Keywords: Prise alimentaire, intestin grêle, CCK, nerf vague, cerveau, cellules entéroendocrines food intake, small intestine, CCK, vagus nerve, brain, enteroendocrine cells

INTRODUCTION : S'il est fortement pressenti que la viscerosensibilité chimique intestinale, c'est-à-dire la détection des macronutriments dans le contenu intestinal est un des paramètres clé de la régulation de la prise alimentaire pendant la digestion, nos connaissances sur ces phénomènes sont encore très fragmentaires. On ignore notamment les mécanismes précis responsables de la détection des nutriments dans l'intestin et les modalités de transmission (nerveuse ou humorale) des signaux ainsi générés vers les centres de régulation du comportement alimentaire. OBJECTIF : L'objet de ces travaux a été de préciser les mécanismes de la détection des nutriments dans l'intestin et de déterminer l'implication du nerf vague dans la transmission des informations de la viscerosensibilité chimique intestinale vers le système nerveux central. RESULTATS : Les résultats obtenus ici confirment le modèle selon lequel l'intestin peut être perçu comme un organe sensoriel capable, pendant la digestion, de détecter la présence de certains macronutriments. Le nerf vague participe activement à la transmission de l'information générée au niveau de l'intestin vers le système nerveux central. CONCLUSIONS : Le système viscérosensoriel chimique intestinal est une composante sensorielle à part entière qui exerce un puissant rôle dans le contrôle de la prise alimentaire. Les avancées dans la compréhension de ces mécanismes et de leur rôle dans l'homéostasie énergétique ouvriront sans nul doute de nouvelles voies dans le développement de thérapies contre l'obésité.

Remerciements:

Je remercie tout d'abord, les institutions qui ont assuré mon financement au cours de ces trois années de thèse. Merci, à la Société Française de Nutrition, à l'école doctorale ABIES et au département d'Anatomie de Physiologie et de Biologie Cellulaire de l'Université de Californie à Davis.

First of all I would like to thank, the three institutions that provided me with financial support along these 3 years. Therefore I thank "la Société Française de Nutrition" ABIES graduate school and The University of California at Davis, Especially the Department of Anatomy Physiology and Cell Biology of the School of Veterinary Medicine.

Je tiens à remercier très chaleureusement le Docteur Helen Raybould, pour m'avoir accueilli dans son laboratoire à UC Davis. J'ai beaucoup apprécié de travailler dans son laboratoire, Helen est autant un chercheur de très grande qualité qu'elle est une personne très agréable et sympathique. J'ai gardé un excellent souvenir de mon passage dans son laboratoire.

I would like to thank warmly Dr Helen Raybould, for having invited me to work for two years in her laboratory, I loved working in her lab. Helen is both a terrific scientist and a fantastic person to know. I loved working for her. It was a real pleasure to work with Helen.

Merci au Pr. Daniel Tomé et au Dr Gilles Fromentin pour m'avoir accueilli dans leur unité, suivi et soutenu au cours de cette thèse depuis mon stage de DEA jusqu'aux dernières corrections. Sans eux rien n'aurait été possible. C'est un plaisir de travailler avec eux. Tous deux ont multiplié leurs efforts pour me permettre de réaliser ce doctorat dans de bonnes conditions.

Thank you to Pr Daniel Tomé and Dr Gilles Fromentin for supporting me from the very beginning of my research work until the very last remarks on the thesis. They worked hard to provide me with a good environment to realise this work.

Merci à tout mes collaborateurs aux États Unis avec qui j'ai travaillé pour cette thèse. Merci à: Alice Liou, Melissa Valdellon, Diana Chavez, Jim Sharp, Donia Bohan, Adam Rechs, Samara Freeman, Kellie Whited, Tim Hayes, Gabriel Paulino, Florence Milhas and Jock Hamilton.

I would like to thank my collaborators in the US: Alice Liou, Melissa Valdellon, Diana Chavez, Jim

Sharp, Donia Bohan, Adam Rechs, Samara Freeman, Kellie Whited, Tim Hayes, Gabriel Paulino,

Florence Milhas and Jock Hamilton. (please forgive me I probably forgot to include many people)

Merci à mes collaborateurs en France avec qui j'ai réalisé les travaux de cette thèse. Merci à: Syvette Gougis, Marie-Jeanne Prud'homme, Benjamin Guesdon, et l'ensemble de l'unité INRA 914.

I would like to thank my collaborators in France: Syvette Gougis, Marie-Jeanne Prud'homme,

Benjamin Guesdon, and all my labmates from unité INRA 914.

Merci beaucoup au Dr Dorothy Gietzen, grâce à qui tout a commencé, qui s'est toujours montrée disponible et dont les conseils m'ont été fort utiles lors de mon séjour aux États Unis. Le Dr Gietzen est un chercheur qui impose le respect mais c'est aussi une personne très agréable et chaleureuse.

Many thanks to Dr Dorothy Gietzen, without whom nothing would have been possible, Dr Gietzen has always been a very good advisor along these years in the US. Dr Gietzen is not only a very good scientist she is also a very nice person.

Le Dr John Horowitz a aussi très fortement marqué ces trois années de thèse. Je lui suis infiniment reconnaissant. Le Dr Horowitz est un de ces scientifiques passionnés comme on en rencontre rarement. J'ai énormément appris avec lui.

Dr Horowitz is together with Dr Raybould and Dr Gietzen the scientist who influenced me the most over the last three years, I am infinitely thankful to him, Dr Horowitz is one of these passionate scientists one rarely meet, I learned a lot working with him.

Enfin merci à mes proches, ma famille et mes amis…

Many thanks to my relatives, friends and family...

Table des matières

Table des illustrations et figures

Principes et fondements de la science du comportement alimentaire

Nombre de travaux récents indiquent que le poids corporel est un paramètre biologique important, voire déterminant pour la santé humaine (2) . Par exemple, il est désormais admis que surpoids et obésité ont des conséquences délétères sur la santé humaine. Un poids corporel excessif augmente la prévalence de pathologies telles que les diabètes de type 2, les maladies cardiovasculaires ou certains cancers. Les facteurs influençant le poids corporel sont donc perçus comme autant de cibles thérapeutiques probables dans la lutte contre ces pathologies.

L'obésité, un problème global majeur de santé publique

La prévalence du surpoids et de l'obésité augmente partout dans le monde à un rythme inquiétant. Les pays riches comme les pays pauvres sont touchés. En outre, comme ce problème semble progresser rapidement aussi bien chez l'enfant que chez l'adulte, ses conséquences réelles pour la santé risquent de n'apparaître dans toute leur ampleur que dans le futur.

Les conséquences de l'obésité pour la santé sont nombreuses et variées, allant d'un risque accru de décès prématuré à des maladies non mortelles ayant des effets indésirables sur la qualité de la vie. Parmi les conséquences les plus notables du surpoids et de l'obésité pour la santé, le diabète, l'augmentation des risques de maladies cardiovasculaires et l'augmentation des risques d'apparition de certains 14 cancers sont les plus souvent cités. Par exemple, en 2000, surpoids et obésité étaient tenus pour responsables de près de 17% des décès aux Etats-Unis. Par voie de conséquence, les dépenses de santé liées à l'obésité représentent jusqu'à 7% des dépenses de santé globales dans certains pays, et ce chiffre ne fait malheureusement qu'augmenter.

Vers une lutte thérapeutique contre l'obésité

Elaborer des stratégies thérapeutiques efficaces pour lutter contre la survenue du surpoids et de l'obésité est donc devenu une priorité de la communauté scientifique internationale. S'il est largement reconnu que l'obésité a pour origine principale une alimentation pléthorique, il est aussi clair que l'obésité survient parce que les processus physiologiques en jeu dans la régulation du poids corporel fonctionnent mal. Parmi ces processus physiologiques, la prise alimentaire semble jouer un rôle de tout premier ordre, obésité et surpoids ayant en effet très souvent pour origine un apport énergétique excessif. Malheureusement, notre compréhension des mécanismes qui contrôlent le comportement alimentaire est encore très fragmentaire. Pourtant la compréhension de ces processus offrirait sans nul doute nombre de précieuses cibles thérapeutiques.

Si on sait aujourd'hui que le cerveau orchestre le comportement alimentaire, le fonctionnement précis des processus physiologiques et neurophysiologiques sousjacents est encore largement incompris. C'est pourtant là que se trouvent les applications thérapeutiques de demain.

Introduction

Le comportement alimentaire, définitions, principes de base, approche expérimentale et mécanismes biologiques de contrôle

Régulation du poids corporel et comportement alimentaire

Introduite par Claude Bernard au XIXe siècle (12), sous le concept de milieu intérieur, puis reprise par Walter Cannon (24)

Définitions du comportement alimentaire

Un comportement se définit par les actions ou les réactions d'un sujet. Dans le cas du comportement alimentaire les actes sont relatifs à l'ingestion d'aliments. On définit donc le comportement alimentaire comme l'ensemble des actes, actions ou réactions, relatifs à l'ingestion de nourriture.

Les différentes composantes du comportement alimentaire

On distingue généralement cinq phénomènes successifs (13; 109) constituant deux types d'évènements: (1) les périodes où l'animal s'alimente appelées les repas et (2) les périodes où l'animal ne s'alimente pas ; il s'agit alors des périodes dites de latence (figure 2).

Le repas se compose de quatre phénomènes successifs, la phase d'initiation, la phase de procuration, la phase de consommation et la terminaison. La phase d'initiation consiste en la prise de décision de s'alimenter. Vient ensuite la phase de procuration au cours de laquelle le sujet va chercher à se procurer de la nourriture.

parler. La consommation s'achève par le phénomène de terminaison, coïncidant souvent avec le rassasiement.

Le temps de latence séparant la fin d'un repas du début du repas suivant est la conséquence du phénomène de satiété. Le phénomène de satiété se définit par une sensation prolongée de non faim de telle sorte que le sujet ne s'alimente pas ni ne cherche à s'alimenter.

L'initiation du repas correspond à la décision de s'alimenter, au cours de la phase de procuration le sujet recherche et se procure de la nourriture. Une fois disponible la nourriture est ingérée au cours de la phase de consommation. L'arrêt du repas est aussi appelé terminaison. Enfin une période de latence sépare la fin d'un repas du début (initiation) du repas suivant.

Principes de base du contrôle du comportement alimentaire

Le contrôle du comportement alimentaire

Nombre de phénomènes comportementaux peuvent être décrits simplement comme des systèmes entrées-intégration-sorties dans lesquels des déterminants aussi appelés entrées ou encore stimuli sont reçus et traités par un système dit intégrateur dont la fonction est de générer des sorties ou réponses (figure 3). Chacun des phénomènes présentés plus haut peut être étudié à la lumière de cette approche.

Chaque système possède des déterminants multiples et c'est particulièrement la connaissance de ces déterminants et de leurs conséquences sur le comportement alimentaire qui constitue notre compréhension du comportement alimentaire.

Le comportement alimentaire est influencé par de nombreux facteurs

Divers facteurs peuvent influencer le comportement alimentaire (13) . Parmi les plus souvent cités, on trouve l'effet de la disponibilité ou de la demande en énergie, les conséquences mêmes de la prise alimentaire (la digestion), l'influence d'autres comportements entrant en compétition avec le comportement alimentaire (comme la fuite par exemple), l'influence de pathogènes ou d'inflammations, l'influence du cycle nycthéméral, l'influence de l'âge et du vieillissement, l'état de motivation, le contexte social ou encore la valeur émotionnelle ou hédonique des aliments (figure 4). La disponibilité en énergie exerce une influence prédominante pendant la période de latence, en augmentant par exemple le temps de latence entre les repas lorsque les réserves en énergie sont élevées (26) . A l'inverse les informations générées au cours de la digestion participent à un rétrocontrôle immédiat des événements internes au repas en déterminant, par exemple, la durée de la phase de consommation ou en réglant la survenue de la terminaison du repas (rassasiement) [START_REF] Moran | Within-meal gut feedback signaling[END_REF].

Les deux déterminants cités ici revêtent un caractère d'autant plus important que c'est principalement ces phénomènes qui sont en cause dans la survenue de l'obésité.

En effet un mauvais fonctionnement du rétrocontrôle exercé lors de la digestion conduit à une augmentation significative de la taille des repas, et il a par ailleurs été constaté que des repas trop grands sont une des raisons premières de la survenue de l'obésité (2;102). Nous avons jusqu'à maintenant présenté les principaux déterminants du comportement alimentaire. Il s'agit désormais de comprendre comment, à partir de ces informations que nous venons de décrire, l'organisme va générer une réponse comportementale adaptée. Autrement dit comment, à partir des informations qui lui sont disponibles l'organisme va prendre des décisions liées à son alimentation. Déjà dans les années 1940 des scientifiques se sont aperçus que des lésions de l'hypothalamus induisaient, selon le sous-noyau lésé, une hyperphagie ou une hypophagie suggérant ainsi que parmi les nombreuses régions du cerveau, l'hypothalamus était impliqué dans le contrôle du comportement alimentaire [START_REF] Elmquist | From lesions to leptin: hypothalamic control of food intake and body weight[END_REF]. Près de 50 ans plus tard, la découverte en 1994 du gène codant pour la leptine, a constitué le premier pas vers une compréhension précise du fonctionnement hypothalamique comme coordinateur central du comportement alimentaire (114). A de nombreuses reprises, l'hypothalamus a été proposé comme un site majeur de convergence de signaux provenant par exemple de la disponibilité en énergie ou de la présence de certains macronutriments dans le contenu digestif (1; 6-10; 13; 16; 17; 101; 112).

Les mécanismes du contrôle du comportement alimentaire

Présentation de l'hypothalamus

L'hypothalamus des mammifères est une région qui, comme son nom l'indique, est située sous le thalamus, (figures 5-7). Elle est constituée de plus de 40 noyaux, euxmêmes pouvant être sous-divisés en de nombreux sous-noyaux (13) . Nous allons nous pencher plus en détail sur deux noyaux hypothalamiques qui semblent jouer un rôle majeur dans le contrôle de la prise alimentaire et plus généralement dans la régulation de l'homéostasie énergétique : il s'agit du noyau arqué (ARC) et du noyau paraventriculaire (PVN), (figure 8). Deux populations de neurones situés dans ces régions constitueraient l'élément central du contrôle du comportement alimentaire: ils forment un système de contrôle bien connu aujourd'hui: le système mélanocortine central. Il semble bien que ce réseau neuronal puisse être considéré comme le principal circuit réglant le comportement alimentaire.

Le système mélanocortine central

Des constatations expérimentales récentes ont d'abord suggéré que les produits du gène codant pour la pro-opiomélanocortine (POMC) pouvaient être associés au contrôle du comportement alimentaire. En effet, chez la souris aussi bien que chez l'homme, l'absence, d'origine génétique, ou la réduction de l'activité de ce gène ou de gènes lui étant associés, ont pour conséquences la survenue de l'obésité, une hyperinsulinémie et une hyperphagie (27; 41; 60; 106) 9). Les deux types de neurones du noyau arqué, aux effets antagonistes sur le comportement alimentaire, sont en compétition constante pour déterminer l'intensité des neurones situés dans le PVN. Les nombreuses informations disponibles pour le noyau arqué déséquilibrent la compétition entre ces deux types de neurones dans un sens ou dans l'autre, aboutissant ainsi à un effet sur la prise alimentaire via une modulation de l'activité des neurones du PVN.

Le système mélanocortine central hypothalamique est influencé par la disponibilité en énergie et par les informations émises au cours des repas.

Gestion des réserves en énergie à long terme: influence de la disponibilité en énergie sur le fonctionnement du système mélanocortine central hypothalamique: exemple de la leptine et de l'insuline

La leptine est une hormone peptidique libérée par les adipocytes. La

Action immédiate de signaux digestifs sur le système mélanocortine central hypothalamique pendant la digestion: exemple de la ghréline

La ghréline est une hormone peptidique stimulant la prise alimentaire sécrétée principalement par l'estomac lorsque celui-ci est faiblement distendu . Sa libération dans la circulation est en revanche fortement inhibée lorsque l'estomac est rempli. Des récepteurs de la ghréline ont été identifiés sur les neurones NPY/AgRP de l'hypothalamus (110) et la liaison de la ghréline à son récepteur sur ces neurones a pour effet d'augmenter leur action inhibitrice sur les neurones POMC/AgRP et les neurones du PVN [START_REF] Hewson | Systemic administration of ghrelin induces Fos and Egr-1 proteins in the hypothalamic arcuate nucleus of fasted and fed rats[END_REF]. La ghréline semble donc pouvoir jouer un rôle, non plus à long terme sur les phénomènes de satiété, mais à court terme sur les phénomènes de rétrocontrôle immédiat de la prise alimentaire lors de la digestion.

Le système mélanocortine central hypothalamique, un processeur central du comportement alimentaire.

