Auriane Cospain

Marie Faoucher

Aurélie Cauchois

Wilfrid Carre

Chloé Quelin

Christèle Dubourg

Keywords: CNOT1, holoprosencephaly, pancreas agenesis/hypoplasia, congenital malformation, post-mortem examination, fetal autopsy

Holoprosencephaly (HPE) is a clinically and genetically heterogeneous disease, which can be associated with various prenatal comorbidities not always detectable on prenatal ultrasound. We report on the case of a foetus carrying a semi-lobar HPE diagnosed at ultrasound, for which a fetal autopsy and a whole exome sequencing were performed following a medical termination of pregnancy. Neuropathological examination confirmed the semi-lobar HPE and general autopsy disclosed a total pancreas agenesis. Whole exome sequencing found the CNOT1 missense c.1603C>T, p.(Arg535Cys), occurring de novo in the foetus. The same variant was previously reported in five unrelated children. All individuals had HPE, and 4 out of 5 presented endo-and exocrine pancreatic insufficiency or total pancreas agenesis. CNOT1 encodes a subunit of the CCRN4-NOT complex, expressed at the early stage of embryonic development. This report is the first fetal description of Fetal Description of the Pancreatic Agenesis and Holoprosencephaly Syndrome associated to a specific CNOT1 variant ACCEPTED MANUSCRIPT / CLEAN COPY the phenotype associating HPE and pancreatic agenesis linked to the recurrent CNOT1 missense c. 1603C>T, p.(Arg535Cys). This finding strengthens the hypothesis of a specific recurrent variant associated with a particular phenotype of HPE and pancreas agenesis. The fetal autopsy that revealed the pancreas agenesis was crucial in guiding the genetic diagnosis and enabling accurate genetic counselling.

Introduction:

HPE can be diagnosed with ultrasound from the first trimester of pregnancy [START_REF] Syngelaki | Challenges in the diagnosis of fetal non-chromosomal abnormalities at 11-13 weeks[END_REF][START_REF] Sepulveda | First trimester screening for holoprosencephaly with choroid plexus morphology ('butterfly' sign) and biparietal diameter[END_REF] . HPE is clinically and genetically heterogeneous. Both environmental and genetic causes have been identified such as chromosomal abnormalities, teratogenic exposure during pregnancy (poorly controlled diabetes, infections, alcohol and cigarette smoking, drugs), and single-gene disorders [3][START_REF] Cohen | Teratogenesis of holoprosencephaly[END_REF][START_REF] Croen | Risk factors for cytogenetically normal holoprosencephaly in California: a population-based case-control study[END_REF] . For molecular genetic anomalies, inheritance pattern is mostly autosomal with dominant transmission and concerns major HPE genes (SHH, ZIC2, SIX3, FGFR1). Other rare inheritance patterns described involves an autosomal recessive inheritance and concerns minor HPE genes (STIL, DISP1, TGIF1, FGF8), while oligogenic inheritance could explain the variable expressivity in several families [START_REF] Ming | Multiple hits during early embryonic development: digenic diseases and holoprosencephaly[END_REF][START_REF] Dubourg | Recent advances in understanding inheritance of holoprosencephaly[END_REF][START_REF] Kim | Integrated clinical and omics approach to rare diseases: novel genes and oligogenic inheritance in holoprosencephaly[END_REF] .

De novo variants in CNOT1 (CCR4-NOT Transcription Complex Subunit 1, OMIM #604917) have been associated with neurodevelopmental delay and a wide spectrum of comorbidities, such as seizures, hypotonia, behavioral problems and organ dysfunction [START_REF] Vissers | De Novo Variants in CNOT1, a Central Component of the CCR4-NOT Complex Involved in Gene Expression and RNA and Protein Stability, Cause Neurodevelopmental Delay[END_REF] . The specific missense c.1603C>T, (p.Arg535Cys) has been reported in five individuals with a singular phenotype associating partial/semi-lobar HPE, pancreas agenesis or neonatal pancreatic insufficiency with diabetes mellitus, and gallbladder agenesis in two cases [START_REF] De Franco | A Specific CNOT1 Mutation Results in a Novel Syndrome of Pancreatic Agenesis and Holoprosencephaly through Impaired Pancreatic and Neurological Development[END_REF][START_REF] Kruszka | A CCR4-NOT Transcription Complex, Subunit 1, CNOT1, Variant Associated with Holoprosencephaly[END_REF] . A sixth case of semi-lobar HPE, pancreas and gallbladder agenesis was reported in 2017 with no molecular diagnosis in the genes known to be associated with pancreatic aplasia or neonatal diabetes but CNOT1 was not assessed. For these patients, the pancreatic anomaly was detected postnatally in the first days of life.

We report on a fetus with semi-lobar HPE prenatally diagnosed, pancreas agenesis identified at fetal autopsy and associated to the specific CNOT1 variant c.1603C>T, (p.Arg535Cys).

ACCEPTED MANUSCRIPT / CLEAN COPY

Case report:

Pregnancy

A genetic consultation took place following observation of abnormalities in an ultrasound examination in the first trimester of pregnancy, for a 27-year-old, gravida 1 para 0 woman. The parents were unrelated and had no relevant personal or familial medical history.

At the routine first trimester ultrasound examination, the clinician suspected a malformation of the cephalic pole and referred the pregnant woman to the gynaecology department of the Rennes University Hospital. A high-accuracy ultrasound examination was performed at the estimated term of 15+2 weeks of gestation and evidenced a progressive intrauterine monofetal pregnancy with semilobar holoprosencephaly and a large median facial cleft. Nuchal translucency was at 1.40 mm (5 th percentile), cranio-caudal length was 75.2 mm (75 th percentile), and estimated fetal weight was 71 g (40 th percentile) [START_REF] Hadlock | Estimation of fetal weight with the use of head, body, and femur measurements--a prospective study[END_REF] .

The parents requested an assisted abortion, which was accepted by the maternity centre of the ethics committee and took place at 17+1 weeks of gestation.

Post-mortem examination

Post-mortem examination of the placenta revealed a small placenta, with weight corresponding to that of a 13 weeks gestation (55g). Microscopic examination was normal.

Genetic investigations

Genetic investigations were performed after delivery. Parental information and consent were assessed.

The fetal karyotype realised on blood from the umbilical cord was normal (46,XX).

An array-CGH analysis showed a 414 Kb heterozygous deletion in the 15q11.2 chromosomal region (arr[GRCh37] 15q11.2(22765628_23179948)x1). This deletion encompasses the OMIM genes NIPA1 and NIPA2, and was solely considered as a locus for susceptibility to neurodevelopmental disorders with incomplete penetrance and variable phenotypes.

A MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) analysis was performed for the genes most frequently implicated in holoprosencephaly (SHH, ZIC2, SIX3, TGIF1, PTCH1, GLI2, TMEM1 and FBXW11) and found neither duplication nor deletion in these genes.

Whole exome sequencing found the missense heterozygous variant c.1603c>T, p.(Arg535Cys) in the CNOT1 gene (NM_016284.5). Sanger analysis carried out on both parents revealed that the variant occurred de novo in the fetus. The variant c.1603c>T was classified as pathogenic (ACMG class5 [START_REF] Richards | Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology[END_REF] ) based on the following argument: reported in ClinVar with concordant phenotype, absent from GnomAD, affected a residue highly conserved across species (up to C. elegans), deleterious effect on protein function with in silico prediction tools used (Align GVGD, SIFT, Mutation Taster and PolyPhen accessed through AlamutVisual). No other significant variant was found.

Discussion:

ACCEPTED MANUSCRIPT / CLEAN COPY

We report here on the sixth proband with the CNOT1 variant c.1603C>T, p.(Arg535Cys) and a similar phenotype to individuals previously described. All patients reported with the same variant in PubMed presented HPE, and pancreas anomalies (except one who had no pancreatic insufficiency nor diabetes mellitus at 6.5 years old). Intrauterine growth retardation was reported for 4/6 patients.

The phenotypes are shown in Table 1.

