François Lecompte

Jackie Vergote

Julie Crétien

Marie-Anne Wicke

Narjis Kraimi

Je remercie tout d'abord Raymond Nowak pour sa gentillesse à toute épreuve et sa confiance en mon travail. Fabien Cornilleau et Chantal Moussu pour leurs conseils et leur aide dans la mise en place des expériences et leurs réalisations sur le terrain. (« 6 heures du matin la tête dans le foin! Une vraie équipe de choc »). Maryse Meurisse et Nicole Jouanneau pour leur aide dans la partie neurobiologie de ce travail. (« Le plaisir simple de contempler les marquages comme un ciel étoilé »). Anne-Lyse Lainé pour sa participation et son aide précieuse dans le développement de la méthode de validation du dosage d'ocytocine plasmatique chez l'ovin. (« Toutes ces extractions… tous ces robinets à tourner…mais ça valait largement le coup ! »).

Toute l'équipe du laboratoire de dosages hormonaux de la PRC pour les nombreux dosages de cortisol. (« Et si on rajoutait une prise de sang là aussi ? »).

Sylvie Chalon pour m'avoir accueillie au sein du laboratoire de Tours « d'imagerie moléculaire du cerveau » afin de mettre au point l'autoradiographie des récepteurs de l'ocytocine ainsi que pour ses conseils.

Je remercie particulièrement Patrick Gouat et Christophe Féron de l'université de Paris 13, sans qui cette histoire n'aurait pas pu commencer (notamment par un rapport bibliographique sur le rôle de l'ocytocine et la vasopressine dans la mise en place du lien monogame…).

Enfin les financeurs, la région centre, l'ARN et l'IFR135 pour avoir permis la réalisation de ces expériences.

Résumé

Chez la plupart des mammifères, le jeune développe un lien d'attachement envers l'individu qui prend soin de lui, généralement sa mère. Ce premier lien affectif lui permet non seulement de maintenir la proximité avec la figure d'attachement mais aussi de découvrir et d'explorer son environnement grâce à l'effet apaisant de la présence de cette figure qui peut être utilisée par le jeune comme base de sécurité. D'après John Bowlby et Mary Ainsworth, l'attachement se définit donc par la présence de 3 critères : une augmentation de l'exploration lorsque la figure est présente, une augmentation de la détresse lors d'une séparation et une recherche de proximité, dans un environnement stressant. Un grand nombre d'études menées notamment sur le primate, suggère qu'un tel lien peut s'établir pour des substituts maternels, comme un congénère ou un objet, chez des individus séparés précocement de leur mère. Cependant, l'ensemble des caractéristiques définissant l'attachement n'a jamais été étudié dans ces situations. L'altération de l'activité de l'axe corticotrope (HPA), observée parfois chez ces individus, a amené certains auteurs à remettre en question la présence d'un lien d'attachement, suggérant que le congénère ou l'objet étaient des figures moins sécurisantes qu'une figure d'attachement telle que la mère. L'ocytocine (OT), est un neuropeptide sécrété au niveau du noyau supra-optique et du noyau paraventriculaire de l'hypothalamus (PVN). Si de récentes études ont montré que l'ocytocine favorise les comportements affiliatifs, participe à la formation des liens sociaux et à un effet d'apaisement en diminuant la sécrétion de corticolibérine (CRF) dans le PVN, peu de travaux se sont intéressés au développement du système ocytocinergique en l'absence de figure maternelle.

L'objectif de cette thèse est donc double : 1) vérifier la présence d'un lien d'attachement pour un congénère ou un objet en se basant sur la définition énoncée par John Bowlby et Mary Ainsworth puis, 2) déterminer si les individus élevés en l'absence de figure maternelle, avec un congénère ou un objet, montrent une modification de l'axe HPA et du système ocytocinergique au niveau central (PVN) et au niveau périphérique. Pour répondre à ces objectifs nous avons utilisé le mouton, Ovis aries, modèle prometteur pour l'étude neurobiologique de l'attachement. Nous avons préalablement vérifié la présence des 3 caractéristiques de l'attachement pour la mère et comparé l'attachement fils-mère à l'attachement fille-mère. Dans le cadre de la ségrégation socio-sexuelle chez les ongulés, on suppose que l'attachement fille-mère pourrait être plus accentué que l'attachement fils-mère facilitant dès le jeune âge le regroupement des sexes. Pour répondre au premier objectif nous avons vérifié, dans un contexte de vie en troupeau, si un attachement sélectif pouvait se développer pour un congénère particulier au sein d'un groupe de jeunes agneaux élevés en allaitement artificiel, sans figure maternelle. Nous avons ensuite évalué si un lien d'attachement pouvait se développer pour un congénère ou un objet (ballon) lorsque les agneaux étaient élevés en binôme avec la figure de substitution en comparant l'expression et la force de ces liens à l'attachement pour la mère. Pour répondre au second objectif, nous avons repris ces dernières conditions d'élevage et étudié l'impact de l'absence de figure maternelle sur l'activité de l'axe HPA et du système ocytocinergique au niveau périphérique et du PVN. Finalement nous avons évalué la faisabilité de l'utilisation d'une méthode d'autoradiographie pour cartographier au niveau central les récepteurs de l'ocytocine chez l'agneau.

Cette thèse montre la présence de l'attachement pour la mère, plus marqué chez les filles que chez les fils, c'est pourquoi les travaux de type neuroendocrinologique ont été menés sur des jeunes femelles. 1) Lorsque des agneaux de même âge sont élevés en groupe sans figure maternelle, ils ne développent pas de lien affectif sélectif pour un congénère particulier contrairement aux agneaux maternés qui montrent, en plus de leur forte préférence sélective pour la mère, des préférences d'interaction avec certains congénères de même âge. Lorsque les agneaux sont élevés en binôme avec un congénère, favorisant ainsi la proximité pour une seule figure, un lien affectif sélectif se développe. Néanmoins ce lien affectif semble différer de l'attachement notamment par le fait que le congénère n'est pas une base de sécurité à l'exploration, caractéristique qui différentie l'attachement des autres liens affectifs. Les agneaux élevés avec un objet (ballon) ne semblent pas partager de lien affectif pour cette figure, mais montrent plus d'intérêt envers les soigneurs humains que les agneaux maternés ou ceux élevés avec un congénère. 2) D'un point de vue neurophysiologique, les agneaux élevés en absence de figure maternelle (avec un congénère ou un objet) ont des taux de cortisol plasmatique plus élevés à 24 heures, mais ces taux ne diffèrent plus de ceux des agneaux maternés de 3 à 18 jours. A 21 jours, les agneaux élevés en l'absence de figure maternelle montrent une réduction du nombre de neurones contenant du CRF au sein du PVN. Ces résultats traduisent une situation potentiellement stressante dans les premières heures de vie et une capacité d'adaptation de l'axe HPA à ces contextes d'élevage qui pourrait passer par une réduction de la production et de la sécrétion de CRF dans le PVN. Alors que l'OT ne semble pas être sécrétée au niveau périphérique suite à des rencontres ou des contacts sociaux affiliatifs non nutritifs, les individus élevés sans figure maternelle montrent un pic de sécrétion basale d'OT à 5 jours et les animaux élevés avec un ballon montrent une altération plus durable de la sécrétion d'OT périphérique. D'un point de vue central, les individus élevés sans figure maternelle ont plus de neurones contenant de l'OT que les individus maternés.

L'augmentation d'une sécrétion centrale d'OT au niveau du PVN, pourrait participer à la réduction de la sécrétion de CRF pour faire face à un contexte néonatal stressant. Concernant les récepteurs de l'ocytocine, alors que la méthode d'autoradiographie semble applicable pour évaluer leur distribution dans le cerveau de rat et au niveau de l'utérus de brebis, la technique semble montrer ses limites pour le cerveau d'agneau où aucun marquage clair n'a pu être mis en évidence.

En conclusion, cette thèse souligne par l'étude de l'ensemble des caractéristiques de l'attachement, l'absence d'un tel lien pour un congénère ou un objet comme substitut maternel chez l'agneau. L'absence de figure maternelle, alors même qu'un lien affectif se crée pour un congénère, conduit à une altération centrale de l'axe HPA et du système ocytocinergique qui pourrait résulter de mécanismes d'adaptation à un stress néonatal. La proximité et la propriété apaisante de la figure maternelle, notamment par les soins prodigués au jeune dès ses premières heures de vie, pourraient participer à l'établissement du lien d'attachement et à la mise en place de l'axe HPA et du système ocytocinergique.

Mots clés : attachement, relation mère-jeune, substitut maternel, hypothalamus, ocytocine, corticolibérine.

However, all of the characteristics defining the attachment have not been studied in these situations. The alteration of the activity of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis (HPA), sometimes observed in these individuals, has led some authors to question the presence of an attachment bond, suggesting that the peer or the object were less reassuring than an attachment figure as the mother. Oxytocin (OT) is a peptide secreted in the supraoptic nucleus and paraventricular nucleus of the hypothalamus (PVN). If recent studies have shown that it promotes affiliative behaviors, participates in the formation of social bonds and has an appeasing effect by reducing the secretion corticotropin-releasing-hormone (CRF) in the PVN, few studies have focused on the development of ocytocinergique system in the absence of maternal figure.

The objective of this thesis is twofold: 1) verify the presence of an attachment bond to a peer or an object based on the definition given by John Bowlby and Mary Ainsworth then 2) determine whether individuals bred without mothers, with a object or a peer figure, endure modification of the HPA axis and oxytocinergic system centrally (PVN) and peripherally. To respond to these objectives we used sheep, Ovis aries, promising model for the neurobiological study of attachment. We have previously verified the presence of three characteristics of attachment to the mother and compared the mother-son to the motherdaughter attachment. In regard to socio-sexual segregation in ungulates, it is assumed that the mother-daughter attachment could be more pronounced than mother-son attachment, facilitating an early same sex grouping. To respond to the first objective we checked, in a context of artifical rearing in a small group, whether a selective attachment could develop with particular peers without mother figure. We then evaluated whether an attachment relationship could develop to a conspecific or an object (gym ball) when the lambs were reared in pair with it by comparing the expression and strength of these bond to attachment to the mother. To respond to the second objective, we studied the impact of the absence of maternal figure in peer and object reared lamb in pair on the activity of the HPA axis and oxytocinergic system at the peripheral level and PVN. Finally we evaluated the feasibility of using a method of autoradiography to map at the central level the oxytocin receptors in lambs.

This thesis shows the presence of attachment to the mother, stronger for daughters than for son. 1) When the lambs of the same age are reared in groups without a mother figure, they do not develop selective preferential bond for a particular peer unlike mothered lambs which show, in addition to their strong selective preference for the mother, prefered interactions with same age peer. When lambs are reared in pair with a peer, promoting close to a single figure, a selective affectional bond develops. Nevertheless it seems to differ from attachment by the fact that the peer seems not a secure base from which to explore, characteristic that differentiates the attachment of other affectional bonds. The lambs reared with an object (ball) do not seem to share emotional bond to this figure but show more interest towards human caregiver than motherd and peer-reared lambs. 2) Neurophysiological studies of maternally deprived lambs reared with a peer or an object, have higher plasma CORT level at 24 hours after birth, but these levels differ no longer from 3 to 18 days. At 21 days, lambs in the absence of maternal figure show a reduced number of neurons containing the CRF within the PVN. These results reflect a potentially stressful situation in the first hours of life and adaptability of the HPA axis to these breeding contexts that could involve a reduction in the production and secretion of CRF in the PVN. While the OT seems not secreted at the peripheral level during an appeasing reunion after a separation or during non-nutritive affiliative contacts, maternally deprived lambs show a peak of basal secretion of OT at five days of age and object-reared lambs show persistent peak of peripheral secretion. At the central level, maternally deprived lambs have more neurons containing OT compared to mothered individuals. The increase of central OT secretion in the PVN, could participate to stress coping strategy toward a stressful neonatal context and favour the reduction of CRF in the PVN. Concerning oxytocin receptors (OTRs), while the autoradiographic method reveal OTRs in rat brain and the uterus of sheep, this technique appears to show its limits for the lamb brain where no clear marking could not be identified.

In conclusion, this thesis emphasizes the presence of all the features of attachment in 3 weeks lambs and the absence of such a bond for a peer or an object in absence of the mother figure in lambs. The absence of a maternal figure, even if an affectional bond is developed for a peer, leads to a central alteration of the HPA axis and oxytocinergic system that may result from coping with neonatal stress. The proximity and soothing property of the mother figure, including the care of the young from the very first hours of life, could participate in the establishment of the attachment relationship and participate to the homeostasis of HPA and oxytocinergic systems. (Bowlby, 1969) (Figure 1). L'attachement (ou lien d'attachement) est un lien affectif qui se développe entre le nouveauné et les figures qui prennent soin de lui (caregiver). Le lien affectif est définit par Ainsworth et ses collègues comme un lien émotionnel durable avec un partenaire qui prend une importance particulière puisqu'il n'est ni remplaçable ni interchangeable (sélectif) et devient de ce fait unique (Ainsworth, 1989 ;Bowlby, 1969). La présence d'un lien affectif se traduit par la présence de détresse lors d'une séparation et une recherche de proximité avec la figure. En plus de ces caractéristique, l'attachement diffère des autres liens affectifs par l'effet de base de sécurité (Ainsworth, 1989 ;Bowlby, 1969). L'effet de base de sécurité de la figure d'attachement permet au jeune de s'engager dans d'autres activités telles que l'exploration car il peut, si nécessaire, revenir près de la figure apaisante (Ainsworth, 1989 ;Ainsworth & Bell, 1970 ;Bowlby, 1969). La présence du lien d'attachement se traduit donc par 3 caractéristiques clés : 1) une détresse lors d'une séparation avec la figure d'attachement, 2) une recherche de proximité, particulièrement dans un contexte stressant, et 3) une utilisation de la figure d'attachement comme base de sécurité pour l'exploration (Ainsworth, 1989 ;Ainsworth & Bell, 1970 ;Weiss, 1982).

Liste des figures

Bowbly, qui a une vision plus évolutionniste de l'attachement de par l'influence des recherches de Lorenz, décrit le système d'attachement comme un système motivationnel (système de contrôle qui permet d'exprimer des comportements dans un but précis) capable de s'activer et se désactiver en fonction du contexte perçu par le jeune (Bowlby, 1969 ;[START_REF] Hinde | Ethology and attachment theory[END_REF]. Ce système d'attachement, dont le lien d'attachement fait intimement partie, permet au jeune de garder la proximité avec la mère lorsqu'il s'active, en déclenchant l'expression des comportements d'attachement. Ainsi, lorsque l'environnement est perçu comme apaisant, le système d'exploration s'active et le système d'attachement se désactive : les comportements d'attachement sont absents et l'attention est focalisée sur l'environnement plutôt que sur le caregiver. Au contraire, lorsqu'un danger est perçu, le système d'exploration s'inhibe et celui de l'attachement s'active : le jeune exprime les comportements d'attachement envers son caregiver focalisant son attention sur lui (Figure 2). Ainsworth souligne par ailleurs l'importance de la qualité sécurisante de l'attachement dans la transition harmonieuse du système exploratoire au système d'attachement, et vice versa (Ainsworth, 1989 ;Ainsworth & Bell, 1970). Mise en place de l'attachement pour la mère Chez la plupart des modèles utilisés, l'étude du développement de l'attachement s'est focalisée sur la recherche de proximité ou les vocalisations. La proximité entre la mère et le jeune est favorisée très tôt après la naissance par une forte attraction mutuelle. Le nouveau-né est rapidement attiré par des indices clés portés par la mère, comme l'odeur du lait provenant de la mamelle, et les phéromones mammaires (pour revue : Porter & Winberg, 1999) mais aussi par les caractéristique apprises potentiellement in utero, comme la reconnaissance vocale de la mère (Homme : [START_REF] Hepper | Newborn and fetal response to maternal voice[END_REF]mouton : Vince, Billing, Baldwin, Toner & Weller, 1985). Ces caractéristiques lui permettent d'être guidé rapidement vers la mère et la mamelle. La mère d'autre part, est attirée par les indices olfactifs et auditifs provenant du jeune (revue : [START_REF] Lévy | Olfactory regulation of maternal behavior in mammals[END_REF]. Les indices sensoriels portés par la mère tel que la chaleur (rat : [START_REF] Kojima | Warmth from Skin-to-Skin Contact with Mother Is Essential for the Acquisition of Filial Huddling Preference in Preweanling Rats[END_REF]rat et hamster : Sokoloff et al., 2002), une silhouette particulière en mouvement (cochon d'inde : [START_REF] Shipley | The demonstration in the Guinea pig of a process resembling classical imprinting[END_REF]Sluckin, 1968 ;mouton : Vince, 1985mouton : Vince, , 1987) ) ou des indices tactiles tel que la fourrure (macaque rhésus : Harlow, 1959), permettent d'induire la mise en place d'une préférence de proximité. Si la valeur nutritive de la figure ne semble pas déterminante dans la formation d'une première relation préférentielle, lorsqu'elle est associée à des indices clés d'une figure, la tétée semble faciliter la discrimination de la figure et la mise en place d'un lien émotionnel (macaque rhésus : Harlow & Zimmerman, 1959 ;mouton : Nowak et al., 1997a, b ;[START_REF] Val-Laillet | Nonnutritive Sucking : One of the Major Determinants of Filial Love[END_REF]rat : Moriceau & Sullivan, 2004). Chez l'enfant, Bowbly (1969) décrit les différentes phases du développement de l'attachement.

Dans la première phase (0 -8 semaines), l'enfant n'est capable de discriminer les individus que par des indices olfactifs et auditifs et n'oriente pas sélectivement ses comportements d'attachement et ses interactions positives envers une figure particulière. Dans une seconde phase (8 semaines -6 mois), l'enfant montre une sélectivité plus grande en dirigeant ses comportements envers la mère. Dans une troisième phase (6 mois -3 ans) l'enfant est capable de maintenir la proximité sélective avec la mère et de l'utiliser comme base de sécurité pour l'exploration. Dans cette dernière phase, l'enfant exprime ainsi pleinement toutes les caractéristiques de l'attachement (Ainsworth, 1989 ;Bowlby, 1969). Si les séparations courtes sont traduites par la présence de comportements d'attachement qui visent à rejoindre et alerter la figure, les séparations plus longues sont de plus caractérisées par une phase de dépression et de désespoir (Bowlby, 1969[START_REF] Bowlby | Attachment and loss[END_REF]. La présence de l'attachement a été mise en évidence chez le macaque rhésus (Macaca mulatta) et les primates de l'Ancien Monde (Higley & Suomi, 1986). Après sa naissance, le jeune macaque rhésus, par exemple, reste en contact constant pendant plusieurs semaines avec sa mère et développe un lien émotionnel fort pour cette figure durant cette période. La séparation donne lieu à une situation de détresse intense avec une période de désespoir aussi notée chez l'enfant (Reite & Capitanio, 1985 ;Reite et al., 1981 ;Seay et al., 1962). Dès le deuxième mois, le jeune est particulièrement curieux et est fortement attiré par les stimuli physiques et sociaux de son environnement, s'écartant plus souvent de la mère. Cependant à cet âge, la mère est la principale responsable de la proximité, en retenant le jeune ou en allant le chercher. Ce n'est qu'entre 2 et 3 mois, lorsque le jeune macaque exprime des comportements de peur en réaction à d'autres individus du groupe social, qu'il est majoritairement responsable des épisodes de proximité avec la mère. Il apprend alors à utiliser la mère comme base de sécurité, revenant à tout moment en contact avec elle suite à un événement stressant, de manière analogue à ce qui est décrit chez l'enfant.

La présence de la mère chez l'enfant comme chez le primate rhésus favorise l'exploration physique et sociale du jeune par son effet de base de sécurité (Ainsworth, 1989 ;Ainsworth et Bell, 1970 ;Harlow et al., 1963) et participe à son développement social (macaques : [START_REF] Suomi | Mother-Infant Attachment, Peer Relationships, and the Development of Social Networks in Rhesus Monkeys[END_REF] et cognitif (enfants : [START_REF] Main | Exploration, play and cognitve functioning related to infant-mother attachment[END_REF][START_REF] De Ruiter | Attachment and cognition : A review of the litterature[END_REF]. Si l'ensemble des 3 caractéristiques de l'attachement pour la mère (détresse lors d'une séparation, proximité recherchée particulièrement dans un environnement stressant et base de sécurité à l'exploration) a été montré chez le primate humain et non-humain, chez les autres mammifères et notamment les rongeurs, la base de sécurité reste encore à démontrer. La présence de l'attachement chez les différentes espèces de mammifères dépend de la capacité du jeune à discriminer la figure d'attachement des autres figures familières ainsi que de l'effet sécurisant de la présence de la figure d'attachement qui permet l'exploration. La présence de l'attachement pour la mère est donc tout particulièrement attendue chez les espèces vivant au sein d'un groupe social où la mère est la source principale de sécurité lorsque le jeune est amené à explorer l'environnement.

Mise en évidence de l'attachement et de sa qualité : Situation étrange Pour tester la présence et la qualité de l'attachement chez l'enfant, Ainsworth a mis en place un test réalisé en laboratoire appelé "Situation étrange" (Ainsworth & Bell, 1970 ;Ainsworth et al., 1971). Ce paradigme consiste en une série de séparations et de réunions avec la mère ou une femme non familière, dans une pièce contenant des jouets (Figure 3).

Dans ce protocole, l'attachement sécurisant (secure) est caractérisé par 1) la propension du jeune à jouer en présence de la mère et de l'individu non familier, 2) l'arrêt de l'exploration et la présence de comportement de détresse lorsque la mère quitte la pièce, et 3) l'apaisement rapide et le retour aux jeux lors du retour de la mère. Ce test met aussi en évidence l'altération de la qualité sécurisante de l'attachement chez certains individus. Les enfants partageant un attachement insécurisant (insecure) se répartissent en 3 catégories (Ainsworth et al., 1978). L'attachement insecure « évitant » est caractérisé par une faible réaction de l'enfant lors de la séparation avec la mère, et des comportements d'évitement de la mère pendant la réunion. L'attachement insecure « résistant » (aussi appelé ambivalent) est caractérisé par peu d'exploration et beaucoup de comportements de détresse, notamment lors de la séparation avec la mère. Cependant, ils montrent aussi, lors de la réunion, des comportements de rejet de la figure (Ainsworth et al., 1978). Une dernière catégorie d'attachement a été décrite plus tardivement par Main et Salomon (1990), appelée « désorganisée » (ou « désorientée »). Ces enfants expriment un manque de cohérence dans leur stratégie d'attachement, traduits par des comportements désorganisés et contradictoires ainsi que des stéréotypies.

Le test de la Situation étrange a été adapté à d'autres contextes que la relation jeune-mère, notamment pour évaluer la présence d'un lien d'attachement dans le cadre de la relation Plusieurs études suggèrent la présence d'un attachement du chien pour son maitre en utilisant une version adaptée de la Situation étrange. En effet, les chiens montrent un panel de comportements d'attachement (vocalisations, augmentation des comportements de recherche) lors de la séparation avec le maître par rapport à un individu non familier (Prato-Previde et al., 2003 ;[START_REF] Topál | Attachment to humans : a comparative study on hand-reared wolves and differently socialized dog puppies[END_REF]. De plus, les chiens utilisent leur propriétaire comme base de sécurité, sa présence augmentant l'exploration et les épisodes de jeux (Palmer & Custance, 2008 ;Prato-Previde et al., 2003). Palmer et Custance (2008)

Interaction avec la figure d'attachement et qualité du lien

La qualité de l'interaction avec la figure d'attachement et particulièrement la sensibilité maternelle, c'est-à-dire la capacité de la mère à percevoir et répondre de manière adéquate aux besoins du jeune [START_REF] Ainsworth | Infant-mother attachment and social development: Socialisation as a product of reciprocal responsiveness to signals[END_REF], a été suggérée comme jouant un rôle dans la mise en place d'un attachement secure [START_REF] Ainsworth | Infant-mother attachment and social development: Socialisation as a product of reciprocal responsiveness to signals[END_REF](Ainsworth et al., , 1978 ; ;[START_REF] Atkinson | On the Relation Between Maternal State of Mind and Sensitivity in the Prediction of Infant Attachment Security[END_REF][START_REF] Laranjo | Associations between maternal mind-mindedness and infant attachment security: investigating the mediating role of maternal sensitivity[END_REF][START_REF] Lundy | Father's and mother's infant face-to-face interaction:Differences in mind-related comments and infant attachment?[END_REF][START_REF] Mcelwain | Maternal sensitivity to infant distress and nondistress as predictors of infantmother attachment security[END_REF][START_REF] Meins | Rethinking maternal sensitivity: Mother's comments on infant's mental processes predict security of attachment at 12 months[END_REF].

Au contraire, les enfants subissant des maltraitances de la part de leur figure d'attachement ont plus de chance de développer un attachement de moindre qualité, désorganisé et plus généralement insecure [START_REF] Baer | Child maltreatment and insecure attachment: a meta-analysis[END_REF][START_REF] Lamb | The Effects of Child Maltreatment on Security of Infant-Adult Attachment[END_REF]. Certains auteurs ont suggérés que les différents patterns d'attachement insecure étaient des stratégies pour faire face à des interactions inadaptées avec la figure d'attachement. D'après cette théorie, le pattern « évitant » qui minimise les comportements de détresse serait associé à une figure répondant de manière négative aux comportements d'attachement émis par l'enfant [START_REF] Main | Avoidance in the service of attachment In[END_REF]. Le pattern « résistant », caractérisé par une augmentation de la détresse, pourrait servir à maintenir l'attention d'une figure qui répond de manière intermittente aux besoins du jeune. L'attachement insecure « désorganisé », quant à lui, pourrait refléter une situation de conflit interne et résulter d'une figure ayant des comportements non sécurisants, voir effrayants [START_REF] Main | Parents' unresolved traumatic experiences are related to infant Disorganized attachment status: Is frighten d and/or frightening parental behavior the linking mechanism[END_REF]. Chez les modèles non humains, l'impact de la qualité des interactions sur la qualité de l'attachement a été moins étudié. Une étude chez le chimpanzé séparé de sa mère quelques heures après sa naissance et élevé en nurserie montre que l'augmentation de la disponibilité et la qualité de l'interaction avec le soigneur humain augmente les chances de développer un attachement secure et augmente les capacités cognitives des jeunes [START_REF] Van Ijzendoorn | Enhancement of Attachment and Cognitive Development of Young Nursery-Reared Chimpanzees in Responsive Versus Standard Care[END_REF].

Nature du lien affectif pour un substitut maternel

Pour mettre en évidence les caractéristiques d'une figure qui permettent et influencent le développement de l'attachement secure chez le jeune, plusieurs études ont testé si ce lien pouvait se développer pour un substitut maternel tel qu'un objet inanimé portant les indices clés attractifs de la mère ou une figure sociale non maternelle. Ces études se concentrent principalement sur les macaques rhésus mais aussi l'ovin (Ovis aries) connu pour former un lien affectif sélectif pour la mère dès 72 heures après la naissance. (Nowak et al., 1997a et b).

Les résultats de ces études suggèrent qu'un lien se met en place en absence de mère pour un objet ayant des indices clés (macaque rhésus : Harlow, 1959 ;Harlow et Zimmerman, 1959 ;Hennessy et al., 1979 ;Meyer et al., 1975 ;Reite et al., 1978 ;mouton : Cairns, 1966a et b), un compagnon social tel qu'un congénère ou un individu d'une autre espèce (macaque rhésus : Boccia et al., 1989 ;Higley et al., 1992 ;Mason & Capitanio, 1988 ;Mason & Kenney 1974 ;mouton : Cairns & Johnson, 1965, Figure 4).

Chez ces deux modèles, le lien développé pour l'objet comme pour le partenaire social est caractérisé par une recherche de proximité et une augmentation de la détresse lors d'une séparation (macaque rhésus : objet : Harlow et Zimmerman, 1959 ;Hennessy et al., 1979 ;Mason & Capitanio, 1988 ;figure sociale : Chamove et al., 1973 ;Mason & Capitanio, 1988 ;Meyer et al., 1975: mouton : objet et figure sociale : Cairns, 1966a et b ;Cairns & Johnson, 1965). La notion de base de sécurité a été peu observée dans ces cas de substituts maternels. Une étude de Harlow et Zimmerman (1959) montre néanmoins, chez les macaques rhésus élevés avec un objet, une exploration plus importante d'un environnement nouveau en présence de l'objet familier par rapport à son absence. Cependant, ces liens formés pour des substituts tels que des objets ou des figures sociales semblent différer de l'attachement jeunemère.

Chez le macaque rhésus élevé avec un objet, Hennessy et al. (1979) ont montré que les vocalisations de détresse étaient stoppées si, lors d'une séparation dans le milieu familier, un objet similaire à l'objet familier mais identifié olfactivement par le jeune comme différent de la figure habituelle était introduit dans la cage. De plus, dans un environnement nouveau, la réaction de détresse suite à la séparation semble moins intense qu'une séparation avec la mère (Reite et al., 1978). Cette diminution de la réactivité lors d'une séparation pourraient être signe d'un lien mois fort et de moindre qualité, qui ne semble par ailleurs pas sélectif et donc ne pas respecter la caractéristique unique et non interchangeable d'une figue pour laquelle un lien affectif s'est développé (Ainsworth, 1989 ;Bowlby, 1969). Contrairement au lien formé pour un objet, le lien pour un partenaire social chez le macaque rhésus semble sélectif et remplir les critères d'un lien affectif (Higley et al., 1992 ;Mason & Kenney 1974). Deux études, l'une menée sur des macaques rhésus et l'autre sur des moutons ont montré que le lien développé pour une figure sociale était plus stable et plus pérenne que celui développé pour un objet. En effet, chez le macaque rhésus, le lien pour l'objet semble réversible lorsqu'il est remplacé par une figure sociale telle qu'un chien (Mason & Capitanio, 1988). Chez l'agneau, la préférence pour l'objet semble s'éteindre plus facilement que celle exprimée pour une figure sociale (Cainrs, 1966a). Si un lien affectif se développe pour la figure sociale non maternelle, quelques données sur le primate suggèrent que le lien s'exprime de manière différente de l'attachement jeune-mère et pourrait être moins fort et moins sécurisant (Boccia et al., 1989 ;Meyer et al., 1975 ;Suomi, 1997). En effet, chez le macaque rhésus, les congénères procurent moins d'apaisement dans un environnement nouveau par rapport à la mère (macaque rhésus : Higley et al., 1992). Une étude a mis de plus en évidence une réversibilité partielle du lien développé avec un congénère de même âge chez cette espèce : un individu élevé avec un congénère pendant les 6 premiers mois de sa vie peut montrer une préférence accrue pour un individu familier avec lequel il a été hébergé pendant 2 semaines après avoir été séparé de sa première figure. Cependant, après une période d'isolement, la préférence pour la figure primaire se réaffirme (Chamove et al., 1973). Finalement, chez le macaque à queue de cochon (Macaca nemestrina) une séparation prolongée avec les congénères n'entraine pas de comportements de désespoir contrairement à la séparation d'avec la mère (Boccia et al., 1989). Aux vues de ces altérations, quelques auteurs ont proposé l'absence d'un attachement similaire à celui jeune-mère pour des substituts tel que des objets avec un indice saillant ou un partenaire social (Boccia et al 1989 ;Meyer et al., 1975 ;Reite et al., 1978 ;Suomi, 1997). Ces liens seraient moins sécurisants (Suomi, 1997) .

Résumé : Figure maternelle et formation de l'attachement

Neurophysiologie du système de stress

Phénoménologie du stress

Les organismes vivants survivent en maintenant un équilibre complexe et dynamique appelé homéostasie [START_REF] Chrousos | Mechanisms of physical and emotional stress[END_REF](Chrousos et al. , 1992 ; ;Gold et al., 1988a, b). Cet équilibre est constamment soumis à des forces intrinsèques ou extrinsèques le déstabilisant, aussi appelées stresseurs. Le maintien de l'homéostasie lors de situation de stress requiert donc une réponse adaptative pour maintenir l'équilibre homéostatique, qui implique des réponses pouvant être physiologiques, physiques et cognitives. Plusieurs situations de stress impliquant des stresseurs externes physiques ou émotionnels entrainent une redirection de la distribution de l'énergie, nécessaire pour préparer le corps à un effort soudain et pour répondre et faire face efficacement au stresseur (gluconéogenèse, augmentation de la fréquence cardiaque et respiratoire, suppression des comportements alimentaires et reproductifs). Cette redirection de l'énergie est facilitée par les glucocorticoïdes (GCs) sécrétés par l'axe hypothalamohypophysaire (HPA), qui modulent par ailleurs l'état d'alerte et certaines fonctions cognitives comme la mémoire. Le terme de stress peut avoir une définition très large. Dans cette étude nous nous intéresserons particulièrement aux situations de stress engendrant (en dehors du contexte d'habituation) une réaction comportementale et physiologique de l'axe HPA [START_REF] Levine | A definition of stress?[END_REF]. Le système de stress concernera plus particulièrement les mécanismes mis en jeu dans cette réponse. L'efficacité de la réponse du système de stress dépend non seulement de la rapidité de la réponse appropriée mais aussi de la régulation de l'intensité de la réponse afin que celle-ci ne soit pas exagérée. Toutes les situations de stress ne sont pas délétères pour l'individu, particulièrement les stress de magnitude moyenne, brefs et contrôlables, qui peuvent être perçus comme plaisants ou excitants et qui contribuent au développement émotionnel et intellectuel de l'individu. Au contraire, les stress prolongés, incontrôlables semblent conduire à une dérégulation du système de stress et favoriser des états pathologiques (revues : [START_REF] Chrousos | Stressors, Stress and Neuroendocrine Integration of the Adaptative Response. The 1997 Hans Selye Memorial Lecture[END_REF], Chrousos & Gold, 1992).

Les principaux acteurs de la réaction au stress

Les principaux composants de la réponse centrale du système de stress sont situés au niveau de l'hypothalamus et du tronc cérébral. Ils incluent les neurones parvocellulaires à corticolibérine (CRF) du noyau paraventriculaire de l'hypothalamus (PVN) et de la médulla, les neurones produisant l'arginine-vasopressine (AVP) au niveau du PVN ainsi que les neurones noradrénergiques du locus coeruleus (LC), de la médulla et du pont (système LC/NE) (Figure 5). La réponse périphérique est régulée majoritairement par l'axe HPA, et le système LC/NE, tous deux stimulés par le CRF [START_REF] Chrousos | Mechanisms of physical and emotional stress[END_REF]Chrousos & Gold, 1992 ;Gold et al., 1988a , b ;Gunnar & Quevedo, 2007 ;[START_REF] Ulrich-Lai | Neural regulation of endocrine and autonomic stress responses[END_REF].

Le CRF

Le CRF joue un rôle particulièrement important dans la réponse adaptative périphérique et comportementale. En effet l'injection intra-cérébro-ventriculaire (icv) de CRF permet d'induire l'élévation de GCs par stimulation de l'axe HPA [START_REF] Rock | Corticotropin releasing factor administered into the ventricular CSF stimulates the pituitary-adrenal axis[END_REF] (Figure 6) et déclencher une réponse comportementale et émotionnelle [START_REF] Sutton | Corticotropine releasing factor produces behavioral activation in rats[END_REF] exprimée lors de situations de stress (pour revue [START_REF] Dunn | Physiological and behavioral-responses to corticotropin-releasing factor administration -Is CRF a mediator of anxiety or stress responses[END_REF] [START_REF] Sawchenko | The Functional Neuroanatomy of Corticotropin-Releasing Factor[END_REF]. Au contraire, chez la brebis, les neurones parvocellulaires et magnocellulaires exprimant le CRF sont trouvés, en plus du PVN [START_REF] Chaillou | Long-Term Undernutrition Followed by Short-Term Refeeding Effects on the Corticotropin-Releasing Hormone Containing Neurones in the Paraventricular Nucleus : An Immunohistochemical Study in Sheep[END_REF]Matthews et al., 1991) au niveau du cortex, du LC, du pont et du cervelet mais aucun ne sont mis en évidence au sein du SON, du MPOA et du BNST, contrairement au rat (Matthews et al., 1991).

L'AVP

L'AVP est un nonapeptide qui est exprimé au niveau du PVN, du noyau supraoptique (SON) et suprachiasmatique de l'hypothalamus [START_REF] Brownstein | Synthesis , Transport , and Release of Posterior Pituitary Hormones[END_REF][START_REF] Swanson | Hypothalamic integration: organization of the paraventricular and supraoptic nuclei[END_REF]. Les neurones magnocellulaires produisant et sécrétant l'AVP projettent leurs axones au niveau de la partie postérieure de l'hypophyse pour la libérer dans la circulation générale.

En plus des neurones magnocellulaires, quelques neurones parvocellulaires produisent et sécrètent l'AVP au niveau de l'hypophyse où le peptide potentialise l'effet du CRF sur la sécrétion d'adrénocorticotrophine (ACTH) au niveau de l'hypophyse antérieure [START_REF] Antoni | Vasopressinergic control pituitary adrenocorticotropin secretion comes age[END_REF][START_REF] Birnbaumer | Vasopressin Receptors[END_REF][START_REF] Rivier | Modulation of stress-induced ACTH release by corticotropin-releasing factor, catecholamines and vasopressin[END_REF][START_REF] Whitnall | Regulationfo the hypothalamique corticotrotpin-releasing hormone neurosecretory system[END_REF] (Figure 6). Lors d'un stress, la proportion de neurones contenant à la fois du CRF et de l'AVP augmente [START_REF] Goeij | Repeated stress enhances vasopressin synthesis in corticotropin releasing factor neurons in the paraventricular nucleus[END_REF] et les pics de sécrétion de ces deux hormones augmentent en amplitude et se synchronisent [START_REF] Tsigos | Physiology of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in health and dysregulation in psychiatric and auto-immune disorders[END_REF].

Le système LC/NE

Le système LC/NE est constitué de neurones noradrénergiques impliqués dans la réponse du système sympathique et favorisant la réponse de l'axe HPA lors d'un stress. Le système LC/NE interagit avec l'axe HPA de par la stimulation de la sécrétion de noradrénaline par le CRF et la stimulation de sécrétion de CRF par la noradrénaline (Chrousos & Gold, 1992).

L'activation du système LC/NE est ainsi capable d'induire la sécrétion d'ACTH [START_REF] Ward | Inhibitory and Facilitatory Areas of the Rostral Pons Mediating ACTH Release in the Cat[END_REF] en plus des comportements d'anxiété induits par l'activation du système sympathique [START_REF] Elenkov | The Sympathetic Nerve -An Integrative Interface between Two Supersystems : The Brain and the[END_REF]. D'autres régions du système limbique comme l'amygdale, l'hippocampe et le cortex préfrontal participent à la réponse comportementale adaptative au stress et à l'activité de l'axe HPA [START_REF] Feldman | Limbic Pathways and Hypothalamic Neurotransmitters Mediating Adrenocortical Responses to Neural Stimuli[END_REF][START_REF] Forray | Role of noradrenergic projections to the bed nucleus of the stria terminalis in the regulation of the hypothalamic -pituitary -adrenal axis[END_REF][START_REF] Jacobson | The Role of the Hippocampus in Feedback Regulation of the Hypothalamic-Pituitary-Adrenocortical Axis[END_REF]. L'amygdale est stimulée en partie par les projections des neurones noradrénergiques du LC/NE et peut être stimulée suite à l'activation de certaines aires associatives corticales. En réponse à cette stimulation, elle est capable d'inhiber des fonctions du cortex préfrontal [START_REF] Garcia | The amygdala modulates prefrontal cortex activity relative to conditioned fear[END_REF] et de favoriser la sécrétion hypothalamique de CRF [START_REF] Akana | Corticosterone Exerts Site-Specic and State-Dependent Effects in Prefrontal Cortex and Amygdala on Regulation of Adrenocorticotropic Hormone , Insulin and Fat Depots[END_REF][START_REF] Dallman | Chronic stress and obesity : A new view of "' comfort food[END_REF][START_REF] Herman | Limbic system mechanisms of stress regulation : Hypothalamo-pituitary-adrenocortical axis[END_REF](Figure 6).

GCs

GCs

GCs

GCs

Axe HPA Le CRF produit au niveau du PVN par les neurones parvocellulaires est le principal régulateur de l'axe HPA [START_REF] Rivier | Modulation of stress-induced ACTH release by corticotropin-releasing factor, catecholamines and vasopressin[END_REF][START_REF] Vale | Characterization of a 41-residue ovine hypothalamic peptide that stimulates secretion of corticotropin and beta-endorphin[END_REF]. En réponse au stress, le CRF produit au niveau des neurones parvocellulaires du PVN (Figure 7) est sécrété au niveau de l'hypophyse.

