Amélie Nicolas

David Launay

Christelle Duprez

Isabelle Citerne

Sandrine Morell-Dubois

Vincent Sobanski

Éric Hachulla

Delphine Staumont-Sallé

Meryem-Maud Farhat

Dr Sébastien Sanges
email: sebastien.sanges@univ-lille.fr

Impact de l'angioedème héréditaire sur les activités de la vie quotidienne, la sphère émotionnelle et la qualité de vie des patients [Impact of disease on daily activities, emotions and quality of life of patients with hereditary angioedema]

Keywords:

Introduction : L'angioedème héréditaire (AOH) est caractérisé par des poussées récidivantes d'oedèmes de localisations et de sévérité variables. Une altération de la qualité de vie des patients atteints d'AOH est décrite par plusieurs études. Nous avons étudié l'impact global de la maladie chez les patients suivis pour un AOH de type I, notamment son retentissement sur les activités de la vie quotidienne, la sphère émotionnelle et la qualité de vie. Méthodes : Un questionnaire a été distribué aux patients consultant pour un AOH de type I, recueillant les caractéristiques démographiques, les caractéristiques de la maladie, le retentissement sur la vie professionnelle, le score Hospital Anxiety And Depression (HAD), le score SF-36 et le questionnaire de handicap prioritaire McMaster Toronto Arthritis Patient Preference Disability Questionnaire (MACTAR). Résultats : Les 33 patients inclus rapportaient en moyenne de 5,17 crises sur l'année précédente. Le stress était le principal facteur déclenchant. Un traitement de fond était rapporté par 58% des patients, 72% recevaient un traitement spécifique en cas de crise sévère. Un absentéisme pendant leurs études était rapporté 33% des patients, et pendant leur travail par 34%. Un patient souffrait de symptômes dépressifs et dix autres de symptômes anxieux d'après le questionnaire HAD. Les domaines les plus impactés sur le score SF-36 étaient la perception générale de la santé et de la vitalité. Le score moyen pour le MACTAR était faible. Conclusion : L'AOH a un retentissement encore important dans la vie quotidienne et affective des patients, malgré la disponibilité de traitements préventifs et curatifs des crises.

Introduction

Les angiooedèmes (AO) sont un groupe de pathologies caractérisées par l'apparition localisée et transitoire d'un oedème des tissus sous-cutanés ou sous-muqueux. Même si le mécanisme de plus fréquent de l'AO est l'histaminolibération, comme dans l'urticaire chronique, il existe également des AO bradykiniques, pouvant être héréditaires ou acquis. L'angioedème héréditaire (AOH) est une maladie chronique rare, touchant 1/50 000 à 100 000 personne, qui se caractérise par des poussées récidivantes d'oedème durant de 1 à 5 jours et pouvant toucher l'ensemble des parties du corps [START_REF] Longhurst | Hereditary angio-oedema[END_REF]. Il existe plusieurs types d'AOH, dont le plus fréquent est le type I, caractérisé par un déficit en C1 inhibiteur lié à une mutation autosomique dominante du gène SERPING1 [START_REF] Cicardi | Classification, diagnosis, and approach to treatment for angioedema: consensus report from the Hereditary Angioedema International Working Group[END_REF]. Le déficit en C1 inhibiteur est à l'origine d'un défaut de dégradation de la bradykinine qui entraîne une augmentation de la perméabilité capillaire et la survenue de l'angioedème [START_REF] Davis | Mechanism of Angioedema in First Complement Component Inhibitor Deficiency[END_REF]. Le diagnostic d'AOH de type I repose sur des manifestations cliniques évocatrices, une activation biologique du complément avec baisse du C4, et un dosage quantitatif et qualitatif de C1 inhibiteur inférieur à 50% de la valeur normale à deux reprises [START_REF] Agostoni | Hereditary and acquired angioedema: Problems and progress: Proceedings of the third C1 esterase inhibitor deficiency workshop and beyond[END_REF][START_REF] Bouillet | Diagnostic biologique des angioedèmes bradykiniques : les recommandations du CREAK[END_REF]. Des antécédents familiaux doivent être recherchés mais ne sont pas systématiques, une mutation de novo survenant dans 25% des cas [START_REF] Pappalardo | Frequent de novo mutations and exon deletions in the C1inhibitor gene of patients with angioedema[END_REF]. Les crises sont de gravité variable selon la zone atteinte, allant du gonflement isolé d'une extrémité jusqu'au risque de décès par asphyxie en cas d'oedème laryngé non traité [START_REF] Bork | Fatal laryngeal attacks and mortality in hereditary angioedema due to C1-INH deficiency[END_REF]. Plusieurs traitements sont maintenant disponibles pour la prophylaxie et le traitement des crises, cependant sans permettre de guérison complète [START_REF] Longhurst | Hereditary angio-oedema[END_REF][START_REF] Zeerleder | Hereditary and acquired C1-inhibitor-dependent angioedema: from pathophysiology to treatment[END_REF]. Les patients atteints d'AOH sont donc soumis à un risque permanent et imprévisible de poussée. L'impact des maladies chroniques sur la qualité de vie est documenté pour de nombreuses pathologies chroniques. La première mention dans la littérature de la qualité de vie de patients avec un AOH date de 1999, dans une étude menée auprès de patients présentant différents types d'angioedèmes et/ou d'urticaires chroniques. L'évaluation par le questionnaire Dermatology Life Quality Index retrouvait alors un impact plus important chez les patients atteints d'un angioedème bradykinique que chez les patients avec urticaire chronique [START_REF] Poon | The extent and nature of disability in different urticarial conditions[END_REF]. Même s'il existe moins d'études sur l'impact de l'AOH que d'autres pathologies chroniques en raison de la rareté de cette maladie, il a été montré à plusieurs reprises que l'AOH a des répercussions négatives sur la qualité de vie des patients, en terme de santé physique et mentale, mais aussi au niveau professionnel et économique [START_REF] Caballero | Burden of Illness and Quality-of-Life Measures in Angioedema Conditions[END_REF].

Nous avons souhaité étudier l'impact global de la maladie chez les patients suivis pour un AOH de type I dans notre centre, et notamment d'en déterminer le retentissement sur les activités de la vie quotidienne, sur la sphère émotionnelle et sur la qualité de vie.

Matériel et méthodes

Le

Résultats

Caractéristiques des patients

Au total, 33 patients présentant un AOH de type I ont été inclus, avec un âge moyen de 43 ans (± 15,5) et un sex ratio F/H à 1,06. La durée moyenne de suivi était de 16,5 ans (± 12,4). Trente patients (91%) rapportaient des antécédents familiaux d'AOH, parmi lesquels 27 avaient au moins un apparenté au premier degré suivi pour un AOH (90%). Dix-huit patients avaient au moins un enfant à charge (55%), et 16 patients avaient au moins 1 enfant atteint d'AOH (49%). Vingt-cinq patients étaient en couple (76%), 6 étaient célibataires (18%), 1 séparé (3%) et 1 veuf (3%).

Caractéristiques des crises

Globalement (Tableau 1), la durée moyenne des crises était de 66,9 heures (± 33,6). Le nombre moyen de crises sur la dernière année était de 5,17 ± 5,4, 7 patients (23%) rapportant plus de 10 crises par an.

Les 3 localisations principales des crises d'angioedème étaient l'abdomen (76% ; intensité moyenne 6,3/10), les mains (64% ; intensité moyenne 4,8/10) et les pieds (49% ; intensité moyenne 4,4/10). Les crises localisées au-dessus des épaules restaient rares : face (27% ; intensité moyenne de 4,7/10), gorge ou larynx (15% ; intensité de 5,7/10), langue (3% ; intensité moyenne 2,2/10).

Les facteurs déclenchant des crises étaient essentiellement d'ordre psychique (stress 73%, fatigue 67%, contrariété 55%, émotions 30%) ou liés aux activités de la vie quotidienne (traumatismes locaux 46%, sport 18%, travail 18%, vacances 6%, voyages 6%). Parmi les 17 femmes, 2 patientes décrivaient la contraception comme facteur déclenchant, 2 autres les menstruations et 2 autres la grossesse.

