P Javerliat

F Pizon

L Gerbaud

Etude exploratoire de la santé musculo-squelettique du rachis d'étudiants en ostéopathie Exploratory study on spinal musculoskeletal health of osteopathy students

Keywords: Troubles musculo-squelettiques, Rachis, Études d'ostéopathie, Manipulations vertébrales, Pratiques en santé Musculoskeletal diseases, Spine, Osteopathic medicine studies, Spinal manipulations, Health practices

Position du problème Lors de l'apprentissage des manipulations vertébrales, les étudiants en ostéopathie se font manipuler fréquemment le rachis par d'autres étudiants durant leurs études, les exposant à des gestes non experts. Ces manipulations vertébrales s'accompagnent généralement de gênes articulaires, courbatures ou douleurs de faible intensité, qui peuvent durer deux à trois jours. Les étudiants en ostéopathie pourraient donc avoir des troubles musculo-squelettiques du rachis (TMSR) en permanence durant leurs études. Nous avons cherché à déterminer chez des étudiants en ostéopathie, la présence éventuelle de TMSR, leur intensité maximale et leurs différences entre étudiants.

Méthode

Une étude exploratoire transversale répétée pendant trois ans, a été menée en utilisant un questionnaire standardisé de dépistage des troubles musculo-squelettique (le questionnaire nordique).

Résultats

Au total, 733 questionnaires ont été analysés (taux moyen de réponse 91,5 %). En moyenne, la prévalence de TMSR a été de 98,4 % au cours des 12 derniers mois.

L'intensité maximale ressentie a été de 6/10 ; 45 % des étudiants ont eu à connaître un TMSR intense (entre 7 et 10/10). La variation de l'intensité maximale des TMSR vécue entre « avant les études » et « au cours des douze derniers mois » a été de 1,2/10. Elle est influencée par le nombre de jours hebdomadaires à se faire manipuler le rachis (p<0,0001), les étudiants se faisant manipuler le rachis en moyenne trois jours par semaine.

Conclusion

Cette étude confirme l'importance de la prévalence des TMSR durant les études d'ostéopathie. Ce résultat nous conduit à mener une étude qualitative sur les conceptions en santé des étudiants et leurs pratiques des manipulations vertébrales.

Introduction

Parmi les études sur la santé des étudiants en France, peu d'études abordent la santé musculo-squelettique de ces jeunes adultes [START_REF]Enquête nationale sur les conditions de vie des étudiants[END_REF][START_REF] Fry | Prevalence of overuse (injury) syndrome in Australian music schools[END_REF][START_REF] Laberge | TMS et les jeunes : enjeux et perspectives de recherche pour une prévention durable[END_REF][4]. La prévalence des troubles musculosquelettiques du rachis (TMSR) varie fortement selon l'exposition des individus aux facteurs biomécaniques, leur âge et leurs activités [START_REF] Bernard | Musculoskeletal Disorders and Workplace Factors: A Critical Review of Epidemiologic Evidence for Work-Related Musculoskeletal Disorders of the Neck, Upper Extremity, and Low Back[END_REF][START_REF] Ha | The French Musculoskeletal Diseases Surveillance Program: Pays de la Loire network[END_REF][START_REF] Dartois | Troubles musculo-squelettiques et pathologies du rachis dans une population de conducteurs receveurs d'une entreprise de transport urbain de voyageurs[END_REF][START_REF] Oziol | Particularités des troubles musculo-squelettiques des membres supérieurs et du rachis chez les enseignants des écoles de musique[END_REF][START_REF] Sayegh-Ghoussoub | Troubles musculo-squelettiques chez une population de chirurgiens-dentistes libanais : fréquence des facteurs de risque[END_REF][START_REF]Agence nationale pour l'amélioration des conditions de travail[END_REF][START_REF] Carton | Prévalence des troubles musculo-squelettiques et des facteurs biomécaniques d'origine professionnelle : premières estimations a ̀ partir de Constances[END_REF]. A titre d'exemple : une enquête menée dans une population de travailleurs a ̀ l'aide du questionnaire standardisé de dépistage des troubles musculo-squelettiques (appelé communément « questionnaire nordique ») a démontré que la prévalence au niveau du rachis variait entre 26 % et 57 % [START_REF] Parot-Schinkel | Prevalence of multisite musculoskeletal symptoms : a french cross-sectionnal working populationbased study[END_REF]. L'absence de données relatives aux TMSR chez les étudiants en ostéopathie, pourtant eux-mêmes formés à prendre en charge ce type de trouble, nous a incité à mener une étude exploratoire du phénomène dans cette population exposée aux contraintes biomécaniques et aux gestes répétitifs au niveau du rachis.

Cet intérêt est également justifié par la forte évolution des études d'ostéopathie en 2014 avec une nouvelle architecture curriculaire faisant passer la formation de 2660 heures à 4860 heures [START_REF]Décret n° 2014-1505 du 12 décembre 2014 relatif a ̀ la formation en ostéopathie[END_REF]. Cette évolution a eu pour principale conséquence d'exposer les étudiants aux manipulations vertébrales plus précocement et plus souvent durant leur cursus. Durant cet apprentissage, les étudiants sont alternativement mis en situation de praticien qui effectue les manipulations et de patient qui les reçoit. Les thérapies manuelles au sens large du terme (massage, mobilisations passives ou actives, manipulations) occasionneraient des événements indésirables mineurs temporaires, dont des TMSR, avec un pic au deuxième jour après l'application des techniques, sans que ces évènements aient un caractère prédictif de l'apport du traitement [START_REF] Carnes | Adverse events and manual therapy: A systematic review[END_REF][START_REF] Rajendran | Monitoring self-reported adverse events: a prospective pilot study in UK osteopathic teaching clinic[END_REF][START_REF] Rajendran | Reporting patterns and predictors of common adverse events following osteopathic treatment: lessons learned from a prospective patient-administrated questionnaire feasibility study in a UK teaching clinic[END_REF]. L'exposition répétitive à des gestes non-experts lorsque les étudiants occupent le rôle de patient, sollicite leurs articulations et leurs structures péri articulaires du rachis. Elle peut générer des risques pour leur appareil musculo-squelettique. Forts de ces hypothèses, notre objectif a été d'évaluer chez les étudiants d'un cursus d'ostéopathie, la présence de TMSR, leur intensité et de déterminer s'il existe des différences selon les caractéristiques, les comportements ou les activités des étudiants.

Matériel et méthode

En accord avec la direction d'un établissement agréé par l'État proposant une formation d'ostéopathie en présentiel sur cinq ans [START_REF]Décision n° 2015-19 du 7 juillet 2015 portant agrément du Centre européen d'enseignement supérieur de l'ostéopathie[END_REF] [START_REF]Décret n° 2014-1505 du 12 décembre 2014 relatif a ̀ la formation en ostéopathie[END_REF], nous avons mené une étude exploratoire transversale répétée pendant trois ans, en mars 2016, 2017 et 2018, par questionnaire auto administré anonyme. L'étude fait l'objet d'un engagement de conformité à la méthodologie MR-003 auprès de la CNIL. Tous les étudiants inscrits dans l'établissement en début d'année universitaire ont été inclus dans l'étude à l'exception des étudiants qui allaient être encore mineurs le jour de la distribution des questionnaires, de ceux ayant quitté l'établissement entre la rentrée et à la date de l'enquête et de ceux ne voulant pas participer.

Les étudiants étaient libres d'accepter ou de refuser de participer à ce travail ; leur choix ne modifiant en rien leurs relations avec l'établissement, ni la suite de leurs études. Tous les questionnaires ont été anonymisés et un code numérique a été attribué à chacun, à l'aide de la fonction génératrice de nombre aléatoire du logiciel Excel ® . Aucune liste nominative n'a été constituée. Les conditions de mesure ont été standardisées en utilisant un questionnaire auto administré communément appelé le « questionnaire nordique ». Le « questionnaire nordique » fait partie des outils permettant de dépister les TMSR [START_REF] Kuorinka | Standardised Nordic questionnaires for the analysis of musculoskeletal symptoms[END_REF][START_REF] Fleishman | Analyse des problèmes de l'appareil locomoteur : questionnaire scandinave[END_REF][START_REF] Forcier | ABC de l'utilisation d'un questionnaire sur la sante ́ musculo-squelettique[END_REF][START_REF] Roquelaure | Utilisation du protocole de surveillance en entreprise : expérience du réseau de surveillance épidémiologique des TMS dans les pays de la Loire[END_REF][START_REF] Descatha | Validity of Nordic-style questionnaires in the surveillance of upper-limb work-related musculoskeletal diseases[END_REF] Le parcours d'étude a été discrétisé en trois classes : année 1, années 2 et 3, années 4 et 5, correspondant aux trois étapes durant les études, pouvant solliciter une réorganisation des conceptions en matière de santé [START_REF] Pizon | Éducation a ̀ la sante ́ et prévention : théorie des conceptions en sante[END_REF][START_REF] Chérillat | Représentations de la maladie chronique chez les professionnels de santé : entre représentations négatives et réflexivité engagée[END_REF] influant sur la santé et sa conception: dès le début de la première année, à travers la découverte du corps de l'autre [START_REF] Vigarello | Histoire et modèles du corps[END_REF][START_REF] Potel-Baranes | Intimité du corps. Espace intime. Secret de soi[END_REF][START_REF] Hall | La dimension cachée[END_REF][START_REF] Boltanski | Les usages sociaux du corps[END_REF], puis à partir de la deuxième année, lors de la découverte de la maladie et de ses traitements et concomitamment des manipulations vertébrales [START_REF] Hunter | Nosophobia and hypochondriasis in medical students[END_REF][START_REF] Collier | Imagined illnesses can cause real problems for medical students[END_REF] et enfin, à partir de la quatrième année, lorsque l'étudiant commence à effectuer de manière autonome des consultations ostéopathiques [START_REF]Décret n° 2014-1505 du 12 décembre 2014 relatif a ̀ la formation en ostéopathie[END_REF]. Les jours hebdomadaires à se faire manipuler le rachis ont été discrétisés en trois classes : 1 jour ou moins (pratique inférieure à la moyenne des étudiants), 2 à 3 jours (pratique dans la moyenne), 4 jours ou plus (pratique supérieure à la moyenne).

