomass produced in two different crops despite the control of the climatic conditions. Mushroom yield of wild strains ranged from 149 to 189 g kg -1 substrate in experiment 1, and from123 to 227 g kg -1 in experiment 2, whilst cultivars and CA454 produced 7.1 to 28 g kg -1 in experiment 1 and 13 to 91 g kg -1 in experiment 2. The wild strains were early fruiting compared to the other strains, irrespective of the experiment. Antioxidant capacities varied significantly with the experiment. The DDPH scavenging activity was higher in experiment 1 than in experiment 2 for CA438-A, CA487 and CA 565 whilst it was the opposite for the other strains but the hybrid, and greater differences between experiments were observed (Fig. 1). The Pearson coefficient between mushroom yields and DPPH EC 50 values (r = 0.785 p = 0.037 for experiment 1 without CA454 (poorly yielding, 7.1 g kg -1 ), and r = 0.753, p = 0.031 for exp. 2, all strains) showed that the more the strain was productive, the more its scavenging activity of DPPH radicals was low. No significant correlation (p = 0.05) was observed between mushroom yield and the level of reducing power. A common effect of the experiment was observed; all the strains had higher reducing power in experiment 2, but the differences between experiments were not significant for CA438-A, CA487 and CA565.

DISCUSSION

Radical-scavenging activity in the sporophore of the eight evaluated strains ranged among EC 50 values of 1.13 to 3.17 mg mushroom mL -1 . Some works on the antioxidant properties of A. subrufescens cultivars have been made, but data varied greatly depending on the strain, technique of extraction and method of antioxidant activity measurement. Carvajal et al. 29 determined EC 50 value of 0.305 mg of extract mL -1 for DPPH radical scavenging Variations in antioxidant activity during the A. subrufescens sporophore ripening are reported. These works concern the mushroom biology and its use as a nutritional source of antioxidant. Soares et al. 23 Consequently, the highest antioxidant activity observed in primordia could result from antioxidant mediated defences necessary to protect the cells from the high levels of ROS generation at this critical stage of mushroom differentiation.

Beyond the development stage of sporophores, the antioxidant activity can differ according to the sporophore part. For DPPH radical scavenging activity and to a lesser extent for reducing power, activities in the cap were found either higher or similar to those present in the stipe, depending on the strain. Geosel et al. 24 analysed two cultivars of A. bisporus and seven cultivars of A. subrufescens by the FRAP method and found all strains but two A. subufescens cultivars with higher antioxidant activity in the cap than in the stipe.

Investigations on wild edible mushrooms revealed that the cap contributed better to the DPPH radical scavenging activity than the stipe in Boletus edulis, Suilus granulatus and Russula cyanoxantha whilst it was the opposite in Amanita rubescens. 32 Caps of the wild edible mushrooms Lactarius deliciosus and Tricholoma portentosum exhibited greatest antioxidant activities than stipes. 33 Despites some variability between strains and species, the presence of higher antioxidant capacities in the cap compared to the stipe is probably common in edible fungi. This is in agreement with the results of Savoie et al., 28 who found the highest antioxidant activities in the gills, since the gills are an organ where the redox reactions are important and consequently the antioxidant defences are higher.

A. subrufescens cultivars are known to be characterised by a brownish gold colour of the cap, which explains that there is no report in the literature on antioxidant capacity in A. subrufescens in relation to cap colour. In our work using wild strains with different cap colours, no relationship was observed between cap colour and antioxidant activities.

Similarly, analysing A. bisporus mushrooms at commercial stage, Savoie et al. 28 found higher radical-scavenging activity and reducing power in a cream wild strain than in a brown wild strain and a white cultivar. Removal the pileipellis by cutting it off produced a yellowish colour that could explain the decrease in antioxidant capacity we observed with CA438-A.

The antioxidant activity of methanolic extracts of A. subrufescens appeared to depend on the strain, and probably not on the cap colour. However, more studies including a greater number of strains are needed to clarify this point.

Cultivation condition is another source of variability as well as strain, development stage or mushroom part. The base ingredients of the commercial compost used in the present work were wheat straw and horse manure, whose nutrient content varied with batches. Results

from experiments 1 and 2 showed that the best batch of substrate for mushroom antioxidant activities depended on the strain. Similarly, Geosel et al. 24 reported antioxidant capacity variations between cultivars and years and suggested that substrate fluctuation may influence the polyphenol biosynthesis pathway of the mushroom. These studies performed with different substrate origins and strains pointed out the importance of the genetic and phenotypic background of the strain when the objective is to produce functional food or bioactive components.

A. subrufescens is a culinary-medicinal mushroom mainly sold as powder, extracts or tea. From a scientific point of view, the primordium and the cap of A. subrufescens were the samples the most interesting for antioxidant properties, but processing primordia (weak biomass, time consuming harvest) or caps (one more step in preparation compared to whole sporophore) seemed not the best choice for commercial production when antioxidant properties were taken as a whole. But it would be different if particular compounds beneficial to health could be detected in primordium and/or cap.

Antioxidant properties of A. subrufescens compounds soluble in methanol varied with the strain, development stage, part of the fruiting body studied and cultivation conditions. All samples showed important radical scavenging activity but primordia and caps were particularly more active. The rapid production of a large biomass easy to transform is of prime importance for commercial valorisation of A. subrufescens as food or dietary supplement with antioxidant properties. Besides, the antioxidant capacities of the strain should vary little with the batch of commercial substrate. This point might be the most difficult to solve, although strains like CA438-A and CA487 could have this potential. Taking into account their short time to fruiting, high yield and good sporophore antioxidant capacities, the wild strains, especially CA438-A and CA487, showed advantages compared to the cultivars for development as functional food or nutraceutical. This potential of wild strains can be useful to improve cultivated strains through breeding programmes.

Conclusions

Ce travail est le premier rapport sur la comparaison de la composition chimique de la biomasse mycélienne et du sporophore d'A. subrufescens en utilisant l'analyse en phase solide par Résonance Magnétique Nucléaire du 13 C (RMN 13 C).

Dans cette étude, le mycélium a été identifié comme une biomasse plus riche en polysaccharides que les sporophores. Cette information peut être d'utilité pour la recherche de composés à effet thérapeutique.

-glucanes sont des composés d'intérêt thérapeutique comme l'indique la littérature [START_REF] Angeli | Beta-glucan extracted from the medicinal mushroom Agaricus blazei prevents the genotoxic effects of benzo[a]pyrene in the human hepatoma cell line HepG2[END_REF][START_REF] Camelini | Structural characterization of beta-glucans of Agaricus brasiliensis in different stages of fruiting body maturity and their use in nutraceutical products[END_REF][START_REF] Cha | Antitumor and immuno-potentiating activities of crude polysaccharides from fruiting body of Agaricus brasiliensis[END_REF]. Les produits d'A. subrufescens vendus dans le commerce peuvent être d'origine mycélienne ou provenir de sporophores. Plusieurs travaux ont été focalisés sur la production de biomasse mycélienne en fermenteur (milieu liquide) pour l'obtention de polysaccharides d'A. subrufescens [START_REF] Chin-Hang | Effects of culture pH on the production of bioactive polysaccharides by Agaricus blazei in batch cultures[END_REF], 2007 ;[START_REF] Ha-Yull | Isolation and characterization of a water-soluble polysaccharide from the mycelia of solid cultured Agaricus blazei Murill[END_REF][START_REF] Shu | Medium optimization for producing bioactive exopolysaccharides by Agaricus brasiliensis S. Wasser et al. (=A. blazei Murrill ss. Heinem) in submerged culture[END_REF].

Que ce soit pour le mycélium ou pour le sporophore, les spectres RMN n'ont pas montré de différences qualitatives au niveau des pics entre les différentes souches étudiées. Le rendement des cultivars d'A. subrufescens observé dans cette étude a été similaire à ceux rapportés dans la littérature pour des cultures effectuées au Brésil avec des substrats locaux [START_REF] Minhoni | Cultivo de Agaricus blazei Murril ss[END_REF]Zied et al., 2009a). Plusieurs travaux réalisés au Brésil ont été menés avec les cultivars pour augmenter leur rendement en modifient le compost et la terre de gobetage [START_REF] Colauto | Alternative to peat for Agaricus brasiliensis yield[END_REF]Zied et al., 2009b[START_REF] Zied | Production of Agaricus blazei ss. Heinemann (A. brasiliensis) on different casing layers and environments[END_REF][START_REF] Zied | Medicinal mushroom growth as affected by non-axenic casing soil[END_REF], mais ils sont encore très faibles par rapport aux rendements d'A. bisporus. Dans toutes les conditions testées ici, les souches sauvages ont montré une meilleure performance que les cultivars, avec un rendement de 17 à 24% proche du rendement commercial d'A. bisporus qui est de 25 à 41% selon [START_REF] Kariaga | Imporatant factors in composting for production of high yields in button mushroom and Agaricus bitorquis (Quel) Saccardo[END_REF]. Cependant, les cultivars ont montré un rendement plus élevé que celui rapporté pour les cultures brésiliennes (8-16%) [START_REF] Zied | Production of Agaricus blazei ss. Heinemann (A. brasiliensis) on different casing layers and environments[END_REF]. La variabilité phénotypique observée chez A. subrufescens dans cette étude peut être utilisée pour l'amélioration de la production. [START_REF] Smiderle | Agaricus bisporus and Agaricus brasiliensis (1 )--dglucans show immunostimulatory activity on human THP-1 derived macrophages[END_REF][START_REF] Angeli | Beta-glucan extracted from the medicinal mushroom Agaricus blazei prevents the genotoxic effects of benzo[a]pyrene in the human hepatoma cell line HepG2[END_REF][START_REF] Blafkova | Chitin-glucan complex from Agaricus blazei, a potential raw material for production of food additives[END_REF]Camelini et al., 2005 ;[START_REF] Ha-Yull | Isolation and characterization of a water-soluble polysaccharide from the mycelia of solid cultured Agaricus blazei Murill[END_REF], ce qui rend intéressante la quantité de ce polysaccharide contenu dans le champignon. Cependant, les cultivars ont montré une vitesse d'accroissement mycélien plus élevée que celle des souches sauvages, tandis que ces dernières ont eu un rendement plus important. Par conséquent, plus d'études sont nécessaires pour identifier la meilleure source de polysaccharides de qualité.

Les activités antioxydantes des échantillons ont montré une variabilité intra spécifique et séparent les cultivars des souches sauvages, les premiers ayant une activité plus élevée.

Malgré cette différence d'activité, toutes les souches ont une activité antioxydante importante en considérant que des valeurs EC 50 au-dessus de 10 mg mL -1 sont considérées comme importantes [START_REF] Mau | Antioxidant properties of methanolic extracts from Grifola frondosa, Morchella esculenta and Termitomyces albuminosus mycelia[END_REF].

L'activité antioxydante est un critère important pour identifier un aliment thérapeutique ou une source de composés antioxydants naturels. Les souches les plus productives comme CA438-A et CA487 représentent un matériel intéressant pour ses propriétés antioxydantes.

Les fortes activités antioxydantes observées dans les primordia représentent une avancée au niveau cognitif. Cependant, au niveau pratique, ils peuvent être moins intéressants car ils ne représentent pas une biomasse aussi importante que les sporophores.

Dans ce travail, une variation de l'activité antioxydante a été identifiée en fonction des lots de compost, c'est-à-dire que la qualité des matériaux de base peut avoir un effet sur les activités antioxydantes. D'autres études sont nécessaires pour préciser les composés qui induisent ces modifications. Les activités antioxydantes n'ont pas été mesurées dans le mycélium. Cette estimation permettrait de voir si le mycélium, qui se produit très bien en fermenteur [START_REF] Han | Optimization of submerged culture conditions for mycelial growth and exopolysaccharides production by Agaricus blazei[END_REF]) est un meilleur matériau que le sporophore pour valoriser cette propriété.

Conclusions et perspectives

Biology, chemical characterization and antioxidant activities of the culinary medicinal mushroom Agaricus subrufescens

SUMMARY

Agaricus subrufescens is becoming a mushroom of interest because of its medicinal properties. Commercial production had developed in tropical countries using local materials. However, data available in the literature referred to cultivars that are genetically similar. Our study of a set of cultivars and wild strains led to a better understanding of the biology of the species. Contrary to cultivars, wild strains exhibited a high level of genetic polymorphism. High phenotypic variability was identified in mycelial growth, productivity and morphology. Chemical analyses by solidstate 13 C NMR and antioxidant activities showed that the wild strains as well as the cultivars proved a valuable source of functional food to prevent cardiovascular diseases, cancers and diabetes. Using cultivation substrate produced for A. bisporus and modifying cultivation conditions allowed fruiting of A. subrufescens, then increase in strain yield and optimization of agronomic traits of interest.

Wild material with good antioxidant activity and high productivity was identified. The evaluation of intercontinental hybrids showed the possibility to transfer traits of interest to offspring. A. subrufescens could be proposed to French mushroom growers as an alternative to Agaricus bisporus during the summer season.

Keywords: Antioxidant, biodiversity, cultivation, quality.

  Contrairement aux cultivars, les souches sauvages présentent un haut niveau de polymorphisme génétique. Une variabilité phénotypique élevée a été mise en évidence pour l'accroissement mycélien, la productivité et la morphologie. Des analyses chimiques par RMN du solide et l'estimation des activités anti-oxydantes ont montré que les souches sauvages comme les cultivars sont une source à exploiter comme aliment fonctionnel pour prévenir les maladies cardio-vasculaire, les cancers et le diabète. L'adaptation des conditions culturales à partir du substrat utilisé pour la culture d'A. bisporus a permis d'obtenir des fructifications d'A. subrufescens, puis d'augmenter le rendement et d'optimiser des caractères agronomiques d'intérêt. Du matériel sauvage avec une activité antioxydante et un rendement élevés a été identifié. L'évaluation d'hybrides intercontinentaux a montré la possibilité de transférer des caractères d'intérêt à une descendance. Agaricus subrufescens pourrait être proposé aux champignonnistes français comme alternative à Agaricus bisporus pendant la saison estivale. Mots clés : Antioxydant, biodiversité, qualité, rendement.

