PhD Steffi Rocchi
email: steffi.rocchi@univ-fcomte.fr

Manon Ponçot

Nadia Morin-Crini

Audrey Laboissière

& Benoit Valot

Chloé E Godeau

Clothilde Léchenault-Bergerot

PhD Gabriel Reboux

Grégorio Crini

Laurence Millon

PhD Emeline Scherer

Audrey Laboissiere

Clothilde Lechenault-Bergerot Msc

PhD Steffi Rocchi

Éva Fenyvesi

Fatemeh Haghighi

Marc Fourmentin

Christophe Ramseyer

Determination of azole fungal residues in soils and detection of Aspergillus fumigatus-resistant strains in market gardens of Eastern France

Keywords: Autres communications triazoles, Aspergillus fumigatus, environmental pollution, antifungal resistance, cyclodextrin, agriculture 1973 céréales, betteraves, choux, raisins 39 1979 céréale, maïs, riz, cacahuètes, amandes, sorgho, avoine, noix de pécan, abricots, prunes, pruneaux, pêches, nectarines, préservation du bois pommes, bananes, céréales, cacahuètes, plantes ornementales, haricots, soja, préservation du bois 13 1983 céréales, maïs, soja, pommes 30 Diniconazole cacahuètes, raisins, céréales, plantes ornementales 11 Penconazole raisins, pommes, poires, pêches, prunes, abricots, fraises, plantes ornementales, houblon, concombres, tomates 17 1986 raisins, pommes, poires, bananes, légumes, céréales à petits grains, préservation du bois 27 céréales, légumes, pois, haricots, asperges, colza, betteraves, pommes, pêches, amandes 76 Myclobutanil cultures pérennes et annuelles, gazon, plantes ornementales, arbres fruitiers, raisins 60 Tebuconazole céréales, raisins, cacahuètes, oignons, pois, poivrons, bananes, cannes à sucre, préservation du bois carottes, asperges, choux, pommes de terre, céréales, maïs, coton, colza 93 Tetraconazole betteraves, blé, raisins, pommes 31 Fenbuconazole céréales, vignes, fruits, bananes DMI fungicides . Aspergillus fumigatus resistance . Market gardens . TR34/L98H mutation . TR46/Y121F/T289A mutation . Selection pressure Triazole resistance Tulips TR34/L98H Aspergillus fumigatus, azole resistance, organic tulips bulbs, hospital environment, TR 34 /L98H qPCR detection

The negative impact of human activities on the ecosystem is significant. Environmentally oriented studies in multidisciplinary approaches are needed to better understand and limit this impact. One of the major issues is the development of antimicrobial resistance, of which one example is the resistance of Aspergillus fumigatus to triazoles. This ubiquitous mould species is an opportunistic pathogen for humans and animals. The therapeutic alternatives to combat this fungus are few and essentially based on triazoles. However, mechanisms of resistance to these treatments have been described worldwide and are partly linked to the excessive use of triazole molecules in the environment to fight against phytopathogenic moulds, whose chemical structures are very close to those of triazoles in medical use. This impact, described as unintended, is a source of emergence and spread of resistant fungal strains. The aim of this research was to compare different areas of application of triazole molecules, ranging from cereal crop fields to vegetable farms and ornamental plant beds, in order to better understand the conditions in which this resistance develops. This multiscale approach enabled us to highlight a gradient of resistance according to the areas studied. Thus, while the soils of cereal crops did not present any resistant isolates, 71% of the isolates found in the ornamental plants surrounding Besancon hospital centre proved to be resistant to triazoles, classifying the bulbs of these triazole-treated plants as potential resistance "hotspot". Therefore, the transition to the use of organically grown bulbous plants is necessary to avoid exposure of populations at risk, especially around the hospital. While in certain agricultural types where these fungicides guarantee good production yields, innovative approaches must be developed to limit the emergence of this public health problem. Cyclodextrins, cage molecules resulting from the degradation of starch, seem to be an interesting avenue.

Remerciements

Je souhaite d'abord remercier Dr Laure Mamy d'avoir accepté d'évaluer mon travail de recherche, merci pour ses remarques très complètes et constructives. Merci à Pr Françoise Botterel-Chartier qui a accepté de juger mon travail de master puis de thèse, merci pour votre bienveillance dans vos retours et pour l'enthousiasme que vous avez témoigné tout au long de ces travaux. Merci à Dr Fabrice Martin-Laurent et Pr Sophie Fourmentin de m'avoir accompagnée tout au long de ce travail lors des comités de suivi et d'avoir accepté de prendre part à mon jury de thèse. Merci pour vos conseils qui ont permis d'améliorer ce travail et d'ouvrir de nouvelles pistes de recherche, merci pour votre implication. Merci à Dr Jolanta Rousseau pour les remarques positives et les encouragements témoignés sur ce travail, merci pour votre gentillesse. Merci à Dr Frédéric Gimbert d'avoir accepté de prendre part au jury de ma soutenance.

Merci à Dr Nadia Crini et Dr Steffi Rocchi pour leur encadrement dans cette thèse. Nadia, merci pour ta disponibilité et pour ton écoute. Merci de m'avoir accompagnée à chaque étape tant dans les démarches administratives que dans les manips qui nous faisaient parfois partir tard. Merci pour ton soutien qui m'a été indispensable. Steffi, on aura travaillé ensemble sur 5 ans, tu m'as appris énormément de choses et tu m'as donné de la confiance pour que je fasse cette thèse. Merci de m'avoir transmis une partie de cette passion pour la recherche, pour les discussions qui aboutissaient parfois à des projets de manips jamais vus. Merci à vous pour les échanges toujours riches et les moments de rire partagés.

Merci à mes collègues qui ont su me permettre de conserver mon envie d'aller travailler tous les matins (pour certains vraiment tous les matins parfois même le samedi, le dimanche…) et mon sourire après 19h (pas toujours j'en conviens mais souvent). Merci à tous mes collègues des Hauts du Chazal, Audrey C.L., tu m'as presque tout appris de ce que je sais sur le plan technique, merci pour tout. Mille mercis Susie, ton implication dans cette thèse a été tellement indispensable que je me sens un peu coupable de ne pas avoir mis ton nom en co-autrice, merci pour ton amitié. Eline, merci pour ton soutien et ton écoute. Merci à Benoît pour ton aide et ta gentillesse. Daniel, merci pour toutes les discussions et les moments de rire. Clothilde, Adeline, Coralie, Audrey G., Sandra, Loïs, Séverine, Didier, Charlotte, Catherine, Alexandre T., Soumaya, Aya et Julie merci pour tous les moments de convivialité. A mes collègues de la Bouloie : Grégo, merci pour ton implication sur le plan scientifique dans ce travail et pour ton aide. Merci Caroline pour ton aide dans les manips. Quentin et Charles, merci pour tout, de la capture des mulots aux mots fléchés j'ai adoré tous les moments que nous avons partagés et que j'espère nous continuerons de partager, avec Jimmy on formait un quatuor de co-bureaux du tonnerre. Merci à Chiara et Dario pour vos sourires et votre gentillesse. Merci à Alexandre L. et Honorine pour les moments partagés, les réunions de représentants des doctorants, grâce à vous tout ça semblait plus léger.

Merci à l'ensemble du laboratoire Chrono-environnement et à l'ensemble du service de parasitologie-mycologie du CHU. Merci à tous ceux que je n'aurais pas cité et qui ont participé de près ou de loin à la réalisation de cette thèse. Merci à vous tous pour ces années, le temps m'a paru parfois interminable, d'autres fois il m'a paru passer si vite. Vous avez tous contribué à la réalisation de cette thèse et grâce à vous j'ai pu profiter de cette expérience, vous l'avez rendue humaine et agréable. Merci à tous mes amis de longue date pour votre soutien sans faille avec une mention spéciale à Dessislava et Camille.

Un énorme merci à ma famille grâce à qui tout ça est devenu possible. A ma soeur et à mon frère, Laura et Victor, la gratitude n'est pas un mot assez fort pour exprimer ce que je ressens, je suis fière de faire partie de vos vies, vous m'êtes indispensables. A notre maman, Christine, tu as su être notre seul repère et tout nous donner, merci de m'avoir offert les moyens d'en arriver là et de réaliser ce travail. Merci à Jean-Eudes, à mes grands-parents, à mon oncle pour l'intérêt que vous avez porté à ce travail. A notre petit Mushu, notre compagnon qui m'a suivi dans toutes mes révisions, toutes mes répétitions, qui savait s'asseoir sur mon clavier quand elle jugeait que ça suffisait… merci. Tu es partie juste avant la soutenance et tu me manques tous les jours. A mon chéri, Camille, merci pour tout, ta capacité à rester zen a été indispensable pour compenser mon stress. Tu m'as soutenue dans tous les moments, particulièrement les plus difficiles, tu m'as aidée à aller jusqu'au bout. Merci pour tes encouragements, merci d'être là pour moi. Je suis heureuse de partager ces moments avec toi.

Avant-propos

Cette thèse a bénéficié d'un contrat doctoral attribué par l'école doctorale Environnements-Santé de l'Université de Bourgogne Franche-Comté. Ce contrat de thèse a été financé par le Ministère de l'Enseignement Supérieur, de la Recherche et de l'Innovation de la République Française. Le travail de thèse a été réalisé au sein de l'Unité Mixte de Recherche (UMR) 6249

Chrono-environnement à Besançon, qui est sous la double tutelle de l'Université de Franche-Comté (UFC) et du Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Les travaux de thèse se sont déroulés à l'Unité de Formation et de Recherche (UFR) Sciences et Techniques et à l'UFR Sciences de la Santé de l'UFC. Ce contrat a également été le support de plusieurs contrats de vacation d'enseignement, dont les 40 h équivalent TD ont été enseignées dans le département Sciences de la Vie de l'UFC.

Cette thèse a bénéficié des soutiens de l'Observatoire des Sciences de l'Univers (OSU), de la Zone Atelier Arc Jurassien (ZAAJ), du Réseau ECOtoxicologie-TOXicologie (RECOTOX) et du Centre Hospitalier Universitaire (CHU) de Besançon.