Le CRF induit la production d'ACTH au niveau de l'hypophyse antérieure [START_REF] Rivier | Modulation of stress-induced ACTH release by corticotropin-releasing factor, catecholamines and vasopressin[END_REF]. La sécrétion d'ACTH, libérée dans la circulation générale, stimule à son tour le cortex surrénalien et la sécrétion de GCs. Les GCs participent activement à la redirection de l'énergie pour faire face à un stress. Ils permettent notamment la dégradation de plusieurs tissus en diminuant la synthèse et augmentant la dégradation des protéines et de l'ARN. Ils inhibent par exemple l'incorporation du glucose et des acides aminés et favorisent la lipolyse dans les tissus adipeux ainsi que les mécanismes d'immunosuppression et anti-inflammatoires (pour revue : [START_REF] Baxter | Tissue Effects of Glucocorticoids[END_REF]. En plus de ces effets de redirection de l'énergie, les GCs ont une action de régulation négative de l'axe HPA [START_REF] Keller-Wood | Corticosteroid Inhibition of ACTH Secretion[END_REF] et induisent deux types de feedback négatifs. Le premier feedback est une régulation rapide (intervient pour une élévation rapide et brève de GCs circulants). Il régule par exemple la concentration de GCs après une injection de GCs massive [START_REF] Atkinson | Corticosteroids mediate fast feedback of the rat hypothalamic-pituitary-adrenal axis via the mineralocorticoid receptor[END_REF] et implique 3V : 3 ème ventricule. D'après [START_REF] Chaillou | Long-Term Undernutrition Followed by Short-Term Refeeding Effects on the Corticotropin-Releasing Hormone Containing Neurones in the Paraventricular Nucleus : An Immunohistochemical Study in Sheep[END_REF] plus particulièrement les récepteurs minéralocorticoïdes (MRs) chez le rat (Karst et al., 2005).

Ces récepteurs participent à la régulation du niveau basal des GCs et sont sensibles au niveau de GCs circulants [START_REF] De Kloet | in Health and Disease[END_REF][START_REF] Dallman | Pharmacological Evidence that the Inhibition of Diurnal Adrenocorticotropin Secretion by Corticosteroids Receptors[END_REF][START_REF] Ratka | On the role of brain mineralocorticoid (type I) and glucocorticoid (type II) receptors in neuroendocrine regulation[END_REF]. Le second feedback est une régulation à plus long terme des GCs circulants (pour une élévation des GCs de plus longue durée, entre 2 heures et 10 heures, voire plusieurs jours). Il intervient particulièrement dans la régulation des GCs après un stress émotionnel et implique les récepteurs glucocorticoïdes (GRs) [START_REF] De Kloet | in Health and Disease[END_REF][START_REF] Dallman | Pharmacological Evidence that the Inhibition of Diurnal Adrenocorticotropin Secretion by Corticosteroids Receptors[END_REF][START_REF] Ratka | On the role of brain mineralocorticoid (type I) and glucocorticoid (type II) receptors in neuroendocrine regulation[END_REF]. Il est par ailleurs indépendant du taux de GCs circulants au moment du stress. Le PVN et l'hypophyse semblent jouer un rôle important dans la régulation négative plus longue de l'axe HPA (pour revues : Keller-Wood & [START_REF] Keller-Wood | Corticosteroid Inhibition of ACTH Secretion[END_REF][START_REF] Smith | The role of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in neuroendocrine responses to stress[END_REF][START_REF] Watts | Glucocorticoid regulation of peptide genes in neuroendocrine CRH neurons : A complexity beyond negative feedback[END_REF]. En effet, les GCs agissent au niveau du PVN en diminuant son activité et la production et la sécrétion de CRF [START_REF] Kovács | Corticosterone and dexamethasone act at different brain sites to inhibit adrenalectomy-induced adrenocorticotropin hypersecretion[END_REF][START_REF] Sawchenko | Evidence for a local site of action for glucocorticoids in inhibiting CRF and vasopressin expression in the paraventricular nucleus[END_REF], mais aussi directement au niveau de l'hypophyse en inhibant la sécrétion d'ATCH [START_REF] Rochefort | Depletion of pituitary corticotrophin by various stresses and by neurohypophysial preparations[END_REF][START_REF] Koch | Pituitary Nuclear Retention of Dexamethasone and ACTH Biosynthesis[END_REF]Kraicer et al., 1973) et parfois sa production lorsque le stress est perçu sur une longue durée (plus de 24 heures) [START_REF] Engeland | Corticosteroids and ACTH are not required for compensatory adrenal growth[END_REF]. L'augmentation de GCs circulants chez l'individu inhibe d'autre part la production d'AVP [START_REF] Kovács | Glucocorticoid Negative Feedback Selectively Targets Vasopressin Transcription in Parvocellular Neurosecretory Neurons[END_REF][START_REF] Sawchenko | Evidence for a local site of action for glucocorticoids in inhibiting CRF and vasopressin expression in the paraventricular nucleus[END_REF].

Structures limbiques régulant l'axe HPA L'hippocampe

En plus du PVN et de l'hypophyse, des structures limbiques sensibles aux GCs sont capables de réguler l'axe HPA en réponse à des stress plus longs. L'hippocampe est impliqué dans la terminaison de la réponse au stress et de l'activité de l'axe HPA (Jacobson & Sawpolsky, 1991, Figure 8). La stimulation de l'hippocampe diminue l'activité des neurones parvocellulaires du PVN [START_REF] Herman | Evidence for hippocampal regulation of neuroendocrine neurons of the hypothalamo-pituitary-adrenocortical axis[END_REF][START_REF] Sapolsky | Glucocorticoid-sensitive hippocampal neurons are involved in terminating the adrenocortical stress response[END_REF][START_REF] Mizoguchi | Chronic stress attenuates glucocorticoid negative fedback : involvment of the prefrontal cortex and[END_REF] et inhibe la sécrétion de GCs [START_REF] Sapolsky | Glucocorticoid-sensitive hippocampal neurons are involved in terminating the adrenocortical stress response[END_REF] (Figure 6). L'administration de GCs dans l'hippocampe, par exemple, réduit le taux de GCs circulants [START_REF] Diorio | The role of the medial prefrontal cortex (cingulate gyrus) in the regulation of hypothalamic-pituitary-adrenal responses to stress[END_REF][START_REF] Jacobson | The Role of the Hippocampus in Feedback Regulation of the Hypothalamic-Pituitary-Adrenocortical Axis[END_REF]. L'exposition prolongée de l'hippocampe aux GCs semble par ailleurs induire une désensibilisation de cette structure et une réduction de son activité [START_REF] Sapolsky | Why Stress Is Bad for Your Brain[END_REF]. Les lésions hippocampiques augmentent les GCs circulants [START_REF] Knigge | Adrenocortical Response to Stress in Rats with Lesions in Hippocampus and Amygdala[END_REF]primate : Sapolsky et al., 1991), induisent une augmentation de l'expression du CRF et de l'AVP [START_REF] Herman | Selective forebrain fiber tract lesions implicate ventral hippocampal structures in tonic regulation of paraventricular nucleus corticotropin-releasing hormone ( CRH ) and arginine vasopressin ( AVP ) mRNA expression[END_REF] et prolongent la sécrétion d'ACTH et corticostérone après un stress [START_REF] Herman | Contribution of the Ventral Subiculum to Inhibitory Regulation of the Hypot halamo-Pituitary-Adrenocortical Axis[END_REF][START_REF] Sapolsky | Glucocorticoid-sensitive hippocampal neurons are involved in terminating the adrenocortical stress response[END_REF]. La régulation de l'hippocampe sur l'axe HPA semble cependant spécifique au stresseur [START_REF] Herman | Limbic system mechanisms of stress regulation : Hypothalamo-pituitary-adrenocortical axis[END_REF]Mueller et al., 2004) étant impliquée plus particulièrement dans les stress de contention et d'openfield (Herman et al., 1995 ;[START_REF] Herman | Ventral subiculum regulates hypothalamo-pituitary-adrenocortical and behavioural responses to cognitive stressors[END_REF].

Le cortex préfrontal

Le cortex préfrontal (Figure 8) participe à la régulation de l'axe HPA en réponse à un stress.

Les neurones du cortex préfrontal s'activent et sécrètent des catécholamines (adrénaline, noradrénaline et dopamine) après l'exposition à un stress aigu ou chronique [START_REF] Cullinan | Fos Expression in Forebrain Afferents to the Hypothalamic Paraventricular Nucleus Following Swim Stress[END_REF][START_REF] Figueiredo | The medial prefrontal cortex differentially regulates stress-induced c-fos expression in the forebrain depending on type of stressor[END_REF][START_REF] Finlay | Increased dopamine and norepinephrine release in medial prefrontal cortex induced by acute and chronic stress: effects of diazepam[END_REF][START_REF] Jedema | Sensitization of norepinephrine release in medial prefrontal cortex : effect of different chronic stress protocols[END_REF]. Le cortex préfrontal semble avoir un effet inhibiteur sur l'axe HPA, puisqu'une lésion de cette zone entraine une augmentation de l'ACTH et les GCs produits après un stress [START_REF] Diorio | The role of the medial prefrontal cortex (cingulate gyrus) in the regulation of hypothalamic-pituitary-adrenal responses to stress[END_REF]. Les GRs et MRs présents au niveau du cortex préfrontal participent à l'inhibition de l'axe HPA (Figure 6). En effet, chez le rat, une infusion de GCs au niveau du cortex préfrontal atténue le taux d'ACTH et de corticostérone sécrétés après un stress de contention [START_REF] Akana | Corticosterone Exerts Site-Specic and State-Dependent Effects in Prefrontal Cortex and Amygdala on Regulation of Adrenocorticotropic Hormone , Insulin and Fat Depots[END_REF][START_REF] Diorio | The role of the medial prefrontal cortex (cingulate gyrus) in the regulation of hypothalamic-pituitary-adrenal responses to stress[END_REF]. Ici encore, le mécanisme semble spécifique au stresseur [START_REF] Herman | Limbic system mechanisms of stress regulation : Hypothalamo-pituitary-adrenocortical axis[END_REF] car cette réponse n'est pas exprimée en réponse à des vapeurs d'éther par exemple [START_REF] Akana | Corticosterone Exerts Site-Specic and State-Dependent Effects in Prefrontal Cortex and Amygdala on Regulation of Adrenocorticotropic Hormone , Insulin and Fat Depots[END_REF]. Amygdale L'amygdale (Figure 8) semble, au contraire de l'hippocampe, activer l'axe HPA. La stimulation de l'amygdale favorise la sécrétion de GCs plasmatiques [START_REF] Matheson | Effects of amygdaloid stimulation on pituitary-adrenal activity in conscious cats[END_REF][START_REF] Van De Kar | Forebrain Pathways Mediating Stress-Induced Hormone Secretion[END_REF]. Les neurones de l'amygdale médiane sont particulièrement activés après un stress émotionnel comme un stress induit par la présence d'un prédateur, un test de nage forcée, une période de contention ou une défaite sociale dans un test de residentintuder [START_REF] Cullinan | Pattern and time of immediate early gene expression in ray brain following acute stress[END_REF][START_REF] Kollack-Walker | Social Stress in Hamsters: Defeat Activates Specific Neurocircuits within the Brain[END_REF], 1999 ;[START_REF] Figueiredo | The medial prefrontal cortex differentially regulates stress-induced c-fos expression in the forebrain depending on type of stressor[END_REF]. Au contraire, l'amygdale centrale est activée plus particulièrement suivant un stress physiologique comme un challenge immunitaire (Sawchenko et al., 1996). Tout comme l'hippocampe, l'amygdale est une cible pour les GCs puisqu'elle contient un grand nombre de GRs et MRs, cependant, la liaison des GCs avec ces récepteurs entraine une augmentation de l'expression du CRF dans l'amygdale centrale qui potentialise la réponse au stress (Figure 6) [START_REF] Akana | Corticosterone Exerts Site-Specic and State-Dependent Effects in Prefrontal Cortex and Amygdala on Regulation of Adrenocorticotropic Hormone , Insulin and Fat Depots[END_REF][START_REF] Dallman | Chronic stress and obesity : A new view of "' comfort food[END_REF][START_REF] Herman | Limbic system mechanisms of stress regulation : Hypothalamo-pituitary-adrenocortical axis[END_REF]. Adaptation et dérégulation de l'axe HPA suite à des stress répétés Généralement la réponse au stress est accompagnée d'une intense activation de l'axe HPA et du système LC/NE mais de courte durée, notamment grâce au feedback négatif exercé par les GCs. Plusieurs auteurs suggèrent que ce feedback permet de limiter le temps d'exposition des tissus au GCs qui ont un effet délétère à long terme. Lorsque les stress sont modérés mais répétés de manière identique tous les jours (stress homotypique), la réaction comportementale et l'activité de l'axe HPA sont capables de s'amenuiser avec les répétitions. Ce phénomène est aussi appelé processus d'habituation [START_REF] Kanitz | Central and peripheral effects of repeated noise stress on hypothalamicpituitary -adrenocortical axis in pigs[END_REF]Finlay et al., 1997 ;[START_REF] Lightman | The Neuroendocrinology of Stress: A Never Ending Story Neuroendocrinology[END_REF]. Ces changements dans la régulation de l'axe HPA semblent impliquer d'autres mécanismes en plus de l'augmentation du feedback négatif exercé par les GCs (pour revue : [START_REF] Herman | Neural control of chronic stress adaptation[END_REF]Rat : Cole et al., 2000 ;[START_REF] Dallman | Pharmacological Evidence that the Inhibition of Diurnal Adrenocorticotropin Secretion by Corticosteroids Receptors[END_REF][START_REF] Jaferi | Corticosterone Can Act at the Posterior Paraventricular Thalamus to Inhibit Hypothalamic-Pituitary-Adrenal[END_REF] puisque qu'après l'application de stress homotypique, l'axe HPA est capable de répondre de manière normale ou plus forte à un stress nouveau (facilitation : [START_REF] Bhatnagar | Facilitation of hypothalamic -pituitary -adrenal responses to novel stress following repeated social stress using the resident / intruder paradigm[END_REF][START_REF] Grissom | Habituation to repeated stress : Get used to it[END_REF]. Des animaux adrénalectomisés sont par ailleurs capables d'exprimer ce phénomène d'habituation malgré la réduction de GCs et de leurs effets inhibiteurs [START_REF] Jaferi | Corticosterone Can Act at the Posterior Paraventricular Thalamus to Inhibit Hypothalamic-Pituitary-Adrenal[END_REF]. L'habituation semble par ailleurs liée à la mémorisation de la situation par les structures limbiques [START_REF] Herman | Central mechanisms of stress integration : hierarchical circuitry controlling hypothalamo -pituitaryadrenocortical responsiveness[END_REF]. Ces structures, influençant l'activité de l'axe HPA, pourraient dans des contextes de rappel tels que les stress homotypiques, jouer un rôle important dans l'habituation. Une étude sur des stress hétérotypiques a montré une toute autre adaptation de l'axe HPA avec, au contraire, une hyporéponse de l'axe HPA après la fin du protocole de stress [START_REF] Ostrander | Hypoactivity of the hypothalamo-pituitary-adrenocortical axis during recovery from chronic variable stress[END_REF].

Dans les cas les plus extrêmes ou chez les individus ayant un terrain génétique ou ontogénique favorable, les stress dans le jeune âge, les stress intenses, aigus ou chroniques, peuvent entrainer des cas pathologiques de la dérégulation de l'axe HPA incluant une hyperactivité ou une hypoactivité (Ehlert et al., 2001 ;Chrousos & Gold, 1992 ;Gold & Chrousos, 1999, 2002 ;Vreeburg et al., 2009) (Figure 9). Ces altérations peuvent concerner différents niveaux de l'axe HPA comme la biosynthèse de CRF, d'ACTH et de GCs, la sensibilité de leurs récepteurs et l'efficacité de leur action sur les tissus cibles ainsi que l'efficacité des feedback négatifs présents aux différents niveaux de l'axe [START_REF] Fries | A new view on hypocortisolism[END_REF]. Plusieurs études s'accordent sur le fait que les expériences stressantes répétées surtout dans le jeune âge, induisent une hyperactivité de l'axe HPA avec une hypercortiolémie favorisant l'apparition de pathologies comme la dépression [START_REF] Nemeroff | The corticotropin-releasing factor (CRF) hypothesis of depression: new findings and new directions[END_REF][START_REF] Arborelius | The role of corticotropin-releasing factor in depression and anxiety disorders[END_REF]Chrousos & Gold, 1992 ;Gold & Chrousos, 2002 ;[START_REF] Roy | CSF corticotropine-releasing hormone in depressed patients and normal control subject[END_REF]Vreeburg et al., 2009 ;[START_REF] Raadsheer | Increased numbers of corticotropinreleasing hormone expressing neurons in the hypothalamic paraventricular nucleus of depressed patients[END_REF]. Plus particulièrement, dans le cas de la dépression mélancolique (cas de dépression majeure caractérisée par une hyper sensibilité au stress avec une dérégulation du comportement alimentaire, une fatigue aigue et une diminution de la concentration et de l'intérêt pour presque toutes les activités), les individus montrent une augmentation du CRF dans le liquide cérébrospinal (CSF), (Gold & Chrousos, 2002 ;[START_REF] Roy | CSF corticotropine-releasing hormone in depressed patients and normal control subject[END_REF][START_REF] Nemeroff | The corticotropin-releasing factor (CRF) hypothesis of depression: new findings and new directions[END_REF][START_REF] Raadsheer | Increased numbers of corticotropinreleasing hormone expressing neurons in the hypothalamic paraventricular nucleus of depressed patients[END_REF] et une faible sensibilité du feedback négatif induit par les GCs (Chrousos & Gold, 1992 ;Gold et al., 1988a, b ;Gold & Chrousos, 2002 ;[START_REF] Nemeroff | The corticotropin-releasing factor (CRF) hypothesis of depression: new findings and new directions[END_REF][START_REF] Roy | CSF corticotropine-releasing hormone in depressed patients and normal control subject[END_REF]. Les individus atteints de dépression mélancolique mettent ainsi plus de temps à diminuer leur cortisolémie suite à un stress [START_REF] Burke | Depression and cortisol responses to psychological stress : A meta-analysis[END_REF]. D'après différentes études basées sur l'imagerie, les patients atteints de dépression montrent une atrophie de l'hippocampe [START_REF] Bremner | Hippocampal Volume Reduction in Major Depression[END_REF] et une fonctionnalité réduite d'une partie du lobe frontal médian [START_REF] Drevet | Subgenual prefrontal cortex abnormalities in mood disorders[END_REF], ce qui pourrait jouer un rôle dans la diminution du feedback négatif sur les neurones contenant du CRF dans le PVN.

Contrairement à la dépression mélancolique, qui augmente l'activité de l'axe HPA et la cortisolémie, d'autres formes de dépression peuvent être associées à une hypocortisolémie et une hypoactivité de l'axe HPA. Cette hypoactivité se traduit par une apathie une hypersomnie et une moindre réactivité au stress. Certaine études montrent une hypocortisolémie [START_REF] Meewisse | Cortisol and post-traumatic stress disorder in adults Systematic review and meta-analysis[END_REF][START_REF] Yehuda | Low Urinary Cortisol Excretion in Patients with Posttraumatic Stress Disorder[END_REF] parfois associée à une diminution de la sensibilité aux GCs [START_REF] Yehuda | Minireview : Stress-Related Psychiatric Disorders with Low Cortisol Levels : A Metabolic Hypothesis[END_REF] et une augmentation du CRF, chez certaines personnes atteintes de dépression majeure et de stress post traumatiques (PTSD) (Raison & Miller, 2003). Quelques cas de dépression sont aussi associés à une hypocortisolémie et une diminution de la sécrétion du CRF dans le CSF (Gold & Chrousos, 2002 ;[START_REF] Geracioti | Low cerebrospinal fluid corticotropin-releasing hormone concentrations in eucortisolemic depression[END_REF]Vanderpool et al., 1991 ;[START_REF] Demitrack | Evidence for Impaired Activation of the Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis in Patients with Chronic Fatigue Syndrome[END_REF]. Le burn-out, par exemple, caractérisé par une fatigue intense physique et cognitive, est associé à une hypocortisolémie particulièrement chez les cas vécus comme sévères [START_REF] Heim | The potential role of hypocortisolism in the pathophysiology of stressrelated bodily disorders[END_REF][START_REF] Lennartsson | Burnout and hypocortisolism -a matter of severity ? A study on ACTH and cortisol responses to acute psychosocial stress[END_REF]. Il a été suggéré que l'initiale hyperactivité de l'axe HPA due à des stress psychologiques chroniques pouvait évoluer vers une hypoactivité après une exposition trop importante sans période de récupération et favoriser l'apparition de cet état pathologique [START_REF] Heim | The potential role of hypocortisolism in the pathophysiology of stressrelated bodily disorders[END_REF].

Figure maternelle et développement de l'axe HPA Effets des interactions maternelles chez le rongeur

Le développement de l'axe HPA a été particulièrement bien étudié chez le rat (Rattus norvegicus) et la souris (Mus musculus). Les études ont montré une période de maturation de l'axe HPA qui inclue une période d'hyporéponse au stress. En effet, durant les deux premières semaines de vie chez le rat, la corticostérone, reste à des taux assez bas et est très difficile à perturber par un stress. Cette période d'hyporéactivité de l'axe HPA est appelé période hyporéactive (stress hyporesponsive period: SHRP) (Sapolsky & Meaney, 1986;Schapiro, et al., 1962) et s'étend plus particulièrement entre 4 et 14 jours de vie. Cette hyporéactivité de l'axe HPA s'explique en partie par le fait que les glandes surrénales sont moins sensibles à l'ACTH exogène et n'induisent donc qu'une faible augmentation des GCs, [START_REF] Levine | Adrenal and plasma corticosterone and vitamin A in rat adrenal glands during postnatal development[END_REF]. De plus le CRF et l'ACTH sont sécrétés en moins grande quantité durant cette période [START_REF] Walker | Ontogeny of the stress response in the rat: Role of the pituitary and the hypothalamus[END_REF]. La mère semble jouer un rôle important dans le maintien de la SHRP et les interactions mère-jeune influencent la maturation de l'axe HPA (revue: Francis & Meaney, 1999). Chez le jeune, l'ingestion de lait limite l'élévation plasmatique de cortisotérone et maintient la faible sensibilité des glandes surrénales à l'ACTH. Les léchages quant à eux, permettent de maintenir un taux bas de GCs en agissant sur la production d'ACTH et probablement de CRF au niveau central [START_REF] Suchecki | Maternal regulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in the infant rat: the roles of feeding and stroking[END_REF]. Les interactions maternelles précoces semblent ainsi avoir des conséquences à long terme sur la sensibilité de l'axe HPA des jeunes, l'augmentation de la fréquence des soins diminuant sa réactivité au stress. Chez le rat par exemple, une haute fréquence de comportements maternels pendant les 10 premiers jours de vie limite la sécrétion du CRF et de l'ACTH suite à un stress une fois adulte [START_REF] Liu | Maternal care, hippocampal glucocorticoid receptors, and hypothalamic-pituitary-adrenal responses to stress[END_REF]. La réactivité comportementale au stress et l'élévation des GCs sont aussi réduits chez les adultes ayant eu des mères plus maternelles (Caldji, et al., 2000a, b ;Caldji et al., 1998). Les résultats de cette étude suggèrent de plus une augmentation des GRs et MRs hippocampiques et une augmentation de la sensibilité du feedback négatif exercé par les GCs sur la production de CRF au niveau du PVN. Les individus élevés avec moins de soins maternels montrent en parallèle une augmentation des récepteurs du CRF dans le LC et une augmentation de l'expression de l'ARNm du CRF dans l'amygdale (Caldji, et al., 2000a, b).

Pour mettre en évidence l'effet des séparations sur la régulation de l'axe HPA chez le jeune rongeur, plusieurs études ont utilisé une procédure de manipulation (handling) consistant en plusieurs séparations et manipulations quotidiennes des jeunes de 3 à 15 minutes pendant les 21 premiers jours de vie. Ces études ont souligné, contrairement à l'effet attendu d'hyperactivité de l'axe HPA, une diminution de la réponse de l'axe HPA et de la réponse comportementale lors de situations stressantes comme lors d'un test d'open field, et ce jusqu'à l'âge adulte [START_REF] Ader | Effects of Early Experience on Adrenocortical reacttivity[END_REF][START_REF] Levine | Infantile experience and resistance to physical stress[END_REF][START_REF] Levine | Adrenal and plasma corticosterone and vitamin A in rat adrenal glands during postnatal development[END_REF][START_REF] Hess | Modification of the corticosterone response curve as a function of handling in infancy[END_REF][START_REF] Meaney | The effect of neonatal handling on the development of the adrenocortical response to stress : Implication for neuropathology and cognitive deficits in later life[END_REF][START_REF] Meerlo | The Influence of Postnatal Handling on Adult Neuroendocrine and Behavioural Stress Reactivity[END_REF][START_REF] Nunez | Effects of Postnatal Handling of Rats on Emotional , HPA-Axis , and Prolactin Reactivity to Novelty and Conflict[END_REF][START_REF] Vallée | Prenatal Stress Induces High Anxiety and Postnatal Handling Induces Low Anxiety in Adult Offspring : Correlation with Stress-Induced Corticosterone Secretion[END_REF][START_REF] Viau | Increased plasma ACTH responses to stress in nonhandled compared with handled rats require basal levels of corticosterone and are associated with increased levels of ACTH secretagogues in the median eminence[END_REF][START_REF] Zarrow | Handling in Infancy: Increased Levels of the Hypothalamic Corticotropin Releasing Factor (CRF) Followin Exposure to a novel situation[END_REF]. Les individus séparés de la mère produisent moins de CRF et d'ARNm du CRF au niveau du PVN et moins d'ARNm du CRF dans l'amygdale centrale. (Plotsky & Meaney, 1993;[START_REF] Viau | Increased plasma ACTH responses to stress in nonhandled compared with handled rats require basal levels of corticosterone and are associated with increased levels of ACTH secretagogues in the median eminence[END_REF]. Ils montrent de plus, une augmentation du nombre de GRs et MRs au niveau de l'hippocampe et du cortex préfrontal, favorisant ainsi le feedback négatif de la sécrétion de CRF au niveau du PVN [START_REF] Meaney | Early postnatal handling alters glucocorticoid receptor concentrations in selected brain regions[END_REF][START_REF] Meaney | Postnatal handling increases hippocampal type II glucocorticoid receptors and enhances adrenocortical negative-feedback efficacy in the rat[END_REF]Sarrieau et al 1988 ;Viau et al., 1993). Des études ont par la suite souligné que la séparation en elle-même n'était pas la seule variable agissant sur l'axe HPA lors de cette procédure. En effet, l'augmentation de la fréquence des soins maternels lors des épisodes de réunion semble majoritairement responsable des changements centraux et périphériques entrainant une hypoactivité de l'axe HPA (Meaney 2001 ;[START_REF] Pryce | Comparison of the Effects of Early Handling and Early Deprivation on Maternal Care in the Rat[END_REF][START_REF] Macrì | Maternal separation and maternal care act independently on the development of HPA responses in male rats[END_REF]. Au contraire l'effet de séparation semble, comme prédit, augmenter l'activité de l'axe HPA [START_REF] Macrì | Maternal separation and maternal care act independently on the development of HPA responses in male rats[END_REF].

Les séparations maternelles plus sévères pendant la période SHRP induisent, au contraire du handling, des changements opposés sur l'axe HPA. Par exemple, des individus séparés de la mère quotidiennement durant 180 minutes pendant les 14 premiers jours de vie montrent, une fois adultes, une augmentation de l'ARNm du CRF au niveau de l'hypothalamus, une augmentation du CRF contenu dans l'éminence médiane. (Plotsky & Meaney, 1993).

Plusieurs données indiquent de plus une plus grande production de CRF chez les individus adultes qui ont été séparés quotidiennement de leur mère (de 2 à 6 heures), avec une augmentation de la production de CRF au niveau de l'amygdale centrale et du LC, couplée à une augmentation des récepteurs du CRF au niveau du LC [START_REF] Ladd | Persistent changes in corticotropin-releasing factor neuronal systems induced by maternal deprivation[END_REF]. Cette surproduction de CRF est associée à des comportements plus anxieux à l'âge adulte [START_REF] Caldji | The effects of early rearing environment on the development of GABA(A) and central benzodiazepine receptor levels and novelty-induced fearfulness in the rat[END_REF], semblables à ceux induits par l'injection de CRF [START_REF] Dunn | Physiological and behavioral-responses to corticotropin-releasing factor administration -Is CRF a mediator of anxiety or stress responses[END_REF][START_REF] Koob | Corticotropin releasing factor, stress and behavior[END_REF][START_REF] Nemeroff | The corticotropin-releasing factor (CRF) hypothesis of depression: new findings and new directions[END_REF]. Une étude sur des rats séparés quotidiennement durant 15 ou 180 minutes de leur mère du 2 e au 14 e jour de vie montre que les rat séparés pendant 180 minutes ont plus de corticostérone et d'ACTH après un stress [START_REF] Lippmann | Long-term behavioural and molecular alterations associated with maternal separation in rats[END_REF] ce qui implique une plus grande réactivité de l'axe HPA en plus de son hyperactivité. Si la séparation maternelle est prolongée, les modifications de la régulation de l'axe HPA sont encore plus drastiques puisqu'un seul épisode de séparation pendant 24 heures durant la phase SHRP désinhibe l'hyporéactivité de l'axe HPA et augmente la concentration basale de corticostérone plasmatique et la sécrétion de d'ACTH. Plusieurs études, montrent une augmentation de la réponse de l'axe HPA à différents stresseurs, augmentant la sécrétion d'ACTH et de corticostérone en réponse à des stress modérés comme : un environnement nouveau, une injection saline ou des vapeurs d'éther chez les jeunes quelques jours après une privation maternelle de 24 heures (injection saline : [START_REF] Suchecki | Maternal regulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in the infant rat: the roles of feeding and stroking[END_REF]Stanton & Levine, 1988 ;Stanton et al.,1988 ;immobilisation : Sapolsky & Meaney, 1986). L'augmentation de la corticostérone dans un nouvel environnement après 24 heures de privation maternelle qui n'a pas lieu lorsque le jeune ne subit pas de séparations, semble liée à l'absence maternelle plutôt qu'aux comportements maternels chez les jeunes âgés de 20 et 24 jours, puisque la présence de la mère anesthésiée est capable d'inhiber la réponse de corticostérone au nouvel environnement [START_REF] Stanton | Maternal contact inhibits pituitary-adrenal stress responses in preweanling rats[END_REF]Stanton & Levine, 1988). Une étude sur les rats a montré qu'une séparation maternelle de 24 heures à 11 jours de vie conduisait à une augmentation des comportements d'anxiété à l'âge adulte [START_REF] Barbosa | Stress during development alters anxiety-like behavior and hippocampal neurotransmission in male and female rats[END_REF].

Effets des interactions maternelles chez les autres espèces

La maturation de l'axe HPA et l'impact des interactions maternelles sur son développement est largement moins bien connu chez les autres espèces. Quelques études montrent que la cortisolémie pourrait être élevée après la naissance et diminuer au cours des premières semaines de vie (macaque rhésus : Clarke, 1993 ;mouton : Moberg et al, 1980). Cependant, le rôle de la présence de la mère et des comportements maternels n'est pas aussi bien connu que chez le rat. Chez le macaque rhésus néanmoins, il a été montré que les contacts avec la mère dans un contexte de base de sécurité lors de l'exploration étaient capables de diminuer l'activité de l'axe HPA et du système sympathique [START_REF] Gunnar | Behavioral and pituitary-adrenal responses during a prolonged separation perdiod in infant rhesus macaques[END_REF][START_REF] Mendoza | Pituitary-Adrenal Response to Separation in Mother and Infant Squirrel Monkeys[END_REF]Reite et al., 1981). La tétée et l'ingestion de lait pourraient aussi participer à la régulation négative des GCs, comme il a été montré chez le veau (Lupoli et al., 2001). Cependant, aucune donnée ne suggère de comportements maternels particuliers qui pourraient induire une régulation directe de l'axe HPA, comme cela a été décrit chez le rat. Les séparations maternelles en revanche ainsi que les expériences de substitut maternel permettent d'évaluer l'importance de la mère et de la qualité de ses interactions avec le jeune dans la régulation du système du stress.

Séparations maternelles

Pour étudier l'importance de la relation jeune-mère, plusieurs études procèdent à des séparations répétées de la mère. Chez plusieurs espèces, les séparations maternelles induisent des altérations à plus ou moins long terme de l'axe HPA. Les séparations répétées de la mère chez le porcelet provoquent, par exemple, une diminution du CRF présent dans le PVN à l'âge de 56 jours (Kanitz et al., 2004). De manière analogue, chez l'agneau, une séparation maternelle durant 3 jours diminue la quantité de CRF présent dans les fibres de l'éminence médiane (Wańkowska et al., 2006). Les séparations maternelles montrent l'importance de la présence maternelle lorsque le lien est formé. Cependant si les séparations maternelles influencent le développement de l'axe HPA, ce protocole ne permet pas de montrer le rôle des indices et comportements maternels dans le développement de cet axe. Les substituts maternels, présentant des altérations du lien d'attachement, permettent d'évaluer le rôle de la présence de la figure maternelle et de l'attachement dans la mise en place de l'axe HPA.

Substituts maternels

Chez le primate, l'absence de figure maternelle dès la naissance, malgré la présence d'une figure de substitution inanimée ou sociale, modifie l'activité de l'axe HPA en induisant une hyper-ou une hypoactivité de ce système. La variabilité de ces stratégies d'adaptation pourrait résulter en partie de la grande diversité des protocoles utilisés. En effet, l'âge de séparation des individus de leur mère, l'environnement précoce en absence de la figure maternelle incluant la nature et le nombre de figures disponibles et le nombre de réalottements effectués avant la mise en contact avec le substitut d'intérêt différent entre les études. Par exemple, chez les jeunes macaques rhésus élevés avec des congénères en absence de figure maternelle, la cortisolémie semble augmenter avec le nombre de partenaires accessibles (Capitanio et al., 2005). La situation dans laquelle l'activité de l'axe HPA est évaluée diffère aussi selon les études. Certaines prennent en compte la valeur basale et d'autres l'augmentation de l'activité de l'axe HPA suite à un stress social ou non social.

L'étude de l'activité basale de l'axe HPA dans ces différents cas révèle des résultats contradictoires avec parfois une hypo-ou une hyperactivité de l'axe HPA. Chez le macaque rhésus élevé avec des congénères, sans figure maternelle, deux études suggèrent que le CRF serait présent en plus grande quantité dans le CSF (Barr et al., 2004(Barr et al., , 2009)). Clarke (1993) a montré une augmentation de la production d'ACTH au cours des 6 premiers mois de vie chez les individus élevés avec des congénères, mais pas de différence dans le niveau de cortisol basal. Cette absence de différence dans la cortisolémie basale est aussi décrite dans plusieurs autres études (Higley et al., 1992 ;Fahlke et al., 2000). Au contraire, Feng et al., (2012) ont mis en évidence une plus faible quantité de cortisol incorporé dans le poil, suggérant une plus faible exposition aux GCs circulants par rapport aux animaux maternés.

Chez les macaques rhésus élevés avec un substitut maternel inanimé ou social, l'activation de l'axe HPA lors d'une séparation semble différer de la réaction à une séparation maternelle. La séparation de l'objet familier chez le macaque rhésus induit une élévation de la cortisolémie, lorsque celle-ci est effectuée dans un environnement nouveau (Hennessy et al., 1979 ;Hill et al., 1973), comme ce qui est décrit chez les individus séparés de leur mère (Coe et al., 1978).

Cependant, la cortisolémie ne semble pas affectée si la séparation à lieu dans l'environnement familier (Hennessy et al., 1979), contrairement aux individus maternés (Coe et al., 1978). L'ensemble de ces données montre que l'activité de l'axe HPA, lors d'une séparation avec l'objet, peut être atténuée par l'environnement familier et par conséquent l'objet pourrait être un stimulus moins sélectif que la figure maternelle pour permettre un apaisement. La séparation avec la figure de substitution sociale telle qu'un congénère, dans un nouvel environnement, induit de la même manière une élévation de la cortisolémie (Higley et al., 1992 ;Fahlke et al., 2000 ;Clarke, et al., 1998). Un ensemble d'études semble décrire néanmoins une diminution de la réponse de l'axe HPA lors d'un isolement (Capitanio et al., 2005 ;Shannon et al., 1998). De la même manière, Clarke et al. (1998) ont montré une sécrétion plus faible de l'ACTH et du cortisol suite à une séparation avec le congénère, par rapport à des individus séparés de leur mère. Ces données suggèrent que la séparation avec le congénère comme substitut maternel induit une plus faible activation de l'axe HPA. Au contraire, un autre ensemble d'études semble s'accorder sur une augmentation de l'activité de l'axe HPA chez les individus élevés avec un congénère comme substitut maternel. Ces individus présentent une plus grande augmentation de la cortisolémie lors d'une séparation (Fahlke et al., 2000 ;Hill et al., 1973) ainsi qu'une cortisolémie élevée plus persistante (Higley et al., 1992). Peu d'études se sont intéressées à la réaction de l'axe HPA en dehors du contexte du lien social développé pour le substitut mais deux études mettent en évidence une diminution de la réponse de l'axe HPA chez les macaques rhésus élevés avec un congénère, sans figure maternelle. Dans l'expérience menée par Clarke (1993), les individus maternés, soumis à un stress modéré tel qu'un changement de cage en présence de la mère, montrent une plus grande sécrétion d'ATCH et de cortisol que les individus élevés avec un congénère lors de ce même stress. Feng et al. (2012) ont montré quant à eux un retard du pic de cortisol après un stress aigu de contention chez les individus élevés avec des congénères. Qualité de l'attachement et axe HPA Chez l'enfant, des auteurs suggèrent une période d'hyporéponse de l'axe HPA, modulée par la présence de la mère. En effet, alors qu'on observe une élévation de cortisol chez le nourrisson suite à un stress (3 -4 mois d'âge) l'enfant présente une période ou l'élévation de la cortisolémie par des stress en présence de la mère est très limitée (6 -12 mois), donnant une situation analogue à celle rencontrée chez le rongeur [START_REF] Gunnar | Integrating neuroscience and psychological approaches in the study of early expriences[END_REF]. Des auteurs ont proposé que l'effet de la mère, réduisant la sensibilité de l'axe HPA, pourrait être analogue à la SHRP observée chez le rat et participerait à la limitation de l'exposition au GCs pendant une période clé du développement du jeune (Gunnar & Donzella, 2002 ;[START_REF] Tarullo | Child maltreatment and the developing HPA axis[END_REF]. Chez l'enfant et chez d'autres primates, l'interaction avec les figures d'attachement et le développement de l'attachement secure semblent maintenir cette hyporéponse. La plupart des études sur l'enfant ont comparé l'activité et la réactivité de l'axe HPA selon les différents types d'attachement en se focalisant particulièrement sur le cortisol. Une étude a montré par exemple que les enfants partageant un attachement secure étaient plus facilement calmés en présence de leur figure d'attachement maternelle que les enfants au type insecure. Par exemple, des enfant âgé de 18 mois partageant un attachement secure mais réagissant de manière forte à des situations nouvelles, ne montrent pas d'élévation de la cortisolémie après l'interaction avec une personne étrangère, contrairement à des enfants aussi réactifs mais partageant un attachement insecure [START_REF] Nachmias | Behavioral inhibition and stress reactivity: the moderating role of attachment security[END_REF]. De la même manière, lors d'une vaccination chez des enfants âgés de 15 mois, les enfants attachés de manière insecure avec la personne qui l'accompagne ont plus de chance de montrer une élévation de cortisol [START_REF] Gunnar | Stress Reactivity and Attachment Seburity[END_REF]. Luijk et al., (2010) suggèrent de plus que les enfants attachés de manière insecure ont une plus forte réactivité et une plus forte réponse de la sécrétion de cortisol suite à un événement stressant. D'autres auteurs s'intéressant à l'attachement désorganisé ont montré une augmentation de la cortisolémie chez ces enfants, après le protocole de la Situation étrange, ce qui n'est pas observé chez les enfants attachés de manière secure [START_REF] Hertsgaard | Adrenocortical responses to the strange situation in infants with disorganized/disoriented attachment relationships[END_REF]. Enfin, les enfants ayant subi une privation des soins maternels, comme les enfants placés en orphelinat, montrent un pic particulièrement fort de cortisol le matin [START_REF] Carlson | Psychological and Neuroendocrinological Sequelae of Early Social Deprivation in Institutionalized Children in Romania[END_REF]. Ces résultats suggèrent que la qualité secure ou insecure ainsi que la qualité de la relation mère-jeune participe à l'activité de l'axe HPA, une figure stable et un attachement secure, favorisant la faible activité et réactivité de cet axe pendant une période particulièrement sensible du développement du jeune [START_REF] Gunnar | Quality of Early Care and Buffering of Neuroendocrine Stress Reactions : Potential Effects on the Developing Human Brain 1[END_REF].