La première étape a consisté en une analyse univariée en termes de position et de dispersion, des critères de santé musculo-squelettique du rachis des étudiants et de leurs différentes caractéristiques pouvant influencer leur TMSR. La deuxième étape a consisté en une analyse bi variée de comparaison et de liaison selon les caractéristiques des étudiants.

Les données respectant soit une loi normale, soit que le nombre de sujets permet de respecter les règles de normalité, ont permis une analyse par tests paramétriques. La troisième étape a consisté en une régression linéaire multiple pour déterminer parmi les caractéristiques, comportements ou activités corrélés à l'intensité maximale des TMSR ou à la variation d'intensité des TMSR, celle ou celui qui influence le plus, chacun de ces indicateurs (valeur β). Pour ces analyses multivariées, les variables ont été considérées de façon continue. Pour chacun des tests, nous avons fixé le risque α à 5%. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du logiciel Statistical Package for the Social Sciences ® (SPSSv18 ® ).

Résultats

Lors de ces trois années, 427 étudiants ont été inclus, 5 ont fait valoir leur droit de ne pas participer à l'enquête ; 107 y ont participé chaque année. Au total, 733 questionnaires exploitables ont été recueillis. En moyenne, le taux de réponse est de 91,5 %. Les principales caractéristiques des étudiants sont présentées dans le tableau 1. En moyenne, la prévalence de TMSR des étudiants de l'établissement au cours des douze derniers mois, est de 98,4 %, l'intensité maximale du TMSR qu'ils ont connue est de 6/10, la différence d'intensité maximale du TMSR entre avant leurs études et au cours des 12 derniers mois est

Discussion

Cette étude est monocentrique. Le taux de réponses est de 91,5 % ce qui est suffisant pour exclure les conséquences d'un biais de sélection. Comme dans toute étude par questionnaire, un biais d'acquiescement et un biais de réactance peuvent exister.

En moyenne, durant ces trois ans, la prévalence de TMSR chez les étudiants de l'établissement a augmenté de 12,5 % par rapport à avant leurs études (87,4 % versus 98,4 %). Une prévalence de presque 100 % peut laisser penser que leur santé musculosquelettique du rachis s'est grandement dégradée. Pour situer celle-ci, nous devons tenir compte des caractéristiques méthodologiques de notre étude et du contexte de vie des étudiants. Le questionnaire nordique a tendance à donner des prévalences extrêmement élevées [START_REF] Roquelaure | gM4BHQr6AXsQFjAGegQIAhAC&url=http%3A%2F%2Fester.un ivangers.fr%2F_resources%2Fcommunications%2FComm%252520nationales%2F200 8_n%2525C2%2525B03_atelierTMS_5juin2008_evaluationclinique[END_REF]. Une évaluation de l'intensité du TMSR entre 1 et 3 correspond à un TMSR faible, or cette intensité de TMSR ne nous semble pas être l'expression d'une santé dégradée mais plutôt la réaction physiologique de l'appareil locomoteur à la suite d'un effort [START_REF] Coudreuse | Douleurs musculaires post-effort[END_REF]. Presque 14 % des étudiants sont dans ce cas de figure. Prendre en compte uniquement les prévalences des TMSR modérés et intenses, dont l'augmentation est de 24 % (68 % versus 84 %), nous parait mieux refléter la santé musculo-squelettique du rachis des étudiants, même si la prévalence est moindre qu'en prenant en compte la totalité des TMSR. Par ailleurs, afin de faciliter la gestion des questions par les étudiants, nous avons questionné les TMS du rachis dans son ensemble. Une étude zone par zone (nuque, milieu du dos, bas du dos) comme il est possible de le faire avec le questionnaire nordique, aurait peut-être conclu à des prévalences par zone moins élevées que la prévalence globale que nous indiquons. Ainsi, une étude utilisant le « questionnaire nordique » conclut que les travailleurs âgés de moins de 25 ans ont une prévalence de TMS du bas du dos de 31 % [START_REF] Laberge | TMS et les jeunes : enjeux et perspectives de recherche pour une prévention durable[END_REF] ; 87,5 % des étudiants indiquent avoir connu un TMSR avant leur études (68 % en ce qui concerne les TMSR modérés et intenses). La rencontre personnelle avec ce phénomène de santé avant les études a pu les prédisposer à connaître à nouveau des TMSR [START_REF] Simons | Psychological Processing in Chronic Pain: A Neural Systems Approach[END_REF], influencer l'élaboration de leur conception de la santé [START_REF] Pizon | Éducation a ̀ la sante ́ et prévention : théorie des conceptions en sante[END_REF][START_REF] Chérillat | Représentations de la maladie chronique chez les professionnels de santé : entre représentations négatives et réflexivité engagée[END_REF] Depuis le nouveau format d'études de 2014, l'apprentissage des manipulations vertébrales commence en fin de 1 ère année d'étude et s'intensifie jusqu'en fin de 4 ème année ; période à laquelle les étudiants doivent valider un examen spécifique à cette pratique. Il est donc normal de retrouver la même évolution de la santé musculo-squelettique des étudiants au fur et à mesure de leur scolarité, que l'évolution retrouvée selon les heures hebdomadaires à se faire manipuler. Toutefois, les analyses multivariées effectuées chaque année font ressortir que le poids explicatif du nombre d'heures à se faire manipuler est plus important que celui de l'avancée dans le cursus. Cela est vraisemblablement dû au fait que certains étudiants en début de cursus, endossent le rôle de patient auprès d'étudiants désirant pratiquer, alors qu'eux-mêmes n'ont pas entamé cet apprentissage. C'est une manière pour eux de découvrir ces techniques mais cette exposition prématurée aux manipulations vertébrales les conduit à être confrontés à des gestes non-experts.

La perturbation de la santé musculo-squelettique du rachis n'est donc pas exceptionnelle sur l'ensemble du groupe. L'augmentation de la prévalence des TMSR, le très haut niveau d'intensité de certains, la durée durant laquelle ce problème de santé a pu exister et la répétition du phénomène d'année en année sont autant d'indicateurs en faveur d'une dégradation de la santé musculo-squelettique du rachis. Il est concevable que cela puisse avoir des conséquences sur les études.

Conclusion

Notre étude est exploratoire ; photographie d'un établissement en particulier. Il n'y a pas lieu d'inférer ces résultats à la population des étudiants en ostéopathie en France. Un biais de mémorisation peut exister dans notre étude. Bien que les sujets soient jeunes et que leur vie n'ait pas encore eu le temps d'effacer leur mémoire des évènements, leur perception de phénomènes douloureux pendant l'enfance ou l'adolescence peut être différente de celle qu'ils ont, une fois devenus adultes.

Cette étude va dans le sens d'une prévalence importante des troubles musculosquelettiques du rachis durant les études d'ostéopathie. Depuis trois ans, les étudiants de l'établissement enquêté ont vécu en moyenne chaque année, un trouble musculosquelettique du rachis d'une intensité modérée, à la limite de l'intensité intense. Cette moyenne des intensités masque toutefois une grande disparité entre les individus. Les deux facteurs qui influencent de manière statistiquement significative leur santé musculosquelettique du rachis durant les études, sont leur santé musculo-squelettique du rachis avant les études et le nombre de jours hebdomadaires à se faire manipuler le rachis. L'apprentissage en ostéopathie est un échange « gagnant -gagnant ». Je te « prête » mon corps pour que tu puisses pratiquer, en échange de quoi, tu me « prêtes » le tien pour qu'à mon tour, je puisse pratiquer. Parmi les cadres conceptuels existants au sujet des conceptions de la maladie et de la douleur, le modèle de peur-évitement [START_REF] Jensen | Pain-specific beliefs, perceived symptom severity and adjustement to chronic pain[END_REF][START_REF] Vlaeyen | Fear-avoidance and its consequences in chronic musculoskeletal pain: a state of the art[END_REF][START_REF] Fritz | The role of fear-avoidance beliefs in acute low back pain : relationships with current and future[END_REF]

  sans en attribuer de causes. Il mesure les aspects fonctionnels des troubles musculo-squelettiques à travers trois caractéristiques simples : les courbatures, les douleurs ou les gênes, sur une échelle numérique d'auto-évaluation allant de 0 (ni courbature, ni douleur, ni gêne) à 10 (courbature ou douleur ou gêne insupportable) mesurant des intensités moyennes ou maximales. Des questions spécifiques au cadre des études ont été ajoutées concernant l'année d'étude ou la fréquence à laquelle l'étudiant s'est fait manipuler le rachis durant l'année. Les données collectées ont été saisies à l'aide du logiciel Excel ® . La saisie de données a fait l'objet d'une double relecture pour vérifier/corriger les éventuelles erreurs de saisie. Pour chaque année, nous avons analysé les TMSR au cours des douze derniers mois, à travers trois indicateurs : sa prévalence, son intensité maximale et sa différence d'intensité maximale entre « avant les études d'ostéopathie » et « les 12 derniers mois ». Puis nous avons cherché à déterminer si des caractéristiques, des comportements ou des activités des étudiants influencent les TMSR. Certaines variables ont été discrétisées en classes qui correspondent à des caractéristiques cliniques ou pédagogiques usuelles. Ainsi, les intensités maximales des TMSR ont été discrétisées en quatre classes selon la classification de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) relative à la douleur [25-26] : absence de TMSR (0/10), TMSR faible (1 à 3/10), TMSR modéré (4 à 6/10), TMSR intense (7 à 10/10).

de 1 , 2 .

