Préambule

En 2050 la population mondiale devrait atteindre la barre des 10 milliards d'individus. L'une des grandes questions que cela pose est de savoir de quelle façon nourrir ces individus et comment préserver la planète. Le modèle alimentaire actuel n'est pas viable pour une si grande population, ni sur le plan environnemental, ni sur la quantité de ressources disponibles [1]. Plusieurs solutions sont envisagées, comme une transition alimentaire vers des produits végétaux, permettant une durabilité de la production et de la consommation, ainsi qu'une réduction du gaspillage tout au long de la chaine. Parmi ces végétaux, le soja est un bon candidat, de par ses nombreuses propriétés

INTRODUCTION

Le tractus gastro-intestinal (TGI) représente la plus grande surface d'échange entre le milieu extérieur et le corps [2]. Il abrite une large population de micro-organismes entretenant divers types de relations avec l'hôte, comme les organismes commensaux ou les symbiontes. Ces derniers jouent un rôle important dans le métabolisme général [3] ainsi que dans le développement et le fonctionnement du système immunitaire de l'hôte [4].

Le système immunitaire assure la défense de notre corps contre des éléments étrangers via des mécanismes de reconnaissance spécifiques. En effet, 70% des cellules immunitaires sont retrouvées au niveau de l'intestin, sous forme de tissu lymphoïde associé à l'intestin (GALT : Gut-associated lymphoid tissue) [5]. Ces cellules permettent une interaction entre les cellules de l'hôte et les bactéries, via la reconnaissance de composés bactériens de surface, les MAMPs (Microbeassociated molecular pattern), comme le lipopolysaccharides (LPS), les flagelles, etc… [6]. Ces types de motifs sont reconnus par les PRR (pattern recognition receptors), dont il en existe deux principaux capables de reconnaitre les bactéries : les TLRs (Toll-Like Receptors) et les DC-SIGN (dendritic cell specific intercellular adhesion molecule). Ils permettent la transduction des signaux induits par cette interaction (Figure 1) [7]. Ce signal est défini par le couple MAMP-PRR et va conduire à la production de différentes cytokines [6]. Elles peuvent être de nature proinflammatoire ou bien anti-inflammatoire, conduisant à une réponse adaptée, pour maintenir un certain équilibre.

Cependant, de nombreuses situations physiologiques délétères peuvent perturber le microbiote et donc cet équilibre, créant un déséquilibre appelé dysbiose. Cette dernière coïncide avec l'installation de certains troubles ou augmente la sensibilité de l'hôte. Une partie des bactéries probiotiques ingérées peut interagir avec les cellules épithéliales de l'intestin (IEC) et les cellules dendritiques (DC). L'interaction entre l'hôte et la bactérie se fait via le motif moléculaire associé aux micro-organismes (MAMP) présent à la surface de la bactérie. Ces motifs sont reconnus par des récepteurs de reconnaissance de motifs (PRR), dont les TLRs (toll-like receptor) et les DC-SIGN (dendritic cell specific intercellular adhesion molecule) font partie, qui peuvent ainsi transmettre le signal induit par le probiotique. Ce signal déclenche une réponse adaptée, traduite par la synthèse de cytokines et de molécules de co-stimulation. [6] Deux cas typiques de troubles liés à une dysbiose sont les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI ou IBD pour Inflammatory Bowel Diseases) et les troubles fonctionnels de l'intestin (TFI ou IBS pour Irritable Bowel Syndrome) [8]. Les MICI, dont la maladie de Crohn et la recto-colite hémorragique, sont caractérisées par une inflammation chronique du TGI due à un afflux de granulocytes neutrophiles vers la muqueuse intestinale, ainsi qu'à une forte production de médiateurs pro-inflammatoires [9]. Cette inflammation résulte d'un dérèglement du système immunitaire conduisant à une réponse anormale. Les TFI sont décrits comme une douleur ou un inconfort abdominal chronique et un désordre intestinal (constipation ou diarrhée) [10]. La chronicité est un paramètre important dans cette pathologie qui doit répondre à plusieurs critères comme la fréquence de la douleur ou certains changements dans les selles [11].

Les MICI et les TFI ont certains paramètres communs, comme des facteurs de risques, des symptômes, dont une hypersensibilité viscérale, une motilité anormale, ainsi qu'une altération du système immunitaire (figure 2). Le dérèglement du système immunitaire conduit à la création d'un environnement anormal, favorisant l'installation et le maintien d'un environnement intestinal instable chronique [12]. Les dommages causés sur la muqueuse intestinale vont conduire à une réponse immunitaire anomale, largement exagérée (cas des MICI), ainsi que d'autres troubles (TFI) [13]. Parmi les responsables de cette réponse anormale, les TLRs (figure 1) présentent un profil d'expression différent chez un patient atteint d'une MICI ou d'un TFI, par rapport à un volontaire sain [14,15]. Cela entraine un profil d'expression des cytokines différent, tendant vers une augmentation des cytokines pro-inflammatoire (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, TNFα) [15,16]. Le changement dans la diète, des facteurs environnementaux sont à l'origine d'altération du microbiote intestinal. Ces changements vont tous participer à la création et au maintien d'un environnement instable, la dysbiose, conduisant à l'installation de troubles fonctionnels de l'intestin. IBD : Inflammatory Bowel Disease ; IBS : Irritable Bowel Syndrom ; TLR : Toll-like Receptor. Adapté de [8,12] Plusieurs traitements ont été testés en cherchant à diminuer la réponse inflammatoire, soit, par la régulation des TLRs, soit, par une régulation des cytokines pro/anti-inflammatoires, mais peu sont concluants [8]. Des études ont montré qu'une altération du microbiote du TGI était impliquée dans les MICI et les TFI [12,17]. C'est donc vers ces solutions que sont tournés les récents essais cliniques, avec des thérapies basées sur des régimes alimentaires [8] ou des bactéries probiotiques sélectionnées [12],pour restaurer l'équilibre de l'écosystème, en luttant contre la dysbiose. Les résultats de ces essais sont encourageants, avec des succès variables en fonction de la pathologie étudiée et des souches utilisées [18].

Les bactéries probiotiques se définissent comme des « micro-organismes vivants qui, lorsqu'ils sont ingérés en quantité suffisante, exercent des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels » [19]. Ces effets sont permis via plusieurs modes d'action [5,20] :

-La modulation du microbiote de l'hôte et l'effet barrière. La production de différents métabolites peut favoriser le développement de certaines espèces, mais aussi l'inhiber, via la production de bactériocines ou bien par une exclusion compétitive.

-L'amélioration de la fonction de barrière de la muqueuse intestinale via l'action sur les jonctions serrées des cellules épithéliales, ainsi qu'une modulation de la voie de signalisation régulant la production du mucus ou des défensines.

-La modulation du système immunitaire. Les bactéries probiotiques interagissent avec les cellules épithéliales intestinales, les cellules dendritiques et les macrophages, formant des couples MAMP-PRR (Figure 1). Cette interaction peut avoir un effet différent selon l'espèce bactérienne, entrainant la production de différentes cytokines et déclenchant soit une réponse inflammatoire, soit une réponse anti-inflammatoire (Figure 3). Lorsqu'une bactérie entre en contact avec une cellule, l'interaction MAMP-PRR se forme. Selon le type de MAMP Certaines formulations à base de bactéries probiotiques sélectionnées ont montré leur intérêt dans le traitement, ou dans l'accompagnement de rémission dans certaines pathologies [18]. L'effet immunomodulateur est un des principaux intérêts pour l'utilisation des bactéries probiotiques, mais il n'est jusqu'à présent pas le critère principal de sélection. La majorité des criblages sont réalisés sur des propriétés comme la survie des bactéries face aux contraintes technologiques de fabrication.

Un deuxième intérêt réside ensuite dans la survie de ces bactéries dans le TGI ou leur adhérence aux cellules épithéliales. Pourtant, il existe un lien entre la survie des bactéries et leurs propriétés immunomodulatrices. Certaines préparations probiotiques solutions actuellement distribuées dans le commerce ont été choisies uniquement pour leurs critères technologiques proposées avec un marketing « santé », mais sans preuve réelles des effets. Comme l'ont montré Sniffen et al. [18], les probiotiques ne sont pas universels, certaines formules fonctionnent, lorsque la souche est soigneusement sélectionnée et pour certaines pathologies uniquement, comme L. rhamnosus GG qui est très efficace dans le traitement de la diarrhée infectieuse chez l'enfant, mais inefficace dans les MICI.

