Attaf Djoullah

Rémi Saurel

Controlled release of riboflavin encapsulated in pea protein microparticles prepared by emulsion-enzymatic gelation process

Keywords: riboflavin, pea proteins, emulsion, transglutaminase, encapsulation, release 23

Riboflavin was encapsulated in pea protein microparticles crosslinked by transglutaminase and the release properties of this system was studied in simulated gastric (pH=1.2) and intestinal (pH=7.4) fluids. The microparticles were obtained from a water-in-oil emulsion and subsequent enzymatic gelation. In presence of polyglycerol polyricinoleate as hydrophobic surfactant, magnetic agitation was preferred to high-speed homogenization in order to form spherical microparticles of ~150 µm average size. The encapsulation efficiency of crystallized riboflavin (RF) varied from 74% to 84% depending on the amount of loaded RF (0.1-1.0 wt%). According to the kinetic power law model, the release mechanisms of riboflavin under simulated gastrointestinal conditions were governed by diffusion in absence of digestive enzymes and by a support degradation phenomenon in their presence. The designed microparticles represented a potential system for the delivery of riboflavin up to the intestinal digestion phase.

3

Introduction

The encapsulation of active substances is one of the major innovation challenges in the pharmaceutical, cosmetic and food industries. Encapsulation is a technology that can be applied to a large number of bioactive molecules (antioxidants, vitamins, probiotics, minerals) and aims to protect or isolate them from adverse environments, or allows to control the release of the encapsulated substances in the gastrointestinal tract (Đorđević et al, 2015).

In food systems, many of these molecules have low solubility, are sensitive to environmental factors (such as light, temperature and oxygen), or are degraded by the conditions encountered in the gastrointestinal tract (digestive enzymes, pH). These properties can thus affect significantly their bioavailability. The basis of encapsulation is to create a biocompatible barrier between the environment and the substance entrapped in the protective matrix [START_REF] Mcclements | Encapsulation, protection, and release of hydrophilic active components: potential and limitations of colloidal delivery systems[END_REF]. Various protection and delivery systems have been proposed to form (micro-)capsules which can release their contents under specific conditions. One well-known strategy is that of trapping bioactive molecules in hydrogel matrices [START_REF] Mcclements | Recent progress in hydrogel delivery systems for improving nutraceutical bioavailability[END_REF].

Hydrogels are three-dimensional cross-linked networks of natural macromolecules adapted to the controlled release of bioactive compounds due to their sensitivity to environmental stimuli, such as pH and digestive enzymes in the gastrointestinal tract. Proteins, such as dairy or plant proteins, have been stated as attractive choices for designing hydrogels thanks to their high nutritional value, their excellent functional properties and their amphiphilic nature compatible with many active substances (Shewan & Stokes, 2013). Furthermore these hydrogels are particularly suitable to entrap hydrophilic compounds thanks to their capacity to retain water [START_REF] Aditya | Encapsulation systems for the delivery of hydrophilic nutraceuticals: Food application[END_REF]McClements, 2017a).

Among hydrophilic bioactive molecules, Riboflavin (RF), also known as vitamin B2, is a water-soluble vitamin indispensable for living beings. It plays an essential role in energy metabolism of cells and acts as coenzyme factor in various oxidation-reduction processes in cell (Suwannasom et al. 2020). Sufficient dietary or supplemental intake in RF appears to have biological protective effects encompassing anti-oxidant, anti-aging, anti-inflammatory, anti-nociceptive and anti-cancer properties (Suwannasom et al. 2020). However, this molecule of low molar mass (376,36 g/mole) is highly photosensitive and slightly soluble in water (~0.08 g/L at 25 °C) [START_REF] Morrison | Cyclodextrin-mediated enhancement of riboflavin solubility and corneal permeability[END_REF]Sheraz et al, 2014). Many encapsulation strategies have been proposed in the past 10 years to overcome these drawbacks and to offer nutraceutical solutions. In addition, RF has been chosen as a model molecule in several studies on encapsulation and controlled release of hydrophilic bioactive compounds. Thus, in the recent period authors have investigated the encapsulation of RF in different biopolymeric systems. For instance, particulate systems were proposed such as hydrogel microspheres based on proteins [START_REF] Chen | Elaboration and characterization of soy/zein protein microspheres for controlled nutraceutical delivery[END_REF][START_REF] O'neill | Whey microbeads as a matrix for the encapsulation and immobilisation of riboflavin and peptides[END_REF] or sodium alginate [START_REF] El-Ghaffar | pH-sensitive sodium alginate hydrogels for riboflavin controlled release[END_REF][START_REF] Messaoud | Physico-chemical properties of alginate/shellac aqueous-core capsules: Influence of membrane architecture on riboflavin release[END_REF], dried polysaccharide carriers [START_REF] De Farias | Microencapsulation of riboflavin with galactomannan biopolymer and F127: Physico-chemical characterization, antifungal activity and controlled release[END_REF][START_REF] Prosapio | Freeze-dried gellan gum gels as vitamin delivery systems: modelling the effect of pH on drying kinetics and vitamin release mechanisms[END_REF], or water-in-water emulsions [START_REF] Chen | Zein particlestabilized water-in-water emulsion as a vehicle for hydrophilic bioactive compound loading of riboflavin[END_REF]. Different macromolecular complexes such as inclusion complexes in cyclodextrins (Terekhova et al, 2011), protein-polysaccharide electrostatic complexes [START_REF] Kurukji | Fabrication of sub-micron protein-chitosan electrostatic complexes for encapsulation and pH-Modulated delivery of model hydrophilic active compounds[END_REF], β-lactoglobulinbased nanocomplexes [START_REF] Madalena | In vitro digestion and stability assessment of β-lactoglobulin/riboflavin nanostructures[END_REF] or molecularly imprinted polymers [START_REF] Mokhtari | Water compatible molecularly imprinted polymer for controlled release of riboflavin as drug delivery system[END_REF], were also investigated. Finally, lipid-based systems such as double emulsions [START_REF] Bou | Physicochemical properties and riboflavin encapsulation in double emulsions with different lipid sources[END_REF], liposomes (Ahmad et al, 2015), or solid lipid nanoparticles [START_REF] Couto | Encapsulation of Vitamin B2 in solid lipid nanoparticles using supercritical CO2[END_REF], were designed. Recently, some authors proposed the use of enzymatically crosslinked plant protein-based hydrogels by using laccase (Yan et al, 2020) or transglutaminase (Wen et al, 2018) for RF encapsulation. In these latter works, encapsulation systems were designed as macrogels, divided in small pieces for release properties evaluation. Assuming that delivery systems usually gain advantages in the form of microparticles, the present paper proposes to design microparticulated hydrogels from crosslinked pea proteins for RF encapsulation.

Among plant proteins, pea proteins are considered as good candidates to design encapsulation carrier because of their sustainable production, non-allergenic status and tunable functional properties [START_REF] Quintero | Vegetable proteins as potential encapsulation agents: a review[END_REF]. Furthermore, they have demonstrated good susceptibility to enzymatic crosslinking with transglutaminase, due to their high content in reactive amino acid residues (glutamine and lysine) [START_REF] Djoullah | Native-state pea albumin and globulin behavior upon transglutaminase treatment[END_REF].

In the present work, we evaluated the encapsulation of RF in microparticulated pea protein hydrogels obtained from a double stage process based on the formation of water-in-oil emulsion and subsequent enzymatic gelation of the internal protein phase by using transglutaminase. The emulsification process was first developed to form spherical microparticles of a few tens of micrometers. In a second step, we investigated the in vitro kinetics and release mechanisms of RF in simulated gastric and intestinal fluids.

Material and methods

Materials

Pea flour from yellow peas (P. sativum L.) was supplied by Roquette SA (Lestrem, France). A Ca 2+ -independent microbial transglutaminase (MTGase) derived from Streptoverticillium mobaraense was obtained from Ajinomoto Foods Europe SAS, France. The commercial enzyme preparation (Activia ® WM) contains 1% active enzyme and 99% maltodextrin. The powdered preparation was assessed to have an activity of 100 U/g. The oily phase (Miglyol 812 N) was supplied by Sasol Germany Gmbh (Germany). Miglyol is a neutral, colorless, odorless and tasteless edible oil containing medium chain triglycerides. It has a high oxidation stability and remains liquid at 0 °C. Polyglycerol polyricinoleate (PGPR, Grinsted® PGPR 90, E 476) was obtained from Danisco (Denmark). PGPR is a hydrophobic emulsifier (HLB=1.5±0.5) used for the stabilization of water-in-oil emulsions. Riboflavin, vitamin B2, was supplied by Sigma Aldrich® (France). It is a water-soluble (67-333 mg/L) orange powder. All other chemicals of analytical grade were purchased to VWR International SAS (France) and Sigma-Aldrich® (France).