Caractéristiques des traitements

Au total (Tableau 2), 19 patients (58%) prenaient un traitement de fond, dont 13 (69%) par danazol, 5 (26%) par acide tranexamique et 1 (5%) par bithérapie. Les effets indésirables du danazol étaient « très bien » et « bien » supportés par la majorité (93%) des patients traités.

En cas de crise non sévère, 64% des patients prenaient de l'acide tranexamique, avec une efficacité estimée à 4,53/10 (± 2,96). En cas de crise sévère, 58% réalisaient des injections d'icatibant, dont 74% en autoinjections, 21% par l'entourage et 5% aux urgences. L'efficacité de l'icatibant était évaluée à 8,11/10 (±2,08).

Retentissement de la maladie sur les activités de la vie quotidienne

Séjours à l'hôpital Au total (Tableau 3), 21 patients (64%) s'étaient déjà rendus aux urgences et avaient déjà été hospitalisés pour une crise ; seul 1 patient (3%) avait déjà été transféré en réanimation en raison d'un angioedème.

Études et vie professionnelle 11 patients (33%) décrivaient un absentéisme lié à leur AOH pendant leurs études, 2 (6%) rapportaient un impact de leur maladie sur le choix de leurs études et 2 (6%) disaient avoir eu des difficultés à poursuivre leurs études à cause de l'AOH. 1 patient (3%) rapportait un sentiment de discrimination liée à sa maladie au cours de ses études. L'importance des répercussions sur les études était évaluée à 4,21/10 (± 2,9) sur une EVA. 20 patients exerçaient une activité professionnelle (61%) dont 18 à temps plein (90%). 7 patients étaient retraités (21%), 1 patient était en invalidité (3%) et 1 sans emploi. L'importance des répercussions sur le travail était évaluée à 2,14/10 sur une EVA.

Parmi les 29 patients exerçant ou ayant exercé une activité professionnelle, 8 patients rapportaient des arrêts liés à leur maladie ; 3 rapportaient un absentéisme au travail ; 2 signalaient une évolution de carrière lente attribuée à leur maladie parmi lesquels 1 rapportait une non augmentation de ses revenus ; et 1 patient rapportait des répercussions sur le placement de ses congés. Trois patients décrivaient une discrimination au travail liée à leur maladie.

Vie sociale et familiale 16% des patients rapportaient mal vivre l'implication de leurs proches dans la maladie, 59% la vivaient bien et 26% la vivaient très bien. A l'aide d'une EVA allant de « peu satisfaisante » à « très satisfaisante », les patients évaluaient la qualité de leur vie sentimentale à 7,68/10 (± 3,27). Ils estimaient l'importance de la gêne liée à l'AOH sur leur vie sexuelle à 1,75/10 (± 1,88) et sur leur vie sociale à 2,76/10 (±2,80). 61% des patients pratiquaient au moins une activité sportive, mais 21% signalaient éviter au moins une activité sportive à cause de l'AOH. 39% des patients pratiquaient au moins un loisir régulier, et 12% disaient éviter au moins une activité de loisir à cause de l'AOH.

Retentissement de la maladie sur les émotions et la qualité de vie

Ressenti émotionnel

Interrogés sur les émotions accompagnant leurs crises, 14 patients (42%) rapportaient ressentir de l'angoisse, 14 (42%) décrivaient une irritabilité, 7 (21%) ressentaient de la panique et 4 (12%) de l'agitation. La population de notre étude était limitée à un centre, mais comportait 33 patients, soit une taille similaire à de précédents travaux multicentriques [START_REF] Bygum | Burden of Illness in Hereditary Angioedema: A Conceptual Model[END_REF]. La fréquence moyenne et médiane des crises chez nos patients était plus faible que dans la littérature. En effet, 77% de nos patients rapportaient moins de 10 crises par an, avec un nombre moyen de crises sur la dernière année à 5,2 ± 5,4 et une médiane à 3, alors que la médiane annuelle de crises dans la cohorte danoise de Bygum et al. [START_REF] Bygum | Hereditary angio-oedema in Denmark: a nationwide survey[END_REF] Les patients rapportaient une majorité de crises abdominales, qui étaient aussi les crises les plus intenses.

Les crises laryngées, qui ne représentaient que 15% des crises rapportées, étaient les secondes en termes d'intensité. La fréquence des crises abdominales et laryngées était comparable à celle retrouvée par Javaud et al. en 2019 [START_REF] Javaud | Hereditary angioedema: Clinical presentation and socioeconomic cost of 200 French patients[END_REF]. La fréquence élevée des crises abdominales, dont la présentation clinique ressemble parfois à des urgences chirurgicales, expose les patients à un risque d'opération inutile, bien décrit dans la littérature mais qui n'a pas été évalué dans notre questionnaire [START_REF] Agostoni | Hereditary and Acquired C1-Inhibitor Deficiency: Biological and Clinical Characteristics in 235 Patients[END_REF][START_REF] Bouillet | Hereditary angioedema with C1 inhibitor deficiency: clinical presentation and quality of life of 193 French patients[END_REF]. Les crises laryngées sont particulièrement anxiogènes du fait du risque de détresse respiratoire et de décès par asphyxie, même si le risque est plus important en cas d'AOH non diagnostiqué qu'en cas de maladie déjà connue [START_REF] Bork | Fatal laryngeal attacks and mortality in hereditary angioedema due to C1-INH deficiency[END_REF].

La présence de facteurs déclenchant des crises d'ordre psychique, comme le stress et les émotions, était déjà rapportée dans de nombreuses publications [START_REF] Bygum | Burden of Illness in Hereditary Angioedema: A Conceptual Model[END_REF][START_REF] Bygum | Hereditary angio-oedema in Denmark: a nationwide survey[END_REF][START_REF] Agostoni | Hereditary and Acquired C1-Inhibitor Deficiency: Biological and Clinical Characteristics in 235 Patients[END_REF][START_REF] Bouillet | Hereditary angioedema with C1 inhibitor deficiency: clinical presentation and quality of life of 193 French patients[END_REF]. En plus des traitements médicamenteux, un travail sur la gestion du stress et sur l'identification des émotions pourrait donc permettre une meilleure prise en charge globale de l'AOH et nécessite d'être étudié, comme c'est le cas dans d'autres pathologies chroniques [START_REF] Farhat | Exploring illness perceptions of lupus patients for a motivational environment in therapeutic education[END_REF]. Certains facteurs déclenchants rapportés dans notre étude, notamment les vacances et les voyages, peuvent sembler étonnant car normalement associés à des émotions plus positives. Cependant, il est possible que certains patients ressentent de l'anxiété à l'idée de présenter une crise d'AOH loin de leur domicile, et que le stress engendré participe à la survenue d'une poussée. D'autres facteurs pourraient également intervenir : modification des habitudes de sommeil (décalage horaire), charge mentale élevée (préparatifs, gestion des enfants), survenue d'impondérables au cours du voyage, etc.

Concernant la prise en charge thérapeutique, aucun patient dans notre étude ne recevait de traitement préventif par C1-INH au long cours malgré l'AMM récente du CINRYZE © au moment du questionnaire. Les bénéfices du traitement de fond étaient toutefois jugés satisfaisants par les patients recevant du danazol ou de l'acide tranexamique au long cours, avec une bonne tolérance du danazol. Les traitements disponibles pour la prévention des crises ont évolué depuis la réalisation de l'étude, avec l'arrivée du landadelumab [START_REF] Banerji | Effect of Lanadelumab Compared With Placebo on Prevention of Hereditary Angioedema Attacks: A Randomized Clinical Trial[END_REF] et plus récemment la disponibilité du berotralstat [START_REF] Zuraw | Oral once-daily berotralstat for the prevention of hereditary angioedema attacks: A randomized, double-blind, placebo-controlled phase 3 trial[END_REF] en Autorisation Temporaire d'Utilisation, ce qui devrait améliorer la qualité de vie des patients insuffisamment contrôlés par le danazol ou l'acide tranexamique. Pour le traitement de crise, certains patients rapportaient prendre de l'acide tranexamique en cas de crise grave. Cette attitude thérapeutique, recommandée à l'époque de notre travail, n'est désormais plus indiquée et a pu contribuer à la prise en charge sous-optimale de crises de certains patients, et donc à impacter leur qualité de vie.