 12 En raison du nombre trop faible d'étudiants n'ayant pas connu de TMSR au cours des 12 derniers mois (1,6 %), aucune comparaison n'a révélé de différence statistiquement significative, quelle que soit la situation testée. Il n'a donc pas été possible de conclure que la présence de TMSR durant les études d'ostéopathie diffère significativement selon certaines caractéristiques, activités ou comportements des étudiants. Que les étudiants n'aient pas connu de TMSR avant leurs études d'ostéopathie ou quelle que soit la sévérité de celui qu'ils ont connu, ils sont 61 % à avoir vécu un TMSR d'une intensité supérieure durant l'année scolaire écoulée ; 99 % des étudiants qui n'ont pas connu de TMSR avant leurs études en ont connu un durant les 12 derniers mois, dont 36 % un TMSR intense ; 61 % des étudiants qui ont connu un TMSR faible avant leurs études ont connu un TMSR d'une intensité maximale supérieure durant les 12 derniers mois, dont 20 % un TMSR intense ; 27 % des étudiants qui ont connu un TMSR modéré avant leurs études ont connu un TMSR d'une intensité maximale supérieure durant les 12 derniers mois, soit un TMSR intense et 64 % des étudiants qui ont connu un TMSR intense avant leurs études ont à nouveau connu un TMSR intense durant les 12 derniers mois. La répartition des étudiants ayant connu un TMSR intense au cours des 12 derniers mois présente une différence statistiquement significative avec la répartition avant leurs études (p<0,0001). L'intensité maximale des TMSR ressentie au cours des 12 derniers mois est liée positivement, principalement à l'intensité maximale des TMSR ressentie avant les études (r=0,365 -p<0,0001) et accessoirement aux jours hebdomadaires à se faire manipuler le rachis (r=0,114 -p=0,0001) et aux jours hebdomadaires à occuper un emploi sollicitant le rachis (r=0,072 -p=0,04). L'intensité maximale des TMSR avant les études est la seule variable qui influence chaque année l'intensité maximale des TMSR ressentie au cours des 12 derniers mois de manière statistiquement significative. (Tableau 2). Trois cents vingt-sept étudiants (327) de l'établissement (45 %) ont connu un TMSR intense durant les 12 derniers mois ; 6 % l'ont ressenti entre 1 et 7 jours, 15 % entre 8 et 30 jours, 16 % plus de 30 jours mais pas tous les jours et 8 % l'ont ressenti tous les jours durant les 12 derniers mois. Bien qu'il existe des variations, il n'y a pas de différence statistiquement significative dans la répartition de la classe « durée du TMSR intense » (p=0,2) d'une année sur l'autre. Ce phénomène semble donc se répéter d'année en année. Il existe une faible corrélation entre avoir connu un TMSR intense au cours des 12 derniers mois et l'intensité du TMSR vécue avant les études (r=0,19 -p=0,0005) (Fig. 1). Parmi les 107 étudiants que nous avons pu suivre durant les trois années, 77 (72 %) ont vécu durant cette période un TMSR plus sévère que ce qu'ils ont connu avant leurs études ; 75 (70 %) ont vécu un TMSR intense au moins une fois durant cette période. L'année où cela s'est produit, l'intensité du TMSR a été en moyenne de 7,9/10 ; 23 (22 %) ont vécu un TMSR intense chacune des trois années. En moyenne, l'intensité qu'ils ont indiquée a été de 8,9/10. En moyenne, il existe une augmentation de seulement un point d'intensité environ (1,2) entre les intensités maximales du TMSR que les étudiants ont vécues avant leurs études et celles qu'ils ont vécues au cours des 12 derniers mois mais la dispersion autour de cette moyenne est importante. Selon la classe d'intensité des TMSR vécue avant les études, les moyennes de variations d'intensité se répartissent comme indiqué dans le (Tableau 3). Lorsque l'on analyse ce phénomène en fonction des trois étapes durant les études pouvant solliciter une réorganisation des conceptions des étudiants en matière de santé, on observe une augmentation progressive de la variation du TMSR durant ces trois étapes. (Tableau 3). La variation de l'intensité maximale entre « avant les études » et « au cours des 12 derniers mois » est liée en premier et de manière négative, au fait d'avoir connu un traumatisme du rachis (r=-0,222 -p<0,0001). Elle est liée positivement principalement aux jours hebdomadaires à se faire manipuler le rachis ((r=0,147 -p<0,0001) et accessoirement au fait d'être en second cycle (r=0,116 -p=0,001) et d'avoir redoublé (r=0,078 -p= 0,003). Le nombre de jours hebdomadaires à se faire manipuler le rachis est la seule variable qui influence chaque année la variation de l'intensité maximale des TMSR de manière statistiquement significative. (Tableau 2). Si l'on ne note, chez les étudiants se faisant manipuler le rachis 1 jour par semaine ou moins, aucune différence statistiquement significative de la variation d'intensité maximale des TMSR, ce n'est pas le cas chez ceux se faisant manipuler plus souvent. On constate chaque année, chez les étudiants se faisant manipuler le rachis entre 2 et 3 jours par semaine au cours des 12 derniers mois, des pourcentages d'étudiants présentant une absence de TMSR et un TMSR faible, moins importants qu'avant les études et a contrario des pourcentages d'étudiants présentant un TMSR modéré et un TMSR intense, plus importants qu'avant les études. Les proportions d'étudiants des classes de TMSR, respectivement ci-après « avant les études versus au cours des 12 derniers mois », présentent chaque année, une différence statistiquement significative (p<0,05) : « absence de TMSR vs TMSR faible », « absence de TMSR vs TMSR modéré » et « absence de TMSR versus TMSR intense ». Ce phénomène est encore plus marqué chez ceux se faisant manipuler 4 jours ou plus par semaine. Ainsi, les proportions d'étudiants des classes de TMSR, respectivement ci-après « avant les études versus au cours des 12 derniers mois » présentent chaque année, une différence statistiquement significatives (p<0,05) : « absence de TMSR versus TMSR intense », « TMSR faible versus TMSR intense » et « TMSR modéré versus TMSR intense » (Fig. 2). Parmi les 168 étudiants ayant indiqué s'être fait manipuler le rachis 4 jours par semaine ou plus, le pourcentage de ceux qui ont présenté un TMSR intense a doublé par rapport à celui estimé avant les études : 54 % versus 27 %.

  et peut constituer un motif de choix d'études d'ostéopathie. Cette conception serait différente de celle partagée par les individus du même âge qui n'auraient pas été confrontés à ce phénomène de santé, avec une plus grande sensibilité et une meilleure auto-perception à des TMSR. La prévalence déterminée à l'aide du « questionnaire nordique » peut amener à produire des résultats alarmistes, si elle n'est pas associée à l'indicateur « intensité du TMSR ». Notre étude a évalué l'intensité maximale ressentie au cours des 12 derniers mois à 6/10 en moyenne contre 5/10 avant les études. Dans les deux cas, le TMSR est modéré puisque compris entre 4 et 6/10. Cette variation d'un point d'intensité seulement est faible sur le plan clinique et peut se situer dans la marge d'erreur des auto-évaluations. Cela pourrait laisser penser que le phénomène n'est pas perturbant durant les études puisqu'il correspond à ce que les étudiants ont déjà connu avant. Au moins trois éléments viennent contrebalancer cette appréciation. Le premier est la grande variabilité individuelle. Ainsi, les étudiants qui n'ont pas connu de TMSR avant les études affichent en moyenne, une augmentation de l'intensité de 5/10. La moitié des étudiants ont vécu un TMSR intense contre moins d'un tiers avant les études. Le deuxième élément concerne la durée du TMSR chez certains. Un quart des étudiants a connu ce phénomène de façon chronique puisqu'il a persisté trois mois ou plus [38]. Certains étudiants ont indiqué avoir souffert d'un TMSR intense tous les jours durant les 12 derniers mois. Le troisième élément est que le phénomène peut se répéter d'année en année ; certains étudiants ayant indiqué avoir souffert d'un TMSR d'intensité très élevée pendant ces trois années. Bien qu'il existe une liaison statistiquement significative, entre l'intensité maximale du TMSR vécue avant les études et celle vécue au cours des 12 derniers mois, il n'y a pas de lien systématique entre la sévérité du phénomène de santé vécue avant les études et la sévérité vécue au cours des 12 derniers. En outre, les étudiants qui ont vécu un TMSR intense tout au long des 12 derniers mois n'ont pas obligatoirement vécu un TMSR intense avant leurs études. La santé musculo-squelettique du rachis avant les études ne peut être retenue comme un indicateur global suffisamment robuste de la santé musculo-squelettique au cours des études. D'autres mécanismes interviennent dans la genèse des TMSR et leur sévérité. Nous avons analysé les caractéristiques, activités ou comportements autres que la santé musculo-squelettique avant les études, susceptibles d'influer sur l'intensité des TMSR durant les études. Seul le nombre de jours hebdomadaires à se faire manipuler le rachis influe chaque année sur la variation de l'intensité maximale des TMSR vécue entre « avant les études » et « au cours des douze derniers mois » de manière statistiquement significative. Son « poids explicatif » est toutefois faible mais assez semblable d'une année sur l'autre puisqu'il varie de 15 % à 18 %. Les étudiants se faisant manipuler le rachis moins souvent que la moyenne des étudiants (1 jour par semaine ou moins,) n'ont aucune différence statistiquement significative de l'intensité maximale des TMSR ressentie au cours des 12 derniers mois par rapport à ce qu'ils ont vécu avant leurs études. En revanche, ceux qui indiquent une fréquence de manipulation dans la moyenne (entre 2 et 3 jours par semaine) et plus encore ceux qui se font manipuler plus souvent que la moyenne des étudiants (4 jour par semaine ou plus), ont une santé musculo-squelettique du rachis moins bonne qu'avant leurs études. On retrouve chez ces étudiants des pourcentages d'absence de TMSR et de TMSR faible moins importants qu'avant les études et a contrario des pourcentages de TMSR modéré ou intense plus importants qu'avant les études. Ainsi, la moitié seulement des étudiants s'étant fait manipuler le rachis 4 jours par semaine ou plus et ayant connu un TMSR intense, avait déjà connu ce phénomène avant les études. Il semblerait donc exister une relation entre l'augmentation de la fréquence à laquelle les étudiants se font manipuler le rachis et l'augmentation de l'intensité de leur TMSR.

  pourrait s'appliquer à ces étudiants. Leurs expériences répétées de TMSR pourraient être perçues comme nocives pour leur santé, entrainant ainsi de la peur. Leur peur ne pouvant pas être gérée par l'évitement de l'activité qu'ils associent à leur TMSR, un phénomène d'autoentretien s'installerait. La composante biomécanique dans ce processus ne serait plus alors la seule à l'oeuvre.Afin de conforter ces résultats, cette étude va se poursuivre encore deux ans pour avoir un aperçu du phénomène sur la totalité de la scolarité d'une promotion. Nous envisageons également d'élargir notre analyse en nous appuyant sur le modèle biopsychosocial, par une étude qualitative sur les conceptions en santé des étudiants et leurs pratiques des manipulations vertébrales. Elle éclairera la problématique qui peut émerger chez ces étudiants, à savoir : comment les manipulations vertébrales qui m'ont occasionné des troubles musculo-squelettiques du rachis durant mes études peuvent-elles apporter un soulagement à des patients qui souffrent de troubles musculo-squelettiques du rachis et alimentera la réflexion d'une démarche promotrice de santé chez ces étudiants.Tableau 2La valeur β représente la capacité d'une caractéristique des étudiants (colonne de gauche) à influer sur une caractéristique des TMSR (colonne du milieu). Plus elle est proche de 1, plus elle est influente.