Methods

Pea protein extraction

The extraction of the total pea protein fraction (TPP) was carried out by dispersing 100 g of pea flour in 1 liter of phosphate buffer (0.1 M, pH=8) in the presence of K2SO4 1% for 1 h at 4 °C. The protein extract (supernatant) was recovered by centrifugation (12,000g, 10 min) then concentrated (x5) by using an ultrafiltration device (Millipore Pellicon 2®) equipped with a Kvick TM cassette (0.11 m2; 10 kDa cutoff) and operating at 2.2 bar at ambient temperature. The liquid sample was then purified by diafiltration against 10 volumes of a 5 mM solution of ammonium carbonate by using the same ultrafiltration device. The pea protein extract obtained was consecutively frozen and lyophilized. The dried protein extract was collected, grinded and stored at -20 °C. The freeze-dried protein isolate had a protein content of 87.2% on a dry basis and a 3.6% water content. The polypeptide profile determined by SDS-PAGE indicated that the protein isolate contained ~20% albumins and ~80% globulins (data not shown).

Microparticle preparation

The pea protein microparticles were prepared by using a microencapsulation process similar to that proposed by [START_REF] Heidebach | Transglutaminase-induced caseinate gelation for the microencapsulation of probiotic cells[END_REF]. The procedure consisted in forming a water-in-oil (W/O) emulsion and subsequently applying enzymatic crosslinking for gelling the dispersed protein phase. First, a 15 wt% TPP dispersion was prepared in phosphate buffer (50 mM, pH=7). After 2 h stirring, the MTgase preparation was quickly dispersed in the protein solution at the rate of 20 MTGase U/g protein and the mixture (20 g) was slowly introduced under magnetic strirring (~ 900 rpm) in vials containing 100 g of oil (Miglyol® 812 N) previously heated to 45 °C with or without PGPR. The samples were maintained under stirring during 2 h at 45 °C. After incubation, the dispersed TPP globules were gelled in the form of microparticles under the action of MTGase. The microparticles were separated from the oil by gentle centrifugation (500g, 5 min), washed twice with 2% Tween 80 solution, then collected on a filter paper and freeze-dried. Alternatively, in order to reduce the size of the microparticles, a thinner emulsion was formed by 5 min homogenization with an Ultra-Turrax (IKA T25) at 10,000 rpm before incubation in the same conditions.

Microparticle size

The size distribution of the microparticles was determined by a Mastersizer 2000 laser granulometer (Malvern Instruments, Southborough, MA). The average size of protein microparticles were calculated as the Sauter mean diameter (d32).

Microscopy

The morphology and external structure of the microparticles were visualized by an optical microscope (Nikon TE2000) equipped with a camera (EMCCO Andor iXon +885).

Microparticle dissolution rate

The dissolution of the microparticles was evaluated in synthetic gastric (HCl solution at pH=1.2) and intestinal (phosphate buffer at pH=7.4) juices with or without 0.1% pepsin and 1% pancreatin respectively [START_REF] Chen | Elaboration and characterization of soy/zein protein microspheres for controlled nutraceutical delivery[END_REF]. For that, 200 mg of freeze-dried microparticles were dispersed in the four digestive fluids (30 ml) with continuous stirring (~100 rpm) at 37 °C. Two ml of supernatant excluding any particles were taken at regular time intervals and the amount of protein was assayed by Kjeldahl method. After each sampling, an equivalent volume of fresh digestive juice was added to maintain a constant volume. The percentage of solubilized microparticles was calculated from Eq.1.

% solubilized microparticles = (QPi/QPT)*100

(1

)
where QPi is the cumulative amount of dissolved proteins at time i; QPT is the amount of proteins after complete microparticle dissolution (10 h).

Riboflavin encapsulation

The RF encapsulation process was performed as previously described for the preparation of microparticles. RF was introduced into the protein solution at 0.1, 0.5 or 1% concentration before the addition of MTGase. Considering the low solubility of RF powder, the loaded RF in microparticles remained mainly in a crystal form.

To evaluate the encapsulation rate of RF in TPP microparticles, encapsulation efficiency (EE)

and loading efficiency (LE) were calculated according to the method of Chen and Subirade (2009) with some adaptations. For that, 200 mg of RF-loaded microparticles were dissolved in 25 ml of intestinal juice (pH=7.4) with 1% pancreatin at 37 °C under vigorous stirring for 6 h.

The mixture was then centrifuged (10,000g, 20 min) and RF was assayed in the supernatant with an UV spectrophotometer (Spectronic BioMate 3) by measuring absorbance at 445 nm and using a calibration curve. EE and LE were calculated by Eqs. 2 and 3 respectively.

EE = A / B * 100 (2) LE = A / C * 100 (3)
where A is the measured amount of RF encapsulated in the sample (mg); B is the theoretical amount of RF corresponding of the initial load in the sample (mg); C is the weight of microparticle sample (mg).

Release kinetics in simulated gastro-intestinal fluids

The RF release kinetics were studied in the gastric and intestinal juices with or without digestive enzymes as proposed by [START_REF] Chen | Elaboration and characterization of soy/zein protein microspheres for controlled nutraceutical delivery[END_REF] with some modifications. 200 mg of lyophilized microparticles were suspended in 30 ml of each digestive fluid with gentle stirring (~100 rpm) at 37 °C. Two milliliters of supernatant excluding any particles were removed at regular time intervals and then centrifuged (12,000g, 10 min) and the amount of RF in the supernatant was assayed by absorbance measurement at 445 nm. After each sampling, an equivalent volume of fresh digestive juice was added to maintain a constant volume. The percentage of RF released at each time was calculated from Eq. 4.

% of released RF = (QRi/QRT) * 100 (4)

where QRi is the amount of RF released at time i (mg); QRT is the amount of total RF encapsulated in sample estimated after total dissolution of microparticles (6 h) in the fluid containing digestive enzymes (mg).

Release kinetics modelling

A semi-empirical model, establishing the exponential relationship between the release rate and the time, was used to evaluate the main controlling phenomena. This model known as the Peppas equation [START_REF] Ritger | A simple equation for description of solute release I. Fickian and non-fickian release from non-swellable devices in the form of slabs, spheres, cylinders or discs[END_REF] represents the release rate as a power law function of time as follows:

Mt/M∞ = K * t n (5) 10
where M∞ is the amount of active molecule released at the equilibrium (it was assumed that total RF release was achieved at an infinite time); Mt is the amount of active molecule released over time t; K is the the release velocity constant, and n is the exponent of release.

Statistic analysis

All measurements were performed with at least three replicates. The statistical analyses were performed with XLSTAT Pro v2013 software by analysis of variance (ANOVA). A Tukey post-hoc test was used to determine significant differences between group means with a confidence interval of 95% (p<0.05). Linear regressions and related statistical parameters were obtained by using Excel® software (2016, 16.0.5017.1000).

Results and discussion

Elaboration and characteristics of microcapsules

In order to produce individualized gelled microparticles, a reverse emulsion was first formed by dispersing a 15 wt% TPP suspension containing MTGase in Miglyol oil and incubating the mixture for 2 h at 45 °C. The protein concentration, incubation temperature and time where chosen from preliminary gelation experiments in order to form strong crosslinked protein gels (data not shown). In order to improve the formation of the W/O emulsion, a hydrophobic emulsifying agent (PGPR) was used. Fig. 1 shows light microscopy images of the W/O emulsions after gelation in the absence (Fig. 1a) and in the presence of 1% (Fig. 1b) or 2% (Fig. 1c) PGPR. Without PGPR, the dispersed TPP was gelled in the form of a semicontinuous network composed of interconnected blocks of irregular shape. This could be explained by the poor ability of protein to stabilize reverse emulsion. Proteins are hydrophilic emulsifiers that do not generate W/O interfaces stable enough to prevent the association of TPP globules with each other [START_REF] Lam | Food proteins: A review on their emulsifying properties using a structure-function approach[END_REF].

With 1% PGPR addition (Fig. 1b), the gels were in the form of aggregated microparticles of spherical shape. PGPR is a lipophilic emulsifying agent that facilitate the formation of the W/O interfaces and dispersed globules with regular shape (Zhu et al., 2019). The formation of W/O emulsions generally needs high emulsifying agent concentrations. The 1% PGPR concentration was insufficient to prevent flocculation among microparticles. A higher quantity of PGPR was thus necessary to separate the clustered microparticles. Indeed, the use of 2% of PGPR (Fig. 1c) led to the formation of individual microparticles of spherical shape.

Synergistic effect may occur between PGPR and the proteins from the internal phase, that would enhance the efficiency of the lipophilic emulsifying agent (Zhu et al., 2019).

The size distribution of the microparticles produced under different conditions were evaluated and typical size profiles are presented in Fig. 2. The microparticles produced in the presence of 1% of PGPR under 900 rpm magnetic agitation had a non-Gaussian and relatively wide distribution with an average diameter of ~320 μm, reflecting a multimodal distribution. This result was consistent with the microscopic observations (Figure 1b) showing that the microparticles gathered in small groups. The size distribution of the systems with 2% and 3%

PGPR addition had Gaussian and narrow profiles centered to ~153 and ~149 μm respectively.

These microparticle size values were close to those obtained by [START_REF] Heidebach | Transglutaminase-induced caseinate gelation for the microencapsulation of probiotic cells[END_REF] who used a similar process for encapsulating probiotic cells in MTGase-induced caseinate gels.