Il existe des espèces de bactéries qui possèdent des propriétés immunomodulatrices, et une certaine efficacité dans le traitement des MICI et/ou TFI [22][23][24][25][26]. Parmi les espèces les plus étudiées, 11 espèces ont été retenues : Lactobacillus acidophilus, L. delbrueckii subsp bulgaricus, L. delbrueckii subsp lactis, L. fermentum, L. helveticus, L. plantarum, L. rhamnosus, Propionibacterium acidipropionici, P. freudenreichii, P. jensenii et Streptococcus thermophilus. Ces espèces ont toutes le statut « GRAS » (Generally Recognized As Safe) délivré par la Food & Drug Administration (FDA) [27], et sont toutes inscrites sur la liste QPS (Qualified Presumption of Safety) éditée par l'EFSA (European Food Safety Authority) [28]. D'autre part, certaines espèces comme L. delbrueckii, P. freudenreichii ou S. thermophilus, servent de levain dans la fabrication de nombreux aliments fermentés. Ces bactéries sont largement cultivées et consommées par l'homme de par leurs places centrales dans les différents produits fermentés de notre alimentation (fromages, yaourts…). De plus, certaines souches de ces espèces possèdent un effet prometteur vis-à-vis des troubles intestinaux (MICI et/ou TFI) in vitro, ex vivo, in vivo et en clinique, tel que présenté dans l'annexe 1.

Les propriétés immunomodulatrices de ces espèces sont souches-dépendantes, et peuvent induire une réponse pro ou anti-inflammatoire [29][30][31]. De manière générale, les espèces sélectionnées, seules, ont un effet majoritairement anti-inflammatoire prouvé dans plusieurs conditions (ex vivo, in vitro et in vivo). Les effets principaux sont la modulation du ratio IL-10/IL-12 (biomarqueur positivement corrélé aux propriétés anti-inflammatoires) [32], une réduction du taux de cytokines pro-inflammatoires, et une inhibition de l'activité de la voie NF-κB (un facteur de transcription dont l'activation résulte d'une stimulation via la transduction du signal par les différents MAMPs, et conduisant à la libération des messagers pro-inflammatoires) [33]. Les effets de certaines espèces seules ne sont que très peu étudiés, comme P. acidipropionici qui a été majoritairement utilisée dans des cas de cancer afin d'induire une apoptose [34]. D'autres espèces, comme S. thermophilus, sont souvent utilisées en associations de souches comme dans le VSL#3 [35]. L'efficacité de ce mélange a été prouvée dans les traitements des MICI chez l'homme, en permettant une réduction des symptômes et une amélioration de la rémission, mais elle reste en revanche débattue pour les TFI [18]. Les combinaisons de souches permettent une application différente, utilisant les propriétés de chacune des espèces, créant un environnement synergique et une efficacité plus importante du produit probiotique final. Certaines de ces applications reposent sur des produits fermentés, comme la fabrication d'un fromage dont les souches utilisées pour les différentes étapes de fabrication ont été sélectionnées pour leurs propriétés probiotiques, qui ont été confirmées chez l'animal [36,37].

Comme énoncé précédemment, les bactéries interagissent avec les cellules de l'hôte via l'interaction MAMP-PRR. Cette interaction va permettre la transduction du signal et produire une réponse immunitaire adaptée, via la production de différentes cytokines (Figure 1 et 3). Les bactéries possèdent différents composés de surface capables d'être reconnus par les PRRs, dont l'interaction et la réponse sont très spécifiques. Par exemple, le très étudié L. rhamnosus possède des protéines capables d'interagir avec le système immunitaire. Ses pilis, avec les protéines SpaCBA, présentent des résidus glycanes qui peuvent être reconnus par les cellules dendritiques, via le récepteur Lectine type C (DC-SIGN) qui lie les glycoprotéines [38]. Les protéines de surface sont un élément de choix pour les interactions entre les bactéries et le système immunitaire. Parmi elles, les protéines de surface S-Layer sont connues pour leurs activités immunomodulatrices, notamment chez L. acidophilus et P. freudenreichii [39]. D'autres composés comme les polysaccharides sont retrouvés chez certaines espèces, comme L. rhamnosus ou L. delbrueckii subsp bulgaricus. La production de ces polysaccharides est souche-dépendante et présente des propriétés différentes selon le type de polysaccharide produit [40,41]. L'une des propriétés est l'immunomodulation, via une possible interaction avec les TLR-2 et TLR-4 [42]. Le tableau 1 présente une liste non exhaustive des différents MAMPs pouvant être retrouvés sur les différentes espèces étudiées dans le cadre de mon stage. -Gel supérieur de concentration : T= 4%, C= 3.3%, tampon Tris-HCl 125mM pH6,8 ; SDS 0,1% (p/v) ; APS 0,05% (p/v) ; TEMED 0,15% (v/v).

-Gel inférieur de séparation : T= 12%, C= 3.3%, tampon Tris-HCl 375mM pH8,8 ; SDS 0,1% ; APS 0,05% ; TEMED 0,15%.

-Tampon de migration : Tampon Tris 25mM, glycine 152mM, SDS 0,1% -Tampon échantillon : Tampon Tris 1,25M HCl (pH 6,8), SDS 4%, DTT 0,6% (p/v), glycérol 20%

(p/v), Bleu de Bromophénol 0,01% (p/v).

La Nous avons essayé de les éliminer par une étape de filtration, qui s'est avérée infructueuse. Nous avons alors testé plusieurs conditions de centrifugation dont la plus efficace a été 28000 g  30min.

Résultats et discussion

Malgré tout, nous avons ensuite utilisé plusieurs filtres de porosité décroissante afin de filtrer stérilement ce milieu à savoir : papier Whatman (GE Healthcare) avec des filtres de porosité 30µm, 25µm, 8µm, puis sur une membrane Isopore -polycarbonate (Merck Milipore) de 10µm, 5µm, 1,2µm, 0,8µm et 0,4µm. À cette étape, nous avons complémenté le milieu avec de la peptone de soja (Bacto Soytone, BD Biosciences) à 5g/L, puis finalisé les étapes de filtrations stérilisantes avec des Top Filter (Thermofischer) de 0,45µm et 0,2µm.

En parallèle, nous avons testé plusieurs conditions de culture afin de déterminer quelles étaient les conditions les plus favorables à la croissance des espèces sélectionnées (Figure 4A). Pour cela, 4 espèces ont été choisies, en utilisant la souche type pour chacune d'entre elles, L. fermentum, une espèce dont les capacités de croissance sur des milieux végétaux sont connues, L. helveticus, S. Pour la suite du stage, nous nous sommes intéressés plus particulièrement à 2 espèces, P. freudenreichii et L. delbrueckii subsp bulgaricus que nous appellerons par la suite L. bulgaricus. Ces deux espèces ont été choisies d'une part pour leur activité immunomodulatrice prouvée (résultats issus de l'ARN SURFING), notamment via leurs composés de surface. De plus, ces souches présentaient certaines différences de morphologies à l'état frais, en fonction du milieu. Nous avons étudié l'acidification des 2 milieux par les 2 souches (P. freudenreichii CIRM-BIA 129 et L. bulgaricus CRIM-BIA 1592), en suivant l'acidification en continu par iCinac (Figure 6). Les deux souches n'ayant pas été cultivées avec le même lot de milieu, le pH initial du milieu est différent, tout en ayant subi le même traitement. L. bulgaricus (figure 7A)

Les observations au microscope optique (MO) (Figure 7A1 et 7A2) montrent plusieurs différences.

Outre le nombre d'individus présents sur la lame qui est grandement différent entre le PUF de lait et le PUF de jus de soja, la morphologie générale est elle aussi très différente. Sur le PUFL (Figure 7A1), les bactéries se trouvent soit seules, ou bien forment des chaines de 2 à 5 grands bacilles. À l'inverse, sur le PUFS (Figure 7A2), les bactéries forment de très longues chaines (parfois plus grande que le champ de vision du microscope) de bacilles de petite taille. Le cycle cellulaire semble affecté par le milieu, notamment au niveau de la division.

Les observations au microscope à force atomique (AFM) (Figure 7A3 et 7A4) viennent confirmer ces différences de morphologie, et apportent une précision sur les composés de surface. Dans le PUFL (Figure 7A3), les bactéries apparaissent bien formées et incluses dans une gangue, tandis que dans le PUFS (Figure 7A4), les septa sont très marqués et on retrouve cette gangue autour des bactéries.

