Véronique Kervella

Santoni Née
email: santoniv@ensam.inra.fr

J.-C Kader

Liste de publications

Articles publiés dans des revues à comité de lecture 1. Rossignol M, Kervella V et Blein J-P (1989) Octylglucoside reconstitution of plasma membrane H + -translocating ATPase from corn roots Plant Physiol. Biochem. 27: 437-441.

2. [START_REF] Santoni | Differential auxin sensitivity of proton translocation by plasma membrane H + -ATPase from tobacco leaves[END_REF] Differential auxin sensitivity of proton translocation by plasma membrane H + -ATPase from tobacco leaves Plant Sci. 68: 33-38. 3. Santoni V, Vansuyt G et Rossignol M (1991) The changing sensitivity to auxin of the plasma membrane H + -ATPase: relationship between plant development and ATPase content of membranes Planta 185: 227-232 4. Santoni V, Vansuyt G et Rossignol M (1993) -Dr G. Amodeo (programme ECOS-Sud, CONICET, Université de Buenos-Aires, Argentine). Caractérisation post-traductionnelle des aquaporines du tonoplaste d'Arabidopsis. La réponse de la cellule à une hormone est déterminée à la fois par la concentration de l'hormone et la sensibilité de la cellule, facteurs qui traduisent la présence fonctionnelle des entités impliquées dans le mode d'action de l'hormone. Au cours de ma thèse, j'ai mené une approche comparative des étapes membranaires de réception et de transduction du signal auxine au cours du développement du tabac. Cette approche a été menée in vitro, sur des fractions de MP, et la réponse à l'auxine a été appréciée par l'effet de l'hormone sur l'activité vectorielle de l'ATPase. L'ensemble des résultats a donné lieu à quatre publications (notées 1 à 4).

Articles publiés dans des revues sans comité

Contrats sur appel d'offres

Résultats

Mode d'action de l'auxine : l'auxine exerce plusieurs types d'effets selon sa concentration [START_REF] Santoni | Differential auxin sensitivity of proton translocation by plasma membrane H + -ATPase from tobacco leaves[END_REF]):

-à faible concentration, le transport de protons est stimulé et cet effet met en jeu la chaîne de réception/transduction.

-A des concentrations intermédiaires, la stimulation disparaît. Un point remarquable est que ceci s'observe quelle que soit la sensibilité du système étudié et semble ainsi indissociable de l'effet stimulateur qui le précède à plus faible concentration.

-A des concentrations supérieures à 100 µM, l'auxine inhibe le transport de protons en perturbant la perméabilité membranaire.

Les seuls éléments bien caractérisés de la chaîne de réception/transduction du signal auxine étaient l'ABP (Auxin Binding Protein) et la H + -ATPase. Après purification de l'ATPase ainsi que d'une protéine (p2) sans homologie de séquence avec l'ABP mais présentant une activité de fixation d'auxine, nous avons obtenu des sérums polyclonaux contre ces protéines. Des dosages immunologiques ont montré que l'abondance de ces protéines varie au cours du développement de la plante (Santoni et al. 1991) mais qu'aucune des deux protéines ne contrôle entièrement la sensibilité à l'auxine. Par contre la variation du rapport de l'abondance de ces protéines rappelle celle de la sensibilité suggérant que ces deux éléments sont liés de façon fonctionnelle dans la variation de sensibilité de l'ATPase à l'auxine au cours du développement.

La disposition de différentiels de sensibilité autorise une approche biochimique comparative tant descriptive que fonctionnelle. Par cartographie en gel d'électrophorèse bidimensionnelle (EBD) de protéines de MP extraite de tabacs aux principaux stades physiologiques (végétatif, induit à la floraison, floral), nous avons identifié des polypeptides spécifiques de stades de développement de la plante. Ces résultats montrent que des caractéristiques biochimiques distinguent des systèmes de sensibilité différente.

Biologie du développement : nous avons démontré qu'il existe des gradients temporels de la sensibilité à l'auxine [START_REF] Santoni | Differential auxin sensitivity of proton translocation by plasma membrane H + -ATPase from tobacco leaves[END_REF][START_REF] Rossignol | Changing membrane sensitivity to auxin during plant development[END_REF] type WT [START_REF] Delarue | Cristal mutations in Arabidopsis confer a genetically heritable, recessive, hyperhydric phenotype[END_REF][START_REF] Santoni | A comparison of two-dimensional electrophoresis data with phenotypical traits in Arabidopsis leads to the identification of a mutant (cri1) that accumulates cytokinins[END_REF]) alors que les teneurs en auxine et en acide abcissique sont identiques. Le mutant cri1, qui montre des symptômes de vitrification, accumulerait des cytokinines à la suite d'un défaut de signalisation de cette hormone.

En résumé, ces deux études illustrent la pertinence d'une approche protéomique comparative pour l'étude de mutants de développement.

Protéome de la membrane plasmique d'Arabidopsis

L'émergence d'un thème nouveau dans l'équipe de M. Caboche -la caractérisation du continuum paroi/MP/cytosquelette -m'a conduit par la suite à développer l'approche de cartographie bidimensionnelle au niveau des protéines de la MP et de la paroi. Ce projet a été soutenu par un programme européen débuté au 01/12/95. Rossignol.

Plant Plasma membrane database : un protéome de protéines extrinsèques

Objectifs

L'ensemble des résultats a donné lieu à 3 publications (notées 11 à 13).

Résultats

L'étude protéomique de la MP nécessite d'évaluer la pureté de la fraction purifiée.

L'utilisation de marqueurs enzymatiques spécifiques de membranes cellulaires a montré que les membranes plasmique, mitochondriale, tonoplastique et golgienne représentent respectivement 83 %, moins de 1 %, 13 % et 4 % de la fraction membranaire purifiée (Santoni et al. 1998). Ces résultats, similaires à ceux obtenus sur des fractions membranaires de MP purifiées par partage de phase [START_REF] Larsson | An introduction to the plant plasma membrane -its molecular composition and organization[END_REF]), montraient un net enrichissement en MP de la fraction purifiée.

20

L'analyse comparative par EBD des MPs de feuille et de racine m'a permis de mettre en évidence deux populations distinctes de protéines: l'une est spécifique de chacun des tissus et l'autre (60 % des protéines de chaque carte) représente des protéines présentes à la fois dans les deux types de MP. Cette deuxième catégorie constitue ainsi une population de protéines constitutives de la MP (Santoni et al. 1999). De plus, l'analyse comparative des gels d'EBD des fractions solubles et plasmalemmiques montre que des protéines peuvent avoir plusieurs localisations subcellulaires et que leur association avec la MP dépend du type d'organe (Santoni et al. 1998;Santoni et al. 1999). Par ailleurs j'ai aussi montré que le protéome de MP foliaire est modifié au cours de la journée. L'ensemble de ces résultats mettait ainsi en évidence une dynamique de la MP.

Dans le cadre du projet PPMdb, une analyse transcriptomique d'ARNm correspondant à des protéines de la MP avait été engagée par l'équipe de J. Hoheisel (Heidelberg, Allemagne). La comparaison de l'évolution au cours de la journée, des niveaux d'expression de 73 protéines de la MP et des transcrits correspondants a montré l'absence de corrélation entre l'abondance des protéines et celle des transcrits correspondants. Ce résultat confirmait les résultats obtenus à l'époque sur deux autres études (la levure et le rat), où une corrélation d'à peine 0.4 était mesurée entre ces deux paramètres.

L'identification des protéines de ce protéome a été réalisée à l'aide de gels préparatifs d'EBD utilisant les composants classiques de solubilisation des protéines ie CHAPS et urée, compatibles avec la focalisation des protéines. Le séquençage de 104 protéines (Santoni et al. 1998;Santoni et al. 1999) décrit chez l'AQP NOD26 de la membrane péribactéroïdienne de nodules de soja [START_REF] Guenther | Phosphorylation of soybean nodulin 26 on serine 262 enhances water permeability and is regulated developmentally and by osmotic signals[END_REF]) et chez PM28A de la MP d'épinard [START_REF] Johansson | Water transport activity of the plasma membrane aquaporin PM28A is regulated by phosphorylation[END_REF]. Par contre, le degré de phosphorylation des AQPs animales module plutôt leur localisation subcellulaire [START_REF] Marinelli | Secretin induces the apical insertion of aquaporin-1 water channels in rat cholangiocytes[END_REF][START_REF] Madrid | Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clatrhrin-adaptator complexes[END_REF][START_REF] Huebert | Expression and localization of aquaporin water channels in rat hepatocytes. Evidence for a role in canalicular bile secretion[END_REF][START_REF] Ishikawa | The muscarinic acetylcholine receptor-stimulated increase in aquaporin-5 levels in the apical plasma membrane in rat parotid acinar cells is coupled with activation of nitric oxide/cGMP signal transduction[END_REF][START_REF] Brown | The ins and outs of aquaporin-2 trafficking[END_REF] en interagissant avec des séquences d'adressage localisées en N-et C-terminal de l'AQP [START_REF] Van Balkom | Role of cytoplasmic termini in sorting and shuttling of the aquaporin-2 water channel[END_REF]). Ainsi, dans les cellules rénales, le trafic de l'AQP AQP2 de vésicules intracellulaires vers la MP est finement régulée par la phosphorylation du résidu Ser286 par une protéine kinase [START_REF] Kamsteeg | The subcellular localization of an aquaporin-2 tetramer depends on the stoichiometry of phosphorylated and non phosphorylated monomers[END_REF][START_REF] Van Balkom | The role of putative phosphorylation sites in the targeting and shuttling of the aquaporin-2 water channel[END_REF]. De plus, à l'intérieur d'un tétramère, la stoechiométrie relative de monomères d'AQP2 phosphorylés ou non phosphohorylés détermine précisemment la localisation de l'AQP2 [START_REF] Kamsteeg | The subcellular localization of an aquaporin-2 tetramer depends on the stoichiometry of phosphorylated and non phosphorylated monomers[END_REF].

D'autres modifications post-traductionnelles récemment décrites sont des déterminants importants de la régulation de l'expression des AQPs et de leur fonction. Ainsi, la glycosylation de la boucle C d'AQP2 régule son expression à la surface de la cellule [START_REF] Hendricks | Glycosylation is important for cell surface expression of the water channel aquaporin-2 but is not essential for tetramerization in the endoplasmic reticulum[END_REF]). Chez les plantes, la redistribution intracellulaire d'une TIP (McTIP1;1) en réponse à un choc osmotique dépend aussi de la glycosylation de la protéine [START_REF] Vera-Estrella | Novel regulation of aquaporins during osmotic stress[END_REF]). Dans les fibroblastes humains, un stress hyperosmotique réduit l'ubiquitination de l'AQP AQP1 augmentant ainsi sa stabilité [START_REF] Leitch | Altered ubiquitination and stability of aquaporin-1 in hypertonic stress[END_REF].