Retentissement de la maladie sur la vie quotidienne

Plus de la moitié de nos patients avaient déjà consulté aux urgences ou été hospitalisés pour une crise. Pour les patients ayant des enfants à charge, la nécessité de se rendre à l'hôpital en cas de crise ajoute des contraintes organisationnelles aux symptômes physiques et au stress déjà causés par la crise. Ces Le retentissement financier de l'AOH est très peu évalué par notre questionnaire, en dehors de l'item « nonaugmentation de revenu » rapporté par seulement un patient. L'aspect financier est probablement peu impliqué dans la qualité de vie des patients français atteints d'AOH, étant donné la prise en charge à 100% par l'assurance maladie. Il n'en est pas de même dans d'autres pays où les patients doivent assumer le poids financier de leur maladie, chiffré en moyenne à 42 000$ par patient dans une étude de Wilson et al. aux États-Unis en 2010 [START_REF] Wilson | Economic costs associated with acute attacks and long-term management of hereditary angioedema[END_REF]. Quelques années plus tard, une évaluation des coûts socioéconomiques sur une cohorte française chiffrait les dépenses directes et indirectes liées à l'AOH à 10 422€ en moyenne, dont 97% liés aux prix des traitements, qui sont totalement remboursés pas l'assurance maladie [START_REF] Javaud | Hereditary angioedema: Clinical presentation and socioeconomic cost of 200 French patients[END_REF].

Retentissement de la maladie sur les émotions

21% des patients rapportaient fréquemment ressentir des émotions négatives, et le dépistage des symptômes anxieux et dépressifs par le score HAD retrouvait principalement des signes d'anxiété, présents chez 30% des patients, avec un score moyen à 8,03 (± 3,09). Ces résultats peuvent être comparés à l'étude allemande de Hinz et al. évaluant l'anxiété et la dépression chez des patients atteints de cancer : le score moyen de symptômes anxieux chez ces malades était de 7,19 (± 4,15) avec 20,6% des patients ayant un score positif selon l'échelle HAD [START_REF] Hinz | Anxiety and depression in cancer patients compared with the general population: Anxiety and depression in cancer patients[END_REF][START_REF] Hinz | Normative values for the Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS) in the general German population[END_REF]. En revanche, la prévalence des symptômes dépressifs (certains et possibles) reste faible dans notre cohorte.

La prévalence de l'anxiété avait été décrite dans certaines études, mais à des pourcentages plus élevés, alors que d'autres études décrivaient plus de dépression que d'anxiété parmi les patients atteints d'AOH [START_REF] Caballero | Burden of Illness and Quality-of-Life Measures in Angioedema Conditions[END_REF][START_REF] Banerji | The burden of illness in patients with hereditary angioedema[END_REF][START_REF] Fouche | Depression and anxiety in patients with hereditary angioedema[END_REF]. L'absence de symptômes dépressifs dépistés par le questionnaire HAD chez nos patients est discordante avec la majorité des données de la littérature (Tableau 4). Cette différence ne semble pas uniquement expliquée par la prise de traitements, car 14% des patients de l'étude de Caballero et al.

présentaient des signes de dépression d'après le score HAD alors que 66% recevaient un traitement spécifique de l'AOH en cas de crise [START_REF] Caballero | The humanistic burden of hereditary angioedema: Results from the Burden of Illness Study in Europe. Allergy Asthma[END_REF].. Cependant, un article plus récent de Lumry et al., suggère une amélioration globale de la qualité de vie des patients avec un AOH depuis quelques années. Le développement de traitements de crise efficaces s'accompagne probablement d'une meilleure connaissance de la maladie par les médecins, permettant un meilleur suivi des patients et participant à l'amélioration de leur qualité de vie (30). 73% des patients utilisant de l'icatibant savaient réaliser une auto-injection en cas de besoin, permettant d'avoir accès à un traitement rapide en cas de crise grave, sans risque de délai de prise en charge ou nécessité d'hospitalisation. D'autre part, nos patients étaient tous pris en charge dans un centre de référence, où ils bénéficient d'un accompagnement par des médecins et infirmières formés à leur maladie, avec des séances d'éducation thérapeutique. Cette prise en charge permet vraisemblablement une meilleure compréhension et un meilleur vécu de leur maladie. Enfin, il faut également souligner que, si la prévalence des symptômes dépressifs dépistés par le score HAD est faible dans notre cohorte, 21% des patients rapportaient une tristesse de l'humeur dans le mois précédent, ce qui est proche des valeurs retrouvées dans la littérature. Cette discordance pourrait donc également s'expliquer par un manque de sensibilité du questionnaire [START_REF] Coyne | No further research needed: abandoning the Hospital and Anxiety Depression Scale (HADS)[END_REF][START_REF] Mitchell | Diagnostic validity of the Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS) in cancer and palliative settings: a meta-analysis[END_REF].

Retentissement de la maladie sur la qualité de vie et le handicap

Par rapport aux normes françaises du questionnaire SF-36v2, et sous réserve de l'absence de comparaison statistique, nos patients semblent principalement présenter une atteinte des composantes physiques, avec des valeurs basses du score de perception générale de la santé, de douleurs physiques et de limitations dues

  recueil d'informations a été réalisé grâce à un questionnaire anonyme distribué à l'ensemble des patients consécutifs consultant pour un AOH de type I dans le service de Médecine Interne et d'Immunologie Clinique du CHU de Lille, membre constitutif du Centre National de Référence pour les Angioedèmes à Kinines (CREAK), et ayant donné leur consentement pour participer à cette étude, entre septembre 2011 et novembre 2013. Le questionnaire comportait une section portant sur les données démographiques, une section portant sur les caractéristiques de la maladie (crises, traitements), une section relative à la répercussion sur la vie quotidienne et une section relative à la connaissance de la pathologie. L'évaluation du handicap prioritaire était réalisée par une question à réponse libre et par le questionnaire MACTAR (McMaster Toronto Arthritis Patient Preference Disability Questionnaire) (11) dans sa version française. Celui-ci consiste à demander au patient de choisir les 3 principales activités impactées par la maladie et de coter, sur une échelle de 0 à 10, le niveau de gêne ressenti pour chacune d'elles. Un score global est ensuite calculé en additionnant les résultats des trois activités identifiées, allant de 0 (aucune limitation) à 30 (limitation complète). Les patients répondaient également au questionnaire Hospital Anxiety And Depression (HAD) et au questionnaire SF-36 version 2 (12,13). Les données relatives à la pathologie renseignées par les patients ont été vérifiées après la soumission du questionnaire et modifiées en cas d'erreur. La distribution des paramètres étudiés était présentée sous la forme d'une moyenne (± écart-type) pour les variables quantitatives et sous la forme d'une valeur absolue (pourcentage) pour les variables qualitatives.

  15% des patients recevaient un traitement par inhibiteur de la C1 estérase (C1-INH) en perfusion en cas de crise sévère, dont 60% aux urgences et 40% par une infirmière à domicile. L'efficacité du C1-INH était évaluée à 7/10 (± 3,55). Le bénéfice global des traitements était évalué à 7,87/10 (± 2,94) et la compliance à 8,29/10 (± 2,91).