Cette gangue, malgré sa forme différente entre les deux conditions, n'a pas montré de différence majeure dans les deux milieux de culture. La forme compacte (Figure 7A3) ou bien relâchée (Figure 7A4) a été retrouvée après culture sur les deux milieux. En effet, les lactobacilles, et plus particulièrement L. bulgaricus, sont connus pour leurs production d'exopolysaccharides [START_REF] Patel | Potentials of exopolysaccharides from lactic acid bacteria[END_REF]. Ces derniers sont impliqués dans les interactions MAMP-PRR et permettent, chez certaines souches, une modulation de la réponse inflammatoire (Tableau 1). La perturbation du cycle cellulaire peut avoir plusieurs causes, dont la composition en nutriments du milieu. En effet, le lait et le jus de soja ont une composition bien différente, comme les lipides, les sucres, la source d'azote et les vitamines [START_REF]FoodData Central[END_REF][START_REF]FoodData Central[END_REF], les perméats qui en sont issus seront aussi différents. Parmi ces différences, la vitamine B-12 et la vitamine B-5 sont des facteurs essentiels de croissance, impliqués notamment dans le cycle de division cellulaire, la biosynthèse de Coenzyme A [START_REF] Kusaka | Effect of several vitamins on the cell division and the growth of Lactobacillus delbrueckii[END_REF][START_REF]Linus Pauling Institute[END_REF]. La carence ou la faible concentration de ces composés pourrait expliquer la morphologie observée ici [START_REF]FoodData Central[END_REF][START_REF]FoodData Central[END_REF]. Les mesures de taille des lactobacilles ne montrent pas de différence de hauteur ou de largeur significative selon les milieux. Cependant, la longueur qui est le critère le plus discriminant en MO n'a pas pu être mesurée en AFM du fait de la trop grande variabilité de la taille des individus (Tableau 3).

P. freudenreichii (Figure 7B)

Les observations au MO montrent dans un premier temps un nombre d'individus différents, en accord avec la courbe de croissance et le dénombrement de la population finale. Elles montrent ensuite des bactéries légèrement plus rondes dans le PUFS (Figure 7B1), tandis qu'elles semblent plus allongées dans le PUFL (Figure 7B2) sans autres différences notables.

Les observations en AFM apportent deux autres informations. La première est que les bactéries sont enclavées dans une gangue dans le PUF de lait (Figure 7B3), qui a totalement disparu dans le PUF de soja (Figure 7B4). En effet, le PUF de lait est connu pour augmenter les propriétés antiinflammatoires de P. freudenreichii [50], ces propriétés étant liées aux composés de surfaces comme les β-glucans et les S-layer. Ces deux composés sont d'ailleurs impliqués dans l'activité immunomodulatrice de P. freudenreichii [56,[START_REF] Deutsch | Identification of proteins involved in the anti-inflammatory properties of Propionibacterium freudenreichii by means of a multi-strain study[END_REF][START_REF] Maréchal | Surface proteins of Propionibacterium freudenreichii are involved in its anti-inflammatory properties[END_REF]. Les bactéries présentent une morphologie légèrement différente. Les mesures confirment cette observation (Tableau 3).

Les deux souches sont donc impactées différemment par les milieux. Chez L. bulgaricus, le cycle de division cellulaire semble altéré, tandis que P. freudenreichii semble avoir un déficit en protéines de surface.

Des observations par microscopie électronique à transmission sont prévues, les échantillons étant en cours de préparation, pour appuyer ces résultats.

Le protéome des deux souches est déterminé par le milieu

La morphologie étant différente pour les deux bactéries étudiées, nous nous sommes intéressés aux protéines exprimées, afin d'expliquer ces modifications morphologiques. Les protéines totales ont été extraites ainsi que les protéines de surface extractibles, puis analysées sur un gel SDS-PAGE 12 % (Figure 8). Les pistes 9 et 10 montrent les protéines contenues dans les milieux de culture non fermentés. L'αlactalbumine (14,4kDa) et la β-lactoglobuline (18,1kDa), protéines majeures du lactosérum, sont retrouvées dans le PUF de lait. Leur présence est probablement due à une saturation partielle de la membrane lors de l'ultrafiltration, laissant ainsi passer une faible quantité de ces deux protéines. Le PUF de jus de soja contient quant à lui de nombreuses protéines.

Les 8 autres pistes montrent de nombreux changements du protéome total entre les deux milieux, très marqués chez L. bulgaricus (pistes 1 et 2 figure 8), et moins prononcées chez P. freudenreichii (pistes 5 et 6 figure 8). De même, les protéines de surface extractibles sont très différentes chez L. bulgaricus (pistes 3 et 4 figure 8) entre le PUF de lait et le PUF de soja en terme d'intensité des bandes. Cette différence est moins visible chez P. freudenreichii (pistes 7 et 8 figure 8), expliquée en partie par la différence de quantité de protéines déposée dans le gel. Ces changements témoignent d'une adaptation différente de ces deux espèces qui est confirmée par les analyses protéomiques différentielles. En effet, les extraits protéiques des pistes 1,2, 5 et 6 ont été analysés par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). Cette analyse montre deux profils assez différents pour les deux bactéries (Figure 9). Le L'alanine est en effet largement présent dans les protéines majoritaires du soja probablement [START_REF] Nishinari | Soy proteins: A review on composition, aggregation and emulsification[END_REF] (UniprotKB).

Conclusion et perspectives

Asbtract

Keywords : Propionibacterium freudenreichii, Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus, milk, soy, microscopy, proteomic

In a close future, world population will have increased sharply, raising questions about how to feed these people while preserving the planet. The current model is not viable for sustaining this future population. One of the solutions considered is a transition to fermented plant products like soy. Fermentation can indeed bring a taste appeal, but also lead to the production of functional foods with certain selected bacteria. Some probiotic bacteria can have an influence on the intestinal microbiota, helping to maintain the balance of the intestinal flora. In addition, an imbalance in the intestinal microbiota is correlated with certain intestinal disorders. We therefore used two media, an ultrafiltrate permeate from milk and soy juice, to cultivate lactic and propionic bacteria with probiotic potential. We focused on Propionibacterium freudenreichii and Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus, because they are starters widely used in the industry and we had data on these species. We studied their capacities to grow on different media, their acidification abilities, their shapes by optical and atomic force microscopy, and their total proteome. The comparative study showed a better adaptation to the dairy environment for the two strains, as well as significant morphological and proteomic differences. P. freudenreichii showed an over-expression of its surface compounds in the dairy medium compared to the plant environment. These compounds were the main responsible for the immunomodulatory properties for this species. L. bulgaricus appeared to be poorly adapted to this plant environment. This work offers perspectives in the development of new functional, good, safe and healthy fermented foods.

Figure 1 : 2 Figure 2 : 3 Figure 3 : 4 Figure 4 : 15 Figure 5 :

 1223344155 Figure 1 : Interaction entre les bactéries probiotiques et les cellules de la muqueuse intestinale.................. 2 Figure 2 : Facteurs, mécanismes et symptômes partagés des MICI/TFI. .......................................................... 3 Figure 3 : La différenciation des lymphocytes T-helper et leurs fonctions. ...................................................... 4 Figure 4 : Le mode de préparation et de stérilisation du PUF de jus de soja détermine la croissance des bactéries .......................................................................................................................................................... 15 Figure 5 : Courbes de croissances des 10 espèces bactériennes dans les deux milieux ................................. 17Figure 6 : Cinétique d'acidification en continu des 2 milieux PUFL et PUFS fermentés par L. bulgaricus CIRM-BIA 1592 ou P. freudenreichii CIRM-BIA 129 ................................................................................................... 18 Figure 7 : Observation microscopique de L. bulgaricus CIRM-BIA 1592 et P. freudenreichii CIRM-BIA 129….20 Figure 8 : Variation du protéome de P. freudenreichii et L. bulgaricus en fonction du milieu de culture ...... 22 Figure 9 : répartition générale des protéines selon le milieu ......................................................................... 23

Figure 6 : 18 Figure 7 : 20 Figure 8 : 22 Figure 9 : 23 Tableau 1 : 2 : 3 : 4 : 5 :

 61872082292312345 Figure 1 : Interaction entre les bactéries probiotiques et les cellules de la muqueuse intestinale.................. 2 Figure 2 : Facteurs, mécanismes et symptômes partagés des MICI/TFI. .......................................................... 3 Figure 3 : La différenciation des lymphocytes T-helper et leurs fonctions. ...................................................... 4 Figure 4 : Le mode de préparation et de stérilisation du PUF de jus de soja détermine la croissance des bactéries .......................................................................................................................................................... 15 Figure 5 : Courbes de croissances des 10 espèces bactériennes dans les deux milieux ................................. 17Figure 6 : Cinétique d'acidification en continu des 2 milieux PUFL et PUFS fermentés par L. bulgaricus CIRM-BIA 1592 ou P. freudenreichii CIRM-BIA 129 ................................................................................................... 18 Figure 7 : Observation microscopique de L. bulgaricus CIRM-BIA 1592 et P. freudenreichii CIRM-BIA 129….20 Figure 8 : Variation du protéome de P. freudenreichii et L. bulgaricus en fonction du milieu de culture ...... 22 Figure 9 : répartition générale des protéines selon le milieu ......................................................................... 23