La plupart des résultats issus de ces recherches ont été valorisés par la rédaction d'articles scientifiques qui ont été intégrés à ce travail, et les parties n'ayant pas encore fait l'objet de publication ont été rédigées pour ce manuscrit. L'ensemble des données de matériel et méthode est présenté en annexe. [START_REF] Ram | Chapter 5-Five-membered heterocycles[END_REF] ________________________________ 33 Figure 3 : Voie de synthèse de l'ergostérol et action des antifongiques (tri)azolés. _______ 35 Figure 4 : Action des molécules azolées sur la membrane fongique. Une accumulation de stérols toxiques dans la membrane induit un effet fongistatique (Mycoses Study Group Education and Research Consortium, 2014). _____________________________________ 36 -3 , comprises entre 0,1 et 1 ng.m -3 et supérieures à 1 ng.m -3 . Les nombres entre parenthèses correspondent aux nombres totaux d'échantillons dans lesquels la substance active concernée a été retrouvée. Encadrées en rouge et de haut en bas, les molécules triazolées époxiconazole, tétraconazole, tébuconazole et difénoconazole [START_REF] Désert | Spatial and temporal distribution of current-use pesticides in ambient air of Provence-Alpes-Côte-d'Azur Region and Corsica, France[END_REF]. _______________________________________________________________ 40 Figure 8 : Distribution des résidus de difénoconazole (A) et de tébuconazole (B) dans des sols agricoles de Chine en mg.kg -1 (Pan et al., 2019). __________________________________ 43 Figure 9 : (A) Evaluation de la contamination en pesticides de 317 prélèvements de sols de surface (0-15 cm) dans l'Union Européenne. (B) Focus sur les molécules triazolées les plus fréquemment retrouvées dans les 270 prélèvements de sol de 9 pays d'Europe. D'après (Silva et al., 2019). _______________________________________________________________ 44 Figure 10 : Représentations schématiques de (A) l'interaction hydrophobe (B) la liaison hydrogène et (C) les interactions π-π. Réalisé avec Biorender _______________________ 46 Figure 11 : Exemples de risques liés à une exposition aux pesticides, dont les triazolés, chez l'Homme. D 'après Yura et al. 2021. Réalisé avec Biorender ________________________ 51 Figure 12 : Modification de la sensibilité des populations de Zymoseptoria tritici isolées dans le nord de l'Allemagne entre 1999 et 2020, aux triazolés, tébuconazole (AI ; BI) et propiconazole (AII ; BII). Les données sur l'efficacité des différentes concentrations de fongicides sont exprimées en pourcentage de réduction de la croissance fongique par rapport au témoin non traité. (BI-BII) Comparaison des valeurs de la EC50 (mg.L -1 ). Les valeurs de la EC50 ont été déterminées comme étant la concentration de fongicide réduisant la croissance fongique de 50 % (p ≤ 0,05). [START_REF] Birr | Temporal Changes in Sensitivity of Zymoseptoria tritici Field Populations to Different Fungicidal Modes of Action[END_REF]. ___________________________________ 54 Figure 13 : Observations macroscopique (après culture sur gélose DG18 pendant 4 jours à 37°C) et microscopique (coloration au bleu de lactophénol) de colonies d'Aspergillus fumigatus. _____________________________________________________ 57 Figure 14 : Principales pathologies causées par Aspergillus fumigatus et leurs incidences. [START_REF] Pettersen | UCSF Chimera -A visualization system for exploratory research and analysis[END_REF] Figure 15 : Les modes d'actions des différentes familles d'antifongiques sur la cellule fongique. Encadrées en rouge les familles de molécules utilisées préférentiellement dans le traitement des pathologies aspergillaires. Réalisé avec Biorender. ____________________________ 60 Figure 16 : Épidémiologie mondiale des fréquences de résistance (en %) aux azolés dans les isolats cliniques et environnementaux d'Aspergillus fumigatus. (Lestrade et al., 2019b) ___ 61 ; β-et γcyclodextrines (n= 6,7 et 8 respectivement). [START_REF] Crini | Cyclodextrins, from molecules to applications[END_REF] _____________________ 108 Figure 33 : Photos des dispositifs de prélèvement de poussières (A) girouette placée sur le toit ; (B)

Liste des figures

Liste des tableaux

Tableau 1 : Historique de mise sur le marché des molécules triazolées majeures dans la lutte contre les moisissures phytopathogènes et nombre de formulations commerciales associées à chacune d'entre elles. D'après [START_REF] Russell | A century of fungicide evolution[END_REF][START_REF] Jørgensen | Azole use in agriculture, horticulture, and wood preservation-is it indispensable?[END_REF]E-phy, Anses ___ 33 Tableau 2 : Synthèse non exhaustive des études montrant une contamination des eaux par les molécules triazolées. ________________________________________________________ 41 Tableau 3 : Caractéristiques chimiques des molécules triazolées époxiconazole, tébuconazole et difénoconazole. __________________________________________________________ 48 Tableau 4 : Exemples de demi-vies décrites dans la littérature pour les molécules triazolées d'époxiconazole, de tébuconazole et de difénoconazole. ____________________________ 48 Tableau 5 : Date de réévaluation de l'agrément de molécules triazolées et leurs classifications en Europe, en rouge les molécules retirées du marché, en vert les molécules dont l'agrément peut encore être renouvelé. (D'après l'European Comission of Food Safety, Règlement (CE) 1272/2008, 2008) _____________________________________________ 50 Tableau 6 : Diagramme d'évaluation des risques approximatifs de développement de résistance des moisissures phytopathogènes pour les (tri)azolés (inhibiteur de déméthylase). Le risque combiné est obtenu en multipliant le risque lié au pathogène par le risque lié au fongicide. Adapté de Brent & Hollomon, 2007. ____________________________________________ 53 Tableau 7 : Effet d'une forte dose de fongicides triazolés sur les micro-organismes du sol [START_REF] Roman | Effects of triazole fungicides on soil microbiota and on the activities of enzymes found in soil: A review[END_REF]. ________________________________________________________ 55 Tableau 8 : Exemple de mutations décrites dans le gène Cyp51A et phénotypes de résistance correspondant chez Aspergillus fumigatus. D'après [START_REF] Guegan | Résistance aux azolés chez Aspergillus[END_REF]. _______ 62 triazolés. Des mécanismes de résistance à ces traitements sont décrits sur tous les continents et sont liés, en partie, à l'utilisation, dans l'environnement, de molécules triazolées pour combattre les moisissures phytopathogènes, dont les structures chimiques sont très proches des triazolés à usage médical. Cet impact, qualifié de non intentionnel, est une source d'émergence et de diffusion de souches fongiques résistantes. Ce travail de recherche vise à comparer différents domaines d'application des molécules triazolées, allant des champs de cultures céréalières aux exploitations maraîchères et aux parterres de plantes ornementales, afin de mieux comprendre les conditions d'émergence et/ou de diffusion de cette résistance. Cette approche multi-échelle a permis de mettre en évidence un gradient de résistance en fonction des domaines étudiés.

Ainsi, alors que les sols des cultures céréalières ne présentent aucun isolat résistant, 71% des isolats retrouvés dans les plantes ornementales entourant le centre hospitalier de Besançon se sont avérés résistants aux triazolés, classifiant les bulbes de ces plantes traitées aux triazolés comme des « hotspots » potentiels de résistance. La transition vers l'utilisation de plantes à bulbes issues de l'agriculture biologique est nécessaire pour éviter l'exposition de populations à risque autour de l'hôpital notamment. Dans d'autres types d'agriculture où ces fongicides garantissent de bons rendements de production, des approches innovantes doivent être développées pour limiter l'émergence de ce problème de santé publique. Les cyclodextrines, molécules cages issues de la dégradation de l'amidon, semblent être une piste intéressante.

Mots clés : triazolés, Aspergillus fumigatus, pollution environnementale, résistance aux antifongiques, cyclodextrine, agriculture

Introduction générale

La pression écologique causée par l'explosion démographique est sans précédent. Nourrir la population mondiale devient un défi de santé publique. La sécurité alimentaire était d'ailleurs l'un des premiers objectifs mondiaux du programme de développement durable de 2015 des Nations Unies. Mais en 2020, plus de 45 millions d'enfants de moins de 5 ans souffraient encore de malnutrition dans le monde.

Les prédictions de l'ONU montrent que la population mondiale sera multipliée par 3 en moins de 100 ans, entre 1960 et 2050, atteignant ainsi les 9 milliards d'individus. Parallèlement, selon l'Union des Industries de la Protection des Plantes (https://www.uipp.org/), la surface agricole pourrait passer, sur la même période, de 4300 m 2 à 1900 m 2 par individu, principalement dû à la transformation des zones agricoles en zones artificialisées au profit des activités humaines.

Les pressions anthropiques qui s'appliquent sur l'agriculture sont donc amenées à augmenter puisque, pour subvenir au besoin global, les productions de denrées alimentaires devraient être augmentées de 70%. A défaut d'un changement dans nos pratiques de consommation, les pertes induites par des bioagresseurs, estimées aujourd'hui à plus de 30% de la production mondiale, devront diminuer. Sur les cultures céréalières, les bioagresseurs majeurs sont les ravageurs (e.g. oiseaux, insectes, rongeurs, acariens), les adventices ou bien encore les maladies, principalement causées par des moisissures. Afin de combattre ces bioagresseurs, de tout temps les hommes ont utilisé des procédés chimiques et développé des composés pesticides. En parallèle, la mécanisation et entre autres les nouveaux procédés d'application des pesticides par pulvérisation, ont permis de grandement faciliter l'usage de ces substances. Depuis les années 1960, l'usage des pesticides a été multiplié par 20, tandis que la production alimentaire mondiale a doublé [START_REF] Oerke | Crop losses to pests[END_REF].

L'usage des pesticides a été déterminant dans le développement agricole du siècle dernier. Ils ont notamment joué un rôle important dans la mise en place des productions dites « intensives ».

Au sein de ces substances biocides, on retrouve les herbicides contre les adventices, les fongicides agissant contre les moisissures phytopathogènes et pour finir les insecticides utilisés contre les ravageurs. En France, les herbicides et les fongicides sont les deux catégories de pesticides les plus largement utilisées (Ministère de l'agriculture, 2018.)

Les fongicides représentent la sous-catégorie de pesticides qui nous intéresse particulièrement dans ce travail. D'abord utilisés sous l'état de soufre ou de sels de cuivre fin du XIX ème et début du XX ème siècle, d'autres composés de synthèse sont apparus dans les années 1950, avec par exemple les dithiocarbamates et les phtalimides. L'arrivée sur le marché de composés de la famille chimique des azolés dans les années 1950 a représenté une réelle avancée dans la lutte contre les moisissures phytopathogènes.

Reconnus comme d'intérêt majeur pour la limite des pertes agricoles, et représentant un enjeu économique important, les azolés sont aujourd'hui considérés comme indispensables à l'indépendance de production céréalière de certains pays, notamment la France [START_REF] Price | Azole fungicides understanding resistance mechanisms in agricultural fungal pathogens[END_REF]. En revanche, l'usage massif de ces molécules au cours des dernières décennies est source d'impacts négatifs majeurs, associant pollution environnementale importante et effets sur des organismes non cibles. Cette problématique actuelle s'intensifiera dans le futur et consistera à allier augmentation de la production nécessaire à la population, réduction drastique des surfaces agricoles et changement climatique. Les facteurs agricoles (e.g. l'expansion des zones agricoles sur des écosystèmes naturels et l'intensification des méthodes de production : irrigation, utilisation d'engrais et biocides) sont déjà étroitement liés à l'émergence des maladies infectieuses [START_REF] Foley | Solutions for a cultivated planet[END_REF][START_REF] Rohr | Emerging human infectious diseases and the links to global food production[END_REF] et aux phénomènes de résistance aux antimicrobiens [START_REF] Azevedo | Genesis of azole antifungal resistance from agriculture to clinical settings[END_REF][START_REF] Ter Kuile | The risk of low concentrations of antibiotics in agriculture for resistance in human health care[END_REF][START_REF] Dalhoff | Does the use of antifungal agents in agriculture and food foster polyene resistance development? A reason for concern[END_REF]. Le changement climatique entraîne d'une part un stress accru sur les plantes et les animaux, les rendant plus sensibles aux infections fongiques (American Academy of Microbiology, 2019), et il réduit d'autre part de plus en plus la zone d'exclusion thermique qui protège normalement les animaux (notamment mammifères) des champignons. A cela s'ajoute une modification de la diffusion des pesticides dans l'environnement et donc de la contamination des écosystèmes (Figure 1). Ces molécules non désirables sont présentes dans différents compartiments environnementaux.

En premier lieu, les sols, qui sont largement exposés de par les techniques modernes de pulvérisation des fongicides sur les cultures. Puis les eaux de surface et les eaux souterraines qui sont impactées par des mécanismes de ruissellement ou d'infiltration. Enfin l'air qui se voit contaminé par des phénomènes de volatilisation. Les pesticides peuvent persister et être transportés via ces différents compartiments.