These sizes cover the main food applications [START_REF] Heidebach | Transglutaminase-induced caseinate gelation for the microencapsulation of probiotic cells[END_REF]. To produce smaller microparticles, the emulsion was prepared using an Ultra-Turrax homogenizer (5 min, 10,000 rpm) with 2% PGPR before incubation. The high-speed homogenization step led to a monomodal size distribution with a ~28 μm average diameter.

In the case of food applications, the size of the microcapsules is a determining factor. While large microparticles can change sensory perception, too small microparticles are sometimes unable to offer satisfactory encapsulation capacity. Indeed, the release of the encapsulated molecules is controlled by diffusion phenomena and/or degradation of the matrix, which are generally inversely proportional to the size of the microparticles [START_REF] Berkland | Precise control of PLG microsphere size provides enhanced control of drug release rate[END_REF].

The degradation of croslinked TPP-based microparticles was studied in synthetic gastric and intestinal fluids with or without digestive enzymes at 37 °C. For that, freeze-dried microparticles resulting from emulsions prepared using gentle agitation and with 2% PGPR, were assessed. The dissolution profiles of the microparticles were recorded for 10 hours and are reported in Fig. 3.

In the absence of digestive enzymes, the microparticles were slighty solubilized (<10%) whatever the pH of the fluid (pH=1.2 and pH=7.4) even up 48 h dissolution (results not shown). This observation is in agreement with previous works showing the stability of MTGase-induced protein microparticles in gastric juice without pepsin [START_REF] Heidebach | Transglutaminase-induced caseinate gelation for the microencapsulation of probiotic cells[END_REF]. Limited particle dissolution is a desirable feature to control the release of the encapsulated molecules. [START_REF] Cho | Encapsulation of fish oil by an enzymatic gelation process using transglutaminase cross-linked proteins[END_REF] showed that thermal gels of soy proteins were 5 times more solubilized than gels prepared by enzymatic crosslinking. This was due to the nature of the bonds stabilizing the protein network, which are covalent in the case of enzymatic crosslinking and mainly non-covalent in the case of thermal gelation.

On the other hand, the addition of digestive enzymes accelerated the degradation of microparticles (Fig. 3). The degradation was faster in the intestinal conditions than in the gastric ones. In the intestinal fluid, the dissolution rate reached 80% and 100% after 90 min and 4 h incubation respectively. Under gastric conditions, the dissolution rate was limited to 32% after 90 min and complete dissolution was achieved after 10 h. Smaller degradation of microparticles in gastric juice with pepsin in comparison to intestinal conditions was also recently reported for similar enzymatically crosslinked protein hydrogels (Wen et al, 2018;Yan et al, 2020). The observed dissolution behavior seemed adapted to protect the active molecules from the gastric environment and significantly release them during the intestinal phase, as the gastric transit time is typically not longer than 1-2 h [START_REF] Gonçalves | Advances in nutraceutical delivery systems: From formulation design for bioavailability enhancement to efficacy and safety evaluation[END_REF].

Riboflavin encapsulation

In order to encapsulate RF in the microparticles, RF was dispersed in the TPP solution before emulsification. Three RF contents (0.1, 0.5 and 1.0 wt%) in the protein solution were studied to assess the loading capacity of the microparticles. The microcapsules were prepared from W/O emulsions containing 2% PGPR using magnetic agitation only or with prehomogenization by Ultra-Turrax. The encapsulation efficiency (EE) as well as the loading efficiency (LE) of the microparticles are reported in Table 1. The size of the loaded microparticles resulting from mild agitation condition was close to 150 µm whatever the RF concentration. The size of the microparticles prepared with high-speed homogenization was significantly lower (~32 µm) in agreement with the previous observations (section 3.1). For the largest microparticles, the EE values decreased significantly from ~84% to ~74% when increasing RF concentration, while the smallest microparticles had the lowest EE (~56%).

The same trends were logically observed for LE values. The microparticle size variation from ~150 to ~30 μm, following the use of high-speed homogenization, resulted in one-third decrease of LE and EE values. The EE values were in the same order of magnitude as those found by [START_REF] Chen | Effect of preparation conditions on the nutrient release properties of alginate-whey protein granular microspheres[END_REF] for RF encapsulation in alginate-whey protein microparticles generated from an emulsification and internal gelation process. The decrease in EE was mainly explained by the size of the RF crystals relative to the microparticle size. This behavior was confirmed by microscopic observations of loaded microparticles (Fig. 4). It was clearly observed that the larger microparticles (Fig. 4a) are significantly better suited for incorporating large RF crystals than the smaller microparticles (Fig. 4b). These observations were again consistent with the findings of [START_REF] Chen | Effect of preparation conditions on the nutrient release properties of alginate-whey protein granular microspheres[END_REF] for alginate-whey protein microspheres (<100 μm) encapsulating RF crystals. Typically, RF solubility vary between a few mg/L and a few tens of mg/L depending on the crystal form, the solvent temperature and pH (Rivlin, 2012). Owing to its low solubility, RF remained mainly crystallized in the form of "short thin needles" (5 to 10 µm) in the TPP microparticles after encapsulation. Because of these particular shape and size, the RF crystals were not totally incorporated in 30 µm microparticles. Part of the RF flakes remaining outside the microparticles would be then dissolved and/or removed by the washing step after enzymatic incubation.

Release kinetics and mechanism

The microparticles produced from W/O emulsion by applying magnetic stirring at 1% RF concentration where chosen for further release experiments. The release kinetics of RF from the loaded microparticles was carried out at 37 °C in four different fluids: pH=1.2; pH=1.2 + pepsin; pH=7.4 and pH=7.4 + pancreatin for 6 hours. The corresponding results are presented in Fig. 5.

The release of RF was enhanced by the addition of digestive enzymes in both gastric and intestinal juices. RF release evolved faster under intestinal conditions (pH=7.4 + pancreatin) than under gastric ones (pH=1.2 + pepsin). Complete release of RF (100%) was achieved after 4 and 6 h respectively. These release profiles were very similar to those observed for the dissolution experiments (Fig. 3) in intestinal conditions but slightly different in the case of gastric conditions since the degradation was longer in the latter case. The present release behaviours reflected probably different phenomena such as mainly matrix degradation, solubilization of crystallized RF and/or its diffusion. As shown in Fig. 4C at a microscopic scale, the surface of TPP microparticles were early degraded in the intestinal juice with pancreatin, whereas the peripheral RF crystals became exposed. The gradual release of RF from the outer layers to the inner layers due to the proteolytic action of pancreatin could be thus hypothesized.

In the absence of digestive enzymes, RF release rates evolved much more slowly independently of digestive conditions (pH=1.2; pH=7.4), reaching only a 40% value after 6 h.

The release profiles differed in intensity from those observed under the same conditions for microparticle dissolution since the degradation rate remained below 10% in the latter case (Fig. 3). This could indicate that diffusion phenomena predominated in the case of limited microparticle degradation.

The release mechanisms of active molecules from polymeric matrices are generally based on two main phenomena: degradation (dissolution or erosion) of the encapsulating support and diffusion of the active molecule through the support; but other phenomena have to be taken into account such as swelling, glass transition, chemical degradation, osmotic effect or reaction. [START_REF] Peppas | Mathematical models in drug delivery: How modeling has shaped the way we design new drug delivery systems[END_REF]. Many mathematical models have been proposed to simulate the release kinetics of encapsulated agents from hydrogel-based systems [START_REF] Lin | Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling[END_REF][START_REF] Peppas | Mathematical models in drug delivery: How modeling has shaped the way we design new drug delivery systems[END_REF]. In the present paper, the Peppas equation (Eq. 5)

was used in order to distinguish between the main controlling phenomena. This power law model is generally applicable for the first ~60% of the release profile [START_REF] Lin | Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling[END_REF], so that it was applied to release rate values below 70% in a logarithmic representation for all the experimental release kinetics (Fig. 6). Thus, the n value corresponded to the slope of the interpolating straight line for each release condition. The experimental values of n as well as the regression coefficients (R²) were reported Table 2.

All the regression coefficients were found higher than ~0.96 indicating the appropriateness of the model to fit the data. The n values varied between 0.48 and 0.81 and were compared to the theoretical values corresponding to Fickian and non-Fickian transport behaviours [START_REF] Ritger | A simple equation for description of solute release I. Fickian and non-fickian release from non-swellable devices in the form of slabs, spheres, cylinders or discs[END_REF]. In a pure Fickian model (Case I), n = 0.45 for a spherical geometry and the active molecule release is governed by diffusion. The exponent values calculated for the simulated gastric and intestinal fluids without digestive enzyme were 0.48 and 0.51 respectively, close to the n theoretical value for diffusion behaviour. The discrepancy observed between experimental and theorical values could be explained by a limited dissolution effect (<10% degradation rate) and other phenomena like swelling or heterogeneous particle size distribution, that may influence diffusion kinetics [START_REF] Ritger | A simple equation for description of solute release I. Fickian and non-fickian release from non-swellable devices in the form of slabs, spheres, cylinders or discs[END_REF]. In the present case, progressive solubilization of RF crystals inside microparticles accompanied also diffusion of RF molecules through the crosslinked protein network.