Figure 1 :

 1 Figure 1 : Interaction entre les bactéries probiotiques et les cellules de la muqueuse intestinale.

Figure 2 :

 2 Figure 2 : Facteurs, mécanismes et symptômes partagés des MICI/TFI.

  et de PRR, la réponse sera différente et produira différentes cytokines. Les interleukines IL-2 et IL-4 vont permettre la différenciation d'un lymphocyte T naïf en lymphocyte Treg ou Th2, dont le rôle est anti-inflammatoire. À l'inverse, la production d'IL-12 et IL-6 va conduire à la différenciation en lymphocytes Th1 ou Th17, médiateur de la réponse proinflammatoire. L'interaction MAMP-PRR va induire la production de plusieurs cytokines. En présence d'IL6 ; IL-21 et IL-12, le lymphocyte T naïf va se différencier en Th1 ou Th17, médiateurs pro-inflammatoires. Les cytokines IL-2 et IL-4 vont permettre la différenciation en Treg et Th2, médiateurs antiinflammatoires. [21]

Figure 3 :

 3 Figure 3 : La différenciation des lymphocytes T-helper et leurs fonctions.

  concentration des échantillons a été dosée avec le kit 2-D Quant kit (GE Healthcare) en suivant les instructions du fournisseur. Les échantillons ont été chauffés au bain-marie à 100°C pendant 10min avant d'être déposés. La migration a été effectuée selon une tension de 70V, 35A pour les petits gels et 120V, 35A pour les grands gels.Analyse par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) Les extraits protéiques totaux (décrits précédemment), contenant du SDS, ont été dosés comme décrits précédemment, 100µg de ces aliquots ont été précipités à l'aide du 2D Clean Up Kit (GE Healthcare), selon les instructions du fournisseur. Les culots ont ensuite été resuspendus dans 50µL contenant de la guanidine-HCl 6M, 50mM Tris-HCl (pH8), 3mM DTT, puis chauffé à 95°C pendant 20min. 450µL de NH4HCO3 50mM (pH 7 ,8) ont été ajoutés pour refroidir la solution. La digestion trypsique des protéines a été effectuée par l'ajout de 5µL de trypsine (0,4µg/µL) (Promega) et une incubation à 37°C sur la nuit. La réaction a été stoppée par l'ajout de 3µL de TFA (acide trifluoroacetique). Les échantillons ont été stockés à -20°C jusqu'à l'analyse.Les peptides ainsi extraits ont été séparés par chromatographie liquide en phase inverse (RP-HPLC) sur un système Dionex-U3000-RSLC, qui permet de séparer les peptides en fonction de leur polarité en faisant passer un gradient à deux solvants pendant 80 min pour chaque échantillon. 4 µL d'échantillon ont ainsi été injectés sur une cartouche de préconcentration C18 (PepMap 100, diamètre interne 300 µm×5 mm, Dionex) avant la séparation des peptides sur une colonne C18 (PepMap 100, diamètre interne 75 µm×250 mm, Dionex). La séparation a été réalisée avec 5% de solvant B (acétonitrile 95%, acide formique 0.08% et TFA 0.01% dans de l'eau ultrapure) et 95% de solvant A (acétonitrile 2%, acide formique 0.08% et TFA 0.01% dans de l'eau ultrapure) pendant 5 min, suivis d'un gradient linéaire de 5 à 35% de solvant B pendant 40 min à un débit de 300 nL/min. Le système nanoLC était couplé en ligne avec un spectromètre de masse Qexactive quadripôle/orbitrap (Thermo scientific). Les spectres ont été ainsi recueillis dans la gamme de masse sélectionnée 250-2000 m/z. Afin d'identifier les peptides, toutes les données (MS et MS/MS) ont été soumises au logiciel de recherche en banque de données X!Tandem (http://pappso.inra.fr/bioinfo/xtandempipeline/). La recherche a été effectuée contre le protéome de Propionibacterium freudenreichii CIRM129 (téléchargé sur le site www.ncbi.nlm.nih.gov) et le protéome de Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus (UP000001259 téléchargé sur le site uniprot.org) ainsi que les banques de données contenant les protéines majeures du lait (banque interne STLO) et le protéome du soja, Glycine max (UP000008827 de uniprot.org) pour l'identification des contaminants. Les coupures enzymatiques spécifiques de la trypsine ont été spécifiées (C-ter de K et R) et les modifications optionnelles suivantes ont été sélectionnées : oxydation des résidus méthionine et phosphorylation des résidus sérine ou thréonine. La tolérance de la mesure sur la masse du peptide a été fixée à 10ppm pour les spectres MS et 0,02 Da pour les spectres MS/MS. L'ensemble de ces paramètres de recherche permet d'identifier avec confiance (p-value<0.05) des peptides de longueur minimale 6 acides aminés. Deux peptides minimum étaient nécessaires pour qu'une protéine soit considérée comme identifiée avec certitude dans un échantillon.Quantification des protéinesChaque peptide identifié par la MS/MS a été quantifié en utilisant le logiciel MassChroQ (http://pappso.inra.fr/bioinfo/masschroq/), avant traitement et analyse statistique avec R (https://www.r-project.org/). Un package spécifique de R, « MassChroqR », a été utilisé pour filtrer automatiquement les peptides pour lesquels le décalage du temps de rétention était supérieur à 30 secondes, et pour regrouper les peptides quantifiés en protéines. Deux méthodes complémentaires ont été utilisées pour les analyses, basées sur le nombre de pics observés (Peak Counting : PC) ou XIC (eXtracted Ion Current). Pour le PC, l'analyse de variance a été effectuée sur des protéines ayant un rapport minimum de 1,5 entre les deux conditions de culture. Les protéines ayant une p-value <0,01 ont été considérées comme significativement différentes. Pour la quantification en XIC, une normalisation a été effectuée pour tenir compte d'éventuelles variations quantitatives globales entre les différentes injections en LC-MS. Les peptides communs à plusieurs protéines ont été exclus automatiquement des données, tout comme les peptides présents dans moins de 90% des échantillons. Les données manquantes ont ensuite été imputées à partir d'une régression linéaire basée sur d'autres intensités peptidiques pour la même protéine. L'analyse de variance a été utilisée pour déterminer les protéines ayant une abondance significativement différente entre nos deux conditions de culture.

  thermophilus et P. freudenreichii, utilisés dans la fabrication de l'emmental et utilisant préférentiellement le lactose, mais ayant la capacité pour également de croitre sur des ressources végétales. Ces 4 espèces sont représentatives du portoir de bactéries lactiques et propioniques que nous avons utilisé ultérieurement. Le PUFS a été ensemencé à 2% et placé à la température optimale de croissances des bactéries (voir tableau 2) pendant 48h.

Figure 4 :

 4 Figure 4 : Le mode de préparation et de stérilisation du PUF de jus de soja détermine la croissance des bactériesÀ : Essais de différentes conditions de stérilisations du PUF de jus de soja. L'étape de filtration a été remplacée par une centrifugation en conditions stériles à 28000 g pendant 30min après le traitement thermique par autoclave. 0,22 : filtration 0,22µm ; A : autoclave 110°C -10minutes ; pep : ajout de peptone de soja (5g/L). B : Processus final de préparation du PUF de jus de soja utilisé pour toutes les cultures bactériennes.Les essais de culture des 4 souches, n'ayant été réalisés qu'une fois, les données obtenues sont à considérer comme une tendance, qui a été cependant suffisamment claire pour nous orienter dans nos choix de préparation du PUFS et de son utilisation comme milieu de culture (Figure4A). Ainsi, le traitement thermique seul a permis d'obtenir une meilleure croissance de L. fermentum 608 par rapport à la filtration seule, l'effet étant moins visible pour les autres espèces. En effet, les milieux

  Des bactéries lactiques et propioniques sont capables d'acidifier différentiellement les 2 milieux.

Figure 6 :

 6 Figure 6 : Cinétique d'acidification en continu des 2 milieux PUFL et PUFS fermentés par L. bulgaricus CIRM-BIA 1592 ou P. freudenreichii CIRM-BIA 129 L'acidification a été suivie par iCinac, avec un point toutes les 5 minutes, jusqu'à atteindre une stabilisation du pH. En bleu, le perméat d'ultrafiltration de lait et en vert celui de soja

Figure 7 :

 7 Figure 7 : Observation microscopique de L. bulgaricus CIRM-BIA 1592 et P. freudenreichii CIRM-BIA 129. A : L. bulgaricus CIRM-BIA 1592 ; B : P. freudenreichii CIRM-BIA 129 ; 1 et 2 : Observation au microscope optique en contraste de phase des cultures en phase stationnaire de croissance, avec un grossissement de x100 ; 3 et 4 : Observation de cultures bactériennes en phase stationnaire de croissance, séchées à l'air ambiant puis au dessiccateur par microscopie de force atomique en mode oscillant. Les images sont présentées en amplitude, soit la vitesse de correction du levier pour s'adapter à la forme de l'objet.