FIGURESFigure 1 . 1 .

 11 FIGURES

Figure 1 . 3 .

 13 Figure 1.1. Sporophores d'Agaricus subrufescens à chapeau brun doré caractéristique des cultivars ………………………….…………………… Figure 1.2. Voile floconneux caractéristique d'Agaricus subrufescens.Figure 1.3. Diagramme représentatif du processus de production d'Agaricus bisporus (champignon de Paris) ………………………….………………………… Figure 1.4. Génération d'une ligne blanche entre la tolaasine produite par Pseudomonas tolaasii et le WLIP produit par Pseudomonas reactans …... Figure 1.5. Taches brune et jaune produites par Pseudomonas tolaasii chez Agaricus bisporus (A) et Pleurotus ostreatus (B) ………………………………….. Figure 1.6. Trichoderma aggressivum f. aggressivum vu au microscope ……………..Figure 1.7. Compost envahi par Trichoderma aggressivum …………………………..Figure 1.8. Lecanicillium fungicola vu au microscope ………………………………..Figure 1.9.Culture d'Agaricus bisporus contaminée par Lecanicillium fungicola ……

Figure 1 . 7 .

 17 Figure 1.1. Sporophores d'Agaricus subrufescens à chapeau brun doré caractéristique des cultivars ………………………….…………………… Figure 1.2. Voile floconneux caractéristique d'Agaricus subrufescens.Figure 1.3. Diagramme représentatif du processus de production d'Agaricus bisporus (champignon de Paris) ………………………….………………………… Figure 1.4. Génération d'une ligne blanche entre la tolaasine produite par Pseudomonas tolaasii et le WLIP produit par Pseudomonas reactans …... Figure 1.5. Taches brune et jaune produites par Pseudomonas tolaasii chez Agaricus bisporus (A) et Pleurotus ostreatus (B) ………………………………….. Figure 1.6. Trichoderma aggressivum f. aggressivum vu au microscope ……………..Figure 1.7. Compost envahi par Trichoderma aggressivum …………………………..Figure 1.8. Lecanicillium fungicola vu au microscope ………………………………..Figure 1.9.Culture d'Agaricus bisporus contaminée par Lecanicillium fungicola ……

Figure 1 . 8 .

 18 Figure 1.1. Sporophores d'Agaricus subrufescens à chapeau brun doré caractéristique des cultivars ………………………….…………………… Figure 1.2. Voile floconneux caractéristique d'Agaricus subrufescens.Figure 1.3. Diagramme représentatif du processus de production d'Agaricus bisporus (champignon de Paris) ………………………….………………………… Figure 1.4. Génération d'une ligne blanche entre la tolaasine produite par Pseudomonas tolaasii et le WLIP produit par Pseudomonas reactans …... Figure 1.5. Taches brune et jaune produites par Pseudomonas tolaasii chez Agaricus bisporus (A) et Pleurotus ostreatus (B) ………………………………….. Figure 1.6. Trichoderma aggressivum f. aggressivum vu au microscope ……………..Figure 1.7. Compost envahi par Trichoderma aggressivum …………………………..Figure 1.8. Lecanicillium fungicola vu au microscope ………………………………..Figure 1.9.Culture d'Agaricus bisporus contaminée par Lecanicillium fungicola ……

Figure 1 . 9 .

 19 Figure 1.1. Sporophores d'Agaricus subrufescens à chapeau brun doré caractéristique des cultivars ………………………….…………………… Figure 1.2. Voile floconneux caractéristique d'Agaricus subrufescens.Figure 1.3. Diagramme représentatif du processus de production d'Agaricus bisporus (champignon de Paris) ………………………….………………………… Figure 1.4. Génération d'une ligne blanche entre la tolaasine produite par Pseudomonas tolaasii et le WLIP produit par Pseudomonas reactans …... Figure 1.5. Taches brune et jaune produites par Pseudomonas tolaasii chez Agaricus bisporus (A) et Pleurotus ostreatus (B) ………………………………….. Figure 1.6. Trichoderma aggressivum f. aggressivum vu au microscope ……………..Figure 1.7. Compost envahi par Trichoderma aggressivum …………………………..Figure 1.8. Lecanicillium fungicola vu au microscope ………………………………..Figure 1.9.Culture d'Agaricus bisporus contaminée par Lecanicillium fungicola ……

Figure 3 . 2 .

 32 Figure 3.1. Culture de Pseudomonas tolaasii sur milieu B de King ………………….Figure 3.2. Barquette contenant 160 g de seigle envahi par le mycélium d'Agaricus subrufescens ………………………….…………………………………… Figure 3.3. Barquettes contenant 0,5 kg de compost, utilisées pour la production d'Agaricus subrufescens à petite échelle …………………………………. Figure 3.4. Paniers contenant 8 kg de compost, utilisés pour la production d'Agaricus subrufescens à moyenne échelle ……………………………... Figure 3.5. Exemple d'électrophérogramme d'un ensemble multiplex SubSSR obtenu avec le logiciel GeneMapper pour un génotype d'Agaricus subrufescens (d'après Foulongne-Oriol et al. 2012b) …………………………. Figure 3.6. Développement du mycélium d'Agaricus subrufescens sur milieu cristomalt gélosé ………………………….………………………………. Figure. 3.7. Barquettes (Microbox, Combiness, Belgique) avec filtre d'aération pour le développement du mycélium ………………………….………………. Figure 3.8. Effet de l'angle et de la vitesse de rotation du rotor sur la qualité du spectre RMN obtenu. (d'après Grandinetti, www.encconference.org/portal/0/ Tutorial Grandinetti.pdf) ………………………..

Figure 4 . 1 .

 41 Figure 4.1. Dendrogramme des distances génétiques entre les 25 souches d'A. subrufescens, basées sur la méthode d'analyse UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Analysis) à partir des résultats des marqueurs SSR ………………………….………………………………...

Figure 5 . 1 .

 51 Figure 5.1. Développement mycélien de T. aggressivum en absence d'extrait d'A. subrufescens (A), en présence d'amphotéricine (antifongique commercial) (B) et d'extrait chaud (C) et froid (D) de CA487 …………...

Figure 6 . 1 .

 61 Figure 6.1. Exemple de spectres RMN en phase solide obtenus avec du mycélium et des sporophores d'Agaricus subrufescens ………………………………... Figure 6.2. Echantillons analysés dans l'article 7 pour l'activité antioxydante chez Agaricus subrufescens ………………………….………………………

Figure 1 . 1 .

 11 Figure 1.1. Sporophores d'Agaricus subrufescens à chapeau brun doré caractéristique des cultivars (Photo INRA MycSA).

Figure 1 . 2 .

 12 Figure 1.2. Voile floconneux caractéristique d'Agaricus subrufescens (Photo INRA MycSA).

  d'A. subrufescens et le marché pendant la période 2001-2009 sont présentés dans l'article 1. Récemment, Chang et Wasser ( 2012) ont rapporté une production en Chine de 42, 43,6 et 47 tonnes d'A. brasiliensis déshydraté dans les années 2003, 2005 et 2007 respectivement, ce qui correspond à une quantité plus élevée que celle indiquée pour le Brésil en 2006-2007 avec 40

Figure 1 . 3 .

 13 Figure 1.3. Diagramme représentatif du processus de production d'Agaricus bisporus (champignon de Paris). (Photos INRA, MycSA).

Figure 1 . 4 .Figure 1 . 5 .

 1415 Figure 1.4. Generation d'une ligne blanche entre la tolaasine produite par Pseudomonas tolaasii et le WLIP produit par Pseudomonas reactans. (Photo INRA, MycSA)

1. 1 . 7 . 3 .

 173 La môle sèche causée par Lecanicillium fungicolaLa moisissure Lecanicillium fungicola (anciennement Verticillium fungicola) (Figure1.8) est responsable de 8 à 10% de pertes lors d'attaques de cultures d'A. bisporus.

Figure 1 . 6 .

 16 Figure 1.6. Trichoderma aggressivum f. aggressivum vu au microscope. (Photo INRA, MycSA).

Figure 1 . 7 .

 17 Figure 1.7. Compost envahi par Trichoderma aggressivum. (Photo INRA, MycSA).

Figure 1 . 8 .

 18 Figure 1.8. Lecanicillium fungicola vu au microscope. (Photo INRA, MycSA).

Figure 1 . 9 .

 19 Figure 1.9.Culture d'Agaricus bisporus contaminée par Lecanicillium fungicola. (Photo INRA, MycSA).

  Brésil et qui sont actuellement produits et commercialisés comme champignon médicinal dans différents pays. Les quelques articles faisant référence à des origines sauvages ne concernent que l'identification d'A. subrufescens dans ces régions. De nouvelles souches d'A. subrufescens sauvages sont indispensables pour apporter de la biodiversité.

Chapitre 2 .

 2 Objectifs et démarche L'étude bibliographique présentée dans le chapitre précédent montre que les travaux publiés portent essentiellement sur la biologie, la culture et l'aspect thérapeutique de cultivars d'A. subrufescens d'origine brésilienne. L'amélioration quantitative et qualitative de la culture de ce champignon peut s'appuyer sur l'amélioration génétique qui fait appel au développement de connaissances sur la variabilité intra-spécifique pour le rendement, la résistance aux maladies, la qualité nutritionnelle et la teneur en composées bioactifs. La "Collection du Germoplasm des Agarics à Bordeaux" (BGCM) comprend des cultivars brésiliens d'A. subrufescens mais aussi des isolats sauvages provenant du continent américain, d'Europe, et récemment d'Asie. Cette collection offre une opportunité pour l'étude de la diversité à l'intérieur de l'espèce afin d'améliorer les connaissances sur la biologie et la reproduction qui pourraient être mises en pratique plus tard pour la création de nouvelles souches commerciales. Les objectifs de ce travail sont de contribuer à la connaissance de la biologie d'A. subrufescens pour l'adaptation de la culture en régions tempérées à partir des souches de différentes origines géographiques, et d'identifier celles qui présentent un intérêt agronomique et thérapeutique. Pour atteindre les objectifs fixés, la démarche comporte trois axes : L'estimation de la diversité génétique et phénotypique des cultivars et des souches sauvages. L'optimisation de la culture d'Agaricus subrufescens. La caractérisation chimique des souches et la recherche de propriétés antioxydantes. Le premier axe vise à déterminer la variabilité génétique et phénotypique des souches pour identifier le potentiel des isolats européens d'A. subrufescens comme une source de nouvelles caractéristiques pour améliorer le rendement, la qualité et les propriétés des champignons. La littérature fait référence à un nombre limité de cultivars commerciaux disponibles, mais génétiquement similaires. Cette absence de diversité génétique représente un risque d'épidémies dans les cultures en cas d'attaque par des pathogènes en raison d'une réponse semblable des cultivars face à l'infection, et du fait de l'absence de souches de substitution moins sensibles. L'étude de la variabilité génétique et phénotypique doit permettre d'identifier des souches présentant des caractères d'intérêt. La capacité de fructification dans différents conditions de culture (présentées dans le deuxième axe) été prise en compte pour la comparaison des souches. En complément, des études ont été réalisées in vivo et in vitro sur l'interaction entre A. subrufescens et des pathogènes d'agarics pour connaitre la réponse physiologique des isolats aux maladies. La démarche pour cette partie a été la suivante:

  base pour l'étude des paramètres permettant d'optimiser la production d'A. subrufescens. Pour répondre à cette question, un dispositif de culture qui permet de contrôler et d'enregistrer les paramètres physiques (lumière, humidité, température, ventilation, CO 2 , O 2 ) a été utilisé ainsi que le pourcentage de semence dans le substrat, la présence ou l'absence de lumière, la quantité et la composition de la terre de couverture. Le premier et le second axe sont présentés dans les chapitres 4 et 5. Le troisième axe concerne la caractérisation chimique et l'estimation des propriétés antioxydantes chez A. subrufescens. Ce champignon est connu comme un champignon médicinal mais aussi comme un aliment fonctionnel grâce à la qualité et à la quantité de polysaccharides. L'analyse en résonnance magnétique nucléaire (RMN) du carbone 13 offre une approche globale permettant d'observer les échantillons d'A. subrufescens dans leur état brut et de donner la proportion des groupes fonctionnels. Cette analyse donne également la possibilité d'identifier des marqueurs pour la détermination de certains polymères d'intérêt médicinal, par exemple les polysaccharides. Les cultivars d'A. subrufescens sont considérés comme une source riche en antioxydants naturels, mais à notre connaissance il n'existe pas de travaux sur l'activité antioxydante de souches sauvages. L'activité antioxydante de différentes souches a été comparée pour mettre en évidence les caractéristiques des ressources sauvages, en comparaison avec celle des cultivars.

3 . 1 . 2 .

 312 Agaricus subrufescens Les souches d'A. subrufescens utilisées dans ce travail appartiennent à la collection de Germoplasm des Agarics de Bordeaux (CGAB), INRA-Bordeaux. Les origines des souches et leur code sont présentés dans le tableau 3.1. L'hybride CA454-3 x CA487-100 (Tableau 3.2) a été créé par E. Huang et P. Callac à partir de deux isolats monospores homocaryotiques obtenus à partir respectivement de la souche brésilienne CA454 et de la souche française CA487. L'ensemble de ces souches a été utilisé pour vérifier leur aptitude à fructifier (petite échelle), estimer leur croissance mycélienne in vitro et leur variabilité génétique. Par la suite, les différents critères ont été étudiés sur un groupe formé de 3 cultivars (CA561, CA565, CA570), la souche CA454 considérée à l'origine des cultivars, trois souches sauvages européennes (CA438-A, CA487 et CA643) génétiquement différentes (cf. chapitre 4), et l'hybride CA454-3 x CA487-100. Des hybrides intercontinentaux entre la souche française CA487 et la souche brésilienne CA454, et des hybrides européens entre CA487 et la souche espagnole CA438-A (Tableau 3.2) ont été mis en culture pour des premiers essais de recherche dx 454-3 438-A -12 x 487-42 487-42 x 454-4 487-100 x 454-4 487-125 x 454-4 438-A -12 x 487-125 438-A -12 x 487-35 Les souches sont conservées à l'état mycélien à 12 °C, en tubes sur milieu extrait de compost et recouvertes avec de l'huile minérale. Pour la réactivation des souches, un implant est mis dans une boîte de Petri contenant de l'extrait de compost et l'ensemble est incubé à 25 °C. Après développement de la colonie mycélienne, deux repiquages successifs suivis d'une incubation à 25 °C pendant 15 jours sont effectués avant utilisation pour les diverses expérimentations. Les agents pathogènes La moisissure Trichoderma aggressivum (souche TriB) et la bactérie Pseudomonas tolaasii (souche CNBP2152, collection CNBP, INRA, Angers, France) font partie de la collection des micro-organismes de l'UR MycSA, INRA, Bordeaux. Ils sont conservés dans l'azote liquide, et une semaine avant l'expérimentation, ils sont décongelés à 36 °C pendant 5 minutes, placés sur gélose nutritive et incubés à 25 °C, puis repiqués. La moisissure est cultivée sur milieu malt gélosé et la bactérie sur milieu B de King gélosé (King et al. 1954).