CNOT1 encodes a subunit of the CCR4-NOT complex, implicated in the post-transcriptional mRNA degradation and expressed in early embryonic development [START_REF] De Franco | A Specific CNOT1 Mutation Results in a Novel Syndrome of Pancreatic Agenesis and Holoprosencephaly through Impaired Pancreatic and Neurological Development[END_REF][START_REF] Kruszka | A CCR4-NOT Transcription Complex, Subunit 1, CNOT1, Variant Associated with Holoprosencephaly[END_REF] . CNOT1 contains two HEAT-like repeat domains in C-terminal, providing a rigid scaffold to the complex subunit formed by CNOT1 and the heterodimer CNOT2-CNOT3 [START_REF] Boland | Structure and assembly of the NOT module of the human CCR4-NOT complex[END_REF] Prenatal diagnosis of HPE should lead to specific genetic counselling, as HPE is a severe condition linked to multiple aetiological factors. A rigorous clinical evaluation of the family history, environmental factors, and associated features should be the first step of the consultation [START_REF] Mercier | Genetic counseling and 'molecular' prenatal diagnosis of holoprosencephaly (HPE)[END_REF] . While HPE can be diagnosed by ultrasound at the first trimester of pregnancy, the pancreas is an organ that is difficult to examine by ultrasound and normal reference ranges allow a reliable assessment after 19 weeks of gestation 16 . In this case report, pancreas agenesis has not been evidenced at the 17th gestational week and was discovered at the post-mortem examination.

ACCEPTED MANUSCRIPT / CLEAN COPY

In conclusion, this sixth consistent description of an association between the CNOT1 variant c.1603C>T, p.(Arg535Cys) and a particular phenotype of HPE and pancreas agenesis strengthens the hypothesis of a specific recurrent nonsense variant in CNOT1. As the pancreas is difficult to explore through prenatal ultrasound examination or in-utero MRI examination during the pregnancy, fetal autopsy remains a major element to guide genetic diagnosis and to allow accurate genetic counselling.

16. Kivilevitch, Z., Achiron, R., Perlman, S. & Gilboa, Y. The Normal Fetal Pancreas. J. Ultrasound Med. Off. J. Am. Inst. Ultrasound Med. 36, 1997-2005 (2017).

Legends:

ACCEPTED MANUSCRIPT / CLEAN COPY

  Figure 1. X-rays revealed short tubular bones consistent with an estimated gestational age (EGA) of

  . The variant c.1603C>T, p.(Arg535Cys) is located in the HEAT domain of the protein. In a cohort study of 39 individuals with the CNOT1 variant distributed throughout the protein, Visser et al. 9 found one other variant in the HEAT domain (c.1924C>G, p.(Gln642Glu)). The individual also had de novo variants in ATP6V0C, XPO7 and ETNK1, and presented with a severe intellectual deficiency, hypotonia, Lennox-Gastaut epilepsy and an Arnold-Chiari malformation requiring surgery at 14 months old, but neither pancreatic disorder nor HPE were reported. De Franco et al. 10 suggested a potential effect of the c.1603C>T, p.(Arg535Cys) variant in the Sonic Hedgehog pathway at an early stage of embryonic stem cell differentiation. The variant could maintain an increased expression of SHH by maintaining its inhibition activity on Gata4 and Gata6 transcriptor factors and, therefore, blocking the differentiation of pluripotent cells into pancreatic cells.

Figure 1 :

 1 Figure 1: Photographs of the fetopathological and neuropathological evaluation. A and B: dysmorphic

Table 1 :

 1 Phenotypic description of the reported case and five other individuals reported with the CNOT1 variant p.(Arg535Cys). Brain MRI showed dysplastic frontal horns of the lateral ventricles, missing septum pellucidum, broadly joined cella media of the lateral ventricles, and hypoplasia of the corpus callosum (absent frontal parts).

	ACCEPTED MANUSCRIPT / CLEAN COPY

*

Acknowledgment:

We are grateful to Sylvie Odent and Marie De Tayrac for their involvement and expertise in the clinical and molecular diagnosis of this fetus's disease.

The Authors declare that there is no conflict of interest.

No funding source.


Marie-Émilie Dourthe

Karima Yakouben

Delphine Chaillou

Emmanuelle Lesprit

Jean-Hugues Dalle

André Baruchel
email: andre.baruchel@aphp.fr

Marie-Émilie Dourthe

Marie-Émilie Dourthe

Jean-Hugues Dalle

M.-É Dourthe

J.-H Dalle

Cd3

Linker Linker

E Génération

CAR-T cells : indications actuelles en pédiatrie et perspectives de développement

Keywords:

Les CARs sont des récepteurs composés d'un domaine de liaison extracellulaire se liant à un antigène défini spécifique de la cellule tumorale cible, combiné à un domaine de signalisation intracellulaire d'un lymphocyte T. Le domaine de liaison à l'antigène consiste en la combinaison de chaines protéiques issues de la région variable d'une chaine lourde (VH) et d'une chaine légère (VL) d'une immunoglobuline reliée entre elles par un « linker » de petite taille (de 10 à 25 AA) pour former une protéine de fusion : scFv (pour single chain fragment variable). Cette protéine de fusion linéaire est hautement spécifique de son antigène cible. Le récepteur chimérique peut donc reconnaitre une cellule tumorale portant cet antigène cible sans que celui-ci ne doive être présenté par une molécule du Complexe Majeur d'Histocompatibilité. Des antigènes tumoraux de nature non protéique peuvent aussi être ciblés. Le domaine intracellulaire du CAR transmet l'activation et les signaux de costimulation par l'intermédiaire de la chaine zeta du CD3 (signal 1) et de molécules de costimulation nécessaires aux fonctions effectrices et à la multiplication du lymphocyte T (signal 2) [START_REF] Ramos | CAR-T Cell Therapy for Lymphoma[END_REF]. Le processus de production des CAR T cells repose sur le respect de règles de bonnes pratiques de fabrication (« GMP ») permettant d'assurer la sécurité, l'efficacité et la reproductibilité de la production. Les lymphocytes du patient ou d'un donneur sain sont prélevés par leucaphérèse puis isolés et activés par des anticorps anti CD3 et/ou anti CD28. Parallèlement une construction génique contenant le scFv et les molécules de costimulation est intégrée à un vecteur de type lentivirus ou gamma-retrovirus dans la plupart des cas. L'utilisation d'un gamma retrovirus permet un processus simplifié par rapport au lentivirus qui nécessite des transfections répétées. Ce vecteur ADN ou ARN est ensuite introduit dans les lymphocytes du patient ou du donneur sain après stimulation ex vivo, ce qui facilite la transduction du vecteur. Une fois transduites les cellules monospécifiques pour le scFV sont amplifiées jusqu'à un nombre suffisant pour leur application clinique. Ils donnent lieu aux CAR autologues lorsqu'il s'agit de lymphocytes du patient ou aux CAR allogéniques lorsqu'il s'agit de lymphocytes d'un donneur sain. Ils sont administrés au patient après contrôle de fonctionnalité et de l'absence de contamination infectieuse. La purification des lymphocytes T, leur modification génétique puis leur expansion en culture nécessitent une durée totale de production de l'ordre de 2 à 3 semaines [START_REF] Davila | Biology and clinical application of CAR T cells for B cell malignancies[END_REF][START_REF] Wang | Manufacture of tumorand virus-specific T lymphocytes for adoptive cell therapies[END_REF]. Il est important de noter que le produit final, bien que constitué de cellules vivantes, a un statut de médicament (« living drug ») puisqu'il s'agit de cellules transformées.

Évolution des CAR T cells

Depuis leur développement initial en 1989 les CAR T cells ont évolué en générations successives suivant les caractéristiques de leur domaine intracellulaire (Figure 1) [START_REF] Zhang | Engineering CAR-T cells[END_REF]. Les CAR de 1 re génération contiennent uniquement la sous-unité zeta de la molécule CD3 du complexe TCR/CD mais ne permettent pas de générer un effet anti tumoral satisfaisant [START_REF] Cooper | T-cell clones can be rendered specific for CD19: toward the selective augmentation of the graftversus-B-lineage leukemia effect[END_REF]. Les CAR de 2 e génération contiennent, en plus de la sous-unité zeta de la molécule CD3, un autre gène exprimant le domaine de transduction du signal CD137 ou CD28 ou 4-1 BB [START_REF] Milone | Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo[END_REF][START_REF] Carpenito | Control of large, established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28 and CD137 domains[END_REF]. Ils ont montré leur supériorité dans leurs capacités d'expansion et de persistance à long terme ainsi que dans l'obtention de réponses cliniques objectives par rapport aux CAR-T de première génération [START_REF] Savoldo | CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients[END_REF]. Les CAR de 3 e génération utilisent 2 unités de costimulation au choix parmi CD28, 4-1BB, ICOS, OX40, CD27, NKG2D. L'addition de molécules de costimulation supplémentaires permettrait une augmentation de la prolifération ainsi que de la survie des CAR T cells [START_REF] Van Der Stegen | The pharmacology of second-generation chimeric antigen receptors[END_REF]. Les CAR de 4 e génération contiennent en plus une cassette d'expression génique induite par le CAR (TRUCK), capable de sécréter des cytokines suite à la reconnaissance de l'antigène par le CAR [START_REF] Pegram | IL-12-secreting CD19-targeted cord bloodderived T cells for the immunotherapy of B-cell acute lymphoblastic leukemia[END_REF]. Actuellement, dans la plupart des études utilisant des CAR autologues, les patients reçoivent une chimiothérapie de lymphodéplétion par cyclophosphamide et fludarabine suivie de l'injection des CAR T cells. En effet les 8 premières études rapportant les 38 premiers patients avec lymphome non from 60 to 90% in phase I-II studies in patients with second relapse or more or with refractory disease. Persistent remissions and even cures have been observed. These very good results could lead to use this treatment in first line for patients with very high-risk disease. However, CAR-T cells production, costs and adverse events management represent major issues for the future of this therapeutic. The occurrence of CD19 negative relapses has led to develop bispecific CAR-T cells. Allogeneic CAR would permit to obtain a "CAR garage" off the shelf available from the diagnosis. Perspectives for CAR-T cells are immense but will involve technological progresses around the CAR conception and production, leading to further improve results in leukemias (ALL but also AML) and lymphomas and hopefully to the emergence of efficacy in childhood solid tumors.