  Concernant l'humeur au cours du dernier mois, la majorité de nos patients se disaient heureux, calme et paisible, et plein d'entrain et de vitalité au moins une grande partie du temps. Cependant, 7 patients (21%) rapportaient passer au moins une grande partie du temps à se sentir cafardeux, triste et déprimé, nerveux et irritable, épuisé et/ou démoralisé par leurs problèmes de santé.Anxiété et dépressionL'évaluation par le questionnaire HAD retrouvait un score moyen pour les symptômes dépressifs à 3,48/21 (± 2,96) et pour les symptômes anxieux à 8,03 (± 3,09). Un patient (3%) avait un dépistage positif pour la dépression et 10 patients (30%) pour l'anxiété d'après le questionnaire HAD. Deux patients (6%) avaient un score intermédiaire laissant présager la présence possible de symptômes dépressifs et 7 (21%) la présence possible de symptômes anxieux.Qualité de vie et handicapLe questionnaire SF36 (Figure1) retrouvait les scores les plus bas dans les domaines de la perception générale de la santé (58,78/100) et de la vitalité (58,94/100). Venaient ensuite les douleurs physiques (69,56/100), puis la santé psychique (70,24/100) et les limitations liées à l'état physique (71,88/100). Les domaines les moins impactés étaient la vie et fonctionnement avec les autres (79,55/100), les limitations dues à l'état psychique (85,82/100) et l'activité physique (90,3/100).Interrogés sur leur handicap prioritaire, 14 patients (42%) ne rapportaient aucune activité affectée par leur AOH. Les activités fréquemment mentionnées par les autres patients comportaient le sport (7 patients) dont la randonnée (3 patients), les voyages (4 patients) le bricolage (4 patients), le jardinage (2 patients). Chez les 15 patients ayant renseigné au moins 1 activité dans le questionnaire MACTAR, le score moyen était de 9,01±7,0 (pour un maximum possible de 30).DiscussionLes principaux résultats de notre étude peuvent être résumés ainsi : (1) les patients d'atteints d'AOH perçoivent un impact important de la maladie au niveau de leur vie quotidienne (activités sociales, professionnelles et familiales) ; (2) la plupart des patients n'identifiait cependant pas de handicap prioritaire associé à la maladie, avec un score MACTAR plutôt faible ; (3) l'impact émotionnel de l'AOH est également majeur, notamment en termes de symptômes anxieux (en particulier au moment des crises) et de tristesse de l'humeur rapportée ; (4) la prévalence des symptômes dépressifs dépistés par le score HAD restait cependant faible dans notre cohorte.

  était à 10,7 (0-60) et la moyenne annuelle de crise dans la cohorte américaine de Lumry et al. (17) était de 26,9 ± 43,1. Cette différence dans la fréquence des crises peut être partiellement expliquée par une différence dans la prophylaxie des crises : dans la cohorte danoise, seuls 29,3% des patients recevaient un traitement de fond par danazol ou acide tranexamique. Cependant 49,5% des patients américains de l'étude de Lumry et al. recevaient une prophylaxie, ce qui reste relativement comparable à notre population. Notre étude étant rétrospective et basée sur un auto-questionnaire, l'estimation du nombre de crises sur l'année passée a aussi pu être sousestimée par les patients, notamment en oubliant les crises les moins sévères n'ayant pas ou peu impacté leur vie quotidienne.

  hospitalisations participent également à l'absentéisme scolaire et professionnel rapportés par plus d'un tiers des patients dans notre étude. L'absentéisme au travail était cependant moins important que dans la cohorte américaine de Lumry et al. où 50,6% des actifs rapportaient au moins une journée d'absence au travail liée à leur crise d'AOH la plus récente. Cet écart peut être lié à la disponibilité de traitements spécifiques des crises comme l'icatibant et le C1-INH pour les patients de notre étude, mais pas dans la cohorte américaine.

  à l'état physique. Cependant, le score d'activité physique n'est pas diminué. Parmi la composante psychique, seul le score de vitalité parait abaissé. Les scores de santé psychique et de limitations dues à l'état psychique semblent similaires à la population générale, concordant avec l'absence de symptômes dépressifs retrouvée au questionnaire HAD. La comparaison avec d'autres cohortes de patients atteints d'AOH est difficile car les normes du score SF-36 peuvent varier en fonction des pays, et l'accès aux traitements varie en fonction des pays et de l'année de réalisation des études (Tableau 4). Une fréquence moins importante des crises chez les patients de notre cohorte pourrait également expliquer une partie des différences observées avec l'étude de Bouillet et coll. réalisée en 2013 en France, avec la même disponibilité des traitements.Le MACTAR est une échelle fonctionnelle qui a pour but d'évaluer le handicap identifié comme prioritaire par le patient, qui peut être différent des items proposés dans les autres questionnaires de qualité de vie. Le questionnaire est habituellement réalisé sous forme d'entretiens avec des questions ouvertes, afin d'encourager les patients à identifier les trois activités de leur vie quotidienne les plus impactées par la maladie, puis de noter l'importance des limitations dans chacune de ces activités. A notre connaissance, le questionnaire MACTAR n'a jamais été utilisé dans l'évaluation du handicap prioritaire des patients atteints d'AOH. La plupart des patients n'ayant pas identifié de handicap prioritaire, le score MACTAR n'est disponible que chez 15 patients. Ce faible nombre de réponse peut être lié à la réalisation du questionnaire sur papier sans la présence d'une personne expérimentée posant les questions. Dans ce sous-groupe, la valeur du score reste faible et inférieure à celles observées dans d'autres pathologies (polyarthrite rhumatoïde[START_REF] Verhoeven | Validity of the MACTAR questionnaire as a functional index in a rheumatoid arthritis clinical trial. The McMaster Toronto Arthritis[END_REF], sclérodermie systémique[START_REF] Mouthon | Patient preference disability questionnaire in systemic sclerosis: A cross-sectional survey[END_REF]). Ce résultat paraît surprenant au regard des réponses préalables, la plupart des patients identifiant un retentissement important de la maladie dans leur vie quotidienne et émotionnelle. Ceci peut traduire une forme de résignation et/ou d'acceptation de cet impact, permettant aux patients de le surmonter et de faire preuve de résilience. Également, le retentissement émotionnel de la maladie pour le patient peut être lié à l'impact sur ses proches, ce qui n'est pas documenté par le score MACTAR. Enfin, dans la mesure où ce questionnaire a été initialement développé pour les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, il ne capture peut-être pas de façon satisfaisante le handicap d'origine non musculo-squelettique, notamment psychique.ConclusionNotre étude souligne le retentissement encore important de l'AOH dans la vie quotidienne et affective des patients, malgré la disponibilité de traitements médicamenteux préventifs et de traitements de crise. Une meilleure prise en compte de cet impact émotionnel, social et professionnel est indispensable dans le suivi des patients. L'arrivée de nouvelles molécules spécifiques indiquées dans la prophylaxie des crises d'AOH aura surement un impact sur la qualité de vie des patients. Une nouvelle étude similaire pourrait être envisagée pour comparer les résultats avant et après l'utilisation des nouveaux traitements. C1-INH : traitement par inhibiteur de la C1 estérase EVA : échelle visuelle analogique HAD : questionnaire Hospital Anxiety and Depression MACTAR : McMaster Toronto Arthritis Patient Preference Disability Questionnaire

Figure 1 :

 1 Figure 1 : Questionnaire SF-36 des patients atteints d'angioedème héréditaire (bleu) et de la population générale française (rouge, à titre indicatif)(14)

Proc. 2014;35(1):47-53.

Jindal & al, 2017[START_REF] Jindal | Hereditary angioedema: health-related quality of life in Canadian patients as measured by the SF-36[END_REF] Score SF-36 Diminution de la qualité de vie prédominant dans les domaines de la santé perçue, les douleurs physiques et la vitalité. Diminution significative du score de santé perçue par rapport aux normes de population générale.Lumry & al, 2018(30)Score HAD Score moyen de symptômes anxieux à 6,2 ± 3,93 et score moyen de symptômes dépressifs à 2,76 ± 2,84 (norme < 7)

Remerciements

Les auteurs remercient la société Orgamétrie pour leur expertise méthodologique et l'analyse statistique des données de cette étude.

Conflits d'intérêt

Ce travail a fait l'objet d'un soutien par le laboratoire Shire-Takeda, qui n'a eu aucun droit de regard sur les résultats et leur interprétation.

Abréviations

AOH : angioedème héréditaire


Ahmed Nasri
email: ahmed.nasri@fsb.u-carthage.tn

Pierre-André Lafon

Amine Mezni

Philippe Clair

Nicolas Cubedo

Ezzeddine Mahmoudi

Hamouda Beyrem

Mireille Rossel

Véronique Perrier

Developmental exposure to the A6-pesticide causes changes in tyrosine hydroxylase gene expression, neurochemistry, and locomotors behavior in larval zebrafish

Keywords: zebrafish exposure, malformations, A6 accumulation, tyrosine hydroxylase, locomotor behavior

des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.