Fig. 1 .

 1 Fig. 1. Avoir connu un TMSR intense au cours des 12 derniers mois n'implique pas systématiquement avoir connu un TMSR intense avant les études d'ostéopathie.

Fig. 2 .

 2 Fig. 2. Parmi les étudiants qui se sont fait manipuler le rachis 4 fois ou plus par semaine et qui ont indiqué avoir connu un TMSR intense durant cette période, la moitié seulement a connu un TMSR intense avant les études.

Fig. 1 -Fig. 2 -

 12 Fig. 1 -Diagramme de flux de l'étude

3 .

 3 Variation de l'intensité maximale des TMSR entre « avant les études d'ostéopathie » et « au cours des 12 derniers mois ». Moyennes des variations de l'intensité maximale des TMSR entre « avant les études d'ostéopathie » et « au cours des 12 derniers mois » selon les caractéristiques et comportements des étudiants. (Saint Denis [France], Centre européen d'enseignement supérieur de l'ostéopathie, 2018)

au cours des 12 derniers mois Intensité maximale du TMSR au cours des 12 derniers mois Variation de l'intensité maximale du TMSR entre avant les études et au cours des 12 derniers mois Effectif Fréquence

  Fréquence et intensité des TMSR au cours des 12 derniers mois, variation de l'intensité des TMSR entre « avant les études d'ostéopathie » et « au cours des 12 derniers mois », comparaisons selon les caractéristiques, comportements et activités (seuls les caractéristiques, comportements et activités ayant une influence sur une des trois variables dépendantes sont indiqués). (Saint Denis [France], Centre européen d'enseignement supérieur de l'ostéopathie, 2018)

	Tableau 1.
		Trouble musculo squelettique du rachis
		(TMSR) Significativité de la comparaison	Moyenne Écart type	Significativité de la comparaison	Moyenne Écart type	Significativité de la comparaison
	Hommes	Pas TMSR TMSR	5 -0,7% 244 -33,3%			5,5 -2,0		1,3 -2,9
	Femmes	Pas TMSR TMSR	7 -0,9% 477 -65,1%		p=0,5	6,3 -2,0	p<0,0001*	1,3 -2,7	p=0,9
	Ne pas avoir connu de TMSR avant ses études d'ostéopathie	Pas TMSR TMSR	1 -0,1% 91 -12,4%	Taux de réponse : 91,5 % 5,6 -2,1		5,6 -2,1
	Avoir connu un TMSR avant	Pas TMSR	11 -1,6%		p=0,5		p=0,03*		p<0,0001*
	ses études d'ostéopathie	TMSR	630 -85,9%			6,1 -2,0		0,7 -2,2
	Ne pas avoir connu d'accident ou de	Pas TMSR	8 -1,1%
	traumatisme au niveau du rachis avant ses études	TMSR	630 -70,4%			5,9 -2,0		1,7 -2,8
	d'ostéopathie				p=0,7		p<0,0001*		p<0,0001*
	Avoir connu un accident ou un traumatisme au niveau	Pas TMSR	11 -1,5%
	du rachis avant ses études d'ostéopathie	TMSR	209 -28,5%			6,4 -2,3		0,2 -2,6
	1 er cycle 2 nd cycle	5.3 Pas TMSR TMSR Pas TMSR TMSR	8 -1,1% 434 -59,2% 5.7 4 -0,5% 287 -39,2%		p=0,7	6.8 6,1 -2,1 6,1 -2,0	6.6 p=0,2	0,9 -2,4 1,9 -3,1	p<0,0001*
	Avoir redoublé	Pas TMSR TMSR	9 -1,2% 570 -77,8%			6,1 -2,1		1,2 -2,7
	Ne pas avoir redoublé	Pas TMSR TMSR	3 -0,4% 151 -20,6		p=0,7	6,0 -2,2	p=0,9	-2,7 -1,9	p=0,04*
	TMSR à 7/10 au	TMSR à 8/10 au	TMSR à 9/10 au	TMSR à 10/10 au
	cours des 12	cours des 12		cours des 12	cours des 12
	derniers mois	derniers mois	derniers mois	derniers mois

Ne pas s'être fait manipuler le rachis

	Pas TMSR	4 -0,5%
	TMSR	211 -28,8%	5,8 -2,2	0,7 -2,0
		p=0,7	p=0,2	p<0,0001*
	S'

être fait manipuler le rachis

	Pas TMSR	8 -1,1%
	TMSR	510 -69,6%	6,1 -3,0	1,5 -3,0
	S'

être fait manipuler le rachis 1 jour ou moins par semaine

	Pas TMSR	3 -0,4%
	TMSR	69 -9,4%	5,7 -2,1	2,1 -3,1
	S'

être fait manipuler le rachis entre 2 et 3 jours par semaine

  Régressions linéaires multiples effectuées sur l'intensité maximale des TMSR et sur la variation d'intensité maximale des TMSR (Saint Denis [France], Centre européen d'enseignement supérieur de l'ostéopathie, 2018). La valeur β représente la capacité d'une caractéristique des étudiants (colonne de gauche) à influer sur une caractéristique des TMSR (colonne du milieu). Plus elle est proche de 1, plus elle est influente.

	Ne pas avoir été contraint(e) de réduire ses activités de loisir	Pas TMSR TMSR	12 -1,6% 428 -58,4%	5,4 -2,0		1,0-2,6
	Avoir été contraint(e) de	Pas TMSR	0 -0%		p<0,0001*		p<0,0001*
	réduire ses activités de loisir	TMSR	293 -40%	7,1 -1,7		1,7 -2,9
	Tableau 2.
		Pas TMSR	2 -0,3%
		TMSR	276 -37,7%	6,1 -2,0		1,5 -3,0
	S'être fait manipuler le rachis 4 jours et plus par semaine	Pas TMSR TMSR	3 -0,4% 165 -22,5%	6,4 -2,0		1,8 -2,7
	Ne pas avoir été contraint(e) de réduire ses activités habituelles chez soi	Pas TMSR TMSR	12 -1,6% 459 -62,7%	5,5 -1,9		1,1 -2,6
	Avoir été contraint(e) de réduire ses activités habituelles chez soi	Pas TMSR TMSR	0 -0% 262 -35,7%	7,1 -1,7	p<0,0001*	1,8 -3,0	p<0,0001*
	Ne pas avoir été contraint(e) de réduire sa pratique des manipulations vertébrales	Pas TMSR TMSR	12 -1,6% 405 -55,3%	5,5 -2,0		0,8 -2,5
	Avoir été contraint(e) de réduire sa pratique des manipulations vertébrales	Pas TMSR TMSR	0 -0% 316 -43,1%	6,8 -1,8	p<0,0001*	1,9 -2,9	p<0,0001*

Remerciements

Nous remercions la direction de l'établissement qui soutient notre démarche et les étudiants qui ont participé à cette étude.


J Lacroux

E Trably

N Bernet

J-P Steyer

R Van Lis

Mixotrophic growth of microalgae on volatile fatty acids is determined by their undissociated form

Keywords: Dark fermentation, microalgae, acetic acid, butyric acid, pH

The influence of pH and substrate concentration on the mixotrophic growth of five microalgae species in presence of acetate or butyrate was evaluated. Acutodesmus obliquus, Auxenochlorella protothecoïdes, two strains of Chlamydomonas reinhardtii, and Chlorella sorokiniana were cultivated at pH from 5 to 10. Acetate was efficiently assimilated by all strains while butyrate uptake was greatly strain dependent. Growth rates at pH values above 8 were reduced while values below 5 or 6 inhibited growth on acetate and butyrate respectively. The influence of acetic and butyric acid concentration was tested. It was demonstrated that the main factor affecting microalgae growth is the concentration of undissociated acid, which can be controlled by pH adjustment. The strains exhibited inhibition threshold concentrations of 71 -207 mg.L -1 for acetic acid and of 13 -25 mg.L -1 for butyric acid. These findings are crucial for proper control of processes coupling bacterial fermentation and microalgae cultures.

Introduction

Fossil fuel depletion and climate change concerns have raised the interest in microalgae based biotechnologies, as microalgae can accumulate 20-50% of their dry weight as lipids convertible in biofuel [START_REF] Chisti | Algae production comparrison[END_REF] as well as other high added value molecules such as carotenoids [START_REF] Chew | Microalgae biorefinery: High value products perspectives[END_REF]. Conventional cultivation methods involve growing microalgae under photo-autotrophy, only using CO2 as carbon source and light as energy in the process of photosynthesis. However, these light dependent systems are limited in productivity, as the increase in biomass density prevents light from penetrating in the bulk of the reactor [START_REF] Brennan | Biofuels from microalgae-A review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products[END_REF]. Heterotrophic growth has been suggested as a way to get around this constraint by feeding microalgae under dark conditions with organic compounds such as glucose or acetate, used as both carbon and energy sources [START_REF] Perez-Garcia | Heterotrophic cultures of microalgae: Metabolism and potential products[END_REF]. When microalgae are cultivated under mixotrophy, organic carbon and CO2 are both consumed under illumination [START_REF] Zhan | Mixotrophic cultivation, a preferable microalgae cultivation mode for biomass/bioenergy production, and bioremediation, advances and prospect[END_REF], usually leading to higher growth rates and biomass yields than those achieved by either auto-or heterotrophy [START_REF] Li | Mixotrophic cultivation of a Chlorella sorokiniana strain for enhanced biomass and lipid production[END_REF].