Cet article fait partie du numéro supplément Les cellules CAR-T : une révolution thérapeutique ?

réalisé avec le soutien institutionnel des partenaires Gilead : Kite et Celgene.

Bulletin du

CANCER

Article

hodgkinien ayant reçu des CAR T cells de première ou deuxième génération sans conditionnement préalable n'ont pas présenté de réponse objective [START_REF] Davila | Biology and clinical application of CAR T cells for B cell malignancies[END_REF]. Une étude de phase I a confirmé l'intérêt de l'utilisation d'une chimiothérapie de lymphodéplétion pour obtenir une meilleure expansion et une meilleure persistance des CAR T cells. La supériorité de l'association cyclophosphamide et fludarabine sur le cyclophosphamide seul a été confirmée dans une étude incluant des patients adultes présentant une LAL B en rechute ou réfractaire avec une meilleure persistance des CAR T cells et une meilleure survie sans maladie [START_REF] Gardner | Intent-to-treat leukemia remission by CD19 CAR T cells of defined formulation and dose in children and young adults[END_REF][START_REF] Turtle | Addition of Fludarabine to Cyclophosphamide Lymphodepletion Improves In Vivo Expansion of CD19 Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells and Clinical Outcome in Adults with B Cell Acute Lymphoblastic Leukemia[END_REF].

Indications actuelles en pédiatrie

L'utilisation de CAR T cells a pour objectifs de cibler un antigène associé aux tumeurs. L'antigène doit être le plus spécifique possible de la cellule maligne afin d'obtenir un effet sélectif sans effet secondaire sur les cellules saines. Le CD19 est considéré comme étant proche de l'antigène idéal. Il s'agit d'une protéine exprimée à la surface des cellules B et de leurs précurseurs ainsi que dans la majorité des leucémies aigues lymphoblastiques B (LAL-B) de l'enfant. Le CD19 n'est pas exprimé par les cellules souches hématopoïétiques. Son expression est donc restreinte à une lignée cellulaire dont l'absence peut être palliée par des injections substitutives d'immunoglobulines polyvalentes. Les LAL-B CD19+ sont ainsi l'indication de choix en pédiatrie pour l'utilisation des CAR T cells CD19 (Tableau 1).

Leucémie aiguë lymphoblastique B : cibler le CD19 (Tableau 2)

Les premières observations pédiatriques

Deux patients, un présentant une LAL-B en 2 e rechute à 2 ans du diagnostic initial et un présentant une LAL-B en 2 e rechute post allogreffe de moelle, ont reçu une injection de CAR T cells transduits avec un lentivirus comportant les gènes codant pour un CAR anti CD19 et 2 molécules de costimulation du lymphocyte T (CD3 zeta et 4-1BB). Le taux d'expansion des CTL étaient 1000 fois supérieur au taux initial de cellules injectées. Les cellules étaient détectées dans la moelle osseuse et dans le liquide céphalo rachidien. Une rémission complète a été obtenue chez les 2 patients. La première patiente est actuellement considérée comme guérie puisque sa survie sans rechute est supérieure à 6 ans. Le second

CANCER

Article

a présenté une rechute sous la forme de cellules leucémiques CD19 négatives, 2 mois après le traitement [START_REF] Grupp | Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia[END_REF].

Études pilotes

Au National Cancer Institute (Bethesda, Ma, États-Unis), un premier essai de phase I d'escalade de dose a étudié 21 patients. Ces patients présentaient une LAL-B ou un lymphome non hodgkinien et il s'agissait de CAR T cells CD19 autologues transduits avec un retrovirus comportant le gène codant pour un scFV anti-CD19 plus les gènes codant pour CD28 et CD3 zeta. La dose maximale tolérée a été définie à 1x10 6 CAR T CD19 par kg. Tous les effets secondaires ont été réversibles sans aplasie B secondaire [START_REF] Lee | T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial[END_REF]. 14 % des patients ont présenté un syndrome de relargage cytokinique (CRS, voir plus loin). Quatorze sur 21 patients ont obtenu une réponse complète à J28 post injection. Douze sur 20 patients avec une LAL B étaient en rémission moléculaire. Dix patients ont ensuite été traités par une allogreffe de moelle et étaient toujours en rémission à un an de l'injection. Deux patients qui n'avaient pas bénéficié d'une allogreffe de moelle ont rechuté sous la forme d'une LAL B CD19-. À l'Université de Pennsylvanie, une cohorte de 30 patients présentant une LAL B en rechute ou réfractaire (25 de moins de 22 ans, 5 de plus de 26 ans) a été traitée. Parmi les 30 patients, 18 présentaient une rechute post allogreffe de moelle, présentaient une maladie réfractaire au blinatumomab (anticorps bispécifique « BiTE »). Les patients recevaient de 0,76 à 20,6 x 10 6 CTL019 par kg (CAR T cells de 2 e génération, transduits avec un lentivirus codant pour un scFV anti CD19 et pour les domaines CD3 zeta et 4-1 BB) après une chimiothérapie de lymphodéplétion. 90 % des patients (27/30 patients) étaient en rémission morphologique complète à 1 mois. Parmi les patients en rémission cytologique 19 ont conservé leur réponse sur une durée médiane de suivi de 7 mois. Parmi les 3 patients réfractaires au blinatumomab, 2 ont obtenu une rémission complète après l'injection de CAR-T cells. Les 2 patients qui présentaient des blastes dans le LCR au moment de la réinjection ont également obtenu une réponse complète y compris au niveau du système nerveux central. À 6 mois, la survie sans événement était de 67 % (intervalle de confiance 95 % : 51 à 88 %) et la survie globale de 78 % (IC 95 % : 65 à 95 %). La probabilité de persistance des CTL019 à 6 mois était de 68 % (IC 95 % : 50 à 92 %). Parmi les 18 patients traités par CTL019 après allogreffe de moelle la survie sans événement et la survie globale ne différaient pas de façon significative de l'ensemble des patients de l'étude. Après traitement par CTL019 5 patients ont reçu une thérapeutique supplémentaire dont 3 une allogreffe de moelle en rémission. Les effets secondaires rapportés étaient de 2 ordres : aigus et à long terme. L'effet secondaire majeur aigu était le syndrome de relargage des cytokines (CRS) associant élévation des cytokines inflammatoires, activation des lymphocytes T et prolifération. Le CRS était mineur à modéré chez 22 patients et TABLEAU 1

Nombre d'essais recensés dans le monde (à gauche) et en France (à droite) chez l'enfant d'après

Indications émergentes en pédiatrie

Par ailleurs, de nouvelles cibles se développent :

-Pour permettre de lutter contre l'émergence de cellules leucémiques CD19 -après traitement par CAR T cells CD19. -Pour cibler d'autres pathologies lymphoïdes (LAL T, lymphome de Hodgkin) ou myéloïdes (LAM). -Pour cibler des tumeurs solides comme le neuroblastome.