Ces données suggèrent l'existence de régulations post-traductionnelles multiples agissant tant au niveau du gating que de celui de la localisation des AQPs. Dans ce contexte, je me suis intéressée aux processus moléculaires qui pourraient rendre compte de la modulation du transport racinaire d'eau par des stress environnementaux.

L'ensemble de ces travaux à conduit à cinq publications [START_REF] Santoni | The high diversity of aquaporins reveals novel facets of plant membrane functions[END_REF](18)(19)(20)22) et un article soumis (25). L'application des techniques que j'avais préalablement développées pour l'étude des protéines membranaires par EBD ( § 4), a permis de montrer qu'une seule AQP PIP peut se présenter sous de multiples formes, de points isoélectriques différents, suggérant l'existence de modifications post-traductionnelles (MPTs) [START_REF] Santoni | A proteomic study reveals novel insights into the diversity of aquaporin forms expressed in the plasma membrane of plant roots[END_REF]

Résultats et

Projet de recherche

Etant donnée l'originalité des observations concernant la méthylation des AQPs PIPs, le projet de recherche que je compte développer s'appuiera en grande partie sur ces résultats. Il s'articulera principalement autour de deux axes que sont la caractérisation des activités de type méthyltransférase modifiant PIP2;1 ainsi que la caractérisation des protéines interagissant avec PIP2;1 en fonction du degré de modification (notamment de méthylation) de l'extrémité N-terminale. De plus, l'analyse des profils de MPTs des AQPs en fonction de conditions environnementales modulant l'activité de ces protéines, sera poursuivi. La capacité de ces enzymes à méthyler la Lys3 de la partie N-terminale de PIP2;1 sera testée in vitro par un test radioactif d'incorporation de 3 H-S-adenosylméthionine dans un peptide N-terminal de PIP2;1. Le peptide modifié sera analysé par spectrométrie de masse pour identifier le nombre de groupements méthyl incorporés dans le peptide. Ce nombre correspond à un incrément de masse de 14 Da par groupement. On étudiera différents types de séquences N-terminales en plus de la version non modifiée. On évaluera notamment si la présence d'un méthyl sur le glutamate en position 6 affecte la méthylation de Lys3.

Purification de méthyltransférases

L'approche précédente ne donne accès qu'à des méthyltransférases de Lys et pourrait même s'avérer infructueuse puisque certaines méthyltransférases ne possèdent pas de domaine SET. On mettra donc en place en parallèle une approche biochimique alternative pour la purification de méthyltransférases, modifiant soit Lys3 soit Glu6, à partir d'extraits protéiques de racines et de cellules. La priorité sera donnée à l'étude des cellules pour lesquelles nous disposons déjà d'un grand nombre de données biochimiques et fonctionnelles.

Des fractions membranaires brutes seront utilisées comme une source potentielle d'activité. La présence d'activité méthyltransférase sera évaluée de la même façon que précédemment par marquage in vitro d'un peptide N-terminal en présence de 3 H-Sadénosylméthionine. Par la suite, la SM permettra de déterminer précisément la spécificité de l'enzyme étudiée (nombre de groupements méthyl incorporés et type du résidu méthylé).

Les enzymes seront ensuite purifiées par fractionnement séquentiel et/ou chromatographie, séquencées par SM et les gènes correspondants seront clonés. Des versions fusionnées à une étiquette 6-His seront ensuite produites en bactérie et leurs propriétés enzymatiques seront caractérisées en détail (voir § suivant).

Paramètres cinétiques et spécificité des méthyltransférases

Les paramètres cinétiques (Km, Vm) des activités méthyltransférases identifiées seront finement évalués selon un test basé sur la quantification de l'homocystéine (Hcy), produit de la réaction d'hydrolyse de la S-adénosylméthionine. La concentration en Hcy est déterminée par la conjugaison spécifique de son groupement SH à une sonde fluorescente.

Cette technique a déjà permis de déterminer les paramètres cinétiques de deux méthyltransférases d'histones [START_REF] Collazo | A coupled fluorescent assay for histone methyltransferases[END_REF].

Par la suite on s'intéressera à la capacité de ces enzymes à méthyler une ou plusieurs AQPs et d'une façon plus générale à la spécificité de substrat de ces enzymes (voir § 5.2.4.).

Fonction des méthyltransférases

Plusieurs stratégies seront menées pour comprendre la fonction des méthyltransférases, notamment l'étude de leur localisation subcellulaire et de leur profil d'expression in planta. systématique de recherche de partenaires en interaction avec AQP2, un complexe multiprotéique a été isolé comportant un ensemble de protéines supposées constituer la machinerie du trafic d'AQP2 dans la cellule [START_REF] Barile | Large Scale Protein Identification in Intracellular Aquaporin-2 Vesicles from Renal Inner Medullary Collecting Duct[END_REF]Noda et al. 2005 ).

La

Dans ce contexte, l'identification des partenaires en interaction avec la partie Nterminale de PIP2;1 devrait permettre de mieux comprendre les mécanismes qui modulent la localisation subcellulaire des AQPs PIP.

Purification des complexes protéiques

Dans l'étude décrite en

Pull-down

Nous envisageons, dans un premier temps, de trier plusieurs types de fractions protéiques (totale, microsomale, soluble) quant à la présence de protéines en interaction, par la technique du BIACORE (Biomolecular interaction analysis). La fixation entre la molécule en solution et le ligand immobilisé (ici, un peptide PIP2 ;1) provoque un changement de l'index de réfraction [START_REF] Malmqvist | Biomolecular interaction analysis: affinity biosensor technologies for functional analysis of proteins[END_REF] indicatif de la présence d'une interaction. Le couplage du BIACORE avec un spectromètre de masse permettrait d'identifier les protéines en interaction [START_REF] Lopez | Improved sensitivity of biomolecular interaction analysis mass spectrometry for the identification of interacting molecules[END_REF]. Il est à noter que deux appareillages BIACORE sont disponibles sur la génopole Languedoc-Roussillon.

Dans le pull-down, les peptides immobilisés seront incubés avec les extraits protéiques d'intérêt. Les protéines en interaction seront ensuite décrochées, séparées par électrophorèse SDS-PAGE et identifiées par SM. On dressera ainsi un inventaire des protéines en interaction avec la partie N-terminale de PIP2;1 selon le degré de méthylation de cette extrémité. Ce type de stratégie s'est avéré efficace pour étudier les régulations liées à la méthylation de la Lys4 de l'histone H3 et a permis d'élucider le rôle de la protéine WDR5 dans la méthylation de Lys4 et ses conséquences fonctionnelles sur la transcription de certains gènes [START_REF] Wysocka | WDR5 associates with histone H3 methylated at K4 and is essential for H3 K4 methylation and vertebrate development[END_REF].

L'avantage de cette approche est la possibilité de tester un grand nombre de peptides modifiés. Par contre sa limitation réside dans le fait que les protéines sont extraites et donc sorties de leur contexte cellulaire pour être incubées en présence des peptides appâts. Ceci pourrait conduire à identifier des protéines qui n'interagissent pas avec PIP2;1 in vivo mais qui se retrouvent en contact artéfactuel lors du pull-down du fait de l'homogénéisation des extraits.

Chromatographie d'affinité

L'utilisation d'anticorps génériques reconnaissant une étiquette fusionnée à la protéine d'intérêt permet de limiter les problèmes de spécificité d'anticorps. Il existe de nombreux types d'étiquettes difficiles à comparer entre elles faute d'études à ce sujet. Dans le cas du TAP-tag (Tandem Affinity Purification) [START_REF] Rigaut | A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration[END_REF]), l'étiquette, fusionnée à la protéine d'intérêt, contient une séquence de protéine A, un site de clivage protéasique (TEV) et une séquence peptidique à forte affinité pour la calmoduline [START_REF] Dziembowski | Recent developments in the analysis of protein complexes[END_REF]. Cette technique a été peu utilisée chez les plantes [START_REF] Rivas | The Cf-9 disease resistance protein is present in an approximately 420-kilodalton heteromultimeric membrane-associated complex at one molecule per complex[END_REF][START_REF] Rohila | Improved tandem affinity purification tag and methods for isolation of protein heterocomplexes from plants[END_REF][START_REF] Witte | Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope[END_REF][START_REF] Rubio | An alternative tandem affinity purification strategy applied to Arabidopsis protein complex isolation[END_REF]) mais a récemment été améliorée [START_REF] Rohila | Improved tandem affinity purification tag and methods for isolation of protein heterocomplexes from plants[END_REF][START_REF] Rubio | An alternative tandem affinity purification strategy applied to Arabidopsis protein complex isolation[END_REF] Les problèmes liés à l'utilisation du TAP-tag sont sa grande taille qui peut interférer avec la fonction de la protéine étiquetée et la durée de la purification (>1 jour) qui peut affecter l'intégrité des protéines, et diminuer le rendement des protéines en interaction faible.

Une méthode récente, basée sur l'utilisation d'une plus petite étiquette unique (de 8 acides aminés), le Strep-II tag, permettant la purification en seulement quelques heures [START_REF] Witte | Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope[END_REF]) semble être un bon compromis entre rendement et qualité [START_REF] Lichty | Comparison of affinity tags for protein purification[END_REF].

La purification de protéines en interaction avec une protéine transmembranaire est peu documentée. Ceci tient à l'incompatibilité à simultanément solubiliser les protéines transmembranaires et maintenir le complexe de protéines en interaction. On utilisera donc plutôt comme appât, la séquence correspondant à la partie N-terminale de PIP2;1 fusionnée avec une étiquette. Ces constructions seront surexprimées de façon stable dans des suspensions cellulaire d'Arabidopsis. A ce stade, le profil de MPTs des peptides sera évalué par SM. Les protéines en interactions seront purifiées, séparées et identifiées par SM.

L'avantage de cette approche est la possibilité d'isoler les complexes protéiques à partir d'un contexte in vivo. Le rendement de purification de ces complexes peut être amélioré en utilisant in vivo des ponteurs chimiques tels que la formaldéhyde [START_REF] Rohila | Improved tandem affinity purification tag and methods for isolation of protein heterocomplexes from plants[END_REF]). Par contre, un problème majeur sera l'absence de localisation membranaire du peptide. De plus, il faudra évaluer la stabilité cellulaire du peptide et envisager, si nécessaire, de le coupler à une protéine permettant de le stabiliser in vivo. D'autre part, seul un pourcentage du peptide sera modifié in vivo, ce qui risque d'entraîner l'isolement de protéines en interaction à la fois avec le peptide modifié et non modifié.