Depuis le début des années 2000, le concept « One health » (une seule santé) est largement mis en avant et souligne l'existence de liens étroits entre les santés humaines, animales et l'état des écosystèmes dans lesquels les êtres vivants évoluent. Ce concept encourage les recherches transdisciplinaires qui permettent de répondre aux problématiques liées à l'émergence de problèmes de santé publique. L'usage des triazolés dans l'environnement et leurs impacts sur Aspergillus fumigatus, une espèce pathogène opportuniste pour l'Homme et les animaux, est décrit comme un problème de santé publique émergent, ayant pour cause différents mécanismes de résistance [START_REF] Macedo | Emergence of triazole resistance in Aspergillus spp. in Latin America[END_REF]. Mieux comprendre la diffusion de ces fongicides dans l'environnement et les conditions de développement de ces résistances est un enjeu important afin d'en limiter les conséquences. [START_REF] Ram | Chapter 5-Five-membered heterocycles[END_REF] Le groupe Bayer a été le premier à développer des produits chimiques à base de molécules triazolées pour combattre les moisissures phytopathogènes en 1973 [START_REF] Schwinn | Ergosterol biosynthesis inhibitors. An overview of their history and contribution to medicine and agriculture[END_REF]. De nombreuses autres formulations ont par la suite été synthétisées à base de tébuconazole en 1986, de difénoconazole en 1988 ou bien encore de propiconazole en 2004 [START_REF] Russell | A century of fungicide evolution[END_REF]. Près de 30 molécules triazolées sont actuellement autorisées pour l'usage environnemental [START_REF] Barber | Effects of agricultural fungicide use on Aspergillus fumigatus abundance, antifungal susceptibility, and population structure[END_REF]. Elles sont exploitées seules ou en mélange dans des centaines de formulations (Tableau 1).

Synthèse bibliographique

Ces molécules sont particulièrement appréciées pour leur large spectre d'action qui permet de cibler un grand nombre de moisissures phytopathogènes [START_REF] Hof | Critical annotations to the use of azole antifungals for plant protection[END_REF][START_REF] Price | Azole fungicides understanding resistance mechanisms in agricultural fungal pathogens[END_REF]. Elles sont ainsi utilisées en préventif et en curatif sur de nombreux types de culture [START_REF] Šelešovská | The first study of triazole fungicide difenoconazole oxidation and its voltammetric and flow amperometric detection on boron doped diamond electrode[END_REF][START_REF] Ayres | Critical timing of fungicide application for pruning wound protection to control grapevine trunk diseases[END_REF].

Tableau 1 : Historique de mise sur le marché des molécules triazolées majeures dans la lutte contre les moisissures phytopathogènes et nombre de formulations commerciales associées à chacune d'entre elles.

D'après [START_REF] Russell | A century of fungicide evolution[END_REF][START_REF] Jørgensen | Azole use in agriculture, horticulture, and wood preservation-is it indispensable?[END_REF] Malgré l'intérêt de ces molécules pour éviter les pertes de rendement et leur impact économique important, de nombreuses études ont souligné le risque de pollution environnementale qu'elles pouvaient engendrer (cf. partie 2.2). Ces constats ont conduit à l'interdiction de l'utilisation de plusieurs d'entre elles, remplacées récemment grâce au développement de nouveaux dérivés de structure chimique très proches des molécules existantes [START_REF] Bryson | Mefentrifluconazole-The first Isopropanol-azole fungicide for the control of Zymospetoria tritici including field isolates with known complex CYP51 haplotypes[END_REF]. Ainsi des substances très largement utilisées dans l'environnement se sont vu retirer leur droit de mise sur le marché, à l'image du propiconazole et de l'époxiconazole qui sont interdits depuis 2019 (Anses).

2.1.2.

Mode d'action des fongicides (tri)azolés

Les fongicides (tri)azolés font partie de la famille des inhibiteurs de la déméthylation (DMI).

Ils rentrent par diffusion facilitée dans la cellule fongique [START_REF] Mansfield | Azole drugs are imported by facilitated diffusion in Candida albicans and other pathogenic fungi[END_REF][START_REF] Esquivel | Azole drug import into the pathogenic fungus Aspergillus fumigatus[END_REF] et agissent ensuite sur une enzyme clé impliquée dans la biosynthèse d'un des composés majeurs de la membrane des champignons: l'ergostérol (Figure 3). Les triazolés agissent sur l'enzyme 14α-déméthylase. Elle est impliquée dans une étape clé de la biosynthèse des stérols des membranes biologiques et fait partie de la superfamille des cytochromes P450 [START_REF] Lepesheva | Sterol 14α-Demethylase Cytochrome P450 (CYP51), a P450 in all giological kingdoms[END_REF].

En ciblant spécifiquement cette enzyme, les triazolés bloquent toute la voie des stérols, induisant un dérèglement membranaire qui provoquera un effet fongistatique sur les cellules.

(Figure 4). Les cellules fongiques sont ainsi bloquées dans leur développement. Utilisés spécifiquement pour leur action contre les moisissures, ces traitements sont susceptibles, dans certains cas, de provoquer des effets non-intentionnels. Leur mode d'action les rend capables d'agir sur des organismes non ciblés en bloquant par exemple la synthèse de composés métabolisés par des cytochromes. Ces impacts peuvent toucher d'autres cellules eucaryotes de mammifères [START_REF] Yang | Effects of tebuconazole on cytochrome P450 enzymes, oxidative stress, and endocrine disruption in male rats[END_REF]. Les triazolés, le tébuconazole notamment, sont également décrits comme inhibiteurs de certains cytochromes hépatiques humains [START_REF] Habenschus | In vitro enantioselective study of the toxicokinetic effects of chiral fungicide tebuconazole in human liver microsomes[END_REF][START_REF] Knebel | The azole fungicide tebuconazole affects human CYP1A1 and CYP1A2 expression by an aryl hydrocarbon receptor-dependent pathway[END_REF]. Malgré le risque potentiel d'utilisation de ces composés (cf.

partie 2.4 et 2.5) leur usage environnemental est largement répandu dans le monde.

2.1.3.

Utilisation environnementale des molécules (tri)azolées

Les molécules (tri)azolées, bien que controversées dans leur usage ces dernières années, restent considérées comme d'intérêt majeur dans la lutte contre les moisissures phytopathogènes.

Introduites dans les années 70 comme des molécules révolutionnaires capables de remplacer les fongicides organiques au mercure ou au cuivre utilisés depuis plus de 200 ans [START_REF] Eastmond | Chapter 11-Genotoxicity of pesticides[END_REF][START_REF] Gupta | Chapter 37-Herbicides and Fungicides[END_REF], elles ont rapidement été autorisées sur tous les continents.

Leur usage environnemental global n'a fait qu'augmenter depuis les années 1990 [START_REF] Zhang | Global pesticide use: Profile, trend, cost / benefit and more[END_REF]. Les (tri)azolés ont en effet la spécificité d'être efficaces sur un très grand nombre de moisissures. Leur large spectre d'action et leur facilité d'usage en ont donc fait des molécules très utilisées encore de nos jours. Ces substances représentent à elles seules une très grande part de marché des fongicides utilisés sur les cultures. En combattant les agents responsables de la fusariose, de la septoriose ou encore de la rouille (e.g. Fusarium spp, Microdochium spp, Septoria spp, Puccinia recondita, Drechslera teres) ces molécules ont pu permettre de limiter les impacts de ces maladies sur les rendements quantitatifs et qualitatifs des cultures. Leur flexibilité d'usage les rend particulièrement avantageuses : ces molécules peuvent être pulvérisées sur les cultures, ou bien directement appliquées sur les graines avant semis ce qui limite le risque d'exposition professionnelle au moment du traitement [START_REF] Montfort | Effects of two triazole seed treatments, triticonazole and triadimenol, on growth and development of wheat[END_REF][START_REF] Rothrock | Importance of fungicide seed treatment and environment on seedling diseases of cotton[END_REF][START_REF] Meena | Efficacy of strobilurin, triazole and propylene bis-dithiocarbamate fungicides against Macrophomina phaseolina (Tassi) goid of jute[END_REF].

La quantité moyenne de fongicides appliqués dans les pays d'Europe est de 1,26 kg.ha -1 pour une année. Les molécules (tri)azolées y sont particulièrement représentées notamment avec le prothioconazole et le tébuconazole. Les pratiques varient selon l'activité agricole, avec des quantités appliquées qui peuvent aller de 0,07 à 5,59 kg.ha -1 au sein des différents pays européens et un nombre d'applications variable. En France, jusqu'à 4 traitements à base de triazolés peuvent être appliqués par saison, notamment sur les cultures de fruits ou de légumes [START_REF] Jørgensen | Integrating disease control in winter wheatoptimizing fungicide input[END_REF][START_REF] Hayes | Evidence of selection for fungicide resistance in Zymoseptoria tritici populations on wheat in western Oregon[END_REF][START_REF] Lamichhane | Toward a reduced reliance on conventional pesticides in European agriculture[END_REF][START_REF] Bibliographie Abolghasemi | A star-shaped polythiophene dendrimer coating for solid-phase microextraction of triazole agrochemicals[END_REF].

Les continents les plus consommateurs de ces molécules restent l'Asie et l'Europe, qui se partagent deux tiers des ventes mondiales de produits à base d'azolés [START_REF] Jørgensen | Azole use in agriculture, horticulture, and wood preservation-is it indispensable?[END_REF]. Une étude de l'European Crop Protection parue en 2016 sur les différentes pratiques agricoles européennes montre que ces molécules sont utilisées sur un grand nombre de cultures pour chaque pays (Figure 5, [START_REF] Kim | Cumulative impact of hazard-based legislation on crop protection products in Europe[END_REF]European Crop Protection). Elles sont particulièrement représentées dans le traitement des céréales, principalement le blé, l'orge et le maïs, cultures qui à elles seules, en France, représentent une surface d'exploitation de près de 10 millions d'hectares [START_REF] Ricroch | Challenges facing European agriculture and possible biotechnological solutions[END_REF][START_REF] Rabbat | Sustainability of biomassbased insulation materials in buildings: Current status in France, end-of-life projections and energy recovery potentials[END_REF].

Concernant leur utilisation en Asie, entre les années 2013 et 2016, la Chine aurait consommé plus de 80 000 tonnes de fongicides (tri)azolés. Sur la même période, la consommation de tébuconazole a doublé, faisant de cette molécule l'une des plus utilisées du pays pour l'usage agricole [START_REF] Chen | high azole resistance in Aspergillus fumigatus isolates from strawberry fields, China, 2018[END_REF]. En plus du tébuconazole, le difénoconazole fait également partie des 20 principaux pesticides autorisés en Chine [START_REF] Zhang | Global pesticide use: Profile, trend, cost / benefit and more[END_REF].

Les Etats-Unis, quant à eux, ont également largement augmenté leur consommation de molécules triazolées ces dernières années. En dix ans, la consommation de certaines molécules a été multipliée par 4, surtout en raison de leur utilisation sur des cultures telles que le maïs, le blé ou encore le soja [START_REF] Toda | Trends in Agricultural Triazole Fungicide Use in the United States, 1992-2016 and Possible Implications for Antifungal-Resistant Fungi in Human Disease[END_REF]Figure 6). Le tébuconazole est d'ailleurs l'une des molécules fongicides la plus largement utilisée en Géorgie du sud, où son application varie entre 7 à 8 fois par saison [START_REF] Glinski | Analysis of pesticides in surface water, stemflow, and throughfall in an agricultural area in South Georgia, USA[END_REF].

Avec le mode d'agriculture actuel, l'arrêt complet de l'utilisation des molécules azolées sur les cultures pourrait conduire à de grandes pertes en termes de rendement et donc en termes financiers. Les pertes estimées seraient de 5%, 6,8% et 8,7% pour le Danemark, l'Angleterre et la France respectivement. Pour chacun de ces pays, la perte économique associée estimée serait donc de 34 M€, 157 M€ et enfin 408 M€ par an respectivement [START_REF] Blake | Evaluation of the benefits provided by the azole class of compounds in wheat, and the effects of losing all azoles on wheat and potato production in Denmark, France and UK. Report 1 -Impact of the loss of all azoles. ADAS report[END_REF].