  Euromycel. Des barquettes munies d'un filtre d'aération (Microbox, Combiness, Belgique) (Figure 3.2) sont remplies avec 160g de grain, stérilisées une heure à 120 °C et laissées refroidir à température ambiante. Le grain est inoculé avec du mycélium d'A. subrufescens développé sur milieu cristomalt solide (le contenu d'une boîte de Petri par barquette). L'ensemble est incubé à 25 °C pendant environ 3 semaines jusqu'à envahissement du grain. Une fois prêt, le blanc est conservé à 19 °C et utilisé dans un délai inférieur à 3 semaines.

Figure 3 . 1 .

 31 Figure 3.1. Culture de Pseudomonas tolaasii sur milieu B de King (Photo INRA, MycSA).

Figure 3 . 2 .

 32 Figure 3.2. Barquette contenant 160 g de seigle envahi par le mycélium d'Agaricus subrufescens (Photo INRA, MycSA).

  photopériode et variations de température pendant la fructification) selon les modalités décrites dans les articles 2 et 4 (chapitre 4), afin d'optimiser la production.

Figure 3 . 3 .

 33 Figure 3.3. Barquettes contenant 500 g de compost, utilisées pour la production d'Agaricus subrufescens à petite échelle (Photo INRA, MycSA).

Figure 3 . 4 .

 34 Figure 3.4. Paniers contenant 8 kg de compost, utilisés pour la production d'Agaricus subrufescens à moyenne échelle (Photo INRA, MycSA).

L

  'ensemble des souches (Tableau 3.1) est utilisé dans cette étude. Les souches sont cultivées sur milieu cristomalt. L'extraction d'ADN génomique des échantillons de mycélium lyophilisé est réalisée avec le kit Nucleon Phytopure (GE Healthcare) en suivant les instructions du fabricant. La qualité et la quantité de l'ADN sont évaluées en utilisant un spectrophotomètre Nanodrop® ND-1000. Pour la PCR, les échantillons d'ADN sont calibrés à une concentration de 25 ng µl -1 . Les marqueurs microsatellites ou SSR (single sequence repeat) utilisés dans ce travail ont été développés par Foulongne-Oriol et al. (2012b). Vingt-deux marqueurs SSR (Tableau 3.3) ont été utilisés pour le génotypage des souches. Les conditions d'amplification et d'électrophorèse sur séquenceur ABI 3130 (Applied Biosystems) ont été définies par Foulongne-Oriol et al. (2012b). Les profils des électrophérogrammes (Figure 3.5) sont lus manuellement et à l'aide du logiciel GENEMAPPER™ version 4.0 pour attribuer les pics aux allèles correspondants.

Figure 3 . 5 .

 35 Figure 3.5. Exemple d'électrophérogramme d'un ensemble multiplex SubSSR obtenu avec le logiciel GeneMapper pour un génotype d'Agaricus subrufescens (d'après Foulongne-Oriol et al. 2012). Six microsatellites (SubSSR66, SubSSR41, SubSSR10, SubSSR46, SubSSR47, SubSSR50) sont amplifiés simultanément en fonction de l'ordre de leur taille d'allèles et de la couleur de leur fluorescence (6-FAM = bleu, PET = rouge, VIC = vert et NED = jaune (pics noirs)). Le standard interne GeneScanTM-600 LIZ (pics orange) est utilisé pour estimer la taille des allèles.

Figure 3 . 6 .

 36 Figure 3.6. Développement du mycélium d'Agaricus subrufescens sur milieu cristomalt gélosé (Photo INRA, MycSA).

Figure. 3 . 7 .

 37 Figure. 3.7. Barquettes (Microbox, Combiness, Belgique) avec filtre d'aération pour le développement du mycélium (Photo INRA, MycSA)

3. 5 .

 5 Caractérisation chimique d'A. subrufescens par Résonance MagnétiqueNucléaire du Solide sur le Carbone 13La haute qualité des polysaccharides chez A. subrufescens représente un des aspects importants comme aliment fonctionnel.L'analyse par résonance magnétique nucléaire offre une approche holistique qui permet d'analyser les échantillons dans leur état natif. Cet outil permet d'identifier des marqueurs chimiques(Pizoferrato et al., 2000) pour déterminer l'effet du type de biomasse (mycélium ou corps fructifère), le stade de développement du corps fructifère, les conditions de culture et la diversité génétique sur les concentrations de groupes fonctionnels associés à des polymères constituants de la biomasse fongique. 3.5.1. Résonance Magnétique Nucléaire du 13 C par polarisation croisée et rotation à l'angle magique ( 13 C CP/MAS NMR). Des analyses chimiques du pourcentage de groupes carboxyliques ont été faites à partir de mycélium et de sporophores d'A. subrufescens. La préparation des échantillons et les paramètres utilisés pour l'analyse par Résonance Magnétique Nucléaire du 13 C par polarisation croisée et rotation à l'angle magique ( 13 C CP/MAS NMR,) sont décrits dans l'article 6 (chapitre 5). La technique de rotation à l'angle magique (rotor incliné de 54,74° par rapport au champ magnétique) et à une fréquence élevée (10 kHz dans notre travail) permet d'obtenir des spectres qui séparent les espèces chimiques en fonction de leur déplacement chimique (Figures 3.8). Dans les solides, les spins abondants ( 1 H) sont proches des spins rares ( 13 C) et sont couplés par interaction dipolaire. Le principe de la 13 C CP/MAS NMR est le suivant : les spins abondants ( 1 H) sont excités, leur magnétisation est transférée aux spins rares ( 13 C) via le couplage, et le signal est enregistré.

Figure 3 . 8 .

 38 Figure 3.8. Effet de l'angle et de la vitesse de rotation du rotor sur la qualité du spectre RMN obtenu. (d'après Grandinetti, www.enc-conference.org/portal/0/Tutorial Grandinetti.pdf)

Figure 4 . 1 .

 41 Figure 4.1. Dendrogramme des distances génétiques entre 25 souches d'A. subrufescens, basées sur la méthode d'analyse UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Analysis) à partir des résultats des marqueurs SSR. s = souche sauvage, c = cultivar, ? = cultivar supposé.* Souches retenues pour l'ensemble des études de variabilité et de production.

Figure 1 :

 1 Figure 1: Distribution of the mycelium growth rate at five incubation temperatures.x : ATCC 76739, o : hybrid. Within a same group of strains, growth rate distributions with a same letter did not differ significantly at p = 0.05.

Figure 2 :

 2 Figure 2: Radial growth rate observed at 25°C after previous 14-day incubation at 35°C compared to (A) radial growth at 35 °C and (B) radial growth at 25°C with no pre-incubation. A. subrufescens

Figure 3 :

 3 Figure 3: Concentrations in hydrogen peroxide and biomass produced by the Brazilian cultivars and the wild strains. A. subrufescens

Figure 4 :

 4 Figure 4: Mushroom yield after a 65-day fruiting period. A: small scale experiment; B: comparison of the small and medium scale experiment. Data for medium scale are means of 2 to 4 experiments of 4 replicates

Figure 5 :

 5 Figure 5: Time to fruiting (in days after casing) of the cultivars and the wild strains: (A) small scale experiments; (B) comparison of small scale and medium scale experiments.

Fgure 7 :Figure 8 :

 78 Figure 8: Veil of cultivar (A) and wild strain (B).

Figure 6 :

 6 Figure 6: Mean weight of sporophores: (A) produced in small scale experiment and (B).comparison of small scale and medium scale experiments

  d'A. subrufescens à T. aggressivum et P. tolaasii ainsi que la mise en évidence d'effets inhibiteurs ou stimulants vis-à-vis de ces pathogènes dans des extraits hydrophiles de mycélium et de sporophore (Figure 5.1).

Figure 5 . 1 .

 51 Figure 5.1. Développement mycélien de T. aggressivum en absence d'extrait d'A. subrufescens (A), en présence d'amphotéricine (antifongique commercial) (B) et d'extrait chaud (C) et froid (D) de CA487. (Photo INRA, MycSA).

  Photoshop CS5. Data are means of six replicates.

Figure 1 .

 1 Figure 1. Experiment design for confrontation between T. aggressivum and A. subrufescens.

Figure 3 .

 3 Figure 3. Blotch symptoms developed on the cap surface of two A. subrufescens strains.

  Neves M.A. Kasuya MCM, Araújo E, Leite CL,Camelini CM, Ribas LCC, Mendonça MM (2005) Physiological and genetic variability of commercial isolates of culinary-medicinal mushroom Agaricus brasiliensis S. Olivier JM,Mamoun M, Munsch P (1997) Standardization of a method to assess mushroom blotch resistance in cultivated and wild Agaricus bisporus strains. Can J Plant pathol 19: 36-42. Savoie JM, Iapicco R, Largeteau-Mamoun ML (2001) Factors influencing the competitive saprophytic ability of Trichoderma harzianum Th2 in mushroom (Agaricus bisporus) compost. Mycol Res. with Trichoderma aggressivum f. europaeum isolates on the yielding of some wild strains of Agaricus bitorquis from different regions of Poland. Phytopathologia 58:5-11 Soler-Rivas C, Jolivet S, Arpin N, Olivier JM, Wichers HJ (1999) Biochemical and physiological aspects of brown blotch disease of Agaricus bisporus. FEMS Microbiol Rev 23:591-614 5.3. Conclusions L'article 5 montre que la surface de compost colonisée par T. aggressivum a été légèrement inférieure lorsque la moisissure était en compétition avec deux souches sauvages alors que les mêmes niveaux très élevés d'occupation de l'espace ont été observés en présence du mycélium des deux autres souches sauvages et des cultivars. Trichoderma aggressivum peut donc potentiellement causer des pertes importantes dans la culture. Globalement les extraits aqueux d'A. subrufescens n'ont pas eu un effet protecteur visà-vis du développement mycélien de la moisissure, à part un extrait qui a montré une inhibition similaire à l'inhibiteur commercial. Toutefois, l'effet d'extraits des deux souches sauvages les moins sensibles, qui n'ont pas pu être obtenus dans le temps imparti pour ce travail, doit être connu avant de confirmer l'absence d'effet protecteur de tels extraits, ce que la sensibilité des souches laisse supposer. Cette étude est en cours. La sensibilité des sporophores à l'agent de la tache brune a été variable selon les souches, mais globalement faible. Des différences par rapport à la réponse chez A. bisporus (couleur de la tache, absence de relation entre la couleur du chapeau et la sensibilité à la bactérie) sont analysées dans la discussion générale. Les extraits aqueux d'A subrufescens ont montré une inhibition de P. tolaasii par apport au traitement témoin, mais à un niveau plus faible qu'un cocktail d'antibiotiques. Cependant, la forte tolérance de l'ensemble des souches étudiées laisse supposer qu'il pourrait s'agir d'un caractère intrinsèque chez A. subrufescens. Il ne semble donc pas nécessaire d'envisager la recherche de moyens de lutte contre la tache bactérienne pour les cultures d'A. subrufescens, mais l'effet antibiotique observé pourrait être utilisé, après concentration des extraits, pour une protection des cultures d'autres champignons contre cette maladie. La souche CA918 est l'une des moins sensibles à T. aggressivum et s'est montrée résistante dans le test in vivo face à P. tolaasii. Même si cette souche pourrait révéler une faible sensibilité à la bactérie dans d'autres conditions de culture, elle représente un premier matériel intéressant pour la culture. L'identification de nouvelles souches moins sensibles à T. aggressivum est nécessaire. Le comportement des quelques souches sauvages testées ici supporte l'hypothèse qu'il sera possible de trouver du matériel sauvage présentant une meilleure tolérance à la moisissure verte.

6. 2 . 1 .

 21 Caractérisation chimiqueLa caractérisation chimique des biomasses fongiques d'A. subrufescens par RMN du solide du carbone 13 est présentée dans l'article 6. Ce travail décrit l'analyse chimique de la biomasse mycélienne et des corps fructifères d'A. subrufescens à l'état commercial (chapeau fermé). Ma contribution à ce travail a consisté d'abord à préparer les échantillons à partir de sporophores puis une fois les spectrogrammes des échantillons obtenus, à participer à leur lecture (calcul des surfaces des pics, en particulier dans la région des polysaccharides, Figure6.1) ainsi qu'aux analyses statistiques des données, et ultérieurement, à rechercher la bibliographie pour discuter les rapports des surfaces des pics protéines / polysaccharides dans les échantillons.

Figure 6 . 1 .

 61 Figure 6.1. Exemple de spectres RMN-13 C en phase solide obtenus avec du mycélium et des sporophores d'Agaricus subrufescens.

2 .

 2 figure donnant une impression visuelle du travail effectué. La figure 6.2 est proposée pour illustrer l'article 7.

Figure 6 . 2 .