A pure erodible system corresponds generally to a zero-order release kinetics [START_REF] Lin | Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling[END_REF]. In this case, the amount of active substance released is proportional to time (n=1) for a system with a constant planar surface as a slab-shaped geometry. It could be assimilated to the Case II condition of the power law model for which n=0.85 for a spherical geometry even if this case is generally related to relaxation of the polymeric matrix [START_REF] Ritger | A simple equation for description of solute release I. Fickian and non-fickian release from non-swellable devices in the form of slabs, spheres, cylinders or discs[END_REF]. clearly identify the behavior of our system for each digestive condition. Extrapolated to real digestive conditions, the present results suggested that RF could be regularly released up to ~40-50% during the gastric phase (<90 min), likely followed by a very fast release of the

  The n value determined for intestinal fluid with added pancreatin (n = 0.81) was close to this value, indicating the RF release was mainly controlled by the enzymatic degradation of the protein microparticles. The release exponent calculated for the gastric fluid with pepsin was 0.6 indicating an intermediary behaviour as the dissolution of TPP microparticles was significantly slower compared to intestinal conditions. In agreement with these results, comparable systems based on enzymatically crosslinked protein hydrogels(Wen et al, 2018; Yan et al, 2020) have shown non-Newtonian RF release behaviour under gastric conditions and erosion-controlled behaviour under intestinal conditions. The choice to test the microparticles in the gastric and intestinal artificial juices separately, made it possible to

Figure 1 :

 1 Figure 1 : Light microscopy images of the TPP microparticles in absence or presence of

Figure 2 :Figure 3 :Figure 4 :

 234 Figure 2 : Size distribution of crosslinked TPP microparticules prepared with different

Figure 5 :Figure :

 5: Figure 5 : Release kinetics of riboflavin from microparticles in different simulated digestive

  Sheraz, M. A., Kazi, S. H., Ahmed, S., Anwar, Z., & Ahmad, I. (2014). Photo, thermal and chemical degradation of riboflavin. Beilstein Journal of Organic Chemistry, 10(1), 1999-

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Table 1 :

 1 Mean diameter (d32), encapsulation efficiency (EE) and loading efficiency (LE) of microparticules prepared with different emulsification methods and at different riboflavin contents (CRibo).Different superscripts in the same column represent significant differences (p<0.05) among samples

	CRibo (%)	Agitation (rpm)	d32 (µm)	EE (%)	LE (%)
	0.1	900	149.2 ± 1.8 a	84.1 ± 2.4 a 0.56 ± 0.02 a
	0.5	900	148.4 ± 2.9 a	81.7 ± 2.6 a 2.72 ± 0.09 b
	1.0	900	151.6 ± 3.1 a	74.5 ± 3.4 b 4.97 ± 0.23 c
	0.1	+10000 (Ultra-Turrax)	31.7 ± 1.2 b	56.5 ± 3.4 c 0.38 ± 0.02 d

Table 2 :

 2 Release exponent values (n) and regression coefficient (R²) of the power law model from different release kinetics.

	Release fluids	n	R²
	pH 1.2	0.48 ± 0.07 a	0.986
	pH 1.2 + pepsin	0.60 ± 0.03 b	0.956
	pH 7.4	0.51 ± 0.02 a	0.978
	pH 7.4 + pancreatin	0.81 ± 0.02 c	0.979
	Different superscripts in the same column represent significant differences (p<0.05) among
	samples

Acknowledgement

Authors are grateful to Ajinomoto Foods Europe SAS for providing the MTGase powder and to Conseil Régional de Bourgogne (France) for its financial support (PARI MATBIO).

remaining RF from the pre-degraded protein microparticles under intestinal conditions. Sequential and standardized in vitro digestion protocol such as the INFOGEST method [START_REF] Minekus | A standardised static in vitro digestion method suitable for food-an international consensus[END_REF] would be necessary to validate these synergistic release effects.

Conclusion.

Pea protein microparticles encapsulating RF were successfully prepared by W/O emulsion and enzymatic gelation. The size of the micropartricles (~150 µm) was controlled by mild agitation during emulsion preparation and adequate concentration of the hydrophobic emulsifying agent. This size was adapted to entrap RF crystals with a significant yield (>74%). The release of RF from the enzymatically crosslinked microparticles seemed controlled by diffusion in digestive juices when no proteolytic enzyme was added. In the presence of digestive enzymes, the release kinetics could correspond to erosion-like behaviour under intestinal conditions and intermediary situation under gastric conditions where diffusion and matrix degradation occurred simultaneously. The protein microparticles would thus ensure a sufficient protection of RF to allow significant release during intestinal phase. This conclusion needs further validation by applying successive digestive steps or using a continuous-type digester.


Lucie Guilbaud
email: lucie.guilbaud@gmail.com

Paul Maurice

Ferdinand Dhombres

Émeline Maisonneuve

Agnès Rigouzzo

A.-M Darras

J.-M Jouannic

Anne-Marie Darras

Jean-Marie Jouannic

Emeline Maisonneuve

Jean-Marie Jouannic

Geste d'arrêt de vie foetale : techniques pour les interruptions médicales de grossesse des deuxième et troisième trimestres

Keywords: Foeticide, interruption médicale de grossesse, xylocaïne, chlorure de potassium, analgésie foetale Feticide, late termination of pregnancy, lidocaine, potassium chloride, fetal analgesia

Introduction

En France, l'article L2213-1 du code de la santé publique stipule qu'une interruption médicale de la grossesse (IMG) peut être pratiquée, à tout moment de la grossesse, si deux médecins membres d'un Centre Pluridisciplinaire de Diagnostic Prénatal (CPDPN) attestent, soit que « la poursuite de la grossesse met en péril grave la santé de la femme », soit qu'il « existe une forte probabilité que l'enfant à naître soit atteint d'une affection d'une particulière gravité reconnue comme incurable au moment du diagnostic ».

Ceci implique la possibilité d'interrompre une grossesse au-delà du terme de viabilité foetale. Bien qu'aucune disposition légale n'impose la réalisation d'un geste d'arrêt de vie foetale (GAF) dans le cadre des IMG de deuxième partie de gestation, le Collège National des Gynécologues Obstétriciens Français (CNGOF) a recommandé en 2008 la réalisation d'un GAF à partir de 22-24 semaines d'aménorrhée (SA) afin de prévenir toute douleur foetale et d'éviter la naissance d'un enfant grand prématuré vivant et présentant une "affection d'une particulière gravité reconnue comme incurable au moment du diagnostic" [START_REF] Houfflin-Debarge | Interruption me ́dicale de grossesse. Processus de ́cisionnel et prise en charge[END_REF][START_REF] Mandelbrot | Aspects techniques des interruptions médicales de grossesse[END_REF]. Ainsi, chaque année en France, 1800 à 2000 foeticides sont réalisés au sein des CPDPN, avec des chiffres relativement stables depuis une dizaine d'années [START_REF]Rapport d'activité des Centres Pluridisciplinaires de Diagnostic Prénatal[END_REF].

Afin d'être considérée comme efficace, une technique de GAF doit permettre une asystolie foetale rapide, par le biais d'un geste techniquement simple et reproductible, tout en assurant une sécurité totale à la mère et en permettant une analyse histologique de qualité des tissus foetaux.

Compte tenu des législations limitant le terme de réalisation des IMG dans de nombreux pays, rares sont les équipes ayant étudié les techniques de GAF aux deuxième et troisième trimestres de la grossesse. Nous proposons ici une revue de la littérature afin de déterminer quels sont la voie d'abord, le produit et la dose les plus adaptés aux GAF tardifs dans le cadre des IMG.

Méthodes

Nous avons effectué une recherche électronique utilisant la base de données [START_REF] Chen | Cardiac tamponade: an alternative procedure for late feticide[END_REF]. Tous les autres articles ont été analysés dans leur intégralité.

Résultats

Au total, dix articles correspondaient aux critères de notre recherche. Les différentes techniques employées ainsi que les taux de succès en fonction des âges gestationnels sont résumés dans le tableau 1.