L'adaptation de l'axe HPA au stress est dépendante de la nature, de la sévérité et de la chronicité du stresseur mais aussi de l'âge auquel le stresseur est appliqué, puisque l'axe HPA endure une maturation lors des premier jours de vie et l'adaptation de l'axe HPA n'est pas la même à différents stades de maturation. Les stress dans le jeune âge, comme une perturbation du lien jeune-mère, facteur influençant une hypo-ou une hyperactivité de l'axe HPA, favorisent, de plus, l'apparition de pathologies telles que la dépression. Les études chez le rongeur suggèrent que la relation avec la mère, particulièrement lors de la période d'hyporéactivité de l'axe HPA, influence son activité et ce, à long terme jusque dans l'âge adulte de par ses indices clés et ces comportements. Cependant, le lien entre mise en place de l'attachement et activité de l'axe HPA est encore peu exploré. Chez les primates, la diversité des protocoles ne permet pas de montrer clairement les adaptations de l'axe HPA lorsqu'un lien de moindre qualité par rapport à l'attachement se met en place pour un substitut comme un objet ou un congénère. Cette question requiert donc des recherches plus structurées sur un modèle limitant et standardisant l'interaction avec les soigneurs humains pour lesquels un lien peut se développer. Les études montrent néanmoins que la qualité de la relation d'attachement (secure ou insecure) lorsque celui-ci est développé pour un caregiver, influence la réaction de l'axe HPA et suppose donc que la qualité de ce premier lien affectif pourrait structurer la réactivité de l'axe HPA. ; chèvre : [START_REF] Kikusui | Vasopressin and Oxytocin Neurons in the Goat Hypothalamus[END_REF]mouton : Broad et al., 1993 ;rat : Sofroniew, 1980rat : Sofroniew, , 1983 ; rat 'autres neurones magnocellulaires synthétisant l'OT ont été mis en évidence au sein mais aussi en dehors de l'hypothalamus, comme dans le BNST, l'aire périventriculaire de l'hypothalamus et l'hypothalamus ventromédian (VMH). Cependant, la distribution de ces groupes de neurones varie largement selon l'espèce considérée (Rat : [START_REF] Sofroniew | Vasopressin and oxytocin in the mammalian brain and spinal cord[END_REF][START_REF] Jirikowski | Estradiol influences oxytocin-immunoreactive brain systems[END_REF]chèvre : Kikusui et al., 1997 ;mouton : Broad et al.,1993). L'OT produite par les neurones magnocellulaires est transportée le long des axones qui se projettent 3V : 3 e ventricule majoritairement jusque dans l'hypophyse. Elle est stockée jusqu'à sa sécrétion périphérique dans le système sanguin. L'OT peut aussi être sécrétée par des neurones parvocellulaires présents à la fois au niveau du PVN, du SON ainsi que dans les régions extrahypothalamiques. Au contraire des neurones magnocellulaires, ils ne semblent pas projeter leurs axones au niveau de l'hypophyse mais plutôt au niveau central comme dans le LC, la medulla et la moelle épinière ainsi que dans différentes zones cérébrales comme le bulbe olfactif, le BNST, l'hippocampe, l'amygdale, le MPOA ou l'aire tegmentale ventrale (VTA) chez le rat [START_REF] Shahrokh | Oxytocin-dopamine interactions mediate variations in maternal behavior in the rat[END_REF][START_REF] Sofroniew | Projection from vasopressin, oxytocin and neurophysin neurons to neural targets in the rat and the human[END_REF][START_REF] Sofroniew | Vasopressin and oxytocin in the mammalian brain and spinal cord[END_REF][START_REF] Buijs | The distribution and synaptic release of oxytocin in the central nervous system[END_REF][START_REF] Sawchenko | Immunohistochemical identification of neurons in the paraventricular nucleus of the hypothalamus that project to the medulla or to the spinal cord in the rat[END_REF][START_REF] Swanson | Hypothalamic integration: organization of the paraventricular and supraoptic nuclei[END_REF].

Dans les neurones magno-et parvocellulaires, l'OT est synthétisée d'abord sous forme d'un pré-propeptide par les ribosomes. Ce précurseur est ensuite clivé dans le réticulum endoplasmique et empaqueté dans des vésicules neurosécrétrices par le Golgi. Ces vésicules contiennent le pro-peptide constitué de la neurophysine I et de l'ocytocine, celui-ci peut être transporté ainsi le long de l'axone où s'opère le clivage entre les deux peptides. Lorsque les vésicules arrivent au niveau terminal de l'axone, elles sont stockées jusqu'au signal permettant la sécrétion sous forme de pulse [START_REF] Ludwig | Talking back: Dendritic neurotransmitter release[END_REF][START_REF] Brownstein | Synthesis , Transport , and Release of Posterior Pituitary Hormones[END_REF][START_REF] Renaud | [END_REF][START_REF] Poulain | Les congélations-décongélations successives pourraient séparer les deux molécules et entrainer ainsi plus d'OT libre détectée par le dosage. L'ensemble de ces résultats confirment la possibilité d'utiliser cette méthode de dosage chez le mouton et l'utilisation de tubes héparinés[END_REF]. L'exocytose est liée à une activité électrique qui résulte d'une entrée de Ca 2+ par des canaux ioniques, créant ainsi une dépolarisation et des potentiels d'action [START_REF] Leng | Physiological pathways regulating the activity of magnocellular neurosecretory cells[END_REF][START_REF] Wang | An R-type Ca(2+) current in neurohypophysial terminals preferentially regulates oxytocin secretion[END_REF]. Les neurones magnocellulaires du PVN et du SON sont aussi capables de sécréter l'ocytocine au niveau local par une sécrétion dendritique (pour revue : [START_REF] Ludwig | Talking back: Dendritic neurotransmitter release[END_REF][START_REF] Ludwig | Dendritic release of vasopressin and oxytocin[END_REF]. Cette sécrétion est permise par le stockage dans la cellule de Ca 2+ qui induit la sécrétion des neuropeptides par les dendrites, indépendamment de la sécrétion axonale (revue : Landgraf & Neumann, 2004 ;[START_REF] Ludwig | Intracellular calcium stores regulate activity-dependent neuropeptide release from dendrites[END_REF]. La sécrétion périphérique induite par les neurones magnocellulaires semble indépendante de la sécrétion centrale majoritairement régulée par les neurones parvocellulaires chez le rat et dépendant des contextes d'activation du système ocytocinergique (Babygirija et al., 2012 ;Engelmann et al., 1999Engelmann et al., , 2000 ; ;[START_REF] Gibbs | Stress-specific modulation of ACTH secretion by oxytocin[END_REF]. la protéine G aussi appelé RCPG (classe I ou A) (Figure 11). Lorsque l'OT se lie au récepteur, une protéine G est activée, qui permet la réponse effectrice. Une des caractéristiques de ce récepteur est d'être capable de se désensibiliser lorsqu'il est trop stimulé. Le récepteur se dissocie alors de la protéine G et est internalisé ou piégé dans la cellule avant d'être dégradé (Gimpl & Fahrenholz, 2001). Chez le rat ces récepteurs sont particulièrement présents au niveau du putamen, du VMH, du subiculum venral, de l'amygdale centrale et du BNST (revue : Gimpl & Fahrenholz, 2001). Cependant, ici encore, la distribution des OTRs semble très variable selon l'espèce considérée et selon la stratégie de reproduction (revue : Gimpl & Fahrenholz, 2001 ;[START_REF] Young | Oxytocin and Vasopressin Receptors and Species-Typical Social Behaviors[END_REF] (Tableau 1). ND, non détecté ; ?, non étudié ; (+), pas toujours détecté ; +, ++ et +++, présent en faible, moyenne et grande quantité. D'après Freund-Mercier et al., 1987 ;Tribollet et al., 1998 (Rattus norvegicus) ; Loup et al., 1991 (Homme) ; Insel & Shapiro, 1992 (Microtus ochrogaster et montanus) ; Tribollet et al., 1992 (Cavia porcellus) ; Insel et al., 1991 Engelmann et al., 2006). Au contraire d'un stress aigu de contention de 90 minutes dans un tube en plastique qui augmente l'ARNm seulement dans de SON, l'immobilisation répétée de 90 minutes sur 5 jours chez la souris augmentent l'ARNm de l'OT présent dans le SON et le PVN (Babygirija et al., 2010). Les défaites sociales répétées chez la souris induisent par ailleurs une augmentation du nombre de neurones contenant de l'OT stimulés à la suite d'un stress [START_REF] Litvin | Effects of chronic social defeat on behavioral and neural correlates of sociality: Vasopressin, oxytocin and the vasopressinergic V1b receptor[END_REF].

Plusieurs études incluant d'autres modèles animaux que le rat, mettent en évidence l'augmentation de la sécrétion d'OT suite à des séparations sociales prolongées. En effet, Grippo et al. (1997) ont observé une augmentation du nombre de neurones contenant de l'OT dans le PVN chez les femelles de campagnol des prairies, isolées socialement. Chez le rat, une séparation maternelle à 14 jours de vie entraine une augmentation de l'OT centrale et périphérique [START_REF] Kojima | Maternal contact differentially modulates central and peripheral oxytocin in rat pups during a brief regime of mother-pup interaction that induces a filial huddling preference[END_REF]. Enfin, une étude chez l'agneau séparé dès la naissance de sa mère et élevé avec un congénère, une séparation par une barrière ajourée pendant 24 heures ou un isolement social dans un environnement nouveau pendant 20 minutes entrainent une élévation de l'OT plasmatique [START_REF] Coulon | Human-lamb bonding: Oxytocin, cortisol and behavioural responses of lambs to human contacts and social separation[END_REF].

Comportement sociaux positifs, soins parentaux et liens sociaux

Facilitation des comportements sociaux par l'ocytocine De nombreux travaux ont souligné la capacité de l'OT à faciliter les comportements sociaux.

Chez le rat, l'injection d'OT dans l'amygdale médiane favorise la reconnaissance de congénère [START_REF] Ferguson | Oxytocin in the Medial Amygdala is Essential for Social Recognition in the Mouse[END_REF][START_REF] Young | The neurobiology of social recognition, approach, and avoidance[END_REF]. Des souris, au contraire, knockout pour le gène de l'OT ne montent pas de signe de reconnaissance des congénères [START_REF] Young | The neurobiology of social recognition, approach, and avoidance[END_REF], alors que l'injection d'OT restaure cette capacité [START_REF] Ferguson | Oxytocin in the Medial Amygdala is Essential for Social Recognition in the Mouse[END_REF][START_REF] Ferguson | The neuroendocrine basis of social recognition[END_REF]. Cet effet est relevé seulement lorsque l'injection est faite avant la rencontre sociale, ce qui suppose que l'OT joue un rôle dans l'encodage du souvenir plutôt que dans le rappel [START_REF] Ferguson | Oxytocin in the Medial Amygdala is Essential for Social Recognition in the Mouse[END_REF]. L'OT au contraire a un effet amnésique pour les stimuli non sociaux [START_REF] De Oliveira | Glucocorticoid-mediated effects of systemic oxytocin upon memory retrieval[END_REF] et réduit l'agression en plus de la réaction à la peur [START_REF] Lim | Neuropeptidergic regulation of affiliative behavior and social bonding in animals[END_REF] participant ainsi à l'initiation des interactions sociales. Chez l'Homme, l'OT facilite la mémorisation des informations sociales positives [START_REF] Guastella | Oxytocin enhances the encoding of positive social memories in humans[END_REF], augmente la capacité à interpréter les états mentaux d'autrui (métacognition) [START_REF] Domes | Oxytocin Improves " Mind-Reading " in Humans[END_REF] et augmente la confiance en autrui [START_REF] Kosfeld | Oxytocin increases trust in humans[END_REF]) même pour des cas pathologiques d'altération du comportement social comme l'autisme [START_REF] Andari | Promoting social behavior with oxytocin in high-functioning autism spectrum disorders[END_REF] interaction avec l'AVP, la dopamine et les GCs participe à la mise en place du lien pour le partenaire [START_REF] Williams | Development of partner preferences in female prairie voles (Microtus ochrogaster): the role of social and sexual experience[END_REF][START_REF] Insel | Mating in the monogamous male: behavioral consequences[END_REF][START_REF] Wang | Neurochemical regulation of pair bonding in male prairie voles[END_REF]) (Figure 12).

Ainsi l'injection icv d'AVP ou d'OT chez le campagnol des prairies est capable d'induire la

préférence pour le partenaire sexuel sans copulation [START_REF] Cho | The effects of oxytocin and vasopressin on partner preferences in male and female prairie voles (Microtus ochrogaster)[END_REF][START_REF] Winslow | A role for central vasopressin in pair bonding in monogamous prairie voles[END_REF].

L'AVP semble cependant plus critique pour la formation du lien pour le partenaire chez le mâle, alors que l'OT semble jouer un rôle prépondérant chez les femelles [START_REF] Cushing | Peripheral Pulses of Oxytocin Increase Partner Preferences in Female, but Not Male , Prairie Voles[END_REF][START_REF] Cho | The effects of oxytocin and vasopressin on partner preferences in male and female prairie voles (Microtus ochrogaster)[END_REF][START_REF] Wang | Voles and vasopressin : A review of molecular , cellular , and behavioral studies of pair bonding and paternal behaviors[END_REF] même si l'interaction entre les deux hormones favorise la formation du lien social chez les deux sexes [START_REF] Cho | The effects of oxytocin and vasopressin on partner preferences in male and female prairie voles (Microtus ochrogaster)[END_REF][START_REF] Liu | Vasopressin in the Lateral Septum Regulates Pair Bond Formation in Male Prairie Voles (Microtus ochrogaster}[END_REF].

Certains campagnols, bien que génétiquement proches des espèces monogames, sont polygames, comme le campagnol des montagnes (Microtus montanus) ou des prés (Microtus pennsylvanicus). Si la distribution des fibres et des neurones contenant de l'OT est assez (Insel & Shapiro, 1992 ;[START_REF] Smeltzer | Dopamine , oxytocin , and vasopressin receptor binding in the medial prefrontal cortex of monogamous and promiscuous voles[END_REF][START_REF] Young | Deficiency in Mouse Oxytocin Prevents Milk Ejection , but not Fertility or Parturition[END_REF]. Ces différences de répartition des récepteurs n'a pas pu être mis en évidence pour d'autres molécules favorisant la formation de liens sociaux comme la benzodiazépine et les opiacés, soulignant l'importance de l'OT dans la mise en place du lien.

La dopamine, en interaction avec l'OT et l'AVP participe à la mise en place du lien particulièrement au niveau du noyau accumbens (Aragona et al., 2003[START_REF] Aragona | Nucleus accumbens dopamine differentially mediates the formation and maintenance of monogamous pair bonds[END_REF][START_REF] Liu | Nucleus accumbens oxytocin and dopamine interact to regulate pair bond formation in female prairie voles[END_REF]. L'axe HPA, régulé par l'OT, et plus particulièrement les GCs semblent aussi jouer un rôle important dans la mise en place du lien social. La comparaison entre campagnol monogame et polygame a montré une différence importante dans la résistance aux GCs. Les espèces monogames semblent plus résistantes que les polygames, leur taux basal est 5 à 10 fois supérieur aux espèces polygames alors qu'ils possèdent 10 fois moins de récepteurs (Hasting et al., 1999 ;[START_REF] Taymans | The Hypothalamic -Pituitary -Adrenal Axis of Prairie Voles ( Microtus ochrogaster ): Evidence for Target Tissue Glucocorticoid Resistance[END_REF]. Les GCs ont des effets opposés selon le sexe chez le campagnol, d'un côté ils favorisent la mise en place du lien chez le mâle comme l'injection de corticostérone ou les stress de nage répétée (DeVries et al. 1996), alors que de l'autre côté, chez la femelle, ils semblent inhiber la mise en place du lien [START_REF] Devries | Modulation of pair bonding in female prairie voles (Microtus ochrogaster) by corticosterone[END_REF][START_REF] Devries | The effects of stress on social preferences are sexually dimorphic in prairie voles[END_REF][START_REF] Curtis | Glucocorticoid receptor involvment in pair bonding in female prairie voles : The effect of acute blockade and interactions with central dopamine reward systems[END_REF]. Ces données suggèrent donc le rôle de l'OT en interaction avec la dopamine, l'AVP et les GCs dans la mise en place d'un lien affectif pour un autre individu, tel que le partenaire sexuel, et suggèrent l'implication de mécanismes analogues dans la mise en place d'autres liens affectifs tels que le lien d'attachement jeunemère ou le lien mère-jeune.

Ocytocine, comportements maternels et lien mère-jeune

Par son action périphérique induisant une contraction musculaire, l'OT déclenche les contractions utérines pour faciliter la parturition. L'OT induit aussi le réflexe d'éjection de lait [START_REF] Young | Deficiency in Mouse Oxytocin Prevents Milk Ejection , but not Fertility or Parturition[END_REF]. Chez un grand nombre d'espèces de mammifères, les auteurs ont ainsi montré une augmentation de l'OT centrale et périphérique lors de la parturition, après stimulation vaginocervicale mais aussi après stimulation de la mamelle lors de la tétée (rat : [START_REF] Neumann | Oxytocin and vasopressin release within the supraoptic and paraventricular nuclei of pregnant, parturient and lactating rats: a microdialysis study[END_REF][START_REF] Higuchi | Detailed analysis of blood oxytocin levels during suckling and parturition in the rat[END_REF]mouton : Kendrick et al., 1986mouton : Kendrick et al., , 1988 ; ;Mitchell, & Brennecke, 1982 ;primate non humain: Amico et al., 1990 ;Homme : Mcneilly et al., 1983 ;vache : Schams et al., 1984 ;Lupoli et al., 2001).

Chez le rongeur, l'élévation de l'OT participe activement à la mise en place des comportements maternels. Ainsi, une infusion d'OT dans le bulbe olfactif ou icv chez une rate vierge, traitée préalablement avec des oestrogènes, induit l'ensemble des comportements maternels en présence de nouveau-nés (Perderson et al., 1982 ;[START_REF] Yu | The olfactory bulb: A critical site of action for oxytocin in the indutction of maternal behaviour in rat[END_REF]. L'OT semble aussi promouvoir une réponse maternelle rapide avant la stimulation de la tétée [START_REF] Fahrbach | Possible role for endogenous oxytocin in estrogen-facilitated maternal behavior inrats[END_REF]. Plusieurs études montrent par ailleurs que l'OT dans le MPOA et le VTA jouent un rôle clé dans la quantité de soins maternels fournie aux jeunes. En effet, les rates les plus maternelles expriment plus d'ARNm de l'OT dans le PVN, particulièrement au niveau des neurones parvocellulaires, projetant dans le MPOA et le VTA [START_REF] Sawchenko | Immunohistochemical identification of neurons in the paraventricular nucleus of the hypothalamus that project to the medulla or to the spinal cord in the rat[END_REF] et non dans les neurones magnocellulaires projetant dans l'hypophyse [START_REF] Shahrokh | Oxytocin-dopamine interactions mediate variations in maternal behavior in the rat[END_REF]. Parallèlement, l'injection d'OT au niveau du VTA et du MPOA réduit les comportements maternels dispensés aux jeunes (Perderson et al., 1994).

Si le rôle de l'OT dans la mise en place et l'expression des comportements maternels a été très étudié chez le rongeur, ce modèle présente une limitation majeure dans l'étude de la mise en place du lien mère-jeune et de l'attachement jeune-mère dans le cadre de la généralisation à d'autres espèces comme les ongulés ou les primates humains et non-humains, puisque la mère ne reconnait pas sélectivement sa portée. Au contraire, chez la brebis, un lien sélectif s'établit entre la mère et le jeune. Kendrik et al. (1987) ont ainsi montré chez des brebis ovariectomisées et traitées avec des oestrogènes qu'une injection d'OT icv diminuait les comportements agressifs envers un agneau étranger et déclenchait des comportements maternels comme une proximité avec l'agneau, des léchages et parfois l'acceptation à la mamelle (non nutritive pour l'agneau puisque la femelle n'est pas en lactation), comportements qui ne sont pas exprimés par les femelles non maternelles. De manière intéressante, l'injection d'OT icv augmente les vocalisations de détresse chez la brebis lorsque la brebis et l'agneau sont séparés, suggérant la mise en place d'un lien émotionnel pour l'agneau. Plusieurs auteurs ont par ailleurs montré une augmentation de l'OT dans le bulbe olfactif après la parturition (Kendrick et al., 1987 ;[START_REF] Lévy | Intracerebral oxytocin is important for the onset of maternal behavior in inexperienced ewes delivered under peridural anesthesia[END_REF]. L'établissement du lien sélectif de la mère se faisant au travers de la mémorisation de la signature olfactive du jeune (Burger et al., 2011), l'OT pourrait, en facilitant la mémorisation des indices olfactifs du jeune, participer à la formation du lien sélectif. Chez l'Homme, la naissance d'un enfant est suivie par une augmentation de la sécrétion d'OT chez la mère, mais aussi chez le père. Comme chez les modèles précédents, la concentration d'OT est corrélée positivement avec les interactions maternelles positives En effet, la concentration plasmatique d'OT durant les 6 premiers mois après la naissance est corrélée positivement avec les interactions positives et les contacts entretenus avec l'enfant [START_REF] Gordon | Oxytocin and the Development of Parenting in Humans[END_REF]. La quantité d'OT sécrétée chez la mère, lorsqu'elle perçoit des émotions positives de son enfant, semble aussi corrélée avec la qualité du lien qu'elle a développé avec lui (Strathearn et al., 2009). Les interactions positives non nutritives avec le jeune augmentent ainsi la sécrétion d'OT plasmatique chez la mère partageant un lien d'attachement secure avec son enfant (Strathearn et al., 2009 ;Feldman et al., 2011[START_REF] Feldman | Si l'OT est impliquée dans les comportements sociaux positifs, elle peut cependant être sécrétée de manière plasmatique à la suite de différents stress, notamment chez le jeune rat lors de séparation maternelle[END_REF].

Relation jeune-mère et système ocytocinergique Effets de la tétée et des stimulations tactiles de la mère La tétée est un événement majeur chez le jeune qui, comme vu précédemment, facilite la discrimination de la mère et la mise en place d'un lien émotionnel pour une figure qui possède des indices adéquates (macaque rhésus : Harlow & Zimmerman, 1959 ;rat : Moriceau & Sullivan, 2004 ;mouton : Nowak et al., 1997a, b ;Vail-Laillet et al., 2006). En parallèle, la tétée produit une augmentation de la sécrétion d'OT périphérique. En effet, l'ingestion et plus particulièrement la distension gastrique induit une production centrale et périphérique de l'OT (rat : Nelson et al., 1998 ;Vache : Lupoli et al., 2001 ;mouton : Kendrick et al., 1988). La cholecystokinine (CCK), peptide sécrété par les muqueuses intestinales lors de la digestion, semble aussi participer à la sécrétion d'OT [START_REF] Verbalis | Oxytocin secretion in response to cholecystokinin and food: differentiation of nausea from satiety[END_REF] et à la mise en place de la discrimination et de l'attraction pour la mère (Nowak et al., 1997a). Une étude sur le lapin a montré par ailleurs, une augmentation de l'activité des neurones contenant l'OT à la fois dans le SON et dans le PVN à la suite de l'ingestion de lait [START_REF] Caba | Suckling and genital stroking induces Fos expression in hypothalamic oxytocinergic neurons of rabbit pups[END_REF]. L'OT étant donc OTRs dans l'amygdale centrale et le BNST chez la femelle [START_REF] Francis | Naturally occurring differences in maternal care are associated with the expression of oxytocin and vasopressin (V1a) receptors: Gender differences[END_REF][START_REF] Veenema | Toward understanding how early-life social experiences alter oxytocin-and vasopressin-regulated social behaviors[END_REF]. Cette augmentation des OTRs semble par ailleurs associée à une augmentation des comportements maternels durant l'âge adulte et participe ainsi à la transmission épigénétique de la qualité des soins maternels. Une étude réalisée par [START_REF] Kojima | Maternal contact differentially modulates central and peripheral oxytocin in rat pups during a brief regime of mother-pup interaction that induces a filial huddling preference[END_REF] sur les ratons suggère que les contacts du jeune avec la mère augmentent la quantité d'OT contenue dans l'hypothalamus notamment par le contact "peau-contre-peau". Chez le rat adulte anesthésié, Stock et Uvnäs- Moberg (1988) ont montré qu'une stimulation tactile comme une caresse ou un pincement pouvait induire une augmentation plasmatique d'OT. Une étude menée sur les jeunes lapereaux montre une augmentation du nombre de neurones produisant l'OT activés au niveau de la région antérieure et médiane du PVN, suite au massage de la région anogénitale [START_REF] Caba | Suckling and genital stroking induces Fos expression in hypothalamic oxytocinergic neurons of rabbit pups[END_REF]

Séparations maternelles, substistuts maternels et qualité de l'attachement

Les séparations maternelles et la procédure de handling chez les rongeurs sont associées à une altération du système ocytocinergique (revue : [START_REF] Veenema | Toward understanding how early-life social experiences alter oxytocin-and vasopressin-regulated social behaviors[END_REF]. En effet, des séparations maternelles chez la souris entrainent une augmentation de l'OT dans le PVN chez la femelle adulte (souris : [START_REF] Veenema | Opposite effects of maternal separation on intermale and maternal aggression in C57BL/6 mice: Link to hypothalamic vasopressin and oxytocin immunoreactivity[END_REF]campagnol des prairies : Ahern 2009). Chez le rat, une étude montre une diminution de l'OT dans l'amygdale (Oreland, 2010). La distribution des OTRs semble aussi altérée (Lukas et al., 2010). La procédure de handling chez le rat, induisant une augmentation des comportements maternels lors des réunions, diminue la quantité d'OT présente au niveau de l'hypothalamus et de l'amygdale (Oreland, 2010). Plusieurs études chez le rat s'accordent par ailleurs sur une diminution de l'OT dans le PVN chez les mâles et les femelles suite à une procédure de handling (Oreland, 2010 ;Todeschin 2009a, b). Une étude sur les macaques rhésus élevés sans figure maternelle et avec des congénères montre une diminution de l'OT dans le CSF chez ces individus par rapport à des individus maternés (Winslow et al., 2003). Chez l'enfant, deux études se sont intéressées à la qualité de la Le mouton, Ovis aries, modèle pour l'étude de l'attachement Le mouton (Ovis aries) est un ongulé polygyne chez qui la ségrégation sexuelle est observée : les mâles et les femelles avec les jeunes vivent dans des groupes sociaux séparés en dehors de la période de reproduction (revue : Main et al., 1996 ;Ruckstuhl & Neuhaus, 2002, 2005). Le nouveau-né au sein du groupe de femelles naît relativement mature puisqu'à la naissance le poids du cerveau de l'agneau représentent 50% de celui de l'adulte (24 mois) et les capacités sensorielles et motrices sont fonctionnelles [START_REF] Mcintosh | Foetal brain development in the sheep[END_REF].

Quelques minutes seulement après la naissance, l'agneau est donc capable de se lever et de marcher [START_REF] Fahmy | Ewe and lamb behaviour at parturition in prolific and non-prolific sheep[END_REF]) puis de suivre la mère au bout de quelques heures (revue : Lent, 1974). Cette proximité sélective est particulièrement importante pour leur survie car la mère est la source principale de nourriture jusqu'au sevrage, vers 4 mois, ainsi qu'une source de sécurité. Entre le sevrage et la puberté (4 mois -10 mois) les agneaux mâles s'associent moins souvent avec leur mère que les femelles et préfèrent interagir avec des congénères de même âge et de même sexe (Walser & Williams, 1986). Les mâles subadultes interagissent entre eux à la périphérie du groupe de femelles et quittent le groupe vers l'âge de 24 mois (Geist, 1971). Les femelles adultes ne sont plus associées préférentiellement avec leur mère mais restent au sein du même domaine vital.

Le développement de la relation préférentielle avec la mère a été particulièrement étudié chez cette espèce. La tétée et l'ingestion de colostrum facilitent la mise en place de cette préférence et de la discrimination de la figure par rapport à une femelle étrangère (Nowak et al 1997a, b ;Vail-Laillet et al., 2006). La préférence pour la mère 24 heures après la naissance a été observée en condition naturelle (Shillito- Walser et al., 1984) mais aussi mise en évidence en laboratoire à travers des tests de choix par exemple (Nowak et al., 1987(Nowak et al., , 1997a et b) et b), ainsi que la présence de vocalisations lors d'une séparation (Hernandez et al., 2009). Si l'utilisation de la mère en tant que base de sécurité pour l'exploration est souvent observée dans le cadre de males preferring abundant low-quality forage. According to the reproductive strategy, females with offspring would be also more inclined to choose a habitat with low predation risk than males in order to favour the survival of young and the mother's fitness (Main et al., 1996). More recently, some researchers have proposed that allometric and life history differences between the sexes due to dimorphism in body size (gastrocentric model hypothesis, Barboza & Bowyer, 2000) and predation risk (reproductive strategy) explain sexual segregation by the fact that males choose habitat to maxi-mize energy gain in preparation for the breeding season and fe-males select habitats with a combination of resources that contribute to offspring survival (Bowyer, 2004;Main, 2008;Mooring et al., 2005). While sexual segregation may be explained by a different use of habitat, this is not systematically the case since it has been shown that males and females remain socially segre-gated within a homogeneous habitat (Bon & Campan, 1996;Bon, Rideau, Villaret, & Joachim, 2001;Conradt, 1999). Conradt (1999Conradt ( , 2005) ) proposed that the sexes can be segregated either by social affinity (social segregation) or by habitat use (habitat segregation), both leading to variation in spatial segregation scale between same-sex groups (spatial segregation).

Many mechanisms have been proposed to explain social segregation including the avoidance of oddity effect, sex differences in activity budgets, forage selection within a habitat and social factors (MacFarlane & Coulson, 2009) such as preferential association between same-sex individuals and avoidance of the opposite sex. The activity budget and social factors hypotheses have frequently been used to explain sociosexual segregation (Michelena et al., 2004(Michelena et al., , 2005;;[START_REF] Pérez-Barbería | Are social factors sufficient to explain sexual segregation in ungulates?[END_REF]Ruckstuhl & Neuhaus, 2002). The activity budget hypothesis (Conradt, 1998;Ruckstuhl, 1998) predicts that segregation is caused by asynchrony between the sexes due to dimorphism in their body size and differences in time spent foraging and moving compared to lying down and ruminating (Ruckstuhl, 1998). Synchronizing activity budgets and staying in mixed-sex groups could be costly if an optimal activity budget and associated optimal foraging strategies are not pursued (Conradt, 1998;Ruckstuhl, 1998) leading to the formation of same-sex groups. Whereas the activity budget hypothesis has received wide support, its role in spatial segregation now tends to be controversial (Bowyer & Kie, 2004;Mooring et al., 2005) because activity budgets are seen by some to be a result of animal grouping (Mooring & Rominger, 2004). In regard to the social factors hypotheses, four mechanisms leading to sociosexual segregation have been proposed.

(1) The male social affinity hypothesis (also referred to as the social preference hypothesis: Ruckstuhl & Neuhaus, 2000; the social affinity hypothesis: Bon et al., 2001; and the social factors hypothesis: [START_REF] Pérez-Barbería | Are social factors sufficient to explain sexual segregation in ungulates?[END_REF] suggests a principal role of male social affinity in sociosexual segregation. It predicts that male preference for same-sex peers may cause the formation of maleonly groups in which the males develop fighting skills efficiently and establish a dominant hierarchy (Bon et al., 2001).

(2) The male avoidance of females hypothesis (Prins, 1989) proposes that segregation is due to males of all size classes avoiding females to reduce rates of maleemale aggressive interactions, and increase time for other activities such as foraging.

(3) The female social affinity hypothesis (included in the social affinity hypothesis: Bon et al., 2001;and social factors hypothesis: Pérez-Barbería et al., 2005) assumes that affinity among females leads to the formation of female-only groups in which females can more efficiently develop skills associated with the rearing of offspring.

(4) The female avoidance of males hypothesis proposes that females avoid males of all size classes, maleemale aggression or agonistic acts impeding cohesion among females (Bon & Campan, 1996;Cransac et al., 1998;Weckerly, McFarland, Ricca, & Meyer, 2004;Weckerly, Ricca, & Meyer, 2001).

Some researchers claim that these social preferences and avoidances observed in adult ungulates have their roots in infancy, develop and intensify during the ontogeny of social behaviours (Bon & Campan, 1996;Bon, Deneubourg, Gerard, & Michelena, 2005) particularly because spatial segregation between single-sex groups increases gradually with age (ungulates: Bon & Campan, 1996; Alpine ibex, Capra ibex: Bon et al., 2001; African buffalo, Syncerus caffer : Sinclair, 1977). In accordance with the male social affinity hypothesis, young male ungulates, even juveniles still dependent upon the mother's milk and protection, show preferred associations with same-sex and same-age peers within the adult female group (Mediterranean mouflon: : Byers, 1980). In this study we investigated another possible mechanism that would result in an early preferred interaction with same-sex conspecifics in females through a stronger offspringemother attachment in daughters than in sons.

The ontogeny of social behaviour in ungulates begins soon after birth with the establishment of an attachment bond with the mother (for review: Lent, 1974). Attachment is defined by three criteria which were initially used in human infants (Ainsworth & Bell, 1970;Holmes, 1993): proximity seeking (attraction), distress and appeasement during separationereunion with the attachment figure, and finally the use of the attachment figure as a secure base, increasing exploration by the young. In sheep, the mothereyoung relationship has been particularly well studied and attachment to the mother seems to develop within a few days after parturition (Nowak, Keller, & Lévy, 2011); however, no study has ever investigated the secure base of the mother and its impact on exploratory behaviour of the lamb, leaving the characterization of filial attachment incomplete. Proximity seeking with the mother from 24 h of age has been observed under natural (Shillito- Walser, Walters, & Ellison, 1984) and laboratory conditions such as in twochoice tests opposing mothers and unfamiliar ewes (Nowak et al., 1997a(Nowak et al., , 1997b;;Nowak, Poindron, Le Neindre, & Putu, 1987). When separated from the mother, lambs display distress reactions (uttering high-pitched bleats, increased locomotor activity) and increased adrenal response (Moberg, Anderson, & Underwood, 1980;Moberg & Wood, 1981). There have been some reports that the mothereyoung relationship varies according to the sex of the lamb. For example, between 24 h and 1 week of age, studies showed that daughters were more distressed than sons by a separation from the mother (domestic sheep: Coutinho-Netto et al., 2003;Hernandez, Matthews, Oliver, Bloomfield, & Harding, 2009). Other studies observed that female lambs (3e7 weeks of age) maintain closer proximity with their mother than males (Mediterranean mouflon: Guilhem et al., 2006;domestic sheep: Walser & Williams, 1986) and reached their mother faster in twochoice tests (Nowak, 1990). Under natural conditions a stronger proximity with the mother is sometimes reported based on 36 S. Gaudin et al. / Animal Behaviour 102 (2015) 33-43 1970) to study infant attachment to their mother in humans and later on adapted for lambs [START_REF] Boivin | Discrimination between shepherds by lambs reared under artificial conditions[END_REF]. The arena consisted of a corridor (2 × 6 m) with a holding pen for a stimulus ewe at one end. A contact zone was drawn in a 120 cm wide area that was adjacent to the holding pen (Fig. 2). First, lambs were randomly allocated to one of three independent groups: eight female and eight male lambs were tested with their mother (mother group), seven female and seven male lambs with the familiar ewe (familiar group) and seven female and eight male lambs with an unfamiliar ewe (unfamiliar group). The test procedure comprised three phases, each lasting 3 min. In the isolation phase, the lamb was introduced into the middle of the corridor and left alone. In the reunion phase, a ewe (mother, familiar or unfamiliar ewe, according to the group) was led to the holding pen and the lamb could interact with her. The unfamiliar ewe used in this test was different from the one used in the choice test. In the separation phase, the ewe was then removed, and the lamb was left alone again. The aim of this test was to assess the secure base effect produced by the presence of the different categories of ewes, as measured by the proximity seeking, appeasement of high-pitched bleats and increased exploration in lambs after a stressful period of isolation, which triggers distress and highpitched bleats. The separation phase permitted us to distinguish the appeasement associated with each category of ewe met during reunion or habituation to the test arena. All the tests were videorecorded and the number of high-pitched bleats, the number of olfactory explorations and the time spent in the contact area during reunion were recorded.

Interobserver Reliability

Two observers (OBS 1 and OBS 2) blind to the hypothesis, to the category of the ewe in the tests and to the sex of lambs, analysed the video recordings to measure the number of high-pitched bleats, the number of olfactory explorations and the time spent in the contact areas in the choice and IRS tests for 20% of the total data. To assess interobserver reliability, we used percentage agreement (data obtained by both OBS 1 and OBS 2/total detected: by OBS1 only þ by OBS 2 only þ by both OBS 1 and OBS 2) and the Pearson correlation. In the choice test, the time spent in the contact areas had 94% of agreement between the two observers and was correlated with r 2 = 0.99, the number of high-pitched bleats had 92% of agreement and was correlated with r 2 = 0.98 and the number of olfactory explorations had 85% of agreement and was correlated with r 2 = 0.95. In the IRS test, the time spent in the contact area had 94% of agreement and was correlated with r 2 = 0.98, the number of high-pitched bleats had 90% of agreement and was correlated with r 2 = 0.98 and the number of olfactory explorations had 83% of agreement and was correlated at r 2 = 0.88 (all P < 0.01). Reliability estimates for the time spent in a contact area, the number of high-pitched bleats and the number of olfactory explorations across the different tests are considered to be high because they were always above 80% of agreement and the r 2 correlation was between 0.90 and 0.99.

Statistical Analysis

To analyse behavioural responses of lambs in relation to sex we used linear mixed models (package 'lme4'). Some lambs had the same mother and the linear mixed-effect model (LMER) allowed us take into account the identity of the lamb (lambs ID) and the identity of the mother (mother ID) as random effects. When the factor had a significant effect (threshold for significance was set at P ≤ 0.05) or was almost significant (0.05 < P ≤ 0.09), multicomparison was conducted using the package 'multcomp' with Tukey HDS correction ('glht' function; Dobson, 2002).

In a first step, we analysed the three sessions of choice tests in order to test the effect of the session and the sex of the lamb (fixed effects) on the number of bleats and on the number of olfactory explorations. In a second step, to analyse differences in time of contact with the two ewes in the three different sessions, we compared the time spent near the two ewes according to the category of the stimulus ewes, the session and the sex of the lamb (fixed effects). Finally, we analysed the IRS test comparing the number of high-pitched bleats and olfactory explorations according to phase, category of the ewe met during reunion and sex (fixed effects) and also lamb and mother ID (random effects). Because no sex difference was observed during the isolation and separation phases, we only took into consideration the time spent in the contact area, number of olfactory explorations and number of highpitched bleats according to the category of ewe met, lamb sex (fixed effects) and lamb and mother ID (random effects) during the reunion phase. In a final model we compared the time spent in the contact zone during reunion according to the category of the ewe reunited with and the sex of the lamb (fixed effects) and according to the mother ID (random effect). Given the restricted number of males and females per group (<10), for this test, sex groups were compared using an exact permutation test (Ludbrook & Dudley, 1998). This randomization test compares, by binomial tests, the difference in means between data of the two groups with the difference in means obtained by 1000 permutation bootstraps of the data between groups. Permutation tests were conducted using R (package 'exactRankTest', function permtest).

Table1

Effects of the category of the ewe and sex of the lamb on attachment behaviours during tests Model 1 (time in contact~ ewe-session*sex + (1j mother ID/lamb ID)) evaluates the time spent near each ewe according to the category of the ewe, the sex of the lamb (fixed effects), the identity of the lambs (lamb ID) and their mother (mother ID) (random effects). Model 2 (bleats~ session*sex + (1j mother ID/lamb ID)) and model 3 (exploration~ session*sex + (1j mother ID/lamb ID)) evaluate, respectively, the number of high-pitched bleats and the number of olfactory explorations according to the session, the sex of the lamb (fixed effects), the identity of the lamb and their mother (random effects). Model 4 (time in contact~ session* sex +(1j mother ID)) evaluates the time spent in the contact area during the reunion phase of the IRS test according to the category of the ewe met, the sex of the lamb (fixed effects) and the mother ID (random effect). Model 5 (bleats~ session*sex + (1j mother ID)) and model 6 (exploration~ session*sex + (1j mother ID)) evaluate, respectively, the number of high-pitched bleats and the number of olfactory explorations according to the category of the ewe met during reunion (mother, familiar or unfamiliar ewes), the sex of the lamb (fixed effects) and the identity of the mother (random effect). Gaudin et al. / Animal Behaviour 102 (2015) 33-43 37 Ethical Note

All the animals were maintained under routine indoor hus-P < 0.01; females: Z = 12.49, N = 22, P < 0.01; Fig. 3). During the second session (mother versus familiar ewe), lambs spent more time near their mother than the familiar ewe (males: Z = 4.293, bandry conditions at an INRA research station (Unité Expé ri-N = 24, P < 0.01; females: Z = 11.04, N = 22, P < 0.01; Fig. 3) but the mentale de Physiologie Animale de l'Orfrasie`re, Nouzilly, France). Animal welfare requirements were fully respected in accordance with the European Directive 2010/63/EU. The experimental facilities were approved by the local office of veterinary services (Indreet-Loire, France, authorization no. E 37-175-2), all behavioural tests were approved by the Val de Loire Ethic Committee (authorization no. 2010-8), and the personnel involved had special training in animal care, handling and experimentation as required by the French Ministry of Research. The experimental protocols included short test periods (3-5 min) when lambs were removed from their group and placed with familiar and unfamiliar adult sheep. Some situations were likely to cause distress, especially when lambs were tested without their mother, but not unlike what would normally occur when lambs intermingle in large outdoor flocks. Once a test session was accomplished, the lamb was immediately reunited with its mother. The experimental procedures had no detrimental effect on the development of the lambs and at the end of the experiment all the animals were returned to the breeding INRA research station.