 62 Figure 6.2. Echantillons analysés dans l'article 7 pour l'activité antioxydante chez Agaricus subrufescens. (Photos INRA, MycSA)

  . subrufescens strains. Eight strains were analysed: three cultivars (CA561, CA565 and CA570) kept in the Collection of Germplasms of Agarics in Bordeaux (CGAB), INRA-Bordeaux, since 2007; CA454 kept in the CGAB collection since 2006; three wild European strains of A. subrufescens (CA438-A, CA487 and CA643); and one hybrid provided by E.

  methanol HPLC gradient grade. The effective concentration at which DPPH radicals were scavenged by 50 % (EC 50 value expressed as mg extracted mushroom powder mL -1 reactive mixture) was obtained by interpolation from linear regression of absorbance measured with different concentrations of extracts. The percent DPPH radical scavenging effect was calculated according to the following equation: Radical scavenging activity (%) = [(A control -A sample ) / A control ] x 100

Figure 1 .

 1 Figure 1. Comparison of DPPH radical scavenging activity (A) and reducing power (B) of the A. subrufescens strains on two different batches of compost. Dark bars = experiment 1, white bars = experiment 2. * = significant difference between the two experiments at p<0.05, Duncan's test.

  using a mix of ethanol:water (70:30) for extraction. On the other hand, Soares et al.23 have observed EC 50 values of 3.0 and 3.2 mg of extract mL -1 for young and mature sporophores respectively, using methanol as extraction solvent. In the present work we expressed the activities as EC 50 per mg of dry powder of mushroom used for obtaining the extract, because it takes into account the extraction rate and it is more representative of the use of mushrooms as functional food. By a rapid conversion of the published data, we stated that the ranges of antioxidant activity observed herein among the eight strains showed efficient abilities compared to other works.

L 7 . 2 . 7 . 3 .

 7273 'hybride intercontinental CA487-100 x CA454-3 a été testé dans la majeure partie des essais. Il a montré des caractéristiques intermédiaires par rapport à celles de ses deux parents pour la croissance mycélienne in vitro et in vivo, la précocité, le rendement et l'activité antioxydante. Il représente la possibilité d'améliorer la qualité et la performance en culture. L'hybride intracontinental H1X1, crée par[START_REF] Kerrigan | Agaricus subsrufescens mushroom plant named 'H1X1[END_REF] entre une souche du Brésil (I-101) et une des Etats Unies (SBRFG), a montré une amélioration de 4 jours pour la précocité et de 257% pour le rendement par rapport au parent SBRFG. Dans notre étude, l'hybride testé est entre 270 et 300% plus productif que son parent brésilien (CA454), mais moins productif que son parent français. Par contre, un autre hybride (CA487-42 x CA454-43) est aussi productif que son parent français, qui a un fort rendement. Cette étude sur des hybrides constitue un travail préliminaire qui montre qu'une amélioration des souches cultivées actuellement est possible grâce à du matériel nouveau d'origine sauvage. Le groupe de cultivars et des souches sauvages peuvent apporter des caractères différents. Par exemple, les souches sauvages montrent une précocité et un rendement plus élevés que les cultivars, tandis que les cultivars produisent des sporophores de poids moyen plus important. Les caractères de qualité (fermeté, calibre) sont recherchés pour la création d'hybrides, en conséquence, des hybrides intercontinentaux pourraient être plus intéressants que des hybrides intracontinentaux. Sensibilité face aux pathogènes La résistance des souches aux maladies est parmi les caractères d'intérêt à améliorer pour la culture des champignons comestibles. De plus, dans des conditions proches d'une culture monovariétale, comme c'est le cas pour A. subrufescens au Brésil, il existe un risque accru face aux maladies en raison d'une possibilité d'attaque massive liée à la faible biodiversité et à l'absence de matériel de remplacement. La recherche de nouveau matériel génétique est capitale pour le développement de souches moins sensibles. Les souches d'A. subrufescens ont montré de la variabilité dans la sensibilité à P. tolaasii, avec des réponses allant de résistante à moyennement sensible. Le nombre de souches testées est trop faible pour pouvoir généraliser et conclure à une sensibilité plus faible que celle observée chez A. bisporus. Des différences par rapport à la réponse chez A. bisporus ont été observées. La couleur de la tâche (jaune et non brune) s'explique par le fait qu'A. bisporus est un champignon rougissant, chez lequel la voie des mélanines intervient dans le brunissement après une blessure ou lors de la sénescence des tissus, tandis qu'A. subrufescens est un champignon jaunissant. D'autre part, chez A. bisporus, les souches brunes sont plus résistantes que les souches blanches du fait qu'un QTL de résistance à P. tolaasii est situé très près de l'allèle de la couleur brune du chapeau (Moquet et al. 1999). Par contre, aucune relation entre la couleur du chapeau et la sensibilité à la bactérie n'est observée chez A. subrufescens. Une importante colonisation du compost par Trichoderma aggressivum a été observée après 16 jours de confrontation, avec toutes les souches d'A. subrufescens. Mamoun et al. (2000a) ont observé que T. aggressivum colonise plus fortement le substrat et produit plus de spores en présence qu'en absence d'A. bisporus et que cette sporulation a un effet inhibiteur vis-à-vis du développement mycélien du basidiomycète. Dans le cas d'A. subrufescens, cette interaction n'est pas observée. Mais le plus important est que deux souches sauvages ont présenté une sensibilité moins forte que les autres, ce qui laisse supposer la possibilité de trouver du matériel intéressant dans la nature. Anderson et al. (2001) ont observé une résistance plus élevée chez des hybrides d'A. bisporus à chapeau brun en comparaison avec des hybrides à chapeau clair. Par contre, Mamoun et al. (2000b) n'ont pas observé de relation entre la couleur du chapeau et la sensibilité chez 25 souches sauvages d'A. bisporus. De même, dans cette étude, nous n'avons pas observé de relation liée à la couleur du chapeau. Ceci n'est pas surprenant, car T. aggressivum entre en compétition avec le mycélium végétatif pour la colonisation du compost, et n'est qu'un pathogène de faiblesse pour le sporophore. Le nombre de souches étudiées par Anderson et al. (2001), 3 brunes et 4 claires, et le fait que ces dernières soient apparentées, pourraient expliquer les résultats observés par ces auteurs. Analyse chimique et pouvoir antioxydant Le terme aliment fonctionnel attribué aux champignons comestibles est dû à leur valeur nutritive riche et leur teneur en élément(s) possédant des propriétés neutraceutiques ou thérapeutiques. Pour être considéré comme aliment fonctionnel, les conditions d'utilisation et la valeur nutritionnelle, la composition chimique ou la caractérisation moléculaire du produit doivent être connues (Vinhal Costa Orsine et al., 2012). A partir des résultats des analyses chimiques par RMN du 13 C en phase solide et des activités antioxydantes, les souches d'A. subrufescens étudiées peuvent être considérées comme un aliment fonctionnel riche en antioxydants et polysaccharides. Les analyses par RMN ont montré des différences qualitatives et quantitatives entre le mycélium et les sporophores. Le mycélium est plus riche en polysaccharides que les sporophores. Plusieurs études ont montré l'intérêt glucanes extraits d'A. subrufescens comme produits neutraceutiques et leur bénéfice pour la santé humaine

L

  'amélioration quantitative et qualitative de la culture du champignon comestible et médicinal Agaricus subrufescens Peck devrait pouvoir s'appuyer sur l'amélioration génétique qui pourra être mise en oeuvre suite au développement de connaissances sur la variabilité intra-spécifique pour le rendement, la résistance aux maladies, le potentiel comme aliment de haute qualité nutritionnelle et la teneur en des composées bioactifs. Des cultivars et des souches sauvages d'Agaricus subrufescens Peck de différentes origines géographiques ont été caractérisés génétiquement et phénotypiquement. Une importante variabilité intra spécifique a été observée pour plusieurs caractères d'intérêt pour la biologie de l'espèce et son utilisation. Les souches cultivées au Brésil ont montré une absence de polymorphisme, ce qui confirme leur origine commune probable. Elles ont montré de la variabilité phénotypique, mais les risques liés à une culture monovariétale demeurent. D'autre part cette étude a permis d'identifier un haut niveau de polymorphisme parmi les souches sauvages. L'introduction, dans les cultivars, de ce nouveau matériel génétique permettra d'obtenir des souches qui limiteront les risques de pertes massives de production causées par des maladies ou des stress environnementaux. Les approches génétiques et phénotypiques sont complémentaires pour la gestion optimale du matériel fongique avant d'entreprendre des travaux de création variétale avec pour objectif l'amélioration de l'espèce du point de vue agronomique et comme aliment fonctionnel. L'analyse phénotypique a montré que le potentiel pour les différents caractères d'intérêt varie avec la souche. Globalement, les souches sauvages ont montré une meilleure précocité et un plus fort rendement en culture que les cultivars, tandis que ces derniers produisent des champignons plus fermes et généralement plus gros. Par contre, le groupe de souches sauvages et le groupe de cultivars ne diffèrent pas significativement pour le pouvoir antioxydant et la sensibilité à la tache bactérienne. La création des hybrides européens ou intercontinentaux a démontré la capacité de transférer dans une descendance des caractères d'intérêt agronomiques et/ou biologique comme le rendement ou la couleur. Cependant, A. subrufescens est un champignon culinaire et médicinal, par conséquent, l'amélioration devra porter non seulement sur le rendement, mais aussi sur les propriétés telles que le pouvoir antioxydant et la teneur en composés d'intérêt neutraceutique et/ou thérapeutique. La caractérisation chimique d'A. subrufescens par RMN du solide ( 13 C) a montré qu'entre le mycélium et le sporophore, il existe des différences quantitatives et qualitatives au niveau des polysaccharides. Une purification des extraits devra être faite pour identifier ces polysaccharides et isoler ceux qui peuvent avoir une activité neutraceutique. Dans le cas d'A. subrufescens, la production est en général ciblée sur des champignons déshydratés pour l'élaboration de produits à intérêt médicinal. L'optimisation de la culture a été réussie à partir de modifications des paramètres agronomiques et environnementaux définis pour la culture d'A. bisporus. Le compost commercial utilisé pour A. bisporus a servi de substrat standard pour la production des sporophores d'A. subrufescens en donnant des résultats satisfaisants. La biologie de l'espèce (fructification à température plus élevée qu'A. bisporus) et les techniques d'adaptation pour sa culture offrent une alternative pour les cultivateurs de champignon de Paris en France pendant la saison estivale. L'effet de différents niveaux de CO 2 pendant la fructification devra être testé car il peut avoir une influence sur la qualité finale des sporophores (vitesse de maturation, élongation du pied), comme dans la culture d'A. bisporus. Cependant, les souches les plus productives présentent des caractères, comme la fermeté des sporophores et la résistance à T. aggressivum, qui devront être améliorés avant un transfert de la technologie de culture vers l'industrie française du champignon. D'autres caractères n'ont pas fait l'objet de ce travail, mais devront impérativement être étudiés avant de sélectionner des souches pour un programme d'amélioration d'A. subrufescens. Il s'agit de la durée de vie après récolte et de la sensibilité à Lecanicillium fungicola, un pathogène causant des pertes dans les cultures d'A. bisporus. A. subrufescens, considéré comme un champignon bénéfique pour la santé mais aussi comme un aliment exotique peut être intéressant pour le marché en frais. La forme, la couleur du chapeau et le calibre des sporophores sont des critères de qualité pour les consommateurs. Chez le champignon de Paris, de nombreux travaux ont été faits pour améliorer la forme et la couleur du chapeau. La diversité des formes et des couleurs de chapeaux observée parmi les souches de la collection montre un potentiel pour l'amélioration d'A. subrufescens pour le marché en frais. Cependant des études de marché seront nécessaires étant donné que le champignon a un goût d'amande auquel le consommateur n'est pas habitué. Les données obtenues dans ce travail contribuent à la connaissance de la biologie d'A. subrufescens. Le matériel sauvage offre des avantages pour la mise en marche d'un programme d'amélioration de l'espèce. Les caractères agronomiques identifiés et le potentiel comme aliment fonctionnel montrent l'intérêt de l'introduction de la culture en France en remplacement d'A. bisporus pendant la période estivale.

  Chapitre 4. Diversité chez Agaricus subrufescens et optimisation de la culture ……. 4.1. Introduction ………………………….………………………….…………… 4.2. Résultats et discussion ………………………….…………………………… 4.2.1. Variabilité génétique ………………………….………………………… 4.2. 2 Variabilité phénotypique ………………………….……………………. 4.2.3. Optimisation de la culture ……………………………………………… Article 2. Phenotypic variability in cultivars and wild strains of Agaricus brasiliensis and Agaricus subrufescens ………………………………………….. Article 3. Potential of European wild strains of Agaricus subrufescens for productivity and quality on wheat straw based compost ………………………… Article 4. Optimization of the cultivation conditions for mushroom production with European wild strains of A. subrufescens and Brazilian cultivars …………. 4.2.4. Recherche d'amélioration par création d'hybrides ……………………. 4.3. Conclusions ………………………….……………………………………… Chapitre 5. Sensibilité d'Agaricus subrufescens aux pathogènes …………………… 5.1. Introduction ………………………….………………………………………. 5.2. Résultats ………………………….…………………………………………. Chemical characterization of the biomass of an edible medicinal mushroom, Agaricus subrufescens, via solid-state 13 C NMR …………………… 6.2.2. Analyse des activités antioxydantes …………………………. Article 7 (soumis). Antioxidant activities in primordia, stipes and caps of cultivars and wild strains of the almond mushroom Agaricus subrufescens ……. 6.3. Conclusions ………………………….……………………………………….

	Chapitre 7. Discussion générale ………………………….………………………….
	7.1. Diversité et optimisation de la culture ………………………….……………
	7.2. Sensibilité face aux pathogènes ………………………….…………………..
	7.3. Analyse chimique et pouvoir antioxydant ……………………………………
	Conclusions et perspectives ………………………….………………………………
	Références ………………………….………………………….……………………..

Article 5 (en projet). Susceptibility of Agaricus subrufescens to Trichoderma aggressivum and Pseudomonas tolaasii ………………………….………………. 5.3. Conclusions ………………………….………………………………………. Chapitre 6. Potentiel d'A. subrufescens comme source de composés bioactifs ……... 6.1 Introduction ………………………….……………………………………….. 6.2 Résultats ………………………….…………………………………………... 6.2.1. Caractérisation chimique ………………………….…………………… Article 6.