Ces chiffres témoignent de l'intérêt de ces molécules dans l'agriculture, notamment pour les pays d'Europe, qui, dans le cas d'un arrêt de leur utilisation pourraient ne plus être en mesure d'assurer une production suffisante à leur indépendance [START_REF] Price | Azole fungicides understanding resistance mechanisms in agricultural fungal pathogens[END_REF]. L'usage de ces molécules ne se limite pas aux cultures céréalières, maraîchères ou viticoles elles sont également largement répandues dans le traitement des plantes ornementales, du bois ou bien encore des gazons sur les terrains de sport (Jeanvoine et al., 2017 ;Godeau et al., 2020 ;[START_REF] Fisher | Pesticides and their degradates in groundwater reflect past use and current management strategies, Long Island[END_REF]. Leurs nombreux domaines d'application les rendent omniprésentes dans l'environnement.

Risque de contamination environnementale

2.2.1.

Contamination atmosphérique aux (tri)azolés

La pollution atmosphérique par les pesticides trouve son origine principale dans les pratiques agricoles [START_REF] Lichiheb | Synthèse des connaissances sur le transfert des pesticides vers l'atmosphère par volatilisation depuis les plantes[END_REF]. L'air est exposé aux risques de contamination par les triazolés notamment quand les fongicides sont pulvérisés, ce qui en fait un vecteur important de la diffusion des résidus de ces molécules. Les études menées sur la qualité de l'air sont souvent ciblées sur des pesticides organochlorés et organophosphorés [START_REF] Coscollà | Particle size distributions of currently used pesticides in a rural atmosphere of France[END_REF][START_REF] Estellano | Assessing levels and seasonal variations of current-use pesticides (CUPs) in the Tuscan atmosphere, Italy, using polyurethane foam disks (PUF) passive air samplers[END_REF][START_REF] Zivan | Airborne organophosphate pesticides drift in Mediterranean climate: The importance of secondary drift[END_REF] du fait de leur toxicité. Néanmoins, les triazolés font également l'objet d'études, principalement du fait de leur persistance [START_REF] Socorro | The persistence of pesticides in atmospheric particulate phase: An emerging air quality issue[END_REF]. [START_REF] Mattei | Heterogeneous atmospheric degradation of pesticides by ozone: Influence of relative humidity and particle type[END_REF] ont par exemple montré que la demi-vie par ozonolyse du difénoconazole et du tétraconazole était supérieure à 800 jours. Des recherches ont mis en évidence la présence de tébuconazole et de penconazole dans l'atmosphère en Espagne à raison de 32 pg.m -3 et 3,54

pg.m -3 respectivement [START_REF] Coscollà | Particle size distributions of currently used pesticides in ambient air of an agricultural Mediterranean area[END_REF]. et al., 2015 ;[START_REF] Schummer | Gas/particle partitioning of currently used pesticides in the atmosphere of Strasbourg (France)[END_REF]Villiot et al., 2018 ;Climent et al., 2019a). Encadrées en rouge et de haut en bas, les molécules triazolées époxiconazole, tétraconazole, tébuconazole et difénoconazole [START_REF] Désert | Spatial and temporal distribution of current-use pesticides in ambient air of Provence-Alpes-Côte-d'Azur Region and Corsica, France[END_REF].

Du fait du risque important de voir ces molécules se diffuser aussi facilement dans l'air, à l'échelle locale et globale, le contrôle de la qualité atmosphérique représente un enjeu important [START_REF] Aktar | Impact of pesticides use in agriculture: Their benefits and hazards[END_REF][START_REF] Kim | Cumulative impact of hazard-based legislation on crop protection products in Europe[END_REF].

Contamination de l'environnement aquatique aux (tri)azolés

La présence de résidus de pesticides dans l'eau de surface ou dans les eaux souterraines est particulièrement problématique. Elle fait d'ailleurs l'objet d'un suivi développé en lien avec la Directive-Cadre Européenne sur l'eau. Cette pollution met en péril la santé publique en nuisant à l'approvisionnement des populations en eau potable de qualité (Mekonen et al., 2016 ;Pazikowska-Sapota et al., 2020). Les principales causes de contamination des eaux par les pesticides sont le ruissellement, la lixiviation, le drainage de surface ou bien encore la dérive lors de la pulvérisation (Mojiri et al., 2020).

Les triazolés font partie des molécules fongicides les plus fréquemment retrouvées dans les eaux de surface [START_REF] De Souza | Occurrence, impacts and general aspects of pesticides in surface water: A review[END_REF]Tableau 2). Des études menées sur les continents les plus consommateurs révèlent leur présence dans de nombreuses rivières et de nombreux lacs.

2.2.3.

Contamination des sols aux (tri)azolés

Le sol est un compartiment directement exposé au risque de pollution par les triazolés, principalement quand ils sont appliqués par pulvérisation. Non seulement il constitue le plus grand réservoir de pesticides environnementaux, mais il représente également un vecteur de diffusion vers les autres compartiments, notamment l'eau [START_REF] Al-Wabel | One Health: Fungal Pathogens of Humans, Animals, and Plants: Report on an American Academy of Microbiology Colloquium held[END_REF].

Certaines études démontrent la présence des molécules triazolées dans les sols au Brésil ou bien en Jordanie par exemple [START_REF] Fernandes | Distribution of pesticides in agricultural and urban soils of Brazil: A critical review[END_REF][START_REF] Kailani | Monitoring of pesticides residues in soil samples from the southern districts of Jordan in 2016/2017[END_REF] L'effet de ces « cocktails » de fongicides associés ou non avec d'autres pesticides est mal connu même si leur coexistence influence probablement leur persistance ou bien encore leurs effets sur les organismes vivants par exemple [START_REF] Clasen | Bioaccumulation and oxidative stress caused by pesticides in Cyprinus carpio reared in a rice-fish system[END_REF][START_REF] Rossi | Fish inhabiting rice fields: Bioaccumulation, oxidative stress and neurotoxic effects after pesticides application[END_REF][START_REF] Jakl | Triazole fungicides in soil affect the yield of fruit, green biomass, and phenolics production of Solanum lycopersicum L[END_REF].

2.3.1.

Lien avec la matière organique des sols

La matière organique (MO) du sol joue un rôle important dans de nombreux processus et fonctions du sol. Dans les sols agricoles notamment, la MO est considérée comme un élément indispensable à une production alimentaire durable [START_REF] Johnston | Chapter 1 Soil organic matter: its importance in sustainable agriculture and carbon dioxide fluxes[END_REF][START_REF] Schjønning | Chapter two -The role of soil organic matter for maintaining crop yields: evidence for a renewed conceptual basis[END_REF]. Elle impacte entre autres la structuration des sols, constitue un réservoir d'éléments nutritifs indispensables aux plantes et à d'autres organismes présents dans le sol et permet d'y augmenter la réserve utile en eau [START_REF] Diacono | Effectiveness of organic wastes as fertilizers and amendments in salt-affected soils[END_REF][START_REF] Obour | Soil organic matter widens the range of water contents for tillage[END_REF][START_REF] Wood | Soil organic matter underlies crop nutritional quality and productivity in smallholder agriculture[END_REF].

La MO est également décrite comme un des principaux facteurs qui affecte la persistance des pesticides dans les sols. Quand le taux de matière organique est supérieur à 5%, elle est considérée comme site d'adsorption préférentiel des pesticides [START_REF] Đurović-Pejčev | Effects of organic matter and clay content in soil on pesticide adsorption processes[END_REF][START_REF] Čadková | Tebuconazole Sorption in Contrasting Soil Types[END_REF]. La teneur en MO du sol est décrite comme étant le paramètre le plus important qui permet d'expliquer les variations de sorption des molécules triazolées. Les argiles semblent être également impliqués, mais dans une moindre mesure [START_REF] Singh | Sorption behavior of triazole fungicides in indian soils and its correlation with soil properties[END_REF][START_REF] Badawi | Degradation and sorption of the fungicide tebuconazole in soils from golf greens[END_REF]. [START_REF] Sund | Plant Regulator Residues, Residual Activity of 3-Amino-1,2,4-triazole in Soils[END_REF] a par exemple montré que la CEC jouait un rôle déterminant dans la rétention dans les sols de l'aminotriazole, un herbicide de la famille des triazolés, en lien avec son groupement amine. La kaolinite a été soulignée comme jouant un rôle dans l'adsorption de l'époxiconazole et du tébuconazole surtout due à des interactions hydrophobes [START_REF] Bošković | Adsorption of epoxiconazole and tebuconazole in twenty different agricultural soils in relation to their properties[END_REF]. Les argiles de type montmorillionite ont également été décrites comme déterminantes dans l'adsorption du triadimefon dans les sols. Ces argiles présentent de très grandes capacités de sorption pour cette molécule, et ce particulièrement quand le sol est riche en argile et pauvre en MO [START_REF] Celis | Sorption and Desorption of Triadimefon by Soils and Model Soil Colloids[END_REF]. Des argiles modifiées ont été étudiées afin d'évaluer leur capacité à dépolluer les sols. [START_REF] Andrades | Effect of the modification of natural clay minerals with hexadecylpyridinium cation on the adsorption-desorption of fungicides[END_REF], ont montré que des argiles modifiées avec des cations organiques présentaient des capacités d'adsorption 24 fois plus importantes pour le penconazole que l'argile naturel. L'adsorption du penconazole est également plus importante dans le cas de la modification de la montmorillionite avec des micelles cationiques comparativement au contrôle [START_REF] Suciu | Adsorption of chlorpyrifos, penconazole and metalaxyl from aqueous solution by modified clays[END_REF].

Concernant

2.3.2.

Structure du sol et pH

Le pH joue également un rôle déterminant dans la capacité de sorption des pesticides dans les sols. Il affecte notamment les fonctions du sol dont les activités microbiennes qui peuvent permettre de dégrader les molécules [START_REF] Buerge | Influence of pH on the stereoselective degradation of the fungicides epoxiconazole and cyproconazole in soils[END_REF][START_REF] Sun | Bacterial compatibility and immobilization with biochar improved tebuconazole degradation, soil microbiome composition and functioning[END_REF]. Le pH intervient également dans l'hydrolyse et la solubilité des pesticides et peut impacter leur réactivité [START_REF] Gao | Environmental fate and transport of pesticides[END_REF].

La nature des molécules elles-mêmes représente également une variable importante dans leur capacité à s'adsorber sur les sols.

2.3.3.

Caractéristiques propres aux molécules

Plusieurs propriétés propres à chaque molécule peuvent caractériser leur capacité à persister dans les sols. La structure et la taille moléculaire dans un premier temps déterminent le potentiel d'ionisation de la molécule. Une taille non adaptée à l'espace disponible sur les sites d'adsorption abaissera la capacité de la molécule à se fixer sur les structures internes des argiles.

La solubilité du composé déterminera son comportement entre les phases liquides et solides des sols. Ainsi, des molécules à faible solubilité seraient plus susceptibles d'être adsorbées dans les sols [START_REF] Guimont | Devenir des pesticides dans les sols en fonction de l'état d'humidité et du mode de circulation de l'eau dans le sol[END_REF]. Les principales caractéristiques chimiques de 3 molécules triazolées fréquemment retrouvées dans l'environnement sont présentées dans le Tableau 3. Les molécules triazolées, de par leur utilisation et leurs caractéristiques, en particulier leur persistance, présentent un risque important de pollution environnementale aux conséquences multiples.

Impacts associés à l'utilisation des (tri)azolés

La pollution environnementale causée par l'usage massif des molécules triazolées à travers le monde est une problématique qui prend de plus en plus d'ampleur, notamment du fait des impacts néfastes qui peuvent être constatés sur les organismes. Les conséquences de cette exposition sont un sujet préoccupant qui nécessite un suivi constant [START_REF] Lv | Effects of triazole fungicides on androgenic disruption and CYP3A4 enzyme activity[END_REF].