Le système mélanocortine central hypothalamique apparaît donc comme un centre important dans le contrôle du comportement alimentaire. Il intègre des informations principalement relatives à la disponibilité en énergie, comme les taux circulants de leptine par exemple, dont nous avons précisé l'effet sur la satiété et les périodes de latence entre les repas. Le système mélanocortine central hypothalamique peut contrôler pendant la digestion certains paramètres liés la prise alimentaire via la ghréline par exemple. Toutefois l'hypothalamus est plus impliqué dans la gestion à long terme des réserves en énergie plutôt que dans le rétrocontrôle immédiat de l'ingestion pendant la digestion.

Le système mélanocortine central du tronc cérébral

Un petit nombre de neurones du tronc cérébral (figure 4

Le NTS est le principal relais des fibres vagales afférentes en provenance du tube digestif.

Les branches vagales dérivant de différents organes du tube digestif établissent des connexions dans le NTS (figure 12), notamment avec les neurones exprimant POMC. S'il a été montré qu'il existe d'autres types de neurones différents de POMC qui reçoivent des connexions des afférences vagales, les neurones POMC semblent importants tant leur présence est nécessaire à la modulation du comportement alimentaire par les informations périphériques (23). Le NTS, notamment via sa composante POMC, apparaît alors comme un acteur à part entière dans le contrôle du comportement alimentaire, avec un rôle complémentaire de celui de l'hypothalamus. L'hypothalamus semble, pour sa part, réguler principalement le comportement alimentaire à moyen ou long terme en déterminant la fréquence des repas ou les périodes de latence, autrement dit la gestion des réserves en énergie de l'organisme. Le tronc cérébral semble plus impliqué dans le contrôle immédiat de l'ingestion, en contrôlant la mastication, la déglutition ou la mécanique digestive. Loin de fonctionner indépendamment, ces deux centres sont au contraire massivement interconnectés et interagissent constamment.

Le nerf vague constitue une des principales voies par lesquelles le NTS collecte des informations en provenance de la périphérie.

L'activité du NTS est influencée par trois principaux facteurs (figure 13). D'abord le NTS via l'Area Postrema est sensible à certains facteurs circulants dans le sang. Il existe aussi, comme on l'a vu précédemment, une modulation de l'activité du NTS par d'autres structures centrales telles que l'hypothalamus. Enfin, et surtout, le NTS reçoit des informations émises depuis la périphérie, notamment au cours de l'ingestion, par voie nerveuse. Le nerf vague constitue ici la principale voie par laquelle le NTS collecte ces informations.

Les informations transmises par le nerf vague vers le NTS sous forme de trains de potentiels d'action ont deux origines correspondant à deux principales formes de stimulations: (1) des informations d'origine mécanique relatives à la distension gastrique ou aux mouvements de intestin (2) des informations d'origine chimique transmises par les médiateurs comme la CCK ou les cannabinoïdes par exemple (figure 14). La capacité du système nerveux central à s'informer sur des évènements survenant en périphérie est appelée l'intéroception ou la viscérosensibilité ou encore la sensibilité viscérale.

On distingue généralement deux voies permettant au système nerveux central de collecter des informations générées depuis la périphérie, autrement dit il existe deux voies de l'intéroception. Il existe d'abord une voie dite humorale, le support de cette information étant la concentration plasmatique d'hormones telles que la leptine ou l'insuline dont nous avons traité plus haut. Une seconde voie met en jeu un réseau de fibres nerveuses connectant le tube digestif au cerveau. Si la voie humorale est impliquée majoritairement dans la gestion à long terme des stocks d'énergie (49; 55; 58) , la voie nerveuse dont il sera principalement question dans notre travail semble intervenir dans le contrôle immédiat de l'ingestion au cours de la digestion [START_REF] Schwartz | The role of gastrointestinal vagal afferents in the control of food intake: current prospects[END_REF].

L'innervation du tractus digestif

La détection des nutriments dans l'intestin et la génération de signaux anorexigènes depuis le tube digestif

Principes généraux de la détection de macronutriments dans la lumière intestinale

Dispersées le long de l'intestin, au niveau de la membrane épithéliale, les cellules entéroendocrines (CEECs) produisent une grande variété de médiateurs et de neuromédiateurs digestifs, comme la sérotonine, le NPY, ou la cholécystokinine. La plupart de ces cellules sont situées à proximité de terminaisons vagales, qui sont les cibles des médiateurs libérés par les CEECs [START_REF] Furness | Responses of afferent neurons to the contents of the digestive tract, and their relation to endocrine and immune responses[END_REF]. La libération des médiateurs est, vraisemblablement, spécifiquement influencée par de nombreux facteurs externes tels que la présence d'un type de macronutriment dans la lumière intestinale ou par la présence d'un facteur circulant dans le milieu basal interstitiel. En libérant ces médiateurs les CEECs modulent (parfois fortement) l'activité spontanée des afférences du nerf vague situées à proximité. L'augmentation de l'activité des afférences du nerf vague est souvent considérée comme un signal anorexigène envoyé vers le système nerveux central.

Exemple de la CCK

La cholécystokinine (CCK) est un bon exemple de ces médiateurs anorexigènes.

Produite par les cellules entéroendocrines de type «I», la CCK est libérée dans le milieu interstitiel en réponse au passage, dans la lumière intestinale, de certains nutriments tels que des acides gras à chaîne longue et des oligopeptides (36; 87; 89). L'action de la CCK est double. Elle régule d'abord les fonctions digestives locales et participe ainsi à l'adaptation de la mécanique digestive aux capacités absorptives du tube digestif (contraction de la vésicule biliaire, stimulation de la sécrétion enzymatique du pancréas, stimulation du péristaltisme intestinal et inhibition de la motricité gastrique et de la vidange gastrique). Mais la CCK exerce aussi un effet anorexigène puissant à court terme [START_REF] Obici | Hypothalamic insulin signaling is required for inhibition of glucose production[END_REF] . Dans l'intestin proximal la CCK interagit avec les récepteurs CCK1 exprimés par les terminaisons vagales situées à proximité des cellules entéroendocrines, et augmente la décharge spontanée des afférences vagales. C'est principalement l'action de la CCK sur le nerf vague qui constitue le message relatif à la présence spécifique de certains nutriments dans l'intestin (96; 98)(figure 18). fragmentaires. Enfin, la plasticité de ces mécanismes, c'est-à-dire la capacité que possède ce système sensoriel à réguler sa propre activité, semble aussi un phénomène critique dans la survenue de l'obésité.

L'objet de ces études a donc été de participer à répondre aux trois questions suivantes: (1) Quels sont les mécanismes précis qui permettent la détection des macronutriments lors de leur passage dans l'intestin ? (2) Dans quelle mesure ce phénomène participe-t-il au contrôle de la prise alimentaire et à la régulation du poids corporel ? (3) Existe-t-il une plasticité, c'est à dire d'une adaptation à long terme du système intéroceptif intestinal dans des cas de stimulation

chroniques ? (Figure 19).

L'étude des mécanismes biologiques précis de la détection des macronutriments dans l'intestin

Nous tenterons d'apporter des éléments de réponse concernant les mécanismes biologiques cellulaires précis qui sous-tendent la détection de chacun des macronutriments (1 ère question). Nous présenterons trois aspects de la détection des macronutriments dans l'intestin, chacun de ces aspects étant associé à un macronutriment spécifique et à un événement précis de la cascade de transduction mise en jeu.

Nous aborderons d'abord les systèmes impliqués dans la détection du glucose dans la lumière intestinale (étude 1) puis les phénomènes transmembranaires qui leur sont associés (étude 2). Ensuite, nous étudierons les modalités de la détection des acides gras à chaîne longue au cours de la digestion et notamment l'implication d'afférences vagales CCK sensibles (étude 3). Enfin nous étudierons les phénomènes permettant la détection des protéines lors de leur passage dans l'intestin, et plus particulièrement nous tenterons de montrer qu'il existe un «transporteur membranaire » responsable de la détection des protéines (étude 4).

Implications de la sensibilité viscérale dans le contrôle de la prise alimentaire et plasticité à long terme du système intéroceptif

Ensuite reviendrons sur les modalités par lesquelles la sensibilité du nerf vague aux nutriments peut, ou ne peut pas, être à l'origine de changements dans le comportement alimentaire et la prise de poids (2 ème et 3 ème questions). Nous nous concentrerons sur le cas de la détection des protéines Nous étudierons d'abord l'implication du nerf vague dans le contrôle des fonctions digestives et de la satiété à travers deux approches, l'une par mesure immunohistochimique d'un marqueur de l'activité du système nerveux central (étude 5) et l'autre par vagotomie chimique, toutes deux en condition de régime hyper-protéique (étude 6).

La détection du glucose dans l'intestin.

Rôle de la sérotonine

Les glucides alimentaires sont connus pour stimuler la libération de nombreuses substances dans l'intestin au cours de la digestion, tels que le glucagon like peptide (GLP1) ou la sérotonine (5HT) (figure 20). Cette dernière semble être impliquée dans les mécanismes de contrôle de la mécanique digestive et dans les modifications du comportement alimentaire induites par la présence de glucose dans l'intestin (19; 35).

En effet les fibres afférentes vagales semblent être extrêmement sensibles à la présence de 5HT dans leur environnement. En retour, les fibres nerveuses vagales lorsqu'elles sont activées conduisent à une modification des cinétiques digestives et à une modification des mécanismes de contrôle du comportement alimentaire.

La libération de 5HT par la muqueuse intestinale est le fait de cellules entéroendocrines localisées dans la muqueuse intestinale, adjacentes au entérocytes.

Ces cellules sont donc au même titre que les entérocytes en contact avec l'ingesta de la lumière intestinale.

Les oses simples comme le glucose, le galactose et le fructose sont les seuls glucides à être absorbés par la muqueuse intestinale. Le glucose et le galactose

Implication des transporteurs membranaires du glucose

Des études récentes ont montré que c'est le transport via les transporteurs de type SGLT qui est à l'origine de la libération de sérotonine dans la lymphe interstitielle et par conséquent de la détection de l'absorption du glucose au cours de la digestion [START_REF] Raybould | Inhibition of gastric motility induced by intestinal glucose in awake rats: role of Na(+)-glucose co-transporter[END_REF]. Toutefois, on ignore quel transporteur précis, parmi les membres de la famille SGLT, est impliqué dans ces mécanismes d'initiation de la détection du glucose dans l'ingesta. On ne sait pas non plus quels sont les phénomènes intracellulaires qui conduisent à la libération de sérotonine par les cellules entéroendocrines.

Etude 1: Caractérisation du transporteur impliqué dans la détection du glucose dans l'ingesta, approche électrophysiologique.

Introduction L'identification du transporteur de glucose impliqué dans la détection du glucose par la muqueuse intestinale est une étape préalable à la compréhension des mécanismes qui régissent ce phénomène. Des études menées grâce à des substrats spécifiques, ont permis d'identifier, parmi les membres de la famille des transporteurs apicaux du glucose, la famille des SGLT, deux transporteurs (SGLT1 et SGLT3) potentiellement responsables de ces phénomènes [START_REF] Raybould | Inhibition of gastric motility induced by intestinal glucose in awake rats: role of Na(+)-glucose co-transporter[END_REF].

Les transporteurs SGLT sont des transporteurs qui utilisent le gradient de sodium comme force motrice pour faciliter la diffusion des monosaccharides comme le glucose ou le galactose (111). SGLT1 possède une affinité élevée et une spécificité faible pour ses substrats. En revanche SGLT3, s'il est similaire dans sa structure à SGLT1, présente une affinité faible mais une plus grande spécificité. Il est par exemple spécifique au glucose mais ne transporte pas de galactose.

Sur la base de ces constatations nous avons essayé de déterminer lequel de SGLT1 et SGLT3 initie la réponse à la présence de glucose dans l'intestin (figure 21).

Matériels et méthodes

Animaux et préparations de solutions

Des rats (Sprague-Dawley), pesant entre 200g et 300g, hébergés dans une pièce maintenue à température constante (21-23°C), ayant accès libre à la nourriture et à l'eau ont été utilisés pour ces expériences. La solution de 2-Methyl-5hydroxytryptamine (analogue de synthèse de la 5HT) a été réalisée par dissolution de 2-methyl-5HT dans du liquide physiologique, la concentration étant de 1 µmol.L -1 . Les solutions pour les perfusions intra-duodénales de glucose ou de galactose ont été réalisées dans du liquide physiologique à hauteur de 0.5 mol.L -1 . Le tampon physiologique utilisé pour l'électrophysiologie contenait: (en mM) 140 NaCl, 5KCl, 1 MgCl2, 1.3 Na2HPO4, 5 Hepes, 2 CaCl2, et 10 D-glucose. Le pH du tampon était stabilisé à 7.38 ± 0.02.

Enregistrement des décharges spontanées des afférences vagales

Cette méthode est décrite en précision en annexe 1. Brièvement, les rats sont décapités et un segment du tube digestif depuis l'oesophage jusqu'au duodénum est retiré et placé immédiatement dans du liquide physiologique oxygéné maintenu à 33°C.

Le nerf vague est identifié, isolé de l'estomac et de l'oesophage avant que ces derniers ne soient retirés de la préparation. L'intestin reçoit deux canules intra-luminales permettant la perfusion des solutions à tester et leur évacuation, et une canule intraaortique donnant accès à la circulation sanguine. L'estomac et l'oesophage sont retirés.

Le nerf vague est disséqué et placé sur le pôle d'une électrode de platine. Un morceau de tissu conjonctif environnant est placé sur l'autre pôle de l'électrode et sert de référence. Lors de l'enregistrement l'extrémité de l'électrode est recouvert d'huile minérale, assurant l'isolation des deux pôles. La vitesse de perfusion des solutions est de 2.0-2.5 mL/min. Chaque solution est suivie, 5 min après, d'un rinçage de la lumière du duodénum par du liquide physiologique.

Analyse des enregistrements

Les potentiels d'actions ainsi enregistrés sont envoyés vers un amplificateur (AM System 1700 differential AC Amplifier) affichés sur un oscilloscope (modèle 3012, Tektronix) et enregistrés simultanément sur un ordinateur (PC) équipé du logiciel Spike2 via un module de conversion A/D (Micro 1401 MK2, CED). Les potentiels d'action pouvant provenir de plusieurs neurones, nous effectuons une discrimination des signaux basée sur certains paramètres morphologiques de la forme d'onde qu'ils génèrent.

On considère qu'une fibre répond à une stimulation lorsque son coefficient de réponse (= moyenne des potentiels d'action pendant la première minute suivant la stimulation/moyenne des potentiels d'action pendant la dernière minute précédant la stimulation) est supérieur ou égal à 1.2. À l'inverse on considère qu'il n'y a pas de réponse spécifique à une stimulation si le coefficient de réponse est inférieur à 1.2.

Enregistrement des décharges spontanées des afférences vagales en réponse à la perfusion de glucose et de galactose.

Après avoir été placées sur l'électrode, les fibres sont laissées au repos pendant 30 minutes avant le début du protocole expérimental. Dans un premier temps, un volume de 0.2 mL de la solution de 2-methyl-5HT est injecté dans la canule intraaortique et ne sont conservées que les unités neuronales répondant à cette injection (donc sensibles à la sérotonine). Ensuite, une solution de glucose est perfusée dans la canule intra-duodénale. La perfusion dure 1 min et est laissée dans la lumière duodénale pendant les 4 minutes suivantes. Le contenu de l'intestin est rincé avec du liquide physiologique. Puis, 15 minutes plus tard, une solution de galactose est perfusée dans la canule intra-duodénale et, de la même façon, y est laissée 5 min avant d'être rincée par du sérum physiologique.

Résultats

Les résultats obtenus sont présentés dans la table 1

Objectif de l'étude

Nous avons choisi de déterminer dans cette étude si la détection du glucose était un phénomène impliquant une dépolarisation transmembranaire (figure 23).

Conclusion sur les mécanismes cellulaires de la détection du glucose dans l'intestin.

Au vu des expériences décrites dans ce chapitre nous tenterons ici de proposer un modèle de détection du glucose dans l'intestin au cours de la digestion.

La détection du glucose dans l'intestin semble être initiée, du moins en partie, par la liaison du glucose au transporteur SGLT3, sur des cellules entéroendocrines sérotoninergiques. Ce transporteur, proche du transporteur SGLT1, semble, à la différence de ce dernier, ne pas contribuer de façon significative à l'absorption de glucose, et pourrait jouer un rôle de détecteur membranaire spécifique au glucose.

Il est vraisemblable que la détection du glucose dans la lumière intestinale induise la production (ou l'activation) de seconds messagers intracellulaires, plutôt que des variations de voltage transmembranaire, conduisant à la libération de sérotonine intracellulaire.

Enfin il est prévisible que cette libération de sérotonine augmente l'activité spontanée des afférences vagales innervant le duodénum et contribue ainsi au contrôle de la mécanique digestive et du comportement alimentaire (figure 25).

Introduction La détection des acides gras par l'organisme

Les mécanismes de détection des acides gras à chaîne longue dans l'intestin, au cours de la digestion.