Leucémies aiguës lymphoblastiques B : cibler le CD22

Le marqueur de surface CD22 est exprimé sur la plupart des cellules leucémiques de la lignée B. La perte de l'antigène CD19, dont les mécanismes sont divers, est logiquement à l'origine d'une résistance à l'immunothérapie anti CD19 [START_REF] Jacoby | Lineage Switch As a Relapse Mechanism of Pre-B Acute Lymphoblastic Leukemia Following CD19 CAR[END_REF][START_REF] Sotillo | Convergence of Acquired Mutations and Alternative Splicing of CD19 Enables Resistance to CART-19 Immunotherapy[END_REF]. Des études pilotes sont actuellement en cours chez l'enfant afin de tester la faisabilité d'un traitement par CAR T cells CD22+ dans le cadre de la prise en charge de LAL B réfractaire ou en rechute. Des constructions de CAR se basant sur différents épitopes de CD22 ont permis de démontrer une potentielle efficacité en l'associant aux domaines de signalisation du TCR 4-1 BB et CD28 [START_REF] Haso | Anti-CD22-chimeric antigen receptors targeting B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia[END_REF]. Une étude de phase I avec escalade de dose a rapporté les résultats obtenus chez 21 patients d'âge pédiatrique et adulte incluant 17 patients préalablement traités par immunothérapie anti CD19. À une dose supérieure à 1 X 10 6 CD22-CAR T cells par kg, 11 patients sur 15 ont obtenu une rémission complète. La durée médiane de rémission était de 6 mois. Les rechutes étaient associées à une diminution de la densité d'expression du CD22 [START_REF] Fry | CD22-targeted CAR T cells induce remission in B-ALL that is naive or resistant to CD19-targeted CAR immunotherapy[END_REF]. Un essai est actuellement ouvert à Stanford testant un CAR bispécifique antiCD19 /anti CD22 (NCT03241940) Actuellement en France aucun essai thérapeutique n'est ouvert se basant sur ce traitement chez l'enfant.

Leucémie aigüe lymphoblastique T : cibler le CD5 et/ou le CD7

Problématique

Étendre l'indication des CAR T cells aux pathologies malignes T est problématique car la plupart des marqueurs T de surface pouvant être ciblés sont partagés par les cellules T normales et pathologiques. Cibler un marqueur T comme le CD5 ou le CD7 conduirait à une aplasie T et à une « lutte fratricide » à l'origine d'une destruction des cellules injectées. Cependant des études in vitro et précliniques montrent la faisabilité de cette démarche. Après cette « lutte fratricide » transitoire, les lymphocytes T activés transduits avec un CAR CD5 s'expandent. Ils ont la capacité de reconnaitre et tuer des lignées de cellules T malignes, des cellules lymphoblastiques T primaires et de contrôler une maladie progressive dans des modèles murins de xénogreffe. La limitation de leur efficacité est due à une perte de l'expression du CD5 à la surface de cellules cibles [START_REF] Mamonkin | A T-cell-directed chimeric antigen receptor for the selective treatment of T-cell malignancies[END_REF].

Perspectives

Afin de réduire la « lutte fratricide » au cours de l'expansion des cellules T transduites plusieurs méthodes sont utilisées en préclinique : bloquer l'expression du CD7 par l'intermédiaire d'un PEBL (protein expression blocker) ou générer une disruption du gène CD7 au sein de lymphocytes T exprimant le CAR [START_REF] Gomes-Silva | CD7-edited T cells expressing a CD7-specific CAR for the therapy of T-cell malignancies[END_REF] sans compromettre leurs fonctions cytotoxiques. Actuellement il existe un essai de phase I ouvert aux États-Unis utilisant les CAR CD5 (NCT03081910).

Leucémie aiguë myéloïde : cibler le CD33 et/ou le CD123

Le CD33 est un marqueur présent sur les cellules de leucémies aigues myéloïdes (LAM) dans 87 % des cas mais également sur les progéniteurs myéloïdes normaux. Il est considéré comme une cible de choix depuis l'utilisation du gemtuzumab ozogamycin, anticorps monoclonal anti CD33 conjugué à l'immunotoxine calicheamicin, en combinaison avec de la chimiothérapie dans les LAM. L'utilisation de CAR T cells CD33 dans des modèles précliniques murins de LAM conduit à une éradication des blastes myéloïdes humains mais également à une myélotoxicité sévère. Afin d'éviter cet effet secondaire à long terme, des CAR T cells CD33 sont développés de manière à être exprimés de façon transitoire par l'utilisation d'un ARN modifié. Cette approche pourrait être utilisée pour obtenir une réponse satisfaisante avant allogreffe de moelle [START_REF] Kenderian | CD33-specific chimeric antigen receptor T cells exhibit potent preclinical activity against human acute myeloid leukemia[END_REF]. Le CD123 est un marqueur présent dans 78 % des LAM, mais également sur les progéniteurs et les cellules hématopoïétiques matures des cellules de la lignée myéloïde. Il est une cible de choix en s'attaquant aux cellules souches leucémiques. Des modèles précliniques montrent une efficacité in vivo de CAR Bulletin du CANCER Article bispécifiques CD33/CD123 de 2 e génération et dont l'expression est uniquement transitoire [START_REF] Cartellieri | Switching CAR T cells on and off: a novel modular platform for retargeting of T cells to AML blasts[END_REF]. L'expression de NKG2DL à la surface des cellules de LAM est rapportée dans plus de 2/3 des cas. Des lymphocytes T autologues ont été modifiés afin d'exprimer un CAR comprenant un récepteur NKG2D associé à la chaine zeta du CD3. L'avantage est que les molécules NKG2DL sont très peu voire pas exprimées à la surface des cellules de tissu sain, ce qui rend ce traitement très spécifique des cellules tumorales. Cette technologie a été utilisée avec succès chez un patient de 52 ans présentant une LAM en rechute [START_REF] Sallman | NKG2D-based chimeric antigen receptor therapy induced remission in a relapsed/refractory acute myeloid leukemia patient[END_REF].

Lymphomes B : cibler le CD20

Le CD20 est un antigène présent à la surface des cellules B du stade pré B au lymphocyte B mature. Il est un marqueur de surface pour les lymphomes B comme le lymphome B diffus à grandes cellules. Les anticorps monoclononaux type rituximab ont transformé le pronostic des lymphomes B folliculaires et des DLBCL. Des essais précoces sont en cours pour cibler les lymphomes B réfractaires de l'adulte par des CAR T cells CD20+. Des CARs de première génération CD20+ ont été utilisés dans 2 études publiées avec des réponse obtenues respectivement pour 2/7 patients atteints d'un lymphome folliculaire ou du manteau et 0/2 patients atteints d'un lymphome B diffus à grandes cellules en rechute [START_REF] Ramos | CAR-T Cell Therapy for Lymphoma[END_REF].

Lymphome de Hodgkin et lymphome anaplasique à grandes cellules : cibler le CD30

Le CD30 est un antigène présent dans les pathologies lymphoïdes type lymphome de Hodgkin (LH) et lymphome anaplasique à grandes cellules (ALCL). Une étude de phase I d'escalade de dose a été menée chez 9 patients réfractaires ou en rechute d'un LH ou d'un ALCL. Une injection de CAR T cells CD30+ exprimant la molécule de costimulation CD28 a été réalisée sans chimiothérapie préalable. Aucune toxicité n'a été attribuée aux CAR T cells. Sur les 7 patients présentant un LH, un patient a obtenu une rémission complète plus de 2 ans et demi après la 2 e injection, un patient pendant 2 ans et 3 ont connu une stabilisation de la maladie. Sur les 2 patients présentant un ALCL, un patient a été mis en rémission complète pendant 9 mois après la 4 e injection [START_REF] Ramos | Clinical and immunological responses after CD30-specific chimeric antigen receptor-redirected lymphocytes[END_REF]. Actuellement, des essais cliniques précoces de CAR CD30 sont en cours, notamment aux États-Unis, dans les lymphomes Hodgkiniens et non hodgkiniens réfractaires CD30+. En France, aucun essai n'est ouvert dans cette indication, ni chez l'enfant, ni chez l'adulte.

Tumeurs solides : identifier la cible spécifique

Problématique

Plusieurs cibles surexprimées dans les tumeurs solides de l'adulte font l'objet de CAR T cells dédiées. La plupart des antigènes associés aux tumeurs sont également présents au sein de cellules normales. Cibler des antigènes de surface présents de façon non exclusive sur les cellules malignes conduit à des effets secondaires à court et/ou long termes plus ou moins acceptables. avec une augmentation des effets « on target / off tumor », soit une augmentation de la toxicité [START_REF] Castellarin | Driving cars to the clinic for solid tumors[END_REF]. De plus, le microenvironnement tumoral est à l'origine de 3 types de barrières empêchant une bonne accessibilité des CARs à la tumeur : environnementale (dysfonction des cellules endothéliales, hypoxie), inflammatoire (recrutement de cellules immunosuppressives, sécrétion de TGF beta, et de leucotriènes), et immunosuppressive (expression de ligands de PD -1). Chez l'adulte l'utilisation de CAR T cells ciblant le récepteur tyrosine kinase ERBB2/HER2 a conduit à un décès chez le premier patient traité. Ce décès a été expliqué par la présence de cellules ERBB2+ à la surface de l'épithelium pulmonaire, conduisant à une défaillance pulmonaire et un syndrome de relargage cytokinique. Une défaillance hépatique est survenue après l'utilisation de CAR T cells ciblant le carbonic anhydrase IX (CAIX), antigène présent à la surface des cellules de carcinome rénal mais également sur l'épithélium biliaire sain.