The cost of organic compounds (especially glucose) required for hetero-and mixotrophic cultivation mode may however limit the economics of the process [START_REF] Liang | Producing liquid transportation fuels from heterotrophic microalgae[END_REF].

Therefore, glucose must be substituted by low cost carbon sources, preferentially originating from various waste streams so as to further improve environmental benefits of micro-algae cultivation [START_REF] Lowrey | Heterotrophic and mixotrophic cultivation of microalgae for biodiesel production in agricultural wastewaters and associated challenges -a critical review[END_REF]. In recent years, coupling dark fermentation (DF) with microalgal culture has been suggested as an effective way to treat DF effluents and provide cheap substrates for heterotrophic or mixotrophic micro-algae production [START_REF] Turon | Potentialities of dark fermentation effluents as substrates for microalgae growth: A review[END_REF], [START_REF] Chalima | Utilization of Volatile Fatty Acids from Microalgae for the Production of High Added Value Compounds[END_REF]. During DF, the organic matter from waste is converted into hydrogen and other metabolites by fermentative bacteria. Most of the initial organic material (expressed as COD) is however retrieved in the effluent in the form of volatile fatty acids (VFA), mainly acetate and butyrate [START_REF] Moscoviz | The environmental biorefinery: State-of-the-art on the production of hydrogen and value-added biomolecules in mixed-culture fermentation[END_REF]. Consequently, DF must be associated with another bioprocess, typically anaerobic digestion or photo-fermentation, in order to reduce the effluent COD and to maximize waste valorisation [START_REF] Ghimire | A review on dark fermentative biohydrogen production from organic biomass: Process parameters and use of by-products[END_REF]. Although acetate is a suitable substrate for most strains, butyrate is not as easily degraded. As an illustration, Auxenochlorella protothecoïdes and Chlorella sorokiniana were able to quickly assimilate acetate up to 2.1 g.L -1 in heterotrophy, leading to biomass yield of 0.75 g.gC.L -1 and 0.84 g.gC.L -1 respectively [START_REF] Turon | Use of fermentative metabolites for heterotrophic microalgae growth: Yields and kinetics[END_REF]. Meanwhile, butyrate was found to be inhibitory at concentrations as low as 0.16 g.L -1 . Paradoxically, [START_REF] Liu | Biohydrogen production by a novel integration of dark fermentation and mixotrophic microalgae cultivation[END_REF] successfully cultivated C. vulgaris ESP-6 on a sterilized and diluted DF effluent containing 0.3 g.L -1 acetate and 0.8 g.L -1 butyrate [START_REF] Liu | Biohydrogen production by a novel integration of dark fermentation and mixotrophic microalgae cultivation[END_REF]. Fei et al [START_REF] Fei | Lipid production by microalgae Chlorella protothecoides with volatile fatty acids (VFAs) as carbon sources in heterotrophic cultivation and its economic assessment[END_REF] showed that cultivation of C. protothecoïdes was possible on a mixture of VFA with ratio of acetic:propionic:butyric acid of 6:1:3 up to a total concentration of 4 g.L -1 . The lag phase increased considerably with increasing concentrations of VFA and growth was totally inhibited at 8 g.L -1 VFAs.

Because of the variability of strains as well as the growth conditions, it remains unclear whether the microalgal growth is hampered by high concentrations of VFA, pH or is only strain dependant. Acetic and butyric acid are well known for their detrimental effects on bacteria [START_REF] Ricke | Perspectives on the use of organic acids and short chain fatty acids as antimicrobials[END_REF] or eukaryotic organisms by interacting with the cell membrane and eventually disrupting essential metabolic activities such as the electron transport chain and oxidative phosphorylation [START_REF] Desbois | Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of action and biotechnological potential[END_REF]. Zuo et al showed that 1 mM acetic acid at pH 5 induced programmed cell death was inhibitory for Chlamydomonas reinhardtii by inducing oxidative stress [START_REF] Zuo | Plant Physiology and Biochemistry Acetic acid-induced programmed cell death and release of volatile organic compounds in Chlamydomonas reinhardtii[END_REF]. The authors suggested this inhibition was dependant on the ROOH concentration more than on the total (un-dissociated and dissociated form) of the acid. Therefore, it was supposed in this work that growth suppression at acidic pH or at high VFA concentration was likely neither due to pH value nor the total organic acid concentration but rather resulted from the presence of the undissociated acid form (ROOH).

Understanding the causes of inhibition of microalgal growth is crucial to allow an efficient coupling of DF processes with microalgal growth. The performances of five microalgal strains grown on a synthetic medium mimicking a DF effluent were thus evaluated. The strains Acutodescmus obliquus, Auxenochlorella protothecoïdes and Chlorella sorokiniana were chosen for their ability to perform mixotrophic growth on acetate and butyrate and their high growth rates. The model strain Chlamydomonas reinhardtii CC-124 was also selected as the most studied model species. The cell wallless mutant C. reinhardtii CC-400 was also tested since its lack of cell wall is of potential biotechnological interest. Using a microplate set-up, pH values of the medium ranging from 5 to 10 were screened. In addition, concentrations of acetic and butyric acid used as single substrates ranging from 0.16 to 8.6 g.L -1 of total acetate and from 0.08 to 3.8 g.L -1 of total butyrate were tested in order to determine the optimal growth conditions as well as a minimum inhibitory concentration caused by the undissociated form.

Material and methods

General growth medium

A modified TAP medium (named hereinafter HAP medium) was prepared, by replacing the TRIS buffer by a 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffer. The medium was composed as follows: sodium acetate (1.1 g.L -1 ), potassium phosphate (K2HPO4) (1 mM), HEPES (20 mM), 25 mL.L -1 Beijerincks (40X) solution, leading to an ammonium (NH4 + ) concentration of 7.5 mM, 1mL.L -1 Hutner's trace element solution and 100 µL.L -1 vitamins solution (vitamin B1 50 mM; Biotin 1 mM; Cyanocobalamin 1 mM). The pH of the medium was adjusted to 7.0 by addition of NaOH 5M prior to sterilization by autoclave at 121°C for 20 min. Vitamins were sterilized by filtration over a 0.2 µm filter and added after autoclaving to avoid their degradation. To obtain a solidified medium, 1.5 % m/v agar were added before sterilization. An HBP medium was also prepared by replacing sodium acetate by sodium butyrate (0.8 g.L -1 ). All chemicals were purchased from Sigma Aldrich, USA.

Microalgae strains and cultivation conditions

Five strains were used in this study. Acutodescmus obliquus, Auxenochlorella protothecoïdes and Chlorella sorokiniana were obtained from the SAG culture collection (Goettingen, Germany). The wild-type Chlamydomonas reinhardtii CC-124 and the wall-less mutant Chlamydomonas reinhardtii CC-400 were obtained from the Chlamydomonas Resource Center (University of Minnesota, St Paul, MN, USA). The strains were maintained on agar HAP medium under constant illumination at 25°C.

Before performing experiments, few colonies were picked and re-suspended in 40 mL of HAP medium in pre-sterilized 125 mL flasks. Flasks were then incubated at 25°C, under constant light of 100 µE and constant agitation of 130 rpm. After a few days, cultures were resuspended in 40 mL fresh HAP medium and incubated for 1-2 days at 25°C under constant light (100 µE) and constant agitation (130 rpm).

Cells in exponential growth phase were collected, centrifuged at 2500 rpm for 10 min and supernatant was discarded. The pellet was resuspended in PBS so as to reach a final optical density at 750 nm (OD750) around 5. This concentrated culture was used as inoculum for the experiments. Before incubation and during cultivation, cultures were periodically checked for contaminants by microscopy.

Variable pH or concentration media

Media were prepared as described in section 2.1 except for pH, buffer and substrate composition. The pH was buffered at values between 5 and 10 using 100 mM of an appropriate buffer, ie MES at pH 5 and 6, HEPES at pH 7 and 8, CHES at pH 9 and 10. Substrate was either sodium acetate (1.1 g.L -1 ) or sodium butyrate (0.8 g.L -1 ) with a constant organic carbon concentration of 0.5 gC.L -1 . An autotrophic control was also performed for each strain and under each pH condition by omitting organic acids in the medium under atmospheric CO2 conditions and constant illumination of 100 µE.

Culture media with variable concentrations of the undissociated acid form were prepared as follows. In all experiments, MES was used as buffer at a concentration of 100 mM. The pH was set to 5.5, 6.0 or 6.5. Increasing concentrations of sodium acetate and sodium butyrate were added to the medium to get a range of undissociated acid concentrations from 23.6 to 295 mg.L -1 of acetic acid (AcOOH) and 12.5 to 74.7 mg.L -1 of butyric acid (BuOOH). The undissociated acid form concentration ([ROOH], mg.L -1 ) was calculated based on the modified Henderson -Hasselbach equation:

[ ] =
where Ct is the total concentration of organic acid (in mg.L -1 ).

The nutrients concentration was adjusted based on the Redfield C/N/P ratio of 106/16/1 by diluting the proper amount of 1 M NH4Cl and 1 M K2HPO4 stock solutions.

Beijerincks solution (40X), Hutner's trace solution and vitamins were added as stated in section 2.1. Media were sterilized by autoclaving (121°, 20 min).

Sterile 24-well microplates were used to screen each condition. Up to six conditions in triplicates were tested in one plate, the six remaining wells being blank condition.

Wells were filled with 1 mL of medium and inoculated with 10 µL of culture prepared as stated in section 2.2 (initial DO750 = 0.05). Micro-algae were incubated in an AlgaeTron AG 230 shaker incubator (PSI, Drásov, Czech Republic). Agitation was set to 100 rpm to prevent spilling from the wells, at 25°C and under constant illumination of 100 µE. Final pH was measured at the end of cultivation.