Pour comprendre les mécanismes de la détection spécifique des acides gras à chaîne longue dans la muqueuse intestinale, il est nécessaire de connaître les voies En conclusion, il est vraisemblable que le nerf vague joue un rôle clé dans le contrôle de la prise alimentaire par les acides gras à chaîne longue en relayant l'information initiée par la libération d'apo A-IV dans l'intestin.

Discussion

Ces données suggèrent que l'apo A-IV libérée au cours de la digestion lors de l'absorption d'acides gras à chaîne longue influence le fonctionnement digestif (et très vraisemblablement par la même occasion la prise alimentaire) via une action sur les terminaisons vagales de la branche duodénale. De plus, étant donnée l'action inhibitrice qu'exerce un antagoniste des récepteurs CCKR1, il est légitime de proposer que les afférences CCK-sensibles sont impliquées dans ce phénomène, autrement dit que l'apo A-IV stimule les terminaisons CCK sensibles du nerf vague au niveau de l'intestin proximal (figure 28). S'il permet d'avancer considérablement dans notre compréhension des mécanismes de la détection des acides gras à chaîne longue dans l'intestin, ce travail pose néanmoins de nouvelles questions. Pour progresser encore dans notre compréhension de ces mécanismes, il est maintenant critique de savoir comment l'apo A-IV stimule l'activité spontanée du nerf vague.

Conclusion

Cette étude illustre bien les mécanismes de la détection périphérique des nutriments. Lors de leur absorption, les nutriments émettent des signaux qui sont détectés par des cellules spécialisées dont la fonction est de sécréter des médiateurs qui, à leur tour, vont activer les terminaisons vagales innervant l'intestin proximal.

L'augmentation de l'activité de ces fibres constitue le signal relatif à la présence spécifique de certains types de macronutriments dans l'intestin et participe, entre autres, au contrôle du comportement alimentaire.

Article: Glatzle J, Darcel N, Rechs AJ, Kalogeris TJ, Tso P and Raybould HE. Apolipoprotein A-IV stimulates duodenal vagal afferent activity to inhibit gastric motility via

Les stratégies mises en place par l'organisme pour s'informer de la disponibilité en protéines et/ou en acides aminés sont nombreuses.

Il est donc peu étonnant que l'organisme ait mis au point des systèmes lui permettant de s'informer de la disponibilité en acides aminés et en protéines.

Au niveau cellulaire d'abord, certaines cellules sont sensibles aux taux d'acides aminés à chaînes ramifiées. En fonction du taux de ces acides aminés, elles modulent la synthèse protéique (3). D'autres systèmes récemment découverts chez la levure détectent les carences en acides aminés via les ARN de transfert non chargés qui déterminent l'activation d'une enzyme de contrôle du métabolisme cellulaire, GCN2 (4).

Certaines régions du cerveau comme le cortex piriforme antérieur ont pour fonction (entre autres) de détecter les carences en acides aminés dans l'alimentation et, sur la base de ces informations, d'influencer le comportement alimentaire [START_REF] Hao | Uncharged tRNA and sensing of amino acid deficiency in mammalian piriform cortex[END_REF].

Les protéines alimentaires sont détectées lors de leur absorption dans l'intestin.

En

L'activité de PEPT1 au cours de la digestion initie-t-elle la détection des oligopeptides dans l'intestin ?

Il apparaît donc légitime de proposer que l'activité d'absorption d'oligopeptides via le transporteur PEPT1 soit à l'origine de la détection des protéines alimentaires au cours de la digestion. Nous avons choisi de tester cette hypothèse.

Étude 4: Détermination du rôle du transporteur d'oligopeptides PEPT1 dans la détection des oligopeptides du contenu digestif

Résumé de l'étude

Discussion

Cette étude démontre que l'activité de PEPT1 au cours de la digestion initie la détection des oligopeptides dans l'intestin (figure 29). Toutefois, à la lumière de ces avancées de nouvelles questions sont soulevées.

Comment l'activité de PEPT1 peut-elle générer un signal cellulaire ?

Une seconde question se pose alors: en supposant que l'activité de PEPT1 déclenche la libération de CCK par les CEECs, comment l'activité de PEPT1 peut elle générer un signal ayant un sens pour la cellule ?

Compte tenu des données sur le fonctionnement de PEPT1, plusieurs hypothèses peuvent être proposées. Premièrement, puisque PEPT1 est un symporteur proton/oligopeptides, il fait entrer des protons dans l'entérocyte. L'activité de PEPT1 est donc associée à un changement local de pH intracellulaire qui pourrait initier une cascade de signalisation [START_REF] Kennedy | Optimal absorptive transport of the dipeptide glycylsarcosine is dependent on functional Na+/H+ exchange activity[END_REF]. Cependant, les variations locales de protons sont 123 rarement à l'origine de mécanismes de signalisation intracellulaire. Cette hypothèse est donc peu probable.

Une analyse plus approfondie du fonctionnement de PEPT1 permet de proposer une seconde hypothèse. L'activité de PEPT1 conduit à l'augmentation intracellulaire de proton, il existe un échangeur ionique protons sodium localisé au niveau de la membrane apicale. Son rôle est d'échanger les protons entrés via PEPT1 avec des ions Na + pour maintenir le pH interne constant. Le bilan de l'activité de PEPT1 est donc une augmentation nette de la concentration intracellulaire de Na + . Cette augmentation peut constituer l'élément initiateur de la détection des protéines dans l'intestin, puisque l'entrée massive de Na + dans une cellule a pour conséquence sa dépolarisation.

Toutefois, considérant les concentrations de sodium de part et d'autre de la membrane, la quantité de sodium à faire pénétrer reste relativement importante. Cette hypothèse aussi paraît peu probable.

Troisième hypothèse, il se peut que PEPT1 interagisse avec des messagers intracellulaires tels que les MAP Kinases. Il a, en effet, été montré que PEPT1 influence l'activité de certaines de ces protéines connues pour jouer un rôle clé dans la signalisation intracellulaire [START_REF] Murai | Control of c-fos expression in STC-1 cells by peptidomimetic stimuli[END_REF]. Toutefois, ces voies de signalisation intracellulaires semblent ne pas être impliquées dans les phénomènes de sécrétion de CCK.

Où est localisé PEPT1 ?

Une question préalable à l'étude des mécanismes par lesquels PEPT1 pourrait déclencher la libération de CCK est aussi de savoir sur quel type de cellule se trouve le transporteur. Il a en effet été suggéré que PEPT1 est aussi situé dans d'autres cellules de la muqueuse intestinale. Certaines cellules proches des cellules entéroendocrines comme les cellules de la lignée STC1 expriment PEPT1.

Des données très fragmentaires que nous avons recueillies sur des intestins de rat fixés laissent penser qu'il y a probablement des transporteurs sur les cellules entéroendocrines CCKergiques dans l'intestin mais la précision des données obtenues ne permet pas de conclure (figure 30 et 31).

Article: Darcel NP, Liou AP, Tome D and Raybould HE. Activation of vagal afferents in the rat duodenum by protein digests requires

PepT1.

129

Étude 5: Effets d'un régime hyper-protéique sur l'activation des régions du système nerveux central impliquées dans la régulation de la balance énergétique Introduction

Les protéines semblent pouvoir fortement influencer le comportement alimentaire. En effet, parmi les trois macronutriments, les protéines semblent posséder un puissant pouvoir inhibiteur sur la prise alimentaire (11). La compréhension des mécanismes à l'origine de ce phénomène est donc d'une importance critique. Pourtant ces mécanismes sont encore mal connus.

Nous avons vu dans la première partie que certains mécanismes ayant lieu au niveau de l'intestin permettent de détecter la présence de produits de la digestion des protéines lors de leur absorption. Toutefois, les liens entre cette détection précoce et les effets des protéines alimentaires sur le comportement alimentaire sont encore très mal connus.

Il s'agit ici de comprendre, en plus des effets des protéines sur le système nerveux central, si l'action des protéines sur la prise alimentaire peut être mise au crédit (au moins en partie) de la viscérosensibilité et notamment de sa composante vagale.

Conclusion

Pour conclure, si cette étude confirme l'implication de la viscérosensibilité vagale dans l'effet des protéines ingérées sur le comportement alimentaire, elle soulève par là même deux nouvelles questions: s'il est acquis que le nerf vague est impliqué dans ce phénomène, dans quelle mesure y participe-t-il? Existe-t-il une modulation de l'activité du nerf vague en condition de stimulation massive et chronique par des protéines alimentaires? C'est à ces questions précisément que nous allons tâcher de répondre dans la seconde partie de ce chapitre.

Article: Darcel N, Fromentin G, Raybould HE, Gougis S, Gietzen DW and Tome D. Fos-positive neurons are increased in the nucleus of the solitary tract and decreased in the ventromedial hypothalamus and amygdala by a high-protein diet in rats.

143

Introduction

Bien

Objet de l'étude

L'objet de cette étude était donc de déterminer laquelle des voies de transmission de l'information depuis le tube digestif vers le système nerveux central était impliquée dans la détection périphérique des protéines alimentaires.

Méthodes

Traitement à la capsaïcine

5 rats ont été traités avec des injections successives de doses croissantes de capsaïcine (90% grade, Sigma Chemical, St Louis, MO) en vue de leur déafferentiation spécifique par excitotoxicité (annexe 4). La solution de capsaïcine a été obtenue en dissolvant la poudre de capsaïcine dans une solution véhicule à base de Tween 80 (10%), de DMSO (10%) dans une solution de NaCl 0.9% (80%). Une série de 3 injections sous-cutanées (sous la peau du cou) ont été réalisées sur une période de 24h. Les rats ainsi traités on reçu une première dose de capsaïcine (25 mg/kg) puis deux autres doses de solution de capsaïcine (50 mg/kg) ; toutes les injections étant espacées de 12h et réalisées sous anesthésie par inhalation de halothane. 10 min avant chaque anesthésie les rats recevaient une injection de sulfate d'atropine (15mg/ml, 0.2 ml, IP). A la suite des injections, les rats ont montré une vasodilatation cutanée témoin du succès du traitement [START_REF] Ledda | Cardiovascular effects of capsaicin-sensitive neurons[END_REF]. 5 autres rats (groupe témoin) ont subi un traitement similaire, à l'exception notable que la solution injectée ne contenait pas de capsaïcine.

Depuis leur arrivée et jusqu'à sept jours après le traitement à la capsaïcine les rats étaient nourris avec des granulées standard. A partir du huitième jour suivant le traitement les rats ont été nourris pendant 4 jours avec un régime normo-protéique

Résultats

Suivi des traitements

Les rats ont récupéré rapidement des différents traitements et ont recommencé à prendre du poids. Au début du régime hyper-protéique nous n'avons pas constaté de différence significative (p>0.7) entre les groupes expérimentaux.

Prise alimentaire

La prise alimentaire cumulée pendant la durée de l'expérience est présentée en figure [START_REF] Dow | Integrative physiology and functional genomics of epithelial function in a genetic model organism[END_REF]. Il apparaît que le traitement à la capsaïcine n'a pas induit de changement significatif dans la consommation du régime HP. Bien que nous ayons enregistré une augmentation totale de 5.9 %, cette augmentation n'a pas été significative. Néanmoins, nous avons observé une tendance des animaux ayant subi une déafférentation sélective à manger plus du régime HP que les animaux n'ayant subi qu'un traitement avec le véhicule (témoins).

Prise de poids

En revanche, nous avons observé au cours de cette expérience un gain de poids significativement plus élevé chez les rats préalablement traités à la capsaïcine par rapport aux rats traités avec le véhicule (p=0.04). Le gain de poids total au cours de l'expérience est présenté en figure 34. Le gain poids total des rats traités ayant subi une déafférentation sélective était supérieur de 29% au poids des rats témoins.

Vers une physiologie intégrative

Références Bibliographiques

Introduction

Ample evidence exists demonstrating the importance of the extrinsic sensory innervation in mediating inhibition of gastric emptying (7; 12; 23), gastric acid secretion (17), stimulation of pancreatic secretion (16) and inhibition of food intake (26; 28) in response to the presence of nutrients in the intestinal lumen. Ablation of small intestinal afferents using intraluminal perfusion of the sensory neurotoxin capsaicin, has demonstrated that afferent nerve terminals located in the wall of the gut mediate the majority of the response to macronutrients (30; 32).

Different macronutrients can activate separate and distinct pathways via release of mediators, suggesting specific sensory transduction mechanisms exist in the gut wall. There is good evidence to suggest that 5-HT is involved in mediating inhibition of gastric motility and food intake, and stimulation of pancreatic secretion in response to intestinal perfusion with glucose via stimulation of 5-HT 3 receptors located on vagal afferent nerve terminals (15; 16; 22).

Glucose in the intestinal lumen results in the release of a number of peptides and neurotransmitters, including the incretin hormones, gastrointestinal inhibitory peptide (GIP) and the glucagon-like peptides, GLP-1, GLP-2 (4), and 5-HT (16; 18; 20). There is evidence that release of GIP and GLP-1 involves a mechanism similar to insulin release from the pancreas, via generation of ATP and opening of K ATP channels in the membrane (25). However, a different mechanism for glucose-induced release of 5-HT from EC cells has been suggested. We have shown that in an enterochromaffin cell line, BON, release of 5-HT stimulated by glucose is mimicked by α-methyl glucose, a non-metabolizable analog of glucose and inhibited in the presence of the competitive blocker of SGLT, phloridzin (13). This suggests a mechanism involving transport of glucose via SGLT in glucose-mediated release of 5-HT in the gut. Further support of this hypothesis comes from observations that glucose-induced inhibition of gastric motility in awake rats is attenuated by co-infusion of phloridzin, a competitive inhibitor of SGLT (24), suggesting that transport of glucose into enterocytes via SGLT-1 is important in the ability of the gut to detect the presence of luminal glucose and subsequent 5-HT-mediated activation of the vagal afferents.

Recently, evidence has been obtained to support the idea of a member of the SGLT family of transporter as a glucose sensor in smooth and skeletal muscle (3). Human SGLT-3

(hSGLT-3), which has 70% homology with hSGLT-1, is expressed in smooth and skeletal muscle, and possibly localized to neurons in the enteric nervous system. In hSGLT-3 transfected oocytes, glucose was not transported across the membrane but depolarized the membrane potential with a Km of 20 mM; this depolarization was specific for D-glucose (galactose had no effect) and was blocked by phloridzin.

The specific aim of the present study was to determine the mechanism by which glucose is detected in the intestinal lumen, leading to release of 5-HT and activation of the vagal afferent pathway and alteration of intestinal function. Ingested carbohydrate is hydrolyzed within the lumen and the brush border of the intestine and is absorbed as monosaccharride. Glucose and galactose are absorbed via the sodium-coupled transporter SGLT-1 located on the apical surface of the enterocyte and extruded out of the basolateral membrane by facilitated diffusion via the carrier GLUT 2 (14). The sensory transduction mechanism may lie at or beyond the apical membrane and may reside within epithelial cells, possible the EC cells. We test the hypothesis that an SGLT protein is involved in the sensory transduction for glucose, specifically involved in release of 5-HT from enterochromaffin cells in the intestinal mucosa. In order to test our hypothesis, we measured changes in gastric motor function, intestinal secretory function and stimulation of vagal afferent fiber discharge in response to different analogues of glucose and to galactose. In addition, we measured release of 5-HT from the intestine in response to glucose and galactose by measuring concentration in mesenteric lymph harvested from awake rats. In order to determine whether SGLT-3 is expressed in the intestinal mucosa, we measured mRNA by real time quantitative PCR. Experimental Protocols: Inhibition of gastric motility was measured during duodenal perfusion with saline and compared to intraduodenal perfusion with glucose or galactose (10 min at 0.05 ml/min, 660 mM, 60 mg and 990 mM, 90 mg respectively); the order of perfusion was randomized.

Measurement of intestinal secretion in anesthetized rats

Net ileal fluid absorption or secretion was measured in anesthetized rats (sodium pentabarbitol, 60 mg/kg ip) as previously described (19). Following a midline abdominal incision, a small incision was made into the terminal ileum approximately 2 cm rostral to the ileo-cecal junction. A pre-weighed 2.5% agarose cylinder (type II-A: 140 mM NaCl/5mM KCl; dimensions diameter 4 mm, length 3 cm) was inserted into the lumen and the intestine sutured closed. After 90 minutes, the agarose cylinder was removed and re-weighed; the difference between the initial and final weight of the agarose cylinder was taken as a representative measure of the net absorption/secretion in that segment of intestine. Data are expressed as µl fluid/cm 2 /hr.

Experimental Protocols: Prior to anesthesia, rats were randomized into 3 groups; water 1 ml, glucose (660 mM, 990 mM, 120 and 180 mg) or galactose (990 mM, 180 mg) was administered by oral gavage and rats anesthetized after 15 min. Data Analysis. Values were compared using one way ANOVA followed by Tukey's test and considered significantly different if P<0.05. Differences in mesenteric lymph concentrations were determined using a two-tailed unpaired t test.