Neuroblastome

Une des cibles actuellement étudiées dans les tumeurs solides est le GD2, ganglioside présent à la surface des neuroblastes mais également en moindre proportion sur les cellules nerveuses périphériques et le cervelet. L'utilisation sur des modèles précliniques de CAR T cells ciblant le GD2 a conduit à une neurotoxicité fatale [START_REF] Richman | High-Affinity GD2-Specific CAR T Cells Induce Fatal Encephalitis in a Preclinical Neuroblastoma Model[END_REF]. Un essai de phase I a rapporté l'expérience de CAR GD2 de 1 re génération chez des patients atteints d'un neuroblastome. Sur 8 patients évaluables 2, ont obtenu une réponse objective. Cependant l'utilisation de CAR de 2 e génération a été décevante avec une absence de réponse chez 11 patients après la 6 e semaine de traitement et l'absence de persistance des CAR [START_REF] Majzner | Harnessing the Immunotherapy Revolution for the Treatment of Childhood Cancers[END_REF].

Glioblastome

Une revue a rapporté récemment 3 études utilisant des CAR T cells en traitement des glioblastomes, pathologie dont la durée médiane de survie à la rechute n'excède pas 9 mois [START_REF] Migliorini | CAR T-Cell Therapies in Glioblastoma: A First Look[END_REF]. Une étude de phase I d'escalade de dose a évalué la faisabilité de l'administration de CAR T cells ciblant HER2 chez des patients présentant un glioblastome progressif sans lymphodéplétion préalable. Dix-sept patients ont été inclus dont 7 de moins de 18 ans avec une durée médiane de suivi de 8 mois (10 semaines-29 mois). Sur 16 patients évaluables, 1 a obtenu une réponse partielle pendant 9 mois, 7 une maladie stable pendant 8 semaines à 29 mois, 8 ont progressé. La survie globale médiane était de 11,1 mois (IC95 %, 4,1-27,2) après l'injection des CAR T cells [START_REF] Ahmed | HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor-Modified Virus-Specific T Cells for Progressive Glioblastoma: A Phase 1 Dose-Escalation Trial[END_REF]. L'injection locale de CAR T cells ciblant la sous unité a2 du récepteur de l'interleukine 13 dans les glioblastomes a montré une activité clinique sans toxicité notable (qui aurait pu être attendue après injection par voie systémique) [START_REF] Brown | Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy[END_REF]. L'injection intra tumorale pourrait être une voie d'amélioration dans l'utilisation des CAR T cells dans les tumeurs du système nerveux central. Enfin, une étude de phase I a évalué l'utilisation de CAR T cells EGFRvIII chez des patients présentant un glioblastome résiduel ou en rechute. Cette étude a montré la faisabilité, sans CRS ni autre toxicité, de l'administration de CAR T cells dans cette indication.

CANCER

Article

Elle a également permis de montrer que l'injection intraveineuse de ces lymphocytes T modifiés avaient la capacité de passer la barrière hématoencéphalique car ils étaient retrouvés au sein de la tumeur [START_REF] Choi | Engineering Chimeric Antigen Receptor T cells to Treat Glioblastoma[END_REF].

Sarcomes

Une étude de phase I/II a évalué la faisabilité de CAR ciblant HER2 dans les sarcomes. Dix-neuf patients ont été inclus dont 12 de moins de 18 ans. Sur 17 patients évaluables, 4 ont présenté une maladie stable pendant 12 semaines à 14 mois sans toxicité significative [START_REF] Ahmed | Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2) -Specific Chimeric Antigen Receptor -Modified T Cells for the Immunotherapy of HER2-Positive Sarcoma[END_REF].

Perspectives de développement et moyens

Place dans l'arsenal thérapeutique des LAL B

Actuellement, l'indication validée aux États-Unis (et en attente en Europe) des CAR T cells est le traitement des LAL-B CD19+ réfractaires ou en 2 e rechute ou plus, chez des patients de moins de 25 ans. Devant les taux de réponse importants secondaires à l'administration de cette thérapeutique il serait envisageable de considérer leur utilisation i) à la place d'une allogreffe de moelle pour les patients avec une maladie avancée (plus de 2 rechutes, rechute post allogreffe de moelle) puis pour les 1 res rechutes de haut risque et en 1 re ligne pour les LAL réfractaires et ii) à la place d'une chimiothérapie intensive prolongée en 1 re ligne pour les LAL de haut risque. Pour envisager cette indication, il est nécessaire de confirmer les résultats initiaux en termes d'efficacité (plus de patients traités et suivi plus prolongé) et de comprendre et maitriser les effets secondaires spécifiques liés aux CAR T cells. Il est également indispensable d'améliorer leur accessibilité. En effet les CAR autologues ont l'inconvénient de requérir la présence d'un nombre suffisant de lymphocytes T chez le patient ainsi qu'un temps d'ingénierie parfois trop long. Ainsi sont développés des CAR allogéniques permettant de disposer à tout moment de lymphocytes T dirigés contre les cellules cibles définies (cf infra). La place de l'allogreffe de moelle par rapport à l'administration des CAR T cells est également discutée. En effet la survie des patients traités par CAR T cells ne diffère pas selon qu'ils ont reçu une allogreffe de moelle au préalable ou pas [START_REF] Gardner | Intent-to-treat leukemia remission by CD19 CAR T cells of defined formulation and dose in children and young adults[END_REF]. Le traitement par CAR T cells permettrait soit d'obtenir une maladie résiduelle négative, facteur prédictif d'un meilleur succès de la greffe, soit de se passer d'une allogreffe de moelle, pourvoyeuse d'effets secondaires non négligeables.

Amélioration de l'accessibilité

CAR allogéniques

Le développement de CARs universels à partir de lymphocytes T issus de donneurs sains présente de nombreux avantages. Il permet de passer outre les difficultés de recueil de lymphocytes chez un patient préalablement traité par chimiothérapie. Il permet également de mettre à disposition immédiate des cellules T modifiées « sur l'étagère » (off the shelf) selon la cible choisie. Le principe est d'inactiver le TCR endogène de la cellule T en question pour ainsi limiter le risque de réaction du greffon contre l'hôte. Deux nourrissons en rechute de LAL B avec réarrangement de MLL, ont ainsi reçu des CAR allogéniques anti-CD19. Ceux-ci subissent une triple manipulation 1) délétion de la chaine alpha du récepteur T (TCR), 2) délétion du gène codant pour CD52 grâce à des « ciseaux moléculaires » (TALEN : transcription activator like effector nuclease), 3) insertion par vecteur lentiviral d'une construction (scFV anti-CD19-41BB-CD3 zeta). Les enfants ont reçu une lymphodéplétion intensifiée : Fludarabine, Cyclophosphamide et alemtuzumab (anti CD52). Malgré cela, l'expansion des cellules a été restreinte dans le temps. Une des hypothèses expliquant cette difficulté est la reconnaissance puis la destruction de ces lymphocytes modifiés par les cellules NK qui ont la capacité de cibler les cellules déficientes en CMH de classe I. Un des patients, non compatibles pour les allèles du CMH de classe I, a développé une réaction du greffon contre l'hôte par contamination lors de l'injection des CAR T cells par des lymphocytes T pour lesquels l'inactivation du TCR n'avait pas fonctionné [START_REF] Qasim | Molecular remission of infant B-ALL after infusion of universal TALEN gene-edited CAR T cells[END_REF]. Néanmoins, ces deux enfants ont reçu une allogreffe post CAR et vont bien avec un recul significatif (3 ans pour le premier patient). Actuellement, deux essais internationaux de phase I/II sont en cours. Ils évaluent la faisabilité de l'utilisation de ces CARs universels anti-CD19 chez des patients d'âge pédiatrique (étude PALL, NCT02808442) ou adulte (étude CALM, NCT02746952) pris en charge pour une LAL B réfractaire ou en 2 e rechute (ou 1 re rechute si post-greffe). L'utilisation des CAR allogéniques se conçoit actuellement plus comme un pont vers la réalisation d'une allogreffe de moelle en situation de meilleur minimum tumoral. D'autres CAR T cells allogéniques sont en cours d'essai, notamment anti CD123 (NCT03190278).