Introduction

The exponential growth of the world's population has necessitated the use of intensive production systems in agriculture globally [START_REF] Köhler | Wildlife ecotoxicology of pesticides: Can we track effects to the population level and beyond? Science[END_REF]. The over the top use of synthetic pesticides and improve crop yields places great strain on natural resources [START_REF] Liu | A 1961-2010 record of fertilizer use, pesticide application and cereal yields: a review[END_REF]. The use of chemical pesticides has led to the appearance of several impacts in the environment, including toxic effects on non-target organism (Abdelkhalek et al. 2015).

The arrival of new technologies such as high throughput screening and mass spectrometry in the 1990s boosted "green" chemistry, i.e., the identification of new molecules extracted from plants, and the production of derived molecules with improved properties [START_REF] Benelli | Tick repellents and acaricides of botanical origin: a green roadmap to control tick-borne diseases?[END_REF]. This "green" chemistry aims to design industrial processes that are more respectful of the environment, and to generate products that are more harmless to non-target organisms (Campos et al. 2016). These pesticides of plant origin or biopesticides are currently being explored as promising alternatives to synthetic pesticides [START_REF] Benelli | Tick repellents and acaricides of botanical origin: a green roadmap to control tick-borne diseases?[END_REF], because they are considered less harmful to non-target organisms since they are of natural origin [START_REF] Shao | Non-target effects on soil microbial parameters of the synthetic pesticide carbendazim with the biopesticides cantharidin and norcantharidin[END_REF]. A6 is a biopesticide derived from the molecule α-terthienyl which was originally isolated from plants such as Asteraceae [START_REF] Nivsarkar | Alpha-terthienyl: A plant-derived new generation insecticide[END_REF] for its blue fluorescent properties [START_REF] Zechmeister | A Blue-Fluorescing Compound, Terthienyl, Isolated from Marigolds[END_REF]Nasri et al. 2016a), as well as being described to have herbicidal activity [START_REF] Friedman | A theoretical study of 2,2′;5′,2″-terthiophene (α-T) and its analogs. Part 1. Correlation of electronic structure and energies with herbicidal phototoxicity[END_REF].

The use of biological origin pesticides in agriculture presents more and more a risk due to their gradual accumulation in aquatic environments [START_REF] Tejada | Effect of controlled release formulations of diuron and alachlor herbicides on the biochemical activity of agricultural soils[END_REF]. In addition, an increasing number of these compounds are now considered endocrine disruptors (EDCs) [START_REF] Jiang | Pretilachlor has the potential to induce endocrine disruption, oxidative stress, apoptosis and immunotoxicity during zebrafish embryo development[END_REF]Nasri et al. 2021a). Estrogenic EDCs act by modulating the interaction between 17β-estradiol (E2) and estrogen receptors (ER) that deregulate physiological functions [START_REF] Sonnenschein | An updated review of environmental estrogen and androgen mimics and antagonists[END_REF]. Nasri et al. (2016a) showed that A6 exercised antiestrogenic activity and down-regulate cell proliferation in zebrafish brain after decrease of gene transcription of estrogen receptors (ER). It has been demonstrated also that α-terthienyl has the capacity to inhibit several enzymes such as superoxide dismutase (SOD) and acetylcholinesterase (AChE) both in vitro and in vivo leading to important consequences in mosquito larvae nervous system [START_REF] Nivsarkar | Alpha-terthienyl: A plant-derived new generation insecticide[END_REF]. New data have shown that A6 at 5 mg/kg accelerates the prion pathology in mice after treatment [START_REF] Lafon | Low doses of bioherbicide favour prion aggregation and propagation in vivo[END_REF]. Generally, biopesticides classified as endocrine disruptors (EDCs) have shown harmful effects on the nervous system development in aquatic organisms [START_REF] Legradi | An ecotoxicological view on neurotoxicity assessment[END_REF]. Neurotoxicity caused by these environmental pollutants is responsible for changes in locomotor behavior and an alteration in the regulation of the dopaminergic systems [START_REF] Paiva | Behavioral plasticity and gene regulation in the brain during an intermittent ethanol exposure in adult zebrafish population[END_REF][START_REF] Xin | Effects of prednisolone on behavior and hypothalamic-pituitary-interrenal axis activity in zebrafish[END_REF].

Tyrosine hydroxylase is used as biomarker dopaminergic neurons since it is a dopamine synthesis enzyme [START_REF] Hokfelt | Immunohistochemical studies on the localization and distribution of monoamine neuron systems in the rat brain. I. Tyrosine hydroxylase in the mes-and diencephalon[END_REF][START_REF] Pickel | Ultrastructural localization of tyrosine hydroxylase in noradrenergic neurons of brain[END_REF]. Dopamine is considered is a neurohormone and neurotransmitter that plays a crucial role in regulating animal life by acting in both the central and peripheral nervous systems [START_REF] Ugrumov | Developing brain as an endocrine organ: Secretion of dopamine[END_REF]. Dopamine in the peripheral nervous system has been reported in the kidneys, carotid bodies, peripheral arteries, and parts of the gastrointestinal, genitourinary, and endocrine systems [START_REF] Pivonello | Novel insights in dopamine receptor physiology[END_REF]). The monoaminergic neurons use dopamine as a transmitter, and it contributes to a variety of functional processes in the vertebrates [START_REF] Zagrean | Principles of Neural Science[END_REF]. The very wide distribution of dopaminergic cells in the central nervous system illustrates its involvement in a varied range of central functions, such as motivation [START_REF] Schultz | Getting formal with dopamine and reward[END_REF], learning and memory (Goldman-Rakic 1997), affective and emotional processes [START_REF] Diehl | Nuclear progesterone receptors are up-regulated by estrogens in neurons and radial glial progenitors in the brain of zebrafish[END_REF], control of body temperature [START_REF] Cox | Dopamine receptors in the central thermoregulatory pathways of the rat[END_REF], locomotion [START_REF] Mok | Effects of dopaminergic drugs on locomotor activity in teleost fish of the genus Oreochromis (Cichlidae): Involvement of the telencephalon[END_REF], and behaviors [START_REF] Dufour | Neuroendocrine control by dopamine of teleost reproduction[END_REF].

Because the multiple advantages (small size, high fecundity, short life cycle, and facile breeding in the laboratory), zebrafish was used for behavioral and developmental studies [START_REF] Grunwald | Headwaters of the zebrafish -emergence of a new model vertebrate[END_REF], genetics research [START_REF] Eisen | Zebrafish make a big splash[END_REF], and toxicology bioassays [START_REF] Hill | Developmental estrogenic exposure in zebrafish (Danio rerio): I. Effects on sex ratio and breeding success[END_REF]. In our study, it was used to determine the acute toxicity of the biopesticide A6 at low concentrations. The aim was to evaluate the associated physical malformations, the body accumulation, and locomotion behavior as well as to determine the mechanism responsible in relation with the toxicity by evaluation the TH expression after exposure.

Materials and Methods

Fish strains and embryos treatment

The pyrimidino bithiophene or biopesticide A6 and Dimethyl sulfoxide (DMSO) were obtained from Maybridge [START_REF] Friedman | A theoretical study of 2,2′;5′,2″-terthiophene (α-T) and its analogs. Part 1. Correlation of electronic structure and energies with herbicidal phototoxicity[END_REF]. Animals were treated in the laboratory Inserm U1198 following the National and European ethic guidelines under permit number (agreement #A34-172-37). Fish were fed twice daily and handled according to standard procedures in the laboratory [START_REF] Westerfield | The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio), 5th Edition[END_REF]. Adult fish were maintained at 28 °C, with a circadian rhythm (14 h of light and 10 h of darkness), in a recirculation, flowthrough system where tank water is constantly filtered. Embryos were obtained from pair matings and exposed in groups in an incubator, which was staged according to a previously published method (Nasri et al. 2021b). Embryos of wild-type AB line were dechorionated at 24 hpf, and then kept in the incubator (28 °C) in six-well plates, with 10 to 20 embryos in two milliliters (per well) of solution for A6 tissue accumulation study, body malformations and locomotion behaviors, or in glass bottles, with 80 embryos in one hundred milliliters of solution for gene expression and immunochemical study. For all experiments, the A6 concentrations tested were 0.5 nM, 5 nM, and 50 nM when compared to a DMSO control.