RESULTS

Choice Tests

In the three test situations, all the lambs left the holding pen swiftly and walked or ran towards the stimulus ewes. Most of them made a clear choice but the linear mixed models revealed that the time spent near each ewe was dependent upon their identity and the session (Table 1) and that there was a significant interaction between the sex of the lamb and the time spent near each ewe (Table 1).

More specific comparisons showed that during the first session (mother versus unfamiliar ewe) all male and female lambs showed a very clear preference for their mother as they spent far more time near her than near the unfamiliar ewe (males: Z = 14.50, N = 24, choice was not as pronounced as in the first session. During this second session, daughters spent more time near their mother than sons (Z = 3.51, N1 = 22, N2 = 24, P = 0.02; Fig. 3) whereas the reverse was found for the time near the familiar ewe (Z = 3.567, N1 = 22, N2 = 24, P = 0.02; Fig. 3). Thus in a familiar social context, female lambs sought more contact and maintained closer proximity with their mother than male lambs. During the third session performed in the absence of the mother (familiar versus unfamiliar ewe), males spent more time near the familiar than near the unfamiliar ewe (Z = 4.010, N = 24, P < 0.01; Fig. 3) whereas females did not show any preference.

In all cases when the lambs were released in the test pen, they bleated immediately. At no time did vocalizations cease completely even when lambs were close to their mothers. None the less, analysis of the number of high-pitched bleats uttered by the lambs showed that they varied across sessions (Table 1) and according to sex (Table 1). Lambs bleated less in the presence of the mother and the familiar ewe than in the presence of the mother and an unfamiliar ewe (session 2 versus session 1: Z = 3.39, N = 46, P = 0.001; Fig. 4a). But, when given the choice between the familiar and an unfamiliar ewe, they uttered more high-pitched bleats, on average twice as many, than in choice tests involving their mother as one of the stimulus ewes (session 3 versus session 1: Z = 7.71, N = 46, P < 0.0001; session 3 versus session 2: Z = 4.32, N = 46, P < 0.0001; Fig. 4a). Comparisons between the sexes revealed that females bleated more than males in session 3, in which the choice test did not include the mother (Fig. 4a).

The number of olfactory explorations varied across sessions (Table 1). It was highest in the presence of the mother and the familiar ewe and lowest in the presence of the familiar and unfamiliar ewes, these two sessions differing significantly (Z = 3.024, N = 46, P = 0.007; Fig. 4b) and was almost exclusively displayed when lambs were in the contact zone. No significant difference in exploratory activity was found between male and female lambs. unfamiliar ewe. In the same way, during the choice tests, lambs performed more explorations in the presence of their mother and the familiar ewe than during the test opposing the familiar and the unfamiliar ewe. It has been shown in human and nonhuman primates that infants explore toys and objects when tested in a novel environment in the presence of their attachment figure. In contrast, when alone or in the presence of unfamiliar individuals, exploration is inhibited (mother: Ainsworth & Bell, 1970;surrogate: Harlow, 1959). It was concluded that the mother provides a secure base that increases exploratory behaviour in contrast to the unfamiliar figure (Ainsworth & Bell, 1970;Feeney & Thrush, 2010). Our results highlight for the first time this key feature of attachment behaviour in lambs. Interestingly in the IRS test, during reunion with the mother exploration increased more in daughters than in sons, suggesting that the mother could be a stronger secure base for female than for male lambs. Curiously, the choice test did not reveal any sex differences in exploratory behaviour, even though the mother was present in the first two sessions. It may be that choice tests are more stressful and the number of bleats supports this point: lambs were very vocal in the two-choice tests even in the presence of their mother while they were fairly quiet when reunited with their mother in the IRS test. In the choice test, the presence of the other adult female may be disturbing since she has been separated from her own lamb and is therefore agitated. Our results show that, in an appeasing context, the mother is a stronger secure base for daughters than for sons and increases olfactory exploration in the nearby area.

Infant-mother Attachment and Early Social Segregation

Our study demonstrates clearly that in both sexes attachment to the mother is very much present in 3-week-old lambs. However, daughters seek closer proximity with the mother, display more exploratory behaviour in her presence than sons, and are more distressed in her absence even though an unfamiliar ewe is nearby. All these attachment behaviours support the idea that daughters are more strongly attached to their mother than sons in domestic sheep. Bon and Campan (1996) suggested that sociosexual segregation has its roots in infancy through a difference between sexes in their social ontogeny. Our results suggest that early stronger daughteremother attachment is one of these roots. In fact, as the attachment bond generally promotes proximity and interactions between individuals, the stronger daughteremother attachment would promote proximity between them. In contrast, a weaker sonemother attachment would drive sons away from the mother at a time when they are still being nursed to interact with attractive same-sex and same-age peers as described in a large number of ungulates (for a review: Lent, 1974;red deer: Lowe, 1966;Guinness et al., 1979;Cederlund, Sandegren, & Larsson, 1987;domestic sheep: Grubb & Jewell, 1966;bignorn sheep: Leslie & Douglas, 1979;bovids;Lidfors & Jensen, 1988;Green, 1992; African elephant: Lee, 1986;Moss & Poole, 1983). This early difference in attachment would consequently favour early sociosexual segregation inside the matriarchal group. Accordingly, in the Mediterranean mouflon, Guilhem et al. (2006) observed that between 3 and 10 weeks of age female lambs stay close to their own mother while male lambs interact more often with same-sex and same-age peers at the periphery of the motheredaughter group. Under natural conditions, Walser and Williams (1986) described a rather similar pattern in twin lambs of domestic sheep at the age of 13e18 weeks, just before separating mother and young at weaning. In regard to other ungulates, it has been reported that juvenile male African elephants and domestic cattle, Bos taurus, play more often with either same-sex or unfamiliar peers, and tend to be farther from mothers than females which, in contrast, stay closer to their mothers (Lee, 1986;Lidfors & Jensen, 1988: Veissier, Le Neindre, & Garel, 1990).

In the theoretical framework of sociosexual segregation, the stronger daughteremother attachment would have several selective advantages. It would help young females to learn features of their natal home range and maintain the strong philopatry observed in ungulates (Clutton-Brock et al., 1982;Festa-Bianchet, 1991;Lent, 1974;Mathews & Porter, 1993). It could also increase association and formation of affiliative behaviours between individuals that interact preferentially with the mother, such as siblings (Ligout & Porter, 2004;Shillito-Walser, Willadsen, & Hague, 1981). Finally, a stronger daughteremother attachment may favour, via the mother's presence, interactions and social affinities for same-sex class conspecifics increasing the cohesion of the female group. In contrast, the weaker sonemother attachment, in addition to their attraction for same-sex and same-age peers (the male social affinity hypothesis) could promote postweaning separation and the grouping of young males. Ultimately, it may also prepare males for dispersal which occurs at around 2 years of age in sheep (Geist, 1971).

Many researchers have tried to find an explanation for sociosexual segregation through social preferences in adulthood (MacFarlane & Coulson, 2009;[START_REF] Pérez-Barbería | Are social factors sufficient to explain sexual segregation in ungulates?[END_REF]. Our results suggest that social preferences differ between the sexes at the beginning of the youngemother relationship. As sexual dimorphism increases with age, differential energy requirements and differences in reproductive strategies would lead same-sex groups to use different habitats consolidating sexual segregation acquired in the juvenile period (Bowyer, 2004;Main, 2008;Pérez-Barbería & Yearsley, 2010). Following this framework, the difference in habitat use would then be a by-product of the sociosexual segregation (Bon & Campan, 1996).

Conclusion

As stated by Bon and Campan (1996, p. 137), 'Segregating means that males quit the maternal environment as well as other female groups, involving a double process of social rupture. The first consists in disrupting the attachment to the mother and the second consists in stopping interactions with juvenile and adult females'. Our results combined with the male social affinity hypothesis suggest that by 3 weeks of age male lambs already start moving some distance from their mother while the stronger daughteremother attachment promotes their proximity. This provides new arguments in support of the social affinity hypothesis in ungulates. (Carter, 1998 ;[START_REF] Keverne | Vasopressin, oxytocin and social behaviour[END_REF]Insel & Young, 2001 ;Neumann, 2002Neumann, , 2008)). Dans le cadre de ces recherches, l'OT plasmatique est très souvent dosée (Babygirija et al., 2012;Stock, 1988;Stock & Uvnäs-Moberg, 1988;Zhang et al., 2011;Stock & Uvnäs-Moberg, 1988;Devarajan, & Rusak, 2004;Kramer et al.,2004 ;Maestripieri et al., 2009;Winslow et al., 2003;Feldman et al., 2007Feldman et al., , 2011 ; ;Carter et al., 2007). Plusieurs méthodes sont employées: le dosage radio-immunologique (RIA) ou le dosage immuno-enzymatique (EIA) avec ou sans extraction préalable de l'OT. En comparant ces différentes méthodes, Szeto et ses collègues (Szeto et al., 2012) ont mis en évidence la nécessité de l'extraction bien que la méthode de dosage "en direct" soit largement utilisée dans la littérature (Devarajan, & Rusak, 2004 ;Kramer et al., 2004 ;Maestripieri et al., 2009;Winslow et al., 2003 ;Feldman et al., 2007Feldman et al., , 2011 ; ;Carter et al., 2007). Cette étude souligne par ailleurs la nécessité de valider le dosage avant son utilisation.

Le dosage EIA avec extraction préalable, simple à mettre en place, semble être une méthode efficace pour doser l'OT plasmatique (Szeto et al., 2012). Dans le cadre de ce travail sur la sécrétion d'OT chez l'agneau élevé dans différents contextes sociaux, nous avons testé la validité du dosage de l'OT plasmatique par EIA chez le mouton à partir de kits commerciaux (Enzo Life Sciences). Pour évaluer la justesse et la répétabilité du dosage, nous avons utilisé des profils d'exactitudes (Feinberg, 2006(Feinberg, , 2009)). Cette méthode consiste à doser plusieurs échantillons de plasma surchargés de différentes concentrations connues d'OT (niveaux) sur plusieurs jours et à évaluer la variabilité de la mesure. Les profils d'exactitudes permettent de valider la méthode de dosage selon une certaine tolérance de variabilité fixée. L'OT est un peptide qui peut être dégradé par la chaleur, le pH (Hawe et al., 2009) et la lumière (Mozziconacci & Schöneich, 2012). Plusieurs études utilisent des tubes additionnés d'aprotinine pour limiter cette dégradation, et congèlent le plasma avant le dosage (Matthiesen et al., 2001 ;Wu et al., 2003 ;Skrundz et al., 2011). Dans la mesure où lors de nos expériences les tubes sont rapidement mis dans la glace puis centrifugés dans les 30 à 60 minutes après le prélèvement, nous avons évalué si l'utilisation de tubes héparinés pouvait plasma initial pour le niveau de base, trois aliquotes surchargés en OT de 25 pg/ml (niveau 1), trois aliquotes surchargés de 50 pg/ml (niveau 2) et trois aliquotes surchargés de 100 pg/ml (niveau 3). Pour le second profil d'exactitude, nous avons fait varier la concentration d'OT en modulant la quantité de plasma passée dans la colonne: pour le niveau de base, trois aliquotes de plasma initial ont été dosés selon la procédure normale, pour le premier niveau, trois aliquotes de 0,5 ml de plasma ont été passés sur la colonne au lieu de 1 ml, réduisant par 2 la quantité d'OT initiale. Pour le second niveau, trois aliquotes de 2 ml de plasma ont été passés sur la colonne, augmentant la quantité d'OT fixée sur la colonne par 2. Pour la dernière série, trois aliquotes de 3 ml de plasma ont été passés sur la colonne augmentant par 3 la quantité d'OT (niveau 3). Tous les aliquotes ont été recongelés puis décongelés le jour de leur dosage. + 100 pg/ml pour le niveau 1, + 200 pg/ml pour le niveau 2 et + 400 pg/ml pour le niveau 3.

La justesse du dosage (écart par rapport à la valeur cible) varie en fonction de la concentration puisque le biais passe de -14,3 % pour le niveau 1 (+ 25 pg/ml initialement, + 100 pg/ml après concentration) à -2,2 % pour le niveau 2 (+ 50 pg/ml initialement, + 200 pg/ml après concentration), puis de 7,3% pour le niveau 3 (+ 100 pg/ml initialement, + 400 pg/ml après concentration) à 5,8%. La fidélité (écart entre les différentes valeurs obtenues d'un même niveau) varie aussi suivant les niveaux de concentration passant de 8,1% au niveau 1, à 10,3% au niveau 2 et 5,8% au niveau 3. La fidélité ne dépasse pas les 30% fixés. De plus, les limites de tolérance fixées à 80 % (intra-essai pour un niveau) sont comprises entre les limites d'acceptabilité (30%). La méthode de dosage est donc validée pour un domaine d'application s'étendant de 150 pg/ml à 450 pg/ml, soit une concentration plasmatique de 37,5 pg/ml à 112,5 pg/ml (Figure 15). On observe que la justesse du dosage diminue lorsque la concentration augmente, le biais absolu passe de 1,9 % au niveau 1 à 13,1 % au niveau 3. La fidélité, par contre, augmente lorsque la concentration augmente, le coefficient de variation de fidélité passant de 18,3% au niveau 1 à 8,4 % au niveau 3. Pour ce profil aussi, les limites de tolérance fixées sont comprises dans les limites d'acceptabilité validant ainsi la méthode de dosage un domaine d'application s'étendant de 25 pg/ml à 140 pg/ml, soit une concentration plasmatique de 6,25 pg/ml à 35 pg/ml (Figure 16). sont utilisés dans le cadre de la validation de méthode de dosage (Feinberg, 2006(Feinberg, , 2009)). Les résultats des deux profils d'exactitude valident notre méthode de dosage pour une concentration plasmatique d' OT entre 6,25 pg/ml et 450 pg/ml, soit une concentration plasmatique de 1,6 pg/ml à 112 pg/ml avec une limite d'acceptation de 30% et une limite de tolérance de 80%. Dans notre étude, l'utilisation de tubes héparinés n'influence pas le dosage par rapport à des tubes additionnés d'aprotinine parfois utilisés (Matthiesen et al., 2001;Wu et al., 2003;Skrundz et al., 2011). Le délai entre le prélèvement et la centrifugation, la récupération et la congélation du plasma étant rapide, ce protocole pourrait limiter la un cache mamelle a été posé sur la mère afin d'éviter que le jeune ne tète durant 1 heure. A la fin de l'heure, une première prise de sang a été réalisée pour fixer un taux de base de l'OT plasmatique. Le premier jour, pour déterminer l'effet de la séparation sur le taux d'OT plasmatique, l'agneau a été séparé de sa mère pendant 15 minutes dans une autre pièce puis conduit dans la deuxième partie d'une case, similaire à la case de vie, mais en absence de congénère. Une prise de sang a été effectuée 1 minute après que l'agneau ait été placé dans la deuxième partie de la case. L'agneau a ensuite été reconduit dans sa case de vie avec sa mère et le cache-mamelle retiré. Le deuxième et troisième jour, la procédure a été répétée sauf que l'agneau a été réuni dans la deuxième partie d'une case contenant une brebis étrangère. Le quatrième jour, l'agneau a été réuni avec sa mère puis le cinquième jour, il a été de nouveau laissé seul comme le premier jour de test.

Résultats

Conclusion

Comme montré lors de précédentes études, l'OT plasmatique augmente dans les premières minutes suivant la tétée chez la mère et celles suivant l'ingestion de lait chez l'agneau (mère : [START_REF] Neumann | Oxytocin and vasopressin release within the supraoptic and paraventricular nuclei of pregnant, parturient and lactating rats: a microdialysis study[END_REF][START_REF] Higuchi | Detailed analysis of blood oxytocin levels during suckling and parturition in the rat[END_REF]Kendrick et al., 1988 ;Mitchell, & Brennecke, 1982 ;[START_REF] Amico | Pattern of Oxytocin Concentrations in the Plasma and Cerebrospinal Fluid of Lactating Rhesus Monkeys (Macaca mulatto): Evidence for Functionally Independent Oxytocinergic Pathways in Primates[END_REF][START_REF] Mcneilly | Release of oxytocin and prolactin in response to suckling[END_REF][START_REF] Schams | Oxytocin secretion during milking in dairy cows with regard to the variation and importance of a threshold level for milk removal[END_REF]Lupoli et al., 2001;jeune : Nelson et al., 1998 ;Lupoli et al., 2001). Dans la seconde expérience, la séparation de la mère et l'isolement pendant 15 minutes n'induisent pas d'augmentation de l'OT plasmatique.

Plusieurs types de stress aigus sont pourtant capables d'induire une telle augmentation après 15 minutes, comme le stress de nage forcée ou l'immobilisation (pour revue : Neumann, 2007).

La séparation de la mère chez l'agneau pourrait ne pas être liée à une sécrétion d'OT plasmatique, ou l'OT pourrait être sécrétée à partir d'une durée plus longue de séparation. En effet chez le rat, l'augmentation plasmatique est mesurée après 1 heure de séparation [START_REF] Kojima | Maternal contact differentially modulates central and peripheral oxytocin in rat pups during a brief regime of mother-pup interaction that induces a filial huddling preference[END_REF]. La réunion avec la mère ou une brebis étrangère, avec une possibilité limitée d'interaction physique mais source d'apaisement après un isolement (Gaudin et al., 2015), n'influence pas la sécrétion d'OT plasmatique sous forme de pulse comme l'ingestion de lait.

Comme montré chez le rat, les contacts physiques peuvent induire la sécrétion centrale et une sécrétion plasmatique d'OT durant la réunion [START_REF] Kojima | Maternal contact differentially modulates central and peripheral oxytocin in rat pups during a brief regime of mother-pup interaction that induces a filial huddling preference[END_REF]. Quelques auteurs proposent que cette sécrétion potentialise l'effet d'apaisement chez l'Homme (Heinrichs et al., 2003). La prochaine étape de ce travail sera donc de mesurer l'OT plasmatique après une réunion où l'agneau et la mère ont la possibilité d'interagir mais sans téter. Si les situations de séparations et réunions de ce protocole ne mettent pas en évidence d'augmentation d'OT plasmatique, ces données ne permettent pas de conclure sur la sécrétion d'OT centrale dans ces contextes. En effet, l'OT peut être sécrétée de manière centrale, indépendamment de sa sécrétion périphérique [START_REF] Gibbs | Stress-specific modulation of ACTH secretion by oxytocin[END_REF]Engelmann et al., 1999Engelmann et al., , 2000 ; ;Land et al., 1983 ;Babygirija et al., 2012). Une étude plus particulière de la concentration d'OT dans le liquide cérébrospinal pourrait informer sur la sécrétion centrale de l'OT lors de ces différentes situations stressantes et apaisantes. La sécrétion centrale pourrait être accompagnée d'une faible augmentation de l'OT plasmatique par diffusion plutôt que par pulse mais dans des quantités faibles, non détectables par le dosage d'OT qui permet une erreur de 30% de la mesure. Ce phénomène pourrait expliquer l'augmentation de la variabilité dans les 3 derniers jours et refléter un début d'adaptation à des stress chroniques comme montré chez le rongeur (Babygirija et al., 2012 ;Zheng et al., 2010).

Etude 3 : Un attachement peut-il se développer pour un ou plusieurs congénères au sein d'un groupe d'agneaux sans figure maternelle ?

Article 2: Mothers participate to early development of preference relationships between same-age female lambs Gaudin S 1,2,3,4* , Cabanes G 5 ., Chaillou E 1,2,3,4 , Cornilleau F 1,2,3,4 , Crétien-Corjon, J 1,2,3,4 , Kraïmi N 1,2,3,4 ., Moussu C 1,2,3,4 Murray, 1981). In Ovis species, social organization of female's group with offsprings includes strong proximity with the lamb, particularly with daughter, and labile preferential association between adult ewes that are generally not related (Arnold, Wallace & Rea, 1981;Le Pendu, Briedermann, Gerard & Maublanc, 1995). If preferential relationship between juvenile males has been extensively studied (Mediterannean mouflon: Guilhem, Bideau, Gerard, Maublanc & Pépin, 2006;Bighorn sheep: Geist, 1968), no studies have investigated the development of preferential relationship among juvenile females despite their potential role in the cohesion of the female group and in the ontogeny of social preference for interacting with other same age females (Bon Rideau, Villaret & Joachim., 2001;Pérez-Barberìa, Robertson & Gordon, 2005). Like human and non-human primates, lambs develop an attachment bond for the mother (children: Ainsworth, 1989;Ainsworth & Bell, 1970; non-human primate: Higley & Suomi, 1986;lamb: Gaudin, Chaillou, Cornilleau, Moussu, Boivin & Nowak, 2015) keeping strong proximity with this figure (Morgan & Arnold, 1974). This attachment strongly express in females (Gaudin et al., 2015;Hinch, Lynch, Elwin, & Green, 1990;Hinch, Lecrivain, Lynch & Elwin, 1987;Lawrence, 1990). In human and non-human primates, attachment for the mother play an important role in the early socialization of the infant and relationship with peers (children: Collins & Laursen, 1999;Maccoby, 1992;Sroufe & Fleeson, 1986; primates: Suomi, 1997;Harlow, Harlow, Margaret & Hansen, 1963) particularly by the use of the mother as a secure base to explore (Ainsworth, 1989;Ainsworth & Bell, 1970;Bowlby, 1969). In female lambs, attachment for the mother could also permit the development of preferential relationship among juvenile females and interactions between mothers could also facilitate interactions between daughters. Another parameter that could influence the proximity between juvenile females is the strong selectivity of the maternal behavior observed also in many ruminants. In fact, mother accepts the proximity of only her own offspring and reject any other with agonistic behaviours (sheep and goat: Poindron, Lévy & Keller, 2007;Romeyer & Poindron, 1992;mouflon: Guilhem, Bideau, Gerard & Maublanc, 2000; European bison Bison bonasus: Daleszczyk, 2004). Impossibility to interact with another adult female ewe could favor interaction between youngs.

By these both mecanisms the presence of maternal figures should participate to the development of social relationship among juvenile females. This question is particularly important because maternal separation is widespread in farm breeding practices (Large, 1969;Napolitano, De Rosa & Sevi, 2008). Neonates are often separated from the mother within 24 hours of life and reared with same age peers in group without maternal figure and, in our knowledge, any study has shown if social relationships between peers are affected by the absence of the mother attachment figure. The absence of such figure in primates is often associated with alteration of stress system and more particularly hypotalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis that participate to the secretion of plasma cortisol (CORT). Peer-reared infant monkeys for example show higher (Barrett, Noble, Hanson, Pine, Winslow & Nelson, 2009;Champoux, Coe, Schanberg, Kuhn and Suomi, 1989;Higley, Suomi and Linnoila, 1992) or lower level of CORT (Meyer, Novak, Bowman & Harlow, 1975;Capitanio, Mendoza, Mason & Maninger, 2005;Barr, Newman, Lindell, Becker, Shannon, Champoux, Suomi, Higley, 2004). Such alteration of HPA axis is also observed in individuals submitted to adverse childhood or early stress (Sànchez, 2006;Veenema, 2009) and is a factor for psychological diseases as depression (Chrousos & Gold, 1992;Gold & Chrousos, 2002). One study of Napolitano and colleagues (Napolitano, Cifuni, Pacelli, Riviezzi & Girolami, 2002) did not report difference in CORT response to stress at 42 days of age. However, physiological reaction to novel environment could also mask differences in basal level. Additional studies on basal CORT are needed to detect eventual alteration of HPA axis activity.

In this study we evaluated the importance of mother's presence in the development of attachment for one particular figure in a group and the development of preferential relationships among juvenile female lambs. We followed preferential proximity but also avoidances between individuals in mothered lambs and artificial peer-reared lambs group during their second and third weeks of age. This period was chosen because attachment and proximity express strongly during the during this period (Gaudin et al., 2015) and female lambs were more often seen near mothers (Lawrence, 1990;Hinch et al., 1987Hinch et al., , 1990) ) whereas young males interact more often with same age peers (domestic sheep, Ovis aries: Sachs & Harris, 1978;Mediterranean mouflon: Guilhem et al., 2006;bighorn sheep: Geist, 1968) that offer possibility to daugthers to interact in the vicinity of the mother. We hypothesized that mother caracteristics will permit the formation of attachment for this particular figure and preferential relation between some female lambs. Proximity between mothers could also influence interactions between offspring in addition to avoidance of others selective maternal ewes. If the mother permits the development of attachment and peer relationship, absence of mother figure in peer-reared female lambs would results in absence of more prefered individual and absence or delayed development of preference for same age peers. In such case, alteration of basal CORT is expected in peer-reared compared to mothered lambs.

Materials and method

Animals and housing 11 mothered and 11 peer-reared female Ile-de-France lambs (Ovis aries) were used in this study. Animals were provided by the INRA animal breeding center (UEPAO n°1297, EU0028, INRA Centre Val de Loire). The 11 peer-reared lambs were separated from their mother at 24 hours after birth and were reared together in a 20 m 2 pen in another facility.

They were trained to feed by human caregivers every the 6 hours for 3 first days using teats fixed on a metal wall and linked to an automatic feeder (Eurolouve, Alliance pastorale) providing milk ad libidum at constant concentration (200 g/ l) and temperature (43°C). 11 lambs were reared with their mothers in a symmetrical 20 m 2 pen located in the same building. A feeding belt separated the two pens and wooden boards were used to avoid visual communication between the two groups (Figure 1a and1b). In order to provide the same surface per lamb in the two groups, 11 plastic cubes were placed in the pen of the peer-reared group. Fresh straw was added daily to keep the litter clean and adult ewes were fed with granule for lactating ewes and hay in the morning.

Associations and assessment of preference and avoidance for individuals

Associations between sheep were recorded during two periods. In the first period (second week of life), assosciations were recorded for 5 days, when lambs were aged from 7 ± 1 to 11 ± 1 days. In the second period (third week of life), associations were recorded for 9 days when lambs were age from 17 ± 1 to 29 ± 1. To measure association between individuals, a security cameras (AXIS camera) was installed to record the two parks. Before individuals were reared in these two pens. Before bringing the animals, a grid of 1 m X 1 m squares was drawn on the floor (Figure 1a). This grid was then reported on the computer screen in presence of the individuals to evaluate the different associations (Figure 1b). In the morning, at 5:00 AM, light was turned on and daily care was provided. At 6:00 AM the two pens were videotaped until 12:00 AM and associations between individuals were recorded on snapshot taken every 15 minutes. An association between two individuals was considered when the distance between both was equal or less than 1 meter, distance generally observed between mother and offspring at this age (Hinch et al., 1987). The total number of associations for the first and the second period of observation were calculated for each dyad using association matrices. Four association matrices were obtained: one association matrice for each group for the first and second period. For all dyad the half-weight association index (HWI) was calculated with the formula: HWI = x/ ((na +nb)/2) where x represent the number of associations observed during two individuals (a and b), na the total number of associations involving individual a and nb the total number of associations involving individual b. From association matrices at 1 and 2 weeks, we calculated the probability for each dyad to be more or less associated than the random expectation, by this way preferences but also avoidances for individuals of the group could be respectively assess. The calculation of random expectation was based on shuffle the total number of association observed for each dyad. Consequently, in the mothered group, the few associations between lambs and familiar ewes expected could influence the assessment of preferences for same age peers. In addition to assess preference and avoidance among all individual of the mothered group to identify strong proximity for the mother and avoidance for other ewes, we evaluate preference among same age peers without taking in account associations with adult ewes.

Blood samples and CORT dosage

Blood samples were collected in the afternoon (14:00) for each lamb from the third day following the grouping of animals to 35 days. Samples were collected with 5 ml heparined tubes and immediately chilled on ice until being centrifuged for 15 minutes at 4°c and 3600 g.

The resultant plasma was separated and stored at -20°C until assayed. Blood samples were taken by experienced and competent staff within 2 min of the start of the sampling procedure.

CORT was dosed with RIA method in a laboratory of hormonal dosages (Laboratoire de dosages hormonaux, INRA -Centre val de Loire). The radioimmunoassay method to measure plasma CORT was used as described by Orgeur (Orgeur, Mavric, Yvore, Bernard, Nowak, Schaal & Lévy, 1998).

Statistical analysis

Preference and avoidance for individuals in mothered and peer-reared groups In order to detect significant preferrance or avoidance relationships between the individuals, we compared the association matrices created from the observations with a set of association matrices randomly generated using a permutation method. For each association matrix, we generated 10 000 matrices of random associations between the individuals. In these matrices, the number of observations for each individual is constrained to be the same as in the original data, but the associations are randomly permuted between individuals. In that way, in the generated matrices, the characteristics of each individual is preserved, e.g. if a sheep was observed X times in association with other sheep, it will be in association X times in the generated matrices, but with randomly chosen individuals. The HWI index was then computed for each pair of individual in each generated matrix, in order to have a randomized distribution of HWI for each pair. If the observed HWI index of a pair is the expression of random associations between individuals, it should fit in the generated distribution. It is therefore possible to computes the probability p of rejecting this hypothesis by comparing the observed HWI with the generated distribution. In this study we use p<0.05 as a threshold for significant association between two sheep. A similar approach is described by Bejder, Fletcher & Bräger (1998).

Basal CORT level

Linear mixed models (LMER) was used to analyze plasma CORT level according to the group and the age of lambs. LMER model on CORT level was conducted on the log of plasma CORT to respect normal distribution and included the group and the day of sampling as fixed effects. Lamb identity (lamb ID) was added as random effect. We used t-tests for independent samples to compare both groups at different ages. p<0.05 were considered as significant. Sofwares R 3.1.1 was used to performed LMER models and correlation tests and the analysis of matrices have been done with Matlab 2014a. UCINET 6 and Netdraw were used to draw sociograms [START_REF] Borgatti | NetDraw Software for Network Visualization[END_REF]Borgatti, Everett and Freeman, 2002).

Results

Associations between infant and adult ewes in mothered lambs

The HWI observed in mothered lambs during the second and third week of age are given respectively in Figure 2 and3.

During the second week of life, 8 /11 mothered lambs were more often associated with their mother than any other individuals, including others familiar ewes and other lambs. All mother-infant dyad significantly preferred to interact with each other. Concerning mothers, they were all more associated with their lamb than with any other individual. During this first period, all lambs presented in addition to preferred association with the mother, at least 5 and a maximum of 9/10 familiar ewes avoided.

During the third week of life, 7 /11 lambs were more associated with their mother than any other individual and only one lamb (M 6) did not show significant preference for the mother. 9 /11 ewes still showed more association with their lambs. Lambs showed at least 6 and a maximum of 10 adult ewes avoided (all other ewes than mothers). During this second period, two lambs showed in addition to the preferential association with the mother, association with a ewe (M 6).

Across the two weeks of observation, 10/11 lambs showed a maintenance of the preference for the mother. 65 /74 avoidance relationships were aslo maintained. Significant correlation was recorded between HWI of ewe-lambs dyads between the second and third weeks of age.

(Spearman correlation: r = 0.33, p<0.05).

Preference and avoidance among ewes

During the second week, 10 preferential and 6 avoidance associations between ewes were recorded. Only one ewe (M 4) had not preferential association. The other ewes showed between 1 and 4 preferential association with other ewes. M 6 ewe showed the more preferential associations with 4 ewes. 7 /11 ewes showed between 1 and 3 avoidances of individuals. M 10 and M 11 showed the more avoidance of individuals.

During the third week, 17 preferential and 2 avoidance associations were recorded. All ewes showed between 1 and 5 preferential associations with other adult ewe. M 4 show the more association with other ewes. On 10 preferential associations 2 were maintained between the two weeks of observation. On 6 avoidance relationships one was maintained and 1 turned in 123 preference at 14 days. No significant correlation was found between HWI of ewe associations between the two weeks of observation.

MR1 MR2 MR3 MR4 MR5 MR6 MR7 MR8 MR9 MR10 MR11 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 MR1
-0,08 0,09 0,05 0,16 0,10 0,08 0,01 0,05 0,06 0,03 0,13 0,02 0,07 0,01 0,01 0,01 0,03 0,01 0,03 0,03 0,02 MR2 0,08 -0,08 0,11 0,15 0,07 0,03 0,06 0,05 0,02 0,06 0,02 0,14 0,08 0,04 0,01 0,01 0,00 0,00 0,01 0,01 0,01 MR3 0,09 0,08 -0,07 0,12 0,07 0,05 0,01 0,06 0,05 0,00 0,01 0,02 0,21 0,01 0,04 0,06 0,04 0,01 0,00 0,03 0,01 MR4 0,05 0,11 0,07 -0,08 0,01 0,08 0,02 0,08 0,05 0,03 0,00 0,03 0,01 0,28 0,00 0,03 0,03 0,00 0,01 0,02 0,01 MR5 0,16 0,15 0,12 0,08 -0,10 0,09 0,01 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00 0,05 0,00 0,14 0,01 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 MR6 0,10 0,07 0,07 0,01 0,10 -0,13 0,02 0,04 0,07 0,04 0,01 0,01 0,03 0,00 0,03 0,17 0,03 0,00 0,01 0,03 0,01 MR7 0,08 0,03 0,05 0,08 0,09 0,13 -0,04 0,04 0,08 0,01 0,02 0,01 0,01 0,00 0,05 0,01 0,22 0,00 0,02 0,02 0,00 MR8 0,01 0,06 0,01 0,02 0,01 0,02 0,04 -0,03 0,03 0,11 0,03 0,00 0,06 0,01 0,01 0,01 0,00 0,39 0,03 0,01 0,03 MR9 0,05 0,05 0,06 0,08 0,04 0,04 0,04 0,03 -0,12 0,06 0,03 0,06 0,02 0,06 0,00 0,00 0,00 0,01 0,19 0,00 0,02 MR10 0,06 0,02 0,05 0,05 0,03 0,07 0,08 0,03 0,12 -0,08 0,00 0,04 0,01 0,00 0,01 0,01 0,03 0,01 0,01 0,32 0,00 MR11 0,03 0,06 0,00 0,03 0,02 0,04 0,01 0,11 0,06 0,08 -0,01 0,00 0,01 0,03 0,00 0,01 0,02 0,03 0,02 0,02 0,40 M1 0,13 0,02 0,01 0,00 0,01 0,01 0,02 0,03 0,03 0,00 0,01 -0,03 0,06 0,05 0,06 0,08 0,06 0,06 0,08 0,02 0,04 M2 0,02 0,14 0,02 0,03 0,00 0,01 0,01 0,00 0,06 0,04 0,00 0,03 -0,05 0,04 0,07 0,04 0,07 0,05 0,07 0,11 0,03 M3 0,07 0,08 0,21 0,01 0,05 0,03 0,01 0,06 0,02 0,01 0,01 0,06 0,05 -0,05 0,08 0,11 0,04 0,10 0,06 0,02 0,01 M4 0,01 0,04 0,01 0,28 0,00 0,00 0,00 0,01 0,06 0,00 0,03 0,05 0,04 0,05 -0,03 0,07 0,08 0,04 0,05 0,06 0,07 M5 0,01 0,01 0,04 0,00 0,14 0,03 0,05 0,01 0,00 0,01 0,00 0,06 0,07 0,08 0,03 -0,07 0,07 0,08 0,05 0,02 0,07 M6 0,01 0,01 0,06 0,03 0,01 0,17 0,01 0,01 0,00 0,01 0,01 0,08 0,04 0,11 0,07 0,07 -0,12 0,05 0,09 0,04 0,01 M7 0,03 0,00 0,04 0,03 0,01 0,03 0,22 0,00 0,00 0,03 0,02 0,06 0,07 0,04 0,08 0,07 0,12 -0,06 0,05 0,04 0,02 M8 0,01 0,00 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,39 0,01 0,01 0,03 0,06 0,05 0,10 0,04 0,08 0,05 0,06 -0,09 0,02 0,08 M9 0,03 0,01 0,00 0,01 0,00 0,01 0,02 0,03 0,19 0,01 0,02 0,08 0,07 0,06 0,05 0,05 0,09 0,05 0,09 -0,07 0,05 M10 0,03 0,01 0,03 0,02 0,00 0,03 0,02 0,01 0,00 0,32 0,02 0,02 0,11 0,02 0,06 0,02 0,04 0,04 0,02 0,07 -0,09 M11 0,02 0,01 0,01 0,01 0,00 0,01 0,00 0,03 0,02 0,00 0,40 0,04 0,03 0,01 0,07 0,07 0,01 0,02 0,08 0,05 0,09 -

MR1 MR2 MR3 MR4 MR5 MR6 MR7 MR8 MR9 MR10 MR11 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 MR1
-0,12 0,07 0,04 0,08 0,08 0,08 0,08 0,04 0,04 0,03 0,12 0,01 0,04 0,03 0,00 0,04 0,04 0,01 0,02 0,02 0,02 MR2 0,12 -0,10 0,05 0,10 0,08 0,11 0,04 0,07 0,06 0,07 0,01 0,08 0,04 0,02 0,01 0,02 0,03 0,00 0,02 0,01 0,02 MR3 0,07 0,10 -0,08 0,08 0,07 0,05 0,02 0,06 0,06 0,06 0,02 0,01 0,22 0,04 0,00 0,01 0,02 0,01 0,01 0,02 0,01 MR4 0,04 0,05 0,08 -0,10 0,11 0,08 0,04 0,04 0,04 0,05 0,01 0,01 0,04 0,17 0,01 0,02 0,06 0,02 0,02 0,02 0,02 MR5 0,08 0,10 0,08 0,10 -0,16 0,10 0,02 0,04 0,05 0,03 0,01 0,02 0,05 0,04 0,08 0,01 0,05 0,01 0,02 0,02 0,01 MR6 0,08 0,08 0,07 0,11 0,16 -0,08 0,03 0,04 0,05 0,05 0,02 0,01 0,04 0,04 0,01 0,06 0,08 0,01 0,02 0,03 0,02 MR7 0,08 0,11 0,05 0,08 0,10 0,08 -0,05 0,04 0,04 0,04 0,01 0,02 0,04 0,02 0,02 0,02 0,21 0,01 0,01 0,00 0,01 MR8 0,08 0,04 0,02 0,04 0,02 0,03 0,05 -0,06 0,05 0,03 0,02 0,02 0,03 0,04 0,01 0,03 0,02 0,34 0,02 0,04 0,02 MR9 0,04 0,07 0,06 0,04 0,04 0,04 0,04 0,06 -0,09 0,05 0,02 0,01 0,01 0,01 0,01 0,09 0,02 0,01 0,18 0,02 0,02 MR10 0,04 0,06 0,06 0,04 0,05 0,05 0,04 0,05 0,09 -0,03 0,00 0,01 0,02 0,00 0,02 0,09 0,01 0,02 0,01 0,29 0,02 MR11 0,03 0,07 0,06 0,05 0,03 0,05 0,04 0,03 0,05 0,03 -0,04 0,01 0,03 0,02 0,01 0,02 0,02 0,02 0,04 0,02 0,29 M1 0,12 0,01 0,02 0,01 0,01 0,02 0,01 0,02 0,02 0,00 0,04 -0,10 0,06 0,04 0,05 0,04 0,05 0,05 0,08 0,04 0,11 M2 0,01 0,08 0,01 0,01 0,02 0,01 0,02 0,02 0,01 0,01 0,01 0,10 -0,05 0,06 0,15 0,02 0,04 0,05 0,06 0,03 0,07 M3 0,04 0,04 0,22 0,04 0,05 0,04 0,04 0,03 0,01 0,02 0,03 0,06 0,05 -0,07 0,05 0,04 0,06 0,05 0,04 0,04 0,04 M4 0,03 0,02 0,04 0,17 0,04 0,04 0,02 0,04 0,01 0,00 0,02 0,04 0,06 0,07 -0,07 0,07 0,05 0,04 0,08 0,04 0,04 M5 0,00 0,01 0,00 0,01 0,08 0,01 0,02 0,01 0,01 0,02 0,01 0,05 0,15 0,05 0,07 -0,04 0,07 0,06 0,07 0,04 0,04 M6 0,04 0,02 0,01 0,02 0,01 0,06 0,02 0,03 0,09 0,09 0,02 0,04 0,02 0,04 0,07 0,04 -0,08 0,04 0,06 0,10 0,05 M7 0,04 0,03 0,02 0,06 0,05 0,08 0,21 0,02 0,02 0,01 0,02 0,05 0,04 0,06 0,05 0,07 0,08 -0,03 0,04 0,04 0,01 M8 0,01 0,00 0,01 0,02 0,01 0,01 0,01 0,34 0,01 0,02 0,02 0,05 0,05 0,05 0,04 0,06 0,04 0,03 -0,05 0,07 0,09 M9 0,02 0,02 0,01 0,02 0,02 0,02 0,01 0,02 0,18 0,01 0,04 0,08 0,06 0,04 0,08 0,07 0,06 0,04 0,05 -0,05 0,07 M10 0,02 0,01 0,02 0,02 0,02 0,03 0,00 0,04 0,02 0,29 0,02 0,04 0,03 0,04 0,04 0,04 0,10 0,04 0,07 0,05 -0,04 M11 0,02 0,02 0,01 0,02 0,01 0,02 0,01 0,02 0,02 0,02 0,29 0,11 0,07 0,04 0,04 0,04 0,05 0,01 0,09 0,07 0,04 -Matrice of HWI for each dyad during the second week of age. MR: mothered lambs, M: mother. Same number between ewe and lambs identity correspond to mother-infant dyad. Cell coloured in dark grey represent significant preference association and cell coulored in light grey represent significant avoidance (p<0.05).