CAR multispécifiques

Deux stratégies de combinaisons de CAR sont développées, à l'origine de CAR bi-spécifiques ou dual-CAR. Soit le lymphocyte T exprime un CAR contenant 2 domaines de liaison différents « en tandem » (TanCAR) soit le lymphocyte T exprime 2 CAR différents (dual-CAR). Cibler un antigène unique peut être insuffisant pour discriminer de façon certaine la cellule tumorale des cellules saines. Pour augmenter la spécificité, il est possible de créer un lymphocyte T qui, lorsqu'il reconnait une cible n°1 par un CAR, entraine un signal d'activation de la transcription d'un gène codant pour un CAR n°2, les 2 CAR reconnaissant 2 cibles spécifiques de la cellule tumorale, c'est le dual CAR [START_REF] Roybal | Precision Tumor Recognition by T Cells With Combinatorial Antigen-Sensing Circuits[END_REF]. Il permet de limiter la toxicité sur les cellules saines. De plus, environ 20 % des rechutes de LAL B post injection de CAR CD19 sont liées à la perte d'expression du CD19 à la surface de la cellule leucémique. Ce phénomène serait dû soit à l'élimination des cellules porteuses de cet antigène soit à la sélection positive de sous clones CD19 -existant avant l'injection de CAR. L'utilisation de Tan-CAR CD19+CD22+ ou CD19+CD123+ Bulletin du CANCER Article permettraient ainsi de limiter cette pression de sélection. Ils ont montré leur efficacité dans l'émergence de rechutes CD19 -en préclinique [START_REF] Biondi | Redirecting T cells with Chimeric Antigen Receptor (CAR) for the treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia[END_REF]. Ces combinaisons de CAR ont montré une activité tumorale supérieure aux CAR ciblant un antigène unique in vivo en préclinique [START_REF] Ruella | Dual CD19 and CD123 targeting prevents antigen-loss relapses after CD19directed immunotherapies[END_REF].

CAR combinés à une autre immunothérapie

L'utilisation de l'inhibiteur de tyrosine kinase Bruton, ibrutinib en préclinique dans les pathologies B malignes a montré une augmentation de l'activité des CAR T cells en diminuant la présence de récepteurs inhibiteurs à leur surface [START_REF] Fraietta | Ibrutinib enhances chimeric antigen receptor T-cell engraftment and efficacy in leukemia[END_REF]. La combinaison de l'inhibiteur de PD1 pembrolizumab à des CAR T cells CD19 a été étudiée chez 4 enfant pris en charge pour une LAL B en rechute. L'administration du pembrolizumab a permis une augmentation de la détection et de la persistance des CAR associée à des réponses cliniques objectives [START_REF] Maude | The effect of pembrolizumab in combination with CD19-targeted chimeric antigen receptor (CAR) T cells in relapsed acute lymphoblastic leukemia (ALL)[END_REF].

Amélioration de l'efficacité dans les tumeurs solides

L'accessibilité des CAR T cells à la cible joue également un rôle indispensable dans les tumeurs solides. Le microenvironnement tumoral constitué de lymphocytes T régulateurs, cellules myéloïdes immunosuppressives, checkpoints immuns peut diminuer l'efficacité des CAR T cells. Des essais cliniques sont actuellement menés évaluant l'intérêt de combiner des anticorps bloquant PD1/PD-L1 à des CAR T cells GD2 dans les neuroblastomes [START_REF] June | CAR T cell immunotherapy for human cancer[END_REF]. Dans les tumeurs du système nerveux central, le rôle de la barrière hématoencéphalique ainsi que la circulation des lymphocytes T dans le SNC sont des freins éventuels à l'accessibilité des CAR au sein de la tumeur [START_REF] Migliorini | CAR T-Cell Therapies in Glioblastoma: A First Look[END_REF]. Enfin, les tumeurs solides peuvent présenter un défaut de présentation d'antigène à la surface cellulaire ce qui réduit l'action des CAR injectés.

Diminution de la toxicité

La toxicité aigüe induite par les CAR T cells nécessite une prise en charge adaptée. Des recommandations françaises ont été élaborées afin de définir les pré requis à la mise en place de protocoles de recherche clinique évaluant l'efficacité et la toxicité de cette thérapie, incluant la proximité de services de réanimation adaptés [START_REF] Yakoub-Agha | Prerequisite for hematopoietic cellular therapy programs to set up chimeric antigen receptor T-cell therapy (CAR T-cells): Guidelines from the Francophone Society of Bone Marrow Transplantation and Cellular Therapy (SFGM-TC)[END_REF]. Néanmoins d'autres innovations en termes d'ingénierie permettent d'espérer diminuer les effets secondaires à plus long terme.

CAR d'expression transitoire

Pour diminuer le risque d'auto immunité induite par les CAR, il est possible d'introduire un système inductible au sein du lymphocyte T modifié capable de déclencher sa mort cellulaire lors de l'administration d'une molécule spécifique [START_REF] Stasi | Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy[END_REF].

CAR inductible

La dernière génération de CAR en cours de développement consiste en l'utilisation d'un récepteur chimérique en 2 parties : une partie intracellulaire et transmembranaire sur la cellule qui contient les domaines d'activation et de costimulation du lymphocyte et une partie qui formera le domaine extracellulaire que l'on injecte secondairement. Cette partie contient la sous unité capable de reconnaitre l'antigène cible. Ces 2 parties sont reliées par un domaine leucine zipper et permettent de combiner plusieurs sous unités reconnaissant différentes cibles à la surface de la même cellule T. Leur activité peut également être stoppée par l'injection d'une molécule inhibitrice qui se fixe par l'intermédiaire du domaine leucine zipper [START_REF] Cho | Universal Chimeric Antigen Receptors for Multiplexed and Logical Control of T Cell Responses[END_REF]. Cette méthode pourrait augmenter la facilité d'accès aux CAR en limitant le temps de préparation des cellules et limiterait la survenue d'effets secondaires par la possibilité de stopper leur activité.

CAR NK

Les lymphocytes NK sont des cellules du système immunitaire inné qui peuvent cibler les cellules tumorales directement. Elles ne sont pas à la source de réaction du greffon contre l'hôte et peuvent constituer une source de CAR universels à disposition avec une bonne activité antitumorale et sans alloimmunité. De nombreuses études précliniques ont testé les CAR NK avec de multiples antigènes cibles dans les pathologies hématologiques malignes et les tumeurs solides. Un essai précoce est en cours aux États-Unis dans les pathologies lymphoïdes B CD19 réfractaires ou en rechute. Le CAR est transduit par un vecteur contenant également une expression d'IL15, nécessaire à la prolifération des cellules NK, et une caspase 9 inductible, gène suicide capable de déclencher l'apoptose de la cellules T pouvant être activé pharmacologiquement si nécessaire [START_REF] Mehta | Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer[END_REF].

Vecteur alternatif de transduction

La plupart des CAR T cells utilisés actuellement en clinique sont transduits par l'intermédiaire de vecteurs type lentivirus ou rétrovirus. La construction de vecteurs rétroviraux est standardisée mais nécessite un processus long et laborieux. L'utilisation de lentivirus est encore plus contraignante économiquement. Il est donc nécessaire d'évaluer de nouveaux systèmes de vectorisation comme les transposons non viraux. Des études précliniques testent actuellement la production de CARCIK CD19, cellules « cytokine induced killer » issues de donneurs qui expriment le CAR par l'intermédiaire d'un transposon. Ces cellules exercent un effet antitumoral dose-dépendant et persistent in vivo sur des modèles de xénogreffes issues de patients. Elles présentent comme avantage d'être moins coûteuses, plus faciles d'accès et utilisables chez des patients lymphopéniques [START_REF] Biondi | Redirecting T cells with Chimeric Antigen Receptor (CAR) for the treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia[END_REF]. La transduction de CAR par l'intermédiaire d'un transposon type « sleeping beauty » et/ou « minicircle » , a été montrée comme étant plus efficace : augmentation du nombre de cellules transduites et augmentation de la stabilité de la transduction, et plus sûre car non viral par rapport à l'utilisation de plasmides conventionnels [START_REF] Kebriaei | Phase I trials using Sleeping Beauty to generate CD19-specific CAR T cells[END_REF][START_REF] Hudecek | Minicircle-Based Engineering of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells[END_REF]. Un essai est actuellement en cours à Monza en Italie.