La première étude paraît en 1992 [START_REF] Isada | Fetal intracardiac potassium chloride injection to avoid the hopeless resuscitation of an abnormal abortus: I. Clinical issues[END_REF]. L'objectif des auteurs était de montrer l'efficacité d'une injection intra-cardiaque de chlorure de potassium (KCl) pour Dans cette revue de la littérature, trois équipes ont réalisé une anesthésie foetale [START_REF] Bhide | Comparison of feticide carried out by cordocentesis versus cardiac puncture[END_REF][START_REF] Senat | The use of lidocaine for fetocide in late termination of pregnancy[END_REF][START_REF] Senat | Funipuncture for fetocide in late termination of pregnancy[END_REF][START_REF] Rayssiguier | Comparison between potassium chloride and lidocaine as lethal agents for feticide in termination of pregnancy[END_REF]. Une équipe anglaise utilise le diazepam à la dose de 10mg afin de limiter les mouvements foetaux [START_REF] Bhide | Comparison of feticide carried out by cordocentesis versus cardiac puncture[END_REF]. Le diazépam est une benzodiazépine qui possède des propriétés hypnotiques mais pas analgésiques. Deux équipes françaises utilisent le sufentanil à la dose de 5 µg ou 1,5 µg/kg de poids foetal estimé [START_REF] Senat | The use of lidocaine for fetocide in late termination of pregnancy[END_REF][START_REF] Senat | Funipuncture for fetocide in late termination of pregnancy[END_REF][START_REF] Rayssiguier | Comparison between potassium chloride and lidocaine as lethal agents for feticide in termination of pregnancy[END_REF] viscères [START_REF] Coulibaly | Lethal injection of potassium chloride: first description of the pathological appearance of organs[END_REF]. Ces données n'ont pas été confirmées par l'étude de Raissyguier, dans laquelle aucune différence n'a été observée entre le groupe lidocaïne et le groupe KCl, et aucun cristal au sein des viscères foetales n'a été observé dans chacun des groupes [START_REF] Rayssiguier | Comparison between potassium chloride and lidocaine as lethal agents for feticide in termination of pregnancy[END_REF].

La lidocaïne semble plus sécuritaire pour la mère que le KCl. Sur 119 GAF réalisés par lidocaïne, aucune complication maternelle n'a été rapportée [START_REF] Senat | Funipuncture for fetocide in late termination of pregnancy[END_REF][START_REF] López-Cepero | Effectiveness and safety of lidocaine in the induction of fetal cardiac asystole for second trimester pregnany termination[END_REF][START_REF] Rayssiguier | Comparison between potassium chloride and lidocaine as lethal agents for feticide in termination of pregnancy[END_REF]. Des complications neurologiques ou cardiaques peuvent être observées en cas de taux plasmatique atteignant 8 à 12 mg/L et des cas d'asystolie ont été décrits après injection intra-vasculaire involontaire de 800 à 1000 mg de lidocaïne [START_REF] Daykin | The efficacy and safety of intravenous lidocaine for analgesia in the older adult: a literature review[END_REF][START_REF] Tierney | Lidocaine-Induced Cardiac Arrest in the Emergency Department: Effectiveness of Lipid Therapy[END_REF]. Bien que ces données aient été observées chez des adultes non enceintes, il est démontré que la grossesse ne modifie pas la toxicité de la lidocaïne [START_REF] Morishima | Pregnancy does not alter lidocaine toxicity[END_REF]. La dose de lidocaïne recommandée pour une anesthésie locale chez un patient adulte est de 4,5 mg/kg, soit 270 mg chez un adulte de 60kg [START_REF] Daykin | The efficacy and safety of intravenous lidocaine for analgesia in the older adult: a literature review[END_REF]. Ces doses sont largement supérieures à celles utilisées pour un GAF pour lequel les doses moyennes rapportées sont de 88 à 153 mg [START_REF] Senat | Funipuncture for fetocide in late termination of pregnancy[END_REF][START_REF] López-Cepero | Effectiveness and safety of lidocaine in the induction of fetal cardiac asystole for second trimester pregnany termination[END_REF][START_REF] Rayssiguier | Comparison between potassium chloride and lidocaine as lethal agents for feticide in termination of pregnancy[END_REF]. On peut donc penser que le risque de complication maternelle, même en cas de passage vasculaire, est extrêmement faible. Un autre avantage de la lidocaïne est l'existence d'un antidote, représenté par les émulsions lipidiques [START_REF] Daykin | The efficacy and safety of intravenous lidocaine for analgesia in the older adult: a literature review[END_REF][START_REF] Tierney | Lidocaine-Induced Cardiac Arrest in the Emergency Department: Effectiveness of Lipid Therapy[END_REF].

Il

4 . 3 .

 43 . Le sufentanil est un morphinique utilisé en anesthésie et permet une analgésie profonde. Dans les recommandations du CNGOF de 2008, Houfflin-Debarge et Vaast proposent la réalisation d'une injection de 0,3 g de thiopental intra-cordonale avant l'injection létale [1]. Le thiopenthal est un barbiturique qui possède des propriétés hypnotiques mais aucune propriété analgésique. En France, la grande majorité des équipes réalise une anesthésie foetale avant le GAF et utilise le sufentanil, le thiopenthal ou une association des deux [22]. Afin d'obtenir une analgésie foetale avant réalisation de l'injection létale, il nous semble plus adapté d'utiliser le sufentanil en première intention, éventuellement associé au thiopenthal pour obtenir l'équivalent d'une anesthésie générale. Les posologies de sufentanil utilisées habituellement en néonatologie sont de 1 à 2 µg/kg, en accord avec celles choisies par les auteurs cités [8,9,13]. Produit utilisé pour l'injection létale L'utilisation de KCl a été bannie par certaines équipes du fait des risques potentiels qu'engendrerait un passage dans la circulation maternelle. En effet, bien que plus de 500 cas de GAF par KCl aient été rapportés sans complication maternelle sévère, et que Senat et al. aient montré l'absence d'hyperkaliémie maternelle après le geste, les risques théoriques d'une hyperkaliémie, et notamment celui d'un arrêt cardiaque, semblent suffisants pour recommander l'utilisation d'un autre produit [5-8, 10, 11, 13]. Un cas d'arrêt cardiaque maternel interprété comme étant lié à une injection involontaire de KCl dans un vaisseau maternel lors d'une IMG à 23 SA a été rapporté [23]. Si cet accident s'est produit malgré l'utilisation d'un abord foetal intracardiaque, on peut imaginer que ce risque de passage maternel est encore plus important en cas d'injection cordonale puisque l'abord se fait en général à l'insertion placentaire, au plus proche des communications entre les circulations maternelle et foetale. L'utilisation du KCl est également discutée pour son potentiel effet néfaste sur la qualité des examens foetopathologiques avec présence de cristaux au sein des

  foetopathologiques du système nerveux central foetal étaient ininterprétables du fait d'une lyse cellulaire, sans préciser le nombre de cas concernés. goût métallique » pour l'une, et une sensation de paralysie généralisée pour l'autre, sans perte de conscience ou autre symptôme objectif. Sharvit et al. ont publié en 2019 la première étude évaluant l'efficacité d'une injection intra-amniotique de digoxine pour la réalisation des GAF au cours d'IMG[START_REF] Sharvit | Intra-amniotic digoxin for feticide between 21 and 30 weeks of gestation: a prospective study[END_REF].Jusqu'alors utilisée dans le cadre d'interruptions de grossesses chirurgicales avant 24 SA, aucune équipe ne s'était intéressée à l'efficacité de la digoxine après 24 SA et avant déclenchement du travail. Dans leur étude, 59 GAF ont été réalisés par injection de 2 mg de digoxine par voie intra-amniotique, à un âge gestationnel moyen de 24 SA +2 . Une asystolie foetale a été observée chez 55/59 cas, 18 à 24 heures après l'injection. Un cas de spasme coronaire est rapporté à trois jours de l'injection intra-complémentaire semble moindre comparé à celui obtenu par voie intracardiaque (88,2% versus 99,8%), les études sont hétérogènes, réalisées avec des drogues différentes et à des âges gestationnels différents. Par ailleurs, la balance bénéfices-risques est en faveur de cette voie d'abord, qui permet de s'affranchir de