Preference and avoidance among female lambs in the mothered group

Taking in account all the individuals of the group, during the second week of age, all mothered lambs develop between 1 and 5 preferential associations (Figure 4a andb). MR 5 developed the more preferential associations. Only one lamb did not develop avoidance for peer (MR 9) and others showed between 1 and 4 avoidance relationships (MR 8).

During the third week, mothered lambs group showed 13 preferential association and 5 avoidance relationships. All lambs showed between 1 and 5 (MR 2) preferential associations.

7/11 lambs showed between 1 and 3 (MR 8) avoidances relationships. MR 9, 7, 6, 2 did not show avoidance relationship. On 13 preferential relationships 5 were maintained at 14 days of age. On 5 avoidance relationships any was maintained.

During the second week, when only lambs were considered in the mothrered lambs group, 6

/11 lambs developed preferential association with one or two peers and all lambs showed between one and four avoidance relationships with other peer.

During the third week, 9 /11 lambs developed between 1 and 2 preferences relationships. MR 7 and MR 3 did not show preferential relationships. 10 /11 lambs showed between 1 and 3 (MLR 8) avoidance relationship.

On 6 preferences only one have maintained between the two weeks of observation (MR 9-MR 10). 3 /6 of preferred individuals during the second week were then avoided at 14 days of age.

On 10 avoidance relationships 2 were maintained and 2 avoidances turned in preferential relationships between the two weeks of observation. Significant correlation was found between HWI of peer associations (Spearman correlation: r = 0.45, p< 0.05).

Correlation between mother and infant networks

No correlations were found between proximity between mother and proximity between their lambs during the first and the second week.

Preference and avoidance in peer-reared lamb group Peer-reared lambs were more often associated with each other than mothered lambs (mean of HWI ± SEM first week mothered lambs: 0.047 ± 0.003; peer-reared: 0.099 ± 0.0009 at 14 days: Mother-reared: 0.047 ± 0.003; peer-reared lambs: 0.099 ± 0.0003). However, they did not show any preference or avoidance for peers (Figure 4c andd).

Plasma CORT

Plasma CORT differed according to the days considered (Sum square: 6.08, F = 16.04, p<0.001) and there was an interaction between days and groups (Sum square: 0.87, F = 2.27, p<0.001). From 3 days to 10 days, plasma CORT did not differ between peer-reared and mothered lambs. Plasma CORT tended to be higher in peer-reared group at 14 days of age (t = 1.98, p= 0.06). However, plasma CORT in peer-reared lambs was lower than in MR lambs at 21 (t = 2.76, p = 0.01), 28 (t = 2.13, p = 0.04) and tended to remain lower at 35 days of age (t = 1.84, p = 0.08, Figure 5).

Discussion

Mothers and offspring associations

During the second week of age, all mothers preferred to be associated with their daugthers and lambs showed preferred association with their mother. For the major part of infant, the mother was the most associated individual and for all mother the infant was the most associated individual. This pattern was also observed in the major part of mother-lamb dyads during the third week of life. However, at this age, one lamb did not prefer to be associated with the mother and, for 3 ewes, their lamb was no more the most preferred individual. In accordance with our results, strong proximity between mother and infant, particularly the first weeks after birth, has been previously reported in sheep (Arnold, Wallace & Rea , 1981; Hinch et al., 1987;1990), bighorn sheep, (Shackleton & Haywood, 1985), mouflon (Guilhem et al., 2006;Le Pendu, et al., 1995) and other "follower" type species (Lent, 1974;Ralls, Lundrigan & Kranz, 1987; cattle herd, Bos indicus: Reinhardt & Reinhardt, 1981;bison: Green, Griswold & Rothstein, 1989). Decrease of associations in some dyad could result from increase of independence as observed in 2 weeks mouflon lambs (Guilhem et al., 2006). As expected, lambs avoided other familiar ewes for the two weeks of observation. This behavior could be linked to the selectivity of maternal behavior (Poindron, Lévy & Keller, 2007) and agonistic interactions when a familiar lamb was too close to familiar ewes that were not the mother. During the third week, only one ewe was observed to have preferential association with 2 unrelated familiar lambs suggesting lake of selective behavior of this maternal ewe.

According to the weak positive correlation of HWI of ewes-infants dyad between the two weeks of observation, if preference and avoidance for adult ewe were maintained, the intensity of preference and avoidance was more variable. The major part of adult ewes had in addition to preference for their daughter, preferential associations with other familiar ewes.

Few ewes showed avoidances for other familiar ewes, particularly during the third week. As reported in previous studies on free-ranging group of sheep, adult ewes did not show maintenance of the initial preferential associations formed the first week of observation (domestic sheep: Arnold, Wallace & Rea, 1981; mouflon: Le Pendu et al., 1995).

Role of the mothers' presence in the development of preference and avoidance among same age peer

In the peer-reared lambs group, all lambs were more associated between each other than mothered lambs between them, particularly during lying periods. However, as expected, any preference or avoidance has been recorded among peer-reared lambs. On the opposite, the majority of mothered lambs developed one or two preferences and avoidance relationships with other peers during the second and third week of life, in addition to their preferential relationship with the mother. As observed in mothers, preferences and avoidances among young peers were not maintained between the two weeks. On the opposite of what we expected, mother relationships with other familiar ewes did not influence preference and avoidance of respective offspring. It appears so that lambs did not use the proximity between mothers to develop preference and avoidance relationships for proximal peers, maybe due to the strong avoidance of familiar ewes. One feature of attachment is the use of this attachment figure as a secure base to explore (Ainsworth & Bell, 1970;Harlow & Zimmerman, 1959).

This feature has been shown in lambs in a previous study where the presence of the mother enhanced and structured exploratory behavior of the young (Gaudin et al., 2015). Lambs may use the mother as a secure base, taking some distance for a short time from the mother and other familiar ewes to interact with peers before restoring the proximity with the mother. This could permit lambs to interact sequentially with some other peers and explain why mother's relationships were not the mirror of those of its offspring, as described in primates (Berman, 1982). Our results suggest that the mother's presence during the first weeks have an organizational effect on the development of preference and avoidance among same age peers.

Absence of mothers in peer-reared lambs also leads to alteration of basal CORT level with lower CORT level at 21, 28 and 35 days of age than mothered lambs. This alteration was sometimes reported in peer-reared infant monkeys (Champoux et al., 1989;Higley, Suomi & Linnoila, 1992) and describe in individuals enduring early stress or early adverse care (Sànchez, 2006;Veenema, 2009). This suggests potential stressful context in absence of mother figure and normal development of social relationships.

Conclusion

This study confirms that the presence of adult maternal mothers was needed to female lambs for they develop preferential associations with same age peers. However, the infants' preferences were not influenced by the association and avoidances between mothers. Lamb seemed rather take some distance with the mother to interact with peer before returning near the mother. During the second and third weeks of life, lambs were paired sequentially with different peers and not showed stable preference for peers. As expected, peer-reared lambs did not formed preference and avoidance for other lambs and showed decrease of basal plasma CORT level. This alteration could reflect stressful context without maternal figure and physiological adaptation of the HPA axis.

Etude 4 : Qualité du lien développé pour des substituts maternels, activité de l'axe HPA et du système ocytocinergique (Manuscrit soumis le 5 octobre à Developemental Psychobiology)

Article 3: All bonds are not alike: a psychoendocrine evaluation of infant attachment Sabrina Gaudin 1, 2, 3, 4* , Elodie Chaillou 1, 2, 3, 4 , Marie-Anne Wycke 1, 2, 3, , Fabien Cornilleau 1, 2, 3, 4 , Chantal Moussu 1, 2, 3, 4 , Ludovic Calandreau 1, 2, 3, 4 , Raymond Nowak

Introduction

In many mammalian species displaying a long period of parental care, infants develop a primary attachment bond with a selective figure, generally the mother which is the main caregiver, source of nurturance and protection. Attachment is not expressed at birth but rather develops over time through the specific care provided by the mother. In a first phase, immediately after birth, the neonate is attracted by salient maternal cues regardless of the identity of the individual (e.g. odor of milk in humans: Porter & Winberg, 1999; warmth in rats: [START_REF] Kojima | Warmth from skin-to-skin contact with mother is essential for the acquisition of filial huddling preference in preweanling rats[END_REF][START_REF] Sokoloff | Thermoregulatory behavior in infant Norway rats ( Rattus norvegicus) and Syrian golden hamsters ( Mesocricetus auratus): Arousal, orientation, and locomotion[END_REF]visual forms and colors in guinea pigs and lambs: Shipley, 1961;Sluckin, 1968;[START_REF] Vince | Interactions between normal ewes and newly born lambs deprived of visual , olfactory and tactile sensory information[END_REF] tactile cues in rhesus monkeys: Harlow, 1959). In a second phase, the close proximity between mother and young due to mutual attraction helps the infant learn progressively the mother's own characteristics and respond more specifically to her rather than to another individual (sheep: Nowak, 1990;Nowak, Poindron, Le Neindre & Putu, 1987;squirrel monkeys: Kaplan, Cubicciotti and Redican, 1977;human infant: Bowbly, 1969). In a third phase, the infant uses the mother as a secure base to move away (human infants: Bowlby, 1969;sheep: Cairns, 1966a;Gaudin, Chaillou, Cornilleau, Moussu, Boivin & Nowak, 2015; rhesus monkey: Hinde & Spencer-Booth, 1967). This secure base incites the infant to take some distance with the mother to explore, learn features of their environment, interact with conspecifics, and to retreat and gain comfort through proximity with her in case of danger.

According to Mary Ainsworth (1989), "the experience of security and comfort obtain from the relationship with the partner, and the ability to move off the secure base provide by the partner, with confidence to engage in other activities", such as exploration and play, differentiate attachment bond from other affectional bonds that may develop with other individuals like siblings (Ainsworth & Bell, 1970;Ainsworth, Bell & Stayton, 1971;Ainsworth, Blehar, Waters & Wall, 1978). Attachment is therefore defined by the expression of three key features: 1) proximity seeking with a specific figure, especially when the environment is perceived as stressful; 2) selective distress and appeasement during a separation and reunion with the figure; 3) secure base effect that enhances exploratory behavior in the infant when in the presence of the figure (Ainsworth, 1989;Ainsworth & Bell, 1970;Ainsworth, Bell & Stayton, 1971;Ainsworth, Blehar, Waters & Wall, 1978;Hinde 1982;Holmes, 1993;Weiss, 1982).

In non-human primates and sheep, several studies suggested that maternally deprived infant could form attachment bonds with unanimated surrogates, same-age peers or individuals from another species (monkeys: Chamove, Rosenblum & Harlow, 1973;Boccia, Reite, Kraemingk, Held & Laudenslager, 1989;Harlow & Zimmerman, 1959;Harlow, 1959;Hennessy, Kaplan, Mendoza, Lowe & Seymour, 1979;Higley, Hopkins, Thompson & Byrne, 1992;Mason & Capitanio, 1988;Meyer, Novak, Bowman, Harlow, 1975;sheep: Cairns, 1966asheep: Cairns, , 1966b;;Cairns & Johnson, 1965). However, the strength of the bond differs according to the characteristics of the surrogate replacing the mother. Thus, Mason and Kenney (1974) showed in rhesus monkeys that a dog was a more relevant attachment figure than a peer or an object. In sheep, Cairns & Johnson (1965) suggested that maternally deprived lambs became attached to an object but to a lesser extent than those reared with an adult ewe or a dog. In non-human primates, several studies revealed alterations in proximity seeking with the attachment figure in peer-reared compared to mothered infants, as well as in their psychoendocrine responses to separation (Boccia et al. 1989, Hennessy & Kaplan, 1982;Rommeck, Capitanio, Strand & McCowan, 2011;Shannon, Champoux & Suomi, 1998;Clarke, 1993, Clarkes & Snipes, 1998sheep: Viérin & Bouissou, 2003;rhesus monkey: Suomi, 1997). Similar results were reported in object-reared monkeys (Hennessy et al, 1979).

These observations led some authors to question whether or not attachment should apply to all bonds as they seem to differ in their secure quality (Suomi, 1997), strength (Meyer et al., 1975) and perhaps in their nature (Hennessy, et al., 1979;Boccia et al., 1989, Reite et al., 1978). It must be pointed out that while these studies made a wide use of the concept of attachment, they are incomplete since the three main features given above have never been investigated thoroughly and the selectivity of attachment exceptionally assessed. Thus, despite years of research, there is so still a need to clarify whether or not the concept of attachment can apply for a non-maternal figure.

One hiccup concerning the use of primates in studies on attachment is that separation from the mother does not necessarily take place at birth and should this happen, due to their immature state at birth, infants are first hand-fed by humans and mostly reared in a nursery in various conditions, depending on studies (Chamove, Rosenblum & Harlow, 1973;Boccia, et al., 1989;Harlow & Zimmerman, 1959;Harlow, 1959;Hennessy et al.,1979;Higley et al., 1992;Mason & Capitanio, 1988;Meyer et al., 1975). The delay between birth and pairing with a specific figure can reach 57 days (Higley et al., 1992). This period during which bonds can be formed and broken, could be the source of discrepancies between studies. To characterize the strength of the bond for non-maternal figures like peers or an unanimated objects and its psychoendocrine correlates, an alternative experimental model is the sheep where the development and expression of attachment for the mother is well documented (Gaudin et al., 2015;Nowak, Keller & Lévy, 2011;Nowak & Boivin, 2015). In contrast to primates, lambs are born precocial, are physiologically mature to thermoregulate, and can easily be reared under artificial conditions without the mother with minimal human intervention. As such, they are a more suitable experimental model than primates for the study of attachment to animated or unanimated figures. The first objective of the present study was to investigate scrupulously the existence of attachment in lambs reared in various post-natal situations: with their mother, a peer, or an unanimated object. We referred to the attachment theory developed by Bowlby and Ainsworth (Ainsworth & Bell, 1970;Ainsworth, 1989;Ainsworth et al., 1971;Ainsworth et al., 1978;Bowlby, 1969) since it has the advantage of providing clear measurable criteria. Because examination of these criteria in lambs demonstrated that daughters express stronger attachment behaviors with the mother than sons (Gaudin et al, 2015), we focused our work on female lambs only. Attachment was investigated in two distinct situations. One assessed behavioral and endocrine distress responses and appeasement through separation from and reunion with the familiar figure in the home pen at 5 day of age, when attachment is being formed, and at 21 days once attachment is clearly established. Distress responses were recorded during separation and affiliative behaviors during reunion. At the same time, blood samples were taken to investigate endocrine responses. Cortisol (CORT) was selected because it reveals the stress response following separation (Hennessy, 1986;Coe, Mendoza, Smotherman & Levine, 1978). Oxytocin (OT) was chosen because it plays a crucial role in the formation of social bonds, in appeasement during stressful events, and favors the expression of affiliative behaviors (for reviews: Ross & Young, 2009;Heinrichs, Von Dawan & Domes, 2009).

Should an affectional bond establish with a specific figure, separation would result in increased vocal distress during separation and a release of CORT as reported in mothered infants (squirrel monkeys: Levine, Coe & Smotherman, 1978;Coe, Mendoza, Smotherman & Levine, 1978;Levine, Coe & Smotherman, 1978;Stanton & Levine, 1985, 1990;Titi monkey: Hoffman, Mendoza, Hennessy & Masson, 1995). By contrast reunion with the figure would result in minimal vocal distress and proximity seeking, and could be associated with an increase of OT secretion during social contact (rodent: Uvnäs-Moberg 1998) or vocal interaction (human: Seltzer, Ziegler, & Pollak, 2010). The second situation investigated attachment with the use of the Strange Situation. This paradigm was developed in children by

Ainsworth and her colleagues (Ainsworth & Bell, 1970;Ainsworth et al., 1978;Ainsworth et al., 1971) to assess the selectivity and quality of the three attachment features through multiple episodes of separation and reunion with the mother and an unfamiliar woman in a novel room, making the situation slightly stressful. In most cases infants express attachment in its secure form with immediate distress following separation from the mother combined with an inhibition of exploration, and proximity seeking, appeasement as well as rapid return to exploration upon reunion. The separation and reunion with the unfamiliar woman does not influence distress and appeasement of securely attached infant. However some insecure pattern can be detected which includes higher or lower distress during separation, persistence of distress responses during reunion or weaker proximity seeking during reunion. We adapted the Strange Situation to mothered, peer-and object-reared lambs based on behavioral tests performed in previous studies (Boivin, Nowak, Desprès, Tournade & Le Neindre, 1997;Gaudin et al., 2015). We expected that attachment would be revealed by selective distress during separation, selective proximity seeking and enhancement of exploration when the figure is present.

The second aim of the study was to evaluate the strength of the affectional bonds using an evaluation of the rewarding aspect of the different figures. The conditioned place preference is a behavioral test used in rodents to measure the rewarding effect of a stimulus of interest (for review: Bardo & Bevin, 2000). Classically, this protocol consists in submitting the animal to two distinct environmental contexts varying in visual, tactile, or olfactory cues, the stimulus of interest (drug, food, copulation) being paired with one of the two environments. After several pairing sessions, the animal has unlimited access to both contexts in the absence of the stimulus of interest. Should it have rewarding properties, the learned association results in the tested animal showing a preference for the context that had been paired with the stimulus of interest. It has been shown in adolescent rats that conditioned place preference is induced with a social stimulus as a reward (Douglas, Varlinskaya & Spear, 2004;Peartree, Hood, Thiel, Sanabria, Pentkowski, Chandler & Neisewander, 2012).

Estimation of the rewarding aspects of each specific figure lambs were reared with was performed through a conditioned place preference -like paradigm, contrasting a contextual environment associating visual cues with home-pen features, and another context associating different visual cues with the mother, the peer or the object. We hypothesized that should the familiar figure be more rewarding than home-pen features, lambs would show persistence of preference for the context paired with the presence of the figure. The time necessary to extinguish the preference would reveal differences in rewarding properties between different figures, and the strength of the bond with them.

MATERIAL AND METHODS

Subjects and housing

A group of 26 post-parturient Ile-de-France ewes was selected from a flock lambing in an indoor facility at the INRA research center (UEPAO n°1297, EU0028, INRA Centre Val de Loire). The choice of the ewes was based on the sex and birth weight of their litter so that only female lambs (N = 43) weighing at least 2.5 kg were included in the study. This minimum birth weight was required to ensure successful adaptation to our experimental conditions. Immediately after birth, lambs were ear-tagged, weighted and allocated into 3 groups: 11 lambs were left with their dam (mothered group) and 32 lambs separated from their mother of which 11 were reared with an unfamiliar same age peer (peer-reared group, total: 22 animals) and 10 with a 50-cm-diameter ball (object-reared group). The choice for such a ball was based on the work by Cairns (1966a;[START_REF] Cairns | Development, maintenance, and extinction of social attachment behavior in sheep[END_REF] who showed that lambs formed a bond for an unanimated object that had an intermediate size between a lamb and a ewe.

Subjects were transported to an experimental building located 300 m away to avoid any interference with the animals in the lambing barn. Lambs were randomly allocated to adjacent straw bedded pens (1 m X 2 m) with their specific figure, mother, peer or ball. These pens were made of 1.5 m-high opaque panels to avoid any visual and direct contact between animals from different pairs. Peer-and object-reared lambs were bottle-fed twice with 200 ml of bovine colostrum on their first day of life to ensure passive immunological protection. On the second day, they were trained to suckle a rubber teat fixed on the gate of the pen and connected to an automatic feeder (Eurolouve, Alliance pastorale) providing milk ad libidum at constant concentration (200 g/l) and temperature (43 °C). Lambs were trained 3 to 4 times per day by human caregivers until full independence which occurred mostly within 3 or 4 days.

To standardize human presence in all groups, caregivers visited the lambs reared with their mother and handled them in the same manner. Heating lamps were added to home pens of artificial reared lambs and were turned off pass the first two weeks. Mothers were fed once a day with a mixture of barley grains and concentrates suited for lactating ewes, as well as fresh hay. They had ad libitum access to water, and straw was provided daily to all the animals to keep the litter clean. Lambs were reared in their specific conditions for the whole duration of the experiment.

Separation-reunion in the home pen

Procedure and blood samples

Lambs were submitted to separation-reunion protocols at 5 and 21 days of age. In each case, they were temporarily prevented from feeding because it has been shown that OT is released in the blood after milk ingestion and high levels are still detected 15 minutes later (rat pup: Finally, lambs were reunited with their familiar figure and a third blood sample was taken to assess if OT was released following 1 min of contact seeking and interactions (Figure 1).

CORT was also assayed at this point but it was expected that the levels would still reflect the stress response of separation rather than appeasement resulting from reunion. Blood samples, approximately 5 ml, were collected from the jugular vein by venipuncture with heparin vacutainers by experienced and competent staff within 2 min of the start of the sampling procedure. Samples were immediately cooled in ice until being centrifuged for 15 minutes at 4 °C and 3600 g. The resultant plasma was separated and stored at -20°C until assayed. analyzed during the last 3 minutes before separation and the first minute following reunion in order to evaluate differences between groups in social proximity. One minute of observation after reunion was found sufficient since as described in children, after a stressful period of separation with the mother secure attachment is characterized by rapid contact seeking behavior which triggers immediate appeasement (Ainsworth & Bell, 1970;Ainsworth et al., 1978). Social isolation leads to increased emission of high-pitched bleats in lambs (Moberg, Anderson, Underwood, 1980;Moberg & Wood, 1981;Porter, Nowak, Orgeur, 1995). Distress (Szeto, McCabe, Nation, Tabak, Rossetti, McCullough, Schneiderman, Mendez, 2011) involving sample extraction. The cross-reactivity was 100% for OT and less than 0.02% for vasopressin, growth hormone and thyrotropin-releasinghormone. The detection limit was 11.7 pg/ml. Based on a sample at 40 pg/ml included in each assay, inter-assay coefficient of variation was 13.1% and intra-assay coefficients of variation was 5.0%. The radioimmunoassay method to measure plasma CORT was used as described by Orgeur (Orgeur, Mavric, Yvore, Bernard, Nowak, Schaal & Lévy, 1998). Intra-assay coefficient of variation for the CORT dosage was 7.9%.

Strange Situation test

This procedure was inspired from the Strange Situation designed by Ainsworth and colleagues (Ainsworth & Bell, 1970;Ainsworth et al., 1971). However unlike in the initial design where the mother and the unfamiliar woman leave and enter the room in a fixed sequence, we chose to randomize the order of separation with the familiar and the unfamiliar figure, as an effect order had been pointed out (Palmer & Custance, 2008;Prato-Previde, Custance, Spiezio & Sabatini, 2003). The procedure took place in a corridor made of metal hurdles (2 m X 6 m) two days after the separation-reunion protocols performed in the familiar pen. This corridor contained a holding pen at each end with a 120 cm-wide area considered to be a contact zone (Figure 2). In a first phase (habituation), an unfamiliar figure belonging to the same category as the one experimental subjects were reared with (ewe for mother group, lamb for peer group, plastic cube for object group) was put in one of the two holding pens at the extremity of the corridor. For object-reared lambs, a plastic cube (56 cm X 45 cm X 36 cm) rather than another ball was used as an unfamiliar object to ensure that the two figures were as easily discriminated as in the two other groups. Then, lambs with their familiar figure were conducted together near the arena, the figure was put into the free holding pen whereas the lamb was introduced in the middle of the corridor. During the habituation phase, the lamb was left with the familiar and unfamiliar figures for 5 minutes. Then, one of the two figures was removed from the holding pen for 3 minutes and brought back for 3 other minutes (first separation-reunion phase). After this, the other stimulus was removed for 3 minutes and brought back in the same manner for 3 minutes (second separation-reunion phase). All the tests were video-taped and for each phase we counted the number of high-pitched bleats emitted by the tested lamb, the number of olfactory explorations of the environment (nosing the floor or the side of the arena) during reunion and separation and the time spent in contact zones during reunion.

Subjects and apparatus

Due to the length of the sessions, not all the lambs could be tested on a same day. Therefore, we selected randomly 22 individuals to be tested when 4-5 weeks old: eight mothered, seven peer-reared and seven object-reared lambs. The testing arena was hexagonal and consisted of two symmetric areas made of 1 m-high metal hurdles. The two areas were separated by a removal partition which restricted access to only one side of the arena whenever necessary. Specific visual cues were put around the two areas: six red and white road cones on one side (red and white cues) and six identical road cones covered with blue linoleum (blue cues) on the other one. On each side, a 1 m x 2 m holding pen was built (Figures 3a and3b ) and made of 2 symmetrical areas (1 and 2). The two sides were surrounded by distinctive sets of visual cues: red and white road cones ( ) and road cones covered with blue linoleum ( ). Each side contained a holding pen (

) and a fence physically separated the two symmetrical areas ( ) during the conditioning procedure. For the test and extinction sessions, this fence was removed and the holding pens were empty. Lambs were introduced in the arena through the middle-gate (

). b) Conditioned place preference protocol illustrated by peer-reared lambs: Day 1: during habituation lambs could explore the testing area with their familiar figure. Day 2 and 3: a fence separated the two symmetrical areas and one side was conditioned with the presence of the familiar lamb [START_REF]un premier temps nous avons utilisé l'OVTA-I 125 pour mettre en évidence la présence éventuelle d'OTRs chez l'agneau au niveau de l'amygdale centrale et du subiculum, connus pour être spécifiquement marqués chez la majorité des espèces étudiées et présentant de l'ARNm de l'OTR chez la brebis[END_REF] and the other side with home-like pen features [START_REF] Guldenaar | Un échantillon de cerveaux de rat contenant le VMH et l'amygdale centrale est utilisé comme contrôle. Matériels et méthode partie 1 Animaux et collecte des échantillons Deux rats adultes, 1 brebis adulte et 6 agneaux âgés de 6 mois provenant de la plateforme d'élevage de l'INRA val de Loire[END_REF]. Day 4, 5 and 6: during the test and extinction sessions the middle fence, familiar figure and home-like pen were removed, and the time spent by the lamb in the two sides was recorded.

Habituation phase

On day 1, lambs were habituated individually to the testing arena. Each lamb and its familiar figure were led to the conditioning room, introduced into the apparatus through a gate and left free to explore the entire arena for 10 minutes including the holding pens (Figure 3b). To favor exploration of the whole arena by lambs reared with an object, the ball was put for 5 minutes on one side, then on the other side for another 5 min. The habituation procedure was repeated on a same day in the morning and in the afternoon. The time spent in the two sides was averaged across the two sessions to evaluate spontaneous place preference.

Conditioning phase

On day 2, the arena was divided by an opaque fence. As no spontaneous side preference was detected during habituation, lambs were randomly assigned to one of the two sides so that for half of them the familiar figure was associated with contextual blue cues and the home penlike environment with contextual red and white cues. For the other half, conditions were reversed. Conditioning consisted in eight 5-minute sessions over two consecutive days, four times with the familiar figure and four times with home pen-like features. In the morning, lambs were confined in the side displaying the home pen-like environment, and immediately after in the other side with the familiar figure restrained in the holding pen (Figure 3b). This procedure was repeated in the afternoon in reversed order and followed the same pattern on day 3.

Preferences test and extinction

On day 4, the preference induced by the pairing sessions was tested. In the morning, the middle opaque fence was removed, both holding pens were cleaned and left accessible to the tested lamb by leaving the gate open. The two symmetric areas could therefore be explored, with the contextual visual cues around, but were neither reinforced by the presence of the familiar figure nor by the home pen-like environment (Figure 3b). A lamb was led to the testing arena, introduced in the middle of it through a gate, and left free to wander in both areas for 3 minutes. To assess the preference for one side, the time spent in each area was recorded. Immediately after the end of the test, the lamb was taken back to its home pen and reunited with its familiar figure. The same procedure was repeated on days 5 and 6, with two testing sessions per day, in order to evaluate the time required for the preference induced by the stimuli of interest to extinct. The "strength" of the rewarding properties of these two stimuli was reflected by the side preference and the persistence of this preference in the arena when the two stimuli were removed. Subjects were considered to display a preference when they spent significantly more than half of the time in a specific side.

Statistical analysis

Behavioral and physiological measures during separation-reunion tests in the home pen

Linear mixed models (LMER) were used to analyze the physiological responses and the behaviors recorded during separation-reunion tests at 5 and 21 days. We analyzed contact seeking performed before separation (passive or active contact, sniffing), distress responses during isolation and appeasement during reunion (number of high-pitched bleats), and OT and CORT plasma concentrations all along the procedure according to two fixed effects: the age of lamb (5 or 21 days) and the group (mothered, peer and object) taking into account the identity (ID) of the lamb as random effect. OT and CORT concentrations were Log transformed to follow normal distribution.

Behavioral measures during the Strange Situation

The number of high-pitched bleats, the number of olfactory explorations and the time spent in contact zones did not differ between the two phases of reunion. Consequently data collected during these two phases were pooled in order to reduce multi-comparisons. Two types of comparisons were performed. First, the number of vocalizations and olfactory explorations were analyzed using LMER models with phase (reunions, separation from the unfamiliar and separation from the familiar) and groups as fixed effects, and lamb ID as random effect.

Second, the times spent in the familiar and unfamiliar zones were compared with LMER models with category of the figure (familiar-unfamiliar) and groups as fixed effects and ID lambs as random effect.

Multi-comparisons

Following LMER models, multi comparisons between groups or phases were conducted when a factor was found significant (p≤0.05) or tended to be significant (0.05<p<0.1). For dependent samples, t-tests for paired samples with the function "pairwise t-test" with Holm correction were used. Multi-comparison for independent samples was conducted using t-tests for independent samples and false discovery rate correction (Benjamini, Drai, Elmer, Kafkafi & Golani, 2001).

Conditioned Places Preferences-Like test

LMER model tested the proportion of time spent in the area associated with the familiar figure according to the session (test, extinction 1, 2, 3 and 4), the group (fixed effect), and lambs ID (random effect). Comparisons between the three curves were performed with Tukey correction. To assess the preference for one side, the proportion of time spent in the area conditioned by the familiar figure was compared to random.

Softwares

LMER models and multi-comparisons were conducted using "R 3.1.2". LMER models were performed with the package "lme4". Comparison with random were performed on Statistica 8.0 (Statsoft).

ETHICAL NOTE

Animal welfare requirements were fully respected in accordance with the European Community Council Directive 2010/63/UE. The experimental facilities were approved by the local bureau of veterinary services (Indre-et-Loire, France, authorization N°: E 37-175-2), all behavioral tests performed in this work were approved by the Val de Loire Ethic Committee (authorization N°2012-08-11), and the personnel involved had special training in animal care, handling and experimentation required by the French Ministry of Research. Rearing lambs without mothers is widespread in sheep breeding but necessitates special care. All the lambs were carefully followed to make sure that they adapted successfully to the automatic feeder.

At the end of the tests, animals of all the groups returned to the breeding research station (UEPAO n°1297, EU0028, INRA Centre Val de Loire) and were reared with peers of the same conditions (either mothered or artificially-reared).

RESULTS

Behavioral measures during the Separation-Reunion tests in the home pen

Proximity seeking before separation

Passive contact differed significantly between groups and according to age (Table 1). At 5 days of age, peer-reared animals spent more time side by side with their familiar figure than mothered (t = 2.38, p = 0.04) and object-reared lambs (t = 2.64, p = 0.03). At 21 days, mothered and peer-reared lambs were less in contact with their figure (mothered: t = 2.63, p = 0.02; peer: t = 3.87, p = 0.003) whereas no change was observed in the object-reared group (Figure 4a). All lambs performed various forms of active contact. In mothered lambs it was mainly expressed as head contact with the body of the ewe followed by rapid pushes on the udder with the muzzle. Peer-reared lambs searched active contact with the familiar congener through nosing of different parts of its body and also rapid pushes with the head, similar to those observed in mothered lambs when they attempted to suckle, but orientated toward their partner's muzzle or under its belly. In object-reared lambs, active contact consisted of nosing and climbing with the forelegs on the ball. Before separation, active contact seeking was significantly influenced by age of testing but not treatment (Table 1). Active contact with the figure decreased between 5 and 21 days of age (Figure 4b). Lambs spent little time sniffing the familiar figure and no significant difference was found between groups and across age before separation (Figure 4c).

Distress during separation

The number of high-pitched bleats varied between phases, groups and the two age classes and most interactions were found significant (Table 1). Before separation, at 5 and 21 days, lambs of all the groups were mostly silent and there was no significant difference between groups or age classes in the number of high-pitched bleats emitted. At 5 days, the number of vocalizations increased sharply following separation in all the groups (mother: t = 6.43, p<0.0001; peer: t =2.85, p = 0.01; object: t = 3.39, p = 0.007; Figure 5). However, the increase was much higher in mothered lambs than in the other groups (mother vs; peer: t = 4.39, p<0.0001; mother vs. object: t = 3.39, p = 0.007). At 21 days, the number of bleats increased only in mothered (t = 12.02, p<0.0001) and peer-reared lambs (t = 4.55, p = 0.001; Figure 5). Again, mothered lambs bleated always more than peer (t = 3.28, p = 0.0007) and object-reared lambs (t = 10.48, p<0.0001), but peer-reared lambs were also more vocal than object-reared lambs (t = 3.89, p = 0.0009). Only peer-reared lambs increased bleating rate between 5 and 21 days (t = 3.27, p = 0.008).

Appeasement and proximity seeking during reunion

Lambs vocalized very little in the minute following reunion with their familiar figure and no significant effects of group or age were found (mean number of vocalizations ± SEM; 5 days: mothered: 0.27 ± 0.19 s; peer-reared: 0.18 ± 0.12; object-reared: 0.9 ± 0.4; 21 days: mothered: 0.27±0.19; peer-reared: 0.18 ± 0.18; object-reared: 0.47 ± 0.15). Passive contact differed significantly between groups (Table 1). At 5 days of age, mothered lambs spent more time in passive contact with their mother than peer-reared lambs with their peer figure (t = 2.93, p = 0.04; Figure 6a). Active contact on the other hand differed significantly between age classes and tended also to differ between groups (Table 1). In mothered lambs, active contact increased between 5 and 21 days (t = 2.38, p = 0.03) in contrast to peer-reared and objectreared lambs. At 21 days, mothered lambs tended to perform more active contact than peer-(t = 1.67, p = 0.09) and object-reared lambs (t = 1.77, p = 0.09, Figure 6b). Finally, the time spent sniffing the familiar figure differed significantly between groups (Table 1). Peer-reared lambs performed more sniffing behavior than mothered (t = 3.17, p = 0.0008) and objectreared lamb (t = 3.17, p = 0.001). This difference was maintained at 21 days of age (peer vs; mother: t = 5.13, p<0.0001; peer vs. object: t = 4.23, p<0.0001; Figure 6c). Physiological measures during the Separation-Reunion tests in the home pen Plasma CORT levels varied significantly across phases and ages but not between groups (Table 1). In mothered lambs, while levels did not vary significantly at 5 days along the different phases of the test, at 21 days on the other hand, they were higher after 15 minutes of separation than before (t = 2.85, p = 0.03). Plasma CORT tended to be higher 1 minute after reunion (following 30 minutes of separation) than after 15 minutes of separation (t = 2.11, p = 0.06) and was higher after reunion than before separation (t = 3.43, p = 0.01). It was also found that basal plasma CORT (before separation) decreased with age in mothered lambs (t = 3.00, p = 0.01). In peer-reared lambs, CORT levels on day 5 tended to be higher 1 minute after reunion than before (t = 2.67, p = 0.06) and during separation (t = 2.33, p = 0.07). At 21 days, peer-reared lambs showed the same pattern, CORT levels being significantly higher 1 minute after reunion than before separation (t = 2.61, p = 0.05) and after separation (t = 3.01, p = 0.03). No significant difference was detected between 5 and 21 days in this group. No significant differences in plasma CORT levels were obtained in object-reared lambs (Figure 7a).

For OT a significant main effect of age was found as well as a significant day by group interaction (Table 1). Unlike for CORT, OT levels were not significantly influenced by phase of test. At 5 days, peer-reared and object-reared lambs had higher plasma OT levels than mothered lambs before separation (mother vs. peer: t = 6.40, p = 0.0006; mother vs. object: t = 3.62, p = 0.0006), after 15 minutes of separation (mother vs. peer: t = 3.84, p = 0.02; mother vs. object: t = 2.49, p = 0.02) and 1 minute after reunion with the familiar figure (mother vs. peer: t = 3.47, p = 0.07; mother vs. object: t = 2.11, p = 0.03). These differences were not maintained at 21 days. Basal OT levels increased with age in mothered lambs (before separation: day 5 vs. day 21: t = 3.99, p = 0.003) whereas they tended to decrease in peerreared lambs (before separation: day 5 vs. day 21: t = 1.89, p = 0.09; Figure 7b).

Behavioral measures during the Strange Situation

Vocal activity

The number of high-pitched bleats varied significantly across phases and there was a significant interaction between phase and group (Table 1). Globally, the number of highpitched bleats increased in all the groups when the familiar figure was withdrawn: mothered lambs emitted more high-pitched bleats in the sole presence of the unfamiliar ewe than in the presence of both ewes (t = 4.61, p = 0.002) or only their mother (t = 5.37, p = 0.0009; Figure 8a). In addition, mothered lambs vocalized more in the presence of both ewes than with their mother (t = 3.85, p = 0.003). Peer-reared and object-reared lambs emitted also more highpitched bleats in the presence of the unfamiliar figure than when both (peer: t = 4.43, p = 0.003; object: t = 2.42, p = 0.05) or only the familiar figure were present (peer: t = 2.90, p = 0.03; object: t = 2.94, p = 0.02). The vocal activity did not differ significantly between the 3 groups (Figure 8a).

Exploratory activity

Olfactory exploration varied significantly across phases and tended to vary between groups (Table 1). Mothered lambs explored more frequently their environment when their mother was present whether she was on her own (familiar vs. unfamiliar only: t = 5.24, p = 0.001) or in the presence of another ewe (familiar and unfamiliar vs. unfamiliar only: t = 4.24, p = 0.003, Figure 8b). A similar phenomenon was observed in object-reared lambs. They displayed more exploration in the sole presence of their familiar object than in the presence of the unfamiliar object only (t = 4.02, p = 0.009) or both objects (t = 3.67, p = 0.01). They also tended to explore more in the presence of both objects than in the sole presence of the unfamiliar object (t = 1.83, p = 0.09). By contrast, peer-reared lambs did not show any significant variation in the number of olfactory explorations across phases. Between group comparisons revealed that when tested with the unfamiliar figure only, peer-reared lambs explored more the arena than mothered (t = 2.30, p = 0.05) and object-reared lambs reared (t = 2.23, p = 0.05, Figure 8b).

Time in the contact zones

A significant effect of familiarity but not of group was found for the time spent in the contact zones when both familiar and unfamiliar figures were present (Table 1). Lambs of all the groups spent more time near their familiar than near the unfamiliar figure (mother: t = 7.26, p<0.001; peer: t = 2.77, p = 0.01; object: t = 2.67, p = 0.02, Figure 8c). No significant effect of group was detected nonetheless mothered lambs spent only split seconds near the unfamiliar ewe.

Conditioned-Places-Preferences-Like test

The time spent in the area conditioned by the familiar figure varied according to the session and the group considered (Table 1). The comparison of the 3 extinction curves showed that mothered and peer-reared lambs spent more time in the area conditioned by the familiar figure than object-reared lambs (mother-object: z = 2.68, p = 0.01; peer-object: z = 3.12, p = 0.005) with no significant difference between mothered and peer-reared lambs. During the test and the first session of extinction, mothered and peer-reared lambs preferred the side conditioned by the mother or the peer (test: peer: t = 2.39, dl = 7, p = 0.04; mother: t = 2.59, dl = 6, p = 0.04; first extinction: peer: t = 4.55, dl = 7, p = 0.002; mother: t = 2.40, dl = 6, p = 0.05). In contrast, object-reared lambs did not display any preference for a specific side. From the second to the fourth extinction session, mothered and peer-reared lambs did no longer express ) and object-reared lambs in light grey ( ). Different letters: Statistical differences between groups (p<0.05). *: Statistical difference from random (p≤0.05).

DISCUSSION

Mothered lambs

In the home pen, lambs were quiet, spent a bit of time lying next to their mother or exploring her body. This activity declined between 5 and 21 days reflecting a lesser need to keep close contact with the mother and a more autonomous behavior (Napolitano, Annicchiarico, Caroprese, De Rosa, Taibi & Sevi, 2003). Nonetheless at both ages, immediately after separation, lambs exhibited a very high vocalization rate, sign of agitation and distress. After reunion at 21 days, they searched active contact with their mother exploring her belly and udder region whereas at 5 days they expressed more proximity seeking through passive contact. Even if at 5 days separation resulted in behavioral distress, CORT did not increase. By contrast at 21 days of age, behavioral distress was associated with increase in CORT levels 15 minutes after separation and 1 minute after reunion, which at this stage most likely reflects the effect of the 30-minutes-long separation. Similar phenomena was described after separation from the mother in non-human primates (squirrel monkeys: Levine, Coe & Smotherman, 1978;Coe et al., 1978;Levine, Coe & Smotherman, 1978;Stanton & Levine, 1985, 1990;titi monkey: Hoffman et al., 1995). In lambs, but also in other mammals like piglets and marmosets (Gallagher, Giles & Wynn, 2002;Pryce, Palm & Feldon, 2002), maturation of the HPA axis occurs during the first week of life and is characterized by high levels of CORT (Kent, Molony & Robertson, 1993;[START_REF] Moberg | Ontogeny of the adrenal and behavioral responses of lambs to emotional stress[END_REF].