Conclusion

Si leurs résultats se confirment à plus long terme, les CAR T cells vont vraisemblablement révolutionner le traitement des LAL de tome 105 > Supplément 2 > Décembre 2018

Bulletin du CANCER Article la lignée B de l'enfant et du jeune adulte, voire de l'adulte [START_REF] Biondi | Redirecting T cells with Chimeric Antigen Receptor (CAR) for the treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia[END_REF]. Cependant, cette thérapeutique pose de multiples problèmes : complexité de mise en oeuvre, coût extrême (tisagen lecleucel : 475000 dollars aux États-Unis), délais de production, toxicité immédiate et à moyen, voire long terme. Les rechutes liées à l'évolution clonale amènent à élaborer des stratégies d'optimisation avec l'utilisation de CAR multispécifiques. Les effets secondaires induits ont conduit à créer des nouvelles technologies qui permettront d'« allumer » ou d'« éteindre » le CAR en fonction de la réponse souhaitée et des effets secondaires rencontrés. La place exacte de ce traitement dans l'arsenal thérapeutique des LAL B en rechute ou réfractaire reste encore à définir. Les CAR T cells peuvent permettre d'obtenir une rémission moléculaire avant une allogreffe de moelle mais également se suffire à elles-mêmes en induisant des rémissions prolongées et la guérison.

Les résultats précoces des essais cliniques des CAR T cells CD19 dans les pathologies malignes B ont conduit à vouloir étendre l'utilisation de cette thérapeutique T adoptive aux tumeurs solides pédiatriques. Il reste encore de nombreux obstacles à franchir pour l'appliquer avec succès dans cette indication [START_REF] June | CAR T cell immunotherapy for human cancer[END_REF].

FIGURE 1

 1 FIGURE 1 Évolution des CAR T cells. VL = chaîne légère, VH = chaîne lourde, VH + VL + Linker = scFv

tome 105 >

 105 Supplément 2 > Décembre 2018 Bulletin du

Clinicaltrials.gov au 02/07/2018.

	Pathologies
	Cibles	Leucémies	Lymphomes	Tumeurs
	des CAR	aigues		solides
	CD19	77/1	43/0
	CD22	13/0	13/0
	CD33	5/0
	CD123	7/0
	CD20	7/0	8/0
	CD30	1/0	9/0
	CD5	1/0	1/0
	CD7	0/0	0/0
	GD2			11/0
	TABLEAU 2

Études cliniques de phase précoce chez des patients d'âge pédiatrique traités par CAR T cells anti CD19. Lee et al. 2015 [14] Grupp et al. 2013 [15] Maude et al. 2014 [16] Maude et al. 2018 [17] Gardner et al. 2017 [18]

  Une étude internationale de phase 2 multicentrique, ELIANA, menée sur 25 sites (dont 2 sites français) dans 11 pays, a confirmé ces excellents résultats sur une cohorte de 75 patients d'âge pédiatrique ou adultes jeunes traités pour une LAL B CD19+ en rechute ou réfractaire avec le produit CTL019[START_REF] Maude | Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia[END_REF]. Quarantesix patients (61 %) avaient reçu une allogreffe de moelle. Le pourcentage médian de blastes au diagnostic était de 74 % (5-99 %).Le taux de rémission complète à 3 mois était de 81 % avec une maladie résiduelle négative en CMF. Le taux de survie sans événement et de survie globale était de 73 % (IC95 %, 60 à 82 %) et 90 % (IC95 %, 81 à 95 %) respectivement à 6 mois, et de 50 % (IC95 %, 35 à 64 %) et 76 % (IC95 %, 63 à 86 %) à 12 mois. 73 % des patients ont présenté des effets secondaires de grade 3-4. Un syndrome de relargage cytokinique est survenu chez 77 % des patients et 48 % d'entre eux ont dû recevoir du Article 13 % des patients, une complication neurologique chez 28 % des patients. Dans une revue publiée en 2017 sur l'utilisation de l'axicabtagene ciloleucel dans les lymphomes non hodgkiniens agressifs, 5 études principales sont rapportées, initialement monocentriques puis pluricentriques nationales[START_REF] Roberts | Axicabtagene ciloleucel, a firstin-class CAR T cell therapy for aggressive NHL[END_REF]. Dans les 3 études monocentriques réalisées sur 7 à 22 patients évaluables, une réponse objective était obtenue pour 73 à 92 % des patients avec un taux de réponse complète de 14 à 62 %. Dans les 2 études nationales de phase I puis de phase II réalisées sur 7 et 101 patients respectivement, le taux de réponse objective était de 71 à 82 % avec un taux de réponse complète de 54 à 57 %. Parmi les 101 patients de l'étude de phase II, 13 % ont présenté un CRS supérieur ou égal à un grade 3 et 28 % un événement neurologique supérieur ou égal à un grade 3. Aucune étude n'est publiée sur l'utilisation de CAR anti CD19 dans les lymphomes de l'enfant. Actuellement, en France, aucun essai thérapeutique basé sur l'utilisation de CAR T cells CD19+ n'est ouvert pour les patients de moins de 18 ans présentant un lymphome B réfractaire ou en rechute. Deux essais sont ouverts chez l'adulte dans le lymphome du manteau et les lymphomes diffus à grandes cellules (NCT03484702, NCT02601313). Vingt-six essais de phase I et 17 essais de phase II sont ouverts dans le monde pour les patients d'âge pédiatrique présentant un lymphome B.

	sévère chez 8 patients avec nécessité d'utilisation d'amines vaso-pressives. Neuf patients reçurent une injection de tocilizumab,	Étude de phase 2			Article
	anticorps bloquant le récepteur à l'IL-6, permettant une résolution
	des symptômes. Le second effet secondaire notable aigu était
	neurologique pour 13 patients. Les symptômes allaient de la
	confusion à l'encéphalopathie. Aucun patient n'a conservé de
	séquelle neurologique. À long terme, tous les patients qui pré-
	sentaient une réponse au traitement ont développé une aplasie B
	qui a persisté jusqu'à un an après l'injection des CTL019. Sept
	patients ont présenté une rechute entre 6 semaines et 8,5 mois
	après l'injection, dont 3 patients après une perte précoce des
	CAR T cells. Après récupération de lymphocytes B (2 à 3 mois),
	3 autres patients présentèrent une rechute. Le dernier présenta
	une rechute cytologique à 6 semaines [15].
	À Seattle, une étude de phase I a également rapporté l'efficacité
	de CAR T cells anti-CD19, également transduits avec un lentivirus
	codant pour un scFV anti CD19 et pour les domaines CD3 zeta et
	4-1 BB, mais ici caractérisés par un ratio CD4/CD8 défini, chez
	45 patients âgés Onze patients ont été consolidés par une allogreffe de moelle
	dont 2 rechutèrent. L'analyse des 40 patients ayant obtenu une
	rémission complète MRD-a permis de mettre en évidence que la
	perte de l'aplasie B, reflet de la perte de CAR T cells fonctionnels,
	Nb patients augmentait le risque de rechute CD19+. Huit patients reçurent une 21 2	30	75	45	et les
	Age médian seconde injection de CAR T cells après perte précoce des cellules 15 ans 7 et 10 ans	14 ans lymphomes B primitifs du médiastin réfractaires de l'adulte. Le 12,2 ans
	Allogreffe MRD négative MRD : méthode mais seulement 2 présentèrent une expansion de ces cellules. 8 12/20 CMF 1 2/2 CMF Les 6 patients n'ayant pas présenté une expansion des cellules	18 22/30 CMF tisagenlecleucel a également obtenu l'approbation de la FDA en 81 % CMF 28 89 % CMF mai 2018 dans le traitement des DLBCL, lymphome B à grandes
	d'évaluation avaient reçu une chimiothérapie initiale peu immunosuppressive	cellules de haut grade réfractaire ou rechute de l'adulte.
	EFS OS CRS Événement (sans fludarabine). L'incidence globale de CRS était de 93 %, À 9,7 mois : 51,6 % 16 6 classé sévère pour 23 %. Seize patients reçurent du tocilizumab, 10 patients des corticoïdes.	À 6 mois : 67 % À 6 mois : 78 % 100 % 13/30 Dans une étude multicentrique de phase II menée chez À 6 mois : 73 % À 6 mois : 90 % 77 % 40 % À 12 mois : 50,8 % À 12 mois : 69,5 % 111 patients adultes traités pour un lymphome B réfractaire ou en 93 % 49 %
	neurologique
	Bulletin du CANCER

Nb = nombre ; MRD = maladie résiduelle ; EFS = survie sans événement, OS = survie globale, CRS = syndrome de relargage cytokinique. tocilizumab. Trente-cinq patients ont été transférés en unité de soins intensifs pour la gestion du CRS pendant une durée médiane

de

7 jours : 19 ont reçu des amines vasopressives, 33 ont eu besoin d'apport d'oxygène dont 10 une ventilation mécanique, 7 ont été dialysés. 40 % des patients ont présenté une complication neurologique sans oedème cérébral dont 10 patients avec un grade 3. Tous les patients qui ont présenté une réponse au traitement ont développé une aplasie B avec une probabilité de maintien de cette aplasie à 6 mois de l'injection de 83 % (IC95 %, 69 à 91 %). Suite aux résultats de ces études de phase précoce, les CTL019, tisagenlecleucel (CAR T cells de 2 e génération intégrant la sous unité zeta du CD3 et le domaine de costimulation 4-1 BB) a obtenu l'approbation de la FDA en août 2017 dans le traitement des LAL B réfractaires ou après 2 rechutes ou plus chez l'enfant et l'adulte de moins de 25 ans. Une étude d'expansion internationale (CTL019 B2001X), ouverte aussi en France, propose à des patients de moins de 25 ans, pris en charge pour une LAL B CD19+ réfractaire ou en rechute et inéligibles à une allogreffe de moelle, une injection de CTL019 après chimiothérapie de lymphodéplétion (NCT02435849).