Results

Effect of glucose analogs on gastric emptying in awake rats

Under control conditions, during intraduodenal perfusion of saline (0.05 ml/min for 10 min), 76 + 3% of the contents of the stomach emptied in 10 min (n=6

Effect of glucose analogs and galactose on intestinal secretion

In anaesthetized rats treated with vehicle (1 ml water gavage, 15 min before induction of anesthesia), the net fluid movement across the ileum was absorptive (n=16, Fig 3).

Treatment with glucose (120, 180 mgs) or α-methyl glucose (180 mgs) produced a significant decrease in intestinal fluid absorption (p<0.01, n=5-8 in each group). However, treatment with galactose (180 mg) had no significant effect on intestinal fluid flux (NS, n=5).

Effect of glucose and galactose on release of 5-HT

In awake rats, basal release of 5-HT was measured in mesenteric lymph (Fig 4). The release of 5-HT was was increased by perfusion of the intestine with glucose (660 mM, 0.05 ml/min for 60 mins; n=7). The peak increase in the output of 5-HT occurred in the first 15 min (equivalent to perfusion of 90 mgs glucose) and then decreased towards baseline despite continued glucose perfusion. 5-HT release was higher in rats in which the intestine was perfused with glucose compared to galactose perfusion (change from basal, pmol; glucose vs galactose; 2.64 ± 0.75 vs 0.66 ± 0.46); however, this did not reach statistical significance (p<0.055; n=7 and 6, glucose vs galactose).

Effect of glucose and galactose on vagal afferent fiber discharge Data was obtained from 7 fibers of the vagus nerve trunk and single fiber activity was obtained from 23 units. Of these 23 units, 19 responded with an increasing in firing to intraarterial injection of the 5-HT 3 R agonist, 2-methyl 5-HT (mean RQ = 1.54 ± 0.5). Of these 18 units, 7 responded to intraduodenal perfusion of glucose (mean RQ = 1.32 ± 0.2); however, no glucose-sensitive units responded to intraduodenal galactose (mean RQ = 1.05 ± 0.4, n=6 glucose-sensitive fibers).

Real time PCR for SGLT-1 and SGLT-3 mRNA for both SGLT-1 and SGLT-3 were detected in the rat intestinal mucosa.

Discussion

In the present study, we investigated the mechanism involved in the detection of monosaccharides in the intestinal mucosa. Initial experiments were aimed at determining whether the monosaccharide has to be a substrate for SGLT or to be able to enter metabolic pathways within the gut wall to initiate a response. Inhibition of gastric emptying in response to monosaccharide in the intestine was produced only in response to glucose analogues (3-Omethyl glucose and α-methyl glucose) that are substrates for the SGLT family of transporters.

Metabolism of monosaccharide within the epithelial cell layer does not appear to be required because 3-O-methyl glucose, a non-metabolizable substrate of SGLT, was as effective to inhibit gastric motility as glucose and α-methyl glucose. GLUT-2, responsible for the transport of glucose across the basolateral membrane of enterocytes, is not involved since 2deoxy-D-glucose had no effect on the rate of gastric emptying. This supports a role for SGLT in mediating the response to glucose in the intestine. In addition, this data is consistent with other published data; we previously demonstrated that intestinal perfusion of glucose inhibits gastric motility via a phloridzin-sensitive pathway in anesthetized rats suggesting that SGLT may play a role in the initiation of the response to glucose (24).

Recent evidence has suggested that hSGLT-3, a member of the SLC5 family of transporters, might be a glucose sensor because it binds but does not efficiently transport glucose (3). hSGLT-3 has a much lower affinity for galactose than glucose. In order to functionally discriminate between SGLT-1 and SGLT-3, we determined the effect of glucose versus galactose on inhibition of gastric motility, stimulation of vagal afferent activity, release of 5-HT and stimulation of intestinal fluid secretion. Inhibition of proximal gastric motility,

shown to be important in the regulation of gastric emptying, was observed in response to glucose but not galactose. Glucose-mediated inhibition of gastric motility is mediated via a vago-vagal reflex pathway involving 5-HT 3 receptors, located on vagal afferent nerve terminals in the intestinal mucosa (2;22). Similarly, galactose was ineffective to stimulate vagal afferent fiber activity than glucose. Because galactose has a much lower affinity for SGLT-3 than glucose, yet the same affinity for SGLT-1, these results suggests that the mechanism involved in detection of glucose in the intestinal mucosa to initiate release of 5-HT an activation of the 5HT 3 R dependent vagal afferent pathway involves SGLT-3 rather than SGLT-1.

It has been known for sometime that instillation of glucose solutions into the intestine will release 5-HT from enterochromaffin cells in the wall of the gut. Release of 5-HT from enterochromaffin cells and results in activation of vagal afferents and vagal reflex pathways in response to intestinal glucose is mediated via 5-HT 3 Rs but the exact mechanism between the lumen and the nerve terminals remains to be elucidated (20). Using the entrochromaffin-like cell line BON, we demonstrated that release of 5-HT in response to glucose is also dependent on a SGLT protein (13). We concluded that this was SGLT-1; BON cells express mRNA and the protein for SGLT-1 and release of 5-HT from BON cells was phloridzin-sensitive.

However, in light of the new findings suggesting that the glucose sensor may be SGLT-3, two observations suggest that release of 5-HT maybe dependent on SGLT-3 rather than SGLT-1.

Application of phloridzin alone stimulated release of 5-HT from BON cells suggesting that binding of glucose or phloridzin to SGLT-3 may be the sufficient stimulus to elicit 5-HT release. Second, the concentration required to elicit 5-HT release from BON cells in response to glucose were in excess of the kM for glucose binding to SGLT-1. Recent evidence suggests that, at least for human SGLT-3, the affinity for binding of glucose is considerable higher than hSGLT-1. Therefore, in BON cells it is possible that SGLT-3 mediates 5-HT release in response to glucose. We have preliminary evidence that BON cells express mRNA for SGLT- Glucose was more effective than galactose in releasing 5-HT. mRNA for SGLT-3 was detected in the intestinal mucosa, supporting a role for SGLT-3 in the detection of glucose, release of 5-HT and activation of reflex pathways to regulate gastrointestinal motor and secretory function.

In immunochemical studies of the human intestine, expression of SGLT-3 was localized to the neurons in the myenteric plexus; preliminary observations suggest that these were cholinergic neurons (3). Activation of cholinergic reflex pathway in the intestine by 5-HT and 5-HT 3 receptors has been shown to stimulate fluid secretion (19). Therefore, we determined the effect of glucose, given by oral gavage, on fluid secretion in the distal ileum.

Under basal conditions in anesthetized rats, the intestine undergoes net absorption of fluid.

The direct effect of glucose on net luminal fluid balance is to promote absorption, either by passive movement or by water transport along with glucose and sodium (6). The effect of glucose in the proximal gut on fluid secretion in the distal gut is to increase fluid secretion, presumably to bring intestinal contents to isotonicity in the first part of the postprandial period. It is well established that intestinal secretion can be regulated by the enteric nervous system and that 5-HT acting at 5-HT 3 Rs plays a role (8;29). Activation of 5-HT 3 receptors on nerve terminals depolarizes myenteric neurons, some of which have been identified as intrinsic primary afferent neurons (1;31). In the present study we measured effects of luminal glucose on fluid secretion in the terminal ileum. In this model, intestinal fluid secretion is stimulated by agonists of 5-HT 3 R and secretion stimulated by mechanical stimulation of the mucosa or by abdominal irradiation is reduced by 5-HT 3 R antagonist (19) In the present study, the terminal ileum was absorptive under basal conditions and glucose produced an increase in intestinal fluid secretion, the magnitude of which was dependent on the amount of glucose administered. In contrast, galactose had no effect on intestinal fluid absorption, suggesting the importance of SGLT-3 rather than SGLT-1 in the detection of glucose in the proximal GI tract.

There are other glucose-sensitive cells within the body that play a role in glucose homeostasis, including pancreatic ß-cells, hypothalamic neurons and enteroendocrine cells.

The release of the incretin hormones, gastrointestinal inhibitory peptide (GIP), and the glucagon-like peptides, GLP-1, in response to glucose is mediated by the regulation of ATPsensitive K channels (27). However, more recent evidence suggests that other mechanism maybe involved, including SGLT-1 and G-protein coupled sweet-tasting receptors (5;11).

There is evidence, as least for the glucose-induced release of GLP-1 may involve SGLT-1, although similar to beta cells of the pancreas, it is likely to also involve K ATP channels. This mechanism is unlikely to be the case in release of 5-HT because non-metabolizable analogues of glucose are able to induce release of 5-HT and to activate vago-vagal reflexes.

In summary, we have obtained evidence to support the hypothesis that SGLT-3 is involved in glucose-sensing in the wall of the gut. Sensing of glucose at the brush-border membrane of the intestine is important to mount appropriate reflex control of gastrointestinal secretion and motility in the postprandial period. Physiologie: La physiologie (du grec φύση, phusè, la nature, et λόγος, logos, l'étude, la science) étudie le fonctionnement mécanique, physique et biochimique des

Figure 1 : 19 Figure 2 : 22 Figure 3 : 24 Figure 4 : 26 Figure 5 : 30 Figure 6 : 30 Figure 7 : 31 Figure 8 : 31 Figure 9 : 35 Figure 10 : 37 Figure 11 : 38 Figure 12 : 41 Figure 13 : 44 Figure 14 : 45 Figure 15 : 47 Figure 16 : 50 Figure 17 : 53 Figure 18 : 56 Figure 19 : 60 Figure 20 : 67 Figure 21 : 74 Figure 22 : 80 Figure 23 : 82 Table 2 : 88 Figure 24 : 89 Figure 25 : 93 Figure 26 : 98 Figure 27 :Figure 28 :Figure 29 :Figure 30 :Figure 31 :Figure 32 :Figure 33 :Figure 34 :Figure 35 :

 11922232442653063073183193510371138124113441445154716501753185619602067217422802382288248925932698272829303132333435 Figure 1: La régulation du poids corporel. ..................................................................................................................................................................................................... ........19 Figure 2: les différentes phases du comportement alimentaire............................................................................................................................................................... ...............22 Figure 3: modélisation basique d'un comportement, le schéma entrées-intégration-sorties.......................................................................................................................... .........24 Figure 4: Les facteurs influençant le comportement alimentaire........................................................................................................................................................................... ..26 Figure 5: Localisation de l'hypothalamus (homme).................................................................................................................................................................................. ..............30 Figure 6: Localisation de l'hypothalamus (Rat)..................................................................................................................................................................................................... ..30 Figure 7: Localisation de l'hypothalamus (Rat)..................................................................................................................................................................................................... ..31 Figure 8: Localisation des principaux noyaux de l'hypothalamus impliqués dans l'homéostasie énergétique.................................................................................................... .....31 Figure 9: Fonctionnement du système mélanocortine hypothalamique......................................................................................................................................................... .........35 Figure 10: La leptine comme indicateur des réserves en énergies...................................................................................................................................................................... ...37 Figure 11: Influence de la leptine sur le système mélanocortine hypothalamique.................................................................................................................................... ..............38 Figure 12: Le Noyau du Faisceau Solitaire............................................................................................................................................................................................. ...............41 Figure 13: Facteurs influençant l'activité du Noyau du Tractus Solitaire.............................................................................................................................................................. ...44 Figure 14: Surveillance du tube digestif par le nerf vague................................................................................................................................................................................ ......45Figure 15: L'axe tube digestif cerveau, principe de fonctionnement........................................................................................................................................................... ........... 47 Figure 16: L'axe tube digestif cerveau, surveillance du tube digestif par le système nerveux autonome.......................................................................................................... ......50 Figure 17: Les modalités de l'innervation de l'intestin par le nerf vague....................................................................................................................................................... ..........53 Figure 18: La détection des nutriments dans l'intestin...................................................................................................................................................................................... ......56 Figure 19: Les questions..................................................................................................................................................................................................................................... ...60 Figure 20: Principe général de la détection du glucose dans l'intestin.................................................................................................................................................................. ..67 Figure 21: Deux candidats pour la détection des glucides simples dans l'intestin....................................................................................................................................... ...........70 Table 1 Résultats de l'enregistrement électrophysiologique de l'activité du nerf vague.................................................................................................................................. ........74 Figure 22: La détection du glucose par les cellules bêta du pancréas.................................................................................................................................................................. ..80 Figure 23: Deux Hypothèses pour la détection du glucose par les CEECs de l'intestin.................................................................................................................................... ......82 Table 2: Paramètres d'acquisition des enregistrements de patch clamp...................................................................................................................................................... ..........87 Table 3: résultats des expériences de patch clamp............................................................................................................................................................................................. ...88 Figure 24: Effet du glucose sur le potentiel transmembranaire de deux types de cellules entéroendocrines...................................................................................................... ....89 Figure 25: Mécanisme proposé de la détection du glucose dans l'intestin............................................................................................................................................... ..............93 Figure 26: La détection des acides gras à chaîne longue au cours de la digestion ................................................................................................................................... ............98 Figure 27: modalités d'action de l'APO A-IV........................................................................................................................................................................................ ................101 Figure 28: Comment l'apo A-IV agit-elle sur le nerf vague?................................................................................................................................................................... ..............104 Figure 29: La détection des protéines alimentaires au cours de la digestion.................................................................................................................................................. ......122 Figure 30: Co-localisation de PEPT1 et de la CCK dans une crypte intestinale d'un duodénum de rat..................................................................................................... ...........126

  au début du XXe siècle sous le concept d'homéostasie, l'idée que les paramètres biologiques sont soumis à une régulation visant à les maintenir constants est un des principes fondateurs de la physiologie moderne. L'idée que le poids corporel soit ainsi soumis à un contrôle homéostatique a été avancée depuis longtemps. Dans le cas précis du poids corporel la présence d'une régulation stricte est toutefois à nuancer. Une régulation stricte ne présente en effet que très peu de sens d'un point de vue évolutif, car au cours de l'histoire de l'humanité, l'homme a été confronté à des situations de faible abondance de nourriture bien plus qu'il n'a été en présence de nourriture en quantité excessive. A cet égard, les situations d'abondance voire d'excès de nourriture que nous connaissons actuellement dans certains pays riches font figure d'heureux accidents. Pendant très longtemps, tout au long de l'histoire de l'homme, la capacité de l'organisme à accumuler rapidement une grande quantité d'énergie s'est révélée être un avantage évolutif majeur. Dans ce contexte, une régulation homéostatique stricte du poids corporel limitant la capacité du corps à stocker de l'énergie et limitant le gain de poids dans le seul but de le maintenir stable est peu vraisemblable. Les lois de l'homéostasie obéissent à des règles simples: un paramètre est contrôlé par un système régulateur qui s'informe constamment sur la valeur de ce paramètre et peut générer des actions dont l'effet va être de maintenir l'homéostasie, c'est-à-dire la stabilité du paramètre réglé. La régulation du poids corporel, comme toute autre régulation de type homéostatique, obéit à cette règle. Le contrôle homéostatique du poids corporel est assimilé au contrôle de la balance énergétique. Pour assurer la stabilité du poids corporel il s'agit de maintenir un équilibre entre les apports en énergie vers l'organisme et la dépense d'énergie par l'organisme. La dépense énergétique de l'organisme (les sorties d'énergie) est constituée de plusieurs composantes comme l'activité physique ou l'énergie utilisée par le métabolisme. Les apports en énergie disponible pour l'organisme sont assurés par l'alimentation et reposent entièrement sur le comportement alimentaire. En somme, c'est l'équilibre entre entrées et sorties, entre dépenses énergétiques et ingestion d'énergie qui détermine l'évolution du poids corporel (figure 1).

Figure 1 :

 1 Figure 1: La régulation du poids corporel.1, lorsque la dépense énergétique est égale à la prise alimentaire, le poids est stable. 2, lorsque la prise alimentaire est plus importante que la dépense énergétique, le sujet subit un gain de poids. 3, lorsque la dépense énergétique est plus importante que la prise alimentaire, le sujet subit une perte de poids.

Figure 3 :

 3 Figure 3: modélisation basique d'un comportement, le schéma entrées-intégration-sorties.Les stimuli sont collectés puis traités par un système intégrateur qui va générer des réponses comportementales.

Figure 4 :

 4 Figure 4: Les facteurs influençant le comportement alimentaire

L

  'hypothalamus: le chef d'orchestre du comportement alimentaire Chez certains mollusques et chez les vertébrés, le cerveau est l'organe capable d'intégrer des informations et de générer en retour des réponses comportementales. C'est donc dans le cerveau que se trouvent les structures à même de diriger le comportement alimentaire. Une structure centrale semble jouer un rôle particulièrement important dans le comportement alimentaire, c'est l'hypothalamus. Cette structure est aujourd'hui considérée comme le chef d'orchestre du comportement alimentaire (52).