  . L'hybride est plus précoce, a un rendement élevé, produit des sporophores de plus grand calibre et d'apparence attrayante.La ségrégation des allèles chez les descendants démontre que la méiose, la recombinaison et la répartition des noyaux recombinants dans les spores se produisent chez ces isolats

d'A. subrufescens. Des spores hétérocaryotiques et homocaryotiques ont été observées, alors que d'autres spores étaient homoalléliques pour les marqueurs utilisés. Les auteurs (Kerrigan et Wach, 2008), ont conclu que ces observations sont compatibles avec un cycle de vie amphithallique, c'est-à-dire en partie hétérothallique et en partie pseudohomothallique. Une telle coexistence de cycles de vie différents a été largement étudiée chez A. bisporus, et diverses stratégies utilisant les propriétés des cycles de vie ont été développées pour les programmes de sélection

Croissance mycélienne in vitro et conservation

  [START_REF] Escouto | Acceptability of the sensory characteristics of the Brazilian mushroom Agaricus brasiliensis[END_REF] ont réalisé une enquête au Brésil auprès de 218 personnes âgées de 18 à 56 ans, par apport à l'acceptabilité de ce champignon cuisiné en un plat typique, et obtenu une acceptabilité de 68,3%.Agaricus subrufescens fait partie des champignons médicinaux. Aussi, la majorité des publications sur les méthodes de culture est ciblée sur la définition de conditions de culture in vitro qui soient adaptées à la production de composés d'intérêt médicinal en milieu liquide.

	1.1.5.

1.1.4. Arôme, goût et valeur nutritionnelle

Les macromycètes comestibles constituent un élément de l'alimentation humaine dans de nombreux pays à travers le monde. Leur intérêt culinaire et commercial résulte principalement de leurs propriétés organoleptiques telles que l'arôme, le goût et la texture.

L'arôme, le goût et la valeur nutritionnelle des souches brésiliennes sont rapportés dans l'article 1. Dans une publication récente sur la composition chimique des sporophores d'A. subrufescens

[START_REF] Chang | The role of culinary-medicinal mushrooms on human welfare with a pyramid model for human health[END_REF]

la valeur citée pour les hydrates de carbones (68,82%) correspond à un pourcentage plus élevé que la fourchette 38-45% rapporté dans l'article 1, ce qui semble montrer de la variabilité à l'intérieur de l'espèce.

Selon Ernesto N. Uryu, un agronome d'une organisation d'assistance technique (Coodenadoria de Assitência Técnica Integral -CATI, Sorocaba, São Paulo, Brazil) et contemporain de M. Furumoto, les champignons originaux cultivés par ce dernier étaient forts en arôme et saveur, ce qui les rendait difficiles à consommer, tandis que les souches renvoyées depuis le Japon avaient perdu plusieurs de ces caractéristiques originales et avaient acquis une odeur plus agréable, une coloration plus claire et un plus gros calibre

[START_REF] Dias | Truths and myths about the mushroom Agaricus blazei[END_REF]

. A l'exception d'une saveur d'amande marquée chez A. subrufescens il existe très peu de travaux qui font mention du goût. Geoesel et al. ( 2011) ont fait un profil sensoriel selon les méthodes internationales d'évaluation de produits (ISO, 1994). Ces auteurs ont testé sept souches d'A. subrufescens en comparaison de deux souches d'A. bisporus (une variété claire et une crème) et n'ont pas trouvé de différence significative d'intensité de goût entre A. subrufescens et A. bisporus. Ils ont toutefois défini que le goût d'A. subrufescens est clairement différent de celui d'A. bisporus et conclu que cette caractéristique pourrait être un avantage ou un désavantage selon les demandes du marché. En plus de sa consommation sous forme déshydratée pour ses effets médicinaux, A. subrufescens peut avoir un grand potentiel au niveau culinaire.

  observent une croissance mycélienne optimale avec un rapport C/N de 11/1, Faccin et al. (2007) ont évalué différents dosages et sources d'azote et ont trouvé une croissance mycélienne supérieure avec des valeurs de C/N entre 10/1 et 50/1, avec l'urée comme principale source d'azote. Andrade et al. (2007) ont obtenu de bons rendements avec des C/N de 29/1. Toutefois[START_REF] Eira | Cultivation technology for medicinal mushroom Agaricus blazei (Agaricus brasiliensis)[END_REF]

rapportent que des C/N élevés, de l'ordre de 150/1 donnent de meilleurs rendements que des rapports de 33/1 et 40/1, proches de ceux utilisés pour A. bisporus. D'autres auteurs ont observé que pour un rapport C/N initial de 37/1 et de 27 à 33/1 à la fin de la phase II, la meilleure productivité est obtenue quand le rapport azote apporté par l'urée/azote de farine de soja (N u /N s ) est de 1,5/1 (Almeida Amazonas et

  ont observé une croissance d'A. subrufescens deux fois plus rapide sur la surface d'une colonie de Humicola insolens dans un milieu de paille-agar que sur ce milieu sans le champignon thermophile. Il est à noter qu'un effet bénéfique de H. insolens a été observé vis-à-vis de la croissance mycélienne[START_REF] Bilay | Growth of mycelium of Agaricus bisporus on biomass and conidium of Humicola insolens[END_REF]) et de la fructification d'A. bisporus[START_REF] Vijay | Role of thermophilic fungi in compost production for Agaricus bisporus[END_REF].

	1.1.7. Pathologies affectant les cultures d'agarics
	Les problèmes biotiques et abiotiques observés chez des cultivars d'A. subrufescens
	sont présentés dans l'article 1. Les principales maladies signalées chez A. subrufescens sont
	dues à la bactérie P. tolaasii et aux moisissures Trichoderma aggressivum et Lecanicillium
	fungicola, et font l'objet de peu de renseignements dans la littérature. Cependant, ces
	pathologies sont également les plus sévères chez A. bisporus et une abondante documentation
	existe (Berendsen et al. 2010 ; Largeteau et Savoie, 2010 ; Soler-Rivas et al. 1999, pour des
	revues).
	1.1.7.1. La tache bactérienne due à Pseudomonas tolaasii

  Eucaryotes et les Procaryotes produisent des espèces d'oxygène réactif (reactive

	oxygen species, ROS) comme sous-produits de leur métabolisme, essentiellement par la
	respiration aérobie. Les ROS sont de l'oxygène dans sa forme de singlet excité ( 1 O 2 ), de
	radical anion superoxyde (O 2	-), de radical (HO 2	-) et d'ion peroxyde (HO 2	-), de radical
	(HO ) et d'ion hydroxyle (HO -), de peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2 ). Chez un organisme sain,
	un faible niveau de ROS est maintenu par un équilibre entre leur production et leur
	élimination

  1 , pH 6,0), et l'ensemble est incubé à 25 °C pendant 15 minutes. Après centrifugation pendant 10 min à 12 000 g et 4 °C, le surnageant, constituant l'extrait brut, est prélevé et utilisé immédiatement pour le dosage de

	H 2 O 2 . La concentration de H 2 O 2 est déterminée après l'inactivation des enzymes par
	chauffage des extraits bruts à 80 °C pendant 40 min pour limiter l'interférence des
	polyphénols oxydases dans les mesures. Après refroidissement, les extraits sont mélangés
	avec 40	de polyéthylènimine (PEI) à 1%, puis centrifugés à 1000 g pendant 5 min pour
	éliminer les polymères qui pourraient interférer dans le dosage. Le mélange standard contient
	250 de solution à doser, 250 de solution de peroxydase de raifort (Sigma) à 20 U . ml -1 , et
	625	de solution de chromophore contenant 0,6 mmol l -1 de chlorhydrate de 3-methyl-2-
	benzothiazolinone hydrazone (MBTH) et 7,5 mmol l -1 d'acide 3-dimethylamino benzoique

(DMAB) dans du tampon phosphate 0,05 mmol l -1 , pH 6,0. Le mélange est incubé pendant 3 min à 30 °C et l'oxydation des colorants est mesurée à 590 nm. Les mesures sont effectuées en absence (témoin) et en présence (échantillon) de peroxydase. La concentration en H 2 O 2 est donnée par la différence entre le témoin et l'échantillon et exprimée en µmol de H 2 O 2 par mg du substrat.

3.6. Effet d'extraits hydrophiles d'Agaricus subrufescens sur des pathogènes d'agarics

  Les extraits froids ont été soumis à une incubation dans un bain-marie à 80 °C pendant 20 min. Au moment de faire la lecture au spectrophotomètre, des témoins contenant l'extrait d'A. subrufescens et la solution de FDA ont été mesurés, et une légère activité a été détectée.

	Activité = (DO mesurée *1/n) * (1/tps)
	avec n = nombre d'implants, et tps= temps d'incubation en minutes.
	La sensibilité de quatre souches sauvages et trois cultivars d'A. subrufescens a été
	testée face aux pathogènes Trichoderma aggressivum et Pseudomonas tolaasii. L'information
	concernant l'origine et la culture des pathogènes T. aggressivum et P. tolaasii et les
	protocoles utilisés sont décrits dans l'article 5 (chapitre 4).
	Deux types d'extraction hydrophile ont été réalisés, l'une à 100 °C, l'autre à 4 °C, à
	partir de sporophores lyophilisés pour être testées vis-à-vis de la multiplication de P. tolaasi,
	et à partir de mycélium lyophilisé pour étudier leur effet sur l'aptitude de T. aggressivum à
	concentration de 0,01 µg ml -1 dans du tampon phosphate 60 mM à pH 7,6 (8,7 g de K 2 HPO 4
	et 1,3 g de KH 2 PO 4 ) est ajouté dans les tubes contenant les échantillons et 1 ml de tampon
	phosphate 60 mM à pH 7,6 pour les témoins. Les tubes sont placés dans un bain-marie à
	30 °C pendant 30 min, puis 1 ml d'acétone est ajouté. Après 5 min à température ambiante,
	les tubes sont centrifugés à 11 000 rpm, à 15 °C pendant 5 min. La densité optique de 1 ml du
	surnageant est mesurée à 490 nm à l'aide d'un spectrophotomètre (UVIKON, Bio-tek
	Instruments). L'activité d'hydrolyse du FDA est exprimée en µg équivalent de FDA
	hydrolysé/implant/ min, en utilisant l'équation suivante :

coloniser le compost. Les sporophores sont produits selon la condition standard décrite dans l'article 3, (chapitre 4). La production de mycélium, le mode d'extraction et les protocoles des tests sont décrits dans l'article 5 (chapitre 4).

3.6.1. Dosage de l'activité d'hydrolyse du FDA

Il a été démontré que presque tous les microorganismes libèrent de la fluorescéine à partir de diacétate de fluorescéine (FDA) grâce à des estérases qui sont liées au métabolisme primaire. Ainsi la mesure de cette activité in situ permet d'estimer les variations de biomasse microbienne totale présente dans un milieu naturel. On estime en fait une activité métabolique associée à une biomasse

[START_REF] Lestan | Biological potential of fungal inocula for bioaugmentation of contaminated soils[END_REF]

.

Le dosage de l'activité d'hydrolyse du FDA est utilisé pour mesurer le développement des pathogènes en présence d'extrait d'A. subrufescens. La méthode de dosage est adaptée du protocole

de Inbar et al. (1991)

. Après 48 heures d'incubation, 1 ml de solution de FDA à une

Diversité chez Agaricus subrufescens et optimisation de la culture

	Ce chapitre décrit la variabilité génétique et phénotypique observée au sein d'un
	groupe de souches d'A. subrufescens disponibles dans la collection CGAB, et l'adaptation de
	la culture aux conditions européennes (matériaux de base, environnement) tout en permettant
	une production de niveau commercial.

L'activité antioxydante des souches d'A. subrufescens a été déterminée à partir de sporophores cultivés sur deux lots de compost. L'aptitude au piégeage des radicaux de DPPH ou d'ABTS et le pouvoir réducteur des extraits méthanoliques ont été étudiés. Les protocoles d'extraction et les méthodes utilisés sont décrits dans les articles 3 (chapitre 4) et 7 (chapitre 5).

Chapitre 4.

4.1. Introduction

La culture industrielle d'A. subrufescens s'est développée au Brésil, principalement pour l'exportation, et ce pays est considéré comme le premier producteur de ce champignon.

Agaricus subrufescens est également cultivé à l'échelle industrielle au Japon, en Chine, à Taiwan et en Corée

[START_REF] Gregori | Influence of carbon dioxide, inoculum rate, amount and mixing of casing soil on Agaricus blazei fruiting bodies yield[END_REF]

. A notre connaissance, il n'existe pas de méthode standardisée de culture pour ce champignon. Les conditions de culture rapportées dans la littérature concernent presque uniquement des expérimentations effectuées au Brésil à partir de matériaux locaux. Dans ce pays, la culture d'A. subrufescens est relativement récente ; la productivité est variable et dépend principalement du type de substrat utilisé

[START_REF] Ferreira-Silva | Microbial diversity in a bagasse-based compost prepared for the production of Agaricus brasiliensis[END_REF]

. A ce jour, les seules autres données culturales disponibles concernent le Japon. La culture d'A. subrufescens présente plusieurs similitudes avec celle d'A. bisporus, comme le substrat (obtenu par compostage de matériaux lignocellulosiques et de fumiers), les phases d'inoculation et d'incubation, et l'ajout d'une terre de gobetage permettant la fructification. La principale différence est qu'A. subrufescens n'a pas besoin d'une réduction de la température pour la fructification, alors qu'A. bisporus nécessite une température en dessous de 20 ºC pendant la période de fructification

  tous ces caractères sont pris en compte dans les programmes de sélection de champignons (Foulongne et al. 2012a et b). Par ailleurs, une température doit être fixée pour la colonisation du substrat par le mycélium ; elle est de 25 °C pour A. bisporus et pour A. subrufescens. D'autre part, Stamets et Chilton, (1983) rapportent que chaque espèce a sa température optimale pour le développement des sporophores. Cependant, la littérature indique plusieurs conditions de températures pour la fructification d'A. subrufescens. Considérant l'étude préliminaire effectuée par Callac (com. pers.) qui montre qu'A. subrufescens est capable de fructifier à 20-30°C sur le substrat et le gobetage (enrichi en sable) utilisés par les producteurs d'A. bisporus, ces conditions ont servi de point de départ pour optimiser la culture d'A. subrufescens en apportant des changements faciles à réaliser par les champignonnistes.