Response of zebrafish larvae to the effects of A6

Embryos of wild-type AB were treated with all concentrations of A6 or to solvent control (DMSO) for 6 or 9 days. Morphological abnormalities were identified using a stereomicroscope (Olympus Corporation). Three separate experiments were effectuated and 10 larvae were used for each condition. Individual malformation was expressed as the percentage of embryos with at least one malformation, in comparison to the control.

Measurement of A6 accumulation in tissues

Tricaine was used for anesthetizing embryos of wild-type AB (Nasri et al. 2016a) and put on slides using agar, at the end of treatment to A6 or to control DMSO. Using confocal microscopy and ImageJ software, we were capable to follow fluorescence labeling in contaminated and un contaminated embryos and process the associated images. The number of zebrafish embryos observed for each condition was more than 10 for three distinct experimentations.

Locomotor behavior measurement

Behavioral swimming was conducted using an automated behavior recording system, Zebrabox (ViewPoint Life Science, France), after zebrafish larvae treatment to A6 or control DMSO. Wild-type embryos were placed individually in a monitoring area in Zebrabox mounted with a camera system and their free-swimming activities were continuously recorded for the succeeding ten minutes (Nasri et al. 2016a). The swimming of more than 2 mm is represented by red lines; small movements (0.5-2 mm) are symbolized by green lines, and trips below 0.5 mm indicate inactivity. The number of animals followed for a given concentration was more than fifteen for three distinct experiments.

Gene expression measurement by q-PCR

Fertilized wild-type embryos were exposed from 1 to 6 dpf with all concentrations of A6 or to control DMSO. Each experimental group consisted of 80 embryos treated in 100 ml of solution. A set of sixty animal brains were used to extract total RNA using RNeasy Mini Kit (Qiagen, Courtaboeuf, France) (Diotel et al. 2011). Extracts were treated with RNase free DNase to purify the RNA from DNA contamination. Total RNA concentration was quantified using a nanodrop spectrophotometer, and quality was verified by measuring the 260/280 nm ratio (1.8-2.0) (Nasri et al. 2016a). A Reverse-transcription followed by real-time PCR amplification was applied for mRNAs. The relative target genes transcription was performed with SYBR green detection, as previously described (Nasri et al. 2016a). QRT-PCR was performed with six biological replicates (three technical replicates) using a LightCycler 480 Instrument and the protocol consisted of the following phases: denaturation of PCR reaction mixture at 95 °C for 10 min followed by 45 cycles of amplification cycle profile (denaturation for 10 s at 95 °C; annealing for 10 s at 60 °C; and elongation for 10 s at 72 °C). Real-time detection of the SYBR green fluorescence effect (reflecting the amount of PCR produced) was determined at the end of each elongation part. Construction of standard curves using DNA standards was performed in order to display the consistency and efficiency of each qRT-PCR test. Expression of the target gene was quantified based on the comparative cycle threshold (Ct) method (Nasri et al. 2016a). Normalized expression was calculated for quantification according to the 2-ΔΔCT method [START_REF] Schmittgen | Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method[END_REF] with the internal control gene, ef1a. Elongation factor 1 alpha (ef1a) was chosen as a reference [START_REF] Mccurley | Characterization of housekeeping genes in zebrafish: Malefemale differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment[END_REF] because of its stability during zebrafish development and after treatment to environmental pollutants [START_REF] Tang | Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization[END_REF]. For the amplification of cDNA, oligonucleotide primers were used as described in Table 1.

Immunolabelling TH

After exposure to A6 or control DMSO for 6 days, zebrafish larvae were put in 4% paraformaldehyde (PFA) in phosphate-buffered saline (PBS) + 0.5% Triton at ambient temperature for 2.5 h with agitation and then washed with PBS. Then, the samples were fixed with PFA using Triton for 2 h for permeabilization, followed by blocking using a solution (PBS 1×/BSA 1×/DMSO 1×) and incubating with TH primary antibodies (TH, 1:500, ThermoFisher # PA1-4679) overnight at 4°C for immunofluorescence studies. The following day, the zebrafish were laved with PBST while changing the solution regularly (every 1-2 h).

Fluorescence-conjugated secondary antibody Alexa-488 (1/1000) was added to the primary antibody and left overnight (at 4°C). The next morning, larvae were washed in PBST (at least four times for 30 min each), ideally all day. Hoechst dye (stock 7.5 mg/ml; 1/1000) was added after the last wash, followed by incubation for 40 min and then washing with PBST (three times).

Imaging analysis and fluorescence quantification

Zebrafish larvae were placed in depressed slides in a drop of agarose (1%) and were immersed in system water and subjected to imaging using a water immersion objective from a confocal microscope (Leica, SPE). Stacks of images were processed and quantified with ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). The nomenclature used for the brain nuclei and regions was in accordance with that of the zebrafish atlas [START_REF] Rink | Development of the catecholaminergic system in the early zebrafish brain: An immunohistochemical study[END_REF].

Data analysis

When our data showed approximate normality, analysis of variance (1-ANOVA) was chosen for global search of differences, and Tukey's HSD test was eventually used to compare treatment effects of the biopesticide A6 and control groups for evaluation of the malformation rate, swimming behavior, and gene expression. An α of 0.05 assesses the significance of differences for all measures.

Results

A6 caused morphological abnormalities in zebrafish larvae

The treatment of embryos from 24 hpf with the highest nanomolar concentration of A6 caused some abnormalities in zebrafish larvae, including yolk sac edema (YSE), spinal curvature (SC), tail deformity (TD), and pericardial edema (PE) (Fig. 1A). PE, TD, and SC were observed after 6 days, and YSE was detected only after 9 days of exposure at the same concentration (Fig. 1A). The total malformation rates in the group treated with 50 nM A6 were 16.66% (p=0.0006) after 6 days and 36.66% (p < 0.0002) after 9 days of experience (Fig. 1B).

Measurement of tissus accumulation with A6

We examined whether the biopesticide A6 might accumulate in the body of zebrafish larvae after 6 days of exposure at all of the considered concentrations. Zebrafish larvae were placed in depressed slides in a drop of agarose (1%) and were immersed in system water, followed by imaging using a water immersion objective from a confocal microscope (Leica, SPE). The results showed that A6 accumulated in the intestine, adipose tissue, muscle, yolk sac and head based on its blue fluorescence and the ability to detect this by confocal microscopy, when compared with control DMSO (Fig. 2).

A6 changed the locomotor behavior

The results showed that A6 significantly altered the free-swimming distance of zebrafish larvae in the center and periphery at all concentrations. Figure 3 displays that the swimming behavior of zebrafish larvae was affected by treatment with all concentrations of A6. At the center, the duration of inactivity (distance less than 0.5 mm), as well as the time spent for medium and long trips, was long. At the periphery, the idle time was short, as was the time spent moving medium and long distances.

A6 downregulates gene expression

The level of mRNA of each of the TH isoforms, th1 and th2, showed a clear dosedependent decrease following exposure to the biopesticide A6. Exposure to A6 or to the control DMSO from 1 dpf until 6 dpf caused significant decreases in the mRNA level of th2 in the range of 0.3-(p=0.005), 0.32-(p=0.006) and 0.51-(p=0.037) (Fig. 4B). In addition, the mRNA level of th1 was decreased in order 0.69-(p=0.040) only with 50 nM of A6 (Fig. 4A).

These results reveal that the biopesticide A6 could directly or indirectly disturb the synthesis of enzymes regulating dopamine synthesis in zebrafish following exposure to it.

Imminochimistry TH

To confirm the locomotor disruption observed after treatment with the biopesticide, animals were treated to A6 or control DMSO. Changes in the patterning of their dopaminergic neurons were examined at 6 dpf. The nomenclature used for the dopaminergic neurons was as described previously [START_REF] Tay | Comprehensive catecholaminergic projectome analysis reveals single-neuron integration of zebrafish ascending and descending dopaminergic systems[END_REF]. Low doses of A6 resulted in appreciable changes of brain TH expression compared with that in the control (Fig. 5). The first changes in neuronal patterning were observed in the olfactory bulb (OB) at all concentrations tested, where labeling of these neurons showed a decrease in fluorescence intensity (Fig. 5B-D) in contrast to control (Fig. 5A). The subpallium within the telencephalon (SP) also appears not to be altered by A6. In the pre-tectal (Pr) area, the density of neuronal labeling was not affected (Fig. 5F-H) compared with that in the control DMSO group (Fig. 5E). In addition, neuronal labeling in the area postrema (AP) showed a reduction with only the 50 nM of A6 (Fig. 5L) compared with the control (Fig. 5I).