2.4.1.

Impacts sur la santé animale les tissus de ces organismes peut impacter l'ensemble de la chaîne alimentaire et à terme représenter un risque potentiel pour la santé humaine [START_REF] Konwick | Bioaccumulation and biotransformation of chiral triazole fungicides in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)[END_REF][START_REF] Bhagat | A comprehensive review on environmental toxicity of azole compounds to fish[END_REF].

Dans la littérature on retrouve plusieurs effets toxiques liés à l'exposition aux triazolés. De façon non exhaustive on peut citer l'hépatotoxicité, la neurotoxicité, la reprotoxicité. Les triazolés peuvent également être décrits comme cancérigènes et perturbateurs endocriniens [START_REF] Currie | Phenobarbital and propiconazole toxicogenomic profiles in mice show major 233 similarities consistent with the key role that constitutive androstane receptor (CAR) activation plays in their mode of action[END_REF][START_REF] Zhu | Triazole-induced toxicity in developing rare minnow (Gobiocypris rarus) embryos[END_REF][START_REF] Chu | Developmental exposures to an azole fungicide triadimenol at environmentally relevant concentrations cause reproductive dysfunction in females of medaka fish[END_REF][START_REF] Zhou | Triazole fungicide tebuconazole disrupts human placental trophoblast cell functions[END_REF][START_REF] De La Paz | Triazole fungicides inhibit zebrafish hatching by blocking the secretory function of hatching gland cells[END_REF]Ortiz-Santaliestra et al., 2020 ;[START_REF] Pereira | Sperm quality of rats exposed to difenoconazole using classical parameters and surface-enhanced Raman scattering: classification performance by machine learning methods[END_REF][START_REF] Ku | Tebuconazole induces liver injury coupled with ROS-mediated hepatic metabolism disorder[END_REF][START_REF] Kabakci | Assessment of tebuconazole exposure on bovine testicular cells and epididymal spermatozoa[END_REF]. Des effets délétères sur le système immunitaire, les activités cardiaques et le métabolisme des lipides sont également décrits (Hinfray et al., 2006 ;[START_REF] Sancho | Short-term exposure to sublethal tebuconazole induces physiological impairment in male zebrafish (Danio rerio)[END_REF][START_REF] Li | Use of hematological and plasma biochemical parameters to assess the chronic effects of a fungicide propiconazole on a freshwater teleost[END_REF]Mu et al., 2013 ;[START_REF] Mu | Occurrence and origin of sensitivity toward difenoconazole in zebrafish (Danio reio) during different life stages[END_REF][START_REF] Mu | The developmental effect of difenoconazole on zebrafish embryos: A mechanism research[END_REF][START_REF] Souders | Sub-lethal effects of the triazole fungicide propiconazole on zebrafish (Danio rerio) development, oxidative respiration, and larval locomotor activity[END_REF][START_REF] Teng | Effect of Propiconazole on the Lipid Metabolism of Zebrafish Embryos (Danio rerio)[END_REF].

Ces impacts dépendent de la nature et de la durée de l'exposition. Le dosage du tébuconazole et de ses métabolites secondaires (e.g. TEB-OH ; TEB-COOH) a été effectué dans l'urine de travailleurs viticoles montrant que les valeurs médianes étaient de 4 à 249 µg.L -1 , soulignant le risque d'exposition professionnelle [START_REF] Fustinoni | Biological monitoring of exposure to tebuconazole in winegrowers[END_REF]. Le propiconazole est le 27 e pesticide sur 140, retrouvé le plus fréquemment dans les cheveux de 311 femmes enceintes d'une cohorte française, avec 71% de détection [START_REF] Béranger | Multiple pesticide analysis in hair samples of pregnant French women: Results from the ELFE national birth cohort[END_REF].

Les

Les cheveux sont le signe d'une exposition à long terme. Çelik et al., (2021)

2.4.2.

Emergence de résistance chez les moisissures phytopathogènes L'application massive et répétée des fongicides triazolés sur les cultures peut conduire à l'émergence et/ou la dominance de moisissures phytopathogènes résistantes aux traitements.

Certaines espèces sont intrinsèquement résistantes à cette catégorie de molécules. Pour d'autres, l'usage répété des mêmes traitements conduit à la sélection de gènes leur conférant une résistance. Les applications foliaires, les traitements des graines ou bien la présence des composés dans les sols peuvent favoriser cette émergence (van Toor et al., 2012).

Cet avantage permet aux populations résistantes d'être plus compétitives que les souches sensibles dans la survie et dans la reproduction suite à une exposition. La présence de mutations génétiques conférant une résistance entraîne en contrepartie un coût métabolique qui impacte d'autres aspects (e.g. croissance). En présence d'une pression de sélection dans l'environnement, la balance coût/bénéfice induite par les mutations conférant la résistance reste favorable aux populations mutées [START_REF] Billard | Fenhexamid Resistance in the Botrytis Species Complex, Responsible for Grey Mould Disease[END_REF][START_REF] Hawkins | Fitness penalties in the evolution of fungicide resistance[END_REF].

La plasticité génomique, la diversité génétique au sein d'une population, les modes de reproduction possibles et la capacité de la moisissure phytopathogène à se disperser sont autant de paramètres qu'il est important de prendre en compte dans l'évaluation d'une potentielle acquisition de résistance [START_REF] Zhan | The interaction among evolutionary forces in the pathogenic fungus Mycosphaerella graminicola[END_REF][START_REF] Hahn | The rising threat of fungicide resistance in plant pathogenic fungi: Botrytis as a case study[END_REF][START_REF] Garnault | Large-scale study validates that regional fungicide applications are major determinants of resistance evolution in the wheat pathogen Zymoseptoria tritici in France[END_REF]. Bien que l'utilisation de variétés commerciales moins sensibles à certaines maladies soit envisageable, l'usage des fongicides en prévention ou en traitement reste actuellement la norme pour le contrôle des maladies en agriculture conventionnelle [START_REF] Kim | Inheritance of partial resistance to Sclerotinia stem rot in soybean[END_REF][START_REF] Spolti | Triazole Sensitivity in a Contemporary Population of Fusarium graminearum from New York Wheat and Competitiveness of a Tebuconazole-Resistant Isolate[END_REF]. Le Fungicide Resistance Action Committee (FRAC) a pour rôle d'identifier les problèmes liés aux résistances aux fongicides dans les cultures et de faire des recommandations pour éviter leur émergence. A ce titre les moisissures phytopathogènes majeures sont référencées en fonction du risque associé de voir leur sensibilité diminuer face aux triazolés (Tableau 6).

Par exemple, l'espèce Blumeria graminis responsable de l'oïdium dans les cultures céréalières, les vergers ou bien les cultures maraichères est considérée comme à risque de développer des résistances. [START_REF] Meyers | Sensitivity of the U.S. Blumeria graminis f. Sp. tritici population to demethylation inhibitor fungicides[END_REF] ont montré une diminution de la sensibilité de cette espèce pour le tébuconazole et le prothioconazole sur 400 isolats prélevés aux Etats-Unis, soulignant l'existence potentielle d'une résistance croisée. Ces phénomènes sont décrits de longue date en Europe, au Pays-Bas (de [START_REF] De Waard | Variation in sensitivity to fungicides which inhibit ergosterol biosynthesis in wheat powdery mildew[END_REF] pour le triadimefon, en République Tchèque (Švec et al., 1995) et en France [START_REF] Godet | Recent evolution of multiple resistance of Blumeria (Erysiphe) graminis f.sp. Tritici to selected DMI and morpholine fungicides in France[END_REF]) pour le triadimenol. La maladie la plus décrite sur le blé est la septoriose. Elle est causée par Zymoseptoria tritici et peut induire des pertes de rendement jusqu'à 50% [START_REF] Torriani | Zymoseptoria tritici: A major threat to wheat production, integrated approaches to control[END_REF]. Cette espèce a développé une résistance complète contre les inhibiteurs externes de quinones [START_REF] Garnault | Large-scale study validates that regional fungicide applications are major determinants of resistance evolution in the wheat pathogen Zymoseptoria tritici in France[END_REF] d'où l'importance des triazolés dans la lutte contre cette maladie, pour laquelle les options sont limitées. [START_REF] Birr | Temporal Changes in Sensitivity of Zymoseptoria tritici Field Populations to Different Fungicidal Modes of Action[END_REF] ont cependant montré que la sensibilité de cette espèce pour le tébuconazole et le propiconazole avait diminué entre 1999 et 2009 (Figure 12) avant de se stabiliser, soulignant le risque de voir émerger des résistances. ). Les valeurs de la EC50 ont été déterminées comme étant la concentration de fongicide réduisant la croissance fongique de 50 % (p ≤ 0,05). [START_REF] Birr | Temporal Changes in Sensitivity of Zymoseptoria tritici Field Populations to Different Fungicidal Modes of Action[END_REF].

L'émergence de résistances dans des espèces connues comme étant des moisissures phytopathogènes peut mettre en péril la production alimentaire. organismes, au moins transitoirement. Les sous-produits du tébuconazole semblent également avoir un impact [START_REF] Storck | Identification and characterization of tebuconazole transformation products in soil by combining suspect screening and molecular typology[END_REF]. Des effets d'une application de tébuconazole sur les sols sont visibles à des concentrations de 10 mg.kg -1 , à des doses de 100 mg.kg -1 la toxicité du tébuconazole pour les sols est avérée. Il impacte notamment les activités enzymatiques et les fonctions de respiration du sol [START_REF] Mu | The developmental effect of difenoconazole on zebrafish embryos: A mechanism research[END_REF]. Le triadimefon, appliqué à la même concentration, diminue également la population bactérienne [START_REF] Yen | Effects of fungicides triadimefon and propiconazole on soil bacterial communities[END_REF]. Dans des concentrations plus faibles, de l'ordre de 1 mg.kg -1 , le triadimefon induit déjà une diminution significative de l'activité déshydrogénase des sols après 30 jours, signe d'une diminution potentielle de l'activité microbienne [START_REF] Singh | Factors Affecting Triadimefon Degradation in Soils[END_REF]. Le risque d'accumulation des fongicides triazolés dans les sols peut avoir des effets indésirables sous-estimés sur la microbiologie de ce compartiment et impacter leur propre biodégradation [START_REF] Fernández-Calviño | Ecotoxicological assessment of propiconazole using soil bacterial and fungal growth assays[END_REF].

L'impact non-intentionnel des fongicides triazolés dans les sols le plus largement décrit sur les micro-organismes est la pression de sélection qu'ils peuvent induire sur une moisissure ubiquiste d'intérêt médical pour l'Homme, appelée Aspergillus fumigatus.

Impacts sur Aspergillus fumigatus

Bien qu'utilisées en vue de combattre les moisissures phytopathogènes responsables du développement de pathologies en particulier sur les feuilles [START_REF] Weiland | Sugarbeet leaf spot disease (Cercospora beticola Sacc.)dagger[END_REF][START_REF] Shcherbakova | Studying the ability of thymol to improve fungicidal effects of tebuconazole and difenoconazole against some plant pathogenic fungi in seed or foliar treatments[END_REF], les molécules triazolées peuvent également diffuser dans d'autres matrices, comme les sols, en fonction de la méthode utilisée pour leur application. Lors d'une pulvérisation sur grande culture par exemple, une très faible proportion de la molécule active atteint sa cible, le reste diffuse dans l'environnement dans lequel elle rencontre de nombreuses autres moisissures (Pimentel & Burgess, 2012 ;[START_REF] Pacholak | Azole fungicides: (Bio)degradation, transformation products and toxicity elucidation[END_REF].

Une des moisissures ubiquistes que l'on peut y retrouver est Aspergillus fumigatus.

2.5.1.