Validation des complexes protéiques

Ces approches peuvent conduire à identifier un grand nombre de protéines qu'il est nécessaire de valider de façon biochimique et fonctionnelle. D'autre part, elles sont basées sur l'interaction entre un peptide N-terminal de PIP2;1 et une ou plusieurs autres protéines. Il sera donc nécessaire de valider aussi l'interaction avec l'AQP PIP2;1 entière.

Validation in vitro

Plusieurs types de stratégies seront menées pour valider les interactions. L'utilisation de peptides portant divers degrés de méthylation constitue en soi un contrôle de spécificité d'interaction. Cependant on peut anticiper qu'une protéine puisse interagir avec différents types de peptides mais dans des proportions variées. La quantification de ces proportions constituera donc un critère essentiel de spécificité.

Dans la technique du western-ligand blot, les protéines séparées par électrophorèse et transférées sur membrane, sont incubées en présence de peptides radioactifs. Ces profils autoradiographiques seront comparés quant à la nature du peptide utilisé ainsi qu'aux profils études ultérieures. Compte tenu des résultats obtenus chez les AQPs animales, on identifiera probablement des protéines impliquées dans la signalisation et le trafic cellulaire. Ainsi, l'AQP AQP2 interagit directement avec une isoforme d'actine (Noda et al. 2004b) et SPA1, une protéine contenant un domaine PDZ (Noda et al. 2004a). Dans une étude plus globale basée sur l'immunopurification d'AQP2, un complexe de 11 protéines incluant les deux protéines précédentes ainsi que des protéines du cytosquelette a été isolé (Noda et al. 2005).

La plupart des protéines identifiées ayant une affinité pour l'actine, leur interaction avec AQP2 est supposée être indirecte, via l'actine. Par ailleurs, l'extrémité C-terminale de l'AQP AQP4 interagit directement, par un motif tyrosine, avec une protéine de la machinerie d'internalisation des protéines de la MP (AP2) provoquant ainsi l'endocytose d'AQP4 [START_REF] Madrid | Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clatrhrin-adaptator complexes[END_REF]). On peut aussi imaginer caractériser des enzymes modifiantes telles que des phosphatases, des kinases ou des méthyltransférases.

Dans tous les cas, la fonction des partenaires de PIP2;1 sera étudiée par le biais de l'étude de leur localisation subcellulaire et de leur expression tissulaire, déterminées par des stratégies similaires à celles décrites pour les méthyltransférases ( § 6.1.2). Des mutants d'Arabidopsis inactivés pour ces gènes seront recherchés et analysés quant à leurs profils de localisation subcellulaire de PIP2;1.

Intégration des données dans un contexte physiologique

Notre groupe a montré que diverses conditions environnementales telles que le traitement

  Indoleacetic acid pretreatment of tobacco plants in vivo increases the in vitro sensitivity to auxin of the plasma membrane H + -ATPase from leaves and modifies the polypeptide composition of the membrane FEBS Lett. 326: 17-20 5. Santoni V, Bellini C et Caboche M (1994) Use of two-dimensional protein pattern analysis for the characterization of Arabidopsis thaliana mutants Planta 192: 557-566 6. Feiler H, Desprez T, Santoni V, Kronenberger J, Caboche M et Traas J (1995) The higher plant Arabidopsis thaliana encodes a functional CDC48 homologue which is highly expressed in dividing and expanding cells EMBO J. 14: 5626-5637 7. Santoni V, Delarue M, Caboche M et Bellini C (1997) A comparison of two-dimensional electrophoresis data with phenotypical traits in Arabidopsis leads to the identification of a mutant (cri1) that accumulates cytokinins Planta 202: 62-69 8. Delarue M, Santoni V, Caboche M et Bellini C (1997) cristal mutations in Arabidopsis confer a genetically, heritable, recessive, hyperhydric phenotype Planta 202: 51-61 18. Maurel C, Javot H, Lauvergeat V, Gerbeau P, Tournaire C, Santoni V, Heyes J (2002) Molecular physiology of aquaporins in plants. In Molecular mechanisms of water transport across biological membranes, Editeurs T Zeuthen et WD Stein Int. Rev. Cytol. 215: 106-140 19. Gerbeau P, Amodeo G, Henzler, T, Santoni V, Ripoche P, Maurel C (2002) The water permeability of Arabidopsis plasma membrane is regulated by divalent cations and pH Plant J. 30 : 71-81 20. Javot H, Lauvergeat V, Santoni V, Martin F, Güclü J, Vinh J, Heyes J, Franck K I, Schäffner A R, Bouchez D et Maurel C (2003) Role for a single aquaporin isoform in root water uptake 2003 Plant Cell 15: 509-522 21. Luche S, Santoni V et Rabilloud T (2003) Evaluation of non-ionic and zwitterionic detergents as membrane protein solubilizers in two-dimensional electrophoresis Proteomics 3: 249-253 22. Santoni V, Vinh J, Pflieger D, Sommerer N et Maurel C (2003) A proteomic study reveals novel insights into the diversity of aquaporin forms expressed in the plasma membrane of plant roots Biochem J. 373: 289-296 23. Santoni V (2006) Plant plasma membrane protein extraction and solubilization for proteomic analysis, à paraitre dans "Plant Proteomics: Methods and Protocols", Methods in Molecular Biology, Humana press, USA -sous presse 24. Rabilloud T, Luche S, Santoni V, Chevallet M (2006) Detergent and chaotropes for protein solubilizatoin before two-dimensional electrophoresis, à paraitre dans "Plant Proteomics: Methods and Protocols", Methods in Molecular Biology, Humana press, USAsous presse Manuscrits soumis pour publication 25. Santoni V, Verdoucq L, Sorieul M, Luu D-T, Viennois G, Sommerer N, Vinh J, Pflieger D, Maurel C (2006) Methylation, a new post-translational modification of plant aquaporinssoumis Tableau récapitulatif des facteurs d'impact des revues

de lecture 1 .