Figure 5 :

 5 Figure 5: Localisation de l'hypothalamus dans un cerveau humain (Coupe latérale).

Figure 6 :

 6 Figure 6: Localisation de l'hypothalamus dans un cerveau de rat (Coupe latérale).

Figure 7 :

 7 Figure 7: Localisation de l'hypothalamus dans un cerveau de rat (Coupe transversale).

Figure 8 :

 8 Figure 8: Localisation des principaux noyaux de l'hypothalamus impliqués dans l'homéostasie énergétique (coupe transversale dans un cerveau de rat).

Figure 9 :

 9 Figure 9: Fonctionnement du système mélanocortine hypothalamique.

  concentration circulante de leptine est proportionnelle à la masse grasse. Les taux plasmatiques d'insuline reflètent pour leur part l'état de la glycémie. Les concentrations de leptine et d'insuline constituent donc des signaux relatifs respectivement à la quantité d'énergie disponible sous forme de tissus adipeux et à la quantité d'énergie immédiatement utilisable (glucose circulant) (81). De nombreuses études ont montré que la leptine et l'insuline ont un effet sur le comportement alimentaire ; les cibles centrales de la leptine et de l'insuline étant précisément les neurones POMC/CART et NPY/AgRP. Ces derniers expriment des récepteurs à la leptine et à l'insuline. Ces deux facteurs circulant semblent pouvoir accéder aux neurones du noyau arqué et inhiber l'activité des neurones NPY/AgRP, notamment leur activité inhibitrice GABAergique sur les neurones du PVN et sur les neurones POMC/CART du noyau arqué. Ceci ayant pour effet de réduire la prise alimentaire et d'augmenter la sensation de satiété. (figures 10 et 11)

Figure 10 :

 10 Figure 10: La leptine comme indicateur des réserves en énergie. Libérée par les adipocytes elle renseigne le système nerveux central sur l'état du tissu adipeux (quantité de réserves disponibles). La leptine circule par voie sanguine vers le système nerveux central.

Figure 11 :

 11 Figure 11: Influence de la leptine sur le système mélanocortine hypothalamique. La leptine accède par voie sanguine au noyau arqué, elle y diminue l'activité inhibitrice des neurones NPY/AgRP et stimule les neurones POMC/CART. Compte tenu de leur action sur les neurones du noyau paraventriculaire, la leptine a pour effet de diminuer la prise alimentaire.

Figure 12 :

 12 Figure 12: Le Noyau du Tractus Solitaire.Organisation viscérotopique des projections du nerf vague en provenance du tube digestif.

Figure 13 :

 13 Figure 13: Facteurs influençant l'activité du Noyau du Tractus Solitaire.

Figure 14 :

 14 Figure 14: Surveillance du tube digestif par le nerf vague. Les informations transmises vers le NTS ont deux origines différentes (1) une d'origine mécanique relatives à la distension gastrique ou aux mouvements de l'intestin (2) une origine chimique générée par les médiateurs comme la CCK.

Figure 15 :

 15 Figure 15: L'axe tube digestif cerveau, principe de fonctionnement.Le système nerveux central s'informe des événements ayant lieu en périphérie via les systèmes de la viscérosensibilité ou intéroception, en réponse il peut moduler l'ingestion ou certains paramètres de la digestion.

  Le tube digestif établit d'importantes connexions nerveuses réciproques avec le système nerveux central. Le système nerveux autonome assure deux types d'innervation (14) (figure 16): une première innervation, la voie sympathique, relie le tube digestif et la moelle épinière en établissant des relais via les ganglions paravertébraux. Le système sensoriel sympathique est, tant dans son organisation anatomique que dans son fonctionnement, proche d'un système sensoriel «classique» ou somatique, c'est-à-dire fournissant des informations purement «tactiles» au cerveau. Ces connexions sont donc d'un intérêt moindre dans les mécanismes du contrôle de la prise alimentaire. L'innervation parasympathique est le deuxième type d'innervation du tube digestif. Il présente à l'inverse une organisation neuroanatomique tout à fait singulière (14). Il établit en effet des connexions directes ou indirectes avec le système nerveux végétatif dont le NTS ou l'hypothalamus. C'est vraisemblablement par le système parasympathique que les informations générées pendant la digestion transitent vers le tronc cérébral.

Figure 16 :

 16 Figure 16: L'axe tube digestif cerveau, surveillance du tube digestif par le système nerveux autonome. Deux composantes du système nerveux autonome relient le tube digestif au système nerveux central. Une première innervation sympathique implique les différents nerfs splanchniques. L'innervation parasympathique est principalement le fait du nerf vague.

Figure 17 :

 17 Figure 17: les modalités de l'innervation de l'intestin par le nerf vague. (1) Le nerf vague innerve les muscles circulaires et longitudinaux situés autour de l'intestin. (2) Le nerf vague établit des connexions avec le système nerveux entérique. (3) Des terminaisons libres s'étendent jusque dans le voisinage proche des cellules entéroendocrines juste sous la muqueuse intestinale.

Figure 18 :

 18 Figure 18: La détection des nutriments dans l'intestin. 1) Au cours de leur passage dans l'intestin les nutriments sont absorbés à travers la muqueuse intestinale. 2) De surcroît, les nutriments sont détectés et déclenchent la libération de médiateurs dans les cellules entéroendocrines. Ces médiateurs influencent l'activité du nerf vague et signalent ainsi au cerveau la présence spécifique de nutriments.

Figure 19 :

 19 Figure 19: Les questions Dans cette étude nous allons tenter de comprendre 1) Les mécanismes cellulaires de la détection des macronutriments dans l'intestin. 2) Le rôle précis du nerf vague dans l'action de ces phénomènes sur le comportement alimentaire et 3) L'évolution temporelle de ces systèmes de détection dans des conditions de stimulation chronique.

Figure 20 :

 20 Figure 20: Principe général de la détection du glucose dans l'intestin. Lors de la digestion le glucose est détecté pendant son passage dans l'intestin. Il provoque la libération de sérotonine par les CEECs; la sérotonine ainsi libérée stimule l'activité du nerf vague. L'augmentation de l'activité spontanée parasympathique a pour conséquence de réguler le fonctionnement de la mécanique digestive et le comportement alimentaire.

Figure 21 :

 21 Figure 21: Deux candidats pour la détection des glucides simples dans l'intestin. SGLT1 possède une affinité élevée et une spécificité faible pour ses substrats. En revanche SGLT3 présente une affinité faible mais une plus grande spécificité. Par exemple SGLT1 peut se lier au galactose et le transporter, SGLT3 ne le peut pas.

Figure 22 :

 22 Figure 22: La détection du glucose par les cellules bêta du pancréas. 1) L'entrée de glucose dans la cellule permet de produire de l'ATP. 2) L'augmentation des taux d'ATP dans la cellule a pour conséquence la fermeture des canaux KATP (canaux potassium ATP dépendants), la modification de la perméabilité membranaire (baisse de la conductivité au potassium) conduit à une dépolarisation de la cellule (accumulation d'ion K + dans le milieu intracellulaire). 3) Cette dépolarisation provoque l'ouverture des canaux Ca 2+ voltage-dépendants, conduisant à une augmentation de la concentration intracellulaire d'ion Ca 2+ , qui permet l'exocytose d'insuline,4.

Figure 23 :

 23 Figure 23: Deux hypothèses pour la détection du glucose par les cellules entéroendocrines de l'intestin.PREMIERE HYPOTHESE: 1) L'entrée de glucose dans la cellule permet de produire de l'ATP. 2) L'augmentation des taux d'ATP dans la cellule a pour conséquence la fermeture des canaux KATP (canaux potassium ATP-dépendants). La modification de la perméabilité membranaire (baisse de la conductivité au potassium) conduit à une dépolarisation de la cellule (accumulation d'ion K + dans le milieu intracellulaire). 3) Cette dépolarisation provoque l'ouverture des canaux Ca 2+ voltage-dépendants, conduisant à une augmentation de la concentration intracellulaire d'ion Ca 2+ , qui permet 4) l'exocytose de sérotonine. SECONDE HYPOTHESE: 1') le transport du glucose par un transporteur (SGLT3) déclenche une cascade de réactions intracellulaires, conduisant à 2') l'ouverture de canaux calciques non voltagedépendants, conduisant à une augmentation de la concentration intracellulaire d'ion Ca 2+ , qui permet 3') l'exocytose de sérotonine.

Figure 24 :

 24 Figure 24: Effet du glucose sur le potentiel transmembranaire de deux types de cellules entéroendocrines Pendant les périodes correspondant à un segment bleu, les cellules sont perfusées avec du milieu extracellulaire standard. Pendant les périodes correspondant à un segment jaune, les cellules sont perfusées avec du milieu extracellulaire enrichi en glucose. Pendant les périodes correspondant à un segment rouge, les cellules sont perfusées avec du milieu extracellulaire riche en ions K + . A gauche: effet sur une cellule de type BON (CEECs sérotoninergiques). A droite: effet sur une cellule de type STC1 (CEECs cholécystokininergiques).

Figure 25 :

 25 Figure 25: Mécanisme proposé de la détection du glucose dans l'intestin. Le transport du glucose par un transporteur (SGLT3) déclenche 1') une cascade de réactions intracellulaires, 2') conduisant à l'ouverture de canaux calciques non voltage dépendant, conduisant à 3') une augmentation de la concentration intracellulaire d'ion Ca 2+ qui permet l'exocytose de sérotonine.

  d'absorption de ces composés par l'intestin. Les acides gras sont absorbés sous forme de lipides, principalement sous forme de triglycérides. Produits de la réaction de lipolyse des triglycérides dans la lumière intestinale, les acides gras pénètrent la cellule épithéliale intestinale, puis tandis que les acides gras à chaîne courte diffusent à travers la lamina propria dans la lymphe où ils sont pris en charge par l'albumine jusqu'au foie (où ils pourront être remaniés), les acides gras à chaîne longue diffusent vers le réticulum endoplasmique où ils sont re-synthétisés en triglycérides, des lipoprotéines amphiphiles, c'est à dire présentant à la fois un pôle hydrophile et un pôle hydrophobe (ou lipophile), les apolipoprotéines, sont transférées vers les triglycérides nouvellement synthétisés pour former les chylomicrons. Les chylomicrons ainsi formés sont libérés dans la lymphe par exocytose.Les modifications de la prise alimentaire et des cinétiques gastriques par les acides gras n'étant observées que pour des acides gras à chaîne longue (>12 atomes de carbone)[START_REF] Isaacs | Comparison of effects of ingested medium-and long-chain triglyceride on gallbladder volume and release of cholecystokinin and other gut peptides[END_REF], il est légitime de penser que la détection des acides gras est initiée par le processus de formation des chylomicrons, spécifique à l'absorption des acides gras à chaîne longue. En effet, la formation des chylomicrons et plus particulièrement la synthèse d'une des apolipoprotéines, l'apolipoprotéine A-IV (apo A-IV), a été rapidement proposée comme une première étape dans la transduction du signal relatif à la présence d'acides gras à chaîne longue dans l'ingesta[START_REF] Hayashi | Transport of lipid and apolipoproteins A-I and A-IV in intestinal lymph of the rat[END_REF]. L'apo A-IV est synthétisée par les entérocytes en réponse à l'absorption de lipides Elle est incorporée dans les chylomicrons mais aussi libérée sous forme libre dans la lymphe.Plusieurs résultats sont venus étayer cette hypothèse. D'abord des études ont montré que la formation de chylomicrons était nécessaire à l'action des acides gras à chaîne longue sur les phénomènes de motricité gastrique (93) (dont on sait qu'ils ont pour origine la détection des acides gras à chaîne longue dans l'intestin et qu'ils vont de pair avec le rétrocontrôle de la prise alimentaire). L'inhibition de la formation des chylomicrons à l'aide d'un surfactant, l'acide pluronique L-81, supprime la réponse gastrique à la perfusion intra-duodénale d'acides gras à chaîne longue chez le rat[START_REF] Raybould | Inhibition of gastric emptying in response to intestinal lipid is dependent on chylomicron formation[END_REF].Des études plus récentes encore sont venues confirmer que l'apo A-IV était impliquée dans le signal relatif à l'absorption d'acides gras à chaîne longue: en effet, une injection intra-péritonéale d'apo A-IV inhibe le tonus moteur gastrique (5; 6). Ainsi, au cours de la digestion, la capacité des acides gras à chaîne longue à influencer la mécanique digestive ou la prise alimentaire repose sur le processus de formation des chylomicrons et plus particulièrement sur la synthèse et la libération d'apo A-IV dans la lymphe interstitielle. (88) (figure26). Une nouvelle question se pose alors: comment l'apo A-IV influence-t-elle le comportement alimentaire et la mécanique digestive ?

Figure 26 :

 26 Figure 26: La détection des acides gras à chaîne longue au cours de la digestion 1) Les triglycérides d'origine alimentaire sont hydrolysés en acides gras puis transportés dans les entérocytes. 2) A l'intérieur des entérocytes, les acides gras à chaîne longue sont utilisés pour former de nouveaux triglycérides, puis incorporés dans des chylomicrons, avant d'être libérés dans le milieu interstitiel. 3)Un des composants des chylomicrons, l'apolipoprotéine AIV, alors synthétisé est libéré, déclenche la libération de CCK dans les cellules entéroendocrines voisines.

Figure 27 :Étude 3 :

 273 Figure 27: modalités d'action de l'APO A-IV L'objet de cette étude est de déterminer si l'effet de l' apo A-IV est dépendant de la médiation vagale (action indirecte) ou non (action directe)

Figure 28 :

 28 Figure 28 : Comment l'apo A-IV agit-elle sur le nerf vague ? HYPOTHÈSE 1: L'apo A-IV déclenche la libération de CCK par les CEECs, puis la CCK active les terminaisons du nerf vague. HYPOTHÈSE 2: L'apo A-IV active directement les terminaisons du nerf vague.

Figure 29 :

 29 Figure 29: La détection des protéines alimentaires au cours de la digestion. 1) Les protéines alimentaires sont absorbées sous la forme d'oligopeptides et c'est 2) l'activité du principal transporteur d'oligopeptides PEPT1 qui déclenche la libération de CCK dans les cellules entéroendocrines voisines.

Figure 30 :

 30 Figure 30: Co-localisation de PEPT1 et de la CCK dans une crypte intestinale d'un duodénum de rat. Coupe transversale de duodénum de rat (au niveau des cryptes intestinales) fixé dans du paraformaldéhide ayant subi un double marquage immunologique (révélation par fluorescence) contre PEPT1 (en vert) et contre la CCK (en rouge). Photographie par microscopie confocale.

Figure 31 :

 31 Figure 31: Une hypothèse alternative pour la détection des protéines alimentaires au cours de la digestion. C'est l'activité du principal transporteur d'oligopeptides PEPT1, localisé sur les cellules entéroendocrines elles mêmes qui déclenche la libération de CCK .

L

  'objet de cette étude était de répondre à plusieurs questions relatives à l'effet des protéines sur les systèmes centraux régulant le comportement alimentaire. Premièrement, il s'agissait de déterminer les régions du cerveau qui étaient activées par une alimentation riche en protéines. Deuxièmement, l'activation de ces régions était-elle cohérente avec l'hypothèse d'une influence de la détection périphérique sur le comportement alimentaire ? Troisièmement, pouvait-on déceler des changements dans les motifs d'activation du système nerveux central dans les conditions d'une stimulation importante et maintenue ? Nous avons étudié les effets des protéines sur le comportement alimentaire grâce à un modèle expérimental assez répandu aujourd'hui: les régimes hyper-protéiques. Ces régimes ont une teneur en protéines largement supérieure aux régimes classiques. L'énergie fournie sous forme de protéines dépasse 50% (protéines/énergie) dans un régime hyper-protéique contre 14% dans une formulation classique (régime normo-protéique). Ces régimes sont connus pour induire des modifications du comportement alimentaire solides et durables, notamment des phénomènes de satiété (103).Description de l'étudeL'objectif de cette étude était de déterminer les zones du cerveau impliquées dans la modulation du comportement alimentaire induite par des régimes hyperprotéiques. Nous avons collecté les cerveaux de rats adultes provenant de trois groupes différents: dans un premier groupe les rats étaient nourris avec un régime normo-protéique depuis 21 jours, dans un second groupe les rats étaient nourris avec un régime hyper-protéique depuis deux jours seulement. Dans un troisième groupe les rats étaient nourris avec le régime hyper-protéique depuis 21 jours.Nous avons mesuré l'expression de c-fos (un gène précoce, marqueur de l'activation neuronale, voir annexe 3) pour ces trois conditions dans plusieurs zones du système nerveux central impliquées dans le contrôle de la prise alimentaire. Dans ces expériences, la stimulation consistait en l'ingestion d'une petite quantité fixe du régime auquel les rats étaient soumis. Si de nombreux changements ont eu lieu dans les régions étudiées au moment de la transition depuis un régime normo-protéique vers un régime hyper-protéique, à long terme peu d'activations ont persisté, à savoir, une augmentation de l'activation du NTS, une baisse de la réponse de l'hypothalamus Ventro-Médian (VMH) et une baisse de la réponse de l'amygdale (figure32).