	En 2003, la même équipe a rapporté les résultats d'une étude incluant 50
	patientes ayant eu une IMG entre 20 et 36 SA [9]. La technique de GAF utilisée dans
	cette étude consistait en une injection de sufentanil 5 µg puis de lidocaïne 1%, par voie
	En 2002, Bhide et al. ont comparé l'abord intra-cardiaque à l'abord intra-intra-cordonale. Le volume moyen de lidocaïne nécessaire à l'obtention d'une asystolie
	cordonal [7]. Il s'agissait d'une étude rétrospective dans laquelle l'abord intra-foetale était de 15,3mL. Dans 46/50 cas, la procédure a permis une asystolie en deux toute potentielle douleur foetale liée à la ponction, puisque le cordon ombilical est
	cardiaque était choisi préférentiellement, et un abord intra-cordonal était réalisé si minutes en moyenne. Pour trois cas, une injection intra-cardiaque de lidocaïne a dû dépourvu d'innervation. Même si une injection intra-cardiaque secondaire est
	l'indication de l'IMG était une cardiopathie ou s'il s'avérait techniquement plus simple être réalisée faute d'accessibilité de la veine ombilicale. Dans un cas d'IMG pour nécessaire, cette dernière sera réalisée après l'injection d'un analgésique foetal par
	(placenta antérieur et présentation foetale défavorable, patiente obèse, hydramnios). infection foetale à CMV avec atteinte cérébrale à 36SA, l'injection intra-cordonale de voie cordonale. La réalisation régulière de la technique de ponction cordonale permet
	Dans tous les cas, une injection de KCl à 15% était réalisée après injection de 2 mL 30mL de lidocaïne 1%, suivie de l'injection de 10mL de KCL 20% n'ont pas suffis à également aux équipes de Médecine Foetale la pratique de ponctions de sang foetal,
	d'une solution de diazepam à visée sédative, sous contrôle échographique. En cas l'obtention de l'asystolie et une injection complémentaire intra-cardiaque de 5mL de dont les indications dans le cadre du diagnostic prénatal sont limitées, mais dont la
	d'injection intra-cardiaque, la solution de KCl était injectée par aliquots de 5 mL, tandis KCl 20% a été nécessaire. Aucune complication maternelle et aucune naissance maîtrise demeure indispensable, notamment pour la réalisation de transfusions
	qu'elle l'était par aliquots de 1 à 2 mL, en cas d'injection intra-cordonale. Quatre-vingt-vivante n'ont été rapportées. Il n'y a pas d'information quant à la qualité des examens foetales.
	quatorze patientes ont été incluses dans cette étude à un âge gestationnel médian de foetopathologiques.
	Pasquini et al. ont rapporté les résultats concernant 239 GAF réalisés par
	injection intra-cardiaque de KCl au terme moyen de 22SA et 6 jours [10]. La procédure
	avait lieu sous contrôle échographique et consistait en une injection de 2 à 3 mL de
	KCl 15% dans le ventricule gauche. Des injections de 1 à 2 mL de KCl étaient
	renouvelées jusqu'à l'obtention d'une asystolie. Une échographie était
	systématiquement réalisée 30 minutes après le GAF. Avec un volume moyen de
	4,7mL de KCl, une asystolie a été obtenue dans tous les cas, dans les 2 minutes
	suivant l'injection. Aucun cas de complication maternelle ni de naissance vivante n'a
	été rapporté. Il n'est pas fait mention de la qualité de l'examen foetopathologique.
	En 2012, Govender et al. ont rapporté les résultats d'une étude menée chez
	138 patientes pour lesquelles le GAF était réalisé par une injection intra-cardiaque de
	4.2. Place de l'analgésie foetale première KCl 15%, sous contrôle échographique significative entre les groupes concernant la durée moyenne d'obtention de l'asystolie L'idée d'une analgésie ou d'une sédation foetale précédant le GAF est apparue (lidocaïne : 1,7 min -KCl : 2,3 min), le taux de complications maternelles sévères (aucune dans chacun des groupes), et la qualité des examens foetopathologiques au début des années 2000 avec pour rationnel de prévenir une douleur foetale et de

[START_REF] Govender | Late termination of pregnancy by intracardiac potassium chloride injection: 5 years' experience at a tertiary referral centre[END_REF]

. La solution de KCl était injectée par bolus de 2 mL toutes les 30 secondes, jusqu'à l'obtention d'une asystolie. Aucune analgésie foetale n'était pratiquée avant l'injection létale. Une échographie était systématiquement réalisée 30 minutes après le geste. Cette technique s'est avérée efficace pour les 138 patientes, nécessitant des volumes de KCl plus importants pour les termes les plus avancés. Les volumes moyens nécessaires à l'obtention d'une asystolie étaient de 8 mL entre 24 et 25 SA, 10 mL entre 26 et 30 SA, et 13 mL après 30 SA. Les procédures duraient en moyenne 12 minutes. Aucun cas de complication maternelle ni de naissance vivante n'était rapporté. Il n'est pas fait mention de la qualité des examens foetopathologiques. López-Cepero et al. ont rapporté les résultats de GAF réalisés par injection de lidocaïne par voies intra-cardiaque, intra-cordonale, intra-thoracique et intraabdominale [12]. Quarante-huit GAF ont été réalisés par injection intra-cardiaque d'un volume moyen de 8,8 mL de lidocaïne 1% sous contrôle échographique. Pour un cas, correspondant à une hernie de coupole diaphragmatique associée à une cardiopathie complexe dans le cadre d'une délétion 4p-, l'obtention de l'asystolie foetale a nécessité un complément d'injection par voie cordonale (10 mL Lidocaïne 1%) en plus des 5 mL injectés en intra-cardiaque. Les auteurs n'ont pas expliqué pourquoi la voie cordonale a été préférée en seconde intention. Dans trois cas, une injection intra-thoracique a été réalisée en première intention, permettant une asystolie dans deux cas, et nécessitant une injection supplémentaire de lidocaïne en intra-cardiaque pour le dernier cas. Les auteurs rapportent également un cas d'injection de lidocaïne intraabdominale à 19 SA ayant nécessité un complément d'injection en intra-cardiaque, et un cas d'injection intra-cordonale à 25SA ayant nécessité un complément d'injection en intra-cardiaque. Aucune complication maternelle n'a été rapportée dans cette étude. Il n'est pas fait mention de la qualité des examens foetopathologiques. Rayssiguier et al. ont publié la première étude prospective comparant lidocaïne et KCl dans la réalisation des foeticides [13]. Après ponction de la veine ombilicale du cordon, une analgésie foetale par sufentanil à la dose de 1,5 µg/kg de poids foetal estimé était réalisée avant l'injection létale. Dans le groupe « lidocaïne », 10 mL de lidocaïne à 1% étaient injectés et dans le groupe « KCl », 10 mL de KCl à 10% étaient injectés. L'utilisation d'une injection intracardiaque complémentaire s'est avérée nécessaire dans 7 cas sur 17 du groupe lidocaïne. Les 19 foeticides par KCl ont pu être réalisés par injection intra-cordonale seule. Il n'existait aucune différence (degré de macération, de congestion et de lyse cellulaire comparable dans les deux groupes). Trois patientes dans chacun des groupes ont présenté un malaise vagal. Deux patientes du groupe KCl ont présenté des effets secondaires différents, décrits comme un « amniotique de digoxine. Cet épisode est contemporain d'une hémorragie peropératoire lors de l'aspiration endo-utérine réalisée pour rétention placentaire à 27 SA, ne permettant pas de conclure quant au lien de causalité avec l'utilisation de la digoxine. Aucun autre potentiel effet secondaire lié à la digoxine n'a été rapporté dans cette étude et les taux plasmatiques moyens maternels de digoxine entre 6 et 20 heures après l'injection étaient tous inférieurs à 2ng/L.

En dehors des injections de digoxine, la durée d'obtention de l'asystolie après injection est quasiment toujours rapportée dans les articles, et de l'ordre de une à deux minutes (Table

2

). La durée moyenne de la procédure n'est rapportée que dans trois études

[START_REF] Senat | The use of lidocaine for fetocide in late termination of pregnancy[END_REF][START_REF] Pasquini | Intracardiac injection of potassium chloride as method for feticide: experience from a single UK tertiary centre[END_REF][START_REF] Govender | Late termination of pregnancy by intracardiac potassium chloride injection: 5 years' experience at a tertiary referral centre[END_REF]

. La durée moyenne la plus courte était de moins de 5 minutes, dans une équipe où une ponction intra-cardiaque était réalisée, soit par un senior en Médecine Foetale, soit par un interne supervisé par un senior

[START_REF] Pasquini | Intracardiac injection of potassium chloride as method for feticide: experience from a single UK tertiary centre[END_REF]

. La durée moyenne la plus longue était de 12 minutes dans une équipe où le même geste était réalisé par un senior en Médecine Foetale assisté d'un obstétricien, d'une sage-femme, d'une infirmière et d'un échographiste

[START_REF] Govender | Late termination of pregnancy by intracardiac potassium chloride injection: 5 years' experience at a tertiary referral centre[END_REF]

.

4. Discussion

4.1. Voie d'abord

La voie d'abord intra-cordonale nous semble être la plus adaptée. Bien que le taux de succès concernant une obtention rapide de l'asystolie foetale sans nécessité d'injection La voie intra-amniotique est également intéressante. Indolore pour le foetus, elle présente l'avantage de pouvoir être pratiquée par un plus grand nombre de praticiens que les ponctions cordonale et intra-cardiaque. Cependant, cette voie d'abord n'a été étudiée que dans le cadre d'une utilisation la veille d'une interruption de grossesse chirurgicale ou d'un déclenchement, et nous n'avons aucune connaissance du délai entre l'injection de digoxine et l'asystolie foetale

[START_REF] Sharvit | Intra-amniotic digoxin for feticide between 21 and 30 weeks of gestation: a prospective study[END_REF][START_REF] Drey | Safety of intraamniotic digoxin administration before late second-trimester abortion by dilation and evacuation[END_REF][START_REF] Jackson | Digoxin to facilitate late second-trimester abortion: a random-ized, masked, placebo-controlled trial[END_REF][START_REF] Molaei | Effectiveness and safety of digoxin to induce fetal demise prior to second-trimester abortion[END_REF][START_REF] Nucatola | A randomized pilot study on the effectiveness and sideeffect profiles of two doses of digoxin as fetocide when administered intraamniotically or intrafetally prior to second-trimester surgical abortion[END_REF][START_REF] Gariepy | Transvaginal administration of intraamniotic digoxin prior to dilation and evacuation[END_REF][START_REF] White | Intra-fetal compared with intra-amniotic digoxin before dilation and evacuation: A randomized controlled trial[END_REF]