Présentation de l'espèce

Cette moisissure saprophyte se nourrit de la matière organique en décomposition. Elle est une moisissure filamenteuse du phylum des Ascomycètes. Du point de vue morphologique cette espèce est reconnaissable en culture par un aspect en colonies de couleur vertes/bleues avec une texture poudreuse (Figure 13). Dans certains cas, les spores présentent toutefois une absence de pigment et apparaissent blanches. En microscopie, cette moisissure présente des têtes aspergillaires unisériées, ainsi que des spores rondes de surface lisse ou en épi, portées par une seule rangée de phialides [START_REF] Mokobi | Aspergillus fumigatus -An Overview-Mycology[END_REF].

Du fait de la structure très résistante de ces spores, de leur hydrophobicité et de leur petite taille (de l'ordre de 2 à 3 µm), cette espèce est particulièrement résistante à la dispersion qui se fait principalement par les vents [START_REF] Haiduven | Nosocomial aspergillosis and building construction[END_REF][START_REF] O'gorman | Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis[END_REF]. On peut donc facilement la retrouver dans l'air, que ce soit en milieu extérieur ou en milieu intérieur [START_REF] Arné | Aspergillus fumigatus in Poultry[END_REF][START_REF] Aguiar | Biological air contamination in elderly care centers: geria project[END_REF]Pilmis et al., 2018 ;Godeau et al., 2020).

Cette espèce n'est pas décrite comme phytopathogène, mais sa thermo-tolérance, qui lui permet de se développer à des températures allant jusqu'à 70°C, en fait un pathogène opportuniste pour de nombreux animaux (J. C. [START_REF] Rhodes | Aspergillus fumigatus: Growth and virulence[END_REF]. Des cas de pathologies à A. fumigatus ont par exemple été décrits chez des chevaux, des chiens mais aussi des dauphins ou des oiseaux [START_REF] Ricardo | Maxillary cementoblastoma (true cementoma) and secondary aspergillosis in a horse[END_REF][START_REF] Groch | Pulmonary and systemic fungal infections in an Atlantic spotted dolphin and a Bryde's whale, Brazil[END_REF][START_REF] Talbot | Surveillance for azole resistance in clinical and environmental isolates of Aspergillus fumigatus in Australia and cyp51A homology modelling of azole-resistant isolates[END_REF][START_REF] Valdes | Comparative genotyping and phenotyping of Aspergillus fumigatus isolates from humans, dogs and the environment[END_REF][START_REF] Arné | Aspergillosis in Wild Birds[END_REF]. Cette moisissure est également un pathogène opportuniste pour l'Homme qui respire une centaine de ses conidies par jour [START_REF] Beisswenger | Aspergillus fumigatus conidia induce interferonβ signalling in respiratory epithelial cells[END_REF]. Des pathologies chroniques provoquées par cette espèce peuvent être retrouvées chez des patients atteints de mucoviscidose. La virulence de cette espèce réside également dans sa capacité de production de mycotoxines, telles que la fumagilline, la pseurotine ou encore la fumigatoxine [START_REF] Iwata | Fumigatoxin, a new toxin from a strain of Aspergillus fumigatus[END_REF][START_REF] Fallon | Inhibition of neutrophil function following exposure to the Aspergillus fumigatus toxin fumagillin[END_REF][START_REF] Yu | Mating-type factor-specific regulation of the fumagillin/pseurotin secondary metabolite supercluster in Aspergillus fumigatus[END_REF].

L'aspergillose invasive (AI), principalement causée par A. fumigatus, est une pathologie associée à plus de 4% des décès dans les hôpitaux tertiaires européens (Brookman & Denning, ). Cette maladie a récemment été introduite dans l'International Classification of Diseases de l'Organisation Mondiale de la Santé (https ://icd.who.int). Le nombre de cas à travers le monde est souvent sous-estimé en raison de lacunes dans le diagnostic. Un récent rapport a démontré que l'incidence des aspergilloses en Chine était de 312/100 000 habitants chaque année, dont 77 cas d'AI [START_REF] Zhou | Risk-Based Estimate of Human Fungal Disease Burden, China[END_REF]. D'après la fondation « Global Action for Fungal Infection » (https://gaffi.org/), chaque année 30 millions de personnes sont à risque de développer une AI, et parmi eux, 300 000 déclarent la maladie.

Traitements des pathologies causées par Aspergillus fumigatus

La proximité en termes de structure entre les cellules fongiques et les cellules humaines, qui sont des eucaryotes, complexifie la prise en charge de ces pathologies pour lesquelles le traitement peut avoir des effets indésirables croisés sur des cellules humaines non ciblées.

Avant les années 1940, les pathologies fongiques étaient mal prises en charge, jusqu'à la découverte des premiers traitements à base de polyènes [START_REF] Maertens | History of the development of azole derivatives[END_REF]. L'amphotéricine B, un antifongique appartenant à cette famille de molécule, est alors devenu le traitement de choix des maladies systémiques causées par des moisissures en médecine humaine [START_REF] Burton | Aspergillosis in four renal transplant recipients. Diagnosis and effective treatment with amphotericin B[END_REF][START_REF] Jenks | Treatment of aspergillosis[END_REF]. Cette molécule permet d'induire une lyse cellulaire en se liant à un composé majeur de la membrane fongique, l'ergostérol [START_REF] Zotchev | Polyene macrolide antibiotics and their applications in human therapy[END_REF][START_REF] Carolus | Amphotericin B and Other Polyenes-Discovery, Clinical Use, Mode of Action and Drug Resistance[END_REF]. Cependant, ces traitements présentent différents inconvénients et peuvent entraîner l'apparition d'effets indésirables liés à leur administration par perfusion ou bien à leur action néphrotoxique [START_REF] Deray | Amphotericin B nephrotoxicity[END_REF][START_REF] Tragiannidis | Antifungal agents and the kidney: Pharmacokinetics, clinical nephrotoxicity, and interactions[END_REF]. Dans les années 1990, une nouvelle forme de ce traitement a été développée, l'amphotéricine B liposomale, dont l'objectif était d'augmenter la tolérabilité de cette molécule [START_REF] Groll | Clinical Pharmacokinetics, Pharmacodynamics, Safety and Efficacy of Liposomal Amphotericin B[END_REF].

Les azolés ont été introduits dans les années 1980. D'abord les imidazolés avec la mise sur le marché du ketoconazole [START_REF] Heeres | Antimycotic imidazoles. Part 4. Synthesis and antifungal activity of ketoconazole, a new potent orally active broad-spectrum antifungal agent[END_REF] puis les triazolés, 10 ans plus tard [START_REF] Lass-Flörl | Triazole antifungal agents in invasive fungal infections[END_REF], venant combler le manque de molécules imidazolées disponibles pour le traitement des pathologies causées par A. fumigatus.

L'arrivée des triazolés sur le marché dans les années 1990 (déjà utilisées depuis près de 20 ans en agriculture) a modifié la prise en charge des maladies fongiques.

Particulièrement appréciées pour leur facilité d'utilisation et leur toxicité relativement basse, le spectre d'activité élargi des molécules triazolées de première génération en ont directement fait des traitements de choix pour une action préventive ou curative des infections fongiques.

L'itraconazole a ainsi été approuvé en 1992 et présente un large spectre d'action notamment sur les Aspergillus spp. Le voriconazole, triazolé de deuxième génération, a quant à lui été introduit dans les années 2000. Ces 2 molécules ont longtemps constitué la première ligne de défense contre les aspergilloses. Depuis, de nouvelles molécules triazolées, le posaconazole (2006) (Keating, 2005) et l'isavuconazole (2015) [START_REF] Shirley | Isavuconazole: a review in invasive aspergillosis and mucormycosis[END_REF], deux nouveaux dérivés, sont venus compléter la gamme de traitements autorisés.

Ces traitements permettent de faciliter la prise en charge des pathologies aspergillaires (Figure 14). Dans ce contexte, préserver l'efficacité des molécules existantes, et particulièrement des triazolés, est indispensable afin d'éviter l'impasse thérapeutique.

2.5.3.

Résistance chez Aspergillus fumigatus : lien avec l'environnement et impacts sanitaires L'intérêt que représentent les triazolés pour l'usage médical a rapidement été freiné par la découverte, avant les années 2000, des premiers cas de souches résistantes à ces molécules, moins de 10 ans après le début de leur utilisation (Snelders et al., 2008). Cette problématique de résistance est amplifiée par l'augmentation du nombre de patients à risque de développer des pathologies opportunistes dues à la prise en charge de patients avec les techniques médicales modernes (e.g. chimiothérapies, greffes… ; [START_REF] Kim | Cumulative impact of hazard-based legislation on crop protection products in Europe[END_REF]. De nombreuses études ont montré l'existence de ces résistances sur tous les continents (Figure 16 ; Howard et al., 2009 ;[START_REF] Lockhart | Azole resistance in Aspergillus fumigatus isolates from the ARTEMIS global surveillance study is primarily due to the TR/L98H mutation in the cyp51A gene[END_REF]Chowdhary et al., 2012 ;[START_REF] Van Der Linden | Prospective Multicenter International Surveillance of Azole Resistance in Aspergillus fumigatus[END_REF]Lestrade et al., 2019a ;[START_REF] Rivelli Zea | Azole-resistant Aspergillus fumigatus as an emerging worldwide pathogen[END_REF]. Ce phénomène complexifie la prise en charge des patients (van der Linden et al., 2013). Les taux de mortalité des patients atteints d'AI sont de 20 à 50% [START_REF] Nivoix | Factors associated with overall and attributable mortality in invasive aspergillosis[END_REF]Lestrade et al., 2019b) dans le cas d'un traitement de première intention avec les triazolés. Dans le cas d'une souche résistante, ce taux est compris entre 50 et 100% (Howard et al., 2009 ;[START_REF] Steinmann | Emergence of azoleresistant invasive aspergillosis in HSCT recipients in Germany[END_REF].

De nombreuses mutations ont pu être identifiées sur le gène Cyp51A comme principale cause conférant de la résistance à un ou plusieurs triazolés [START_REF] Rivero-Menendez | Triazole resistance in Aspergillus spp.: A worldwide problem?[END_REF]. Des substitutions d'acides aminés dans la région codante du gène ont été décrites (Tableau 8 ; Diaz- et al., 2003 ;[START_REF] Mellado | Substitutions at methionine 220 in the 14α-sterol demethylase (Cyp51A) of Aspergillus fumigatus are responsible for resistance in vitro to azole antifungal drugs[END_REF]Pelaez et al., 2012) issues d'une adaptation suite à un traitement au long cours (Camps et al., 2012). D'autres mutations, plus complexes, associant des substitutions dans la région codante et l'insertion de répétitions en tandem dans le promoteur du gène (e.g. TR34/L98H, TR46/Y121F/T289A) ont aussi été retrouvées chez des patients n'ayant jamais reçu de traitement triazolés [START_REF] Mellado | A new Aspergillus fumigatus Resistance mechanism conferring in vitro cross-resistance to azole antifungals involves a combination of cyp51A alterations[END_REF]Berger et al., 2017).

Guerra

La mutation TR34/L98H notamment a été décrite comme la mutation la plus fréquemment retrouvée dans des souches d'A. fumigatus provenant de l'environnement [START_REF] Rivero-Menendez | Triazole resistance in Aspergillus spp.: A worldwide problem?[END_REF] posant la question d'une origine environnementale de cette résistance. (Lestrade et al., 2019b) Tableau 8 : Exemple de mutations décrites dans le gène Cyp51A et phénotypes de résistance correspondant chez Aspergillus fumigatus. D'après [START_REF] Guegan | Résistance aux azolés chez Aspergillus[END_REF]. La proximité en termes de structure chimique des triazolés à usage médical et à usage environnemental (Figure 17) a été décrite comme source d'une résistance croisée (Snelders et al., 2012 ;[START_REF] Garcia-Rubio | Aspergillus fumigatus cross-resistance between clinical and demethylase inhibitor azole drugs[END_REF]. L'utilisation massive des molécules triazolées dans l'environnement a rapidement été mise en cause dans l'émergence de ces résistances.