Figure 8 :

 8 Figure 8 : Variation du protéome de P. freudenreichii et L. bulgaricus en fonction du milieu de culture Les protéines ont été extraites puis déposées sur un gel SDS-PAGE 12%. Pistes 1 et 5 : extrait protéique total, culture en PUF Soja ; 2 et 6 : extrait protéique total, culture en PUF Lait ; 3 et 7 : Protéines de surface extractibles, culture en PUF Soja ; 4 et 8 : Protéines de surface extractibles, culture en PUF Lait ; 9 : Milieu PUF Lait ; 10 : Milieu PUF Soja ; * : hors de la gamme de dosage < 0,05µg/µL. La quantité de protéine déposée est de 25µg pour les puits 1 et 2, 30µg pour les pistes 5 et 6, 5µg pour les pistes 3, 4 et 8 et 25µg pour les pistes 9 et 10. Les protéines de surfaces de P. freudenreichii sont indiquées, en accord avec la littérature [72]. InlA: Internaline A; LspA: Large surface protein A; SlpE: S-layer protein E; SlpA: S-layer protein A; SlpB: S-layer protein B.

P

  . freudenreichii CIRM-BIA 129 L. bulgaricus CIRM-BIA 1592

Figure 9 :

 9 Figure 9 : répartition générale des protéines selon le milieu Données exprimées en ratio soja/lait. À : P. freudenreichii CIRM-BIA 129 ; B : L. bulgaricus CIRM-BIA 1592. En rouge les protéines plus exprimées dans le PUF de jus de soja, en bleu les plus exprimées dans le PUF de lait.

Tableau 1 :

 1 Exemples d'interactions MAMP/PRR d'espèces à potentiel probiotique Dans ce contexte de transitions alimentaires, la question des aliments fermentés végétaux est un axe de recherche important, notamment pour l'INRA, afin de comprendre comment allier santé et écologie dans de nouveaux aliments. Au STLO, cette problématique est étudiée au travers de plusieurs projets, alliant d'une part des études menées sur les bactéries probiotiques, et d'autres part sur des produits fermentés animaux, végétaux, ou mixtes, pouvant satisfaire les nouvelles exigences sociétales. C'est donc au sein de cette thématique que ce travail s'inscrit, avec l'étude comparative des propriétés de différentes bactéries probiotiques entre un milieu laitier et un milieu végétal. Elles ont ensuite été observées sur le microscope à force atomique (AFM, MFP-3D-BIO, Asylum Research) en mode oscillant avec un cantilever AC240TS (Olympus) comme décrit précédemment par Deutsch et al. [56]. Les images ont été traitées avec le logiciel Igor (Asylum Research). La taille des bactéries a été mesurée avec ce même logiciel et vérifiée par un test statistique de Student (Excel), avec une p-value de 0,05.

	MAMP	Espèce	protéine	PRR	Effet	Réf
	Flagelline	Les espèces mentionnées ci-dessous n'ont pas de flagelles. Néanmoins, lorsqu'ils sont présents, ils ont tendance à déclencher une réponse
					pro-inflammatoire
	Fimbriae	L. rhamnosus GG	SpaCBA	DC-SIGN	Permet l'adhésion aux cellules intestinales et la modulation du taux d'IL-8	[43]
	Protéines	L. rhamnosus GG	Msp1 et Msp2	X	Inhibe l'apoptose lié au TNFα	[43]
	sécrétées	L. plantarum	StsP	X	Inhibe la voie NF-κB	[20]
		WCFS1
	Protéines	L. acidophilus	SlpA	DC-SIGN	Induit la production d'IL-10	[20]
	de surface	NCFM
		P. freudenreichii	SlpA, SlpB, SlpE	X	Induit la production d'IL-10	[44]
	CPS	L. rhamnosus GG	polysaccharides	X	Impliqué dans l'adhésion et la survie	[43]
		L. delbrueckii	polysaccharides	X	Stimule des médiateurs anti-inflammatoires et protège contre l'oxydation	[40,
		subsp bulgaricus				45]
	LPS			Uniquement retrouvé chez les Gram -
	LTA	L. rhamnosus GG		TLR-2/TLR-6	Augmente taux d'IL-8 via l'induction de la voie NF-κB	[43]
		L. plantarum		TLR-2	La quantité de D-ala sur le LTA va orienter vers une réponse plutôt	[46]
		WCFS1			inflammatoire (+D-ala) ou plutôt anti-inflammatoire (-D-ala)
	PG	L. plantarum	DAP	TLR-2	Lorsque le PG contient du DAP, il y a réduction de l'interaction entre le	[6]
					PG et le TLR-2, réduisant l'induction de cytokines pro-inflammatoire.
	CPS : cell wall polysaccharide ; LPS : Lipopolysaccharide ; LTA : lipoteichoic acid ; PG : peptidoglycan ; X : non identifié ; DAP : Acide
	diaminopimélique ; Slp : S-layer protein ; DC-SIGN : dendritic cell specific intercellular adhesion molecule ; IL-8 : interleukin 8 (pro-
	inflammatoire) ; TNFα : Tumor Necrosis Factor α ; NF-κB : Nuclear Factor kappa B ; IL-10 : interleukin 10 (anti-inflammatoire) ; TLR :
	Toll-like receptor
	Ces différentes protéines peuvent être plus ou moins abondantes selon la souche, mais aussi selon
	les conditions de culture, notamment la composition du milieu de culture [47-49], modifiant ainsi
	le potentiel d'interactions avec le système immunitaire et sa modulation. En effet, si la plupart des
	milieux de culture de laboratoire sont adaptés aux besoins de chacune des espèces bactériennes, il
	est encore difficile de prévoir si des coproduits issus des procédés agroalimentaires sont à même

d'être utilisés comme milieux de culture. C'est le cas des perméats d'ultrafiltration (un procédé industriel couramment utilisé pour concentrer les protéines) qui, à l'inverse du rétentat qui est utilisé pour la fabrication de nombreux aliments, ne sont que très peu valorisés et sont bien souvent jetés. Dans le cas de l'industrie laitière, le perméat, après supplémentation en composés azotés, est utilisable par un grand nombre de bactéries lactiques

[50]

. En revanche, d'autres perméats issus de sources végétales, comme le soja, sont peu valorisés et encore peu utilisés comme milieu de culture.

Le soja est de plus en plus utilisé dans l'industrie agroalimentaire afin de répondre à une demande croissante de produits d'origine végétale

[51, 52]

. Il est l'une des principales alternatives au modèle de consommation actuel, basé majoritairement sur les produits d'origine animale. Le soja est une plante dite « écologique », considérée comme peu impactante pour la planète, et possède de bonnes caractéristiques nutritionnelles. En parallèle, les aliments fermentés occupent une place importante dans l'alimentation, environ 20% dans les pays développés

[53]

. De plus, il existe de nombreux produits fermentés végétaux (choucroute, kimchi, natto, tempeh). Les industriels se tournent désormais vers des aliments fermentés fonctionnels, pouvant satisfaire les nouvelles exigences de la société en termes d'éthique et d'écologie, mais aussi d'ajouter des bénéfices pour la santé au travers des microorganismes probiotiques. L'objectif premier était donc la mise au point d'un milieu végétal sur le modèle d'un milieu laitier, avec pour intention de valoriser les coproduits que sont les perméats de lait et de soja. Ces deux milieux ont servi donc de base pour la culture des différentes espèces bactériennes choisies. Afin de rejoindre la problématique de l'équipe, les capacités de croissance et de fermentations ont été étudiées. Ces données ont permis d'aborder de répondre à une des questions que nous nous posons : est-ce qu'une bactérie lactique, qui est généralement utilisée pour fermenter les produits laitiers, peut être capable de fermenter un milieu végétal dont la composition notamment en sucres est très différente ? Si oui, qu'en est-il de ses propriétés probiotiques ? Un précédent projet ANR intitulé SURFING, pour Starter SURFace against INflammation of the Gut, a montré que la variabilité des composés de surface (MAMPs) explique la variabilité des propriétés immunomodulatrices chez P. freudenreichii et chez L. delbrueckii. L'impact du milieu, lait ou soja, sur le protéome intracellulaire et de surface (surfaceome) a été plus particulièrement étudié.