. Le taux de succès rapporté par Sharvit est de 93% et correspond au plus important parmi l'ensemble des études ayant évalué cette technique, qui rapporte un taux de succès compris entre 69 et 92%

[START_REF] Drey | Safety of intraamniotic digoxin administration before late second-trimester abortion by dilation and evacuation[END_REF][START_REF] Jackson | Digoxin to facilitate late second-trimester abortion: a random-ized, masked, placebo-controlled trial[END_REF][START_REF] Molaei | Effectiveness and safety of digoxin to induce fetal demise prior to second-trimester abortion[END_REF][START_REF] Nucatola | A randomized pilot study on the effectiveness and sideeffect profiles of two doses of digoxin as fetocide when administered intraamniotically or intrafetally prior to second-trimester surgical abortion[END_REF][START_REF] Gariepy | Transvaginal administration of intraamniotic digoxin prior to dilation and evacuation[END_REF][START_REF] White | Intra-fetal compared with intra-amniotic digoxin before dilation and evacuation: A randomized controlled trial[END_REF]

. Nous n'avons pas de données concernant l'efficacité de cette technique de GAF à des âges gestationnels plus avancés que 30 SA. Pour les quatre cas d'échec rapportés par Sharvit, le GAF a été réalisé par une injection intra cardiaque de KCl complémentaire, ne permettant pas d'analgésie foetale première. Pour les 8% à 31% d'échecs de GAF rapportés dans le cadre d'interruptions chirurgicales avant 24 SA, les auteurs ne rapportent pas de réalisation de gestes complémentaires. limiter les mouvements du foetus

[START_REF] Bhide | Comparison of feticide carried out by cordocentesis versus cardiac puncture[END_REF][START_REF] Senat | The use of lidocaine for fetocide in late termination of pregnancy[END_REF][START_REF] Senat | Funipuncture for fetocide in late termination of pregnancy[END_REF][START_REF] Rayssiguier | Comparison between potassium chloride and lidocaine as lethal agents for feticide in termination of pregnancy[END_REF]

. Bien que tous les auteurs ne soient pas d'accord, la réalisation d'une analgésie première nous semble importante sur le plan éthique, dès lors que des travaux expérimentaux ont suggéré une activation des voies de la douleur dès 21 SA

[START_REF] Bellieni | Is fetal analgesia necessary during prenatal surgery?[END_REF]

.

À partir de quel âge gestationnel un GAF doit-il être réalisé ?

  Dans cette revue, les GAF sont pratiqués au plus tôt à 17 SA pour l'abord cordonal, et à 14 SA pour l'abord intra-cardiaque. En France, l'enquête nationale publiée en 2019 par Maurice et al. a montré que 5% des CPDPN ont choisi comme seuil le terme de 20 SA, 72% celui de 22 SA, 10% celui de 23 SA, et 13% celui de 24 SA[START_REF] Maurice | Feticide in second-and thirdtrimester termination of pregnancy for fetal anomalies: Results of a national survey[END_REF]. Afin de décider à partir de quel terme il semble nécessaire de réaliser un GAF, deux éléments doivent être pris en compte : le terme à partir duquel il existe un risque de naissance vivante et le terme à partir duquel le foetus risque de ressentir une douleur au cours du travail.

	potentiels pour la patiente semblent trop élevés pour préférer son utilisation à celle de
	la lidocaïne.
	4.4.
	semble simple et utile que des poches d'émulsions lipidiques soient toujours à
	disposition dans les salles où se déroulent des IMG. Les signes devant faire suspecter
	une intoxication à la lidocaïne sont un goût métallique, une dysarthrie, des vertiges,
	des nausées, des acouphènes, des secousses musculaires, un malaise, ou des
	dysesthésies bucco-linguales. Devant une suspicion d'intoxication aux anesthésiques
	locaux, l'American Society of Regional Anesthesia and Pain Medicine et la Société
	Française d'Anesthésie et Réanimation recommandent l'arrêt de l'injection de
	lidocaïne ainsi que l'administration d'intralipides [28].
	Il est rapporté un taux d'échec d'obtention de l'asystolie foetale de 17,6% en cas
	d'utilisation de la lidocaïne par voie cordonale [9,12,13], et de 2% en cas d'abord intra-
	cardiaque [12,13]. Ainsi, il semble licite de réaliser une injection intra-cardiaque
	secondaire en cas d'échec de la voie ombilicale. Cette seconde injection doit avoir lieu
	après analgésie foetale, et en tenant compte de la dose de lidocaïne déjà injectée. Une
	échographie de contrôle peut être réalisée 30 minutes après le geste afin de s'assurer

Le risque de naissance vivante est démontré au terme de 22 SA, terme à partir duquel plusieurs équipes proposent une réanimation active en cas de naissance prématurée

[START_REF] Myrhaug | Survival and Impairment of Extremely Premature Infants: A Meta-analysis[END_REF]

. Concernant la douleur, les connexions thalamo-corticales nécessaires à la perception de la douleur se mettent en place entre 20 et 26 SA

[START_REF] Smith | Pain and stress in the human fetus[END_REF]

.

Ainsi, il nous semble légitime de réaliser un GAF à partir de 20-22 SA, pour éviter une naissance vivante et prévenir toute douleur foetale. Il est par ailleurs montré qu'un abord par voie intra-cordonale est réalisable à partir de 20 SA

[START_REF] Canlorbe | Management of very early fetal anemia resulting from red-cell alloimmunization before 20 weeks of gestation[END_REF]

.

4.

5. Organisation pratique des GAF

  Taux de succès (asystolie foetale) obtenus en fonction du produit utilisé, de la dose, de la voie d'abord et de l'âge gestationnel.SA : semaines d'aménorrhée, IC : intra-cardiaque, VO : veine ombilicale, IT : intra-thoracique, IAbd : intra-abdominal, IA : intra-amniotique 1

	L'utilisation de la voie d'abord intra-amniotique présente un intérêt certain en
	termes d'organisation étant donné la facilité technique de ce geste. Cependant, l'ignorance quant au délai d'obtention de l'asystolie, ainsi que les effets secondaires maternels potentiels de la digoxine ne permettent pas à l'heure actuelle d'envisager cette technique de GAF en routine. Des études supplémentaires seraient nécessaires Tableau 1 -Auteurs Produit Dose Voie Âge gestationnel Taux de succès pour évaluer la durée d'obtention de l'asystolie foetale, les effets secondaires maternels et, éventuellement, d'autres produits que la digoxine. Moyenne d'abord moyen (asystolie)
			[min-max]		[min-max]
	Les auteurs déclarent ne pas avoir de liens d'intérêts (mL)	(SA)
	Isada 1992 [5]	KCl 15%	3 à 5	IC	21 +4 [19 -23]	21/21 (100%)
	Gill 1994 [6]	KCl 15%	3,2 [1-5]	VO	22 [18 -32]	52/60 (87%)
	Bhide 2002 [7]	KCl 15%	5 [3-8]	VO	22 +1 [17 -33 +3 ]	20/21 (95%)
		KCl 15%	10 [4-20]	IC	22 +5 [18 -34 +6 ]	73/73 (100%)
	Senat 2002 [8]	KCl 20%	10	VO	24 [22 -38]	10/10 (100%)
	Senat 2003 [9]	Lidocaïne 1%	15,3 [10-30]	VO	27 +5 [20 -36]	46/50 (92%)
	Pasquini 2008	KCl 15%	4,7 [2-10]	IC	22 +6 [20 +5 -37 +5 ]	239/239 (100%)
	[10]
	Govender	KCl 15%	12 [5 -16]	IC	33 [26 -41]	138/138 (100%)
	2012 [11]
	López-Cepero	Lidocaïne 1%	8,8 [5-25]	IC	21 +2 [14 -26]	47/48 (98%)
	La complexité technique des GAF associée à la difficulté psychologique de la 2013 [12] 15 [10-20] IT 20 +3 [15 -25] 2/3 (67%)
	situation et aux potentielles complications maternelles impliquent une organisation 25 VO 20 0/1 (0%)
	dans un centre adapté avec des professionnels expérimentés. Ce geste ne peut être 10 IAbd 19 0/1 (0%)
	réalisé que dans des conditions stériles sous surveillance maternelle continue, en Rayssiguier KCl 10% 15 [10-20] VO 24 [23 -31] 19/19 (100%) présence d'un professionnel capable d'effectuer une ponction cordonale et intra-cardiaque, d'un anesthésiste et au moins d'une troisième personne pour réaliser 2018 [13] Lidocaïne 1% 10 [10-20] VO 25 [24 -26] 10/17 (59%)
	l'injection. Ce geste doit parfois être réalisé en urgence en cas de mise en travail Lidocaïne 1% IC 1/1 (100%)
	inattendue, et implique un accès à ces ressources matérielles et humaines 24 heures de 49 CPDPN [22]. 1mg/4mL [14] sur 24. En France, cette organisation est possible grâce au réseau national composé Sharvit 2019 Digoxine 8,0 IA 24 +2 [21 -30] 55/59 (93%)