	Le premier objectif du travail présenté dans ce chapitre est de déterminer la variabilité
	génétique et phénotypique disponible dans la collection CGAB d'A. subrufescens.
	L'identification de variabilité génétique est de première importance dans les programmes
	d'amélioration de champignons afin d'éviter les risques de dérive génétique dus à l'utilisation
	de cultivars fortement apparentés. Le polymorphisme génétique a été estimé pour l'ensemble
	des souches disponibles.
	Plusieurs critères ont été retenus pour analyser la variabilité phénotypique :
	Une haute productivité, qui est liée à une bonne efficacité du champignon pour la
	conversion d'un substrat en biomasse fongique, est un intérêt prioritaire pour les
	champignonnistes. Il a été démontré dans des études antérieures, en particulier sur A. bisporus

. Leurs travaux montrent une grande homogénéité des souches commerciales du Brésil, et il est très probable que les souches actuellement cultivées dérivent d'un seul spécimen ou d'isolats de la même population, ce qui laisse supposer une disponibilité limitée de diversité biologique pour la culture. Récemment divers travaux ont signalé de nouveaux spécimens d'A. subrufescens dans d'autres pays que le Brésil

[START_REF] Arrillaga | El género Agaricus L. en España. XI Agaricus subrufescens, primera cita para España[END_REF] Kerrigan et al., 2005 ; Wisitrassameewong et al., 2012)

. Depuis les années 2000, un germoplasme d'A. subrufescens est en cours de réalisation au sein de la collection CGAB. Il rassemble une vingtaine de souches d'origines diverses, dont certaines correspondent à une aire de répartition nouvelle pour cette espèce. L'étude de ce nouveau matériel génétique peut conduire à l'identification d'une diversité pour des caractéristiques d'intérêt agronomique et de qualité comme aliment fonctionnel.

[START_REF] Manolopoulou | Evaluation of productivity and postharvest quality during storage of five Agaricus bisporus strains[END_REF]

que la productivité des cultures et la qualité des champignons frais dépendent du type de souche. Les critères de qualité considérés sont principalement le calibre, le degré de brunissement, la forme et la couleur du chapeau. Ils sont sous contrôle génétique, et -La température optimale et la température létale pour optimiser la propagation in vitro (précultures et préparation du blanc) et pour éviter des risques de dégénération des souches par stress thermique. -L'aptitude à coloniser le substrat de culture et à fructifier, ainsi que la couleur des champignons, qui ont été évaluées à petite échelle. Le deuxième objectif est d'optimiser les conditions de culture d'A. subrufescens en partant du substrat et de la terre de couverture utilisés pour la production commerciale d'A. bisporus en France. Les cultivateurs d'A. bisporus utilisent généralement pour le gobetage une épaisseur de 2,5 cm d'un mélange standardisé. Au Brésil plusieurs travaux ont été réalisés pour identifier le mélange et la hauteur de gobetage qui permettent le meilleur rendement d'A. subrufescens

[START_REF] Largeteau | The medicinal Agaricus mushroom cultivated in Brazil: biology, cultivation and nonmedicinal valorisation[END_REF]

. Cependant tous ces travaux sont faits à partir de matériaux non disponibles en France. L'étude portera sur la quantité et la composition de la terre de couverture, car ces paramètres peuvent déterminer le rendement d'A. subrufescens.

Plusieurs champignons cultivés ont besoin de lumière pour l'initiation fructifère et pour le développement des sporophores. Il est essentiel de connaitre les besoins en lumière pour une espèce donnée afin d'avoir de bonnes pratiques culturales

[START_REF] Stamets | The Mushroom Cultivator. A practical guide to growing mushrooms at home[END_REF]

. Par exemple, dans la culture d'A. bisporus la lumière n'a pas d'impact sur la production et la qualité. Cependant pour la culture de Pleurotus ostreatus la présence de lumière est indispensable pour l'induction fructifère et le développement normal des sporophores.

4.2.1. Variabilité génétique Vingt

  Le dendrogramme obtenu (Figure4.1) montre que les groupes de cultivars se distinguent bien des groupes de souches sauvages. Un groupe est constitué de 11 cultivars du Brésil génétiquement homogènes avec une distance génétique nulle. Ce résultat confirme l'absence de polymorphisme génétique rapporté dans la littérature pour des souches du Brésil(Neves et al., 2005 ;[START_REF] Tomizawa | Genetic variability of mushroom isolates Agaricus blazei using markers rapd[END_REF]. Une deuxième

-deux marqueurs microsatellites (SSR) ont été utilisés pour estimer la variabilité génétique des souches d'A. subrufescens. branche, la plus proche du groupe précédent, comprend cinq souches, un cultivar supposé (CA455, acheté sur un marché chinois) qui montre une DAS (distance of allele shared) ou

Table 1 :

 1 Commercial and wild strains with reference to origin and code in collection.

Table 2 :

 2 Mycelial growth rate of the commercial and wild strains at 35°C

		Radial growth rate (mm day -1 ) *
		Cultivars	Wild strains
	CA570	4.37 A	CA516	3.47 A
	CA563	3.90 AB	CA438	1.50 B
	CA647	3.63 ABC	ATCC 76739	1.23 BC
	CA562	3.57 ABC	Hybride	1.17 BC
	CA646	3.37 ABC	CA487	0.53 BCD
	CA565	3.00 BC	CA462	0.47 BCD
	CA572	2.70 CD	CA643	0.33 CD
	CA560	1.67 DE	CA276	0.10 CD
	CA561	1.47 EF	CA567	0.00 D
	CA566	0.90 EFG	CA536	0.00 D
	CA571	0.33 FG	CA603	0.00 D
	CA564	0.30 G
	CA455	0.23 G
	CA574	0.00 G

Table 3 :

 3 Effect of spawn rate on fruiting earliness and mushroom yield.

	Source	DDL	Fruiting earliness		Yield
			Mean squares	F	Pr > F	Mean squares	F	Pr > F
	Strain	4	264.013	61.237 < 0,0001	4501115.055 32.793	< 0,0001
	Spawn rate	1	53.635	12.440	0.002	425483.469	3.100	0.092
	Replicate	3	0.522	0.121	0.947	192902.776	1.405	0.268
	Strain*spawn rate	4	19.864	4.607	0.007	93777.654	0.683	0.611

Table 4 :

 4 Comparison of the time to fruiting at the two spawning rates.

	Strains		Days after casing 1 1% spawn 2% spawn
	Cultivars	CA561	28 A	20 B
		CA 565	26.2 A	26.7 A
		CA 570	24.2 A	18.5 B
	Wild	ATCC 76739 29.5 A	29.7 A
	A. subrufescens CA 487	14.2 A	13.7 A

1 Data were means of four replicates.

.

  Tableau 4.1. Rendement et couleur du chapeau des hybrides intercontinentaux.

	Les quatre hybrides européens et les deux parents présentent tous le même rendement Les souches étudiées, aussi bien cultivées que sauvages, ont montré une large diversité
	(p = 0,05) (Tableau 4.2). Toutefois un hybride (438-A-12 x 487-42) montre une tendance à phénotypique quel que soit le critère étudié (accroissement mycélien, capacité de colonisation
	produire plus que son parent le plus producteur. du substrat, morphologie et aptitude à fructifier). Cependant, les souches européennes
	(CA438-A, CA487 et CA643) révèlent davantage de variabilité. Les cultivars (CA561 et
	Tableau 4.2. Rendement et couleur du chapeau des hybrides européens CA570) montrent d'avantages de qualités au niveau chimique, comme l'activité antioxydante.
	Ce point est approfondi dans le chapitre 5.
	Agaricus subrufescens	Rendement	Couleur
	Hybrides Le groupe de souches retenu pour l'optimisation des conditions de cultures est 438 -12 x 487-100 174,6 ab 1 Beige
	438 -12 x 487-42 438 -12 x 487-125 représentatif de la variabilité génétique observée avec l'ensemble des souches. 198,1 a Beige 70,8 b Beige ± foncé
	438 -12 x 487-35 Les conditions permettant d'optimiser la production d'A. subrufescens en France ont été 129,1 ab Crème à beige
	CA487 CA438 définies. Les modifications identifiées par rapport au mode de culture utilisé pour A. bisporus 142,1 ab Crème à beige Parents 148,8 ab Crème à beige
	Agaricus subrufescens	Rendement	Couleur
	Hybrides	487-42 x 454-43	126,0 ab 1	Crème à beige rosé
		487-42 x 454-3	94,5 bc	Crème
		487-42 x 454-4	41,5 cde	Brun à brun foncé
		487-100 x 454-43	88,2 bc	Crème à beige
		487-100 x 454-3	41,5 cde	Crème à beige rosé
	487-100 x 454-4 Le faible nombre de souches d'A. subrufescens disponibles, en particulier d'origine 14,3 de Beige à brun
	487-125 x 454-43 487-125 x 454-3 sauvage, ne permet pas d'avoir une estimation de la variabilité au sein de l'espèce. Le but de 2,9 e Beige à brun 76,6 bcd Crème à beige
	487-125 x 454-4 cette étude était de rechercher les meilleures souches pour une production commerciale et des 22,4 de Brun foncé
	sources de diversité utilisables pour une amélioration génétique. Les cultivars évalués sont
	Parents génétiquement homogènes avec les outils moléculaires utilisés. Ce résultat confirme la grande CA454 CA487 11,0 de Beige ± foncé 148,8 a Crème à beige
	homogénéité des souches commerciales du Brésil rapportée dans la littérature. Le plus

1

Les valeurs suivies de la même lettre ne sont pas différentes entre elles (p=0,05) d'après le test de Student Newman Keuls.

1

Les valeurs suivies de la même lettre ne sont pas différentes entre elles (p=0,05) d'après le test de Student Newman Keuls.

Les rendements obtenus montrent le potentiel des souches sauvages pour introduire du matériel génétique d'intérêt (production de biomasse) avec l'objectif d'obtenir un fort rendement mais aussi des champignons de bonne qualité. Des analyses de la composition des champignons pourraient être envisagées pour l'amélioration de la qualité avec pour objectif de développer un aliment fonctionnel.

4.3. Conclusions

intéressant est le haut niveau de polymorphisme génétique observé parmi les souches sauvages, ce qui ouvre la voie à des programmes d'amélioration du champignon. (pour le gobetage, ajout de sable et augmentation de la hauteur ; fructification à 23-25 °C au lieu de 17-18 °C) sont facilement applicables par les champignonnistes. Le rendement des cultivars d'A. subrufescens a été similaire à celui rapporté dans la littérature pour des cultures effectuées au Brésil avec des substrats locaux. Cependant, ce rendement est encore très faible par rapport aux rendements d'A. bisporus. Par contre, dans les conditions définies lors de cette étude, les souches sauvages ont montré une meilleure performance que les cultivars, et un rendement proche de celui d'A. bisporus. Les souches européennes testées, en particulier CA487 et CA438-A, constituent un matériel pouvant être proposé pour une culture commerciale en France. D'autre part, l'évaluation des hybrides a démontré le potentiel de croisements entre des souches intercontinentales, avec transmission des aptitudes culturales des souches sauvages. Ces différents points seront repris et commentés plus en détail dans la discussion générale.

  pathogènes et un effet éliciteur a été détecté. Ces points sont développés dans le paragraphe 'Use in plant protection and other valorisation' de l'article 1 (chapitre 1).Ce chapitre présente la sensibilité d'A. subrufescens à deux maladies, la moisissure verte et la tache bactérienne, avec pour premier objectif la comparaison du degré de sensibilité des cultivars et des souches sauvages dans le but d'identifier du matériel permettant de limiter les risques de pertes en culture. Le deuxième objectif est de rechercher si des extraits d'A. subrufescens peuvent avoir un effet inhibiteur vis-à-vis de ces pathogènes en vue d'une utilisation en lutte biologique.

	Cependant aucune donnée n'est disponible sur le niveau de sensibilité des souches et l'aspect
	des symptômes. La résistance des souches commerciales aux pathogènes constitue une forte
	demande de la part des producteurs de champignons comestibles. L'introduction de la culture
	d'A. subrufescens en Europe amène de nouveaux défis, aussi, la prévention de risques de
	maladies par la sélection de souches tolérantes est un facteur important.

Du fait des modes de cultures proches, les compétiteurs et pathogènes majeurs redoutés, et observés, dans les cultures d'A. subrufescens sont les même que ceux d'A. bisporus qui sont présentés dans le chapitre 1. Les conditions de forte humidité et de températures (entre 25 et 30 °C) maintenues pendant la culture d'A. subrufescens favorisent le développement de moisissures comme Trichoderma aggressivum et Lecanillium fungicola ou de bactéries comme Pseudomonas tolaasii connues pour provoquer les plus importantes pertes dans les cultures d'A. bisporus. Les quelques données disponibles dans la littérature sur les contaminants des cultures d'A. subrufescens sont données dans le paragraphe 'Biotic and abiotic disorders during cultivation' de l'article 1 (chapitre 1).

Au Brésil, des dégâts importants dus à P. tolaasii ont été signalés chez A. subrufescens, et au début des années 2000 des symptômes attribués à L. fungicola ont été observés dans une zone de production

(Eira 2003)

. La littérature signale des contaminations de culture d'A. subrufescens par Trichoderma sp.

[START_REF] Andrade | Productivity, biological efficiency, and number of Agaricus blazei mushrooms grown in compost in the presence of Trichoderma sp. and Chaetomium olivaceum contaminants[END_REF] Kopytowski Filho et al. 2008

). D'autre part, A. subrufescens montre du potentiel comme agent de contrôle biologique.