Figure 32 :

 32 Figure 32: Résumé des activations observées dans le cerveau en réponse à une charge protéique. Conditions de transition d'un régime NP vers un régime HP ou après habituation au régime HP. ARC: Noyau Arqué ; DMH: Hypothalamus Dorso-Médian ; ACC: Noyau Accumbens ; ACO: cortex de L'Amygdale ; VMH: Hypothalamus Dorso-Médian.

Principes

  Dans le cas où la voie dite nerveuse serait impliquée, la transmission de cette information par cette voie reposerait sur les afférences vagales. Ces neurones afférents du nerf vague se divisent en deux catégories anatomiquement et fonctionnellement distinctes: il existe des fibres de petit diamètre dites fibres de type C qui sont amyéliniques et possèdent par conséquent une vitesse de conduction de l'ordre de 1,4 m/s, mais on trouve aussi des fibres dites de type A, myélinisées et présentant des vitesses de conduction pouvant atteindre 14 m/s[START_REF] Mei | La sensibilité viscérale[END_REF]. Parmi les afférences vagales les fibres amyéliniques seraient responsables de la transmission des informations relatives à la détection chimique des nutriments(32; 72; 83; 86; 87; 91; 9). En somme dans le cas de la transmission de l'information relative à la présence de protéines dans l'intestin par voie nerveuse, le transfert de l'information serait vraisemblablement assuré par des afférences vagales de type C.Les fibres de type C expriment des récepteurs spécifiques de la capsaïcine, (et sont par conséquent sensibles à la capsaïcine). Cette propriété physiologique ouvre des possibilités méthodologiques intéressantes. Un excès de capsaïcine conduit, en effet, à la destruction spécifique par excitotoxicité des neurones sensibles à la capsaïcine. Ce type de traitement permet donc de supprimer spécifiquement la sensibilité viscérale chimique. Cette opération est appelée déafférentation sélective. C'est donc par le biais d'un traitement à la capsaïcine que nous avons testé si l'information relative à la présence de protéines dans l'intestin circulait vers le cerveau via les afférences chémosensibles vagales donc via la voie nerveuse Animaux 10 rats mâle (Sprague Dawley (Harlan)) pesant 261g ± 5g au début de l'expérience ont été utilisés pour cette étude. Les rats étaient hébergés dans des cages individuelles dans une pièce à température contrôlée. Les rats étaient soumis à un cycle nycthémèral 12h « jour » / 12h « nuit », avec début du « jour » à 9:00. Les rats avaient librement accès à l'eau.

Figure 33 :

 33 Figure 33: Une déafférentation ne modifie pas la consommation d'un régime hyper-protéique. Prise alimentaire cumulée d'un régime hyper-protéique chez des rats traités à la capsaïcine (déafférentation sélective) ou témoins. Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne quotidienne ± SEM.

Figure 34 :

 34 Figure 34: Une déafférentation augmente le gain de poids chez des rats soumis à un régime HP.Gain de poids total, sur 21 jours, pour des rats soumis à un régime hyper-protéique. Les résultats sont exprimés sous forme de moyennes ± SEM.

Figure 35 :Annexe 1 : 4 - 6 -

 35146 Figure 35: Hypothèse: mécanisme général de la détection des macronutriments au cours de la digestion C'est l'activité de transporteurs, responsables en temps normal de l'absorption de macronutriments, mais cette fois localisés sur les cellules entéroendocrines ellesmêmes, qui déclenche la libération de médiateurs dans le milieu interstitiel.

Figure A: Préparation électrophysiologique: 1 ,

 1 Figure A: Préparation électrophysiologique: 1, une section du tube digestif, allant de l'oesophage jusqu'au jéjunum est sortie de l'animal puis placée dans du liquide physiologique. 2, Après avoir identifié le nerf vague, seul le duodénum est conservé, 3 deux canules (flèches bleues) permettent de injecter des solutions dans la lumière intestinale une canule intra-artérielle (flèche rouge) permet d'injecter des substances dans la circulation sanguine, enfin l'activité spontanée du nerf vague est enregistrée grâce à une électrode de platine (flèche verte).

Annexe 2 : 3 :

 23 Le patch clamp Le terme Patch-clamp est un terme anglais désignant une technique électrophysiologique d'enregistrement des courants ioniques transitant à travers les membranes cellulaires. Cette technique consiste à approcher une micropipette en verre (diamètre de contact de l'ordre de 1 µm) remplie d'une solution ionique de composition définie de la membrane d'une cellule vivante isolée. Elle fut découverte par Erwin Neher et Bert Sackmann (1) à Goettingue en 1978, ce qui leur valut le prix Nobel en 1991. Il peut être utilisé sous deux modes principaux: * le Voltage-Clamp ou mesure de courant en potentiel imposé * le Current-Clamp ou mesure de potentiel en courant imposé Plusieurs configurations de patch clamp existent:Cellule entière, où l'activité macroscopique de l'ensemble des courants cellulaires est mesurée. "inside-out" (signifiant interne à l'extérieur), où le fragment de membrane accolé à la pipette de mesure possède sa face intracellulaire en contact avec l'extérieur de la pipette. "outside-out" (signifiant externe à l'extérieur), où le fragment de membrane accolé à la pipette de mesure possède sa face intracellulaire en contact avec l'intérieur de la pipette (figure B). Dans l'étude 2 nous avons utilisé le mode « current clamp » en configuration cellule entière, Le courant imposé était de 0 ampères.D'après WickipediaAnnexe Le c-fos, un marqueur de l'activation des neurones.C-fos est un gène de la famille des gènes précoces ou IEG (immediate early genes).La protéine FOS codée par le gène c-fos a été identifiée d'abord dans le cadre de travaux en virologie, une altération de cette protéine est la cible d'un virus causant l'ostéosarcome (Le nom FOS signifie Feline OStéoracome), en virologie le gène c-fos est classé comme proto-oncogène. Ces gènes sont présents dans de nombreux tissus mais sont présents très bas niveaux dans les tissus en conditions basales.La protéine fos, produit du gène c-fos forme des complexes dimériques avec un autre IEG produit de c-jun qui en retour active un facteur de transcription inductible, P1, qui se lie à l'ADN pour contrôler spécifiquement l'expression de gènes. Lorsque l'activité de la cellule augmente, les taux de Fos sont considérablement augmentés et se concentrent dans le noyau cellulaire, où ils permettent la transcription de l'ADN. Quantifier l'expression de c-fos est un bon moyen de déterminer de degré d'activation de cellules. Les cellules du système nerveux central expriment c-fos (figure C) et la quantification de la protéine Fos comme marqueur de l'activité de c-fos est très répandue (1,2) (figure D). Dans les neurones l'expression de c-fos est maximale vers 90 minutes après la stimulation (figure E).

Figure C :

 C Figure C: exemple des mécanismes de l'induction du gène c-fos dans les neurones du NTS. Les terminaisons en provenance du tube digestif (neurone afférent vagal) ou les terminaison en provenance de l'hypothalamus peuvent activer l'expression de c-fos. ces deux voies nécessitent l'activation de la protéine kinase ERK1/2 qui va a son tour activer CREB pour qu'il déclenche la transcription de l'ADN et la production de Fos. (d'après (3)).

Figure D: exemple

  Figure D: exemple d'expression de c-fos dans le NTS. AP, Area Postrema, CC canal central.

Figure E :Figure-

 E Figure E: expression relative de c-fos dans le temps. Pour une stimulation à t=0

0

  .965 mm OD) for administration of lymph or drugs. The catheter in the femoral artery was advanced up to the junction with the celiac artery for injections close-arterial to the upper GI tract. IGP was displayed and collected online for the duration of the experiment. Changes of IGP were measured, analyzed as the maximal decrease of ILP [cm H 2 O].

  in oxygenated modified Ringer's solution. The pancreas and stomach were removed except for the pylorus and adjacent antrum, and the subdiaphragmatic dorsal vagus nerve was identified. A catheter was placed into the gastroduodenal artery and the hepatic, left and right gastric arteries were tied. The segment was placed into an organ bath and perfused continuously with oxygenated Ringer's solution at 2.0 -2.5 ml /min flow rate and the temperature of the organ bath was maintained at 33 ± 1°C.Action potentials were recorded from the dorsal gastric vagus nerve trunk; action potentials were sent to a pre-amplifier (DAM-6 X100, 100-10 kHz band-pass filter; World Precision Instruments, Sarasota, FL), displayed on a digital storage oscilloscope (model 2211, Tektronix) and recorded on-line using a digital tape recorder (Sony high-density linear A/D D/A optical digital audio tape deck, DTC-700). In addition, unit potentials were simultaneously sent to a PC computer equipped with an A/D board (DT2831, Data Translation, Marlboro, MA). In addition, unit potentials were simultaneously sent to a A/D module (Micro 1401 MK2, CED, Cambridge England) connected to a PC computer. Electrophysiological recording from duodenal vagal afferents was started approximately 30 min after the preparation during stable recording conditions. Units were selected by the presence of spontaneous activity in the nerve strand. Each nerve strand containing spontaneously active units was tested for the response to intra-arterial injection of 2-methyl 5-HT (10pmol). In 7 preparations, nerve strands containing 5-HTresponsive units were tested to determine their response to intra-duodenal infusion of glucose and galactose (0.05 ml, 10 min, 50 mM).Using the acquisition module of SPIKE2 impulse analysis software (SPIKE2 version 5, CED, Cambridge England), units within upper and lower threshold settings of the amplifier were acquired on-line onto the hard drive of a PC. Single units were discriminated off-line from the multi-unit recordings based on their shape. The response pattern of different units was analysed and displayed separately. Response magnitudes were normalized by a response quotient (RQ), where RQ = the spike count after treatment being divided by 5 min of spike counts before. A value of RQ > 1.20 was taken to indicate an excitatory response and Q = 1 ± 0.19 indicates no response.Real-time quantitative PCR Tissue was taken from anaesthetized rats. The ileum was opened along the antimesenteric border and placed mucosal side up on an ice cold glass plate. The mucosa was scraped away from the muscle. The mucosal and muscle samples were lysed in 1x ABI lysis buffer (Applied Biosystems) and stored at -20ºC until processing. Total RNA was extracted from the lysates using a 6700 Automated Nucleic Acid workstation (6700 ANA, Applied Biosystems) according to the manufacturer's instructions. Complementary DNA was synthesized using 100 units of SuperScript II (Invitrogen, Carlsbad, CA), 600 ng random hexadeoxyribonucleotide (pd(N) 6 ) primers, 10 U RNaseOut, and 1 mM dNTPs (Life Technologies) in a final volume of 40 µl. The reverse transcription reaction proceeded for 50 min at 42C. After addition of 60 µl of water, the reaction was terminated by heating for 5 min to 95C and cooling on ice.Each PCR reaction contained 400 nM of each primer, 80 nM of the TaqMan probe and commercially available PCR mastermix (TaqMan Universal PCR Mastermix, Applied Biosystems) containing 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 5 mM MgCl 2 , 2.5 mM deoxynucleotide triphosphates, 0.625 U AmpliTaq Gold DNA polymerase per reaction, 0.25 U linear amount of target molecules relative to the calibrator, was calculated by 2 -ΔΔCT . Therefore, all gene transcription data is expressed as an n-fold difference relative to the calibrator.

3 (

 3 Freeman and Raybould, unpublished observations). In the present study, we determined release of 5-HT into mesenteric lymph. Determining 5-HT concentrations in mesenteric lymph has several advantages over plasma; mesenteric lymph represents the interstitial fluid in the gut wall and the lack of platelets allow accurate determination of 5-HT concentrations.

Fig 1 :

 1 Fig 1: Substrates of SGLT inhibit gastric emptying of liquid in awake rats. The rate of gastric emptying was measured in awake rats during duodenal perfusion with glucose (glu), 3-Omehtyl glucose (3-OMG, metabolizable substrate of SGLT), α-methyl glucose (α-MG, nonmetabolizable substrate of SGLT) and 2-deoxy-D-glucose (non-metabolizable substrate of GLUT-2). P<0.001, n=5-6 in each group.

Fig 2 :

 2 Fig 2: Effect of intraduodenal perfusion of glucose or galactose on inhibition of gastric motility in anesthetized rats. The change in intragastric pressure was determined by the manometric techniques and the change from baseline taken as the response to intraduodenal perfusion with glucose or galactose. Glucose, but not galactose, produced an inhibition of gastric motility as previously described. (1) * p<0.01 glucose 60 and 90 mg versus baseline intragastric pressure, n=6 and # p<0.05 glucose versus galactose, n=6.

Fig 3 :

 3 Fig 3: Net fluid movement across the wall of the distal small intestine of anesthetized rats in response to glucose or galacotse. Fluid absorption was significantly decreased by glucose and α-methyl glucose but not galactose in the proximal small intestine. P<0.01 glucose, α-methyl glucose vs vehicle, n=5-8 in each group.

Fig 4 :

 4 Fig 4: Increase in the concentration of 5-HT in mesenteric lymph in response to glucose.Mesenteric lymph was collected in awake rats fitted with a cannula in the mesenteric lymph duct and a cannula in the duodenum for perfusion of saline or glucose. Perfusion of glucose (60 mg over 60 min) caused a significant increase in 5-HT concentration in lymph. P<0.05 saline vs glucose, n=7).

Fig 1 c

 1 Fig 1

Le système mélanocortine central hypothalamique

  .

	d'autres régions du système nerveux central. C'est ce réseau qui constitue le véritable force de l'inhibition qu'il exerce sur la faim. Tandis que les neurones POMC/CART
	processeur central du comportement alimentaire. Il va recevoir des informations inhibent la faim car ils activent le PVN (notamment par l'intermédiaire de la libération
	(sensorielles, émotionnelles, mémoires etc.) les intégrer et coordonner en réponse le d'α-MSH qui se lie à des récepteurs de type MC4R sur les neurones du PNV), les
	comportement alimentaire. neurones NPY/AgRP, inhibant à la fois les neurones du PVN et les neurones
	POMC/CART (via des synapses inhibitrices de type GABAergiques, NPYergiques et
	AgRPergiques) ont, à l'inverse, un effet positif sur la faim (figure
	Le principal site d'expression de POMC dans le système nerveux central est
	l'hypothalamus. Les neurones exprimant POMC expriment aussi le neuropeptide
	anorexigène CART (cocaïne amphétamine regulated transcript). Ces neurones
	(POMC/CART) reçoivent des projections d'un second type de neurones, exprimant, lui,
	Le gène codant pour POMC produit deux sous-classes de médiateurs le neuropeptide Y (NPY) et le peptide AgRP (Agouti gene-related Protein, neurones
	peptidiques: les mélanocortines et les β-endorphines. Parmi les mélanocortines on NPY/AgRP). Ces deux types de neurones sont situés dans le noyau arqué et projettent
	distingue trois MSH (melanocyte stimulating hormones) dont les cibles sont une famille principalement vers le PVN. Alors que les neurones POMC/CART exercent un effet
	de récepteurs métabotropiques allant de MC1R à MC5R. Si de nombreuses fonctions excitateur sur les neurones du PVN, les neurones NPY/AgRP exercent eux une action
	périphériques sont attribuées aux produits de POMC et aux récepteurs des inhibitrice.
	mélanocortines comme, par exemple, la production des pigments de la peau ou des
	cheveux, en revanche, dans le système nerveux central, peu de neurones expriment Ce sont principalement les interactions entre ces trois types de neurones
	POMC. La majeure partie de ces neurones, environ 3000 neurones, localisée dans le (neurones POMC/CART, neurones NPY/AgRP et neurones du PVN) dans ces deux
	noyau arqué et projettant vers le PVN constitue le système mélanocortine central noyaux hypothalamiques qui constituent le coeur du système mélanocortine central
	hypothalamique. Une seconde sous-population de neurones encore plus faible, environ hypothalamique et qui sont au centre du contrôle du comportement alimentaire.
	300 neurones, est située dans le noyau du tractus solitaire (NTS) dans le tronc cérébral L'activité des neurones du PVN est associée à la fin du repas et à la sensation
	et constitue le système mélanocortine central du tronc cérébral (54; 56 80; 84; 108). prolongée de satiété. L'activité des neurones POMC/CART et NPY/AgRP va ajuster
	Ces neurones constituent le coeur d'un circuit désormais bien identifié, connecté avec l'activité du PVN, via les connexions qu'ils établissent avec lui, déterminant ainsi la

Table 1 : Résultats de l'enregistrement électrophysiologique de l'activité spontanée du nerf vague en réponse à de la sérotonine, du glucose ou du galactose

 1 . 17 rats ont été utilisés pour cette expérience. Il a été possible de trouver 7 fibres nerveuses (correspondant à 7 préparations sur les 17 initiales) présentant une activité stable et ayant répondu à la 2methyl-5HT. Pour 6 de ces fibres une discrimination des unités neuronales a permis d'identifier 23 neurones dont 19 étaient sensibles à la sérotonine. Parmi ces 19 neurones (provenant de 5 préparations différentes), 6 ont répondu au glucose et parmi les neurones ayant répondu à la perfusion intra-duodénale de glucose aucun n'a répondu à la perfusion intra-duodénale de galactose. initiateur de la réponse au glucose et agir comme un détecteur membranaire de la présence de glucose dans le contenu digestif. ombre quant au déterminants exacts de la libération de ces vésicules, il est toutefois acquis que c'est, avant tout, l'augmentation locale d'ion calcium (Ca 2+ ) intracellulaire qui peut être considérée comme la première étape de l'exocytose. Très

	Nombre de rats	17
	Nombre de fibrés isolées, stables	7
	Neurones identifiés	23	à partir de	6 préparations
	Neurones répondant à la 5HT *	19 (soit 83%)
	Neurones répondant au glucose **	6 (soit 32%)
	Neurones répondant au galactose ***	0 (soit 0%)

. *parmi les neurones identifiés; **parmi les neurones répondant à la 5HT; ***parmi les neurones répondant à au glucose.