In some species, early development of the HPA axis includes a stress hyporesponsive period during which some stressors, such as temporary separation, do not result in an increase of CORT despite behavioral distress (rat: Sapolsky & Meaney, 1986;Schapiro, Geller & Eiduson, 1962, children: Gunnar & Quevedo, 2007). Some authors suggest that the stress hyporesponsive period mitigates the negative effects of CORT during the critical infantile stage of brain development (De Kloet, Rosenfeld, Van Eekelen, Sutanto & Levine, 1988). A few studies in neonatal lambs reported however that CORT is secreted in mothered lambs in response to severe stressors like tail docking, castration, restraint, isolation in a novel room, or ACTH injection (Kent, Molony & Robertson, 1993;[START_REF] Moberg | Ontogeny of the adrenal and behavioral responses of lambs to emotional stress[END_REF].

Our results suggest possible limited secretion of CORT in neonates during less stressful situations like short separation with the mother in the familiar environment. Surprisingly, plasma OT in lambs did not vary across separation and reunion at 5 and 21 days of age. We were expecting a plasma release of OT after reunion since positive social interactions activate the oxytocinergic system like grooming in rats (Stock & Uvnäs-Moberg, 1988;Uvnäs-Moberg, 1998), positive tactile contact between parents and infants [START_REF] Gordon | Oxytocin and the Development of Parenting in Humans[END_REF] or vocal communication with mothers after a stressful event in girls (Seltzer, Ziegler, & Pollak, 2010). Obviously OT responses at plasma levels are not systematic and may not necessarily reflect the central release that contributes to behavioral regulation (Landgraf & Neuman, 2004). Altogether, it is clear from our observations in the home pen at 21 days that lambs respond to separation from their mother with a high rate of vocalization, sign of distress and agitation, and CORT release indicative of stress.

During the Strange Situation, lambs showed unambiguously selective proximity seeking with their mother and selective increase of distress vocalizations in her absence. Unlike in the home pen, lambs maintained a certain level of vocal activity in the presence of their mother indicating that the novelty of the Strange Situation was indeed slightly stressful. Interestingly, the vocal activity was significantly higher in the presence of both the mother and the unfamiliar ewe, suggesting that the latter was responsible for it either because her own bleating activity enhanced vocal rates in the other two subjects, or because being unfamiliar, she disturbed the tested lambs. Once the mother removed, lambs increased sharply their bleating rate, the presence of the other ewe having absolutely no appeasing effect. In addition, the exploratory activity fell as well demonstrating that the mother, and only her, represents a base of security from which the lamb is bold enough to explore the surrounding environment even in the presence of the unfamiliar ewe. This behavioral pattern is unambiguously analog to what is defined in human infants as secure attachment (Ainsworth, 1989;Ainsworth et al., 1970;Ainsworth & Bell, 1971).

In complement to the two other testing situations, the conditioned place preference-like test reveals some interesting results. Initially designed to test addictive properties of drugs it was then expanded to the study of social rewards like copulation in adult rats or physical interactions in juveniles (Bardo & Bevins, 2000 for review). Our test did not follow strictly the rules of a CPP paradigm since the lambs were put in two contexts having potential rewarding properties, the mother and the home-pen like environment. Nonetheless, our data clearly show that just like in adolescent rats (Peartree et al., 2012), limited contact through a metal hurdle is sufficient for social-reward-conditioned place preference: lambs prefer the side associated with the mother on the test day as well as on the first extinction day, after which the response extinguishes. The home-pen like environment does not seem to be relevant when competing with the sole presence of the mother. Our results show how strong and exclusive the bond with the mother is, and reveals the characteristics of secure attachment described in humans and non-human primates (Ainsworth & Bell, 1970;Jensen & Tolman, 1962).

Peer reared lambs

The behavior of peer-reared lambs in the home pen differed markedly from the mothered lambs. While a stronger need for contact with their partner was also observed at 5 compared to 21 days, peer-reared lambs spent far more time in passive contact than mothered lambs a behavior also mentioned in peer-reared rhesus monkeys (Hansen, 1966;Champoux et al., 1991). During separation in the home pen, peer-reared lambs emitted high-pitched bleats but to a lesser extent than mothered lambs at both ages. The vocal activity was also less intense at 5 than at 21 days, suggesting a longer development of the affectional bond with the peer figure compared to the attachment bond with the mother. Specific maternal cues and behavior (Vince, Lynch, Mottershead, Green & Elwin, 1985;Vince, 1987), paired with suckling, could participate to the rapid formation of a strong and stable bond with the ewe (Nowak et al., 1997;Val-Laillet et al., 2004). At both ages, following reunion, peer-reared lambs spent less time in passive or active contacts but more time sniffing and investigating their partner than mothered lambs, a contrasted behavioral pattern that has several explanations. Firstly, the normal behavioral pattern seen between mother and young when reunited cannot be accomplished. While mothered lambs initiate contact by exploring mostly the udder region and then staying close to her, the ewe remains rather motionless after having briefly explored the ano-genital region of her young (Poindron & Le Neindre, 1980). By contrast, peer-reared lambs behave in an incompatible manner, each lamb trying to assuage its need to be comforted without succeeding. Secondly, the enhanced sniffing activity may also reflect exploration of an individual that has a specific olfactory signature. Enhanced olfactory investigation after 30 minutes of separation could reflect altered efficiency in social discrimination as suggested by work on maternally deprived rats (Lévy et al., 2003) and difficulties in recognizing the familiar partner's odor. In the home pen, physiological responses also differed between mothered and peer-reared lambs. CORT plasma levels increased at 5 days of age in the first minute following reunion (which is also after 30 minutes of separation), while they remained unchanged in mothered lambs. At 21 days of age, plasma CORT levels increase but take longer than mothered lamb to differ from basal concentration.

Maternal interactions and behavior participate to the stress hyporesponsive period in infant rodents (Levine, 2002) and children (Gunnar & Donzella, 2002). In children, insecure attachment with the primary caregiver is also associated with alteration of the HPA axis characterized by higher CORT reactivity in stressful situations (Luijk, Saridjan, Tharner, Van Ijzendoorn, Bakermans-Kranenburg, Jaddoe, Hofman, Verhulst & Tiemeier, 2010). In peerreread lambs, the lack of maternal figure in early life and inharmonious interactions with the peer could participate to such early HPA response. Concerning OT, like in mothered lambs, results did not support either the hypothesis of a peripheral release of plasma OT following social comfort. However, at 5 days basal levels were higher in lambs reared with a peer than with the mother. Increase in plasma OT levels have been described in prairie voles exposed to chronic social isolation (Grippo, Cushing, & Carter, 2007), in depressed women (Cyranowsky, Hofkens, Frank, Seltman, Cai, & Amico, 2008;Parker, Kenna, Zeitzer, Keller, Blasey, Amico, & Schatzberg, 2010) and in children having been maternally deprived in early life (Fries et al., 2008). In women, OT could also be a biomarker of distressed pair bond relationships (Taylor, Saphire-Bernstein & Seeman, 2010). Higher basal OT levels in 5-dayold lambs may reflect an adaptive mechanism to cope with early stressful experience due to the absence of the mother, as it is well admitted that the oxytocinergic system participates to the down-regulation of stress and HPA axis (Neumann, 2002;Uvnäs-Moberg & Petersson, 2005).

While peer-reared lambs show less active contact during reunion and less vocal activity during separation in the home pen at 21 days, in the Strange Situation that constitutes a novel environment, such differences were no longer visible and peer-reared lambs showed selective proximity seeking and distress during separation just like mothered lambs. However, unlike mothered lambs, peer-reared lambs maintained exploration behavior in the absence of the familiar peer. Attachment differs from other bonds by the fact that the attachment figure provides selectively a secure base that incites the young to engage in other activities like exploration and play (Ainsworth, 1989;Ainsworth & Bell, 1970;Sroufe & Waters, 1977).

The fact that the familiar peer does not provide selectively such a secure base questions the nature of the relationship. It appears that the relationship between peers is an affectional bond but it does not comply with the definition of attachment. In spite of this, the conditioned preference induced in the conditioned place preference-like test the bond between peers was not different from the one expressed by the mother lamb: peers had a strong rewarding properties, as mother, and far more than any other familiar pen-like features.

Object-reared lambs

Object-reared lambs were often seen lying next to their object or interacting actively with it, sometimes even putting their forelegs on it. Passive contact was maintained relatively constant over time unlike in mothered or peer-reared lambs. The most striking difference with lambs from the other two groups is that after separation the distress reaction of object-reared lambs was either weak (at 5 days) or even nonexistent (at 21 days) and CORT level did not change significantly. Object-reared lambs had also higher plasma OT levels at 5 days suggesting that like for peer-reared lambs, early environmental conditions were stressful.

Again it highlights the importance of the mother's presence in shaping the ontogeny of the neuroendocrine system.

Proximity seeking and distress reactions in the Strange Situation were not different from mothered and peer-reared subjects: lambs searched selective proximity with their familiar ball and were distressed without it. This was also observed in object-reared monkeys placed in a novel environment (Hennessy & Kaplan, 1982). Object-reared lambs may express a sense of safety and protection in the presence of their familiar object only when the environment is perceived as stressful or threatening, nonetheless our data do not support the existence of an affectional bond with the familiar object. First of all, the exploratory behavior in the Strange Situation is unlikely to reflect a secure base phenomenon: while exploration was reduced when the unfamiliar object was added to the familiar one, the vocal activity remained at the same level. In addition, once the familiar object was removed exploration was unaffected. In both instances the behavioral response differ from the one displayed by mothered lambs, suggesting that exploration rate is diminished in the presence of the unfamiliar object rather than being enhanced in the presence of the familiar figure. This may reflect perception of novelty and increase attention. Second and most importantly, results from the conditioned place preference-like test show unquestionably that the gym ball is not perceived in the same manner as a maternal ewe or even a lamb. The lack of initial preference for one side suggests a competition between the rewarding properties of the two contexts. Then in a second step the ball appears to be even less rewarding than the other pen-like features since lambs developed a preference for the side paired with straw and the heating lamp.

Conclusion

In mammals, attachment as defined by John Bowlby and Mary Ainsworth (Ainsworth, 1989;Ainsworth & Bell, 1970;Ainsworth et al., 1971;Bowlby, 1969) needs careful examination of all the criteria to avoid confounding it with other types of affectional bonds. The present work

shows that it is a combination of several experimental situations that brings clear evidence of its existence. This concept was widely used in the literature, describing attachment to peers or different types of surrogates in non-human primates (Harlow, 1959;Harlow & Zimmerman, 1959;Mason & Berkson, 1975;Reite et al., 1978), or even to objects such as television sets in sheep (Cairns, 1966a[START_REF] Cairns | Development, maintenance, and extinction of social attachment behavior in sheep[END_REF]. In most cases, subjects were tested without taking into account the selectivity of their response in regard to the stimulus presented. The three conditions our Article 4: Regulation of the HPA axis and OT system by maternal attachment figure: evidence from peer-and object-reared lambs Sabrina Gaudin 1, 2, 3, 4* , Elodie Chaillou 1, 2, 3, 4 , Baptiste Borde 1, 2, 3, 4 , Fabien Cornilleau 1, 2, 3, 4 , Maryse Meurisse 1, 2, 3, 4 , Anne-Lyse Lainé 1, 2, 3, 4 , Frédéric Lévy 1, 2, 3, 4 , Raymond Nowak

Introduction

In some mammalian species, an attachment bond forms for the primary caregiver figure, generally the mother. According to attachment theory developed by Mary Ainsworth and John Bowlby, attachment is an affectional bond for a selective figure that, in addition to promote proximity between infant and mother (particularly in stressful situations), permit also the young to explore its environnement due to her secure base effect (Ainsworth, 1989;Ainsworth & Bell, 1970;Bowlby, 1969). By this way, infants can modulate their stress state through proximity with the mother according to the context. Attachment for the mother has been well characterized in children (Ainsworth, 1989;Ainsworth & Bell, 1970;Bowlby, 1969), non-human primate infants (Reite & Capitanio, 1985;Reite et al., 1981;Seay et al., 1962) and lambs (Gaudin et al., 2015) and alteration of such primary bond lead to dysregulation of the stress system (lambs: Wańkowska et al., 2006;Gaudin et al., unpublished data;monkeys: Barr et al., 2004monkeys: Barr et al., , 2009;;Clarke, 1993;Fahlke et al., 2000;Feng et al., 2012;Hennessy et al., 1979 ;Higley et al., 1992;Hill et al., 1973;Shannon et al., 1998) that favor psychological diseases as depression (Ehlert et al., 2001;Chrousos & Gold, 1992;Gold & Chrousos, 1999, 2002;Vreeburg et al., 2009). Studies on the effects of the absence of maternal attachment figure and presence of one or some substitute like peers or objects in infant monkeys and lambs show that a bond develops for such maternal substitute, however, it seems less secure than attachment for the mother (monkeys: Boccia et al., 1989;Harlow & Zimmerman, 1959;Meyer et al., 1975;Suomi, 1997;Lambs: Gaudin et al., unpublished data).

In fact, object-reared infants, the bond is of lower quality because not selective to the familiar figure (monkeys: Hennessy et al., 1979;lambs: Gaudin et al., unpublished data). In fact, in infant rhesus monkeys, the separation with the figure in the familiar home pen increase vocalizations but when the familiar figure was replaced by those of another object-reared animal, that differed in the odour, it appease the young like the familiar object (Hennessy et al., 1979). In lambs, while the separation in the novel environment increases distress vocalizations, the separation in the familiar home pen does not result in such increase (Gaudin et al, unpublished data). Conerning peer-reared infants, in rhesus monkeys, long separation does not result in despair phase as seen in mothered individuals. The bond seems also partially reversible because when the familiar figure is replaced by a novel one during 2 weeks, the novel partner is prefered toward the initial familiar peer. However, after 2 weeks of isolation the initial preference is restored (Chamove et al., 1973). In peer-reared lambs the bond is selective for the peer but this figure is not a secure base to explore. Vocal distress response to separation with the peer figure increases between 5 and 21 days whereas such vocal distress is strongly express by mothered lambs since 5 days of age. Peer-reared lambs performed also less distress vocalizations than mothered lambs at 21 days of age. In addition, direct contact after a stressful separation was not searched during a reunion on the opposite of mothered lambs that performed active contact toward the mother in this situation (Gaudin et al., unpublished data).

Physiological consequences on HPA axis, due to the absence of maternal attachment figure, have been particularly studied in rhesus monkeys. Peer-and object-reared infants often show modifications of basal activity and/or reactivity of the HPA axis (monkeys: Barr et al., 2004;Capitanio et al., 2005;Higley et al., 1992;Meyer et al., 1975;sheep: Gaudin, unpublished data). However, data are not clear on the effect of a less secure primary bond compared to attachment on the development of HPA axis activity. In fact, peer-reared infant rhesus mokeys for example may display either higher (Higley et al., 1992), lower (reared in group: Barr et al., 2004; with one peer and socializations with peers: Capitanio et al., 2005;Meyer et al., 1975) or no changes in basal CORT levels (Clarke, 1993). Some studies in infant monkeys focused on ACTH secretion show the same variation (Barr et al., 2004;Clarke, 1993;Clarke et al., 1998). Two studies on peer-reared infant monkeys and lambs are however agreed on delayed peak of CORT after a stress (monkey: Feng et al., 2012;sheep: Gaudin et al., unpublished data). Two other studies suggest also higher secretion of CRF in the hypothalamus (Barr et al., 2004(Barr et al., , 2009)). Differences between rearing protocols could be the source of discrepancy observed in CORT and ACTH levels of maternally deprived rhesus monkeys and additional source of stress could act in addition to the effect of absence of maternal attachment figure.

First, whereas in some studies infants are separated at birth (Capitanio et al., 2005;Champoux et al., 1989;Sackett et al., 1973), in others, infants are separated latter (within 24h: Higley et al., 1992;Mason, & Capitanio, 1988;48 hours: Winslow et al. 2003;1 -4 days post partum: Boccia et al., 1989;Boyce et al., 1995;Shannon et al., 1998). This period of proximity could permit the young to develop a first bond for the mother before being separated and generate additional stress and activity of HPA axis after separation. In a second time, maternally deprived neonate monkeys need human intervention and training to be autonom to feed. This period extend genrally for 15 (Boyce et al., 1995) or 30 days (Capitanio et al., 2005;Rommeck et al., 2011) but can reach 57 days (Higley et al., 1992), during whitch, infants are reared in different context according to studies: 1) alone in the presence of an objet surrogate in which they can climb on soft material (Barr et al., 2004;Capitanio et al., 2005;Hennessy et al., 1979;Higley et al., 1992;Shannon et al., 1998), 2) alone with the object surrogate but with daily socialization with same age peers (Clarke, 1993), 3) in the presence of one (Boccia et al., 1989;Sackett et al., 1973) or some peers and without object surrogate but with a heating pad (Champoux et al., 199;Rommeck et al., 2011;Sackett et al., 1973) or 4) in the presence of some peers in addition to the access to an object surrogate (Boyce et al., 1995). Finally after this period of training, individuals can be moved in another cage with the same or new peer(s) (Capitanio et al., 2005) with (Shannon et al., 1998) or without (Capitanio et al., 2005;Clarke, 1993) the object surrogate. During this period bond can form and break for human caregiver, peer or object that could drastically influence the development of HPA axis. Moreover, the number of social partner avaibles (Capitanio et al., 2005) can also participate to differences in the activity of HPA axis. The sheep model offer an opportunity to study the effect of the absence of maternal figure and attachment on HPA axis because lambs are easy to separate after birth and could be paired with a substitute immediately after the separation with the mother. Lamb model also require a limited intervention of human caregivers, decreasing the possibility for lambs to form a bond with this figure that could interact with the development of the stress system.

On the opposite of the HPA axis, the oxytocinergic system has been shown to have appeasing properties. Oxytocin (OT) is secreted in the paraventicular nucleus of the hypothalamus (PVN) and supraoptic nucleus (SON) and can be secreted at the central level but also in the blood, however, central release is not always linked to peripheral secretion (Babygirija et al., 2012;Engelmann et al., 1999Engelmann et al., , 2000)). In addition to be involved in the formation of social bond and social behaviors as maternal behaviors, OT is involved in stress coping strategy (for reviews : Neumann, 2002: Neumann, , 2008;;Uvnäs-Moberg, 1998) and in rodent is secreted during severe chronic stress such as 30-min of immobilization for 5 consecutive days (Babygirija et al., 2012), or repeated forced swim (Engelmann et al., 2006;Wotjak et al., 1998). Previous results in peer-and object-reared lambs have shown that plasma OT was higher at 5 days of age with no differences at 21 days (Gaudin et al. unpublished data). OT could be early secreted to cope with the absence of attachment for the maternal figure. On the opposite, in primate Winslow et al. (2003) showed in peer-reared infant rhesus monkeys a decrease of OT concentration in the cerebrospinal fluid at 18, 24 and 36 months of life compared to mothered infants.

Additional studies are so needed to better understand peripheral and central OT in absence of mother figure and attachment.

We studied the importance of maternal figure and attachment on the peripheral and central activity of HPA axis and OT system in female lambs. We focus our work on females because they show stronger attachment behaviours than males at one month of age (Gaudin et al., 2015) and because OT was found to play a critical role in the expression of maternal behaviors and mother-lamb bond (Kendrick et al., 1987;Lévy et al., 1995). We first compared the quality of the bond formed for the figure (peer, object, or mother) through evaluation of distress during separation and proximity seeking during reunion at 2 weeks of age. We compared basal CORT and OT plasma levels in mothered lambs with those of maternally deprived lambs, reared with a peer or an object. We finally compared the central activity of Loire). After lambing, 21 female lambs weighing at least 2.5 kg were included in the study to ensure successful adaptation to artificial rearing condition. Lambs were taken away from their mother immediately after being born to be ear-tagged, weighted and allocated randomly into 3 groups. Six female lambs were reared with their dam (mothered group) while the 18 others remained separated from their mother: six of them were reared with an unrelated same sex and age peer, (peer reared group, total: 12 animals) and 6 were reared with a 50-cm-diameter gym ball (object-reared group). In case of twins, the lambs were allocated in different groups.

The choice of such mother substitutes was based on our previous study which showed that attachment was altered for these figures (Gaudin et al, unpublished data). Lambs and ewes were transported to an experimental building located 300 m away to avoid any interference with the animals from the lambing barn. Lambs were randomly allocated to adjacent straw bedded individual pens (1 m X 2 m) with their specific figure: mother, peer or ball. These pens were made of 1.5 m-high opaque panels to avoid any visual and direct contact between penned animals. Peer-and object-reared lambs were bottle-fed twice with 200 ml of bovine colostrum on their first day of life to ensure passive immunological protection. On the second day, they were trained by several human caregivers to suckle a rubber teat fixed on the gate of the pen and connected to automatic feeder (Eurolouve, Alliance pastorale) providing milk ad libitum at constant concentration (200 g/l) and temperature (43°C). Lambs were trained 3 to 4 times per day until full independence that occurred mostly within 2 or 3 days. The fact that several caregivers took care of all maternally deprived lambs reduced the probability of lambs to develop specific attachment bond for one human caregiver. Heating lamps were added to home pens of artificial reared lambs to prevent hypothermia in the first two weeks of life.

Mothers were fed once a day with a mixture of barley grains and concentrates suited for lactating ewes as well as fresh hay. They had ad libitum access to water and straw was provided daily to all the animals to keep the litter clean. Lambs were reared in their specific conditions for the whole duration of the experiment. Lambs were weighted once a week and the weights did not differed between groups that show correct adaptation and normal body condition.

Alteration of attachment in peer-and object-reared lambs

The presence of distress behaviors during separation and proximity seeking through contact seeking during reunion are important features that define attachment bond (Ainsworth, 1989;Ainsworth & Bell, 1970). To evaluate the consequences of alteration of attachment in peer and object-reared lambs on HPA and OT systems, we first check if these alterations were consistent with our previous results in this study. We evaluate during a separation-reunion test in the familiar pen vocal distress during separation and reunion but also proximity seeking 2 minutes (reunion phase, Figure 1). The tested lamb was video-recorded. During this test, the number of high-pitched bleats considered to be distress calls was counted (Gaudin et al., 2015;Moberg et al., 1980). To assess the presence of distress during a separation, we compared the number of high-pitched bleats performed during the 3 phases (before separation, separation, reunion). Proximity seeking was measured through the time spent in active contact (lamb's head in contact with the familiar figure, including nuzzling) and the time spent sniffing the human or the familiar figure. The particular search of proximity with the figure after stressful period of separation was assessed comparing the active contact performed before separation and during reunion. To avoid effect of the suckling behaviour on the time spent in contact with the mother during the test, access to milk was prevented 1 hour before the first human intervention by covering the udder of the ewes and removing the rubber teat from the wall of the pen. Immediately after the test, the udders were uncovered rubber teats were put back in places (Figure 1).

Basal CORT and OT

We followed basal CORT and OT plasma levels across development at 1, 2, 5, 7, 10, 14 and 18 days of life in blood sample from the jugular vein using vacutainers containing heparin (Figure1). On the morning, 1 hour after turning on the light (5:00 AM) and favour the wake up and feeding of all lambs, milk supply was prevented during one hour because data suggest that OT level increases after ingestion (calf: Lupoli, et al., 2001;rat pup: Nelson, et al., 1998;lamb: Gaudin et al., unpublished data) and that this elevation is still detected 15 minutes alter (calf : Lupoli, et al., 2001;rat pup: Nelson, et al., 1998). Therefore, we covered the udder of the mother and removed the plastic teats in the artificially reared lambs. One hour later,, blood samples were collected, immediately chilled on ice and centrifuged for 15 minutes at 4°C and 3600 g (between 7:00 and 8:00 AM). Plasma samples were stored at -20° C until analysis.

CORT was assayed by a direct radioimmunoassay (RIA) method described previously by Orgeur et al. (1998) by the hormonal assay laboratory (UMR85 physiologie de la reproduction et des comportements, INRA centre Val de Loire). The intra-assay coefficient of variation was 4.9%, the inter-assay was 7.8% and the sensitivity was 0.25 ng/ml. OT was enzyme immunoassayed using a method described by Szeto and colleagues [START_REF] Szeto | Evaluation of enzyme immunoassay and radioimmunoassay methods for the measurement of plasma oxytocin[END_REF]. This method used the commercial kit (Oxytocin EIA kit Enzo Life Science) after sample extraction. The cross-reactivity was 100% for OT and less than 0.02% for vasopressin, growth hormone and thyrotropin-releasing-hormone. The detection limit was 11.7 pg/ml.

Based on a sample at 40 pg/ml included in each essay, inter-assay coefficient of variation was 9.9% and intra-assay coefficients of variation was 4.8%. At 21 days of age, period during which attachment fully expressed in mothered lambs (Gaudin et al., 2015), access to milk was prevented during 1 hour as described previously and the 18 experimental lambs were deeply anesthetised with intra-venous injection of thiopenthal (thiopental at 18 mg / kg) then lambs were conducted to slaughterhouse platform (INRA Val de Loire, agreement number B37-175-2) and decapitated by a licensed butcher. Brains were then perfused via carotids with 1 litter of warm (37°C) 1% sodium nitrite in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) solution and then with 1.5 litter of ice-cold 4% paraformaldehyde solution in phosphate buffer solution. After 48 hours of post fixation in the same fixative, brains were stored in 30% sucrose solution in phosphate buffer with azide 0.1% for 2 days before being cut in blocks. Blocks containing the SON and the PVN were frozen and floating sections were cut using a microtome at a thickness of 30 µm. Floating sections were stored in tris buffer saline (TBS) with azide 0.1%. Cresyl violets staining was performed every 10 sections to define the section containing the delineated SON and PVN (Figure 2). In the SON, the number of OT-ir neurons, was evaluated across 3 different levels of this structure and, in the PVN, across 4 different levels (rostral, medial 1, medial 2 and caudal). This difference of sampling was due to difference in the length of the structures. In the PVN, the number of CRF-ir neurons was assessed using the 4 adjacent sections of those used for OT labelling.

CRF-ir was not assessed in the SON because of the absence of CRF-ir neurons in this region in sheep on the opposite of rodent (Matthews et al., 1991). Three lambs, one of each group, woke up during transport and had to be anesthetized a second time. As these individuals showed extreme values of CRF-ir but not OT-ir neurons, they were not included in the statistical analysis of the number of CRF-ir neurons (5 lambs per group). Peer partners and mothers returned to the breeding INRA research station.

CRF immunolabeling

Sections were treated with TBS -Triton 0.3% -Azide 0.1% (TBSTA) with thyroglobuline 0.1% during 1 hour to increase permeability of cell's membranes and reduce background noises. Sections were then incubated overnight at 4°C in primary antiserum raised against rabbit anti-ovine CRF (1: 5000), previously used (Chaillou et al., 2000[START_REF] Chaillou | Long-Term Undernutrition Followed by Short-Term Refeeding Effects on the Corticotropin-Releasing Hormone Containing Neurones in the Paraventricular Nucleus : An Immunohistochemical Study in Sheep[END_REF] with TBSTA and 0.1% thyroglobuline. The next day, sections were rinsed 4 times for 8 minutes in TBS and were incubated for 90 minutes with a goat anti-rabbit peroxydase (1: 500) in TBS and bovine serum albumin (BSA) 0.1%. After rinsing them twice for 5 minutes in TBS, sections were rinsed twice during 5 minutes in Tris-HCL buffer at 0.05 M (pH 7.6). For peroxidase detection, the sections were soaked for about 6 minutes, with a solution prepared in the dark, containing 0.015% of 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB), 0.33% nickel ammonium sulphate and 0.001% H 2 O 2 (DAB-Ni-H 2 O 2 ) in Tris-Hcl buffer solution. They were then rinsed 3 times for 5 minutes in TBS before being mounted on Superfrost slides and stored to dry in a heat chamber at 37°C overnight. After that, the slides were dehydrated in three successive 5 minutes baths of 95° alcohol, 100° alcohol and finally toluene, and coverslipped in Depex.

OT immunolabeling

Sections were treated for 1 hour with TBSTA containing BSA 1%. After one rinse in TBS, sections were incubated for 48 hours at 4°C in primary antiserum raised against rabbit antiovine OT (1:5000) in TBS and BSA 1%. Sections were then rinsed 3 times for 10 minutes in TBS and were incubated for 90 minutes with a goat anti-rabbit peroxidase antibody (1:300) in TBS and BSA 0.1%. After rinsing them twice for 5 minutes in TBS, sections were again twice times for 5 minutes in Tris-HCL 0.05M, pH 7.6. Sections were reacted for peroxidase detections adding the DAB-Ni-H 2 O 2 solution about 6 minutes before being rinse 3 times for 5 minutes in TBS. Sections were mounted as for CRF immunolabelled ones.

Cell counting

OT-and CRF-ir neurones were observed as a blue-black reaction product localized in the cytoplasm and processes. SON and PVN were drawn at low magnification (X 2.5), using a photonic microscope (Axioskope 2, Zeiss, Germany) equipped with a video camera and delineated with the computerized image analysis software Mercator (Explora Nova, la Rochelle, France). Using this system, OT-ir and CRF-ir cells were pin-pointed bilaterally through all the PVN and SON at high magnification (X 40). A semi-automatic counting was used: first the image analyser counted the total number of cytoplasmic profiles within the field, using fixed threshold, then artefacts were corrected manually. Before each series of counting, a reference slice containing a known number of OT-ir or CRF-ir was analysed to verify the settings of the microscope and of the software, all counting were blindly done.

Statistical analysis

Differences between groups were assessed using linear mixed models (LMER). For CORT and OT plasma levels, LMER models included the group and the days as fixed effects and the lamb identity (ID) as random effect. For behavioral data recorded during the separationreunion test, LMER models included the group and the phase as fixed effects and the identity of lamb (ID) as random effect. In addition, the time spent in passive and active contact with the human caregiver during his first intervention was compared between groups using oneway ANOVA as other behavioral data required parametric LMER model to be analyse. The number of OT-ir and CRF-ir neurons was compared between groups including the group and the level of the section as fixed effects. The lamb ID was included as random effects in the LMER model. Comparisons between groups were performed using multiple t-tests. Multiple comparisons between independent samples were corrected with false discovery rate (FDR) correction (Benjamini, et al., 2001). Multiple comparisons between paired samples were corrected using Holm correction. All statistical analysis were conducted using R 3. For both mothered and peer-reared lambs, separation induced an increase and reunion a decrease in the number of vocalizations (mother: separation, t = 5.53, df = 5, P = 0.008; reunion, t= -5.07, df = 5, P = 0.008; peer: separation, t = 5.56, df = 5, P = 0.008; reunion, t = 5.43, df = 5, P = 0.008). In object-reared lambs the number of vocalizations did not vary significantly during separation and reunion. They performed however more high-pitched bleats than the two other groups before separation which is after that the human caregiver left the pen for the first time. (Object vs mother: t = 2.30, df = 5.02, P = 0.02; object vs peer: t = 2.25, df = 5.03, P = 0.02, Figure 3a). During the separation phase object-reared lambs were less vocal than peer-reared (t = 4.58, df = 5.92, P = 0.0008) and mothered lambs (t = 4.13, df = 7.03, P = 0.01). Peer-reread lambs tended to emit more high-pitched bleats than mothered lambs (t = 1.48 df = 8.67, P = 0.09). Plasma CORT levels varied across days and tended to differ between groups (group effect: sum square = 0.43, df = 2, F = 2.59, P = 0.07; days effect: sum square= 8.58, df = 6, F = 17.13, P<0.0001). Differences between groups were found at 24 hours of age: peer-reared (t = 2.30, df = 5, P = 0.05) and object-reared lambs (t = 1.73, df = 6.36, P = 0.07) tended to have higher plasma CORT level than mothered lambs. At 18 days, maternally deprived lambs did no longer differ significantly from those reared by their mother, however, object-reared lambs had higher plasma CORT level than peer-reared lambs (t = 2.71, df = 8.38, P = 0.03, Figure 4a).

CRF-ir neurons in the PVN

As previously reported in sheep, CRF-ir was mainely observed in small neurons in the PVN, especially in the parvocellular parts of the nucleus (Chaillou et al., 2000) (Figure 4b). Very few rostral sections of the PVN contained CRF-ir neurons (from 0 to 4 neurons observed in this part). Therefore, we only compared the number of CRF-ir neurons present in the medial and caudal sections. There was a significant effect of the group (sum square = 3422.3; df = 2; F = 6.61; P = 0.01) and of the level of section (sum square = 7080.3; df = 2; F = 13.8; P<0.001) and significant interaction between the two factors (sum square = 5738.1; df = 4; P = 0.004). In the first medial part, peer-(t = 4.03, df = 4.09, P = 0 .02) and object-reared lambs (t = 2.74, df = 6.26, P = 0.03) had fewer CRF-ir neurons than mothered lambs. In the second medial part, peer-reared had fewer CRF-ir neurons than mothered (t = 6.02, df = 14.55, P = 0.01) and object-reared lambs (t = 3.51, df = 11.72, P = 0 .02, Figure 4c). When data from the 3 brain sections were average, peer-reared lambs had significantly fewer CRF-ir neurons in the PVN than mothered lambs (z = 3.74, P<0.001, Figure 4d).

Oxytocinergic system

3.1 Plasma OT Plasma OT levels also varied significantly across days and tended to differ between groups (group effect: sum square = 0.33, df = 2, F = 3.48, P = 0.05; days effect: sum square = 0.95, df = 6, F = 3.28, P = 0.005). In addition there was a tendency for a day by group interaction (sum square = 0.99, df = 12, F = 1.72, P = 0.07). At 5 days, peer-reared (t = 2.26, df = 7.11, P = 0.06) and object-reared lambs (t = 3.19, df = 9.83, P = 0.08) tended to have higher plasma OT levels than mothered lambs. At 7 days of age, while mothered and peer-reared lambs did not differ significantly, object-reared lambs had particularly higher levels of plasma OT than mothered (t = 2.45, df = 5.80, P = 0.03) and peer-reared lambs (t = 1.99, df = 6.24, P = 0.04).

At 14 days this difference tended to remain (object vs mother: t = 2.32, df = 8.94, P =0.06; object-peer: t = 1.96, df = 8.22, P =0.08, Figure 5a).

3.2 OT-and CRF-ir neurons in the SON and PVN 3.2 OT-ir in the PVN and SON On the opposite of CRF-ir, OT-ir was mainly localised in large neurons of the PVN, corresponding to the magnocellular part of the PVN, where neurophysin-ir was previously described in adult sheep (Chaillou et al., 2000) as in young ones (Val-Laillet et al., 2009) (Figure 5b). All sections of the PVN and SON contained high number of OT-ir neurons.

There was a significant effect of the group (Sum square = 30431; df = 2; F = 7.6 P = 0.001) and of the level of section (sum square = 191531; df = 3; F = 5.5, P<0.0001) on the total number of OT-ir neurons in the PVN no significant interaction between the two. When groups were compared within each section, no significant differences were found in the rostral and first median part of the PVN. In the second median, peer-reared tended to have (t = 1.83, df = 9.96, P = 0.07) and object-reared lambs had a higher number of OT-ir neurons (t = 3.23, df = 7.21, P = 0.03). Such difference was confirmed in the caudal part as both peer-reared (t = 3.36, df = 9.23, P = 0.008) and object-reared lambs (t = 2.87, df = 9.99, P = 0.03) had more OT-ir neurons than mothered lambs (Figure 5c). When data were average from the four brain sections, peer and object-reared lambs were found to have more OT-ir neurons in the PVN than mothered lambs (peer-mother: z = 3.75, P<0.001; object-mother: z = 3.05, P = 0.06, Figure 5d). By contrast in the SON, no significant differences between groups or sections were found in the number of OT-ir neurons even if the differences between groups follow those observed in the PVN (mean ± SEM, mother: 37.7 ± 3.9; peer: 65.4 ± 9.0; object: 69.1 ± 13.61). However on the opposite of what we found previously, the number of vocalizations at 13 days tended to be higher in peer-reared lambs than mothered lambs whereas the number of vocalizations was lower at 21 days of age in our precedent study. The discrepancy seems to come from a higher rate of vocalization in peer-reared lambs rather than a lower rate of vocalizations in mothered lambs compared to the precedent study. The major difference between the two studies is that, in the precedent study, lambs were separated from their figure at 5 days and separated a second time at 21 days. The first 30 minutes of separation at 5 days of age could have reduce vocalization rate during the second separation at 21 days of age through 1) alteration of the formation the affective bond for the peer figure or 2) habituation process and decrease in the expression of distress that not happen in mothered lambs. In this study, a single separation from the figure at 13 days of age resulted in a tendency to perform more vocalization distress than mothered lambs hat show however alteration of this attachment behavior. Further studies are needed to better understand the difference in vocalization rate during a separation in the familiar home pen in peer-reared lambs. Compared to mothered lambs, peer-reared lambs did not display the increase of active contact seeking during reunion but, on the other hand, enhanced sniffing activity. Alteration of this attachment behaviors had been described previously (Gaudin et al., unpublished data) and provide evidence of an unsecure social bond in peer-reared lambs. On their part, object-reared lambs did not from any particular bond with the object but, on the other hand, developed a bond with the human caregiver despite only brief and occasional periods of presence. This highlights the importance of taking into account bonds that could form with a human caregiver who is not a neutral stimulus for animals reared in social isolation. In our experimental paradigm, the vocal activity displayed after separation with the familiar object as evidenced in our previous work (Gaudin et al., unpublished data), is not due to the object disappearing, but to human intervention. This is evidenced not only through contact seeking but also through increased vocal activity in the phase called "before separation" when the human leaves the pen. This point is particularly important because in all non-human primate studies on attachment, neonates are first reared and bottle-fed by a human caregiver from 2 to 8 weeks of age (Champoux et al., 1989;Clarke, 1993;Higley et al., 1992;Mason & Capitanio, 1988;Meyer, et al., 1972Meyer, et al., , 1975;;Shannon et al., 1998;Winslow et al., 2003) and such relationship is never taken into account. Taken together these data support a less secure and more stressful context in peer and object-reared lambs as previously observed (Gaudin et al.,unpublished data) and suggest early activation of HPA axis in these maternally deprived lambs.

In all groups, plasma CORT levels were particularly elevated at birth, as also described in most of mammals (marmoset monkeys: Pryce et al., 2002;piglets: McCauley & Hartmann, 1984). In fact the birth process in lambs includes the elevation of CORT and HPA axis activity but also drastical changes in the HPA axis regulation in the fetus (Challis et al., 2001;Matthews & Challis, 1994). In lamb fetuses near term, an increase of CORT, ACTH, hypothalamic CRF ARNm and number of CRF-ir neurons is correlated with decrease of glucocorticoid receptor and decrease in feedback mechanism regulating CORT level (Challis et al., 2001;Matthews & Challis, 1994). In accordance with our results, after birth, CORT then decreases to 7 days of age, period corresponding to the postnatal maturation of the HPA axis (Moberg et al., 1980). Decrease in hypothalamic CRF ARNm, as number of CFR-ir in this region, suggests an increase in feedback mecanisms during this postnatal period (Challis et al., 2001;Matthews & Challis, 1994). Basal CORT levels during the first 24 hours of life were higher in lambs reared without mother, illustrating a potential early activation of the HPA axis during its maturation postpartum. Attachment in lambs develops early after birth and lambs show preference for the mother toward an unfamiliar ewe since 12 hours of life (Nowak et al., 1987). The development of this preference is in part mediated by mother cues and suckling behavior (Nowak et al., 1997;Val-Laillet et al., 2004;Vince et al., 1985). The lack of maternal cues and care such as nursing, licking, warmth provided through bodily contact could disrupt the sensorial homeostasis as suggested by Cairns and Jonhson (1965) and not permit the development of attachment bond with secure and appeasing properties, leading to a stressful context for maternally deprived lambs. Despite elevated plasma CORT levels at 24 hours of age and alteration of attachment behaviors at 2 weeks of age, maternally deprived lambs were able to reach normal baseline values from 72 hours onwards. The fact that basal CORT level differences did not persist over time was also observed in our previous study (Gaudin et al., unpublished data) as well in some studies on peer-reared infant monkeys (Champoux et al., 1989, Clarke, 1993, Higley et al., 1992, Meyer & Bowman, 1972;Meyer et al., 1975, Shannon et al., 1998).

Both maternally deprived lambs show lower number of CRF-ir compared to mothered lambs in the PVN, especially in the first medal part. Increase of HPA axis activity shortly after birth and alteration of a secure attachment bond could have decrease potential further secretion of CRF in the PVN in peer and object reared lambs. A decrease in CRF activity has been reported in animals enduring long separation with the mother but interactions with peers. For example, such decrease was also reported in preweanling female lambs after a separation from the mother for 3 days (Wańkowska,et al., 2006) and in piglets after daily separation from their mother in their first 10 days of life (Kanitz et al., 2004). The lower potential release of CRF by the lower number of CRF-ir in PVN could well be linked to an increase of downregulation mechanisms and depletion (Meaney, 2001;Plotsky & Meaney, 1993). This observation is in accordance with previous data on the secretion of CORT in peer-reared lambs following 30 minute of separation with the partner in the familiar home pen, where they showed precocious responsiveness of the CORT at 5 days g age and delayed peak of CORT at 5 and 21 days of age (Gaudin et al., unpublished data). Over the whole PVN, the low CRF-ir seemed to affect more peer-reared than object reared lambs and, at 18 days of age, peer-reared lambs had lower level of CORT than object-reared lambs. HPA axis was differentially affected in peer-and object-reared lambs and seems less activated or/ and more down-regulated in peer-reared lambs.