 1 Rakotomavo M, Bourdil I, Santoni V, Blein J-P etRossignol M (1989) Lysophosphatidylcholine effects on plasma membrane ATPase activity, dans "Plant Membrane Transport : the current position" éditeurs Dainty J, De Michelis M I, Marrè E, Rasi-Caldogno F, publié par Elsevier Science, pp 109-110 2. Rossignol M, Bourdil I,Santoni V et Blein J-P (1989) Interaction between plasma membrane H + -ATPase and phytotoxins: use of reconstituted system, dans "Plant Membrane Transport: the current position", éditeurs Dainty J, De Michelis M I, Marrè E, Rasi-Caldogno F, publié par Elsevier Science, pp 379-384 3.Rossignol M, Santoni V, Szponarski W et Vansuyt G (1990) Differential sensitivity to auxin at the plasma membrane level, dans "Progress in Plant Cellular and Molecular Biology" éditeurs Nijkamp H J J, Van Der Plas L H W et Van Aartrijk J, publié par Kluwer Academic, pp 498-503 4. Rossignol M, Santoni V, François J-M and Vansuyt G (1992) Changing membrane sensitivity to auxin during plant development, dans "Progress in Plant Growth Regulation" éditeurs Karssen C M, VanLoon L C, Vreugdenhil D, publié par Kluwer Academic, pp 202-220 Conférences invitées -Santoni V, Doumas P, Rossignol M (1998) Proteome approach on Arabidopsis. The Arabidopsis genome: a model for crop plants, Cold Spring Harbor, USA -Santoni V, Tournaire-Roux C, Verdoucq L, Luu D-T, Sorieul M, Prak S, Sommerer N et Maurel C (2005) Mechanisms of post-translational regulation of plant aquaporins. International conference on aquaporins, Bruxelles, Belgique Communications orales sur sélection -Santoni V, Vansuyt G, Szpornarski W et Rossignol M (1990) Régulation de l'ATPase plasmique par l'auxine et la fusicoccine. Colloque de la Société Française de Physiologie Végétale sur les ATPases membranaires, Dijon -Santoni V, Rouquié D, Rabilloud T, Rossignol M, Doumas P (1998) Two-dimensionnal analysis of hydrophobic proteins from plant plasma membrane 3 rd Siena 2D Electrophoresis Meeting -Santoni V, Rossignol M, Garin J, Kieffer S, Rabilloud T (1999) Proteome approach on plasma membrane of Arabidopsis. Journées thématiques: protéomique. Toulouse -Santoni V, Vinh J, Pfliegger D, Boursiac Y, Maurel C (2002) Expression and regulation of aquaporins in the Arabidopsis plasma membrane. COMBIO, Sydney, Australie -Santoni V, Verdoucq L, Prak S. Vinh J, Pfliegger D, Boursiac Y, Maurel C (2003) The use of proteomics to study the regulation of aquaporins, a multigenic family of membrane intrinsic proteins. Proteomic Forum München 2003, Allemagne -Santoni V, Prak S, Verdoucq L, Vinh J, Sommerer N, Boursiac Y, Maurel C (2004) Use of proteomics to study the regulation of aquaporins, a multigenic family of intrinsic membrane proteins. 10 ème journées de Gerland. Proteomics: new insights and prospects, Lyon, France -Santoni V, Verdoucq L, Sorieul M, Luu D-T, Viennois G, Sommerer N, Vinh J, Pflieger D, Maurel C (2005) Proteomics reveals a role for Lys and Glu methylation in regulating the subcellular expression of aquaporins. 1 er Symposium de Chimie et Biologie Analytiques, "de la Molécule au Protéome", Montpellier, France Séminaires -Santoni V (1999) Notion de protéomique, Campus de Baillargué, Montpellier -Santoni V, Sormani R, Gerbeau P, Vinh J, Sommerer N, Rabilloud T, Maurel C (2002) A proteomic study reveals novel insights into plant plasma membrane aquaporins", Université de Darmstadt, Allemagne -Santoni V, Verdoucq L, Boursiac Y, Prak, S, Vinh J, Sommerer N, Rabilloud T, Maurel C (2003) Expression et régulation des aquaporines dans la membrane plasmique d'Arabidopsis, Ecole doctorale de Lyon -Santoni V, Tournaire-Roux C, Verdoucq L, Luu D-T, Sorieul M, Prak S, Sommerer N et Maurel C (2005) Régulations post-traductionnelles des aquaporines de plantes, Tamani (1997), stagiaire de niveau L3 -Caractérisation d'une fraction membranaire d'Arabidopsis thaliana enrichie en plasmalemme. -M. Tosto (1998), stagiaire de niveau M1 -Efficacité de différents détergents à solubiliser les protéines membranaires de la membrane plasmique d'Arabidopsis. -S. Chevallay (1999), stagiaire COTOREP de 3 mois -Participation à la caractérisation de protéines hydrophobes de la membrane plasmique d'Arabidopsis. DEA -E. Gendreau (1993) -Etude du rôle du cytosquelette dans l'élongation de l'hypocotyle chez Arabidopsis thaliana, DEA de biologie Moléculaire et Cellulaire Végétale, Université Paris XI. J'ai participé à la formation d'E. Gendreau sur les techniques d'extraction de protéines et de gels bidimensionnels. -R. Sormani (2001) -Recherche d'un rôle de l'aquaporine PIP2a dans la régulation de la perméabilité hydrique de la membrane plasmique de cellules d'Arabidopsis thaliana en suspension, DEA Développement et Adaptation des Plantes, Université Montpellier II. R. Sormani est en thèse chez C. Robaglia (Laboratoire de Génétique et Biophysique des Plantes, UMR 6191 CNRS-CEA-Université de la Méditerranée, Luminy, Marseille). -S. Prak (2003) -Recherche du rôle des modifications post-traductionnelles portées par les aquaporines de la membrane plasmique racinaire d'Arabidopsis thaliana dans la réponse à un traitement salin, DEA Développement et Adaptation des Plantes, Université Montpellier II. S. Prak est actuellement en thèse au laboratoire. thaliana, Université Paris VI. J'ai participé à l'encadrement de M. Delarue, coauteur des publications 7 et 8, pour la caractérisation biochimique des mutants sur1 et cristal. M. Delarue est Maître de conférence à Paris. -D. Rouquié (1998) Analyse protéomique de la membrane plasmique chez Nicotiana tabacum et Arabidopsis thaliana, Université Montpellier II. J'ai participé à l'encadrement de D. Rouquié, co-auteur des publications 10, 11, 12 et 14. D. Rouquié a intégré Biogemma puis se trouve actuellement en poste à Bayer CropScience (Antibes). -M. Sorieul (2004-2007) Régulation de la localisation et de la dynamique subcellulaire des aquaporines, Université Montpellier II. M. Sorieul est principalement encadré par D.T Luu et C. Maurel et je participe à son encadrement dans le cadre de l'analyse de mutants de méthylation. -S. Prak (2003-2006) Analyse des modifications post-traductionnelles portées par les aquaporines PIP chez Arabidopsis thaliana, Université Montpellier II. Post-doctorat -F. Masson (1999). Caractérisation de protéomes membranaires d'Arabidopsis. Co-auteur de la publication 16. -T. Henzler (2001-2003). Caractérisation fonctionnelle d'aquaporines PIP surexprimées en suspension cellulaire végétale, co-auteur de la publication 19. T. Henzler a été recruté par la société Biologic (Grenoble). -L. Verdoucq (2003-2004) Mécanismes de régulation des aquaporines de plantes-Etude de la signification fonctionnelle de la méthylation des aquaporines chez Arabidopsis thaliana, coauteur de l'article 25 soumis pour publication. L. Verdoucq est maintenant recruté CR1-CNRS au laboratoire. -T. Sahr (2005-2007): Caractérisation de méthyltransférases d'aquaporines PIP chez Arabidopsis thaliana. 2.2. Collaborations scientifiques -Pr J. Dénarié (CNRS-INRA, Castanet-Tolosan, France) (1994) Influence de facteurs de nodulation, en tant que signal spécifique de différenciation sur le profil en électrophorèse 2D de protéines totales de jeunes plantules d'Arabidopsis. Cette étude a révélé l'induction de 3 polypeptides majeurs et a été poursuivie par l'équipe de J. Dénarié. -Dr F. Corke (laboratoire de K Roberts, John Innes Centre, Norwich, Grande Bretagne) (1995) Isolement de paroi d'Arabidopsis. -Dr D. Falconnet (Université Joseph Fourier, Grenoble, France) (1995) Etude des intégrines d'Arabidopsis. -Dr M. Zivy (INRA, plate forme protéomique du Moulon, Gif sur Yvette, France) Analyse statistique des profils de gels d'électrophorèse bidimensionnelle. Co-auteur de la publication 13. -Dr T. Rabilloud (CEA Grenoble, France) (1998-2002) Collaboration sur l'optimisation de méthodes d'extraction et solubilisation de protéines membrabaires. Co-auteur des publications 10, 12, 14, 15, 16, 21 et 24. -Dr D. Desclaux (INRA de Maugio, France) (1999-2000). Analyse statistique des protéomes hydrophobes de la membrane plasmiques. Co-auteur de la publication 16. -Dr J. Vinh (CNRS, Paris, France) (2001-2004) Caractérisation post-traductionnelle des aquaporines par spectrométrie de masse. Co-auteur des publications 20, 22 et 25. -Dr N. Sommerer (INRA, UR protéomique, Montpellier, France) (2001-2005) Analyse des aquaporines par spectrométrie de masse. Co-auteur des publications 22 et 25.

  que j'ai engagée était basée sur l'étude comparative des profils d'EBD des protéines totales de mutants de développement. Cette technique sépare les protéines en fonction de leur point isoélectrique dans une première dimension et selon leur masse moléculaire en deuxième dimension. L'intérêt de cette technique est la possibilité de visualiser plusieurs centaines de produits de gènes simultanément, ce qui permet de rechercher efficacement des changements dans l'expression du génome en fonction de mutations. De plus, à l'époque, de nouvelles molécules, les immobilines, permettaient de générer des gradients de pH reproductibles et des systèmes d'analyse d'image performants commençaient à être commercialisés. Mon objectif était de classer biochimiquement les mutants de développement en introduisant dans cette classification des contrôles correspondant à des plantes de type sauvage (WT) cultivées en présence de différentes hormones. L'ensemble des résultats a donné lieu à 5 publications (notées 5 à 9).RésultatsL'EBD de protéines totales de jeunes plantules d'Arabidopsis permet de visualiser environ 700 polypeptides[START_REF] Santoni | Use of two-dimensional protein-pattern analysis for the characterization of Arabidopsis thaliana mutants[END_REF]. Des variations qualitatives et quantitatives des polypeptides ont systématiquement été observées lors de la comparaison des mutants avec le type WT. L'étude statistique basée sur une analyse de variance (programme développé sous SAS, en collaboration avec M. Zivy, INRA, Gif/Yvette) a permis de juger de la reproductibilité des variations quantitatives. Les profils d'EBD des écotypes WT Col-0 et Ws étant différents, les dendogrammes de distances biochimiques doivent représenter des mutants issus du même écotype. Des corrélations entre la classification biochimique d'une part et phénotypique d'autre part m'ont permis de valider la méthode (Santoni et al. 1997). Ainsi, les mutants surproducteurs d'auxine sur1 ont, non seulement un phénotype similaire à celui du type sauvage cultivé sur piclorame (PC) (un analogue d'auxine) mais sont aussi biochimiquement liés à ce dernier. De plus, sur un dendogramme de distances biochimiques, ces mutants sont très éloignés du type WT cultivé sur une cytokinine, la benzyladénine (BA).L'exploitation de cette approche a permis de contribuer à interpréter le phénotype des mutants pasticcino et cristal. Les mutants pas1, pas2 et pas3[START_REF] Feiler | The higher plant Arabidopsis thaliana encodes a functional CDC48 homologue which is highly expressed in dividing and expanding cells[END_REF] ne sont pas alléliques mais montrent cependant une partie aérienne anormale similaire suggèrant qu'ils sont impliqués dans une fonction physiologique semblable. La classification biochimique, montrant que ces mutants sont réunis dans le même cluster, a confirmé cette interprétation. D'un point de vue physiologique, les mutants pas répondent fortement aux cytokinines et d'un point de vue biochimique, ces mutants sont plus proches du type WT cultivé sur BA que sur PC. Cette relation s'est avérée être dû à une hypersensibilité des mutants aux cytokinines plutôt qu'à une surproduction de cytokinines car leur teneur en cette hormone n'est pas modifiée. Le gène PAS1, cloné par P. Vittorioso au laboratoire, code une immunophiline dont le rôle serait de réguler négativement la prolifération cellulaire induite par les cytokinines. Comme dans le cas des mutants pas, le profil biochimique du mutant cri1 (mutant cristal) est davantage relié à celui du type WT cultivé sur BA que sur PC. Des dosages d'hormones ont montré que ce mutant accumule environ six fois plus de cytokinines que le

  Le programme européen « Plant Plasma Membrane database, PPMdb » avait pour objectif de réaliser un répertoire des protéines exprimées au niveau de la MP d'Arabidopsis et d'organiser ces résultats en une base de données disponible sur Internet. Le choix de cette membrane résidait dans son rôle majeur dans la transduction d'informations de l'extérieur vers l'intérieur de la cellule et dans le peu de connaissances de cette membrane (seuls 5 % des protéines de la MP étaient représentés à l'époque dans les banques de données). J'ai débuté ce projet au laboratoire de Biologie Cellulaire à Versailles et je l'ai poursuivi à Montpellier, au laboratoire de Biochimie et Physiologie Moléculaire des Plantes (BPMP) dans l'équipe de M.