Cette étude suggère fortement l'implication du transporteur SGLT3 dans la détection du glucose dans l'intestin. En effet, le galactose qui n'est pas un substrat de SGLT3 mais un substrat de SGLT1 uniquement est incapable de déclencher une augmentation de l'activité spontanée des afférences du nerf vague. A l'inverse, le glucose, substrat présentant une affinité pour les deux récepteurs SGLT1 et SGLT3, peut déclencher une augmentation de l'activité spontanée du nerf vague, Il s'agit ici de la première étude soutenant l'hypothèse de l'implication du transporteur SGLT3 dans la détection du glucose dans l'intestin. Elle doit toutefois être confirmée par d'autres études utilisant des approches expérimentales complémentaires.

La présence du transporteur SGLT3 dans les CEECs n'a pas encore été confirmée. Mais il a été montré qu'une lignée de cellules de type entéroendocrine, libérant de la sérotonine, donc présentant un phénotype très proche des CEECs intestinales, les cellules STC-1, exprime les deux types de récepteurs SGLT1 et SGLT3

[START_REF] Dyer | The expression of sugar transporter in the endocrine cell line STC-1[END_REF]

. Ainsi, il se peut que les cellules entéroendocrines de l'intestin libérant de la 5HT possèdent aussi les deux isoformes du récepteur. Dans ces cellules SGLT3 pourrait être l'signal relatif à la détection du glucose dans l'intestin semble être identifié, les mécanismes cellulaires qui conduisent à la libération de sérotonine par les cellules entéroendocrines intestinales restent encore mal connus. Il s'agit de comprendre maintenant quels sont ces mécanismes biologiques établissant un lien entre la détection du glucose par SGLT3 et la libération de sérotonine.

Introduction

Si SGLT3 semble jouer un rôle de détecteur dans la perception intestinale du glucose, les mécanismes consécutifs contribuant à la libération de sérotonine par exocytose par les cellules entéroendocrines sont inconnus.

Biologie cellulaire de la libération de médiateurs

Tout d'abord, pour mieux tenter de comprendre ces phénomènes il est nécessaire de détailler le fonctionnement du phénomène d'exocytose. Les mécanismes cellulaires de l'exocytose, c'est à dire de la fusion de vésicules stockées dans le cytoplasme avec la membrane plasmique, entraînant de ce fait la libération du contenu des vésicules, sont un phénomène ubiquitaire conservé chez de très nombreuses espèces unicellulaires ou multicellulaires

[START_REF] Neher | The calcium dependence of vesicle exocytosis[END_REF]

.

Prisonnières d'un dense réseau cytosquelettique local, ces vésicules ne peuvent pas fusionner avec la membrane plasmique. S'il persiste encore aujourd'hui beaucoup de 77 zones d'2+ est amplifié par l'ouverture de réserves de calcium intracellulaires dont les canaux d'entrée sont sensibles aux concentrations intracellulaires de calcium. En se couplant à la calmoduline, le calcium forme un complexe qui va permettre de libérer les vésicules d'exocytose et donc de re-larguer leur contenu en dehors de la cellule

[START_REF] Neher | The calcium dependence of vesicle exocytosis[END_REF]

.

Deux mécanismes

possibles pour la libération de sérotonine induite par la présence de glucose.

  Ce mécanisme est fréquent et est observé dans les phénomènes de sécrétion d'insuline en réponse à la présence de glucose par les cellules β du pancréas (85) (figure22). Dans ce cas, en effet, l'entrée de glucose dans la cellule conduit à la synthèse et donc à l'élévation des taux intracellulaires d'ATP. Ceci a pour effet de fermer des canaux transmembranaires spécifiques au potassium ATPdépendants conduisant ainsi à la dépolarisation de la membrane plasmique. Par la suite, l'ouverture des canaux calciques voltage-dépendants, déclenchée par cette dépolarisation cause une élévation de la concentration intracellulaire de calcium. Ceci permet la libération des vésicules d'exocytose (contenant dans ce cas de l'insuline). La

	Deux hypothèses peuvent être proposées. Tout d'abord, il peut s'agir d'un
	phénomène de dépolarisation membranaire qui conduit à l'ouverture de canaux
	calciques transmembranaires.

Le phénomène de libération de la sérotonine par les CEECs sérotoninergiques obéit aussi à cette règle. La question se pose alors de connaître les mécanismes qui conduisent à l'augmentation de la concentration de Ca 2+ intracellulaire dans ces cellules. sécrétion de CCK est aussi vraisemblablement contrôlée par un phénomène électrique transmembranaire semblable dans les cellules STC1

(68; 69)

. Toutefois, cette hypothèse se heurte à une constatation expérimentale réalisée sur des cellules de type BON selon laquelle ces cellules entéroendocrines (et donc vraisemblablement pas leurs homologues in vivo) ne possèdent pas de canaux potassium ATP dépendants.

Table 2 : Paramètres d'acquisition des enregistrements de patch clamp.

 2

	87

Table 3 : résultats des expériences de patch clamp.

 3

	88

  Les acides gras, notamment les acides gras à chaîne longue, sont des macronutriments essentiels au bon fonctionnement de l'organisme. Les acides gras à chaîne longue peuvent soit fournir de l'énergie par oxydation dans les mitochondries (β-

	Au cours de la digestion, la présence des acides gras dans l'ingesta semble
	pouvoir être détectée. La détection des acides gras dans l'intestin a pour principaux
	effets une modulation de la prise alimentaire (16; 43; 44) (tout particulièrement la
	survenue du rassasiement) et une modification des cinétiques digestives (motricité
	gastrique, vidange gastrique, péristaltisme intestinal) (66; 92).

oxydation des AG), soit devenir des constituants de l'organisme (structures, médiateurs…). C'est pourquoi, au cours de l'évolution, de nombreuses espèces, dont les mammifères, ont élaboré des stratégies permettant de détecter la présence et/ou la disponibilité en acides gras et plus particulièrement en acides gras à chaîne longue.

Au niveau cellulaire par exemple, le système des « ppars » permet de réguler certaines fonctions de transcription de la cellule en fonction de la présence d'acides gras

(28; 39)

. Le système nerveux central détecte aussi la présence d'acides gras

(62; 63)

.

intérêt de détecter la présence et la disponibilité des protéines

	Introduction
	De l'Les protéines et leurs constituants, les acides aminés, sont des macronutriments
	essentiels au bon fonctionnement de l'organisme. Ils participent à la fois à la structure
	107 108 109 110 111

a CCK1 pathway. du corps des organes et des cellules, dont elles constituent la base, et au fonctionnement de l'organisme. Les enzymes, par exemple, sont des composés protéiques accomplissant des fonctions biochimiques comme l'hydrolyse, ou la réplication de l'ADN. Autre exemple d'implication des acides aminés dans le fonctionnement du corps, la sérotonine, un médiateur impliqué dans de très nombreuses fonctions (cycles veille-sommeil, anxiété, comportement alimentaire), est un dérivé du tryptophane, un acide aminé essentiel.

Même s'il existe un recyclage important de ces composés, le fonctionnement de l'organisme exige toutefois que des protéines et des acides aminés lui soient fournis sur une base très régulière. Avec le recyclage des substances azotées corporelles, c'est l'alimentation qui fournit l'apport protéique.

  des protéines dans l'intestin(15; 79). Dans une première étude réalisée in vitro sur des cellules STC1, il a été montré que des composés non métabolisables semblables aux oligopeptides, les peptidomimétiques, ont un effet positif sur la libération de CCK[START_REF] Murai | Control of c-fos expression in STC-1 cells by peptidomimetic stimuli[END_REF]. Par ailleurs il a été montré in vivo que l'infusion dans le tube digestif d'un composé possédant des propriétés peptidomimétiques stimulait la libération de CCK et diminuait la motricité gastrique.L'intérêt de ces études réside aussi dans le fait que les espèces utilisées sont non métabolisables, ce qui permet de conclure que le signal relatif aux oligopeptides a pour origine l'absorption oligopeptides et non une utilisation métabolique ultérieure.

	mécanismes cellulaires de la transduction du signal relatif à la présence de protéines, oligopeptides (30) et est principalement assurée par le symporteur oligopeptide/protons
	autrement dit sur la nature des phénomènes cellulaires en amont des événements que PEPT1. PEPT1 est une protéine transmembranaire localisée dans la membrane apicale
	sont la libération de CCK par les CEECs intestinales puis son action sur les des entérocytes. Il transporte activement des oligopeptides (<3 acides aminés) depuis
	terminaisons vagales. la lumière de l'intestin vers le cytoplasme des entérocytes, le gradient de protons
	fournissant la force motrice nécessaire.
	Les hypothèses proposées pour la détection des protéines dans l'intestin. Curieusement, les mécanismes de la détection des protéines dans l'intestin n'ont Une première hypothèse concernant les mécanismes cellulaires de la détection
	été que très peu explorés jusque récemment. Ils font désormais l'objet d'une attention des protéines (et des produits de leur hydrolyse) dans l'ingesta au cours de la digestion
	toute particulière.
	hydrolysées en fragments polypeptidiques plus courts et en acides aminés. C'est
	principalement sous les formes de peptides à chaîne courte (< 3 acides aminés) ou
	Au vu de ces études, il semble légitime de proposer que la détection des oligopeptides et d'acides aminés que les composés azotés sont absorbés par les Une autre hypothèse (celle que nous avons choisi de tester) part du principe que
	protéines au cours de la digestion est un phénomène périphérique impliquant l'action de entérocytes. Deux types de transporteurs sont impliqués dans l'absorption: les les éléments détectés sont vraisemblablement ceux présents en plus grande quantité, à
	la cholécystokinine sur les afférences du nerf vague terminant dans l'intestin. Toutefois systèmes de transporteur d'acides aminés et les systèmes de transporteurs
	de nombreuses questions restent en suspens notamment sur la nature des d'oligopeptides. La majorité de l'absorption protéique se fait par l'absorption des

plus des mécanismes cités plus haut, l'organisme semble détecter la présence de nutriments dans le contenu digestif. Par exemple l'infusion de protéines dans la lumière intestinale a pour conséquence la modification des fonctions digestives et, dans une certaine mesure, la survenue de la terminaison du repas

(11; 74)

; autant d'observations qui semblent suggérer l'existence d'une détection des protéines alimentaires au cours du repas.

Les mécanismes de la détection des protéines dans l'intestin.

Il semble tout d'abord que le nerf vague joue un rôle dans la détection des protéines dans l'intestin. Des études électrophysiologiques ont montré que l'infusion de protéines dans l'intestin stimulait l'activité spontanée des afférences vagales de la branche duodénale

[START_REF] Gevrey | Co-requirement of cyclic AMP-and calcium-dependent protein kinases for transcriptional activation of cholecystokinin gene by protein hydrolysates[END_REF]

. Plusieurs travaux semblent montrer que la CCK est associée aux effets des protéines sur le fonctionnement digestif et sur le comportement alimentaire. Des travaux réalisés in vivo ont montré que l'ingestion de protéines était associée à une élévation du taux plasmatique de CCK. Plusieurs hypothèses ont été avancées quant aux mécanismes d'action des protéines ou du produit de leur digestion sur le nerf vague. Tout d'abord, pour pouvoir formuler une hypothèse sur les mécanismes de la détection il est nécessaire d'identifier précisément quelle est la substance qui va, à proprement parler, initier la détection. Dans le cas des protéines, polymères d'acides aminés, cette question est tout particulièrement importante. Il convient d'abord de connaître les mécanismes de la digestion et de l'absorption des protéines. Les protéines arrivent quasi intactes dans le duodénum où elles sont soumises à l'action des protéases pancréatiques telle que la trypsine. Dès lors, elles sont propose que la détection est initiée par les acides aminés. En effet, il a été montré que la phénylalanine provoque la libération de CCK par les CEECs. La phénylalanine interagit avec les réserves intracellulaires de calcium dans les cellules entéroendocrines et augmente la concentration de calcium intracellulaire. Ce mécanisme a pour conséquence l'exocytose des vésicules de CCK. Cette proposition présente toutefois deux faiblesses. D'abord les concentrations de phénylalanine sont minimes dans l'environnement direct des cellules entéroendocrines. Ensuite, ce mécanisme apparaît comme peu spécifique au regard du neurotransmetteur ou de l'hormone sécrété. Pourtant, il a été observé que les niveaux des autres médiateurs après infusion de protéines dans l'intestin sont plutôt stables. L'hypothèse d'un mécanisme peu spécifique est donc peu probable. savoir les oligopeptides. Deux études menées in vitro et in vivo ont suggéré que l'activité du transporteur d'oligopeptides PEPT1 pouvait être à l'origine du phénomène de détection

  que notre compréhension des mécanismes précis de la détection des nutriments dans l'intestin avance nettement, certaines questions essentielles restent aujourd'hui encore sans réponse. Par exemple, les modalités d'action des protéines alimentaires sur le système nerveux central, responsable de la coordination des cinétiques digestives et du contrôle de la prise alimentaire sont largement méconnues.

	On sait que les terminaisons des afférences vagales sont sensibles à la libération
	de CCK (73), toutefois certains travaux suggèrent que la CCK plasmatique peut aussi
	agir directement sur le système nerveux central. Déterminer laquelle des voies:
	humorale ou nerveuse est principalement responsable de l'effet des protéines sur la
	mécanique digestive et le comportement alimentaire est nécessaire à notre
	compréhension globale de l'effet de ce type de macronutriment et ses implications dans
	le comportement alimentaire.
	S'il semble que les phénomènes de détection des protéines au niveau de la
	muqueuse intestinale sont partiellement connus, il apparaît en revanche que les
	modalités d'action, autrement dit les voies par lesquelles l'information générée dans le
	tube digestif parvient au cerveau, sont encore largement ignorées.

Comme nous l'avons en effet décrit plus haut, il semble que l'absorption des protéines au niveau de l'intestin proximal génère des signaux physiologiques dont les principales conséquences sont les modifications des cinétiques digestives et l'arrêt du repas. Plus précisément, ce serait l'activité du principal transporteur d'oligopeptides, PEPT1, qui déclencherait une cascade de réactions conduisant à la libération de cholécystokinine (CCK) dans le milieu interstitiel

(15; 31)

. Cependant le devenir de la CCK, et plus précisément les modalités par lesquels elle influence la mécanique gastrique et le comportement ingestif sont encore méconnus.

Table 4 : Composition des régimes expérimentaux (poudres) Traitement statistique.

 4 (NP), semi liquide dans le but d'habituer les rats au type d'aliment (texture nouvelle), puis les rats ont été soumis à un régime semi-liquide hyper-protéique (HP). La composition des aliments est donnée en table 1. Dans le but de minimiser le gaspillage, les régimes NP et HP étaient mélangés à de l'eau pour former une pâte, donc moins à même d'être éparpillée, (rapport poudre / eau 1:1 et 1:1.5, respectivement). La prise alimentaire était enregistrée chaque jour en calculant la différence entre les poids des gamelles en début et en fin de période d'alimentation. Les rats avaient accès à leur gamelle pendant 8 heures en début de cycle nocturne. La prise alimentaire et le poids corporel étaient mesurés quotidiennement.