Discussion

Our study investigated the deleterious effects of A6 on zebrafish larvae. The results showed that this biopesticide has adverse effects on neurodevelopment after its accumulation in the lateral line (Nasri et al. 2016a) in the organs (Fig. 2). It also has disturbed the expression of the key genes related to the control of neurodevelopment. The exposure of zebrafish larvae to A6 resulted in malformations only at 50 nM. [START_REF] Vismara | Parkinson's disease-like motor and non-motor symptoms in rotenone-treated zebrafish[END_REF] showed that the herbicides (paraquat and diquat) are highly embryotoxic and cause malformations in zebrafish larvae, primarily by causing lipid peroxidation. Generally, pesticides act by affecting various visceral organs in a way that causes abnormalities in different parts of the corps [START_REF] Hamm | The role of development and duration of exposure to the embryotoxicity of diazinon[END_REF][START_REF] Willey | Effects of endosulfan and nonylphenol on the primordial germ cell population in pre-larval zebrafish embryos[END_REF]. In addition to these morphological changes, exposure to pesticides at the embryonic and larval stages also results in decline hatching success and larval death [START_REF] Aydin | Acute toxicity of diazinon on the common carp (Cyprinus carpio L.) embryos and larvae[END_REF] or behavioral modifications [START_REF] González-Doncel | Stage sensitivity of medaka (Oryzias latipes) eggs and embryos to permethrin[END_REF][START_REF] Kienle | Behavioural and developmental toxicity of chlorpyrifos and nickel chloride to zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae[END_REF]. These data are alike to those in our current study in which A6-treated embryos showed abnormal behaviors. [START_REF] Slotkin | Cholinergic systems in brain development and disruption by neurotoxicants: Nicotine, environmental tobacco smoke, organophosphates[END_REF] asserted that organophosphate pesticides cause developmental neurotoxicity and long-term cognitive and behavioral effects through routes including catecholaminergic mechanisms, as well as affecting cell signaling pathways involved in neural cell differentiation. In our study, in the A6-exposed groups, the locomotor behavior was disturbed. This may have been associated with the potential neurotoxicity of biopesticides (Fig. 3), which was in agreement with a previous article by (Nasri et al. 2016a), or related to nervous system alteration.

Generally, behavior is used as an index for evaluating neurodevelopment and has been appeared to be very sensitive to environmental pollutants early in life [START_REF] Rihel | Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation[END_REF].

Exposure to members of the organophosphate pesticide family has been shown to alter swimming behavior [START_REF] Sledge | Critical duration of exposure for developmental chlorpyrifos-induced neurobehavioral toxicity[END_REF] and the reply to a surprising excitation [START_REF] Eddins | Zebrafish provide a sensitive model of persisting neurobehavioral effects of developmental chlorpyrifos exposure: Comparison with nicotine and pilocarpine effects and relationship to dopamine deficits[END_REF]. Several studies have also observed reduced locomotor movement in larval fish immediately following embryonic treatment to chlorpyrifos [START_REF] Richendrfer | Developmental sub-chronic exposure to chlorpyrifos reduces anxiety-related behavior in zebrafish larvae[END_REF][START_REF] Dishaw | Developmental exposure to organophosphate flame retardants elicits overt toxicity and alters behavior in early life stage zebrafish (danio rerio)[END_REF]. In addition, exposure to the insecticide imidacloprid during the embryonic period was found to reduce the motion activity of zebrafish larvae [START_REF] Crosby | Neurobehavioral impairments caused by developmental imidacloprid exposure in zebrafish[END_REF]. Numerous analyses have displayed that various neurotransmitter systems and cellular functions are affected by exposure to organophosphate pesticides during the developmental period. A significant quantity of investigation has concentrated on recognizing the mechanisms by which pesticides apply their effects on normal behavioral development. However, exposure to organophosphates during development leads to transcriptional changes in genes linked to the action of the serotonin, dopamine, and norepinephrine neurotransmitter systems [START_REF] Slotkin | Permanent, sexselective effects of prenatal or adolescent nicotine exposure, separately or sequentially, in rat brain regions: Indices of cholinergic and serotonergic synaptic function, cell signaling, and neural cell number and size at 6 months of age[END_REF]. Several factors may contribute to altered behavior at low doses, such as a rise in dopamine release in synapses caused by stress [START_REF] Abercrombie | Differential Effect of Stress on In Vivo Dopamine Release in Striatum, Nucleus Accumbens, and Medial Frontal Cortex[END_REF]) and a decrease in the uptake of dopamine by dopamine transporters [START_REF] Araki | Characterization of mouse striatal precursor cell lines expressing functional dopamine receptors[END_REF]. The activity change may be due to dopamine-initiated modification in other nervous system pathways that regulate locomotion [START_REF] Friedman | A theoretical study of 2,2′;5′,2″-terthiophene (α-T) and its analogs. Part 1. Correlation of electronic structure and energies with herbicidal phototoxicity[END_REF]. The appearance of behavioral defects after exposure to A6 could be linked to possible effects in the brain, mainly on neurotransmitters. These play an essential role in the nervous system development [START_REF] Lu | Thyroid Disruption by Bisphenol S Analogues via Thyroid Hormone Receptor β: in Vitro, in Vivo, and Molecular Dynamics Simulation Study[END_REF][START_REF] Tufi | Simultaneous analysis of multiple neurotransmitters by hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry[END_REF]. A number of studies have published that chemical pollutants might have adverse effects on zebrafish neurotransmitters (Q. Li et al. 2018;[START_REF] Li | A protective role of autophagy in TDCIPP-induced developmental neurotoxicity in zebrafish larvae[END_REF][START_REF] Tufi | Changes in Neurotransmitter Profiles during Early Zebrafish (Danio rerio) Development and after Pesticide Exposure[END_REF]. In particular, the dopaminergic system is considered to consist of regulator neurotransmitters and is linked to behavior and nervous disorders [START_REF] Zagrean | Principles of Neural Science[END_REF]. Dopamine is a well-described neurotransmitter known for its initiating function of motor activity in the vertebrates' brain [START_REF] Yamamoto | Evolution of dopamine receptor genes of the D1 class in vertebrates[END_REF]. A variety of pesticide groups have been related with selective dopaminergic degeneration, including dithiocarbamates, and organochlorines [START_REF] Hatcher | Parkinson's disease and pesticides: a toxicological perspective[END_REF][START_REF] Jones | The effects of environmental neurotoxicants on the dopaminergic system: A possible role in drug addiction[END_REF], many of which have been shown to induce a loss of dopaminergic neurons causing a parkinsonian syndrome [START_REF] Bové | Toxin-induced models of Parkinson's disease[END_REF][START_REF] Drechsel | Role of reactive oxygen species in the neurotoxicity of environmental agents implicated in Parkinson's disease[END_REF]. Other studies have shown that neurobehavioral defects are associated with developmental exposure to chlorpyrifos and can change brain dopamine content [START_REF] Aldridge | Alterations in central nervous system serotonergic and dopaminergic synaptic activity in adulthood after prenatal or neonatal chlorpyrifos exposure[END_REF][START_REF] Chen | Different reaction patterns of dopamine content to prenatal exposure to chlorpyrifos in different periods[END_REF]. [START_REF] Sallinen | MPTP and MPP+ target specific aminergic cell populations in larval zebrafish[END_REF] showed that the pesticide MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) causes specific loss of dopaminergic neurons, decreases of the dopamine levels, and impaired motility in zebrafish larvae.