  Le maintien du statut hydrique est une contrainte majeure pour la croissance et le développement des plantes terrestres. Ces organismes peuvent en particulier être soumis à des conditions environnementales sévères. La découverte des AQPs a démontré le rôle crucial que jouent les membranes cellulaires dans le maintien du statut hydrique des plantes[START_REF] Maurel | Aquaporins. A molecular entry into plant water relations[END_REF]. Ces protéines forment des canaux qui facilitent la diffusion de l'eau ou de petits solutés neutres au travers des membranes biologiques.Des travaux menés sur diverses espèces végétales montrent que la conductivité hydraulique racinaire (Lp r ) est modulée par le contexte physiologique ou en réponse à des stimuli de l'environnement: cycles jour-nuit, stress hydrique et salin, anoxie, exposition au froid, traitement par l'acide abscissique, carence et levée de carence nutritionnelle (voir[START_REF] Javot | The role of aquaporins in root water uptake[END_REF] pour revue). L'implication des AQPs dans ces processus a été proposée sur la base des effets du mercure, un inhibiteur général mais non spécifique des AQPs[START_REF] Javot | The role of aquaporins in root water uptake[END_REF]. Le transport d'eau dans la racine offre ainsi un contexte physiologique clair pour appréhender la fonction intégrée des AQPs de plantes et analyser les mécanismes moléculaires et cellulaires des régulations qui affectent ces protéines. Les plantes possèdent un nombre important de gènes d'AQPs. Ainsi, le génome d'Arabidopsis thaliana code 35 isoformes d'AQP qui se subdivisent en 4 familles selon leur degré d'homologie de séquences : les PIP (Plasma membrane Intrinsic protein), TIP (Tonoplast Intrinsic protein), NIP (Nodulin-26-like Intrinsic Protein) et SIP (Small Intrinsic basic Proteins). Ce nombre important peut s'expliquer par des localisations subcellulaires spécifiques, des profils d'expression tissulaire variés ou encore le fait que ces protéines soient la cible privilégiée de divers stimuli hormonaux ou environnementaux (Santoni et al. 2000a).Les AQPs sont des protéines transmembranaires de 25-34 kDa assemblées en tétramères. Chaque monomère présente une organisation typique avec 6 hélices transmembranaires α, 5 boucles extramembranaires (A -E), les extrémités N-et C-terminales étant localisées dans le cytoplasme. La résolution à l'échelle atomique de la structure d'AQPs présentant des spécificités de transport différentes permet maintenant d'expliquer les mécanismes moléculaires de perméation à l'eau et aux petits solutés ainsi que l'absence de perméation aux protons[START_REF] Fu | Structure of a glycerol-conducting channel and the basis for its selectivity[END_REF][START_REF] Murata | Structural determinants of water permeation through aquaporin-1[END_REF].Pour appréhender la fonction des AQPs de plantes, une approche du groupe consiste à analyser les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la régulation des AQPs.Outre la régulation des AQPs par la modulation de l'expression de leurs gènes, l'activité de ces protéines peut être régulée au niveau post-traductionnel. Des données issues de la littérature révèlent que les parties extramembranaires (extrémités N-et C-terminales et boucles) des AQPs jouent un rôle critique dans leur fonction en contrôlant soit leur localisation, soit le degré d'ouverture/fermeture du canal (gating). Le gating de certaines AQPs est modulé par le degré de protonation de résidus His situés sur des parties extracytoplasmiques de plusieurs AQPs animales[START_REF] Zelenina | Nickel and extracellular acidification inhibit the water permeability of human aquaporin-3 in lung epithelial cells[END_REF][START_REF] Németh-Cahalan | Molecular basis of pH and Ca 2+ regulation of aquaporin water permeability[END_REF]). Notre groupe a montré que c'est l'acidification cytosolique, par le biais de la protonation d'une His de la boucle D qui inhibe l'activité des AQPs PIP[START_REF] Tournaire-Roux | Gating of aquaporins by cytosolic pH regulates root water transport during anoxic stress[END_REF]. Le gating peut aussi être modulé par le degré de phosphorylation comme cela est

  Les flux cellulaires d'eau dans la racine étant largement contrôlés par la MP, nous avons entrepris une caractérisation systématique des AQPs de cette membrane. Treize des AQPs codées par le génome d'Arabidopsis appartiennent à la famille des PIPs (Plasma membrane Intrinsic Proteins). Une approche protéomique couplant enrichissement en protéines hydrophobes de la MP, séparation de ces protéines par électrophorèse et identification par spectrométrie de masse (SM) MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight) et en tandem [ESI-(Electrospray Ionization)/SM-SM et MALDI-TOF/TOF] montre qu'au moins 5 isoformes PIP sont exprimées dans la MP de racine. Les études de SM ont été menées sur les plate formes protéomiques de la génopole Languedoc-Roussillon (M. Rossignol et P. Jouin) ainsi qu'en collaboration avec J. Vinh (ESPCI, Paris) et ont conduit à un article publié dans Biochem J. (Santoni et al. 2003) (Tab. 1).

  La mutation des sites de méthylation modifie profondément l'extrémité N-terminale L'analyse, par SM, des AQPs mutées sur les sites de méthylation montre que les mutations induisent de nouveaux profils de modifications: notamment, les mutations E6A et EVS induisent l'apparition d'une modification sur l'extrémité N-terminale de la protéine correspondant soit à une acétylation soit à une triméthylation du 1 er (Ala) ou du 2 ème acide aminé (Lys). Ces ambiguïtés devraient être levée en utilisant un spectromètre de masse plus sensible de type FT-ICR (en collaboration avec J. Vinh, ESPCI, Paris). La mutation K3A induit l'apparition d'une acétylation sur Ala1 ainsi que d'une méthylation sur Ala2.Les formes modifiées s'accumulent dans un compartiment intracellulaireLes données de SM des protéines mutantes E6A et EVS montrent que les nouvelles formes modifiées sont spécifiquement localisée dans les membranes intracellulaires (où elles constituent en moyenne 40 % du pool microsomal d'AQPs) et absentes de la membrane plasmique. Des mesures de stopped-flow, réalisées par L. Verdoucq sur des vésicules de MP isolées des cellules transformées montrent qu'aucune des mutations (K3A, K3R, E6A et EVS) n'affecte l'activité des AQPs mutées. Par contre, l'ensemble de ces mutants présentent une suraccumulation cellulaire d'un facteur 3 à 6 par rapport à l'AQP sauvage PIP2;1.Des expériences d'immunofluorescence en microscopie confocale ont permis de confirmer ce résultat et de préciser l'accumulation de la protéine mutante E6A dans le réticulum endoplasmique (RE) (Fig.2). Ce résultat a été confirmé par l'observation en microscopie confocale de ces mêmes protéines fusionnées à la Green Fluorescent Protein, travail réalisé par M. Sorieul au cours de son stage de DEA et de thèse au laboratoire.L'ensemble de ces résultats suggère que la localisation subcellulaire pourrait être reliée au statut de modification de l'extrémité N-terminale. Rôle de l'extrémité N-terminale de PIP2 ;1 dans sa localisation subcellulaire Un fait remarquable est l'existence d'une interférence entre le résidu Glu6 et l'extrémité N-terminale: sa mutation en Ala (mutant E6A) on son décalage d'une position dans la séquence (mutant EVS) provoque l'apparition d'une nouvelle modification sur l'un des 2 premiers résidus, strictement présente dans un compartiment intracellulaire (identifié comme le RE dans le cas d'E6A) et non dans la MP. Il faut noter que l'extrémité N-terminale comporte un motif de type diacide (AKDVEA) dont le Glu6 fait partie. De récents travaux ont montré que ce type de motif peut aussi moduler la sortie de protéines membranaires du RE chez les plantes en combinaison avec d'autres facteurs restant à élucider (Hanton et al. 2005). On peut donc envisager que, si ce motif est fonctionnel chez PIP2;1, sa mutation contribue au phénotype de rétention de la protéine dans le RE. Il reste cependant à évaluer l'influence de la méthylation du glutamate sur le rôle joué par cet éventuel motif diacide. Par contre, l'adressage modifié des PIP2;1 mutés sur la Lys3 ne peut pas être expliqué par l'intervention de ce motif diacide. Parce que les résidus Lys sont des sites préférentiels d'ubiquitination, une mutation ponctuelle à cette position pourrait empêcher la dégradation de la protéine par la voie du protéasome, provoquant ainsi une suraccumulation cellulaire. Le mutant K3R se caractérise par un phénotype cellulaire supplémentaire: son accumulation dans la MP est 3 fois supérieure à celle des autres mutants. Ce résultat suggère que l'arginine en position 3 favoriserait l'adressage à la MP en mimant l'effet d'une lysine diméthylée naturellement présente dans un contexte de protéine PIP2;1 sauvage. Il reste maintenant à découvrir les conditions physiologiques modulant l'état de méthylation des AQPs. L'étude en parallèle de leur localisation subcellulaire devrait permettre d'évaluer plus précisément le rôle de la méthylation N-terminale dans l'adressage subcellulaire. De plus, la caractérisation des Glu-et Lys-methyl transférases agissant sur PIP2;1 ainsi que l'identification des partenaires en interaction avec les différentes formes méthylées contribueront à la compréhension des mécanismes d'adressage des protéines membranaires. 5.2.4. Caractérisation des modifications post-traductionnelles d'AQP de la membrane vacuolaire ainsi que celles d'autres protéines membranaires L'ensemble des résultats obtenus jusqu'à présent a montré qu'une approche protéomique combinée à des approches fonctionnelles et de biologie cellulaire permet de révéler de nouveaux mécanismes de régulation des protéines membranaires. Cette stratégie peut donc être étendue à d'autres protéines membranaires pour résoudre de nouveaux mécanismes de régulation ou au contraire révéler des mécanismes communs de régulation. Nous allons rechercher si la méthylation concerne aussi d'autres AQPs majeures que sont les TIPs (Tonoplast Intrinsic Proteins). Ce projet, débuté dans le cadre d'une collaboration avec G. Amodeo au cours d'un stage de trois mois (2005) dans notre laboratoire a déjà permis de purifier des fractions membranaires enrichies en tonoplaste et de dresser un premier inventaire par SM des TIPs exprimées dans les cellules en suspension d'Arabidopsis. Des stratégies de digestion enzymatique, utilisant d'autres enzymes que la trypsine, sont en cours de développement pour couvrir le maximum de séquence et identifier d'éventuelles modifications comme la méthylation. Des résultats préliminaires montrent que dans les suspensions cellulaires, TIP2;1 et TIP1;2 sont les isoformes les plus exprimées. La methionine initiatrice est maturée (clivée) comme dans le cas des isoformes PIP2 et environ 10 % de TIP2;1 est acétylé en Ala2. D'autres résultats récents suggèrent que la méthylation serait une modification commune à des protéines transmembranaires végétales autres que les AQPs. La caractérisation des enzymes impliquées dans la méthylation des protéines membranaires (voir § 6) constituera un point d'entrée dans l'identification systématique des cibles membranaires méthylées.

  Dans ce projet, qui sera mené par un stagiaire post-doctoral(2005)(2006)(2007), l'AQP PIP2;1 sera utilisée comme modèle pour disséquer des aspects moléculaires et fonctionnels originaux de la méthylation des protéines membranaires végétales. Deux types approches seront engagés pour identifier et caractériser les méthyltransférases d'AQPs de la racine d'Arabidopsis : d'une part, un clonage par homologie de séquences de méthyltransférases potentielles et d'autre part, une purification biochimique des enzymes modifiant PIP2;1. Clonage de Lys-méthyltransférases à domaine SET A part une exception, toutes les méthyltransférases de Lys connues à ce jour possèdent un motif consensus de 130 acides aminés définissant un domaine SET (Su(var) 3-9, Enhancer-of-zeste, Trithorax) (Zhang and Reinberg 2001). Environ soixante protéines codées par le génome d'Arabidopsis présentent ce domaine mais la plupart d'entre elles possèdent un signal peptidique d'adressage chloroplastique ou nucléaire. Celles qui sont potentiellement localisées dans le cytoplasme seront prioritairement clonées puis produites en bactérie, en fusion avec une étiquette de type 6-His pour permettre leur purification.

  localisation subcellulaire sera déterminée par immunocytochimie et par le biais de fusions avec la protéine GFP. L'expression dans les tissus des gènes clonés sera étudiée en utilisant un gène rapporteur comportant le promoteur du gène de méthyltransférase fusionné à la séquence codante du gène de la β-glucuronidase. La co-expression de ces fusions avec certaines AQPs sera particulièrement étudiée. Les méthyltransférases seront surexprimées dans des suspensions cellulaires d'Arabidopsis, et on étudiera leur impact sur l'état de MPTs et la localisation subcellulaire de PIP2;1. Par ailleurs, des mutants d'Arabidopsis dont ces gènes de méthyltransférases auront été inactivés seront analysés en détail. Une analyse protéomique comparative de plantes sauvages et mutantes permettra d'évaluer les substrats de ces enzymes. Ce type d'approche viendra ainsi complémenter l'approche déjà en cours ( § 5.2.4.) et permettra d'identifier des groupes de protéines membranaires susceptibles d'être co-régulées sous l'effet de leur méthylation.