Biomass quantification

Biomass of the microplates cultures was quantified by direct measurement of the optical density at 750 nm (OD750) in an Infinite Nanoquant M200 spectrophotometer (Tecan®, Switzerland). OD750 was chosen to avoid interferences with pigments absorbance [START_REF] Griffiths | Interference by pigment in the estimation of microalgal biomass concentration by optical density[END_REF]. Before analysis, microplates lids were aseptically wiped to remove condensation. The measurements were done 1 to 3 times a day depending on the growth phase. To correlate OD750 to biomass dry weight (DW), calibration curves were plotted for each strain and each substrate. Briefly, 200 mL of HAP medium or HBP medium in 500 mL flasks were inoculated with cells in the exponential phase. Flasks were incubated as stated in section 2.2. Samples were taken 1 to 3 times a day. A known volume of sample was filtered on pre-weighed GF/C filters (Whatman®), dried overnight at 105°C and weighed again to obtain the DW. The OD750 was determined by filling a well of a 24-well microplate with 1 mL of sample, using water as blank. The equation correlating DW to OD750 is as follows:

DW = Cf * OD 750
where DW is g dry weight.L -1 , Cf is a conversion factor (gDW.L -1 ) and OD750 the optical

density

Volatile Fatty Acid (VFA) measurement

The VFA concentrations were quantified at the end of the culture by gas chromatography. Samples were collected, centrifuged at 15 000 rpm and stored at -25°C. Before analysis, 500 µL of supernatant were mixed with 500 µL of internal standard solution (ethyl-2-butyric acid, 1 g.L -1 ). The apparatus was a Perkin Clarus 580 with capillary column Elite-FFAP crossbond®carbowax® (15 m) maintained at 200°C

and with N2 as the gas vector (flow rate of 6 mL.min-1) equipped with a flame ionization detector (FID) maintained at 280°C (PerkinElmer, USA).

Calculation

The apparent production rate of biomass for rapp (gDW.L -1 .d -1 ) was calculated according to equation (1):

= (1)
With X0 and Xf the biomass concentrations (gDW.L -1 ) measured at the beginning (t0, d -1 )

and the end (tf, d -1 ) of the exponential phase.

The mixotrophic yield YM (gDW.gsubstrate -1 ) was calculated according to equation (2):

= (2)
Where X0 and Xf are the biomass concentrations (gDW.L -1 ) at the beginning and at the end of the experiment and SC (g.L -1 ) the substrate consumed.

The estimated heterotrophic yield YH (gDW.gsubstrate -1 ) was calculated according to equation ( 3):

= ! (3)
Where X0 and Xf are the biomass concentrations (gDW.L -1 ) at the beginning and at the end of the experiment, SC (g.L -1 ) the substrate consumed and Xauto the estimated autotrophic biomass concentration (gDW.L -1 ) calculated as follows (Equation 4):

" #$ % = & ' * , #$ % ( 4
)
Where tf is the duration of the mixotrophic experiment (d -1 ) and rapp, auto (gDW.L -1 .d -1 ) the apparent production rate of biomass obtained in the autotrophic control. XAuto and rapp, Auto were calculated for each pH condition.

Results and discussion

Effect of initial pH on acetate growth

The effect of initial pH on microalgae growth was investigated either in autotrophic conditions (Fig. S1) or in presence of acetate (Fig. S2). As the aim of the study was to compare the ability of the microalgal strain to assimilate organic substrate, no extra CO2 was added into the medium by bicarbonate addition or bubbling. The pH of the medium affected microalgal growth differently in both conditions with each strain exhibiting a specific behaviour. Final pH was unchanged for all conditions except at pH 10 where it decreased between 0.2 and 0.5 pH unit (data not shown). Autotrophic cultivation of all the strains is shown in Fig. 1. For all strains, growth was linear (Fig. SI). The autotrophic biomass productivity rapp, Auto of A.

protothecoïdes remained constant at all tested pH values. For the other strains, rapp, Auto increased linearly with initial pH from 5 to 8. For A. obliquus and C. sorokiniana, rapp,

Auto was constant at pH 8-10, but was maximal at pH 9 for both C. reinhardtii strains.

Autotrophic growth of A. obliquus and C. reinhardtii CC-400 was inhibited at pH 5.

Figure 2 shows that acetate was a suitable substrate for mixotrophic growth of all microalgae. The exponential phase lasted 1 to 3 days at most initial pH values (Fig. S2). The highest apparent production rate on acetate (rapp, Ac) was found for most strains at initial pH 7.0, except for C. reinhardtii CC-400 where rapp, Ac is optimal at pH 6. C.

sorokiniana exhibited the highest apparent growth rate (1.17 ± 0.03 g.L -1 .d -1 ) followed by C. reinhardtii CC-124 (0.57 ± 0.02 g.L -1 .d -1 ) (Fig. 2-A). The rapp, Ac of all strains declined with initial pH increasing from 7 to 10. Growth of all strains was inhibited at pH 5 in presence of acetate, with no apparent biomass increase and acetate consumption. Whenever growth occurred, acetate was almost always totally consumed by all strains except at pH 9 and 10 (Fig. 2-B The linear autotrophic biomass growth indicates that cells were limited. As addition of organic carbon resulted in exponential phase, we can assume that carbon was the limiting nutrient. As cells were grown without bicarbonate nor bubbling air, CO2 was only coming from diffusion from atmosphere, which probably was the limiting factor. .j -1

)

Table 1:Biomass yields on 0.5 gC.L -1 acetate. YM (g.g -1 ) stands for global mixotrophic yield. YH (g.g -1 ) is the estimated yield only due to heterotrophy. Standard deviations are given for 3 biological replicates. When no values are given, there was either no growth observed or no substrate consumed.

This would also explain why autotrophic biomass production increased with rising pH and was maximum between pH 8-10 for most strains. Indeed, between pH 6 and 10, bicarbonate (HCO3 -), which is more soluble than CO2, becomes the predominant form of the inorganic carbon species. The increase of initial pH may have resulted in an

Strain

Initial pH YM (g.g -1 ) YH (g.g -1 )

A. obliquus For most strains, YM was superior to 1. As carbon content of biomass can be estimated to 50% and that algae were fed with 0.5 gC.L -1 , this implies that extra carbon (ie. inorganic) was absorbed. This can be inferred from the growth curves (Fig. S2),

where a linear growth phase is visible after the exponential phase. As carbon is the limiting nutrient in the used media, this linear growth was most probably due to autotrophic growth on atmospheric CO2. Many authors reported that mixotrophic biomass production rate is at least the sum of the autotrophic and heterotrophic rates [START_REF] Endo | Studies on Chlorella regularis, heterotrophic fast-growing strain II. Mixotrophic growth in relation to light intensity and acetate concentration[END_REF]. Thus, heterotrophic yield YH (in gDW.gsubstrate -1 ) at each pH was estimated by subtracting the potential autotrophic biomass obtained during the duration of the mixotrophic cultivation. The autotrophic contributions were estimated using results

from figure 1 as suggested by Turon et al [START_REF] Turon | Growth of Chlorella sorokiniana on a mixture of volatile fatty acids: the effects of light and temperature[END_REF]. Some biases are induced with this method as autotrophic growth (meaning growth using atmospheric CO2) was assumed to be constant, independently of the amount of organic substrate present in the medium.

This might be a strong assumption taking into account that acetate was shown to reduce CO2 assimilation in either C. reinhardtii [START_REF] Heifetz | Effects of Acetate on Facultative Autotrophy in<em>Chlamydomonas reinhardtii</em> Assessed by Photosynthetic Measurements and Stable Isotope Analyses[END_REF] or C. sorokiniana [START_REF] Qiao | Short-term effects of acetate and microaerobic conditions on photosynthesis and respiration in chlorella sorokiniana gxnn 01 (chlorophyta)[END_REF]. Despite these limitations, some conclusions can be drawn from these values.

Firstly, the constant heterotrophic yield from pH 6 to 9 for most strains shows that acetate was efficiently converted into biomass at these pH values. This implies that the constant or decreasing biomass production rates observed at pH 8-10 in the mixotrophic conditions are due to the decrease of the heterotrophic biomass production rates. A decrease in mixotrophic productivity was thus probably caused by a limitation in acetate consumption, potentially at the level of its transport into the cells. The uptake of VFAs involves two mechanisms: (i) passive diffusion of the liposoluble undissociated form of the acids across the membrane, and (ii) active transport of the anionic forms mediated by membrane carboxylate/proton transporters [START_REF] Casal | Utilization of short-chain monocarboxylic acids by the yeast Torulaspora delbrueckii: Specificity of the transport systems and their regulation[END_REF]. Near neutral external pH, the concentration of the undissociated form is less than 1% of the dissociated form (pKa,acetate = 4.75 and pKa,butyrate = 4.8) and the transport of VFA relies mostly on an active uptake at a rate that is [H + ]-dependent [START_REF] Jolkver | Identification and Characterization of a Bacterial Transport System for the Uptake of Pyruvate , Propionate , and Acetate in Corynebacterium glutamicum[END_REF]. At high pH where the anionic acid form is predominant, proton concentration might be limiting, leading to a reduced uptake rate of acetate and thus a reduced rapp, Ac, up to a complete inhibition of acetate uptake, eg. at pH 10. The results indicate that this limitation of substrate transport, depending on the pH, is also strain dependant, C. sorokiniana being limited in acetate uptake before the other strains. This is consistent with previous results for other strains.

Hwang et al (2014) showed that increasing the initial pH from 4.9 to 8 increased acetate removal by 90.5% by the strain Micractinium reisseri YSW0 growing under photoheterotrophic hydrogen producing conditions [START_REF] Hwang | Photoheterotrophic microalgal hydrogen production using acetate-and butyrate-rich wastewater effluent[END_REF]. Increasing the pH further resulted however in only 45% of initial acetate uptake. Cho et al (2015) also showed that VFA removal was enhanced for C. vulgaris when pH was controlled below pH 9 in presence of high VFA concentration [START_REF] Cho | Bioresource Technology Effects of pH control and concentration on microbial oil production from Chlorella vulgaris cultivated in the effluent of a low-cost organic waste fermentation system producing volatile fatty acids[END_REF].