Changes in dopaminergic neuron and neurotransmitter levels were also found to be correlated with a locomotor phenotype in larval zebrafish described as a deficit in global swimming parameters [START_REF] Tufi | Changes in Neurotransmitter Profiles during Early Zebrafish (Danio rerio) Development and after Pesticide Exposure[END_REF]. In our study, the biopesticide A6 appeared to induce damage to dopamine neurons by initiating a Bax-dependent apoptosis pathway and decreasing cell proliferation in the brain (Nasri et al, 2016a). [START_REF] Vismara | Parkinson's disease-like motor and non-motor symptoms in rotenone-treated zebrafish[END_REF] reported that the exposure of adult zebrafish to rotenone decreased the levels of dopamine and TH, and caused altération in motor function and behavior, as well as olfactory dysfunction. Precedent studies indicated that dopaminergic neurons are susceptible to paraquat [START_REF] Mccormack | Environmental risk factors and Parkinson's disease: Selective degeneration of nigral dopaminergic neurons caused by the herbicide paraquat[END_REF][START_REF] Prasad | Toxicokinetics and toxicodynamics of paraquat accumulation in mouse brain[END_REF]) and a diminution of motor activity can results [START_REF] Shepherd | The potentiating effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) on paraquat-induced neurochemical and behavioral changes in mice[END_REF][START_REF] Litteljohn | Interferon-γ deficiency modifies the motor and co-morbid behavioral pathology and neurochemical changes provoked by the pesticide paraquat[END_REF].

Tyrosine hydroxylase is the first enzyme involved in the synthesis of catecholamines, especially dopamine [START_REF] Nagatsu | Tyrosine hydroxyalse. The initial step in norepinephrine biosynthesis[END_REF]. It is the molecular marker most commonly used in teleosts as in mammals to evaluate the rate of biosynthesis of neurotransmitters by measuring TH enzymatic activity [START_REF] Chaube | Effects of altered photoperiod and temperature, serotonin-affecting drugs, and melatonin on brain tyrosine hydroxylase activity in female catfish, Heteropneustes fossilis: A study correlating ovarian activity changes[END_REF] or TH protein [START_REF] Pasqualini | Inhibitory Actions of Acute Estradiol Treatment on the Activity and Quantity of Tyrosine Hydroxylase in the Median Eminence of Ovariectomized Rats[END_REF] or mRNA levels [START_REF] Weltzien | Androgen-dependent stimulation of brain dopaminergic systems in the female European eel (Anguilla anguilla)[END_REF]. Our results showed that treatment of zebrafish embryos with A6 significantly decreased the mRNA level of th1 at only the highest concentration of 50 nM and the level of th2 at all tested concentrations. In a preceding study, [START_REF] Brooks | Paraquat elicited neurobehavioral syndrome caused by dopaminergic neuron loss[END_REF] showed that paraquat can diminish TH levels in the striatum in mice. In addition, [START_REF] Reeves | Interactions of Paraquat and Triadimefon: Behavioral and Neurochemical Effects[END_REF] measured TH levels in striatal sections of rat brains treated chronically with paraquat by both HPLC and immunohistochemistry and observed a decrease in TH in both analyses.

Many studies have related the exposure to chlorpyrifos to cell signaling perturbations affecting accordingly dopamine receptor signaling [START_REF] Adigun | Disparate developmental neurotoxicants converge on the cyclic AMP signaling cascade, revealed by transcriptional profiles in vitro and in vivo[END_REF][START_REF] Meyer | Developmental neurotoxicity elicited by gestational exposure to chlorpyrifos: When is adenylyl cyclase a target?[END_REF][START_REF] Meyer | Developmental effects of chlorpyrifos extend beyond neurotoxicity: Critical periods for immediate and delayed-onset effects on cardiac and hepatic cell signaling[END_REF]. The decreased TH expression observed in our present report is possibly attached to the potential of the biopesticide A6 to inhibit cell proliferation (Nasri et al. 2016a). Additionally, A6 has the potential to cause endocrine disruption, being known to change the mRNA expression of estrogenic hormone-related genes such as esr1 and esr2a (Nasri et al. 2016a).

The involvement of estrogenic hormones in the regulation of TH expression has been suggested by several groups [START_REF] Thompson | Estrogen Regulation of Dopamine Release in the Nucleus Accumbens: Genomic-and Nongenomic-Mediated Effects[END_REF][START_REF] Zhang | Effects of manganese on tyrosine hydroxylase (TH) activity and TH-phosphorylation in a dopaminergic neural cell line[END_REF][START_REF] Tobiansky | Estradiol in the Preoptic Area Regulates the Dopaminergic Response to Cocaine in the Nucleus Accumbens[END_REF]. This regulation takes place through the control of the transcription of the sensitive genes by nuclear receptors and may explain the TH expression identified in our work.

Conclusions

Our current results demonstrate that the exposure of zebrafish larvae to A6 led to a significant modification of the locomotion profile associated with the observation of neurological damage and a decrease in the expression of TH. These changes recorded were generally correlate with the alteration of physiological hormonal functions [START_REF] Scott | The effects of environmental pollutants on complex fish behaviour: Integrating behavioural and physiological indicators of toxicity[END_REF][START_REF] Tierney | Behavioural assessments of neurotoxic effects and neurodegeneration in zebrafish[END_REF]Nasri et al. 2016a). These negative effects are triggered by disruption of estrogenic signaling pathways. Our results have just approved and added additional information on the impact of pesticides of plant origin on non-target species and highlight the importance of toxicological studies on the zebrafish model species.

Figure Captions

Fig. 1

 1 Fig. 1 Effect of A6 on zebrafish morphology after 6 and 9 days of treatment. (A): PE, pericardial edema; YSE, yolk sac edema; SC: spinal curvature; TD, tail deformity. (B): Percentage malformation rate for all tested concentrations of A6. Asterisks indicate significantly differences from the control, symbols: * = p < 0.05; ** = 0.05 ≤ p < 0.001; *** = 0.001 ≤ p < 0.0001.

Fig. 2

 2 Fig. 2 A6 accumulation in zebrafish tissue. (A, C, E, G, I) head with Bright field and Fluorescence of confocal microscopy; (B, D, F, H, J) the rest of the body. Scale bars: 100 µm. Asterisks indicate significantly differences from the control, symbols: * = p < 0.05; ** = 0.05 ≤ p < 0.001; *** = 0.001 ≤ p < 0.0001.

Fig. 3

 3 Fig. 3 Effect of A6 on larval swimming behavior. Species are put individually in an observation chamber and their movements are continuously recorded over the next 10 min.

Figure

  Figure shows four representative tracks from 20 larvae as well as the duration of trips to the center or to the periphery (expressed in s) after A6 exposure or to control (DMSO). The overall activity for each exposure group was represented by symbols: +: active; -: less active;

Fig. 4

 4 Fig. 4 Relative gene expression of th1 and th2 after A6 exposure. Results are given as mean values ± SEM (n = 9 replicates). Asterisks indicate significantly differences from the control, symbols: * = p < 0.05; ** = 0.05 ≤ p < 0.001; *** = 0.001 ≤ p < 0.0001.

Fig. 5

 5 Fig. 5 Tyrosine hydroxylase immunohistochemistry in wild type zebrafish larvae (6 dpf) exposed to A6. Olfactory bulb (OB), telencephalon (Tel), subpallium (SP), pretectum (Pr), optic tectum (TeO), area postrema (AP), Green staining is tyrosine hydroxylase-positive catecholaminergic cells. (A, E, I) represent a strong positive labeling of tyrosine hydroxylase in the forebrain in control animals. (B, C, D), (F, G, H) and (J, K, L) show the areas of immunostaining of tyrosine hydroxylase respectively in the telencephalon and the diencephalon (pretectum and postrema) in individuals treated with A6. These are dorsal views of 100 µm sections of the brain.

Table 1 .

 1 Primers used for qRT-PCR analyses.

Acknowledgments

The authors extend their appreciation to INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, France) for supporting several missions for Dr. Ahmed Nasri in Montpellier. We thank Elodie Jublanc and Vicky DIAKOU for help and training on SPEconfocal.

Funding

This work was funded by Taif University Research through Project number (TURSP-2020/28), Taif University, Taif, Saudi Arabia.

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Disclosure statement

The authors have no conflict of interest.

Ethical statements: This article was approved by INSERM and Montpellier University (agreement #A34-172-37, 10 April 2013).