Concerning OT system, the elevated plasma concentration of OT at 5 days of age and the higher number of OT-ir in the PVN at 21 days in bith maternally deprived groups, suggests that the oxytocinergic system is activated in both groups reared in absence of maternal figure.

In our previous study, plasma OT was also higher at 5 days of age in peer and object reared lamb groups (Gaudin et al., unpublished data). Such elevated basal secretion and elevated potential release of OT by the high number of OT-ir neurons in the PVN could reflect stress coping strategy to reduce HPA axis activity and CRF secretion (Babygirija et al., 2010;2012;Zheng et al., 2010). Both maternally deprive lambs, even in presence of a bond for a peer sems to be chronically stressed. Object-reared lambs had particular elevated OT at 7 and 14 days and showed more difficulty to reach homeostasis in plasma OT level than peer-reared lambs. Absence of a stable affectional bond in object-reared lambs due to many separations with the human caregiver figure could lead to a particular stressful social environment and dysregulation of plasma OT secretion. On the opposite the presence of a stable figure as a peer in absence of maternal figure could favor the adaptation to the stress context of the absence of maternal attachment figure reducing of the HPA axis activity and permitting normal basal plasma OT secretion.

Conclusion

Unlike mothered lambs, peer-reared and object-reared lambs did not develop a secure bond with their familiar figure, a phenomenon that has been described in deeper details in our previous work (Gaudin et al., unpublished data). Absence of the maternal attachment figure led to a stressful social context with higher plasma CORT at 24 hours of life. Oxytocinergic system seemed to be early activated and central activity increased as they had higher number of OT-ir neurons in the PVN at 21 weeks of life compared to mothered lambs. This early activation is notably described as an adaptation mechanism to chronic stress. Dysregulation of OT plasma secretion was observed in object-reared lambs and not in peer-reared lambs, suggesting higher stressful condition in object-reared lambs. In both maternally deprived groups had lower CRF-ir neurons in the PVN that reflect reduction of CRF secretion through feedback mechanism and depletion than in mothered lambs. Presence of the peer figure seems to facilitate the decrease of CRF activity and CORT level at 21 days and could by this way constitue an adaptative mechanism to keep homeostasis of OT plasma.Taken together, these results demonstrate the importance of mother in lowering the activity of the HPA axis and the central OT system, an effect that may take place through her early appeasing properties that permit the development of attachment.

Introduction

La distribution centrale des récepteur de l'ocytocine (OTRs) varie entre les espèces (voir introduction, Tableau 1) mais semble particulièrement différer selon des facteurs sociaux, tels que le système d'appariement et la structure sociale, même chez des espèces phylogénétiquement proches (pour revue : [START_REF] Young | Oxytocin and Vasopressin Receptors and Species-Typical Social Behaviors[END_REF]. La densité des OTRs peut aussi différer selon des stratégies de reproduction individuelles tel que l'investissement maternel dans les soins aux jeunes chez le rat (Champagne et al., 2001 ;Francis et al., 2000). Les OTRs sont des récepteurs couplés à la protéine G (RCPG) (pour revue : Gimpl & Fahrenholz, 2001) et plusieurs molécules sont capables de moduler leur densité, comme les stéroïdes (Bale et al., 1995 ;Tribollet et al., 1990) et les glucocorticoïdes (Liberzon et al., 1992(Liberzon et al., , 1997 ; ;Patchev et al., 1993). Ainsi les rates plus maternelles montrent une plus grande efficacité des oestrogènes à augmenter la densité des OTRs (Champagne et al., 2001 ). Le stress influence la densité des OTRS par la libération de glucocorticoïdes (Dabrowska et al., 2011 ;Insel et Shapiro, 1992 ).

Les stress chroniques, tel que les séparations maternelles répétées, modifient la distribution des OTRs chez le jeune raton, altérations qui perdurent à l'âge adulte (Liberzon et al., 1992 ;Lukas et al. 2010 ;Noonan et al., 1994) (loup et al. 1991). Chez l'ovin l'OVTA-I 125 a été utilisé pour étudier la distribution des OTRs par autoradiographie au sein de l'utérus [START_REF] Ayad | uterus and oviduct of the non-pregnant ewe using an iodinated receptor antagonist[END_REF]Wathes & Hamon, 1993) mais aucune étude n'a mis en évidence la distribution de ces récepteurs au niveau central par cette technique (Lévy et al., 1995). Dans l'optique d'étudier l'altération de la distribution des OTRs La technique utilisée semble efficace pour marquer spécifiquement les OTRs présents au niveau de l'utérus de brebis. En effet, comme décrit par deux autres études, un fort marquage est observé au niveau du myomètre et des cellules épithéliales de l'endomètre [START_REF] Ayad | uterus and oviduct of the non-pregnant ewe using an iodinated receptor antagonist[END_REF]Wathes & Hamon, 1993). L'étude de compétition confirme la spécificité de ce marquage puisque l'ajout d'une grande quantité d'OT empêche l'OVTA-I 125 de se fixer aux récepteurs et le signal est fortement diminué. De la même manière, L'amygdale centrale, le VMH et le subiculum du rat sont marqués spécifiquement par l'OVTA-I 125 , comme décrit dans la littérature (Tribollet et al., 1988). L'absence de marquage chez l'agneau au niveau de l'amygdale et du subiculum peut avoir plusieurs explication : 1) Comme décrit chez le primate et l'homme, ces régions pourraient ne pas contenir d'OTRs (Homme : Loup et al., 1991 ;ouistiti commun, Callithrix jacchus : Schorscher-Petcu et al., 2009) malgré la présence d'ARNm dans ces régions (Broad et al., 1999) ou 2) comme proposé chez le primate, l'OVTA pourrait ne pas être sélectif aux OTRs centraux (Toloczko et al., 1997) Le marquage des OTRs par l'OVTA-I 125 chez la brebis montre des zones particulièrement marquées, mais de manière non répétable entre les coupes du même niveau. L'étude de compétition révèle lui aussi la présence de marquage, parfois même plus intense qu'en présence de l'OVTA-I 125 seul. Avec l'OT-H 3 , aucun fort marquage spécifique, comme celui observé au niveau de l'amygdale chez le rat n'a pu être mis en évidence. L'ajout de l'OT par ailleurs ne diminue pas spécifiquement l'intensité du marquage (Figure 24).

Conclusion

Le marquage obtenu avec l'OVTA-I 125 sur l'utérus et le cerveau de rat sont en accord avec la littérature : la présence du radioligand est détectée au niveau du myomètre et des cellules épithéliales de l'endomètre [START_REF] Ayad | uterus and oviduct of the non-pregnant ewe using an iodinated receptor antagonist[END_REF]Wathes & Hamon, 1993) pour l'utérus, ainsi qu'au niveau de l'amygdale centrale, du subiculum et du VMH pour le cerveau de rat (Tribollet et al., 1988 ;Freund-Mercier et al., 1987). Les marquages des OTRs au niveau du cerveau de rat diffèrent entre l'OVTA-I 125 et l'OT-H 3 , l'hippocampe dorsal présentant un faible marquage avec l'OT-H 3 contrairement à l'OVTA-I 125 où la zone n'est pas marquée. Cette différence peut s'expliquer par la forte affinité de l'OT pour son récepteur mais aussi, avec une affinité plus faible, pour d'autres récepteurs structurellement proches comme le récepteur de la vasopressine V 1A (V 1A R) (Boccia et al., 2013 ;Manning et al., 1989Manning et al., , 1995)).

Freund-Mercier et ses collègues (1987) ont observé de la même façon un marquage non spécifique plus important que dans les autres régions en utilisant l'OT-H 3 .

Aucun fort marquage d'une région spécifique n'a pu être mis en évidence en utilisant ces deux méthodes sur les coupes de cerveau d'ovin. L'utilisation de l'OVTA-I 125 ne semble par ailleurs pas spécifique aux OTRs pour les coupes de cerveau de brebis, l'ajout d'une grande quantité d'OT en compétition avec le radioligand ne résultant pas en une diminution systématique du signal et traduisant une accroche non spécifique. Ces résultats sont en accord avec une étude précédente chez la brebis qui n'a pas réussi à révéler par l'OVTA-I 125 la présence d'OTRs dans le bulbe olfactif chez la brebis (Lévy et al., 1995). Une étude suggère que la sélectivité de l'OVTA-I 125 pour se lier aux OTRs centraux dépendrait de l'espèce étudiée, l'OVTA-I 125 se liant avec une forte affinité aux V 1A R chez le macaque rhésus contrairement aux autres modèles étudiés (Toloczko et al., 1997). Comme nous l'avons observé chez la brebis, l'OVTA-I 125 semble pourtant sélective aux OTRs présents dans l'utérus du macaque rhésus (Toloczko et al., 1997). Chez l'ovin, l'OVTA-I 125 pourrait donc ne pas se fixer spécifiquement sur les OTRs centraux contrairement aux OTRs périphériques, différence qui pourrait être dû à un plus fort accrochage non spécifique au tissu et une absence ou une faible liaison avec les OTRs. Cependant, cette dernière hypothèse suggère une différence structurale entre ces deux types de récepteurs, ce qui n'a pas été décrit chez les autres espèces (Gimpl & Fahrenholz, 2001).

Le marquage des OTRs en utilisant l'OT-H 3 sur le cerveau de brebis semble plus répétable d'une coupe à l'autre que le marquage avec l'OVTA-I 125 . Malgré la forte affinité de l'OT-H 3 pour les OTRs, aucune zone fortement marquée n'a pu être mise en évidence dans les régions du noyau basal de Meynert, de la bande diagonale de Broca, de l'amygdale et du subiculum à l'aide de ce radioligand. L'absence totale d'OTRs dans ces régions contenant une grande quantité d'ARNm de l'OTR (Broad et al.,1999) étant peu probable, plusieurs interprétations sont alors possibles : 1) L'OT-H 3 pourraient ne pas pouvoir se fixer efficacement sur les OTRs. Les précédentes études d'autoradiographie menées sur le rat ont suggéré une régulation particulière des OTRs dans les zones du noyau supraoptique (SON) et du noyau paraventriculaire (PVN), où l'OT est produite en grande quantité. Contrairement aux autres régions, le marquage avec l'OVTA-I 125 et l'OT-H 3 de ces zones n'est pas systématiquement observé (Freund-Mercier et al., 1987 ;Van Leeuwen et al., 1985). Pourtant, la présence de ces récepteurs a été mis en évidence par des approches immunohistochimiques (Boccia et al., 2013), et le feedback positif qu'exerce l'OT sur sa sécrétion (Moos et al., 1984) Attachement, axe HPA et ocytocine chez l'agneau materné Attachement Comme suggéré dans notre première hypothèse, l'attachement mère-fille semble s'exprimer de manière plus forte que l'attachement mère-fils (Etude 1). En effet, les femelles expriment plus fortement les 3 caractéristiques de l'attachement : la proximité avec la mère, les vocalisations de détresse lors d'une séparation et l'augmentation du comportement d'exploration lorsque la mère est présente. Comme proposé par notre hypothèse, un plus fort attachement entre la fille et la mère et un plus faible attachement du fils pour la mère pourrait favoriser l'interaction entre mâles de même âge, à distance des mères et des filles. La proximité de la fille pour la mère pourrait aussi favoriser l'apprentissage du domaine vital, les femelles montrant une forte philopatrie (Clutton-Brock et al., 1982 ;Festa-Bianchet, 1991 ;Lent 1974 ) et favoriser les interactions sociales avec les jeunes femelles de même âge. En plus de favoriser la mise en place de lien pour les frères et soeurs (Ligout & Porter, 2004), l'étude du développement des liens sociaux de jeunes femelles maternées (Etude 3) montre l'importance de la présence de la mère et du comportement sélectif des brebis maternelles dans le développement des préférences sociales des jeunes femelles pour les congénères de même âge non apparentés. Une de nos hypothèses de départ était que les interactions de la mère influençaient les interactions des jeunes femelles. Cependant, les préférences des jeunes ne semblent pas liées à celle de leurs mères et ne sont pas stables entre la seconde et troisième semaine de vie. Comme décrit en condition naturelle, les relations préférentielles entre les brebis adultes ne sont, elles non plus, pas stables durant cette période. Le manque de corrélation entre les affinités des mères et celles entre les jeunes femelles pourrait être lié à la surface restreinte du parc qui permet à tout moment au jeune de rester en contact visuel avec la mère, et permettre une exploration complète du parc à distance de la mère. Une étude sur une surface plus grande permettant éventuellement la constitution de sous-groupes de brebis serait intéressante pour compléter ces observations. Axe HPA et système ocytocinergique Comme décrit par Moberg et al. (1980), la cortisolémie est élevée à la naissance et diminue au cours de la première semaine de vie, correspondant à une maturation de l'axe HPA. Alors que cet axe semble répondre à des stress tels qu'une castration, un stress de contention et un stress d'isolement dans un environnement nouveau (Kent et al., 1993 ;Moberg et al., 1980), nos résultats indiquent une absence d'élévation de la cortisolémie à 5 jours de vie pour un stress de séparation (15 à 30 minutes) dans l'environnement familier (Etude 4). Comme observé chez le rongeur (Sapolsky & Meaney, 1986) et suggéré chez l'Homme [START_REF] Gunnar | Integrating neuroscience and psychological approaches in the study of early expriences[END_REF], le jeune ovin pourrait montrer une période hyporéactivité de l'axe HPA, modulée par la présence de la figure maternelle (Etude 4). Ces résultats ouvrent la possibilité d'étudier les conséquences des troubles de l'attachement sur la régulation précoce de l'axe HPA et les caractéristiques maternelles qui modulent l'hyporéactivité de l'axe.

Plusieurs études ont montré une sécrétion d'OT plasmatique chez la mère suite à des interactions positives avec le jeune et ce particulièrement lorsque l'attachement est secure (Feldman et al., 2011). Au contraire, plusieurs études mettent en évidence une augmentation de l'OT plasmatique pendant certains stress (immobilisation : [START_REF] Jezova | Vasopressin and Oxytocin in Stress[END_REF]nage forcée : Wotjak et al.,1998a, b ;Lang et al., 1983 ; le secouement de la cage : [START_REF] Hashiguchi | Single and repeated environmental stress: Effect on plasma oxytocin, corticosterone, catecholamines, and behavior[END_REF][START_REF] Nishioka | Stress increases oxytocin release within the hypothalamic paraventricular nucleus[END_REF]suspension par la queue : Gibbs, 1986 ;défaite sociale : Neumann, 2002défaite sociale : Neumann, , 2007 ; ;environnement nouveau : Ivanyi et al., 1991). La sécrétion de l'OT : Harlow, 1959 ;Harlow et Zimmerman, 1959 ;Hennessy et al., 1979 ;Meyer et al., 1975 ;Reite et al., 1978 ;mouton : Cairns, 1966a -Un attachement peut-il se développer pour un congénère ? D'après notre étude sur les préférences sociales au sein d'un groupe de femelles en allaitement artificiel âgées de 2 à 3 semaines (Etude 3), les agneaux privés de figure maternelle ne développent pas de préférence pour un ou plusieurs congénères particuliers. Ils ne présentent pas non plus d'évitement et n'ont pas un réseau social structuré, avec des préférences plus ou moins fortes. Ces données contrastent avec celles obtenues chez le porcelet. En effet des porcelets sevrés de la mère à 4 semaines montrent des préférences pour certain congénères, même si elles ne sont pas stables au cours du temps (Durrell et al., 2004).

La présence de la mère pendant les 4 premières semaines de vie, pourrait participer à la construction des préférences sociales qui s'exprimeraient par la suite en son absence. Cette hypothèse pourrait être testée chez l'agneau en séparant les individus à des âges différents.

Si aucun lien sélectif ne se développe dans un groupe d'agneaux élevés en allaitement artificiel, au contraire, lorsque la proximité entre deux individus sans figure maternelle est favorisée, un lien affectif se développe pour le partenaire (Etude 4). En effet, ce lien se traduit par une augmentation des comportements de détresse lors d'une séparation, et par un apaisement lors de la réunion dans un environnement familier. Ces agneaux, dans la Situation étrange, montrent par ailleurs la sélectivité de la réponse de détresse, de la proximité recherchée avec le congénère familier par rapport à un congénère étranger. Le test de préférence de place conditionnée montre un effet renforçateur de la présence de la figure de manière analogue à ce qui est observé chez les agneaux maternés. Ces données montrent la présence d'un lien affectif sélectif pour le congénère lorsque la proximité entre deux individus de même âge est favorisée. Cependant, contrairement à ce qui est décrit chez l'agneau materné et à ce qui caractérise un lien d'attachement (Ainsworth, 1989 ;Ainsworth & Bell, 1970), les agneaux ne se servent pas du congénère pour organiser leurs comportements maternés qui montrent une réponse vocale forte dès 5 jours de vie. Chez le rat, la privation maternelle précoce résulte en une diminution de la capacité de l'apprentissage social (Lévy et al., 2003). L'absence des caractéristiques maternelles et des comportements maternels permettant la mémorisation d'indices saillants comme l'allaitement (macaque rhésus : Harlow & Zimmerman, 1959 ;rat : Moriceau & Sullivan, 2004 ;mouton : Nowak et al., 1997a, b ;Vail-Laillet et al., 2006) (Clarke, 1993 ;Higley et al., 1992 ;Fahlke et al., 2000) ou à une réduction de la cortisolémie dans certains cas (Feng et al., 2012 ;Meyer et al., 1975).

Chez les individus élevés avec un congénère comme substitut maternel, la séparation avec la figure entraine dès 5 jours une réponse de l'axe HPA avec une augmentation de la cortisolémie 15 et 30 minutes après la séparation. Cette augmentation de la cortisolémie à 5 jours contraste avec la réponse physiologique des agneaux maternés qui montrent pourtant plus de comportements de détresse en réaction à la séparation mais pas d'augmentation de la cortisolémie. A 21 jours, le pic de cortisolémie est par ailleurs retardé par rapport à celui des individus maternés, indiquant une altération de la réactivité de l'axe HPA. Ces données suggèrent que l'agneau pourrait montrer une période de SHRP tout comme chez le rat et l'Homme, qui pourrait aussi être perturbée en absence de figure maternelle et d'attachement secure pour la figure. Cette sollicitation précoce de l'axe HPA pourrait par ailleurs conduire à une diminution de sa réactivité. D'autres études sont néanmoins requises pour confirmer que l'absence maternelle entraine bien une réponse plus précoce mais différée de l'axe HPA en réponse à différents stress modérés.

Si aucune différence de cortisolémie n'est mise en évidence après 24 heure de vie jusqu'à 18 jours chez les individus élevés en binôme avec un objet ou un congénère par rapport aux agneaux maternés, à 18 jours, la cortisolémie chez les agneaux élevés avec un objet est plus forte que celle des agneaux élevés avec un congénère (Etude 5). Ces données suggèrent donc une adaptation différente de l'axe HPA chez ces deux groupes aux contextes sociaux contrastés. Les agneaux élevés avec un congénère pourraient être plus aptes à réguler la cortisolémie que les agneaux élevés avec un objet. Ces mécanismes pourraient inclure les feedbacks négatifs des GCs sur la production d'ACTH au niveau de l'hypophyse et la production de CRF dans l'hypothalamus mais aussi une modification de la densité et de la sensibilité des récepteurs aux GCs qui modulent la concentration basale en GCs (revues : [START_REF] Chrousos | Stressors, Stress and Neuroendocrine Integration of the Adaptative Response. The 1997 Hans Selye Memorial Lecture[END_REF]Chrousos & Gold, 1992).

Chez les individus élevés en groupe où aucune préférence sociale n'est montrée pour les congénères (Etude 3), la cortisolémie des agneaux élevés dans ce contexte par rapport aux agneaux maternés est plus forte à 14 jours puis plus basse à 21, 28 et 35 jours de vie. Ces résultats suggèrent que l'activation de l'axe HPA pourrait être plus intense dans les premiers jours de vie chez ces individus élevés en groupe sans figure préférentielle. Le feedback négatif pourrait aussi être plus fort et participer à cette hypocortisolémie, comme remarqué dans certain cas de dépression chez l'Homme [START_REF] Meewisse | Cortisol and post-traumatic stress disorder in adults Systematic review and meta-analysis[END_REF][START_REF] Yehuda | Low Urinary Cortisol Excretion in Patients with Posttraumatic Stress Disorder[END_REF]. Cette hypocortisolémie est parfois associée à une diminution de la sensibilité aux GCs [START_REF] Yehuda | Minireview : Stress-Related Psychiatric Disorders with Low Cortisol Levels : A Metabolic Hypothesis[END_REF]. La sensibilité du feedback aux GCs pourrait être testée chez les différents groupes d'agneaux élevés avec un substitut maternel ou maternés par injection de GCs et suivi de l'efficacité de la suppression de ces GCs au cours du temps. Babygirija et al., 2010Babygirija et al., , 2012 ; ;[START_REF] William | La mère, par sa présence particulièrement apaisante par rapport à des brebis étrangères (Gaudin et al., 2015) semble donc être une source de régulation du stress et potentiellement de sécrétion d'OT. Chez le mouton, l'influence de la mère sur la sécrétion d'OT plasmatique de l'agneau a été peu étudiée[END_REF]Dabrowska et al., 2011 ;Grippo et al., 2007 ;Neumann, 2002 ;[START_REF] Windle | Gonadal Steroid Modulation of Stress-Induced Hypothalamo-Pituitary-Adrenal Activity and Anxiety Behavior : Role of Central Oxytocin[END_REF]Zheng et al., 2010). Ces données renforcent par ailleurs l'hypothèse que les agneaux élevés avec un objet endurent une situation plus stressante que celle des agneaux élevés avec un congénère puisque la sécrétion plasmatique est altérée contrairement aux agneaux élevés avec un congénère.

Ce travail souligne donc l'importance des caractéristiques maternelles dans la mise en place de l'attachement et notamment de son expression secure chez l'ovin, ce qui n'avait encore jamais été clairement démontré chez d'autres modèles comme le primate, chez qui l'attachement avait été suggéré pour un substitut maternel ne procurant pas de soins comme un congénère ou un objet.

L

  'équipe de la plateforme CIRE: pour les prélèvements des cerveaux et des organes chez l'agneau et la brebis (« Technique et dextérité assurées ! »). Merci à toute l'équipe de l'ER1 : Elodie Chaillou, Frederic Lévy, Ludovic Calandreau, Aline Bertin, Léa Lansade, Cécile Arnourd, Christine Leterrier et Paul Constantin pour leur accueil chaleureux, leurs encouragements et leurs précieux conseils. Un grand merci aux (ex) docs et post-docs, Rebeca Corona, Emilie Perez, Ophélie Menant, Flore Lormant, Manon Chasles, Kevin Poissenot et Mélanie Jouhanneau ainsi qu'à Marie Lafaille, Maria Jose-Hurtado et Guenael Cabanes pour leur soutien qui m'a permis d'aller au bout de ce travail.

  Keywords: Attachment, Mother-young relationship, Maternal deprivation, Hypothalamus, Oxytocin, Corticoliberin. Table des matières Remerciements .......................................................................................................................4 Résumé ..................................................................................................................................6 Table des matières ................................................................................................................ Liste des tableaux ................................................................................................................. Liste des figures ................................................................................................................... Chapitre I : Attachement et développement de l'axe corticotrope et du système ocytocynergique, revue bibliographique ............................................................................... Attachement chez les mammifères .................................................................................... Nature et fonction de l'attachement ............................................................................... Mise en place de l'attachement pour la mère ................................................................. Mise en évidence de l'attachement et de sa qualité : Situation étrange ........................... Interaction avec la figure d'attachement et qualité du lien ............................................. Nature du lien affectif pour un substitut maternel .......................................................... Neurophysiologie du système de stress ............................................................................. Phénoménologie du stress ............................................................................................. Les principaux acteurs de la réaction au stress............................................................... Axe HPA ...................................................................................................................... Adaptation et dérégulation de l'axe HPA suite à des stress répétés ...............................

Figure

  Figure maternelle et développement de l'axe HPA ............................................................ Effets des interactions maternelles chez le rongeur ........................................................ Effets des interactions maternelles chez les autres espèces ............................................ Qualité de l'attachement et axe HPA ............................................................................. Système ocytocinergique .................................................................................................. Neurones à ocytocine, sécrétion et récepteurs................................................................ Stress et production d'ocytocine : stratégie d'adaptation ................................................ Comportement sociaux positifs, soins parentaux et liens sociaux .................................. Relation jeune-mère et système ocytocinergique ............................................................... Effets de la tétée et des stimulations tactiles de la mère ................................................. Séparations maternelles, substistuts maternels et qualité de l'attachement .....................

Figure

  Figure maternelle et développement de l'attachement, de l'axe HPA et du système ocytocinergique ................................................................................................................ Le mouton, Ovis aries, modèle pour l'étude de l'attachement ............................................

Figure 1 :

 1 Figure 1 : la proximité avec la mère joue un rôle fondamental dans la survie du jeune .........

Figure 2 :

 2 Figure 2 : illustration de la balance entre système exploratoire et système d'attachement. ....

Figure 3 :

 3 Figure 3 : Test de la Situation étrange développé par Ainsworth et ses collègues. ................

Figure 4 :

 4 Figure 4 : illustration des différents types de substituts maternels, inanimés ou sociaux, utilisés dans la littérature pour des modèles tel que le macaque réshus (Macaca mulatta) et l'agneau (Ovis aries). ................................................................................................

Figure 5 :

 5 Figure 5 : neuroanatomie du cerveau de mouton : emplacement du noyau paraventriculaire et du locus coeruleus impliqués dans la réponse au stress. .................................................

Figure 6 :

 6 Figure 6 : représentation schématique de la réponse de l'axe HPA lors d'un stress ...............

Figure 7 :

 7 Figure 7 : a) et b), exemples de marquages immunohistochimiques des neurones contenant le CRF dans le noyau paraventriculaire de l'hypothalammus (PVN) chez le mouton. ........

Figure 8 :

 8 Figure 8 : Neuroanatomie du cerveau de mouton : emplacement du cortex préfrontal, de l'amygdale et de l'hippocampe participant à la régulation de l'axe HPA. ......................

Figure 9 :

 9 Figure 9 : courbe sigmoïde de la dose-réponse entre l'intensité d'un stresseur et activité du système de stress. ..........................................................................................................

Figure 10

 10 Figure 10 : a) et b), exemples de marquage immunohistochique de neurones contenant de l'ocytocine dans le noyau paraventriculaire de l'hypothalamus (PVN) chez le mouton. .

Figure 11 :

 11 Figure 11 : schéma du récepteur de l'ocytocine. ...................................................................

Figure 12 :

 12 Figure 12 : couple monogame de campagnols des prairies avec sa portée. ............................

Figure 13 :

 13 Figure 13 : exemples de jeunes élevés en allaitement artificiel .............................................

Figure 14 :

 14 Figure 14 : gammes d'étalonnage obtenues sur les 3 jours d'expérience. ...............................

Figure 15 :

 15 Figure 15 : représentation graphique du profil d'exactitude obtenu à partir des échantillons surchargés. ..................................................................................................................

Figure 16 :

 16 Figure 16 : représentation graphique du profil d'exactitude obtenu à partir des échantillons dilués ou concentrés ....................................................................................................

Figure 17 :

 17 Figure 17 : effet des de l'EDTA, des congélation-décongélations sur la concentration d'OT mesurée et efficacité de l'élution. ................................................................................

Figure 18 :

 18 Figure 18 : concentration plasmatique d'ocytocine avant et après tétée chez l'agneau et la brebis. Les agneaux représentés en noirs sont des agneaux maternés. Les agneaux représentés en gris et numérotés sont les agneaux en allaitement artificiel. ..................

Figure 19 :

 19 Figure 19 : concentration plasmatique d'ocytocine des agneaux avant séparation et après réunion. ......................................................................................................................

Figure 20 :

 20 Figure 20 : violets de Crésyl et autoradiogrammes des OTRs sur les coupes d'utérus de brebis. .........................................................................................................................

Figure 21 :

 21 Figure 21 : violets de Crésyl et autoradiogrammes des OTRs sur les coupes de cerveaux de rats. .............................................................................................................................

Figure 22 :

 22 Figure 22 : violets de Crésyl et autoradiogrammes des OTRs sur les coupes de cerveaux d'agneaux. ..................................................................................................................

Figure 23 :

 23 Figure 23 : localisation du marquage des OTRs chez le rat.................................................

Figure 24 :

 24 Figure 24 : violets de Crésyl et autoradiogrammes des OTRs sur les coupes de cerveaux de brebis. .........................................................................................................................

Figure 1 :

 1 Figure 1 : la proximité avec la mère joue un rôle fondamental dans la survie du jeune

Figure 2

 2 Figure 2 : illustration de la balance entre système exploratoire et système d'attachement.

Figure 3 :

 3 Figure 3 : Test de la Situation étrange développé par Ainsworth et ses collègues. Dans une salle comportant des jouets, l'enfant est soumis à plusieurs situations de séparation et réunion avec sa figure d'attachement ou une personne non familière.

  soulèvent cependant un point important concernant l'effet d'ordre dans les séquences de séparation-réunion avec la figure familière et étrangère utilisées dans le protocole mis au point par Ainsworth. Une randomisation des séquences parait donc nécessaire pour évaluer correctement l'effet des séparations et réunions sur les comportements d'attachement et d'exploration.

Figure 4

 4 Figure 4 : illustration des différents types de substituts maternels, inanimés ou sociaux, utilisés dans la littérature pour des modèles tel que le macaque réshus (Macaca mulatta) et l'agneau (Ovis aries).

  figure inanimée par rapport à des individus maternés. Les interactions sociales en plus d'indices clés, semblent participer à l'établissement de ce premier lien et augmenter sa sélectivité, caractéristique d'un lien affectif. Cependant aucune étude n'a clairement montré si ce lien affectif diffère ou non de l'attachement. Il parait alors important de préciser le rôle des interactions sociales maternelles c'est-à-dire des comportements spécifiques de la mère envers son jeune (comme certains types de vocalisations, l'acceptation à la mamelle et les léchages chez certaines espèces) dans la formation et l'expression de ce lien particulier qu'est l'attachement. Ce point est d'autant plus important que, lorsque la figure est une figure maternelle procurant des soins, la qualité de l'interaction participe à la qualité secure ou insecure de l'attachement.

Figure 5 :

 5 Figure 5 : neuroanatomie du cerveau de mouton : emplacement du noyau paraventriculaire et du locus coeruleus impliqués dans la réponse au stress.

Figure 6 :

 6 Figure 6 : représentation schématique de la réponse de l'axe HPA lors d'un stress

Figure 7 :

 7 Figure 7 : a) et b), exemples de marquages immunohistochimiques des neurones contenant le CRF dans le noyau paraventriculaire de l'hypothalammus (PVN) chez le mouton.

Figure 8 :

 8 Figure 8 : Neuroanatomie du cerveau de mouton : emplacement du cortex préfrontal, de l'amygdale et de l'hippocampe participant à la régulation de l'axe HPA.

Figure 9 :

 9 Figure 9 : courbe sigmoïde de la dose-réponse entre l'intensité d'un stresseur et activité du système de stress. a) La courbe d'un individu réagissant normalement est indiquée en 1, une l'hyperactivité (hypensensibilité) de la réponse est indiquée en 2 et une hypoactivité (hyposensibilité) en 3. b) Courbe théorique entre l'état homéostasique (« bien être ») des individus 1, 2 et 3 suivant et l'activité du système de stress. D'aprèsChrousos & Gold, 1992.

  (OT) est une neurohormone de 9 acides aminés qui est majoritairement synthétisée au niveau central par des neurones magnocellulaires au niveau du PVN et du noyau supraoptique (SON) (rat : Vadesande et al., 1990a, b ; macaque : Kawata & Sano, 1982

  taupe nu : Valesky et al., 2012) (Figures 10).

D

Figure 10

 10 Figure 10 : a) et b), exemples de marquage immunohistochique de neurones contenant de l'ocytocine dans le noyau paraventriculaire de l'hypothalamus (PVN) chez le mouton.

Figure 11 :

 11 Figure 11 : schéma du récepteur de l'ocytocine. D'après Gimpl & Fahrenholz, 2001.

  . Comme chez le rat, l'OT chez l'Homme semble donc favoriser les interactions sociales positives en diminuant le stress et favorisant la mémorisation sociale. Ocytocine et mise en place d'un lien affectif : exemple du lien monogame L'OT est sécrétée de manière centrale et périphérique lors de la distension vaginale chez la femelle (mouton : Flint et al., 1975) et lors de l'éjaculation chez le mâle (rat : Hughes et al.,1987 ; Homme : Ogawa et al., 1980 ; lapin :[START_REF] Stoneham | Oxytocin and sexual behaviour in the male rat and rabbit[END_REF] Homme : Murphy, et al., 1987). L'OT dans la région du VTM induit l'érection pénienne chez le rat(Melis et al., 2007 ;[START_REF] Tang | Oxytocinergic and serotonergic innervation of identified lumbosacral nuclei controlling penile erection in the male rat[END_REF]. Chez les espèces monogames, développant un lien affectif pour le partenaire sexuel comme le campagnol des prairies (Microtus ochrogaster) et le campagnol des pins (Microtus pinetorium), l'OT en

Figure 12 :

 12 Figure 12 : couple monogame de campagnols des prairies avec sa portée.

  sécrétée lorsque le jeune est en contact rapproché avec sa figure maternelle, elle pourrait participer à la mise en place de l'attachement en facilitant la mémorisation des indices clés de la mère et en étant associée à un état d'apaisement, favorable au développement de l'attachement secure. . Si l'ingestion de lait donne lieu à une sécrétion d'OT centrale et périphérique, plusieurs études ont suggéré, comme dans le cas du lien mère-jeune, que l'OT pouvait être sécrétée lors d'interactions positives avec la figure d'attachement. Chez le rat et la souris, les soins aux jeunes et particulièrement les léchages influencent la sécrétion d'OT et la distribution des

  . Cependant les auteurs suggèrent un rôle possible du stress induit par cette manipulation en absence de la figure maternelle. Aux vues de ces données, aucune n'établit clairement une relation ente stimulation tactile de la mère et sécrétion d'OT périphérique. Des études complémentaires sont donc nécessaires notamment au niveau central pour comprendre l'implication des stimulations maternelles dans la sécrétion d'OT par le jeune et la formation du lien d'attachement.

  Figure maternelle et développement de l'attachement, de l'axe HPA et du système ocytocinergique

  figure adulte (Figure 13). L'élevage des jeunes dans ces conditions nécessite une présence ponctuelle humaine durant les 2 à 3 premiers jours de vie pour aider l'agneau à téter soit à une tétine reliée à un seau, soit à un distributeur de lait automatique. Cependant les jeunes sont rapidement autonomes n'ont plus besoin par la suite d'interventions directes du soigneur. Cette caractéristique est particulièrement intéressante pour l'étude de l'attachement et notamment pour les expériences de substituts maternels. Au contraire, chez le primate, des soins plus importants de la part des soigneurs sont nécessaires et les animaux sont dans un premier temps élevés au sein d'une nurserie avant d'être mis en contact avec le

Figure 13 :

 13 Figure 13 : exemples de jeunes élevés en allaitement artificiel

Etude 2 :

 2 Validation du dosage de l'ocytocine plasmatique ovine Résumé Dans le cadre de l'étude sur l'ocytocine (OT) plasmatique sécrétée dans différents contextes sociaux, nous avons vérifié l'efficacité du dosage de l'OT plasmatique chez le mouton, réalisé avec un kit ELISA commercialisé. L'OT étant présente en faible quantité dans le plasma, le dosage de l'OT plasmatique requiert une phase d'extraction et de concentration avant de pouvoir être exploitée par le kit (Szeto et al., 2011). Cette phase pourrait être source de variabilité et justifie donc la nécessité de valider cette méthode avant son utilisation. Dans cette étude nous avons utilisé des profils d'exactitude pour évaluer la justesse et la répétabilité du dosage. Cette méthode consiste en plusieurs dosage d'échantillons de plasma surchargés de différentes concentrations connues d'OT (niveaux) sur plusieurs jours et d'évaluer la variabilité de la mesure obtenue. Les profils d'exactitudes permettent de valider la méthode de dosage selon une certaine tolérance de variabilité fixée. L'OT est un peptide qui peut se Introduction L'ocytocine (OT) joue un rôle important au niveau du système nerveux central et est impliquée dans la plupart des comportements sociaux ainsi que dans la régulation du stress

  influencer la concentration d'OT lors du dosage par rapport à des prélèvements réalisés avec des tubes additionnés d'EDTA et d'aprotinine. Nous avons aussi évalué les conséquences des congélations-décongélations sur la concentration d'OT détectée. Matériels et méthode Prélèvement de sang et stockage des plasmas 15 brebis et leur agnelle ont été fournies par l'unité expérimentale de production animale (UEPAO, INRA val de Loire) et hébergées dans des cases individuelles (1 m X 2 m). Les brebis avaient accès à l'eau ad libitum et étaient nourries une fois par jour avec des granulés pour femelles en lactation et du foin. Les cases d'hébergement étaient paillées tous les jours pour garder la litière propre. Les prises de sang ont été réalisées au niveau de la veine jugulaire dans des vacutainers héparinés de 5 ml. Pour 3 agnelles et 3 mères, un deuxième prélèvement a été effectué dans un tube additionné d'EDTA et d'aprotinine. Après prélèvement, les tubes ont été immédiatement mis dans la glace et centrifugés à 3600 g pendant 15 minutes à 4°C dans les 30 à 60 minutes suivant le prélèvement. Les plasmas sont ensuite été conservés à -20°C. Plan d'expérience des profils d'exactitudes Deux profils d'exactitude ont été réalisés, l'un à partir de différentes concentrations d'ocytocine ajoutées (provenant d'une solution mère d'OT fournie par le kit de 10 000 pg/ml) et l'autre à partir de différentes quantités de plasma extrait permettant de faire varier la concentration d'ocytocine présente après extraction, sans OT exogène. Pour chaque profil, nous avons dosé 3 concentrations (niveaux), 3 fois lors du dosage et répété la procédure durant 3 jours. Pour limiter le nombre de congélations-décongélations, et avoir un pool de plasma suffisant, quelques échantillons de plasma ont été décongelés, poolés et distribués en différents aliquotes. Pour le premier profil d'exactitude nous avons utilisé trois aliquotes de

Figure 14 .

 14 Figure14. Les gammes couvrent un domaine compris entre 7,8 et 1000 pg/ml. La moyenne des coefficients de variation (CV) intra-essai est de 1,1%, la moyenne des CV inter-essai pour les gammes est de 2,9%.

Figure 14 :

 14 Figure 14 : gammes d'étalonnage obtenues sur les 3 jours d'expérience. Chaque point représente la moyenne des doublons de l'essai

Tableau 4 :

 4 résultats du profil d'exactitude sur les échantillons dilués ou concentrés. Niveau 1: niveau basal (NB)/2, niveau 2: NB * 2, niveau 3: NB *3.

Figure 16 :

 16 Figure 16 : représentation graphique du profil d'exactitude obtenu à partir des échantillons dilués ou concentrés

Figure 17 :

 17 Figure 17 : effet des de l'EDTA, des congélation-décongélations sur la concentration d'OT mesurée et efficacité de l'élution.

  Ocytocine plasmatique avant et après tétée Les résultats montrent une augmentation significative de la concentration plasmatique d'OT après tétée chez les agneaux (test de Wilcoxon, W=45, p=0,004, Figure 18a) et les brebis (Wilcoxon, W=21, p=0,03, Figure 18b).

Figure 18 :

 18 Figure 18 : concentration plasmatique d'ocytocine avant et après tétée chez l'agneau et la brebis. Les agneaux représentés en noirs sont des agneaux maternés. Les agneaux représentés en gris et numérotés sont les agneaux en allaitement artificiel.