Lymphomes B

Depuis octobre 2017 l'axicabtagene ciloleucel, ciblant également le CD19 est le 2 e médicament à base de CAR T cells à avoir obtenu l'approbation de la FDA aux États-Unis, dans les lymphomes B diffus à grandes cellules (DLBCL, lymphome non hodgkinien le plus fréquent chez l'adulte), les lymphomes de haut grade rechute, les taux de réponse objective et de rémission complète après ce traitement étaient de 82 % et 51 % respectivement

[START_REF] Neelapu | Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma[END_REF]

. Le taux de survie globale à 18 mois était de 52 %. Un syndrome de relargage cytokinique de grade 3 ou supérieur survint chez de 12 mois à 27 ans

[START_REF] Gardner | Intent-to-treat leukemia remission by CD19 CAR T cells of defined formulation and dose in children and young adults[END_REF]

. L'âge médian était de 12,2 ans. Le statut de la maladie au moment de l'injection était réparti comme suit : 3 en maladie réfractaire, 15 en première rechute, 22 en seconde rechute, 5 en 3 e rechute ou au-delà. Dix-sept patients n'avaient pas été allogreffés au préalable. Neuf patients présentaient un envahissement neuroméningé. Six patients avaient préalablement reçu du blinatumomab. Le taux de rémission complète avec maladie résiduelle (MRD) négative était de 89 %. Il était de 100 % pour les patients ayant reçu une chimiothérapie de lymphodéplétion par fludarabine cyclophosphamide. Quatre des 6 patients ayant reçu du blinatumomab antérieurement ont présenté une rémission complète avec MRD négative. La survie sans événement (EFS) estimée à 12 mois était de 50,8 % (IC95 %, 36,9-69,9 %) et la survie globale (OS) de 69,5 % (IC95 %, 55,8-86,5 %) avec une durée médiane de suivi de 9,6 mois. Dix-huit patients qui présentaient une réponse complète ont rechuté dont 17 uniquement au niveau médullaire et 1 au niveau méningé isolé. Sept rechutes étaient CD19-. Sur les 11 rechutes CD19+ la durée médiane entre injection et rechute était de 5,98 mois

[START_REF] Ramos | CAR-T Cell Therapy for Lymphoma[END_REF]

avec une durée médiane entre la perte de l'aplasie B et la rechute de 3,7 mois (0-11). L'incidence globale d'événement neurologique était de 49 %, sévère pour 21 %. L'existence d'un CRS sévère était prédictive de la survenue d'une neurotoxicité sévère (p = 0,01). tome 105 > Supplément 2 > Décembre 2018 Bulletin du CANCER

Remerciements

Hôpital Robert Debré : Jérôme Naudin, Stéphane Dauger, Serge Malbezin, Julie Roupret Hôpital Saint Louis : Jérôme Larghero, Valérie Vanneaux, Isabelle Madelaine Déclaration de liens d'intérêts : Les auteurs n'ont pas transmis leurs liens d'intérêts. Cet article fait partie du numéro supplément Les cellules CAR-T : une révolution thérapeutique ? réalisé avec le soutien institutionnel des partenaires Gilead : Kite et Celgene.


Arnaud Saget

Jean-Michel Siksik

Laurent Genser
email: laurent.genser@aphp.fr

Saget A Md

MD Siksik Jm

Genser L Md-Phd

Micro-laparoscopic sleeve gastrectomy using reduced size ports and instruments: technical points

Keywords: minimal invasive, sleeve, versalift, 3 mm, trocar, reduced, port

de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.

Manuscript

Background:

Sleeve gastrectomy (SG) is the most popular bariatric procedure worldwide [START_REF] Angrisani | Bariatric Surgery Worldwide 2013[END_REF] because of weight loss maintenance and acceptable morbidity [START_REF] Zellmer | Is laparoscopic sleeve gastrectomy a lower risk bariatric procedure compared with laparoscopic Rouxen-Y gastric bypass? A meta-analysis[END_REF][START_REF] Salminen | Effect of Laparoscopic Sleeve Gastrectomy vs Laparoscopic Roux-en-Y Gastric Bypass on Weight Loss at 5 Years Among Patients With Morbid Obesity: The SLEEVEPASS Randomized Clinical Trial[END_REF]. Reduced port 5 SG (i.e three trocars) has emerged has a new standard providing comparable safety and efficacy [START_REF] Corcelles | Laparoscopic Three-Port Sleeve Gastrectomy: A Single Institution Case Series[END_REF][START_REF] Consalvo | Three-Trocar Sleeve Gastrectomy vs Standard Five-Trocar Technique: a Randomized Controlled Trial[END_REF] as compared to the five port technique. However liver retraction and incisional hernia remain unresolved issues [START_REF] Genser | Minimal Invasive Internal Liver Retractor in Conventional and Trans-umbilical Single-Incision Laparoscopic Sleeve Gastrectomy: Video Report[END_REF]. Single incision SG has been proposed as a minimal invasive alternative allowing similar outcomes as well as better analgesia and cosmesis in selected patients [7]. Nevertheless it remains 10 technically challenging thus limiting its wide dissemination [START_REF] Raj | Evolution and Standardisation of Techniques in Single-Incision Laparoscopic Bariatric Surgery[END_REF]. Only few data are available regarding the use of reduced size ports and instruments (i.e. 3 millimeter; mm) in laparoscopic surgery [START_REF] Genser | Minimal Invasive Internal Liver Retractor in Conventional and Trans-umbilical Single-Incision Laparoscopic Sleeve Gastrectomy: Video Report[END_REF][START_REF] Yoshiki | Two-port laparoscopic ovarian cystectomy using 3-5 mm instruments[END_REF].

Methods: 15

The present educational video provides step by step instructions for the performance of a three-port SG using 3 mm instruments and an internal liver retractor in a 38years old morbidly obese patient (Body mass index: 43 kg/m², no comorbidities).

Results: 20

The patient was placed in a half-sitting position, surgeon between the legs with the assistant on the left of the patient. After creation of a 12-mmHg pneumoperitoneum, a 12 mm port is inserted just on the left of the midline for stapling and extraction of the stomach. Then, two reduced size trocars (i.e.<5 mm) are positioned: a pararectal optical for the 3 mm lens and one in the left upper quadrant for tissue handling, suture, aspiration and coagulation with 3 mm instruments. Optimal liver suspension and exposure of the angle of hiss was ensured by an internal retractor anchored to the right crus. Operative duration was 52 minutes without intraoperative difficulties.

Postoperative course was uneventful with complete healing and no incisional hernia recorded at postoperative one year. In comparison with the 5 mm trocars and 5 instruments, the 3 mm ones allowed for are a preserved ergonomy (i.e. rigidity of the instruments, accuracy, visualization) and a potential reduction in port site related pain and incisional hernia.

Conclusion: 10

As compared to conventional multiport SG, micro-laparoscopic SG as a combination of reduced size instruments and internal liver retractor does not sacrifice the patient safety as well as the exposure of the surgical field and the ergonomy. Up to now, more than twenty obese patients underwent a micro-laparoscopic sleeve gastrectomy. None of these patients required an additional trocar or a port up-sizing. 15

The impact of this technic on enhanced recovery and reduction in the rates of port site hernia remains to be determined. Keywords: minimal invasive, sleeve, versalift, 3 mm, trocar, reduced, port