Origine supposée de cette mutation

Mutations sur le gène

De nombreuses études ont été menées pour comprendre l'apparition de ce phénomène. Bien que ces molécules ne soient pas considérées comme pouvant avoir une action mutagène chez A. fumigatus, la pression de sélection qu'elles peuvent induire favorise la population de souches résistantes [START_REF] Bastos | Fungicide effects on human fungal pathogens: Cross-resistance to medical drugs and beyond[END_REF]. Certaines conditions semblent être particulièrement propices au développement de ces résistances et sont considérées comme des « hotspots » potentiels. Les « hotspots » sont décrits comme étant des zones qui regroupent à la fois des conditions favorables au développement et à la reproduction d'A. fumigatus et des résidus de triazolés [START_REF] Verweij | The One Health Problem of Azole Resistance in Aspergillus Fumigatus: Current Insights and Future Research Agenda[END_REF].

Ainsi, les déchets de bulbes de fleurs traitées, les déchets verts ou bien encore les copeaux de bois traités peuvent représenter autant de sites d'apparition potentielle de ce phénomène (Schoustra et al., 2019 ;[START_REF] Verweij | The One Health Problem of Azole Resistance in Aspergillus Fumigatus: Current Insights and Future Research Agenda[END_REF][START_REF] Burks | Azole-resistant Aspergillus fumigatus in the environment: Identifying key reservoirs and hotspots of antifungal resistance[END_REF].

Un • Les différents types de sol peuvent influencer la persistance des molécules triazolées.

Résumé :

Les impacts de l'utilisation des triazolés en grande culture sur les populations d'Aspergillus fumigatus ont été étudiés au moyen de deux campagnes de prélèvements de sols réalisées en 22). Une grande majorité des sols analysés étaient des sols à dominante argile limoneuse. Deux sols de Lorraine, LIP et PCP ainsi qu'un sol de Bourgogne, LHP, présentaient des résultats plus contrastés avec des sols à dominante sable limoneux, limon sableux et argile sableux respectivement (SL, LS et AS sur la Figure 22).

Les résultats en termes de quantité de carbone organique étaient cohérents avec les valeurs de matière organique mesurées. Les données observées concernant les caractéristiques des sols, particulièrement les pourcentages de sable, limon, argiles et de CEC, semblent relativement comparables à celles issues de la littérature pour des sols agricoles français (Meite et al., 2022).

Dosage des résidus de fongicides par GC-MS/MS et des éléments traces par ICP-AES.

Le dosage des résidus de fongicides a été réalisé par chromatographie gazeuse triple quadripôle Ces résultats sont cohérents avec les observations de Hvězdová et al. (2018), qui ont montré que sur 75 sols de culture céréalière de République Tchèque, 36% présentaient des résidus de tébuconazole, parmi lesquels 11% présentaient des concentrations supérieures à 10 ng.g -1 .

Avec une médiane de 7,05 ng.g -1 de tébuconazole dans les sols, les niveaux de contamination observés dans notre étude sont tout de même relativement faibles par rapport à certaines valeurs de la littérature. Par exemple, Silva et al. (2019) Les valeurs obtenues semblent comparables avec des valeurs classiquement retrouvées dans les sols [START_REF] Baize | Teneurs totales en « métaux lourds » dans les sols français: Résultats généraux du programme ASPITET[END_REF]. Certaines valeurs pour l'arsenic, le cuivre et le mercure semblent plus élevées que ce qui est ordinairement observé pour ces types de sol (le mercure pour BP et GCP ; Un extrait des valeurs obtenues pour les deux régions pour certains de ces éléments est présenté Tableau 11, la totalité de ces valeurs est présentée en annexe.

Tableau 11: Extrait des valeurs des éléments traces retrouvés dans les sols (en mg.kg-1MS) pour la Lorraine et la Bourgogne. <LDM = inférieur à la limite de détection).

Analyse fongique des prélèvements de sols.

Les 10 prélèvements de sol de chaque parcelle ont été ensemencés sur milieu de culture Dichloran-Glycérol (DG18) pour la pousse fongique et sur des milieux de culture supplémentés en antifongiques Malt-itraconazole à une concentration de 2 mg.L -1 (Mitra) et Maltvoriconazole à une concentration de 1 mg.L -1 (Mvori) (Figure 25). Cette analyse a été faite en triplicat. Différentes conditions de températures ont été appliquées : une culture à 48°C montré des pourcentages de résistance de 21% et 14% respectivement [START_REF] Mortensen | Environmental study of azole-resistant Aspergillus fumigatus and other aspergilli in Austria, Denmark, and Spain[END_REF]Prigitano et al., 2014 ;[START_REF] Riat | Azole resistance of environmental and clinical Aspergillus fumigatus isolates from Switzerland[END_REF].

Toutes ces études sur la détection de la résistance ont été mises en relation avec l'utilisation environnementale des fongicides triazolés. Mais la détection de la résistance semble dépendre directement à la fois des pratiques agricoles utilisées (différentes en fonction des pays) et des domaines étudiés.

Dans notre étude, nous avons voulu voir si la détection des isolats d'A. fumigatus présents dans les sols dépendait de la nature de la culture en place sur ces derniers ou du traitement appliqué (Figure 27).

Le type de céréales cultivé sur les parcelles étudiées n'a pas de lien statistiquement significatif avec la détection des isolats de la section Fumigati issus de ces sols. En ce qui concerne la corrélation avec les traitements appliqués, des tendances montrent que les parcelles en agriculture biologique présentaient très peu d'isolats de la section Fumigati en comparaison des parcelles traitées, notamment au metconazole. La détection de ces isolats, qui s'est faite en partie sur milieux de culture sélectifs (Mitra et Mvori), a probablement favorisé le développement des isolats qui avaient déjà été exposés aux triazolés lors des traitements des parcelles, par rapport à ceux des parcelles en agriculture biologique.

Evaluation de la proportion d'ADN d'Aspergillus fumigatus dans les sols des grandes cultures par qPCR.

Le faible nombre d'isolats identifiés comme appartement potentiellement à l'espèce Aspergillus fumigatus retrouvés après ensemencement des sols des grandes cultures a conduit à l'hypothèse fumigatus. Les résultats de ces qPCR sont présentés dans la Figure 28.

Une variation importante des quantités d'ADN fongique total a été observée entre les parcelles.

Les deux extrêmes sont la parcelle CBP de Lorraine qui présente une quantité d'ADN fongique total 26 fois plus importante que CHP, la parcelle la moins contaminée de Bourgogne. Les sols de Lorraine semblent globalement plus riches en ADN fongique que les sols de Bourgogne.

Les sols en agriculture biologique prélevés en Lorraine présentent des niveaux d'ADN fongique total légèrement plus élevés que les sols traités aux triazolés (Figure 28). [START_REF] Zhang | Effect of tetraconazole application on the soil microbial community[END_REF] ont montré qu'une exposition des sols au tétraconazole entraînait une diminution de la biomasse microbienne et impactait notamment les populations fongiques, avec des effets persistants dans les sols plusieurs mois après le traitement. être retrouvés, tels que le compost, les déchets issus de bulbes de fleurs ou bien encore le bois traités par exemple (Schoustra et al., 2019 ;[START_REF] Burks | Azole-resistant Aspergillus fumigatus in the environment: Identifying key reservoirs and hotspots of antifungal resistance[END_REF].

Caractéristiques physico-chimiques des sols et populations fongiques

Même si les sols des grandes cultures ne semblent pas constituer une niche écologique optimale pour A. fumigatus, une analyse en composante principale a été réalisée afin de comparer l'ensemble des données obtenues pour les sols des grandes cultures et tenter de décrire les tendances concernant les différences de communautés fongiques (Figure 30).

Le peu de contraste observé entre les niveaux de contamination en triazolés des sols et leurs caractéristiques physico-chimiques (pourcentage de matière organique ; CEC) n'a pas permis de conclure quant à de potentiels liens entre ces paramètres.

Aucune corrélation significative n'a pu être mise en évidence mais des tendances montrent que les niveaux de contamination des sols à l'arsenic et le nombre d'isolats de la section Fumigati retrouvés en cultures pourraient être liés. Des espèces fongiques, dont A. fumigatus notamment, sont utilisées pour la remédiation des sols pollués en éléments traces, en particulier l'arsenic [START_REF] Nierman | Genomic sequence of the pathogenic and allergenic filamentous fungus Aspergillus fumigatus[END_REF][START_REF] Maheswari | Biosorption of arsenic(III) ion from aqueous solution using Aspergillus fumigatus isolated from arsenic contaminated site[END_REF]Pandey et al., 2022) ce qui pourrait expliquer cette tendance. Certains gènes présents chez A. fumigatus codent en effet pour des exportateurs d'arsénite, une arsenic méthyltransférase ou bien encore une protéine de résistance à l'arsenic [START_REF] Nierman | Genomic sequence of the pathogenic and allergenic filamentous fungus Aspergillus fumigatus[END_REF]. Cependant, aucune preuve de l'utilisation de l'arsenic dans le métabolisme d'A. fumigatus ne peut expliquer que sa présence dans les sols favorise le développement de cette moisissure. Ces isolats présentaient la mutation TR34/L98H ou TR46/Y121F/T289A sur le gène Cyp51A.

Il est nécessaire d'identifier les activités professionnelles qui pourraient conduire au développement des aR-Af et de développer des mesures préventives pour endiguer l'émergence de ces résistances et empêcher l'exposition des populations à risque vivant à proximité des activités professionnelles utilisant les triazolés.

Eléments essentiels :

• Les fongicides triazolés sont largement utilisés dans l'environnement pour combattre les moisissures phytopathogènes : on les retrouve notamment dans les cultures maraîchères ;

• 30 prélèvements de sol par parcelle ont été réalisés dans 6 exploitations maraîchères et ont été analysés pour quantifier les résidus de triazolés et pour évaluer la présence d'isolats d'A. fumigatus résistants.

• 44 souches résistantes ont été retrouvées sur 2 des 6 exploitations considérées (notées D et E), 87,5% portaient une mutation TR34/L98H et 22,5% une mutation TR46/Y121F/T289A sans qu'aucun génotype commun ne puisse être attribué aux souches résistantes ;

• Le difénoconazole a été retrouvé dans 88% des prélèvements de sols de ces 2 exploitations recourant à l'usage d'un traitement, même celle ayant été traitée l'année N-2 pour la dernière fois, signe de la grande persistance de cette molécule ;

• Les risques d'émergence de la résistance et d'exposition professionnelle sont grands, soulignant l'importance de déterminer quels sont les hotspots impliqués dans ce phénomène.

Introduction

Aspergillus fumigatus is the etiological agent of many diseases, including invasive aspergillosis (IA), which occurs mainly in immunocompromised patients with hematologic malignancies and can reach a mortality rate as high as 50% [START_REF] Denning | Voriconazole resistance in Aspergillus fumigatus: should we be concerned?[END_REF]. Medical azole antifungal drugs (itraconazole, voriconazole, posaconazole, and isavuconazole) are major compounds used to prevent and treat filamentous fungal pathogens, with voriconazole recommended as the first-line therapy for treating IA [START_REF] Groll | Fourth European conference on infections in Leukaemia (ECIL-4): guidelines for diagnosis, prevention, and treatment of invasive fungal diseases in paediatric patients with cancer or allogeneic haemopoietic stem-cell transplantation[END_REF]).