  , Nowak R 1,2,3,4 * 1 INRA, UMR85 Physiologie de la Reproduction et des Comportements, Nouzilly, France 2 CNRS, UMR7247 Physiologie de la Reproduction et des Comportements, Nouzilly, France 3 Université François Rabelais de Tours, Tours, France 4 Institut Français du Cheval et de l'Equitation, Nouzilly, France 5 LIPN, Université Paris 13, Villetaneuse, France (Manuscrit en préparation pour Animal Behaviour) Résumé Chez l'Homme et plus généralement le primate, la figure d'attachement maternelle joue un rôle important dans le comportement d'exploration du jeune et dans le développement de ses préférences sociales. Chez l'ovin, la mère est un point de rencontre qui permet au jeune de développer de nouveau liens sociaux avec ses frères et soeurs par exemple. Chez cette espèce dont les liens sociaux entre femelles pourraient jouer un rôle important dans la cohésion du groupe philopatrique, le rôle de la mère dans le développement des liens préférentiels pour des congénères non apparentés de même âge reste peu exploré. Dans cette étude nous avons évalué l'influence de la présence des mères dans le développement des préférences pour des jeunes femelles de même âge. Nous avons comparé le développement, lors de la 2 e et 3 e semaines de vie, des préférences et des évitements entre jeunes agneaux femelles de même âge élevés soit en troupeau avec leur mère soit absence précoce de la mère en allaitement artificiel. Cette pratique de séparation maternelle précoce est par ailleurs couramment employée en élevage. La perturbation de la formation des liens sociaux est un facteur conduisant le plus souvent à une dérégulation du système de stress. Nous avons donc par ailleurs comparé la cortisolémie basale des agneaux élevés dans ces différentes conditions sociales au cours de leurs 35 premiers jours de vie. Les résultats montrent que seuls les agneaux maternés développent des préférences et des évitements pour les congénères de même âge au cours des 2 semaines d'observation. La cortisolémie basale semble aussi différer entre les groupes : à 14 jours les agneaux élevés en allaitement artificiel ont une cortisolémie plus élevée que les agneaux maternés. Cependant à 21, 28 et 35 jours de vie les agneaux en allaitement artificiel ont une cortisolémie plus basse. Les résultats de cette étude montrent donc l'importance des caractéristiques d'une figure maternelle dans la mise en place d'une forte préférence pour celle-ci et dans le développement de relations préférentielles avec des congénères de même âge non apparentés. L'absence de figure adulte pourrait conduire à une situation de stress précoce impliquant une dérégulation de l'axe HPA et une hypocortisolémie.IntroductionIn most ungulate species, adult females form philopatric group with offspring (red deer, Cervus elaphus: Clutton-Brock,[START_REF] Clutton-Brock | Red Deer. Behaviour and ecology of two sexes[END_REF] bighorn sheep, Ovis canadensis: Festa-Bianchet, 1991; Geist, 1971; social antelopes: Jarman, 1974; white-tailed deer, Odocoileus virginianus: Mathews & Porter, 1993) whereas males associate with other males outside their natal home range (domestic sheep, Ovis aries: Arnold, Wallace, & Rea, 1981; Michelena, Henric, Angibault, Gautrais, Lapeyronie, Porter, Deneubourg, Bon, 2005; American bison, Bison bison: Lott, 1991; grey kangaroos, Macropus fuliginosus: MacFarlane & Coulson, 2009; Mediterranean mouflon, Ovis gmelini: Cransac, Gerard, Maublanc & Pépin,1998; isard, Rupicapra pyrenaica: Richard-Hansen, 1993; impala, Aepyceros melampus:

Figure 1 :

 1 Figure 1: determination of associated individual using security camera

Figure 2 :

 2 Figure 2: associations between individuals in mothered lambs group during the second week of life

Figure 3 :

 3 Figure 3: associations between individuals in the mothrered lambs group during the third week of life

Figure 4 :

 4 Figure 4: sociograms of associations between female lambs

Figure 5 :

 5 Figure 5: plasma CORT level in mothrered (MR) and peer-reared (PR) lambs from 3 to 35 days of age

RésuméL

  figures (mère, agneau ou objet familier) dans un environnement nouveau lors d'un test adapté de préférence de place conditionnée. Les résultats montrent la mise en place d'un lien d'attachement secure pour la mère chez les agneaux maternés. Chez les agneaux élevés avec un congénère, un lien affectif, s'établit pour la figure contrairement aux agneaux élevés avec un objet, où aucun lien affectif n'a pu être mis en évidence. Le lien pour l'objet parait particulièrement plus faible que le lien formé pour la mère ou le congénère puisque, contrairement aux deux autres groupes, la présence de l'objet n'induit pas de préférence de place conditionnée. Les agneaux élevés avec un congénère montrent une altération de la réactivité de l'axe HPA. Contrairement aux agneaux maternés, ils montrent une élévation du CORT lors d'une séparation avec la figure à 5 jours. A 21 jours, l'augmentation du CORT plasmatique suite à une séparation est retardée par rapport aux agneaux maternés. Alors que les séparations-réunions ne semblent pas influencer la concentration d'OT périphérique, les agneaux élevés en absence de figure maternelle montrent des taux élevés d'OT plasmatique à 5 jours. Les données suggèrent donc une modification de l'axe HPA et du système ocytocinergique qui pourrait être liée à un stress précoce en absence de figure maternelle. La mère, par ses indices et comportements spécifiques, pourrait donc permettre la mise en place de l'attachement et participer au maintien de l'homéostasie de ces deux systèmes chez le jeune.

  figure for another 30 minutes. Then, the familiar figures were taken out and transferred into another room to avoid vocal communication with peers or mothers. The tested lambs remained alone in their familiar home pen for 30 minutes and a second blood sample was taken in the middle of this period to evaluate CORT and OT concentrations during separation.

Fig. 1

 1 Fig.1 Schematic representation of the separation-reunion protocol in the home pen

  following separation was measured by comparing the number of high-pitched bleats emitted 3 minutes before and 3 minutes after separation. Appeasement during the reunion, was assessed by comparing the vocalization rate (per min) during isolation to the number of high-pitched bleats emitted in the minute following the reunion. concentrations were analyzed at the laboratory of hormone assays (Laboratoire de dosages hormonaux, UMR85 Physiologie de la Reproduction et des Comportements, INRA -Centre Val-De-Loire, 37380 Nouzilly, France). OT was enzyme immunoassayed with a commercial kit (Oxytocin EIA kit Enzo Life Science) adapting on sheep a method developed by Szeto et al.

Fig. 2

 2 Fig.2 Schematic representation of arena and procedure used in the Strange Situation

  ). During the conditioning phase, one holding pen restrained the familiar figure, the other one contained familiar features (straw, heating lamp) mimicking the home environment. Lambs were tested 5 days after the Strange Situation test.

Fig. 3

 3 Fig.3 Schematic representation of the Conditioned Place Preference Like arena and photographs of the procedure

Fig. 4

 4 Figure identity 203657 1 75.22 p<0.001

Fig. 5

 5 Fig.5 Distress vocalizations emitted before and during separation in the home pen.

Fig. 6

 6 Fig.6 Affiliative behaviors performed after reunion in the home pen. a) Time spent in passive contact with the familiar figure, b) Time spent in active contact with the familiar figure, c) Time spent sniffing the familiar figure. Mothered lambs are represented in black ( ), peer-reared lambs in dark grey ( ) and object-reared lambs in light grey ( ).Within group comparison: bars with different letters are statistically different (p<0.05). Between groups comparison: * = p<0.05. Trends (0.05<p<0.09) are indicated with the p-value associated.

Fig. 7

 7 Fig.7 Plasma levels of CORT (a) and OT (b) during separation-reunion in the home pen.

Fig. 8

 8 Fig. 8 Behaviors displayed in the Strange Situation. a) Distress vocalizations; b) Olfactory explorations; c) Proximity seeking. Mothered lambs are represented in black ( ), peer-reared lambs in dark grey ( ) and object-reared lambs in light grey ( ).Within group comparison: bars with different letters are statistically different (p<0.05). Between groups comparison: * = p<0.05.

Fig. 9

 9 Fig. 9 Extinction curves of the preference for the area conditioned by the familiar figure presence.

  lambs were reared in from birth yielded different conclusions in terms of characteristics of the bond developed with their familiar figure. Mothered lambs meet all three criteria of attachment:[START_REF]un premier temps nous avons utilisé l'OVTA-I 125 pour mettre en évidence la présence éventuelle d'OTRs chez l'agneau au niveau de l'amygdale centrale et du subiculum, connus pour être spécifiquement marqués chez la majorité des espèces étudiées et présentant de l'ARNm de l'OTR chez la brebis[END_REF] selective distress responses and increase of CORT during separation;[START_REF] Guldenaar | Un échantillon de cerveaux de rat contenant le VMH et l'amygdale centrale est utilisé comme contrôle. Matériels et méthode partie 1 Animaux et collecte des échantillons Deux rats adultes, 1 brebis adulte et 6 agneaux âgés de 6 mois provenant de la plateforme d'élevage de l'INRA val de Loire[END_REF] proximity-seeking and contact-maintaining with the mother; (3) use of the mother as a secure base to explore the environment, even in the presence of an unfamiliar ewe. Peer-reared lambs also develop an affectional bond for their peer, source of reward like the mother, however it differs from attachment in its developmental course, behavioral and cortisol distress responses to separation, proximity-seeking pattern with the peer and secure base effect. Concerning object-reared lambs, even though they recognized the ball as familiar, their psychoendocrine response in the various separation-reunion situations does not support the existence of an affectional bond. It can even be concluded from the conditioned place preference-like test that the familiar ball has no specific rewarding values, it just another element of the home pen. In sheep like in primates, the absence of a maternal figure generates a stressful context for the infant, and neither animate nor unanimated substitute can overcome it. The neuroendocrine system regulating stress responses and affiliative behaviors are deeply dysregulated in peerand object-reared lambs. Specific maternal cues and behavior contributes to appeasing the neonate, fulfilling its need and contributing to the development of a sense of security which organize attachment and exploration systems.Etude 5 : Axe HPA et système ocytocinergique chez des agneaux élevés avec un congénère ou un objet comme substitut maternel (Manuscript en préparation pour psychoneuroendocinology)

Résumé

  Chez les mammifères, la mère est généralement la première figure d'attachement et son effet apaisant et sécurisant régule le système de stress du jeune. Dans cette étude nous faisons l'hypothèse que les individus élevés en absence de figure maternelle avec un congénère ou un objet, qui développent par ailleurs un lien qui diffère de l'attachement, montrent en parallèle une altération centrale et périphérique de l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HPA) ainsi que du système ocytocinergique. Dans cette étude nous avons de plus vérifié si un lien pouvait se développer pour le soigneur humain. Des agneaux femelles ont été élevés dans les mêmes conditions que l'étude précédente : un groupe d'agneaux maternés, un groupe d'agneaux séparés de la mère dès la naissance et élevés avec soit un congénère de même âge soit un objet. Pour mettre en évidence la présence d'un lien affectif pour la figure proposée et pour le soigneur nous avons réalisé un protocole de séparations-réunions dans l'environnement familier et évalué la présence de comportements de détresse lors d'une séparation et la recherche de proximité lors d'une réunion. Dans un second temps, nous avons suivi et comparé la concentration du cortisol (CORT) et l'ocytocine (OT) plasmatique de 24 heures à 18 jours de vie. A 21 jours, nous avons dénombré par une méthode d'immunohistochimie les neurones contenant de la corticolibérine (CRF) et de l'OT dans le PVN et le noyau supraoptique (SON). Les agneaux élevés avec un congénère présentent une altération de la détresse lors d'une séparation ainsi que l'altération de la recherche de proximité lors de la réunion. Les agneaux élevés avec un objet ne semblent pas réagir à la séparation avec la figure mais plutôt au départ du soigneur, indiquant un lien particulier pour cette figure contrairement aux deux autres groupes. Les agneaux élevés avec un substitut non maternel (congénère ou objet) ont des concentrations de CORT plus élevées que les agneaux maternés 24 heures après la naissance ainsi qu'une concentration plus importante d'OT plasmatique à 5 jours de vie. A 21 jours, les agneaux élevés avec un substitut montrent moins de neurones contenant du CRF et plus de neurones contenant de l'OT dans le PVN. Ces résultats suggèrent une stimulation précoce de l'axe HPA (24 heures) et ocytocinergique (5 jours) en absence de figure maternelle, qui pourrait conduire à une réduction de la production de CRF et une augmentation de la production d'OT dans le PVN à 21 jours. Par ses caractéristiques physiques et comportementales, permettant le développement de l'attachement, la figure maternelle participe donc à la régulation de l'axe HPA et du système ocytocinergique.

  HPA axis and OT system, counting the number of CRF immunoreactive(-ir) neurons in the PVN and the number of OT-ir neurons in the PVN and SON at 3 weeks of age. In addition to alteration of attachment behaviors for the maternal substitute, if the absence of the mother attachment figure represents a stressful context, peer-and object-reared lambs may show transitory or more prolonged plasma CORT and OT elevation. We expect also central modification of the activity of both systems with increase of activity reflect byhigher number of CRF and OT containing neurons, particularly in the PVN where OT regulates the CRF secretion. Materials and method 1. Animals and housing A group of 24 post-parturient Ile-de-France ewes was selected from a flock lambing in an indoor facility at the INRA research centre (UEPAO n°1297, EU0028, INRA Centre Val de

  figure, could influence distress vocalisations during separation. In fact, as human caregivers are particularly present during the first day of life, a bond could develop for this figure even though human presence is very limited the second week. Human interventions during the separation-reunion protocol may induce distress when they leave the pen, and confounding effect with those due to separation with the familiar figure. To normalize the effect of such interventions, a human caregiver first entered the pen during 30 seconds and left (before the separation phase). Two minutes later, the human entered the pen again to withdrawn the familiar figure which was taken to another room for 2 minutes while the tested lamb remained alone in its familiar home pen (separation phase). Finally the familiar figure was reunited for

Figure 1 :

 1 Figure 1: Timeline of the experiment and separation-reunion test

Figure 2 :

 2 Figure 2: Schematic drawings of the different levels of sections through the SON (in grey) and the PVN (in black) studied from the rostral to the caudal part. *, third ventricule; AC, anterior commissure; OC, optic chiasma, F, fornix; ME, median eminence; PVN, paraventricular nucleus; SON, supraoptic nucleus.

  of the bond with the familiar figure1.1 Distress vocalizations during separationThe number of high-pitched bleats varied across phases (sum square = 4768.60; df = 2, F = 48.41, P<0.0001) and groups (sum square = 410.60, df = 2, F = 4.16, P = 0.03) with a significant interaction between the two (sum square = 2822.70, df = 4, F=14.33, P<0.0001).

1. 2

 2 Contact seeking and sniffing with the familiar figureThe time spent in active contact with the figure was dependent upon the phase considered but not the group (before separation vs reunion: sum square = 405; df = 2, F = 6.42, P = 0.03).Within group comparisons revealed that, contact seeking increased only in mothered lambs (t = 2.40, df = 5.92, P = 0.05, Figure3b). Time spent sniffing the familiar figure differed between group (sum square = 204.38; df= 2, F=6.43, P = 0.009) and across phase (Sum square= 131.48; df = 1, F = 8.27, P = 0.01) with a tendency to interact between the two (sum square= 106.28; df = 2, F =3.34, P = 0.06). Upon reunion, mothered lambs and peer-reared lambs increased their time spent sniffing the familiar figure (mother, t = 2.91, df = 5.06, pvalue = 0.03; peer: t = 2.92, df = 8.59, P = 0.01). As a consequence, peer-reared lambs spent more time sniffing their familiar figure than mothered (t = 3.36, df = 6.34, P = 0.007) and object-reared lambs (t = 2.80, df = 8.29, P = 0.007, Figure3c).

Figure 3 :

 3 Figure 3: Attachment behaviors during separation-reunion test

Figure 4 :

 4 Figure 4: HPA axis in mothered and maternally deprived lambs

Figure 5 :

 5 Figure 5: oxytocinergic system in mothered and maternally deprived lambs

  . L'absence de figure maternelle chez des agneaux élevés avec un congénère ou un objet induit une élévation du cortisol lors des premières 24 heures de vie et une altération de la production d'ocytocine (OT) centrale et périphérique. En accord avec ces résultats, les agneaux élevés en absence de figure maternelle pourraient montrer une modification de la distribution des OTRs centraux. La distribution centrale des OTRs a été particulièrement bien étudiée par la méthode d'autoradiographie chez plusieurs espèces (revue : Tribollet et al., 1992 ; Tableau 1). La majorité de ces études utilise l'ornithine vasotocine, antagoniste selectif aux OTRs, couplée à l'iode 125,( I 125 -d(CH2)5[Tyr(Me)2, Thr4, Orn8, [I125]Tyr9-NH2]) (OVTA-I 125 ), mais l'OT tritiée (OT-H 3 ) est aussi parfois utilisée, les deux techniques donnant des résultats très proches

  chez l'agneau élevé en absence de figure maternelle, nous avons exploré dans cette étude pilote, la distribution des OTRs dans le cerveau d'ovin en utilisant l'OVTA-I 125 et l'OT-H 3 . brebis) : 1 coupe sur 10 a été montée sur des lames Superfrost pour l'autoradiographie et une coloration au violet de Crésyl réalisé toutes les 5 coupes. Couplage entre l'OVTA et I 125 50 µg d'iodogène et 3 µl d'iode 125 (4MBq) ont été ajouté à 50 µg d'OVTA repris dans 60 µl de tampon phosphate. Après agitation pendant 2 minutes, la solution a été injectée dans la chaine HPLC avec comme phase mobile une solution constituée de 35% d'acétonitrile, 65% de TFA 0.1% et un débit de 1150 psi. Le pic correspondant à l'OVTA monoiodé a été récupéré (pic à 17 minutes, 1ml environ), repris dans 10 ml d'eau déminéralisée et passé dans une Sep-Pak C18 (Waters) préalablement régénérée avec 0.5 ml d'éthanol 95°C puis 10 ml d'eau distillée. 1 ml d'éthanol 95°C a été ensuite passé dans la colonne pour éluer et récupérer l'OVTA-I 125 . La solution contenant l'OVTA-I 125 a été ensuite aliquotée en échantillons de 60 µl, évaporés et conservés à -20°C. Autoradiographie des OTRs chez l'agneau Six coupes de 5 agneaux différents contenant l'amygdale centrale et le subiculum ont été utilisées dans cette étude et marqués avec l'OVTA-I 125 (81.4 TBq / mmol). Les coupes adjacentes ont été utilisées pour déterminer la spécificité du marquage par compétition avec de l'OT où, en plus de l'OVTA-I 125 , 1 µM d'OT a été ajouté. 8 coupes de cerveau de rat, et leur coupes adjacentes ainsi qu'une coupe d'utérus de brebis et une coupe adjacente ont été utilisés comme contrôle pour chacune des conditions. Les lames ont été sorties puis laissées à décongeler pendant une heure. Elles ont ensuite été réhydratées pendant 1 heure dans un bain de tampon Tris (50 nM Tris, 5 nM Mgcl 2 , pH = 7.4) à 4°C.avant d'être mises à incuber dans des bains de tampon Tris additionnés d'albumine de sérum bovin (Tris-BSA : 50 nM Tris, 5 nM Mgcl 2 , 1% BSA, pH = 7.4) et de 0.05 nM d'OVTA-I 125 . Les coupes adjacentes ont été utilisées pour la compétition avec l'OT et mise à incuber dans des bains de tampon Tris-BSA contenant 0.05 nM d'OVTA-I 125 et 1 µM d'OT. Après deux rinçages en bains de 5 minutes dans le tampon Tris à 4°C et un rinçage d'une minute à l'eau distillée froide, les lames on été séchées à la verticale sous un courant d'air froid toute la nuit. Les coupes ont ensuite été exposées sur des films photographiques Biomax, (Kodac) dans des cassettes pendant 72 heures avant d'être révélés. Résultats et discussion partie 1 La coupe d'utérus marquée à l'OVTA-I 125 montre un marquage au niveau du myomètre et des cellules épithéliales de l'endomètre. L'ajout de l'OT non marquée dans l'expérience de compétition diminue le signal dans ces zones (Figure 20).

Figure 20 :

 20 Figure 20 : violets de Crésyl et autoradiogrammes des OTRs sur les coupes d'utérus de brebis. Marquage avec l'OVTA-I 125 (50 pM) et compétition avec 1 µM d'OT. Les flèches indiquent les zones spécifiquement marquées. EE, cellules épithéliales de l'endomètre ; End, Endomètre ; My, Myomètre.

Figure 21 :

 21 Figure 21 : violets de Crésyl et autoradiogrammes des OTRs sur les coupes de cerveaux de rats. Marquage avec l'OVTA-I 125 (50 pM) et compétition avec 1 µM d'OT. Les flèches indiquent les zones spécifiquement marquées ; CeA, amygdale centrale ; CP, putamen caudé ; PV, noyau thalamique paraventriculaire ; S, subiculum ; VMH, noyau ventromédian de l'hypothalamus ; 3V, troisième ventricule.

Figure 22 :

 22 Figure 22 : violets de Crésyl et autoradiogrammes des OTRs sur les coupes de cerveaux d'agneaux. Marquage avec l'OVTA-I 125 (50 pM) et compétition avec 1 µM d'OT. Cd, noyau caudé ; CeA, amygdale centrale ; OpT, tractus optique ; Put, Putament ; S, subiculum .

  et dans notre cas, ne pas se lier aux récepteurs avec une forte accroche non spécifique. Matériel et méthode partie 2 Pour répondre aux deux points précédents, nous avons étudié la distribution des OTRs en comparant le marquage obtenu avec l'OVTA-I 125 avec celui obtenu en utilisant l'OT-H 3 . Nous avons étudié, en plus de l'amygdale et du subiculum, les zones de la bande de Broca et du noyau basal de Meynert, noyaux marqués chez les primates (Tableau 1). Six coupes de cerveau de brebis contenant les zones d'intérêt ont été sélectionnées pour le marquage des OTRs : l'une avec 0.05 nM d'OVTA-I 125 (81.4 TBq / mmol) et l'autre avec 3 nM d'OT-H 3 (Perkin Elmer, activité spécifique : 1.8 TBq / mmol). Les deux coupes adjacentes à celles sélectionnées ont été utilisées pour déterminer la sélectivité des ligands par compétition en ajoutant respectivement 2 µM ou 10 µM d'OT. 1 coupe de cerveau de rat contenant l'amygdale et le VMH a été ajoutée comme contrôle pour chaque condition. Après 1 heure de décongélation à température ambiante, les lames ont été réhydratées pendant 1 heure dans un bain de tampon Tris à 4°C (50 nM Tri, 5 nM Mgcl 2 , pH = 7.4). Les lames ont été mises à incuber en chambre humide en couvrant chaque coupe de cerveau et d'utérus de brebis de 500 µl et chaque coupe de cerveau de rat de 250 µl de tampon Tris-BSA (50 nM Tri, 5 nM Mgcl 2 , 1% BSA, pH = 7.4) et pour chaque condition de 1) 0.05 nM d'OVTA-I 125 2) .0.05 nM d'OVTA-I 125 et 2 µM d'OT 3) 3 nM d'OT-H 3 4) 3 nM d'OT-H 3 et 10 µM d'OT. Après deux rinçages en bains de 5 minutes dans le tampon Tris froid et un rinçage d'une minute à l'eau distillée froide, les lames ont été séchées à la verticale sous un courant d'air froid toute la nuit avant d'être exposées au béta-imageur pendant 72 heures. Résultats et discussion partie 2 Le marquage avec l'OVTA-I 125 du cerveau de rat montre des marquages au niveau de l'amygdale centrale et du VMH. Ces marquages s'éteignent en présence d'OT non marquée. Pour les coupes incubées avec l'OT-H 3 , l'amygdale centrale, le VMH sont marqués et le signal est réduit en présence d'OT (Figure 23). Contrairement au marquage avec l'OVTA-I 125 , une partie de l'hippocampe dorsal est aussi marqué avec l'OT-H 3 , l'ajout d'OT n'éteignant pas complétement le signal. Un effet de bords est aussi observé.

Figure 23 :

 23 Figure 23 : localisation du marquage des OTRs chez le rat

Figure 24 :

 24 Figure 24 : violets de Crésyl et autoradiogrammes des OTRs sur les coupes de cerveaux de brebis. Marquage avec l'OVTA-I 125 (50 pM) et l'OT-H 3 (3 nM) ; compétition avec respectivement 2 µM ou 10 µM d'OT. Cd, noyau caudé ; Put, Putamen ; NBma, noyau basal de Meynert ; hBDB et vBDB bande de broca horizontale et verticale ; VL, ventricule latéral ; Am, Amygdale ; OpT, tractus optique ; ic, îlots de Calleja ; OpT, tractus optique.

  suggère fortement la présence de ces récepteurs dans le PVN et SON. Chez le rat, une étude propose que l'absence de marquage dans ces zones soit associée à un second type d'OTRs qui auraient une affinité plus faible pour son ligand (Freund-Mercier, 1987). De la même manière, les OTRs centraux chez l'ovin pourraient montrer une plus faible affinité pour l'OT que les OTRs périphériques. 2) Finalement, et de manière complémentaire, il est aussi possible que la distribution des OTRs centraux chez l'ovin soit moins dense que celle des OTRs présents dans les différents noyaux du cerveau de rat ou au niveau de l'utérus de brebis, donnant un marquage plus diffus. 3) un blocage de la liaison par l'internalisation des récépteurs qui n'aurait pas lieu dans le tissus périphérique pourrait aussi être envisagée. En conclusion, la méthode d'autoradiographie classiquement utilisée chez plusieurs espèces pour marquer les OTRs avec l'OVTA-I 125 et l'OT-H 3 ne semble pas adéquate pour mettre en évidence les OTRs centraux de l'ovin. Une méthode d'immunohistochimie utilisant un anticorps spécifique aux OTRs ovin pourrait être utilisée pour détecter la présence de ces récepteurs au niveau cellulaire, et permettre le marquage même lorsque l'affinité du récepteur avec son ligand est faible. Ces résultats remettent de plus en question la possibilité d'utiliser l'OVTA-I 123 dans une étude de scintigraphie in vivo.

  figure entraine une sécrétion de l'OT centrale, une augmentation de l'OT plasmatique pourrait être détectée plus tardivement (après 15 minutes), suite à la diffusion du peptide dans la circulation générale en vue de sa dégradation. D'autres études sont donc nécessaires pour étudier la dynamique de libération de l'OT dans le plasma suite à des réunions apaisantes avec la figure d'attachement ainsi que la sécrétion centrale d'OT dans ce contexte.

  et b). Pourtant la présence d'un lien pour cette figure pourrait influencer la mise en place du lien pour la figure proposée ainsi que la mise en place de l'axe HPA, notamment de par les nombreuses séparations que l'agneau subit avec le soigneur. Il parait donc important de prendre en compte la qualité de la relation entre l'individu et le soigneur pour les études futures.

  figure, comme observé chez les agneaux maternés (à 5, 15 et 21 jours de vie). Cette altération de la valeur sécurisante du contact avec la figure pourrait refléter une difficulté de reconnaissance du partenaire suite à la séparation, et un besoin de discrimination olfactive en plus d'indices visuels et auditifs. En plus de ces altérations de l'expression de l'attachement, les séparations effectuées dans la case de vie à 5 et 21 jours suggèrent que les animaux élevés avec un congénère mettent plus de temps à construire ce lien affectif pour la figure. En effet les vocalisations de détresse augmentent entre 5 et 21 jours ce qui n'est pas le cas des agneaux

  pourrait donc diminuer la capacité de mémorisation de la figure et le lien pourrait donc mettre plus de temps à se construire et être moins sécurisant que l'attachement pour la mère. L'absence de caractéristiques maternelles ne permet donc pas l'établissement rapide d'un lien d'attachement mais permet, lorsque la proximité entre deux individus est favorisée, le développement d'un lien affectif qui met plus de temps à se mettre en place. Ce lien affectif diffère de l'attachement et particulièrement de l'attachement secure par le fait que la figure n'a pas un rôle organisationnel du système d'attachement et d'exploration, et par le fait que l'apaisement n'est pas lié avec une recherche de contact direct avec la figure. Axe HPA chez les individus élevés avec un substitut maternel -L'absence de figure maternelle conduit-elle à une situation d'adaptation révélée par une hypo-ou hyperactivité de l'axe HPA? Lorsque les agneaux sont séparés de la mère dès la naissance et élevés en binôme avec un objet ou un congénère, les individus montrent une plus forte cortisolémie basale 24 heures après la naissance que les individus maternés. Nos données suggèrent que, rapidement après la naissance, l'attraction et la proximité avec une figure maternelle engendre un contexte apaisant qui limite la sécrétion de GCs induite par la parturition. Ce contexte apaisant pourrait être induit par plusieurs facteurs : 1) la présence des indices saillants de la mère, 2) les comportements maternels particuliers qui ont lieu les premières 24 heures de vie du jeune comme les léchages et les vocalisations basses de la mère et 3) la tétée couplée aux indices adéquates de la mère. Par la suite, la cortisolémie des animaux élevés avec un congénère ne diffère plus de celle des agneaux maternés, ce qui suggère une forte régulation de l'axe HPA entre 24 et 72 heures de vie. Cette régulation de la cortisolémie basale pourrait inclure une augmentation des mécanismes de feedback négatifs et participer à l'absence de différence de cortisolémie basale avec les individus maternés, souvent observée chez le macaque rhésus

L

  figure maternelle. Cette plus forte activité centrale et le plus fort taux plasmatique basal à 5 jours suggère une réponse physiologique d'adaptation à un stress chronique. Elle pourrait par ailleurs jouer un rôle au niveau du PVN dans la réduction du CRF produit comme montré chez le rongeur (rat :Babygirija et al., 2010Babygirija et al., , 2012 ; ;[START_REF] William | La mère, par sa présence particulièrement apaisante par rapport à des brebis étrangères (Gaudin et al., 2015) semble donc être une source de régulation du stress et potentiellement de sécrétion d'OT. Chez le mouton, l'influence de la mère sur la sécrétion d'OT plasmatique de l'agneau a été peu étudiée[END_REF] Dabrowska et al.,

  La présence d'un congénère comme substitut maternel permet cependant la mise en place d'un lien affectif, qui diffère de l'attachement par le manque de recherche de contact lors d'une réunion apaisante, une dissociation entre système exploratoire et comportements de détresse qui n'est pas observée dans le cas du système d'attachement. Contrairement à ce qui avait été suggéré par Cairns (1966a et b), si un lien de familiarité s'instaure pour l'objet, ce lien ne peut pas être qualifié d'attachement ni de lien affectif puisque le contexte familier de la case de vie semble aussi important que la figure inanimée et de ce fait la figure n'a pas une importance particulière et un caractère unique. Ce lien pourrait être qualifié de lien de familiarité. Malgré sa faible présence, les animaux élevés avec un objet semblent développer un lien envers le soigneur et subissent donc potentiellement d'avantage de période de stress liées aux nombreuses séparations avec le soigneur et ses absences répétées. Il est donc nécessaire pour les futures recherches sur le développement de liens pour des objets, de prendre en considération un tel phénomène. Ce travail montre par ailleurs l'importance de la présence de la figure maternelle et la qualité du lien formé dans la maturation de l'axe HPA, ainsi que son rôle dans une période d'hyporéponse autour de 5 jours de vie, aussi décrite chez le rat et l'enfant. Ce travail souligne par ailleurs le rôle de la figure d'attachement maternelle dans l'activité précoce du système ocytocinergique central en minimisant son activité périphérique. L'absence de figure d'attachement maternelle chez l'ovin conduit en effet à une hyperactivité basale de l'axe HPA à 24 heures de vie, suivie par une hyporéactivité révélée notamment lors d'une séparation avec le congénère, et une réduction du nombre de neurones contenant le CRF dans le PVN. Cette altération suggère un stress néonatal suivi d'une période d'adaptation. En parallèle, le système ocytocinergique est hyperactivé, particulièrement chez les individus élevés avec un objet, et les deux groupes d'agneaux privés de figure maternelle montrent plus de neurones contenant de l'OT dans le PVN. Ces données montrent pour la première fois, en plus de l'altération de l'axe HPA, l'activation du système ocytocinergique pour faire face à une situation de stress chronique que représente l'absence de figure maternelle. Ces résultats ouvrent la voie à l'étude de cette plasticité neurophysiologique adaptative et de ses conséquences sur le large panel de comportements dans lequel ils sont impliqués (comportements sociaux, maternels, sexuels, relations affiliatives, comportements alimentaires…), mais aussi les éventuelles pathologies analogues à la dépression qui pourraient se développer chez les individus montrant ce type d'altération.

  . Chez toutes les espèces étudiées, la majorité du CRF est localisée au sein des neurones parvocellulaires du PVN et au niveau de la médulla. Cependant, contrairement aux neurones du PVN, les autres neurones extra hypothalamiques contenant du CRF semblent varier d'une espèce à l'autre. Chez le rat par exemple, d'autres neurones extra-hypothalamiques sont capables de sécréter du CRF dans le noyau supraoptique (SON), l'amygdale, le bulbe olfactif, le globus pallidus (GP), le lit du noyau de la strie terminale (BNST) et le noyau préoptique médian (MPOA)

  Guilhem, Bideau, Gerard, Maublanc, & Pépin, 2006; American bison:Rothstein & Griswold, 1991; impala: Murray, 1981; chital deer, Axis axis: Schaller, 1967; bighorn sheep: Geist, 1968; Grant's gazelle, Nanger granti:Walther, 1972; pronghorn, Antilocapra americana: Kitchen, 1974; African buffalo:Korte, 2008) interacting among themselves with more agonistic and pseudosexual behaviours than juvenile females (reviews on ungulates:Lent, 1974; Pérez-Barbería & Yearsley, 2010; domestic sheep: Guilhem, Bideau, Gerard, & Maublanc, 2000; Sachs & Harris, 1978; American bison: Rothstein & Griswold, 1991; bighorn sheep: Hass & Jenni, 1993). In contrast, neither avoidance of males by young females nor preferred associations among juvenile females have ever been demonstrated (Mediterranean mouflon:Guilhem et al., 2006; Le Pendu, Briedermann, Gerard, & Maublanc, 1995; Siberian ibex, Capra sibirica

Table 1 .

 1 Results of the LMER models used.

	Sum. Sq: Sum square. Significant threshold: # trend, p<0.09; significant *,
	p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001

reunion tests in the home pen

	Passive contact before separation
	Age	55168	1	14.92	p<0.001	***
	Group	31123	2	4.20	0.02	*
	Active contact before separation
	Age	1644.55	1	5.09	0.03	*
	Vocalizations during separation
	Phase	2219.60	1	30.53	p<0.001	***
	Group	1908.80	2	13.12	p<0.001	***
	Age	434.69	1	5.97	0.01	*
	Phase*Group	2357.53	2	16.21	p<0.001	***
	Age*Phase	312.02	1	4.29	0.04	*
	Age*Group*Phase	365.07	2	2.51	0.08	#
	Passive contact during reunion
	Group	1186.64	2	3.74	0.02	*
	Active contact during reunion
	Age	420.77	1	9.0264	0.005	**
	Group	266.04	2	2.85	0.07	#
	Sniffing during reunion
	Group	1785.11	2	26.65	p<0.001	***
	Cortisol
	Age	3.16	1	26.62	p<0.001	***
	Phase	2.25	2	9.48	0.001	**
	Oxytocin
	Age	0.13	1	4.47	0.03	*
	Group*Age	1.30	2	22.45	p<0.001	***
	Strange Situation
	Distress vocalisations
	Phase	14493.30	2	44.90	p<0.001	***
	Phase*Group	2088.30	4	3.23	0.01	*
	Olfactory exploration
	Phase	452	2	16.38	p<0.001	***
	Group	70	2	2.57	0.09	.
	Time spent in the contact zones

dégrader facilement (chaleur, lumière...). Plusieurs études recommandent l'utilisation de tubes additionnés d'aprotinine et d'EDTA pour limiter cette dégradation ainsi que le stockage du plasma à -20°C avant le dosage. Dans la mesure où, lors de nos expériences, les tubes sont rapidement mis dans la glace à l'obscurité puis centrifugés dans les 30 à 60 minutes après le prélèvement, nous avons évalué si l'utilisation de tubes héparinés pouvait influencer la concentration d'OT lors du dosage. Nous avons aussi évalué les conséquences des congélations/décongélations sur la concentration d'OT détectée. Les résultats valident notre méthode de dosage pour une concentration plasmatique entre 6,25 pg/ml et 450 pg/ml, (concentration plasmatique de 1,6 pg/ml à 112 pg/ml) avec une limite d'acceptation de 30% et une limite de tolérance de 80%. L'utilisation de tubes héparinés n'influence pas le dosage par rapport à des tubes additionnés d'EDTA et d'aprotinine parfois utilisés. La concentration d'OT augmente après deux cycles de congélation/décongélation. L'OT plasmatique augmente dans les premières minutes suivant la tétée chez la mère et chez le jeune cependant, l'isolement pendant 15 minutes, ainsi que la réunion avec une brebis étrangère avec la mère pendant 1 minute, n'induisent pas d'augmentation de l'OT plasmatique.

Conditioned-Place-Preference-Like Test

Chapitre IV : Discussion

Remerciements

Acknowledgments

We thank the staff of the experimental farm UEPAO (Nouzilly, France) for the daily care provided to the animals and Dr Emilie Pérez and Dr Vincent Furstoss, Statistician at the INRA research station in Lusignan (France), for their help with the statistical analysis. Thank you to Denise Nowak for corrections to the English and Benjamin Lherminier for video analysis. This work was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR BOND.007, no. NT09 492885) and was made possible through support from the GDR2822 'Ethologie'.

Acknowledgment

We thank the staff of the experimental farm UEPAO (Nouzilly, France) for providing us animals and the Laboratory of hormones dosages for the cortisol dosage. This work was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR BOND.007, no. NT09 492885) and was made possible through support from the GDR2822 ''Ethologie''.

Acknowledgments

We thank the staff of the experimental farm UEPAO (Nouzilly, France) for providing daily care to the pregnant and parturient ewes. We thank the personal from the laboratory of hormone assays (Laboratoire de dosages hormonaux, Nouzilly, France) for the CORT assay and Anne-Lyse Lainé for the OT assay. This work was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR BOND.007, no. NT09 492885) and was made possible through support from the GDR2822 ''Ethologie''.

Acknowledgment

We thank the staff of the experimental farm UEPAO (Nouzilly, France) for providing us animals. We thank the plateform CIRE for their aid to collect brain sample. We thank also the Laboratory of hormones dosages for the cortisol and oxytocin dosage. This work has benefited from the facilities and expertises of the "Plateforme d'imagerie Cellulaire" (PIC) of the UMR-PRC. We thank Philipe Ciofi and Pierre-Guy Marnet for providing CRF an OT antibodies.This work was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR BOND.007, no. NT09 492885) and was made possible through support from the GDR2822 ''Ethologie''.

Abstract

The maternal attachment figure plays an important role in the exploratory behaviour of the young primate and in the development of its social preferences. In sheep, the mother is a meeting point that permits the young to develop new social bonds for siblings in addition to the attachment with the mother. However, in this species in which social bonds between females could play an important role in the cohesion of philopatric group, the role of the mother in the development of preferential bonds for same age unrelated female peers remains little explored. In this study we evaluated the influence of the presence of mothers on the development of preferences and avoidances between juvenile unrelated female lambs. A comparison was performed during the second and third weeks of life between females reared with their mother or without adult figure under artificial rearing conditions. Because disturbance in the formation of social bonds is a factor influencing the dysregulation of the stress system, we also compared basal cortisol levels in lambs reared in these different social conditions. The results show that only mothered lambs developed preferences and avoidances for same age female peers during the second and third weeks of life and no selective bond was established for a particular peer in artificially reared lambs. Basal cortisol values also seemed to differ between groups. At 14 days artificially reared lambs had higher levels than mothered lambs. However at 21, 28 and 35 days of life, artificially reared lambs had lower plasma cortisol levels. The results of this study show the importance of a maternal figure in the establishment of a strong preference for her and in the development of preferential relationships for same age unrelated peers. The absence of such figure in artificially reared lambs could represent a stressful rearing condition which leads to alteration of the HPA axis activity and hypocortisolemia. Keywords: artificial rearing, associations, attachment, cortisol, peer-reared, sheep

Abstract

In mammals, the mother is generally the primary attachment figure and her appeasing presence and contact decreases the stress state of the infant and allows it to explore its environment. We hypothesized that, in addition to influence the development of the hypotalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis, implicated in the stress response, attachment for the maternal figure influence the oxytocinergic system that participates to appeasement and down-regulation of HPA axis. To explore this hypothesis we compared plasma cortisol (CORT) and corticotropin-releasing factor (CRF) immunoreactive (-ir) neurons in the paraventricular nucleus of the hypothalamus (PVN) in addition to plasma oxytocin (OT) and OT-ir neurons in the PVN and supra optic nucleus (SON) in maternally deprived lambs reared with a peer or an object figure that develop a less secure bond than the infant-mother attachment. Both maternally deprived groups had higher level of plasma CORT at 24 hours and presented alteration of attachment behaviors at 15 days of age. At 21 days of age, peerreared lambs had lower CRF-ir neurons in the PVN than mothered lambs whereas, in objectreared lambs, the number of CRF-ir neurons was only lower in the first medial part of the PVN. Both maternally deprived groups had also higher plasma OT level at 5 days of age and more OT -ir neurons in the PVN than mothered lambs. These results suggest an early

Abstract

In mammals, attachment to the mother is characterized by a secure effect of the presence of such figure which allows the young to explore its environment. Several studies have suggested that attachment bond could develop for mother surrogates such as peers or objects. This thesis shows through the evaluation of attachment key features in lambs, the absence of attachment in motherless lambs for a same-aged peer or an object. The alteration of attachment in these individuals is associated with a modification of the hypothalamic-pituitaryadrenal (HPA) axis and the oxytocinergic system: peer-and object-reared lambs show physiological sign of stress 24h after birth, reflected at the central level by a decrease of the number of neurons containing corticoliberin and increase of those containing oxytocin at 21 days of age. This study suggests a soothing effect of the mother figure that could facilitate the establishment of attachment and influence the development of the HPA axis. This work also suggests the involvement of oxytocin in the young to cope with stressful early social context.

Keywords: Attachment, Mother-young relationship, Mother surrogate, Hypothalamus, Oxytocin, Corticoliberin