Secondly, growth inhibition of all strains at pH 5 in mixotrophy compared to the autotrophic control suggests that organic substrates, especially acetate, is responsible for absence of growth at this pH and not the acidic pH value in itself. Results in the literature tend to confirm this hypothesis: C. sorokiniana is able to grow autotrophically from pH 4 to 12 [START_REF] Kumar | High cell density lipid rich cultivation of a novel microalgal isolate Chlorella sorokiniana FC6 IITG in a single-stage fed-batch mode under mixotrophic condition[END_REF] but growth was inhibited at pH 5.5 in presence of acetate [START_REF] Kumar | Cell growth kinetics of Chlorella sorokiniana and nutritional values of its biomass[END_REF]. On the other hand Scenedesmus sp. R-16 could grow heterotrophically in presence of 10 g.L -1 glucose at pH 4 [START_REF] Ren | A new lipid-rich microalga Scenedesmus sp. strain R-16 isolated using Nile red staining: effects of carbon and nitrogen sources and initial pH on the biomass and lipid production[END_REF]. Buffer toxicity was not evaluated in this study, and some authors reported that organic buffer such as those used in the present paper (MES, HEPES and CHES) could be inhibitory [START_REF] De Farias Silva | Effects of pH and Carbon Source on Synechococcus PCC 7002 Cultivation: Biomass and Carbohydrate Production with Different Strategies for pH Control[END_REF]. However, pH 5 and 6 conditions were both buffered with 100 mM MES. Normal growth was observed at pH 6 and as such, although buffers may have some impact on the obtained growth rates, their presence is unlikely to explain the complete inhibition observed at pH 5.

Effect of initial pH on butyrate growth

Effect of the initial pH on microalgal growth in presence of butyrate was also investigated (Fig. S3). Compared to acetate, butyrate is a much less appropriate substrate for microalgae and the strains exhibited stronger discrepancies in their behaviour compared to growth on acetate. Interestingly, exponential growth was observed for A. protothecoïdes and C. sorokiniana while growth was linear for A.

obliquus and the two C. reinhardtii strains. Stationary phase was reached after 6-12 days depending on strains and initial pH. Figure 3 shows that growth on butyrate and its assimilation was strain dependent and more affected by pH values than acetate. When butyrate was used as carbon source, no growth could be observed below pH 7 for most strains. C. sorokiniana exhibited the highest productivity on butyrate (0.23 ± 0.007 g.L - 1 .d -1 at initial pH 8) followed by C. reinhardtii CC-124 (0.20 ± 0.004 g.L -1 .d -1 at pH 9).

For C. sorokiniana and A. protothecoïdes, biomass productivity was increased two-fold at pH 7 and pH 8 respectively compared to the autotrophic control, showing that the strains were able to assimilate and convert butyrate into biomass. On the other hand, biomass production rates of A. obliquus, C. reinhardtii CC-124 and CC-400 were close to the autotrophic ones and butyrate addition resulted in a small increase in the biomass productivity, indicating that butyrate was poorly converted to biomass.

Biomass production rates of A. protothecoïdes and C. sorokiniana decreased above pH 7 and pH 8 respectively, while rapp, Bu of both C. reinhardtii strains and A.

obliquus increased with the pH rising from 7 to 9. For these three strains, growth was totally inhibited at pH 10. respectively. In the other strains, the uptake of butyrate was somewhat less impacted by the pH but was lower to begin with, and it was never assimilated completely. Uptake was highest at pH 8 for both C. reinhardtii strains (around 30% of initial butyrate) and A. obliquus (47.9 ± 1.9 % of initial butyrate). Surprisingly, A. obliquus assimilated more butyrate than C. sorokiniana and A. protothecoïdes at pH 9. No butyrate could be assimilated at pH 10.

Calculated yields varied considerably between strains and pH conditions (Table 2). For instance, A. obliquus YH was close to 1.0 g.g -1 at pH 8 and 9 while the YH of C.

sorokiniana was maximum at pH 7 (0.91 ± 0.09 g.g -1 ) and halved at pH 8 and 9. It appeared thus that physiological differences between the strains for butyrate assimilation are much more pronounced than for acetate. The general trend is that the uptake rate of butyrate is much slower than acetate, as reflected by the fact that YM were always very higher than 1. This means that a substantial amount of atmospheric carbon was assimilated during the duration of the experiment.

The growth inhibition observed at pH 6 shows that the detrimental effect of organic acid suggested in the first section is not only pH-dependant but substratedependant as well, as growth was observed at pH 6 in presence of acetate (Fig. 1).

Increasing the pH by one unit enabled the growth on butyrate, showing that substrate concentration in itself could not explain solely why growth was prevented. Moreover, butyrate was found to be inhibitory at concentrations as low as 0.16 g.L -1 [START_REF] Turon | Use of fermentative metabolites for heterotrophic microalgae growth: Yields and kinetics[END_REF] for C. sorokiniana while C. vulgaris ESP-6 could be cultivated on a DF effluent containing 0.3 g.L -1 acetate and 0.8 g.L -1 butyrate [START_REF] Liu | Biohydrogen production by a novel integration of dark fermentation and mixotrophic microalgae cultivation[END_REF]. The strains, even though different, are both Chlorella species and thus relatively close. The fact that C. vulgaris could grow on butyrate concentration 4 times higher than C. sorokiniana could be attributed to the elevation of pH, as the former study was performed at pH 6.5 while the latter was done at 7.5. Another explanation could be the presence of acetate. In case of a mixture of VFAs, acetate is consumed first by microalgae in a diauxic pattern [START_REF] Turon | Use of fermentative metabolites for heterotrophic microalgae growth: Yields and kinetics[END_REF]. Since assimilation of acetate leads to alkalisation of the medium [START_REF] Cho | Bioresource Technology Effects of pH control and concentration on microbial oil production from Chlorella vulgaris cultivated in the effluent of a low-cost organic waste fermentation system producing volatile fatty acids[END_REF] inhibition by butyrate may have been alleviated. However, butyrate assimilation is greatly reduced at pH above 7. This result, as well as the observed decreased productivity on acetate at alkaline pH, further show that pH medium should be tightly controlled during cultivation of microalgae on dark fermentation metabolites.

Inhibition of C. sorokiniana is due to the undissociated acid form

To dissociate the effect of pH or ROOH concentrations, C. sorokiniana was cultivated on various organic acid concentrations at three different supposedly inhibitory pH values: 5.5, 6.0 and 6.5 (Fig. 4, S4 and S5). This range of concentrations and the initial pH were chosen based on preliminary results (data not shown).

When plotting biomass productivity rapp versus concentration of organic acid expressed as total acetate concentration (Fig 4A ), rapp, Ac of C. sorokiniana increased from 0.45 ± 0.05 to 2.44 ± 0.11 g.L -1 .d -1 when total acetate concentration increased from 0.16 to 4.1 g.L -1 . Lower initial pH permitted lower total acetate concentrations, with growth being inhibited at 0.64 g.L -1 acetate at pH 5.5 while growth occurred at the same concentration at pH 6.0. This is explained by the difference in AcOOH concentration at these different pH values. When expressing the biomass productivity as a function of initial AcOOH, an inhibition threshold could be determined (Fig. 4B). At a given initial pH, the productivity increased or remained constant with increasing initial AcOOH concentrations. However, above 88.5 mg.L -1 AcOOH, growth was totally prevented, independently of the pH value. As opposed to acetate, high concentrations of total butyrate affected biomass productivity, as it decreased from 0.10 ± 0.008 to 0.05 ± 0.008 g.L -1 .d -1 with increasing concentrations of total butyrate from 0.08 to 1.3 g.L -1 (Fig. 4C). Still, when expressing rapp, Bu as a function of BuOOH, an inhibition threshold was observed. Growth was possible as long as undissociated butyric acid concentration was below 37.4 mg.L -1 , above which no growth was detected.

These results support the previous observations that no growth could be detected at pH 5 on acetate but at pH 6 on butyrate. At the concentration of total acid used in these experiments (1.1 g.L -1 of acetate), concentration of AcOOH was 396 mg.L -1 at pH 5.0, far above the threshold. Similarly, at butyrate concentration of 0.8 g.L -1 , BuOOH concentration was 288 mg.L -1 at pH 5 and 42.6 mg.L -1 at pH 6. The inhibition threshold on butyrate is 3 times lower than the one of acetate, suggesting a more toxic effect of this organic acid and explaining why initial pH required for butyrate growth is higher.

This difference could be attributed to the mechanism of ROOH toxicity: upon entry in the cells, ROOH will dissociate in the cytoplasm where pH is near neutral. According to [START_REF] Russell | Another explanation for the toxicity of fermentation acids at low pH: anion accumulation versus uncoupling[END_REF], anion accumulation is the primary toxic effect of organic acids. When present in too high concentrations, cells are unable to efficiently metabolise the acid while also being internally damaged [START_REF] Desbois | Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of action and biotechnological potential[END_REF]. Acetate can readily be metabolized by the cells via a one-step reaction producing acetyl-CoA. In contrast, butyrate, being a 4-C organic acid, is metabolized via a 5-step pathway producing two reducing equivalents in the form of NADH. One of these steps might be limiting, letting butyrate accumulate inside the cells at higher rate than does acetate, which can induce a lethal effect at lower concentrations. The more toxic effect of longer chain organic acid was also reported in the yeast Yarrowia lipolytica where the C50 (concentration of acid necessary to lower the growth rate by 50%) decreased with increasing carbon chain length [START_REF] Rodrigues | The Influence of Acetic and Other Weak Carboxylic Acids on Growth and Cellular Death of the Yeast Yarrowia lipolytica[END_REF].

Inhibition threshold of other strains

The behaviour of A. obliquus, A. protothecoïdes, C. reinhardtii CC-124 and CC-400 on increasing concentrations of acetic and butyric acid was assessed and compared to C. sorokiniana (Fig. 5, S6 and S7). Cultivation was performed at pH 6. Total acetate concentrations ranged from 0.43 to 4. C. sorokiniana exhibited the highest production rate on acetate (2.18 ± 0.02 g.L -1 .d -1 ) (Fig. 5A). Production rate of A. protothecoïdes increased from 0.26 ± 0.05 to 0.94 ± 0.06 g.L -1 .d -1 with increasing acetate concentration. A. obliquus, C. reinhardtii CC-124 and CC-400 production rates were relatively constant for all the tested acetate levels and remained lower than the other two strains. An inhibition threshold could be determined for each of the five micro-algae strains and ranged from 47 to 207 mg.L -1 . Resistance to acetic acid was different for all strains, with A. obliquus being inhibited above 47.2 mg.L -1 of AcOOH while A. protothecoïdes could stand an AcOOH concentration 4 times higher. C. reinhardtii CC-400 supported a higher initial concentration of acetic acid than C. reinhardtii CC-124 (150 mg.L -1 vs 100 mg.L -1 ).