Fig. 1

 1 Fig. 1 Protéome de la membrane plasmique de feuille d'Arabidopsis avant (a) et après (b) un traitement chaotrope (4 M urée) et alcalin (20 mM NaOH) de la fraction membranaire.

3. Premiers travaux de recherches (1986-1992) 13 3.1. DEA de Physiologie Végétale (purification de membrane plasmique)

	-Programme AF2001093 GABI-Génoplante -Functional genomics of membrane
	transporters, financé sur 2 ans (2002-2003)
	Le stage de DEA a été réalisé aux laboratoires de Physiologie Cellulaire (Université Pierre et
	Marie Curie) dans l'équipe de Jean-Claude Kader et de Physiologie Cellulaire Végétale (Gif
	sur Yvette) dirigé par le Pr. Jean Guern. Il a été précédé d'un séjour dans le laboratoire de
	2.4. Participation à des comités et jurys de thèse Christer Larsson (Lund, Suède) au cours duquel j'ai acquis la technique de partage de phases
	pour purifier des fractions membranaires enrichies en membrane plasmique (MP). Au cours
	-Comité de thèse de J. Wirth (2003-2006), équipe A. Gojon (laboratoire BPMP) Etude de la du stage de DEA, j'ai adapté cette méthode à la purification de la MP de feuilles de tabac. La
	régulation de transporteurs de nitrate par la photosynthèse et les sucres caractérisation enzymatique de cette fraction membranaire a permis de montrer un fort
	-Examinateur de la thèse de B. Valot (Université de Bourgogne, Dijon, 2005). Etude des enrichissement en MP. Des analyses complémentaires ont montré une différence dans la
	protéines membranaires de racines de Medicago truncatula colonisées par le champignon composition lipidique de la MP par rapport à celle d'autres membranes cellulaires.
	mycorhizogène Glomus intraradices. Développement et application d'approches de
	protéomique subcellulaire 3.
	2.5. Activité d'expertise
	-Revues scientifiques: Proteomics et Plant Physiology
	-Projets : National Science Foundation et Binational Agricultural Research and Development
	Fund
	2.6. Autres activités
	-Membre du comité technique du laboratoire BPMP (2002-2004)
	-Membre du conseil de service du laboratoire BPMP depuis 2002
	-Membre du comité d'administration de la SFEAP (Société Française d'Electrophorèse et
	d'Applications Protéomiques) depuis 2002
	-Membre du comité d'organisation et du comité scientifique du « 1 er Symposium de Chimie
	et Biologie Analytiques -de la molécule au protéome » septembre 2005 Montpellier
	-Plant Plasma Membrane Database, projet financé par la commission européenne (DGXII)
	pendant 3 ans (1999-2001)

-Protéome subcellulaire végétal, projet financé par le CNRS -programme Physique et Chimie du Vivant, pendant 1 an

(1999)(2000)

2 Thèse: étude de la sensibilité de l'ATPase à l'auxine 3.2.1. Contexte

	J'ai réalisé ma thèse à la Station de Physiopathologie Végétale de l'INRA de Dijon
	sous la direction de Michel Rossignol. Le projet général de la station était d'améliorer la
	connaissance et la maîtrise des processus de différenciation et d'organogenèse chez les
	plantes. Ces phénomènes étant très largement sous contrôle hormonal, notre groupe avait
	choisi d'étudier les mécanismes biochimiques d'action des hormones, et plus particulièrement
	de l'auxine qui intervient dans le contrôle de l'élongation et de la division cellulaire.

. Travaux de recherche en protéomique (1992-2000) 4.1. Etude protéomique du développement d'Arabidopsis 4.1.1. Contexte

	Cellulaire de l'INRA de Versailles dans l'équipe de Michel Caboche. Le projet du groupe consistait à caractériser des déficiences provoquées par des mutations affectant le développement des plantes. Les mutants les plus représentatifs étaient caractérisés par mes collègues d'un point de vue physiologique, génétique, moléculaire et ultrastructural. De mon côté j'ai proposé de mettre en place en tant qu'outil biochimique d'analyse des mutants, une analyse comparative de leur profil de protéines totales par électrophorèse bidimensionnelle 4J'ai effectué un stage post-doctoral de 1992 à 1993 dans le laboratoire de Biologie (EBD). Ceci m'a conduit à mettre en place au laboratoire l'EBD de protéines, à développer
	des outils adéquats d'analyse statistique et m'a permis de contribuer à interpréter plusieurs
	phénotypes mutants.
	. En effet, l'auxine
	exerce les différents types d'effets (stimulateur/inhibiteur) quel que soit l'âge de la plante
	mais la stimulation du transport de protons requiert des concentrations d'auxine différentes
	selon le stade de développement de la plante. Ainsi, la sensibilité à l'auxine de l'ATPase est

2 Protéome hydrophobe de la membrane plasmique d'Arabidopsis

  En 2000 j'ai rejoint le groupe de Christophe Maurel qui créait alors une ATIPE au laboratoire de Biologie et Physiologie Moléculaire des Plantes (BPMP, directeur Claude Grignon). Les enjeux de son groupe sont de développer de nouvelles approches moléculaires permettant d'appréhender la fonction intégrée des aquaporines (AQPs) dans la plante. Plus largement, il s'agit de comprendre les mécanismes qui contrôlent les flux d'eau, au cours du développement de la plante ou en réponse à des contraintes environnementales.Etant donnée l'expérience acquise dans le domaine de la biochimie des protéines membranaires, j'ai développé un projet basé sur l'étude biochimique de la régulation des AQPs d'Arabidopsis par une approche de type protéomique. A terme, mon objectif est d'introduire les retombées de cette approche dans les thématiques physiologiques du groupe.

	4.2.Objectif
	La nature extrinsèque des protéines identifiées dans le projet PPMdb révélait que cette Un résultat remarquable est que chaque type d'extraction identifie un protéome
	approche sous-estime largement l'ensemble les protéines transmembranaires (TM). Or membranaire spécifique. La comparaison de ces protéomes par le modèle statistique AMMI
	l'analyse des génomes entièrement séquencés montre que cette population de protéines (Additive Main effect with Multiplicative Interaction) a permis de regrouper les protéines en
	représente 1/3 des protéines codées par le génome. L'absence de ces protéines sur les cartes fonction de leur solubilité et de leurs propriétés électrophorétiques. Ce travail a été mené en
	d'EBD était attribuable à des problèmes techniques liés à la faible performance du mélange collaboration avec D. Desclaux (station de Génétique et Amélioration des Plantes, INRA,
	classique CHAPS/urée pour extraire ces protéines et les maintenir en solution pendant la Mauguio). Plusieurs familles, regroupant des protéines sur la base de caractéristiques
	focalisation. En collaboration avec T. Rabilloud (CEA, Grenoble), j'ai montré qu'il est structurales communes ou d'interactions biochimiques fortes, ont émergé de cette analyse.
	possible d'améliorer la solubilisation de ces protéines et leur présence sur gel d'EBD à l'aide L'identification par SM de quelques protéines a permis d'attribuer des spécificités à chaque
	J'ai comparé l'efficacité du Triton X-114, du Triton X-100, d'un traitement alcalin et
	des solvants (chloroforme/méthanol) à extraire les protéines TM. J'ai ensuite comparé
	GFP fusionnée à ces protéines nouvelles aurait contribué à valider leur localisation l'efficacité de cinq nouveaux détergents (ƒC5, ƒC6, ƒC7, C8, ASB14) et du CHAPS à nombre d'hélices TM et le poids moléculaire de la protéine, qui permet de définir un seuil de
	subcellulaire. solubiliser ces protéines et à les maintenir solubilisées pendant tout le processus d'EBD détection des protéines TM à hélices α sur gel d'EBD (Santoni et al. 2000c). Au delà de ce
	(Santoni et al. 2000b). seuil, égal à 0.25, la protéomique des protéines membranaires ressemble à un « amour
	Cette étude a permis de dégager des règles générales d'utilisation de ces détergents. En impossible » (Santoni et al. 2000c) et d'autres technologies doivent alors être développées

par chimie d'Edman et spectrométrie de masse a montré que 52 protéines avaient une fonction connue, 64 % d'entre elles ayant déjà été décrites, par d'autres approches, comme étant plasmalemmiques. Les autres protéines étaient inconnues en banque, montrant ainsi la pertinence de cette approche en tant que ressource de nouveaux produits de gènes. En complément de cette étude, une approche de biologie cellulaire utilisant la protéine de nouveaux détergents et de mélanges chaotropiques appropriés à l'isoélectrofocalisation. Ce travail a été réalisé dans le cadre d'un projet financé par le CNRS (Physique et Chimie du Vivant).

L'ensemble des résultats a donné lieu à 5 publications (notées

10, 14, 15, 16 et 21)

.

Résultats

La solubilisation des protéines par un nouveau détergent dérivé d'amidosulfobétaine (détergent C8, synthétisé par T. Rabilloud) et de thiourée a permis de visualiser pour la première fois sur EBD, deux protéines de la MP d'Arabidopsis possédant plusieurs hélices TM (une H + -ATPase à 10 hélices et une aquaporine qui en possède 6)

(Chevallet et al. 1998)

.

Cependant, étant donné le pourcentage élevé de protéines solubles dans la fraction de MP (jusqu'à 80 %), les protéines les plus hydrophobes restent minoritaires sur gel d'EBD. Une étape d'enrichissement en protéines TM est donc absolument nécessaire préalablement à leur séparation par EBD (Fig.