MATERIEL ET METHODES

Liste des souches Parmi la collection du CIRM-BIA (Centre International de Ressources Microbiennes dédié aux Bactéries d'Intérêt Alimentaire), 11 espèces ont été retenues (tableau 2), sur plusieurs critères : la valorisation possible de la souche, la dégradation des sucres contenus dans le lait et le soja, le biotope d'origine et des données de la littérature sur les propriétés immunomodulatrices. Pour chacune de ces espèces, 3 souches ont été retenues par espèce (sauf pour L. acidophilus car seule une souche était disponible). Sur ces 11 espèces, il y a cinq lactobacilles thermophiles, deux lactobacilles mésophiles, trois bactéries propioniques mésophiles et un lactocoque thermophile.

Tableau 2 : Portoir de souches utilisées. ND : non documenté

Milieux de culture

Les souches ont premièrement été cultivées dans leurs conditions optimales de culture, indiquées dans le tableau 2, soit dans du MRS (Difco) pour les lactobacilles, soit du M17 (Difco) + 5g/L de lactose pour les lactocoques, soit du YEL (Yeast Extract Lactate) pour les bactéries propioniques

[54]

.

Après deux repiquages en milieux de laboratoire, ces précultures ont servi à ensemencer les 2 milieux d'intérêts, le perméat d'ultrafiltrat (PUF) de lait (PUFL), ou de soja (PUFS). Ils sont obtenus par ultrafiltration sur une membrane en céramique avec un seuil de coupure de 8kDa. L'ultra filtration du lait est réalisée au STLO sur la plateforme technologique

[55]

, tandis que celle du jus de soja est réalisée en usine par Triballat. Les milieux sont composés majoritairement de sucre, lactose pour le PUFL, saccharose, stachyose et raffinose pour le PUFS, ainsi que des sels minéraux. Les 2 PUFs ont été complémentés avec de la peptone à 5g/L, soit de la caséine peptone (Organotechnie) pour le PUFL, soit de la peptone de soja (Bacto soytone, BD Biosciences), afin de mimer la protéolyse présente lors de la production d'aliment fermenté.

Les populations finales de P. freudenreichii CIRM BIA 129 et de L. delbrueckii subsp. bulgaricus CIRM BIA 1592 ont été mesurées par dilutions successives et dénombrement, respectivement sur YEL Agar et sur MRS Agar. 100µL des différentes dilutions de cultures en phase stationnaire ont été déposés en surface de la gélose et les colonies ont été dénombrées après incubation en anaérobiose 48h à 43°C pour le lactobacille et 7 jours à 30°C pour la bactérie propionique.

Suivi d'acidification

L'acidification du milieu par les bactéries a été suivie en continu par iCinac Wireless (électrodes multiples connectées sans fil à un pH-mètre) (AMS Alliance) à l'aide de sondes ISM (Mettler Toledo). 100mL de milieu PUFL ou PUFS ont été inoculés à 2% avec les différentes souches, à leurs températures de croissance optimale décrites dans le tableau 2. Le suivi a été fait jusqu'à obtenir un plateau, en prenant une mesure toute les 5 minutes.

Analyses microscopiques

Microscopie optique

Les observations ont été réalisées à l'état frais à l'aide d'un microscope optique (Olympus BX51TF), à l'objectif x100 à immersion et en contraste de phase. Les images ont été capturées par une caméra (Qimaging) et traitées avec le logiciel Archimed. 2mL de ces cultures ont été lavés 3 fois par centrifugation (5000 g, 5min, 4°C) avec du tampon HEPES 2mM, NaCl 50mM, pH 6,7. 2µL ont ensuite été placés sur une lame de mica clivé. Les lames ont été séchées à température ambiante 24h puis une nuit dans un dessiccateur contenant un gel de silice absorbeur d'humidité. ont ensuite été dispersés par sonication, avec une amplitude de 10 sur 3 cycles de 30sec (QSonica) puis les cellules ont été cassées par agitation avec 200mg de billes de verre (0,1mm, Zirconia/Silica Beads) sur un broyeur Precellys Evolution (Bertin Technologie) dans des microtubes de 2 mL (Ozyme). Les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation, 21000 g pendant 30min. Les échantillons de protéines intracellulaires totales ont été conservés à -20°C jusqu'à l'analyse.

Extraction des protéines de surface Il s'agit d'extraire les protéines de surface qui ne sont pas liées de manière covalente, à l'aide d'un agent chaotrope à forte concentration sans casser les cellules. 10mL de culture de bactéries en phase stationnaire ont été centrifugés (5 min, 5000 g), lavés dans du PBS puis centrifugés à nouveau (5 min, 5000 g). Les culots ont été resuspendus dans 2mL d'une solution chaotrope, soit du chlorure de guanidine 5M pour les propionibactéries soit du chlorure de lithium 5M pour les lactobacilles, et incubés 15 min à 50°C ou à 0°C, respectivement. Afin de séparer les bactéries des protéines de surface extraites, les suspensions ont été centrifugées 18 min à 21000 g puis les surnageants ont été récupérés. Les molécules chaotropes ont été éliminées par diafiltration, en utilisant des tubes de diafiltration centrifugeables Vivaspin (14 mL, 10 000 MCWO, Sartorius) selon les consignes du fabricant. Les échantillons ont été dialysés avec 2 volumes d'eau distillée puis 2 volumes d'une solution de SDS 1% afin d'éviter que les protéines ne précipitent dans les tubes. Les extraits contenus ont été récupérés puis séparés par électrophorèse sur des gels SDS-PAGE.

Electrophorèse monodimensionnelle

Les gels SDS-PAGE ont été réalisés sur le système Protean II xi Cell (Bio-Rad), selon le protocole décrit par Laemmli

[57]

. La composition des gels est définie d'après la nomenclature de Hjerten

[58]

, où T représente la concentration totale en monomères (acrylamide/bisacrylamide) et C le pourcentage de bisacrylamide par rapport à la quantité totale de monomères. La composition des gels est la suivante :

  Le mode de préparation du perméat d'ultrafiltration de jus de soja influence la capacité de croitre de bactéries lactiques et propioniques Le perméat d'ultrafiltration de lait (PUFL), qui contient principalement du lactose et des minéraux solubles du lait, est couramment produit et utilisé au laboratoire comme milieu de culture pour les bactéries lactiques et propioniques[50, 55]. Il fallait donc trouver un équivalent sur une base végétale. Le perméat d'ultrafiltration de soja (PUFS) peut être une bonne alternative car il contient majoritairement du saccharose (>50% des sucres totaux) et des sucres de la famille du raffinose[59]. Ces sucres sont également utilisables par les bactéries lactiques et propioniques à condition que les souches possèdent les voies métaboliques spécifiques, pour être capables de croitre. De plus, la présence de glucose issue de l'hydrolyse du saccharose pourrait suffire à certaines bactéries pour se développer.

L'UMR STLO étant associée à plusieurs partenaires industriels pour certains projets, nous nous sommes tournés vers Triballat pour nous fournir du perméat d'ultrafiltration de soja (PUFS).

Néanmoins, ce dernier n'étant pas produit directement au laboratoire et étant soumis à des règles industrielles, nous n'avons pas eu connaissance des conditions de fabrication, de conditionnement, de livraison ni de composition. Afin de s'assurer une utilisation de ce perméat comme milieu de culture des différentes bactéries, il était indispensable de réaliser sa stérilisation après récéption.

Contrairement au PUFL, le PUFS possédait de nombreux composés non solubles, empêchant une filtration stérilisante directe. Nous avons donc opté pour un traitement thermique par autoclave, en testant plusieurs conditions de température et de temps. Nous avons retenu les conditions 110°C pendant 10min, afin d'éviter la réaction de Maillard et de trop dénaturer les composés présents dans le milieu. Lors de cette stérilisation, il y a eu formation de nombreux composés non solubles.