	Ingrédients	Quantité (g/kg)
		Normo-Protéique (NP)	Hyper-protéique (HP)
	Protéines	140	500
	Amidon de maïs	622.4	312.7
	Saccharose	103	50
	Huile de soja	40	40
	Vitamin mixture AIN-93M	35	35
	Salt mixture AIN-93M	10	10
	Cellulose	50	50
	Typo-choline	2.3	2.3
	Energie Métabolisable (kJ/g)	14.89	15.77

C'est dans ce contexte que s'inscrit notre étude. Nous savons en effet que les afférences vagales transmettent pendant la digestion des informations vers le système nerveux central. Ces informations, relatives par exemple à la mécanique digestive ou à la présence de nutriments dans l'intestin, peuvent influencer le comportement alimentaire. Le rôle de ces informations semble être important, voire déterminant, dans le contrôle du comportement alimentaire, notamment dans le contrôle immédiat de l'ingestion pendant un repas. Il apparaît de ce fait que la compréhension des mécanismes de la viscérosensibilité parasympathique, notamment de la capacité à détecter la présence spécifique de macronutriments dans la lumière intestinale au cours de la digestion, est un phénomène critique dans le contrôle de la prise alimentaire. C'est en effet ce phénomène qui est en particulier associé à la libération de CCK et à son influence sur la prise alimentaire. La compréhension de ces mécanismes ouvre un champ de stratégies thérapeutiques pour lutter contre l'augmentation préoccupante du surpoids et de l'obésité dans nos sociétés modernes. Plus de vingt ans après avoir été pressentis par Jacques LeMagnen comme importants dans le contrôle de la prise alimentaire[START_REF] Lemagnen | Body energy balance and food intake: a neuroendocrine regulatory mechanism[END_REF], les phénomènes cités ici restent toutefois mal compris, et si on s'accorde sur l'idée que la sensibilité viscérale revêt une importance toute particulière dans le phénomène de contrôle de la prise alimentaire, nos connaissances sur l'intéroception, et plus particulièrement ses mécanismes précis et son implication dans le contrôle du comportement alimentaire, restent très

Produit de la digestion des glucides, le glucose est un substrat important pour le métabolisme énergétique. Au cours de l'évolution, les organismes multicellulaires, et notamment les mammifères, ont développé des systèmes permettant de détecter la présence de glucose dans l'ingesta.On peut considérer l'intestin comme un organe sensoriel capable de détecter la présence des nutriments au cours de la digestion[START_REF] Raybould | Visceral perception: sensory transduction in visceral afferents and nutrients[END_REF]. Pendant la phase intestinale de la digestion des signaux sont envoyés, principalement depuis le duodénum, vers le système nerveux central, indiquant la présence de glucose. Ce phénomène a deux conséquences. Tout d'abord il permet de réguler les processus de digestion pour adapter les cinétiques digestives à la capacité absorptive de l'intestin dans le but d'augmenter l'efficacité de la digestion. Mais l'émission de signaux relatifs à la présence de glucose dans l'intestin initie aussi des changements comportementaux, notamment en influençant la prise alimentaire. L'existence de ces rétrocontrôles implique qu'il existe ded détecteurs sensibles à la présence de glucose dans l'intestin et d'un système relayant l'information vers les centres de contrôle de la mécanique digestive et du comportement alimentaire. Comme nous l'avons proposé en introduction il est souvent avancé que ces systèmes relais sont constitués par les afférences vagales (fibres parasympathiques sensitives) qui sont par ailleurs connues pour innerver massivement l'intestin proximal.

Acknowledgements

This work supported by grant NIH DK58588 (HER) and Canadian …. (SLF). The authors are grateful to Dr Ernest Wright (UCLA School of Medicine) for his helpful discussions throughout the course of this work.

Présentation des études

Mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de la détection du glucose dans l'intestin au cours de la digestion

pénètrent dans les entérocytes via les cotransporteurs glucose-sodium de la famille des SGLT situés sur la membrane apicale des entérocytes et ressortent dans la lymphe interstitielle par diffusion à travers le transporteur de glucose GLUT2.

Etude 2: Les mécanismes cellulaires responsables de l'induction de la libération de sérotonine par les cellules entéroendocrines lors de l'action du glucose sur le transporteur de glucose SGLT3. Présentation de la démarche expérimentale

Nous avons choisi de travailler sur des cultures de cellules de type entéroendocrine. Nous avons utilisé les cellules BON, communément utilisées comme modèle d'étude de la sécrétion de sérotonine dans l'intestin, ainsi que les cellules STC1 qui constituent, elles, un modèle répandu d'étude des phénomènes de libération de CCK dans l'intestin. Grâce à la technique du patch clamp (annexe 2) [START_REF] Neher | The extracellular patch clamp: a method for resolving currents through individual open channels in biological membranes[END_REF] , nous avons étudié les changements de potentiel transmembranaire des cellules en fonction de la présence ou non de glucose dans le milieu.

Matériel et méthodes

Culture de cellules

Des cellules de type BON et STC1, (gracieusement offertes par les Dr C.M.

Townsend et D. Hanahan, respectivement) ont été cultivées dans du HG-DMEM (High

Glucose-Dubleco modified Earls Medium) contenant 15% de sérum de cheval, 2.5% de sérum de veau foetal, de 2 mM de L-glutamine,de 100 U/mL de pénicilline et de 1µg/ mL de streptomycine. Les cellules ont été ensemencées sur des lamelles de verre contenues dans des boites de Pétri. Les cellules ont été conservées à 37°C sous une

Protocole expérimental

Les cellules, une fois « patchées », étaient laissées sans intervention pendant 15 min pour stabiliser leur voltage transmembranaire. Dès lors, une solution extracellulaire de glucose était perfusée pendant 1 min avant d'être évacuée par une solution standard. Au moins 10 min plus tard, la solution riche en K + était perfusée, avant d'être rincée par la solution standard.

Résultats

Cellules de type BON

Les paramètres d'acquisition et les résultats sont présentés dans les tables 2 et 3 (figure 24). Suite à la perfusion de glucose, on observe une variation moyenne de potentiel transmembranaire de -2 mV, ceci ne représentant pas une variation significative pour les cellules de type BON. En revanche la perfusion d'un milieu extracellulaire riche en K + a entièrement dépolarisé ces cellules.

Cellules de type STC1

Deuxième Partie:

Mécanismes cellulaires responsables de la détection des acides gras à chaîne longue dans l'intestin au cours de la digestion Apo A-IV et détection des acides gras à chaîne longue

Comme on l'a vu précédemment, il est désormais acquis que la synthèse de chylomicrons est un processus clé dans la détection des acides gras à chaîne longue pendant la digestion et que ce processus repose sur la synthèse et la libération de l'apo A-IV. Néanmoins, des questions demeurent, notamment quant aux mécanismes d'action de la lipoprotéine.

L'apo A-IV est un élément clé de la transduction du signal relatif à la présence des acides gras à chaîne longue dans le contenu digestif. Il convient de parler de transduction car à partir des acides gras à chaîne longue dans la lumière intestinale on aboutit à la libération d'un médiateur spécifique, correspondant à un signal ayant un sens physiologique pour l'organisme. Le mécanisme de transduction, s'il est nécessaire à l'établissement d'une réponse, est en revanche loin d'être suffisant. Pour exercer une action sur le comportement alimentaire, il faut que ce signal agisse soit directement sur les organes effecteurs, soit sur des systèmes sensoriels qui vont relayer ce message vers les systèmes qui génèrent les réponses.

Troisième Partie:

Mécanismes cellulaires responsables de la détection des oligopeptides dans l'intestin au cours de la digestion

Quatrième partie:

Implication du nerf vague dans le contrôle de la prise alimentaire par la détection des protéines dans l'intestin

Au regard des fonctions prises en charge par ces régions du cerveau, cette étude suggère que les systèmes parasympathiques et sympathiques ainsi que le système limbique sont, en partie, responsables des effets des protéines sur le comportement alimentaire. En effet le VMH est une des régions clés dans le contrôle du tonus sympathique et l'amygdale fait partie du système limbique.

Dicussion

Conclusion générale

Pour étudier des phénomènes comportementaux, nous avons mesuré en revanche des paramètres tels que l'activation de régions du système nerveux central, le poids corporel ou la prise alimentaire. Ces techniques d'investigation ne concernent alors plus le niveau cellulaire, mais l'organisme, et les réponses comportementales.

En conséquence, ces démarches expérimentales ont apporté à la connaissance générale sur ce sujet, des éléments de réponse tant au niveau des mécanismes cellulaires qu'au niveau des modifications du comportement.

Nos résultats et les modèles que nous proposons

Les résultats des travaux d'électrophysiologie (études 1, 2, 3 et 4) réalisés sur des cultures de cellules entéroendocrine et à partir d'une préparation de duodénum isolé ont soutenu l'idée d'un modèle de la détection de nutriments dans l'intestin proposée par le Dr Raybould, (figure 35). Selon ce modèle, à la manière des cellules du goût, certaines cellules situées dans la paroi intestinale détectent la présence spécifique de nutriments dans l'intestin [START_REF] Raybould | Does Your Gut Taste? Sensory Transduction in the Gastrointestinal Tract[END_REF] .

Abstract

The presence of glucose in the intestinal lumen elicits a number of changes in gastrointestinal function including inhibition of gastric emptying and food intake, and stimulation of pancreatic and intestinal secretion. The aim of the present study was to test the hypothesis that a member of the SGLT family of transport proteins is involved in detection of luminal glucose in the intestine. Gastric emptying, measured in awake rats, was significantly inhibited by perfusion of the intestine with glucose (60 and 90 mgs); this effect was mimicked by α-methyl glucose (non-metabolizable substrate of SGLT-1 & 3), but not 2-deoxy-D-glucose (substrate for GLUT-2) or iso-osmotic mannitol. Gastric motility and intestinal fluid secretion, measured in anesthetized rats, were significantly inhibited and stimulated, respectively, by duodenal glucose, but not galactose, which has a fold lower affinity for SGLT-3 than glucose.

Duodenal glucose but not galacotse stimulated the release of 5-HT into mesenteric lymph and stimulated the discharge of duodenal vagal afferent fibers. mRNA for SGLT-3 was identified in the duodenal mucosa. Together these data suggest that detection of glucose in the intestine is dependent on SGLT-3, possibly expressed by enterochromaffin cells in the intestinal mucosa, and release of 5-HT. Key words: gastric emptying; intestinal fluid secretion; sodium-glucose cotransporter; vagal afferents; serotonin; intestinal feedback.

Methods

Animals: Experiments were performed in Sprague Dawley rats (Harlan, San Diego, CA) of initial weight 200-280 gms maintained on regular laboratory chow. Rats were fasted overnight but allowed water ad libitum prior to all surgical and experimental procedures. The institutional guidelines for the care and use of laboratory animals were followed throughout the study.

Measurement of gastric emptying

Surgical Procedures: The procedure to place gastric and duodenal cannulas has been described in detail elsewhere (12). Briefly, rats (n=6) were anesthetized with pentobarbital sodium (50 mg/kg ip; Nembutal, Abbott Laboratories, North Chicago, IL). A small stainless steel Thomas cannula was inserted into the forestomach, exteriorized through the abdominal wall and capped.

The duodenal cannula (PE90, Intramedic; Clay Adams, Parsippany, NJ) was inserted into the duodenum 1-2 cm distal to the pylorus. Rats were allowed to recover for 2 weeks before being used in experiments and were used for a period of up to 3 months after surgery. In the period during which rats were recovering from surgery they were accustomed to light restraint in Bollman cages. The duodenal cannula was flushed daily with 0.9% saline and plugged with petroleum jelly.

On experimental days, fasted rats were placed in Bollman cages and the gastric cannula opened and any residual gastric contents flushed out with warm 0.9% saline. The stomach was then allowed to drain freely for 30-45 min. Three ml of 0.9% saline containing the nonabsorbable marker phenol red (60 mg/l) was instilled into the stomach and the cannula closed.

After 5 min, the contents of the stomach were collected, the volume measured and centrifuged.

The concentration of phenol red was determined in the instilled and recovered fluid and the rate of gastric emptying was calculated using the method of Hunt and Spurrell which calculates the volume emptied from the stomach including any gastric secretions. Data for gastric emptying are expressed as the % of the liquid emptied after 5 min as mean + SEM.

Experimental Protocols: Gastric emptying was measured in two consecutive control periods with no perfusion of the duodenum with 10 min between procedures. Perfusion of the duodenum with glucose analogues or mannitol (330, 660 or 990 mM; total amounts 30, 60 or 90 mg) at a rate of 0.05 ml/min was started and continued for 10 min; gastric emptying measured in the 5-10 min period; in some experiments, gastric emptying was measured again at 20-25 min and 35-40 min after duodenal perfusion. Rats were randomized for treatment only one test perfusion was performed on each day and animals were used no more than every third day. Not all rats received each treatment since the full protocol could not be completed as one rat was euthanized because of a leaking gastric fistula.

Measurements of gastric motility in anesthetized rats

This method has been published previously (21). Briefly, rats (200-250 g) were anesthetized with urethane (1.25 g/kg i.p.; Sigma, St. Louis, MO), a catheter was placed into the trachea to ensure a clear airway (Polyethylene tubing, PE 240, 1.67 mm ID, 2.42 mm OD). The abdomen was opened, the pylorus was secured, gastric contents were gently flushed with warm saline 0.9% through an incision in the forestomach and a catheter (Silastic, 2 mm ID, 3.2 mm OD) was placed through the incision to measure intraluminal gastric pressure (IGP). After a recovery period of about 45-60 min, the stomach was filled with warm saline (0.9%, 1 ml) and kept under continuous pressure of 5-6 cm H 2 O for 60 min to normalize baseline IGP. Catheters were placed in the jugular vein and femoral artery (Polyethylene tubing, PE 50, 0.58 mm ID, Collection of mesenteric lymph Surgical preparation and lymph collection was performed as previously described (9).

Briefly, rats (300 -350 g) were anesthetized with methohexital sodium (60 mg/kg i.p.; Brevital, Jones Pharma Inc., St. Louis, MO). The mesenteric lymph duct was cannulated with a PVC tube (Medical Grade, 0.50 mm ID, 0.80 mm OD, Dural Plastics and Engineering, Dural, Australia), fixed in place with a drop of ethyl cyanoacrylate glue (Krazy Glue, Elmers Products Inc., Columbus, OH) and externalized through a stab wound in the right flank. A second cannula (Silastic 1 mm ID, 2.15 mm OD) was passed through the fundus of the stomach, extended 3 cm into the duodenum, secured in place with a silk suture and additionally fixed with a drop of ethyl cyanoacrylate glue and externalized. After surgery, rats were placed in Bollman cages and were allowed to recover, and a maintenance solution (lipid 0.2 mol/L, NaCl 145 mmol/L and KCL 4 mmol/L) was perfused continuously through the duodenal cannula at a rate of 3 ml/h for 24 h during the recovery period to ensure hydration, electrolyte and nutritional maintenance.

Control lymph was collected for 60 min during perfusion of the intestine with physiological saline followed by collection for a further 60 min during intestinal perfusion with 660 mM glucose or galactose (0.05 ml/min; 90 mgs). Lymph was collected in ice-chilled tubes, centrifuged and stored at -80ºC until assayed for 5-HT using a commercial ELISA kit (Becton Coulter).

Recording of duodenal vagal afferent fiber discharge

The technique has been published previously (10). Briefly, a segment of the thoracic esophagus, stomach and proximal duodenum were removed from anesthetized rats and immersed AmpErase UNG per reaction and 5 µl of the diluted cDNA sample in a final volume of 25 µl.

The samples were placed in 96 well plates and amplified in an automated fluorometer (ABI PRISM 7700 Sequence Detection System, Applied Biosystems). Amplification conditions were 2 min at 50°C, 10 min at 95°C, 40 cycles of 15 s at 95°C and 60 s at 60°C.

For each target gene, two primers and an internal, fluorescent labeled TaqMan probe (5´ end, reporter dye FAM (6-carboxyflourescein), 3´ end, quencher dye TAMRA (6carboxytetramethylrhodamine)) were designed using Primer Express software (Applied Biosystems, Foster City, CA). SGLT3: forward primer SGLT3-38f 5'-CCCCAGAGCCACCTCCAT-3', reverse primer SGLT3-112r 5'-CCAGAAAATAGATGACAATGACTGAGAT-3', TaqMan probe SGLT3-58p 5'-6FAM-TCTGACCACATCCGAAATGCTGCTG-TAMRA-3'; glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH): forward primer GAPDHf 5'-GCACCACCAACTGCTTAGCAC-3', reverse primer GAPDH-557r 5'-TCTTCTGGGTGGCAGTGATG-3', TaqMan probe GAPDH-509p 5'-6FAM-TCGTGGAAGGACTCATGACCACAGTCC-TAMRA-3'. SGLT-1: Assay-on-Demand, Applied Biosystems, cat no Hs00165793_m1. The length of the PCR products was held very short (between 73 and 170 bp) to enable high amplification efficiencies.

Final quantitation was done using the comparative CT method (User Bulletin #2, Applied Biosystems, Foster City, CA) and is reported as relative transcription or the n-fold difference relative to a calibrator cDNA (control group). In brief, the endogenous control feline GAPDH was used to normalize the cytokine gene signals. The normalized values (ΔCT) were calibrated against the normalized values of the control group for each target gene (ΔΔCT). The relative

Références bibliographiques