Des extraits du champignon ont permis de réduire le niveau d'infection de plusieurs plantes par des

Table 1 :

 1 Commercial and wild strains with reference to origin, cap colour and code in collection.

		Origin	Code CGAB Code	Cap colour
				FCA/UNESP 1
	Wild isolates	Spain	CA438-A		Cream to light beige
		Saint-Léon, 33, France	CA487		Cream to light beige
		Le Pian Médoc, 33, France CA643		Brown
		Thailand	CA918		Red brown
	Brazilian Cultivars Piedade, SP, Brazil	CA561	ABL-99/30	Brownish gold
		Boituva, SP, Brazil	CA565	ABL-03/48	Brownish gold
		Rio de Janeiro, RJ, Brazil CA570	ABL-01/29	Brownish gold

Table 2 .

 2 Comparison of T. aggressivum sporulation surface from 13 to 20 days after inoculation in substrate spawned with seven strains of A. subrufescens.

	Substrate part analysed	Mushroom strains	Sporulation of Trichoderma aggressivum Surface (cm 2 ) d15 d16 d17	d20		% total surface d17 d20
	Part A	CA438-A	49.3	ABC 95.6	A	106.0 A	106.6 A	60.4	60.4
		CA487	73.1	A	83.4	A	88.5	A	88.5	A	50.1	50.1
		CA643	23.9	C	37.8	C	45.3	B	48.4	C	25.7	27.4
		CA918	27.7	BC	47.4	BC	53.6	B	64.0	B	30.4	36.3
		CA561	53.8	AB 71.2	AB 92.8	A	102.9 A	52.6	58.3
		CA565	41.3	BC	77.7	A	94.2	A	96.2	A	53.4	54.5
		CA570	54.7	AB 81.0	A	93.8	A	93.8	A	53.1	53.1
	Part B	CA438-A	61.7	b	125.5 ab	142.3 a	143.9 ab	80.6	81.5
		CA487	123.1 a	134.5 a	141.3 a	141.3 ab	80.0	80.0
		CA643	90.4	ab	125. 9 ab	132.0 ab	135.6 ab	74.8	76.8
		CA918	46.4	b	81.1	b	95.8	b	127.1 b	54.3	72.0
		CA561	75.3	ab	110.8 ab	118.7 a	139.5 ab	67.2	79.0
		CA565	82.0	ab	139.3 a	151.3 a	152.9 a	85.7	86.6
		CA570	56.7	b	124.5 ab	141.2 ab	141.2 ab	80.0	80.0

Table 3 .

 3 Effect of hydrophilic extracts of A. subrufescens on the development of the pathogens.

			Mycelial growth of	P. tolaasii growth
	Treatment		T. aggressivum	(ng FDA min -1 µL -1 )
			(ng FDA min -1 µL -1 )
	Control without extract	6.61 B	2.91 A
	Commercial inhibitor	1.27 C	0.38 F
	Cold extract CA487	5.70 B	2.12 D
		CA565	11.62 A	1.87 E
	Hot extract	CA487	2.20 C	2.79 B
		CA565	6.31 B	2.30 C

Table 1 .

 1 DPPH radical scavenging activities of methanolic extracts from eight A. subrufescens strains harvested at the primordium and sporophore stages. Within a line, values followed by the same lower case letter are not different at p = 0.05 by the Duncan's test. b Within a column, values followed by the same capital letter are not different at p = 0.05 by the Duncan's test. EC 50 of radical scavenging activity for ascorbic acid was 0.023 mg mL-1

	strain	primordium	EC 50 values (mg mushroom mL -1 ) whole sporophore cap	stipe
	CA438-A	1.49 c a BCD b	2.17 b BC	1.72 c BC	2.84 a B
	CA487	1.74 b AB	2.06 ab BC	1.88 b BC	2.37 a BC
	CA643	1.56 c BC	2.48 b B	2.19 b AB	2.86 a B
	Hybrid	1.04 d CD	1.86 b C	1.49 c CD	2.16 a C
	CA454	2.12 b A	3.17 a A	2.47 b A	3.49 a A
	CA561	0.95 b D	1.38 a D	1.42 a CD	1.35 a D
	CA565	1.43 a BCD	1.13 b D	1.13 b D	1.13 b D
	CA570	1.00 b CD	1.95 a C	1.75 a BC	2.12 a C

a

Table 2 .

 2 Reducing power of methanolic extracts from eight A. subrufescens strains harvested at the primordium and sporophore stages. Within a column, values followed by the same capital letter are not different at p = 0.05 by the Duncan's test.

	strain	Concentration (mg mushroom mL -1 ) leading to 0.25 absorbance primordium Whole sporophore cap	stipe
	CA438-A	2.64 c a BC b	3.87 b CD	2.75 c D	5.50 a BCD
	CA487	2.90 c BC	4.30 b BCD	3.18 c CD	5.89 a B
	CA643	4.20 c A	6.57 b A	4.29 c AB	9.49 a A
	Hybrid	2.65 d BC	4.77 b BC	3.60 c BC	5.69 a BCD
	CA454	3.63 c AB	5.33 a B	4.48 b A	5.73 a BC
	CA561	2.24 b C	3.23 ab D	2.96 ab CD	3.65 a CD
	CA565	3.67 a AB	3.17 b D	2.96 c CD	3.30 b D
	CA570	2.85 c BC	4.20 ab BCD	3.70 bc ABC	4.65 a BCD
	a Within a line, values followed by the same same lower case letter are not different at p =
	0.05 by the Duncan's test.

b

Table 3 .

 3 Effect of the pileipellis on antioxidant activities of methanolic extracts from a cream (CA438-A) and a brown (CA643) strain of A. subrufescens.Within a column, values followed by the same letter are not different at p = 0.05 by the Duncan's test

		radical scavenging activity	reducing power (mg mushroom mL -1 )
	treatment	EC 50 values (mg mushroom mL -1 )	leading to 0.25 absorbance
		CA438-A	CA643	CA438-A	CA643
	peeled	1.720 a	2.187 a	3.87 a	4.94 a
	not peeled	1.364 a	2.219 a	2.75 b	4.29 a

  found no significant difference in antioxidant properties comparing DPPH radical scavenging activity and reducing power in young (cap closed) and mature (cap opened) sporophores of a Brazilian cultivar. Mourão et al.22 analysed five Brazilian cultivars and measured higher DPPH radical scavenging activity in mushrooms with closed cap compared to aging mushrooms with cap completely turn apart. Nevertheless, no information on the antioxidant activities in the first stage (primordium) of the A. subrufescens fruiting body was available in the literature. Tsai et al.30 analysed ethanol extracts of Agaricus bisporus fruiting body at five development stages: pin head, veil intact (tight), veil intact (stretched), veil opened and gills well-exposed. They found the highest radical DPPH scavenging activity and reducing power in the sporophore veil intact (stretched) stage. The present work with A. subrufescens showed that primordia had better antioxidant activities than sporophores with closed veil in all the studied strains but one. Savoie31 explained that growth and differentiation process during normal cellular metabolism have a balance between ROS generation and ROS elimination. At fruiting initiation in A. bisporus a transitory oxidative burst implies a finer regulation of the redox balance by increases in the antioxidant activities.

Diversité et optimisation de la culture

  'après la quantité de polysaccharides contenue dans le mycélium ou le sporophore et le niveau d'activité antioxydante dans les sporophores, nous pouvons considérer A. subrufescens, y compris les souches sauvages, comme un aliment de qualité. En effet, les rapports protéines/polysaccharides observés sont proches de ceux de Lentinula edodes, un autre champignon réputé pour ses vertus médicinales. Un groupe de souches représentatives de la variabilité génétique a été sélectionné et a fait l'objet de l'ensemble des études de variabilité phénotypique. Cependant, certains caractères ont pu être analysés sur un plus grand nombre de souches. Le groupe sélectionné constitué de sept souches (trois d'origine sauvage européenne, une considérée à l'origine de la culture au Brésil, et trois cultivars) ainsi qu'un hybride Quelques travaux sur l'effet néfaste d'une basse température sur le mycélium d'A. subrufescens sont disponibles dans la littérature, mais aucune donnée n'existe sur l'effet de fortes températures. Ce travail établi, pour la première fois, la température létale pour le développement mycélien in vitro chez un ensemble de souches d'A. subrufescens. Cet acquis, d'un côté permet la prévention des risques liés à une exposition à des températures extrêmes pendant la multiplication des souches, et d'un autre côté contribue à la connaissance de la biologie de l'espèce. Dans ce travail, cinq cultivars ont montré une capacité pour la colonisation du compost (estimation via la mesure de la concentration en H 2 O 2 ) plus élevée que l'ensemble des souches. Farnet et al. (2013) ont évalué six souches d'A. subrufescens de la collection CGAB, dont cinq communes avec les souches de ce travail, et ont montré que trois cultivars avaient une capacité plus élevée pour la colonisation du compost d'après leurs activités lignocellulosiques (dont les laccases), mais que les valeurs de H 2 O 2 mesurées étaient similaires pour l'ensemble des souches étudiées. Ces auteurs ont suggéré que le dosage enzymatique est plus efficace pour estimer l'aptitude à coloniser le substrat au niveau intra spécifique. Cependant, ils ont utilisé un lot de compost et une quantité (450 g) différents et effectué les analyses après une incubation de 15 jours au lieu de 21 jours pour des unités de 150 g dans notre étude où les cinq souches donnant les plus fortes concentrations en H 2 O 2 autre part, la souche étudiée[START_REF] Colauto | Alternative to peat for Agaricus brasiliensis yield[END_REF][START_REF] Elisashvili | Lentinus edodes and Pleurotus species lignocellulolytic enzymes activity in submerged and solid-state fermentation of lignocellulosic wastes of different composition[END_REF][START_REF] Sharma | Production of lignocellulolytic enzymes and enhancement of in vitro digestibility during solid state fermentation of wheat straw by Phlebia floridensis[END_REF].Les substrats (compost et terres de couverture) élaborés au Brésil pour la culture d'A. subrufescens sont faits à partir de matières premières locales qui ne sont pas disponibles en France. A. subrufescens est un champignon saprophytique, qui pousse naturellement dans des litières forestières en décomposition. Face à la nécessité d'un substrat homogène et standardisé pour l'obtention de sporophores, afin d'observer leurs caractères phénotypiques chez les souches étudiées, la première étape a été d'évaluer si le compost commercial et la terre de gobetage préparés pour la culture d'A. bisporus peuvent convenir (conditions standard de culture). La fonction du compostage est de préparer un milieu nutritif sélectif pour le champignon de manière à assurer le développement du mycélium et l'exclusion des organismes compétiteurs[START_REF] Stamets | The Mushroom Cultivator. A practical guide to growing mushrooms at home[END_REF]. Dans un premier temps, un essai de culture à petite échelle en conditions standard a montré que l'ensemble des cultivars et des souches sauvages d'A. subrufescens était capable de fructifier sur ce compost commercial et La variabilité phénotypique observée chez A. subrufescens dans cette étude peut être utilisée pour l'amélioration de la production. Dans les conditions standard de culture utilisées au départ, les cultivars ont montré une faible production tandis que les souches sauvages avaient un meilleur rendement, proche de celui d'A. bisporus. Une optimisation de effet significatif sur le rendement et n'ont amélioré la précocité que pour un cultivar.Cependant, cette étude a montré que des variations entre 17 et 28 °C n'affectaient pas la fructification, ce qui peut permettre au producteur une économie d'énergie en faisant un contrôle de température moins strict que celui appliqué pour A. bisporus pendant la période estivale. Les matériaux à utiliser et les conditions définies pour l'incubation et la fructification sont facilement transposables pour une culture dans des installations utilisées pour produire A. bisporus.