  : température de 43°C pour les thermophiles. B : température de 30°C pour les mésophiles. La densité optique a été mesurée à 630nm toute les 3 ou 5h selon les espèces, sur un temps de 30h à 84h. Les résultats sont exprimés en Log10 de DO. PUF de lait ; PUF de jus de soja. Les populations finales sont de 7x10 8 UFC/mL dans le PUFL et 10 8 UFC/ml dans le PUFS pour P. freudenreichii et de 7x10 8 UFC/ml dans le PUFL et 10 7 dans le PUFS pour L. bulgaricus.

		végétaux, notamment le soja, sont connus pour contenir de nombreux facteurs inhibiteurs, comme
		des inhibiteurs de protéases, qui sont détruits par le traitement thermique [60]. L'ajout de la
		peptone a amélioré aussi les conditions de culture, en apportant des peptides et acides aminés
		libres indispensables pour la croissance des bactéries. Le traitement thermique étant nécessaire
		d'une part pour éliminer les éventuels contaminants présents à la réception, et d'autre part pour
		éliminer les inhibiteurs de croissance, il a été utilisé systématiquement par la suite. De même l'ajout
		de peptone et la filtration ayant montré une amélioration de la croissance des 4 souches testées,
		ces étapes ont aussi été intégrées dans le processus final de préparation présenté figure 4B.
	A	Le milieu PUFS additionné de peptone de soja, autoclavé et filtré permet donc la croissance de
		plusieurs espèces bactériennes et sera donc utilisé pour toutes les expériences ultérieures.
		L. fermentum 608	S. thermophilus 20	L. helveticus 101	P. freudenreichii 1
	B
		Cependant, lors des suivis de croissance de ces 11 espèces bactériennes, nous avons rencontré
		quelques difficultés. Nous suivions la croissance des espèces thermophiles ou mésophiles sur la
		même microplaque de culture, pour les 2 milieux. Les différentes souches ne croissant pas de la
		même façon sur chaque milieu, les dilutions effectuées ont parfois été trop élevées pour une
		souche, sortant alors de la gamme de mesure du spectrophotomètre. Ce biais s'est traduit par une
		courbe en « escalier », au temps 6h et 12h, visible chez L. helveticus et L. rhamnosus (Figure 5), et a

Les différentes bactéries s'adaptent plus ou moins bien aux perméats d'ultrafiltration de lait ou de jus de soja

Les suivis de croissance des 11 espèces de bactéries lactiques et propioniques ont été réalisés en parallèle sur les deux perméats PUFL et PUFS (figure

5

). Le comportement entre les différentes souches d'une même espèce est relativement homogène/similaire pour chacun des milieux. En effet, les souches ont été sélectionnées sur leurs capacités à se développer sur le jus de soja. Les courbes de croissance montrent différents cas :

-Les bactéries qui ont une croissance plus élevée sur le milieu laitier comme L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. helveticus et P. freudenreichii.

-Celles qui ont une croissance plus élevée sur le milieu végétal comme L. fermentum, L. plantarum, S. thermophilus et P. jensenii.

-Celles dont la croissance est plus ou moins équivalente sur les deux milieux comme pour L. delbrueckii subsp. lactis, L. rhamnosus et P. acidipropionici. rendu non fiables les résultats obtenus pour certaines souches, non présentés sur la figure

5

. Figure 5 : Courbes de croissances des 10 espèces bactériennes dans les deux milieux À

Tableau 3 :

 3 Tailles de L. bulgaricus et P. freudenreichii en fonction du milieu Les mesures ont été prises au microscope à force atomique à l'aide du logiciel Igor. 8 individus au minimum ont été mesurés et les différences entre les deux milieux ont été testées statistiquement avec le test de Student et une pvalue <0.05.

		Taille (nm)	PUF Lait	PUF jus de soja	P
		Longueur	-	-
	L. bulgaricus	Largeur	1163±321	1240±299	0,432
		Hauteur	527±85	513±63	0,53
		Longueur	1128±262	1110±193	0,868
	P. freudenreichii	Largeur	588±102	645±79	0,102
		Hauteur	411±41	211±27	<0,0001

Tableau 4 :

 4 tableau 4 montre de grandes différences au niveau de certaines classes de protéines différentiellement exprimées chez L. bulgaricus CIRM 1592, notamment les protéines surface et de membrane cellulaire, celles impliquées dans la traduction, dans le métabolisme des nucléotides et celui des lipides. La présence de certaines protéines de surface est d'ailleurs confirmée par le gel SDS-PAGE (figure8). Le métabolisme parait très différent entre les deux milieux, mais les protéines Liste non exhaustive des protéines exprimées différentiellement entre les deux milieux pour L. bulgaricus CIRM-BIA 1592 Liste non exhaustive des protéines exprimées différentiellement entre les deux milieux pour P. freudenreichii CIRM-BIA 129 énergie et de la transcription. La surexpression de certaines protéines dans l'un ou l'autre milieu témoigne d'une adaptation aux ressources disponibles, comme AsnC, un régulateur transcriptionnel lié à la biosynthèse des acides aminés. La présence d'homosérine deshydrogénase, impliquée dans la synthèse de cystéine et de la méthionine, montre aussi une adaptation au milieu.Pour ce qui est des protéines surexprimées dans le PUF de soja, de nombreuses protéines d'adaptation au stress oxydatif sont présentes, comme plusieurs oxydoréductases, succinate déshydrogénase, catalase, des protéines Fe/S, glycogène synthase. Ces résultats sont en accord avec ceux dans le PUFL, ou le répresseur de transcription était surexprimé. La protéine la plus surexprimée est l'alanine deshydrogénase, permettant de transformer l'alanine en pyruvate[START_REF]KEGG PATHWAY: Alanine, aspartate and glutamate metabolism[END_REF].

	identifiées ne permettent pas d'expliquer les différences de morphologies observées par
	microscopie (figure 7). Néanmoins, on note la présence de certaines protéines présentes dans la
	paroi, comme MreB, celles impliquées dans la traduction, et dans le métabolisme des sucres. Le PUF
	de soja contient du raffinose ainsi que des galactoses libres, utilisables par L. bulgaricus. Cette
	utilisation du galactose se confirme par une production largement supérieure de la lactose
	perméase, un transporteur de β-galactoside. Cette consommation du galactose peut être relié à la
	production d'acide lactique (figure 6).

En bleu, les protéines sur-exprimées dans le PUF de lait ; en vert les protéines sur-exprimées dans le PUF de soja. Les protéines identifiées comme protéines de surface et retrouvées sur le gel SDS-PAGE sont indiquées en gras. a description des protéines à partir de la base de données UniprotKB (https://www.uniprot.org/); b Ratio calculé avec la méthode XIC; c Ratio calculé avec la méthode Peak Counting ; d catégorie COG : C : Energy production ; D : Cell cycle control and mitosis ; E : amino acid metabolism and transport ; F : nucleotide metabolism and transport ; G : carbohydrate metabolism ; H : coenzyme metabolism ; I : lipid metabolism ; translation ; K : transcription ; L : confirmées par le gel SDS-PAGE (figure

8

). Les protéines de surface étant impliquées dans les propriétés immunomodulatrices de la souche CIRM-BIA 129 , le PUFL serait donc un milieu de culture plus propice à la stimulation de ces protéines

[START_REF] Maréchal | Surface proteins of Propionibacterium freudenreichii are involved in its anti-inflammatory properties[END_REF]

. Les changements majeurs présentés dans le tableau 5 ont majoritairement trait au métabolisme des acides aminés, des sucres, de la production d'P. freudenreichii pourrait accumuler du tréhalose au vu de la surexpression de la tréhalose synthase et du glycogène via l'inositol 1-phosphate synthase dans le PUF de lait, comme elle le fait dans le lactosérum

[START_REF] Huang | Hyperconcentrated sweet whey, a new culture medium that enhances Propionibacterium freudenreichii stress tolerance[END_REF]

. La forte présence d'ATP sulfurilase montre l'utilisation possible de phosphates inorganiques présents dans le PUF de lait comme source d'énergie. En effet, P. freudenreichii est connu pour utiliser le phosphate inorganique et pour accumuler des polyphosphates dans son cytoplasme

[START_REF] Aburjaile | Adaptation of Propionibacterium freudenreichii to long-term survival under gradual nutritional shortage[END_REF]

.

On retrouve aussi un répresseur de transcription (nrdR), impliqué dans la régulation de la synthèse d'ADN en situation de stress oxydatif. Sa plus forte expression sur le PUFL suggère donc que P. freudenreichii subit un stress oxydatif moins important que dans le PUFS.