As opposed to the behaviour on acetate, the rapp, Bu of all strains except C. sorokiniana sharply decreased with increasing concentrations of butyrate (Fig 5B) The results presented above could help choosing the appropriate strain and mixotrophic growth conditions in presence of VFAs, notably to allow efficient coupling of DF process with microalgal cultivation. Usually, dark fermentation is operated at an acidic pH around 5.5 [START_REF] Ghimire | A review on dark fermentative biohydrogen production from organic biomass: Process parameters and use of by-products[END_REF]. The fermentation of 10 g.L -1 glucose would be lead to around 1.7 g.L -1 acetate (total) and 3.5 g.L -1 butyrate (total) considering that the theoretical equation ( 5) [START_REF] Hawkes | Continuous dark fermentative hydrogen production by mesophilic microflora: Principles and progress[END_REF]:

4 + , -, + 2 -→ 3 + 2 + -+ -+ + 2 + 2 + + 8 + -+ 10 - (5)
This leads to AcOOH and BuOOH concentration around 278 mg.L -1 and 582 mg.L -1 at pH 5.5, far above the estimated threshold of this study. As the ROOH concentration depends on total VFA concentration and pH value, DF effluent should either be diluted or the pH should be adjusted to a high enough value to minimize ROOH concentrations with regard to the selected (or predominant) strain(s) and its resistance to organic acid and its most favourable growth conditions. Indeed, increasing the pH from 5.0 to 7.0 result in AcOOH and BuOOH concentration of 10.5 mg.L -1 and 21.9 mg.L -1 , enabling microalgae growth. Of course, adjustements should be made according to the VFA concentration in the effluent. The effect of a mixture of substrates however, which may influence the values of threshold concentrations, remains to be further investigated.

It was shown that all strains could assimilate efficiently acetate as long as the pH remained around neutral values. On the other hand, only C. sorokiniana and A.

protothecoïdes could completely consume butyrate although their biomass production rates remained quite low. The three other strains seemed to be able to assimilate butyrate, but their uptake was never complete and thus probably limited by either transport or metabolic capacity. Consequently, these other three strains should not be considered for the coupled process, although their carbon reserve productivity (lipids, carbohydrates) was not assessed in the present study. They may however present an interest for metabolic studies to explore the strain dependence for acetate and butyrate uptake and their associated enzymatic pathways. In fact, C. reinhardtii acetate uptake has been widely studied, but its ability to consume butyrate as a single substrate has not, and to the best of our knowledge, it is the first time that butyrate assimilation by C.

reinhardtii has been evidenced. The improved resistance to organic acids of the cell wall less strain (C. reinhardtii CC-400) was contrary to what we expected since VFA and other short chain fatty acids inhibit bacterial growth and induce cell death notably by damaging cell membranes [START_REF] Royce | The damaging effects of short chain fatty acids on Escherichia coli membranes[END_REF]. As literature is rather scarce on this specific substrate, answering this question would require further studies.

Conclusions

Mixotrophic growth on acetate or butyrate as a function of the initial pH was evaluated for several microalgal strains. C. sorokiniana was found to be the most productive strain on both substrates with the highest biomass yield. VFAs were found to be inhibitory when the undissociated acid form was too concentrated. A threshold concentration of undissociated acetic or butyric acid below which growth was possible was determined for each strain. Therefore, effluents should be either diluted or the initial pH increased to lower the inhibitory effect of these acids. Besides, studying further the model strain C. reinhardtii on butyrate could give more insight on the metabolic bottlenecks limiting butyrate assimilation.

Fundings

Statement of informed consent, human and animal rights

No conflicts, informed consent, or human or animal rights are applicable to this study. (expressed in mg.L -1 ) at initial pH 6.0 in mixotrophic conditions. (expressed in mg.L -1 ) at initial pH 6.0 in mixotrophic conditions.

Fig. 1 :

 1 Fig. 1:Apparent autotrophic productivity rapp, Auto (g.L -1 .d -1 ) of A. obliquus, A.

Fig. 2 :

 2 Fig. 2: Mixotrophic cultivation on 1.1 g.L -1 acetate and atmospheric CO2 of A. obliquus,

Fig. 3 :

 3 Fig. 3: Mixotrophic cultivation on 0.8 g.L -1 butyrate and atmospheric CO2 of A.

Fig. 4 :

 4 Fig. 4: Inhibition is caused by the undissociated acid form. Mixotrophic growth of C.

Fig. 5 :

 5 Fig. 5: Mixotrophic growth rates of A. obliquus, A. protothecoïdes, C. reinhardtii CC-

  . The threshold concentration was 25 mg.L -1 of BuOOH for most strains. A obliquus was the least resistant strain with growth inhibition at 12.5 mg.L -1 of BuOOH. Again, C. reinhardtii CC-400 supported an initial concentration of 72.5 mg.L -1 BuOOH while C. reinhardtii CC-124 was inhibited at 50 mg.L -1 .

JL received a

  PhD fellowship from European Union from the Occitanie region, France, with complementary funding from FEDER. This study was funded by the National Institute of Agricultural Research (INRA; since 2020 INRAE, National Research Institute for Agriculture, Food and Environment), and partly supported by the PHYCOVER project, funded by the French National Agency for Research (ANR-14-CE04-0011).

Fig. S2 :

 S2 Fig. S2: Growth curves of (A) A. obliquus, (B) A. protothecoïdes, (C) C. reinhardtii

Fig. S3 :Fig. S4 :

 S3S4 Fig. S3: Growth curves of (A) A. obliquus, (B) A. protothecoïdes, (C) C. reinhardtii

Fig. S5 :

 S5 Fig. S5: Growth curves of C. sorokiniana at various initial [BuOOH] (expressed in mg.L -1 ) at initial pH (A) 5.5, (B) 6.0, (C) 6.5 in mixotrophic conditions.

Fig. S6 :

 S6 Fig. S6: Growth curves of (A) A. obliquus, (B) and (C) A. protothecoïdes, (D) C.

Fig. S7 :

 S7 Fig. S7: Growth curves of (A) A. obliquus, (B) and (C) A. protothecoïdes, (D) C.

  measured at 750 nm. Values of Cf for growth on acetate were of 2.025 for A.

obliquus (R² = 0.965), 2.622 for A. protothecoïdes (R² = 0.970), 2.687 for C. reinhardtii CC-124 (R² = 0.937), 1.101 for C. reinhardtii CC-400 (R² = 0.922), 2.0745 for C. sorokiniana (R² = 0.999). Values of Cf for growth on butyrate were of 2.562 for A. obliquus (R² = 0.991), 1.864 for A. protothecoïdes (R² = 0.978), 3.1504 for C. reinhardtii CC-124 (R² = 0.965), 1.074 for C. reinhardtii CC-400 (R² = 0.9623) and 1.728 for C. sorokiniana (R² = 0.985).

  ). C. sorokiniana assimilated only 34.4 ± 5.9% of the initial acetate at pH 9. Acetate uptake was completely inhibited at pH 10 for all strains except for A. protothecoïdes which consumed 27.1 ± 3.4% of the acetate.Mixotrophic biomass yield (YM in gDW.gsubstrate -1 ) increased or remained constant with increasing initial pH except for A. protothecoïdes (Table1). C. sorokiniana and C.

reinhardtii CC124 exhibited the highest YM at pH 9.0 (3.88 ± 0.30 g.g -1 and 1.49 ± 0.10 g.g -1 respectively).YH remained relatively constant for all strains for each pH tested, except at pH 10.0. C. sorokiniana exhibited a higher YH at pH 6.0 and 7.0 (1.02 ± 0.04 and 1.19 ± 0.10 gDW.gsubstrate -1 ) than the other pH.

Table 2 :

 2 Biomass yields on 0.5 gC.L -1 butyrate. YM (g.g -1 ) stands for global mixotrophic yield. YH (g.g -1 ) is the estimated yield only due to heterotrophy. Standard deviations are given for 3 biological replicates. When no values are given, there was either no growth observed or no substrate consumed. However, while A. protothecoïdes could consume all acetate at pH 8 and 9, the strain removed only 68.4 ± 3.5 % and 10.3 ± 2.0 % butyrate at pH 8 and pH 9

	Strain	Initial pH	YM (g.g -1 )	YH (g.g -1 )
		5	NA	NA
		6	NA	NA
	A. obliquus	7 8	2.84 ± 0.84 3.72 ± 0.03	0.22 ± 0.03 1.03 ± 0.08
		9	4.30 ± 0.48	1.06 ± 0.12
		10	NA	NA
		5	NA	NA
		6	0.767 ± 0.06	-0.06 ± 0.10
	A. protothecoïdes	7 8	1.07 ± 0.07 1.11 ± 0.01	0.47 ± 0.04 0.74 ± 0.02
		9	NA	NA
		10	NA	NA
		5	NA	NA
		6	NA	NA
	C. reinhardtii 124	7 8	2.64 ± 0.22 3.28 ± 0.21	0.98 ± 0.06 1.38 ± 0.21
		9	7.86 ± 0.36	3.32 ± 0.21
		10	NA	NA
		5	NA	NA
		6	NA	NA
	C. reinhardtii 400	7 8	NA 1.87 ± 0.07	NA 0.72 ± 0.7
		9	4.82 ± 0.27	0.55 ± 0.09
		10	NA	NA
		5	NA	NA
		6	NA	NA
	C. sorokiniana	7 8	1.88 ± 0.13 2.11 ± 0.06	0.91 ± 0.09 0.42 ± 0.06
		9	11.66 ± 6.59	0.44 ± 0.03
		10	NA	NA

Butyrate uptake by A. protothecoïdes and C. sorokiniana was greatly affected by the initial pH (Fig.

3-B

). They were the only strains to completely consume butyrate at

Author contributions

All author contributed to the work either in the design of experiment, collecting or analysing data. All authors participated to the drafting of the article or to its revising.

All authors approved the final version of the manuscript submitted.

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