1

). particulier, nous avons montré que la délipidation préalable de la MP améliore l'efficacité de solubilisation des détergents. De plus, les détergents possédant un noyau aromatique ne délipident pas efficacement la MP mais déstabilisent efficacement les agrégats protéiques et inversement pour les détergents linéaires. Cette étude a conduit à la commercialisation du détergent ASB14 par la société Calbiochem. groupe. Ainsi, deux d'entre eux regroupent les protéines les plus hydrophobes, un autre groupe renferme les sous-unités de la V-ATPase, un quatrième regroupe des protéines à une hélice TM ainsi que des protéines décrites pour interagir avec des protéines membranaires

(Santoni et al. 2000b)

.

Au final, cette étude montre que l'EBD de protéines de membranes biologiques, dont la composition lipidique diffère, nécessite une étude préliminaire pour optimiser les conditions de solubilisation. Cette approche constitue surtout une nouvelle stratégie pour appréhender les relations fonctionnelles entre protéines membranaires. En cela, elle est complémentaire d'autres stratégies et devrait contribuer à la compréhension des interactions entre les protéines de la MP.

Malgré le relatif succès de la démarche précédente, un grand nombre de protéines hydrophobes ne sont pas résolues par l'EBD car elles combinent généralement plusieurs des désavantages suivants: protéines faiblement abondantes et/ou basiques et/ou faiblement solubles dans les tampons de focalisation. Nous avons défini un index, égal au rapport entre le pour étudier ces protéines. Néanmoins, dans ce cas, on perd l'avantage que présente l'EBD de visualiser les modifications post-traductionnelles (MPT) révélées par des décalages de points isoélectriques et/ou de masse induits par la présence de ces modifications.

Bases moléculaires de la régulation de l'activité des aquaporines par un traitement

  La trypsine, a permis d'inventorier les MPTs portées par les extrémités ainsi que les boucles C et E. L'utilisation d'autres enzymes (chymotrypsine, endo-Lysine C) et d'agents chimiques(CNBr) a nécessité une mise au point prise en partie en charge par S. Prak au cours de sa thèse. Actuellement, 65% des parties extramembranaires d'une des AQPs les plus abondantes La surexpression stable en suspension cellulaire a nécessité la mise au point de conditions de transformation. Ces mises au point ont débuté au cours du stage de DEA de R. après purification de la MP, de l'AQP sauvage PIP2;1 surexprimée en cellules a montré que le profil de méthylation de l'AQP est similaire à celui de PIP2;1 exprimée dans les racines (la Lys3 est partiellement diméthylée et Glu6 est partiellement mono-méthylé). Ce résultat démontre que les cellules en suspension constituent un système d'expression favorable pour analyser la méthylation de PIP2;1.

	Protéomique de M. Rossignol). Cette approche a révélé la présence, sur l'extrémité C-
	terminale, de deux sites de phosphorylation sur l'isoforme PIP2;1 (Ser280, Ser283) et de trois technique bien maîtrisée au laboratoire (voir § suivant). Cette approche fonctionnelle sera
	sites chez PIP2;4 (Ser280ou283, Ser286 et Ser289). couplée à la quantification par protéomique de la phosphorylation C-terminale de la protéine
	PIP2;4. La déphosphorylation in vitro de la protéine permettra de juger du rôle de cette
	de la racine, PIP2;1, sont couverts par l'ensemble de ces stratégies. En résumé, cette approche descriptive a permis de dégager un ensemble de nouveaux modification dans le gating de PIP2;4. A terme, si l'activité de PIP2;4 s'avère être essentielle
	mécanismes potentiellement régulateurs des AQPs de la MP de racine. Nous nous sommes dans la réponse au traitement salin, des plantes mutées dans ce gène seront étudiées quant à
	La présence de MPTs sur des peptides du spectre de masse, a été prédite à l'aide du par la suite attachés à étudier ces MPTs dans le cadre de la régulation des AQPs racinaires en leur réponse globale au traitement salin et à d'autres stress environnementaux. La diméthyl-Lys3 est un marqueur de localisation de PIP2;1 à la MP
	logiciel FINDMOD (http://au.expasy.org/tools/findmod/) et les peptides d'intérêt ont été réponse à un traitement salin. Par ailleurs, étant donnée l'originalité de la méthylation, nous L'aquaporine PIP2;1 est par contre, une isoforme abondante dans la MP de racine et sa Dans un premier temps, nous avons étudié la localisation sub-cellulaire du processus
	séquencés par SM en tandem. Cette stratégie a permis de démontrer que la méthionine avons porté un intérêt particulier à l'étude de sa signification fonctionnelle. Enfin, nous déphosphorylation pourrait rendre compte de la baisse de Pf. Nous avons donc engagé une de méthylation en comparant le profil de méthylation de l'AQP PIP2;1 issue de fractions
	initiatrice (Met1) est acétylée chez les isoformes PIP1 et clivée chez les isoformes PIP2 tentons actuellement d'étendre notre stratégie d'étude protéomique aux AQPs d'autres étude sur le rôle de la phosphorylation par le biais de mutants ponctuels des sites de microsomales et plasmalemmiques. Pour cela, j'ai mis au point une technique
	(Tab.1). La maturation de la méthionine initiatrice est un processus co-translationnel qui membranes cellulaires que la MP. phosphorylation (travail mené par S. Prak pendant sa thèse). L'effet des phosphorylations sur d'immunopurification de l'AQP à partir de microsomes, fraction protéique essentiellement
	constituée de membranes intracellulaires. De façon surprenante, la forme diméthylée de Lys3
	est seulement détectée dans la MP, ce qui suggère que la diméthylation de Lys3 constitue un
	La méthylation du glutamate est encore plus originale car cette modification n'a 5.2.2. Une analyse semi-quantitative basée sur la comparaison des spectres de masse montre marqueur d'expression de PIP2;1 à la MP.
	jamais été décrite chez les eucaryotes. Par contre, chez des chémorécepteurs bactériens, la que les méthylations identifiées ne peuvent pas rendre compte de la modulation de l'activité
	méthylation réversible de résidus Glu contrôle leur activité (Simms and Subbaramaiah 1991; des AQPs PIP en réponse au traitement salin. Par contre, des résultats préliminaires suggèrent Sormani et ont été optimisées par L. Verdoucq au cours de son stage post-doctoral.
	Djordjevic et al. 1998). D'autres méthylations sont prédites sur l'extrémité N-terminale des une déphosphorylation partielle des isoformes PIP2;1 et PIP2;4 en réponse au traitement salin.
	AQPs PIP1 et sont en cours de localisation précise. D'après les analyses protéomiques, PIP2;4 ne fait pas partie des AQPs les plus abondantes de L'AQP PIP2;1-WT ainsi que des mutants ponctuels des résidus Lys3 (mutants PIP2;1-
	la MP de la racine. Il faut donc envisager que PIP2;4 soit particulièrement perméable pour K3A et -K3R) et Glu6 (PIP2;1-E6A) ont été produits et surexprimés en cellules par L.

. L'identification de MPTs nécessite de couvrir efficacement l'ensemble des parties extramembranaires de la protéine.

dépend essentiellement de la séquence en acides aminés au voisinage de Met1

[START_REF] Poledova | N-terminal acetyltransferases and sequence requirements for Nterminal acetylation of eukaryotic proteins[END_REF][START_REF] Giglione | Protein N-terminal methionine excision[END_REF]

). Sa signification fonctionelle est encore peu claire. Nos résultats indiquent cependant que les AQPs PIP1 et PIP2 qui sont des isoformes très proches, sont différemment maturées, ce qui en retour pourraient affecter leur activité de façon différente.

Un résultat plus original est la méthylation de l'extrémité N-terminale de PIP2;1: les résidus Lys3 et Glu6 peuvent être respectivement diméthylé et mono-méthylé (Tab. 1). La méthylation de protéines membranaires végétales n'a jamais été décrite et est très peu documentée chez les protéines membranaires animales: une étude protéomique du cerveau de rat décrit 15 protéines portant des résidus lysine mono-, di-ou tri-méthylés mais aucune signification fonctionnelle ne leur a été attribuée

[START_REF] Kluck | Determinants of cytochrome c pro-apoptotic activity. The role of lysine 72 trimethylation[END_REF][START_REF] Wu | The application of mass spectrometry to membrane proteomics[END_REF][START_REF] Chen | Lysine 43 is trimethylated in subunit c from bovine mitochondrial ATP synthase and in storage bodies associated with batten disease[END_REF]

). La méthylation de la lysine est par contre très étudiée chez les histones où elle interagit avec d'autres MPTs pour moduler le fonctionnement de ces protéines et donc la transcription de gènes.

En complément de cette étude, une analyse spécifique des phosphopeptides a été conduite par une stratégie IMAC (Immobilized Metal ion Affinity Chromatography) en collaboration avec S. Laugesen (en stage post-doctoral dans l'Unité de Recherche salin (DEA S. Prak).

Notre groupe a montré que la conductivité hydraulique racinaire d'Arabidopsis baisse de 70% après deux heures de traitement salin des plantes

[START_REF] Boursiac | Early effects of salinity on water transport in Arabidopsis roots. Molecular and cellular features of aquaporin expression[END_REF]

. Cette diminution est attribuable à l'inhibition de l'activité des AQPs mais ne s'explique pas par une baisse de l'expression des gènes d'AQPs

[START_REF] Boursiac | Early effects of salinity on water transport in Arabidopsis roots. Molecular and cellular features of aquaporin expression[END_REF]

. Nous avons donc testé l'hypothèse d'une régulation au niveau des protéines, travail mené par S. Prak au cours de son DEA. En accord avec la réponse au niveau de la racine entière, la perméabilité hydrique osmotique (Pf) de vésicules de MP diminue de 60% après deux heures de traitement. Par contre, l'abondance des AQPs PIPs, mesurée par western-blot et ELISA ne change pas ce qui suggère que des MPTs pourraient réguler l'activité des PIPs. rendre compte d'une activité prépondérante dans la MP ou que sa déphosphorylation ne contribue que partiellement à la baisse de Pf observée. Nous envisageons de tester la contribution de PIP2;4 et de son état de phosphorylation à la Pf globale de la MP en 29 surexprimant de façon stable cette isoforme en suspension cellulaire d'Arabidopsis thaliana, l'activité de transport d'eau de PIP2;1 sera étudié par stopped-flow sur vésicules de MP issues de suspensions cellulaires sur-exprimant les AQPs mutées. Nous évaluerons aussi le rôle des phosphorylations C-terminales dans la localisation sub-cellulaire de PIP2;1, par le biais de fusion des mutants PIP2;1 avec la GFP, exprimés en plantes après transformation par Agrobacterium, ainsi qu'en suspensions cellulaires après transformation par biolistique.