  Les aliments à bases de végétaux connaissent un essor grandissant, de par leurs propriétés écologiques, et nutritionnelle. L'une des possibilités de fabrication d'aliments à base de végétaux est la fermentation. De nombreuses bactéries sont déjà utilisées dans ces processus, mais les industriels se tournent de plus en plus vers les bactéries probiotiques, afin de créer des aliments fonctionnels. Nous avons donc cherché à savoir s'il était possible pour des bactéries lactiques et propioniques, connues pour leurs propriétés immunomodulatrices, de se développer sur un milieu végétal à base de soja.Les résultats obtenus ont montré que le milieu conçu lors de ce stage, un perméat d'ultrafiltrat de jus de soja supplémenté en peptone de soja, était propice à la croissance de plusieurs souches de bactéries lactiques et propionique. Ce milieu est aussi acidifiable, dans une moindre mesure que dans un milieu laitier, par ces bactéries.Nous nous sommes par la suite intéressés à 2 espèces, Propionibacterium freudenreichii et Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus, et avons constaté des différences de morphologie pour ces deux espèces entre les différents milieux. Le cycle de division cellulaire semblait altéré chez L. bulgaricus dans le milieu soja, tandis que la synthèse de composés de surface était différente chez P. freudenreichii, réduite dans le milieu soja.Ces différences morphologiques ont en partie été confirmées par les analyses protéomiques.En effet, les deux bactéries cultivées dans les deux milieux montrent des profils très différents. Chez L. bulgaricus, le métabolisme des sucres est très différent, la bactérie s'est adaptée au milieu de culture. Le milieu soja est d'ailleurs carencé en certaines vitamines jouant un rôle dans le cycle cellulaire. Pour P. freudenreichii, 3 des 4 protéines de surface impliquées dans les propriétés antiinflammatoires de la souche étudiée sont retrouvées largement sous-exprimées dans le milieu soja.De plus, ce milieu crée un stress oxydatif qui n'est pas retrouvé dans le milieu lait. Des analyses immunologiques par quantification des cytokines ainsi qu'une analyse approfondie de la composition du milieu soja pourraient venir confirmer ces résultats.La meilleure maitrise et compréhension de l'adaptation de ces 2 levains majeurs, P. freudenreichii et L. bulgaricus, au milieu laitier ou soja, ouvre des perspectives dans le domaine du développement de nouveaux aliments fermentés fonctionnels, bons, sûrs et sains. Propionibacterium freudenreichii, Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus, lait, soja, microscopie, protéome Dans un futur proche, la population mondiale aura fortement augmenté, posant ainsi une grande interrogation sur la façon de nourrir ces individus tout en préservant la planète. Le modèle alimentaire actuel n'est pas viable pour subvenir aux besoins de cette future population. L'une des solutions envisagées est une transition vers des produits végétaux fermentés comme le soja. La fermentation peut en effet apporter une attractivité gustative, mais aussi conduire à la fabrication d'aliments fonctionnels grâce à certaines bactéries sélectionnées. Certaines bactéries probiotiques peuvent avoir une influence sur le microbiote intestinal, participant au maintien de l'équilibre de la flore intestinale. De plus, un déséquilibre du microbiote intestinal est corrélé avec certains troubles intestinaux. Nous avons donc utilisé deux milieux, un perméat d'ultrafiltrat de lait et de jus de soja, afin de cultiver des bactéries lactiques et propioniques à potentiel probiotique. Nous nous sommes concentrés sur Propionibacterium freudenreichii et Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus, car ce sont des levains largement utilisés dans l'industrie et que nous avions des données sur ces espèces. Nous avons étudié leurs capacités à se développer dans les différents milieux, leurs capacités d'acidification, leurs morphologies en microscopie optique et à force atomique, ainsi que leurs protéomes totaux. L'étude comparative a montré une meilleure adaptation au milieu laitier pour les deux souches testées, ainsi que des différences morphologiques et protéomiques notables. P. freudenreichii présente une surexpression de ses composés de surface dans le milieu laitier par rapport au milieu végétal. Ces composés sont les principaux responsables des propriétés immunomodulatrices de cette espèce. L. bulgaricus semble peu adapté ce milieu végétal. Ces travaux offrent des perspectives dans le domaine du développement de nouveaux aliments fermentés fonctionnels, bons, sûrs et sains.

	Résumé
	Mots clés :

nutritionnelles et ses avantages écologiques. Néanmoins, il reste relativement peu consommé, notamment à cause de son goût et de ses effets secondaires. Afin de le rendre plus attractif, le soja, peut être fermenté sous forme de « yaourt », offrant de nouvelles perspectives. Cette fermentation peut d'une part apporter de nouveaux arômes plus agréables, de nouvelles textures, et d'autres part conduire à la fabrication d'aliments fonctionnels, notamment grâce à certaines bactéries sélectionnées tant sur le plan technologique que santé. En effet, certaines bactéries dites probiotiques peuvent avoir une influence sur le microbiote intestinal, pouvant ainsi participer au maintien ou à la restauration de son équilibre. Il a été démontré qu'un déséquilibre du microbiote (dysbiose) était lié à certains troubles intestinaux, touchant de plus en plus les pays développés.


Biological meaning of feed conversion ratio

Feed distribution Observed FCR = ------------------------------------------Pig growth

Feed intake + spillage Observed FCR = ------------------------------------------Pig growth

Feed intake "Real" FCR = - -----------------------------------------Growth .17 ---------------------------------------------------lean + fat + bone + skin + organs...

Indigestible + (Maintenance + Growth) FCR = -----------------------------------------------------(protein + water) + lipids +minerals

=> means that FCR depends on :

-digestibility of feed and digestive efficiency of pigs -composition of weight gain (lean/fat ratio) -importance of maintenance versus growth (ADG)

.18 ---------------------------------------------------------------------Indigestible + (maintenance + growth + oversupply)

L. Brossard Innovation and Advances in Precision Farming

P retained (in bones and soft tissues) P efficiency = ----------------------------------------------------------------------Indigestible + (maintenance + growth + oversupply)

=> means that efficiency of nutrient utilization depends on -digestibility of the nutrient -oversupply -Develop new local feed resources that are not/less in competition with food -Improve the nutritional value of feed resources  Gene:

-Use of novel traits indicative for feed efficiency and robustness that can be used as selection criteria -"Do better with feeds that may be worse"  Traits, models, and feeding techniques:

-Appreciate variation among animals -Develop precision feeding techniques -Evaluate the overall sustainability Objectives of the Feed-a-Gene project



  Data usable for farmers but also other stakeholders (processors, feed industry, veterinarians, genetic companies, …) (cloud…)  Already, advances but still progress to do in transforming data to information (from raw data, alone or combined, to usable data as growth curve, feed intake curve, alert information based on temperature feed = about 2/3 of production cost  Environmental impact  Reduction of resource use (feed)  Reduction of nutrient excretion (N, P...)  Quality of products  Lean to fat ratio, Fat quality  Homogeneity of products  The improvement of feed efficiency is a major issue for sustainability of all production systems (conventional & alternative) Feed conversion ratio = Feed / Growth => economic representation of a « cost of production »  Feed efficiency ratio = Growth / Feed => representation of the efficiency of a biological process  Different units of expression  kg feed / kg gain => most common !  MJ Energy / kg gain => biological efficiency !  € of feed / kg gain => economic efficiency !

Feed



  Insure adequate, energy, amino acid and mineral supplies (for growth, health…)  sufficient to maximize growth ( FCR)  not in excess to avoid the increase in excretion and in FCR  the optimal supply depends on pig genotype and sex, and age  Difficult to implement in practice  variation of requirements over time  variability between animals Improve the characterization of individual animals (or small groups)  Feed intake, Growth potential  Body condition  Physical activity, health…  To better adapt supplies …  Quantity / Quality  According to time  to groups or individuals  … and improve efficiency  reduction of cost  reduction of excretion  control Using nutritional simulation models (e.g. InraPorc®) to handle the information and take the decisions  Determination of optimal nutrient supplies Tools for identification and measurement  ex.: weighing scales, automatic feeders (control and measurement of feed intake) Decision support tools  ex.: mathematical models for real-time calculation of individual nutritional requirements taking into account behavior and housing conditions  Tools to control  ex.: automatic feeders able to mix several feed to prepare individual ration to be fed; control of feed composition  An improved knowledge of feed (nutritional composition, feed technology, of a precise matrix for both nutrient requirement and nutrient content of the ingredients; 2. Proper use of modifiers such as enzymes, prebiotics, probiotics, antioxidants, mould inhibitors and other feed additives; 3. Exploiting genetic improvements in animals and feedstuffs; 4. Reduction of toxicants and antinutritive factors; 5. Use of improved feed and feedstuff processing techniques that will lead to better nutrient utilization



  to predict the nutritional value of feedstuffs and feed mixtures by NIRS in real-time  Objectives • To determine if it is possible to use NIRS to predict the nutritive value of animal feed -Chemical components -Digestible energy and macronutrients, and metabolizable energy in pigs • For characterisation of chemical and nutritional properties of feed in With PLF and precision feeding techniques, possible to mix two or more diets  change in formulation practices:  two "extreme" balanced diets (high/low nutrient content)  more than two diets (intermediate diets to reduce costs)  A-B mix then B-C mix then C-D mix with nutrient content A>B>C>D  Two or more non balanced diets to further reduce costs and envt impact Letourneau Montminy et al., 2005; Joannopoulos et al., 2017 Management at farm level: possible to have "all-stages" strategy Better knowledge on animal status and feed /composition impact through real-time in situ data  Targeted actions on [digestibility, efficiency…] through additives depending on feed characteristics  Targeted actions through feed or water for health management or answer to housing conditions  ex.: amino-acids requirements (TRP…) ↗ with deteriorated health status  adjustment through water or feed on supplies depending on Requires to transform data into information, which needs to be integrated  Increases resource efficiency and reduces environmental impact  Accounts for the needs of individuals  New possibilities offered to feed and feed additives producers  formulation  use of new feedstuff  use of additives for more reactive and targeted actions  larger scale (several farms) management of feed provisional…