Tableau 2 -

 2 Durée des procédures et temps nécessaire à l'obtention d'une asystolie foetale

	Auteurs	Produit	Voie	Durée moyenne	Temps moyen entre
		utilisé	d'abord	de la procédure	l'injection et l'asystolie
				[min-max]	[min-max]
				(mn)	(mn)
	Senat 2002 [8]	KCl 20%	VO	8 [3-12]	< 1
	Senat 2003 [9]	Lidocaïne 1%	VO		2 [0,5-3,5]
	Pasquini 2008 [10]	KCl 15%	IC	< 5	< 2
	Govender 2012 [11]	KCl 15%	IC	12 [6-25]	< 2
	Lopéz-Cepero 2013 [12] Lidocaïne 1%	IC		< 2
	Rayssiguier 2019 [13]	Lidocaïne 1%	VO		1,7 [1,0 -4,2]
		KCl 10%	VO		2,3 [0,6 -2,8]

VO : veine ombilicale, IC : intra-cardiaque

l'obtention d'une asystolie foetale entre 19 et 24 SA. Les IMG étaient réalisées sous contrôle échographique et utilisaient 3 à 5 mL d'une solution de KCl à 15%. L'injection intra-cardiaque de KCl était toujours associée à une injection intra-amniotique d'urée, diluée dans de l'eau stérile (90 à 120g d'urée pour 200mL d'eau), technique utilisée seule auparavant dans ce centre pour induire les asystolies en cas d'IMG. Parmi les 21 cas, 20 ont présenté une asystolie immédiate. Aucune complication maternelle et aucun cas de naissance vivante n'ont été rapportés. En 1994, Gill et al. ont étudié la réalisation de GAF par injection intra-cordonale de KCl 15% chez 60 patientes, entre 18 et 32 SA [6]. Après ponction écho-guidée de la veine ombilicale du cordon, deux injections de 1,5mL de KCl 15% étaient réalisées, séparées d'un court temps de latence, afin d'éviter une reprise de l'activité cardiaque foetale. Cette technique s'est montrée efficace pour 52/60 cas, avec utilisation d'un volume moyen de 3,2mL de KCl. Dans 7/60 cas, une injection intra-cardiaque a été réalisée car l'abord cordonal était impossible. Malgré un contrôle échographique systématique de l'asystolie réalisé 20 minutes après le GAF, les auteurs ont rapporté un cas de naissance vivante à 24 SA, après injection intra-cordonale de 4mL de KCl, dans le cadre d'une IMG réalisée pour anamnios après rupture prématurée des membranes. Les auteurs ont par ailleurs mentionné que les examens

SA +5 . Le GAF a été réalisé par voie intra-cardiaque dans 73 cas, avec un volume médian de KCl utilisé de 10mL, et aucun cas d'échec d'asystolie ou de complication maternelle n'a été rapporté. Dans 21 cas, la voie cordonale a été choisie, avec un volume médian de KCl utilisé de 5 mL, significativement moindre par rapport à la voie intra-cardiaque. Les auteurs rapportent une naissance vivante parmi les 21 cas de foeticides réalisés par voie cordonale, ayant motivé un changement de protocole avec la réalisation systématique d'une échographie 20 minutes après le geste. Dans cet article, la qualité des examens foetopathologiques n'a pas été rapportée. En 2002, Senat et al. ont étudié les effets secondaires maternels potentiels des GAF réalisés par injection intra-cordonale de KCl [8]. Leur technique consistait à réaliser une ponction cordonale écho-guidée, à l'insertion placentaire du cordon. Après injection de 5 µg de sufentanil pour obtenir une analgésie foetale, le GAF était réalisé par injection de 10mL de KCl 20%. Une échographie de contrôle était réalisée à l'entrée en salle de travail. Les GAF étaient réalisés chez dix patientes entre 22 et 38 SA, en utilisant 10mL de KCl 20% dans tous les cas. Ceci a permis d'obtenir une asystolie foetale en moins d'une minute après l'injection, dans tous les cas, et sans observer d'effet secondaire maternel particulier (absence d'anomalie électrocardiographique, absence d'élévation du taux de potassium sérique). La durée totale des procédures était en moyenne de 8 minutes.

de la persistance de l'asystolie foetale, comme c'est le cas dans la majorité des études[START_REF] Gill | Induction of fetal demise in advanced pregnancy terminations: report on a funic potassium chloride protocol[END_REF][START_REF] Bhide | Comparison of feticide carried out by cordocentesis versus cardiac puncture[END_REF][START_REF] Senat | The use of lidocaine for fetocide in late termination of pregnancy[END_REF][START_REF] Pasquini | Intracardiac injection of potassium chloride as method for feticide: experience from a single UK tertiary centre[END_REF][START_REF] Govender | Late termination of pregnancy by intracardiac potassium chloride injection: 5 years' experience at a tertiary referral centre[END_REF].Toutes les études publiées sur l'utilisation de la lidocaïne rapportent l'utilisation d'une concentration à 1% (10 mg/mL). L'utilisation de lidocaïne à 2% pourrait être discutée pour limiter le volume à injecter et donc la durée du geste, afin de diminuer l'inconfort de la patiente et le risque de sortie de l'aiguille de la veine ombilicale du cordon. Les données disponibles concernant la durée totale d'un GAF par voie cordonale sont issues d'une seule étude et rapportent une durée très courte[START_REF] Senat | Funipuncture for fetocide in late termination of pregnancy[END_REF]. L'absence de données sur cette durée pour toutes les autres études est peut-être le signe de procédures complexes et longues. Il serait pertinent d'obtenir des données supplémentaires concernant la durée de la réalisation des GAF par voie cordonale dans plusieurs centres. Il serait également intéressant de mener une étude comparant l'utilisation de lidocaïne 1% et de lidocaïne 2%, en termes d'efficacité dans l'obtention de l'asystolie et de risque de passage dans la circulation maternelle.La digoxine possède des propriétés inotrope positive, et dromotrope et chronotrope négatives. En dehors de l'étude de Sharvit, son utilisation par injections intra-amniotique et « intra-foetale » est rapportée dans la préparation des interruptions chirurgicales de grossesse avant 24 SA, afin de faciliter le geste chirurgical par l'obtention d'une mort foetale in utero la veille, et de faciliter la dilatation cervicale par une potentielle stimulation de la sécrétion de prostaglandines[START_REF] Drey | Safety of intraamniotic digoxin administration before late second-trimester abortion by dilation and evacuation[END_REF][START_REF] Jackson | Digoxin to facilitate late second-trimester abortion: a random-ized, masked, placebo-controlled trial[END_REF][START_REF] Molaei | Effectiveness and safety of digoxin to induce fetal demise prior to second-trimester abortion[END_REF][START_REF] Nucatola | A randomized pilot study on the effectiveness and sideeffect profiles of two doses of digoxin as fetocide when administered intraamniotically or intrafetally prior to second-trimester surgical abortion[END_REF][START_REF] Gariepy | Transvaginal administration of intraamniotic digoxin prior to dilation and evacuation[END_REF][START_REF] White | Intra-fetal compared with intra-amniotic digoxin before dilation and evacuation: A randomized controlled trial[END_REF]. Le taux d'asystolie foetale observé avant le geste chirurgical semble un peu plus élevé en cas d'abord « intra-foetal » (88 à 95%) que d'abord intra-amniotique (69 à 93%). Les effets secondaires de la digoxine sont essentiellement représentés par des complications cardiaques, tels que des extra-systoles ventriculaires, des blocs auriculoventriculaires, des tachycardies jonctionnelles et ventriculaires. Ces effets sont en général observés en cas de surdosage, dont le seuil généralement admis de 2 ng/mL peut être remis en question[START_REF] Goldberger | Therapeutic ranges of serum digoxin concentrations in patients with heart failure[END_REF]. D'ailleurs, la seule étude avec enregistrement électrocardiographique prolongé après l'injection rapporte l'apparition d'extra-systoles auriculaires et ventriculaires chez 7/8 patientes, d'une tachycardie jonctionnelle chez une patiente, et d'un bloc auriculo-ventriculaire chez une patiente, malgré des pics de digoxinémie maternels compris entre 0,5 et 1,1 ng/mL. Ainsi, même si la grande majorité des études concernant la digoxine est rassurante[START_REF] Jackson | Digoxin to facilitate late second-trimester abortion: a random-ized, masked, placebo-controlled trial[END_REF][START_REF] Molaei | Effectiveness and safety of digoxin to induce fetal demise prior to second-trimester abortion[END_REF][START_REF] Nucatola | A randomized pilot study on the effectiveness and sideeffect profiles of two doses of digoxin as fetocide when administered intraamniotically or intrafetally prior to second-trimester surgical abortion[END_REF][START_REF] Gariepy | Transvaginal administration of intraamniotic digoxin prior to dilation and evacuation[END_REF][START_REF] White | Intra-fetal compared with intra-amniotic digoxin before dilation and evacuation: A randomized controlled trial[END_REF], les risques