5.2.3. Signification fonctionnelle de la méthylation des aquaporines PIP

Nous étudions la signification fonctionnelle de la méthylation N-terminale de PIP2;1 en surexprimant, de façon stable, l'AQP PIP2;1 sauvage (WT) ou mutée sur ses sites de méthylation dans des cellules en suspension d'Arabidopsis. Notons que l'isoforme PIP2;1 est un modèle intéressant car, outre le fait qu'elle soit méthylée, cette AQP est parmi les plus abondantes de la racine et est la cible d'autres MPTs (phosphorylation) et effecteurs (pH et calcium).

Verdoucq au cours de son post-doctorat. Un mutant supplémentaire (PIP2;1-EVS) a été produit, visant à augmenter la distance entre Lys3 et Glu6 et à reproduire la partie Nterminale de l'isoforme PIP2;7 qui n'a jamais été détectée comme étant méthylée. L'analyse par SM,

  eau par les stress environnementaux décrits précédemment. L'étude de leur profil d'expression tant au niveau ARNm que protéine devrait être informatif quant à leur implication dans la réponse à l'environnement. On disposera aussi de plusieurs mutants, de méthyltransférases et de protéines interagissant avec PIP2;1 qu'il s'agira alors de caractériser du point de vue de leur capacité de transport d'eau en conditions environnementales normales point de vue de la biochimie des AQPs, l'ensemble des études que j'ai menées ont mis en évidence de nouveaux mécanismes de régulation, dont certains impliquent la méthylation N-terminale. Cette MPT ne module pas l'activité de transport de l'AQP mais semble plutôt interférer avec son adressage vers la MP, voire même sa stabilité. Ces hypothèses seront examinées en détail dans le cadre d'un projet mené au laboratoire par D.-T. Luu sur la régulation de la biogenèse des AQPs et de leur relocalisation en fonction de divers stimuli. En complément de ces études, le projet que je compte développer sur les méthyltransférases et les protéines en interaction avec les AQPs, devrait fournir des hypothèses et des outils originaux pour appréhender la régulation de l'adressage des AQPs. Par ailleurs il reste à déterminer comment les MPTs des PIPs interfèrent avec la régulation de ces AQPs par le calcium et les protons, deux types d'effecteurs qui provoquent la fermeture du canal. En particulier, le calcium pourrait, au delà de ses effets directs, moduler certaines MPTs comme la phosphorylation.

	et stressantes.
	6.4. Conclusion -Perspectives
	D'un La phosphorylation est une autre MPT identifiée chez les AQPs qui est certes moins
	originale que la méthylation. L'originalité de notre approche réside dans la description d'une
	diphosphorylation de l'isoforme PIP2;1 et d'une triphosphorylation de PIP2;4, et de leur
	déphosphorylation partielle par un traitement salin des plantes. De nombreux efforts restent
	cependant à fournir pour élucider la signification fonctionnelle de ces phosphorylations. Des
	salin des plantes module l'activité des AQPs. L'étude des MPTs suggère que ce traitement résultats préliminaires suggèrent que la phosphorylation de PIP2 ;1 pourrait aussi moduler
	induirait une déphosphorylation des AQPs PIP, conduisant ainsi à une baisse d'activité de ces l'adressage de l'AQP à la MP ce qui constitue un rôle nouveau pour la phosphorylation C-
	protéines. Ce type d'étude sera mené avec d'autres conditions environnementales connues terminale d'AQPs chez les plantes.
	dans notre groupe pour moduler l'activité des AQPs, telles que l'exposition des plantes à des Une question soulevée par cet inventaire de MPTs concerne les interactions mutuelles
	espèces réactives d'oxygène (ROS) ou à l'acide salicylique. Ces études permettront d'évaluer entre ces modifications, comme cela est documenté chez les histones. Dans ce cas,
	le rôle de la phosphorylation mais aussi des autres MPTs comme la méthylation dans la phoshorylation, méthylation et acétylation sont interdépendantes et induisent des niveaux
	régulation des AQPs PIP. distincts d'organisation de la chromatine.
	On se servira aussi des données biochimiques issues de la caractérisation des

méthyltransférases et des protéines en interaction avec PIP2;1, pour identifier des contextes physiologiques dans lesquels la méthylation est impliquée. On étudiera, en particulier comment ces processus moléculaires peuvent rendre compte de la modulation du transport racinaire d'

fois plus élevée à la fin de la période d'induction florale qu'aux stades végétatif ou floral. Des résultats obtenus par la suite au laboratoire ont montré qu'il existe aussi des gradients de sensibilité le long de la plante (F. Masson, non publié). A côté de l'analyse de ces gradients de sensibilité spatio-temporels, un bilan hormonal et notamment des dosages en auxine (réalisés en collaboration avec le Pr. E. Miginiac, Paris) ont montré une augmentation transitoire de la concentration en auxine au cours de la période d'induction florale.Ce travail de thèse posait la question du contrôle de la mise en place de la sensibilité à l'auxine notamment par l'histoire hormonale de la cellule. Dans les systèmes de régénération, la mise en place par les hormones d'une compétence à un programme organogénétique donné constitue un processus à long terme. Comme les changements de sensibilité que nous observions étaient eux aussi étalés sur plusieurs semaines, les outils élaborés durant ma thèse pouvaient a priori être appliqués aux situations d'organogenèse. Cependant il était utile de disposer de systèmes où des changements de sensibilité pouvaient être induits par un traitement hormonal à court ou moyen terme. Nous avons alors testé l'apport in vivo d'auxine sur la sensibilité in vitro de l'ATPase à cette hormone et montré qu'au stade préfloral cet apport augmente la sensibilité de l'ATPase d'un facteur 100(Santoni et al. 1993). Sur cette base, une approche d'analyse de profils protéiques bidimensionnels a été engagée au laboratoire pour identifier des protéines associées à la sensibilité à l'auxine.Au final, ces travaux ont permis de caractériser des différentiels de sensibilité au cours du développement qui constituent d'une part, des outils d'étude du mode d'action de l'auxine et d'autre part, un complément ou une alternative à la démarche génétique de recherche de mutants de sensibilité.Par la suite, ces travaux ont été poursuivis par des collègues de l'équipe, au travers de l'identification d'une nouvelle famille de protéines spécifiquement associées à la MP nommées DREPP pour « Developmentally REgulated Plasma membrane Polypeptides »[START_REF] Gantet | Cloning of a cDNA encoding a developmentally regulated 22 kDa polypeptide from tobacco leaf plasma membrane[END_REF][START_REF] Logan | A new family of plasma membrane polypeptides differentially regulated during plant development[END_REF]) dont l'expression varie au cours du développement de la plante. Ces protéines constituaient des protéines potentiellement impliquées dans la variation de sensibilité à l'auxine au cours du développement de la plante.

6.2. Interactions aquaporines-protéines6.2.1. Problématique -rôle de la méthylation et de l'acétylation dans les interactions entre protéines -protéines en interaction avec les aquaporinesOn suppose que les groupements méthyl créent un environnement local hydrophobe, favorisant ainsi l'interaction avec des protéines partenaires, comme cela est décrit dans le cas des histones où la diméthylation et la triméthylation d'une même lysine provoquent le recrutement de protéines différentes sur la chromatine[START_REF] Lusser | Acetylated, methylated, remodeled: chromatin states for gene regulation[END_REF]. De plus, quelques exemples de la littérature montrent que l'acétylation N-terminale d'une protéine peut provoquer son interaction avec des partenaires protéiques spécifiques, modulant ainsi son adressage subcellulaire[START_REF] Graham | Membrane targeting: getting Arl to the Golgi[END_REF].En interagissant avec des protéines, certaines AQPs animales ont leur adressage modifié[START_REF] Madrid | Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clatrhrin-adaptator complexes[END_REF], Noda et al. 2004b, van Balkom et al. 2004). Dans une approche

Zhang, Y. and D. Reinberg. 2001. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15: 2343-2360.

électrophorétiques issus du pull down et de la chromatographie d'affinité. La technique du BIACORE sera aussi largement utilisée pour valider l'interaction entre peptides et protéines.

Des anticorps pourront être produits contre les protéines d'intérêt. Ces anticorps seront utilisés dans des expériences de co-immunoprécipitation des AQPs sauvage et mutantes surexprimées en suspension cellulaire. L'ensemble de ces opérations sera effectué de façon réciproque.

Dans la technique du Blue Native-PAGE, les protéines solubilisées sont séparées lors d'une première dimension sous forme native puis dans une seconde dimension sous forme dénaturée. Cette technique, récemment utilisée pour l'étude de la MP d'épinard [START_REF] Kjell | Protein complexes of the plant plasma membrane resolved by blue native page[END_REF]), a permis de séparer un complexe protéique majeur de 230 kDa contenant des AQPs.

Cette technique sera utilisée à partir d'extraits de cellules surexprimant les PIP2;1-WT ou mutantes. On testera par western-blot la présence des protéines en interaction dans les complexes d'AQP.

Validation in vivo

A plus long terme les interactions protéiques seront validées in vivo par des approches de biologie cellulaire. Après étiquetage de l'AQP et des protéines en interaction avec respectivement les protéines CFP et YFP, puis co-expression de ces protéines en cellules, la technique du FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) devrait permettre de valider in vivo l'interaction protéique. Cependant, cette technique est encore difficile à mettre en oeuvre et peu de données sont disponibles dans la littérature à ce sujet. On pourra donc aussi utiliser le « bimolecular fluorescence complementation » [START_REF] Walter | Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation[END_REF]) qui repose sur la reconstitution d'un complexe fluorescent par l'association de protéines en interaction. Ces deux types d'études permettront d'aborder la dynamique cellulaire de l'interaction.

Fonction des protéines en interaction

On peut anticiper que cette approche conduise à identifier en premier lieu d'autres AQPs que PIP2;1. Un tel résultat serait informatif sur la composition des tétramères d'AQPs PIP mais aussi sur le rôle éventuel joué par l'extrémité N-terminale de PIP2;1, notamment la méthylation, dans la composition des tétramères. Ceci reste cependant très hypothétique.

Conclusion


domain: math info sdv

text:
Comparison and evolution of closely related genomes: methods and examples of applications in bacteria and fungi

Helene H. Chiapello

To cite this version:

  Helene H. Chiapello. Comparison and evolution of closely related genomes: methods and examples of applications in bacteria and fungi. Séminaire du LIPM, Institut National de Recherche Agronomique (INRA). UMR Interactions Plantes -Microorganismes (0441)., Nov 2010, Toulouse, France. hal-

Comparison and evolu0on of closely related genomes: methods and examples of applica0ons in bacteria and fungi

Hélène Chiapello

November, 26 th 2010 helene.chiapello@jouy.inra.fr