	L'hybride a montré une activité antioxydante moyenne, intermédiaire entre celles de ses deux parents (CA487 et CA454). Ce résultat représente la possibilité d'améliorer la Chapitre 7. Discussion générale
	qualité chimique des sporophores par le transfert de ce caractère d'intérêt à des individus
	d'une descendance.
	Des études complémentaires sont nécessaires pour identifier les composés intercontinental, a été étudié pour la variabilité de réponse à des critères prioritaires pour la production, tout en maintenant des conditions facilement adaptables par les producteurs de
	responsables de cette activité antioxydante, et voir s'ils diffèrent en fonction du stade de Les résultats obtenus dans ce travail contribuent à la connaissance de la biologie l'introduction de la culture d'A. subrufescens en France : champignons de Paris, a été entreprise. En plus de l'aspect production, les conditions
	développement du champignon. d'A. subrufescens et à l'évaluation de souches de différentes origines géographiques pour leur 1) l'accroissement in vitro à différents températures pour l'identification de la optimisées devraient favoriser l'expression des caractères, permettant ainsi une meilleure
	diversité génétique et phénotypique en vue d'identifier des caractères d'intérêt agronomiques température optimale et létale, analyse de la diversité phénotypique.
	et des propriétés d'aliment fonctionnel après adaptation de la culture en France. 2) la capacité de colonisation du substrat pour évaluer l'aptitude enzymatique de Le groupe de souches sélectionnées (3 souches sauvages, CA454, 3 cultivars et 1
	dégradation du compost, Deux voies d'amélioration culturales sont possibles : en modifiant les facteurs hybride intercontinental) pour l'ensemble des essais culturaux permet d'évaluer la variabilité
	3) la capacité à fructifier en fonction du pourcentage de blanc, de la quantité et de la agronomiques et/ou les facteurs environnementaux. des souches entre elles, mais aussi leur sensibilité aux variations culturales.
	composition de la terre de gobetage, et des conditions environnementales (nécessité ou non Les précocités observées parmi les souches évaluées d'A. subrufescens se situent entre
	d'un choc froid et de lumière pendant l'incubation, et de variations de la température pendant 14 et 33 jours après le gobetage. Cette variabilité est déterminée par la diversité des souches,
	la fructification), en faisant, à partir de la culture d'A. bisporus, des adaptations simples, mais certains paramètres agronomiques comme le mélange de gobetage améliorent
	facilement applicables par des producteurs, notablement la précocité.
	4) la réponse à deux maladies répandues en champignonnières, la moisissure verte et la
	Par contre, comparé au mycélium d'A. bisporus, celui d'A. subrufescens a montré un tache bactérienne.
	pourcentage significativement plus élevé au niveau du groupe COOH/CONH (lipidique) et
	moindre pour le groupe O-alkyl-C (polysaccharides). La croissance in vitro des champignons dépend des conditions environnementales
	Les niveaux d'activités antioxydantes observés dans les extraits methanoliques des (intensité de la lumière, température, humidité et aération) et du milieu de culture (tel que pH, comprennent les trois cultivars possédant les fortes activités laccases (CA572, CA646 et
	sources de carbone et d'azote, facteurs de croissance). Dans cette étude, sous les conditions CA647), un cultivar qui ne diffère pas statistiquement de CA646 et CA647 pour cette activité, primordia et de sporophores identifient ce champignon comme une source valable de Dans la culture d'A. bisporus, il a été rapporté que les hybrides et cultivars testées, de la variabilité a été observée pour le taux d'accroissement. Il est plus élevé chez les et un cultivar non étudié par Farnet et al. (2013). Ceci suggère que les mesures enzymatiques composées antioxydants. Le primordium a montré l'activité antioxydante la plus élevée. Bien commerciaux existants sont proches d'une culture 'monolineage' (Foulongne-Oriol et al., cultivars (6,6 -10,7 mm jour -1 ) que chez les souches sauvages (2,2 -8,6 mm jour -1 ). Chez permettent de détecter de la variabilité au début de la colonisation mais que la mesure de que le primordium ne représente pas une biomasse commercialement intéressante, ce résultat 2009). Les travaux présentés dans le chapitre 4 confirment l'absence de polymorphisme chez A. bisporus, les taux d'accroissement in vitro sont assez variables, mais en général, ils sont H 2 O 2 permet de détecter des différences d'envahissement du compost après quelques contribue à la connaissance de la biologie de l'espèce. les cultivars et montrent, avec les marqueurs microsatellites, un haut niveau de plus faibles (3,2 -5,4 mm jour -1 ) (Nogueira de Andrade et al., 2010) que ceux observés dans semaines, comme montré précédemment par Savoie et al. (2007) chez A. bisporus et qui conservent toute l'hétérozygotie parentale (Kerrigan, 1990). D'autre part, des mutations D'autre part, les activités antioxydantes obtenues ont montré une variabilité intra polymorphisme génétique chez les souches sauvages. Ce matériel ouvre la voie à une ce travail. La température optimale pour l'ensemble des souches a varié de 25 à 30 °C, avec Pleurotus spp. somatiques peuvent se produire pendant la propagation végétative du mycélium, comme par A. bisporus, n'a pas besoin de lumière pour l'induction et le développement des spécifique et séparent les souches sauvages des cultivars. Les trois cultivars analysés sont plus amélioration génétique chez A. subrufescens. Ce travail est le premier rapport d'évaluation des écarts de même amplitude dans le groupe de cultivars et celui de souches sauvages, mais exemple lors de sa conservation en collection. Le cycle de vie d'A. subrufescens est mal fructifications. Un choc froid et des variations de températures sont utilisés pour la production actifs que les souches sauvages. Cependant, la souche d'A. bisporus analysée a montré un des souches sauvages. Le seul cas d'amélioration signalé dans la littérature concerne un en général une température de 28 °C pourrait être utilisée pour l'ensemble des souches sans La variabilité pour la colonisation du compost a été observée sous une seule température connu, cependant Kerrigan et Wach (2008) considèrent qu'il s'agirait d'un cycle d'A. bisporus. D'abord, une réduction drastique de la température de 25 °C à 17 °C induit la niveau d'activité se situant dans la moyenne de ceux observés pour l'ensemble des souches hybride entre une souche de Californie, USA, et une de Sao Paolo, Brésil, qui fait l'objet d'un une baisse significative de la vitesse moyenne de croissance. La connaissance de la d'incubation, 25 °C, alors que la température optimale varie de 25,8 à 30,2 °C. Malgré tout, amphithallique, en partie hétérothallique et en partie pseudohomothallique. De ce fait les fructification, ensuite, une courte période à 25 °C après les récoltes est appliquée par des d'A. subrufescens. A. bisporus a été rapporté dans la littérature comme possédant un fort pouvoir antioxydant par rapport à d'autres champignons comestibles (Liu et al., 2013 ; Savoie brevet (Kerrigan et Watch, 2007). température optimale in vitro est une condition préalable pour la préparation du blanc des les huit souches sélectionnées pour les tests d'amélioration de la culture ont montré une observations rapportées pour A. bisporus peuvent s'appliquer à A. subrufescens. Les analyses champignonnistes pour resynchroniser les volées. La même étude a été appliquée chez
	et al., 2008). Par conséquent, les cultivars comme les souches sauvages d'A. subrufescens champignons comestibles au niveau commercial. Bien que le milieu solide synthétique soit colonisation active après 20 jours d'incubation à 25 °C, donc une bonne aptitude à utiliser les génétiques et phénotypiques sont deux approches complémentaires pour la gestion optimale A. subrufescens (Zied et al., 2012). D'autres études ont été réalisées en serre avec des
	montrent un potentiel antioxydant intéressant. du matériel génétique (Foulongne-Oriol et al., 2011).

D

7.1.

La diversité intra spécifique est capitale pour les programmes d'amélioration de la culture d'un champignon et pour son utilisation comme aliment fonctionnel. En effet, la diversité du matériel génétique est d'un grand intérêt pour éviter les risques liés à un 'monolineage' (lignée de même génotype). Avec cette uniformité génétique des souches, la culture des champignons est plus vulnérable aux pathogènes et aux stress environnementaux.

Ainsi, l'identification et l'exploitation des ressources génétiques sauvages pour élargir la variabilité génétique est prometteuse pour développer de nouvelles souches résistantes à des maladies ou leur adaptation à des conditions culturales ou aux changements climatiques

[START_REF] Callac | The germplasm of Agaricus bisporus: Main results after ten years of collecting in France, in Greece, and in North America[END_REF][START_REF] Foulongne-Oriol | Novel microsatellite markers suitable for genetic studies in the white button mushroom Agaricus bisporus[END_REF]

.

L'ensemble des souches caractérisées génétiquement ne pouvait pas être étudié pour la variabilité phénotypique pour des raisons pratiques (capacité de la salle de culture) et de temps imparti pour ce travail. différent des grains utilisés pour la préparation du blanc, tous les deux permettent un bon développement du mycélium, ce qui permet d'extrapoler les résultats observés pour l'optimisation de la préparation du blanc. ressources nutritives du compost. Il y a plusieurs facteurs qui affectent la production d'enzymes lignocelulosiques dans le compost, d'une part la nature des sources d'azote, le matériel lignocelulosique, le niveau d'humidité (important pour la dégradation de la lignine) et d'présentait de la variabilité phénotypique (précocité, rendement, couleur du chapeau). Cette variabilité a été confirmée lors du passage à une culture à moyenne échelle, en conditions standard. Une importante variabilité phénotypique dans le rendement et la précocité a été observée chez les cultivars qui sont génétiquement identiques. Ce phénomène a été rapporté pour A. bisporus et des explications avancées. Moquet et al., (1998) ont démontré chez A. bisporus var. bisporus, qui possède un cycle pseudohomothallique prédominant, que l'auto-reproduction (obtention d'une souche à partir d'une spore hétérocaryotique binuclée) conserve l'hétérozygotie mais induit de la variabilité phénotypique due au réarrangement de la distribution des loci entre les deux noyaux lors de la méiose. Plusieurs laboratoires ont ainsi généré de « nouvelles souches » à partir de spores des lignées pseudo-clonales d'A. bisporus Les paramètres agronomiques déterminés (pourcentage du blanc, composition et épaisseur de la terre de couverture) ont permis d'augmenter le rendement et la précocité. Ces paramètres ont eu un effet plus ou moins marqué sur le rendement des souches. Le pourcentage du blanc utilisé au Brésil pour l'inoculation du compost oscille entre 1 et 3% du poids du compost en matière humide

(Eira, 2003)

. Cette quantité reste élevée par rapport au 0,7% utilisé pour A. bisporus. Dans cette étude, le lardage à 1% a conduit au même rendement que 2 ou 3%. La terre de gobetage C1 (mélange utilisé pour A. bisporus avec ajout de sable) apportée en couche de 5 cm (le double de la quantité utilisée pour A. bisporus) est le facteur qui a contribué le plus à l'augmentation significative du rendement chez toutes les souches.

Les résultats des facteurs environnementaux testés (lumière, choc froid pendant l'incubation et variation de température pendant la fructification) ont permis d'optimiser la culture. La lumière peut agir comme un inducteur de la fructification dans la culture d'espèces comme Pleurotus sp. et Lentinula edodes (shiitake). Toutefois, A. subrufescens comme conditions semi contrôlées (ventilation) ou non contrôlées. Dans ce travail nous avons testé pendant la fructification des variations de température similaires aux oscillations jour/nuit mentionnées pour les cultures en serre au Brésil. Ces variations de température n'ont pas montré d'Les matériaux utilisés pour la préparation du compost peuvent varier dans leur composition chimique, affectant les éléments disponibles pour le champignon à la fin du compostage. Le lot de compost était différent pour chaque essai, mais plusieurs essais comportant le même traitement (1% de blanc, 5 cm de mélange de gobetage C1, température constante, pas de lumière) ont mis en évidence une variation dans le rendement qui a été attribuée principalement au compost. Cet effet a été observé globalement pour l'ensemble des souches.

Biologie, caractérisation chimique et activités antioxydantes du champignon comestible et médicinal Agaricus subrufescens RESUME Récemment

  , Agaricus subrufescens est devenu un champignon d'intérêt de par ses propriétés médicinales. Sa production commerciale s'est développée dans des pays tropicaux à partir de matériaux locaux. Cependant, les données disponibles dans la littérature ne concernent que des cultivars qui sont génétiquement similaires. Notre étude sur un ensemble de cultivars et de souches sauvages a conduit à une meilleure connaissance de la biologie de l'espèce. Contrairement aux cultivars, les souches sauvages présentent un haut niveau de polymorphisme génétique. Une variabilité phénotypique élevée a été mise en évidence pour l'accroissement mycélien, la productivité et la morphologie. Des analyses chimiques par RMN du solide et l'estimation des activités anti-oxydantes ont montré que les souches sauvages comme les cultivars sont une source à exploiter comme aliment fonctionnel pour prévenir les maladies cardio-vasculaire, les cancers et le diabète. L'adaptation des conditions culturales à partir du substrat utilisé pour la culture d'A. bisporus a permis d'obtenir des fructifications d'A. subrufescens, puis d'augmenter le rendement et d'optimiser des caractères agronomiques d'intérêt. Du matériel sauvage avec une activité antioxydante et un rendement élevés a été identifié. L'évaluation d'hybrides intercontinentaux a montré la possibilité de transférer des caractères d'intérêt à une descendance. Agaricus subrufescens pourrait être proposé aux champignonnistes français comme alternative à Agaricus bisporus pendant la saison estivale.

Mots clés : Antioxydant, biodiversité, qualité, rendement.

Revue bibliographique

Chapitre 4 : Diversité chez A. subrufescens et optimisation de la culture

Code in the collection of the Mushroom Research Centre of the College of Agronomic Sciences, Sao Paulo State University.

Chapitre 6 : Potentiel d'A. subrufescens

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors are grateful to Diego Zied for the Brazilian cultivars, and Ludoviq Devaux and Christiane Coldefy for help in mushroom cultivation. This work is part of a research project funded by a bilateral cooperation between Mexico (project 115790 CONACYT) and France (ANR-09-BLAN-0391-01) in the "AgaSub" project: "Biology of the gourmet and medicinal mushroom Agaricus subrufescens, development of its cultivation and of new products of therapeutic interest or for diseases prevention"

ACKNOWLEDGMENTS

We thank Diego Cunha Zied for purchasing Brazilian A. subrufescens strains.

Funding Sources: R.C. L.-H. wishes to thank CONACYT, Mexico, for a Ph.D. fellowship. This work is part of research funded by a bilateral cooperation between Mexico (CONACYT project 115790) and France (ANR-09-BLAN-0391-01) in the "AgaSub" project.

Code Origin

Code Brazil

Tableau 3.3. Caractéristiques des 22 marqueurs microsatellites utilisés pour le génotypage des souches (d'après Foulongne-Oriol et al. 2012b). Article 2.

Locus Name

Proceedings of the 7 th International Conference on Mushroom Biology and Mushroom Products (ICMBMP7) 2011

Projet d'article 5.

Susceptibility of Agaricus subrufescens to Trichoderma aggressivum and

Pseudomonas tolaasii

Results and Discussion

Susceptibility of A. subrufescens to T. aggressivum

Whatever the incubation time and the variable analysed in the confrontations between A. subrufescens and T. aggressivum, variations between replicates were not significant (p=0.05).

Mycelia of A. subrufescens and T. aggressivum grew simultaneously, as observed with

A. bisporus confronted to T. aggressivum (Mamoun et al. 2000).

Mean values for symptom appearance ranged between 12.7 and 14 days after inoculation, and did not differ significantly with the strain (p = 0.05). On day 13 after inoculation, all strains showed green mould symptoms.

In part A of the substrate (with Trichoderma inoculum), the surface covered by sporulating mycelium of T. aggressivum increased from d13 to d17 then little to no increase occurred between d17 and d20. No change was observed on d30 (not shown). The kinetics of sporulation surfaces was identical for the substrates spawned with the three cultivars, and of the same type for substrates spawned with the wild strains CA438-A and CA487. In presence of the wild strains CA643 and CA918, kinetics revealed a slower extension of the surface covered by sporulating T. aggressivum (Fig. 2). Substrate spawned with ------CA438A, ------CA487, ------CA643, ------CA918, --CA561, --CA565, --CA570.

Article 7

Antioxidant activities in primordia, stipes and caps of cultivars and wild strains of the almond mushroom Agaricus subrufescens.