The first azole-resistant A. fumigatus (aR-Af) was isolated in the late 1980s [START_REF] Denning | Itraconazole resistance in Aspergillus fumigatus[END_REF]. Since 2008, the number of clinical cases with resistant strains and publications on this subject have both increased considerably [START_REF] Sweileh | Bibliometric analysis of literature on antifungal triazole resistance: 1980 -2015[END_REF] .T w or o u t e so fr e s i s t a n c es e l e c t i o na r ed e s c r i b e d .T h e first is linked to the long-term treatment of patients with chronic aspergillosis [START_REF] Arendrup | Development of azole resistance in Aspergillus fumigatus during azole therapy associated with change in virulence[END_REF]Camps et al. 2012). However, the emergence of azole-resistant A. fumigatus strains is probably due to the other route caused by fungicides in the environment. Azole fungicides, called DMIs (14-alpha demethylase inhibitors), are widely used for crop protection and have been reported to probably induce resistance to A. fumigatus directly in the environment (Snelders et al. 2012). Until now, no publication has shown Responsible editor: Zhihong Xu Electronic supplementary material The online version of this article (https://doi.org/10.1007/s11356-018-3177-6) contains supplementary material, which is available to authorized users.

that azoles are mutagenic. However, when they are sprayed on crops, selection pressure is exerted on A. fumigatus which is widespread. Thus, resistant strains which spontaneously had mutated are preferentially selected. Patients inhale aR-Afs and develop resistant diseases [START_REF] Snelders | Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles[END_REF]). The two main mutations described in the environmental route of resistance are TR34/L98H and TR46/Y121F/T289A [START_REF] Snelders | Genotype-phenotype complexity of the TR46/Y121F/T289A cyp51A azole resistance mechanism in Aspergillus fumigatus[END_REF];S n e l d e r se ta l .2008; [START_REF] Van Der Linden | Clinical implications of azole resistance in Aspergillus fumigatus, the Netherlands, 2007-2009[END_REF]. They are located on the cyp51A gene and confer a multiple triazole resistance. In fact, five azole fungicides (propiconazole, tebuconazole, difenoconazole, epoxiconazole, and bromuconazole) and medical azoles exhibit similar molecular characteristics, leading to a great level of cross-resistance. Thus, colonization and infection of patients with these resistant strains are associated with treatment failure. It is very important to determine how these mutations were selected, and also to identify practices that could lead to resistance development.

DMIs are used for crop protection and as biocides to preserve material (wood, wall-paper paste, clothing, and paint) (Meis et al. 2016). There are more and more studies on the impact of using DMIs in agriculture (cereal and flower crops and compost), whereas its impact on practices in other professional fields remains largely unknown. Therefore, as suggested by Meis et al., it is important to Bfocus on the questions of 'where', 'when', 'how' and 'how often'^azole resistance by A. fumigatus occurs (Meis et al. 2016). We recently conducted a study in sawmills where propiconazole and tebuconazole were used on a large scale, and TR34/L98H aR-Afs isolation depended on the azole fungicide formulation and residual concentration in soil (Jeanvoine et al. 2017). Another professional field that uses azole fungicides in our region (Bourgogne Franche-Comte region, in Eastern France) is market gardening. Thus, the three aims of this study were to determine whether or not market gardens spraying azole fungicides are also affected by the presence of aR-Afs, to characterize resistant strains (mutations, genotypes), and to assess links between resistance and azole fungicide use.

Material and methods

Environmental sampling

From February to March 2017, six market gardens were included in the study according to their fungicide use. Market gardens consisted of small-scale productions (400 to 2500 m 2 ) of vegetables and fruits, sold directly to consumers and restaurants. A questionnaire dealing with the general organization of the farm operation and vegetable treatment practices (fungicide formulation, frequency of treatment, and sprayed quantities) was given to each market gardener. Four market gardens used DMIs, one used another fungicide, and the other was an organic farm.

Characteristics of market garden soils using DMIs (collectively referred to as MG-DMI, called C, D, E, and F) and their fungicide treatments are summarized in Table 1.The four MG-DMIs treated their crops three times a year with a fungicide product from three different suppliers ( coded 1, 2, and3 in Table 1), all containing difenoconazole (C and F used the same commercial product, coded 1). Fungicide formulations of products 1 and 3 are similar, but are sold by different suppliers: the difenoconazole concentration (250 g L -1 )a n d the molecules of the mixture are identical with a recommended sprayed fungicide dose of 0.5 L per 10,000 m 2 . The product used by market garden D (coded 2 in Table 1)iscomposedof a lower difenoconazole concentration than the others (125 vs 250 g L -1 ) but with a recommended sprayed fungicide dose of 1Lp e r1 0 , 0 0 0m 2 . It also contains another fungicide of the strobilurin family: azoxystrobin (200 g L -1 ).

Thirty surface soil samples were taken at all the farms; sampling sites were selected whether fungicide treatments were used or not. For market gardens without azole treatment, the 30 soil samples were distributed throughout the entire farm. For those with azole treatment limited to only certain areas, 20 surface samples were taken in a treated field and 10 in an untreated field. When all the fields were treated with azoles, samples were taken in two different fields not treated the same year, if possible. For each field, the samples were distributed according to a transect over the entire length of the crop.

Soils were seeded as previously described (Jeanvoine et al. 2017) and incubated at 48 °C. Briefly, 2 g of each dissolved soil was seeded on three media: dichloran-glycerol agar (DG18, Oxoid®, Baingstoke, Hampshire, UK), two malt agars supplemented, respectively, with 1 mg L -1 of voriconazole (Maltvori), and 2 mg L -1 of itraconazole (Maltitra).

Azole susceptibility testing and cyp51A sequencing

The susceptibility to itraconazole (ITC) and voriconazole (VRC) of A. fumigatus isolates isolated on Maltitra and Maltvori was checked using the EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility) microdilution method. Resistance was defined according to the EUCAST breakpoints (> 2 mg L -1 ) [START_REF] Arendrup | EUCAST technical note on Aspergillus and amphotericin B, itraconazole, and posaconazole[END_REF];H o p ee ta l . 2013). Secondly, the susceptibility of one isolate out of 10 isolated on DG18 per soil in market gardens where aR-Afs were detected was also tested using the EUCAST method.

The DNA of azole-resistant isolates was extracted using the DNeasy Plant Mini Kit™ (Qiagen®, Milan, Italy). Then, a part of the beta-tubulin gene (Alanio et al. 2011) was amplified by PCR, purified and sequenced (Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer™ (ThermoFisher®, Waltham, MA)) to validate A. fumigatus identification. In order to detect the possible presence of mutations explaining resistance to azole antifungals, the cyp51A gene and its promoter were amplified by PCR and sequenced with five sets of primers (Alanio et al. 2011;Mellado et al. 2001).

Finally, susceptibilities to posaconazole (PSC), tebuconazole (TBC), propiconazole (PPC), and difenoconazole (DFC) were also defined by the EUCAST method.

Microsatellite typing

Short tandem repeat (STR) typing was performed for all resistant isolates and a selection of susceptible isolates using nine highly polymorphic microsatellite markers (STRAfs 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 4A, 4B, 4C) amplified with three triplex PCRs (de Valk et al. 2005). The reference strain AF293 (CBS 101355) was used as a control. PCR products were analyzed on the Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer with GeneScan™ 400 HD ROX™ size standard (Thermofisher®, Waltham, MA, USA). Amplicon sizes were determined with GeneMapper software and then transformed in repeat number.

Chemical analysis of soils: DMI dosage

At each farm, three deep samples were taken with auger, the same device as for pedological analyses. Each sample was collected as a drilled 40-cm soil core and then divided into four parts to obtain four depths of azole measures. Five DMIs (propiconazole (PPC), tebuconazole (TBC), difenoconazole (DFC), epoxiconazole (EPC), bromuconazole (BMC)) were sought in all the auger samples at four depths (0-10, 10-20, 20-30, and 30-40 cm). A total of 10 surface samples per site with AR-Afs were also analyzed.

DMIs were extracted by using the QuECHERS method (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe), and the dosage was performed by gas chromatography (GC) with a GC system 7890A™ (Agilent Technologies®, Massy, France) coupled with detection by triple quadrupole mass spectrometry (7000 GC-MS/MS model; Agilent Technologies®) as previously described (Jeanvoine et al. 2017). Validation of the method was studied through linearity of the calibration curve established from spiked samples (coefficient of determination > 0.9972), limit of detection calculated at a signal-to-noise ratio of 3 (in the range of 0.7 (EPC) to 4.2 ng g -1 (DFC), precision (19% on average for the 5 studied triazoles), and trueness (between 91 and 107%). For collected samples, analyses were made in triplicate and concentrations were expressed in μgg -1 of soil in dry weight.

Statistical analysis

Statistical analyses were performed using RStudio software (version 3.2.2, Boston, MA). Wilcoxon tests were used to compare resistance and minimal inhibition concentration (MIC) values. Microsatellite genotype distances were calculated using Bruvo'sdistance(Bruvoetal.2004). A minimum spanning network was calculated via the bruvo.msn function on the poppr library (Kamvar et al. 2015).

Results

Market gardens and crop treatment

The four MG-DMIs sprayed difenoconazole on celery and carrots (D, E, F), cabbage (D), or apples (C): C, E, and F in all fields in 2016 and D in one field in 2015 and in another in 2016. Sampling in MG-DMI C was done in an orchard, in three fields of apple trees. Soil was covered with grass. The soils of MG-DMI D, E, and F had recently been plowed. The clay soil of D contained 4.5% of organic matter, and the sandy soils of E and F contained less 2% and 0.2% of organic matter, respectively (Table 1). The 40 aR-Afs were found in market gardens D and E. For these two market gardens, susceptibilities of 25 A. fumigatus isolated on DG18 media were also tested and 4 were resistant for one or more medical azoles (ITC, VRC, and PSC). Thus, the percentages of soils with aR-Afs were 23% (7/30) in D and 10% (3/30) in E, for a total of 44 aR-Afs.

Among the 44 aR-Afs, 34 isolates had the TR34/L98H mutation (77.5%), nine the TR46/Y121F/T289A mutation (22.5%), and one had no mutation in the cyp51A gene. Twenty-seven aR-Afs were highly resistant with MIC for ITC and/or VRC ≥ 16 mg L -1 . Fifteen (13 TR34/L98H and 2 TR46/Y121F/T289A) were pan-resistant to 3 medical azoles (Table 2). Among aR-Afs, all isolates had high MIC for DFC (≥ 8mgL -1 ) except 3 (with MIC = 4 mg L -1 ). MIC values for VRC and DFC were significantly higher for strains carrying the TR46/Y121F/T289A mutations (Wilcoxon tests: p values < 0.01). For ITC, strains carrying the TR34/L98H mutation had higher MIC (p value = 0.050).

Susceptible isolates had low MIC for fungicides (≤ 4m gL -1 ) except two isolates (numbered 103 and 104 in Table 2 with MIC = 8 mg L -1 for TBC and/or PPC).

Strain genotyping

In total, 43 genotypes were defined from the 65 analyzed isolates (Table 1 in supplemental data). STRAf 3A was the most variable locus with a minimum of 10 repeats and a maximum of 101 repeats. The 21 susceptible strains had 21 different genotypes, with two groups of two and three genotypes with similarities (Bruvo's distance, cutoff < 0.2 represented by a thicker link and dotted lines in Fig. 1).

The 44 aR-Afs were caracterized by 22 genotypes, with some isolates genotypically indistinguishable (for example, numbers 36 and 40 from a market garden D field sprayed in 2015, and 66 from a market garden D field sprayed in 2016, Fig. 1 and Table 2). Genotypes showed diversity between aR-Afs with different mutations confering resistance, but also in the TR34/L98H group. However, for aR-Afs, four groups of genotypes were defined (Bruvo's distance, cutoff < 0.2) and presented similarities (Fig. 1). Three isolates from market garden D, two TR46/Y121F/T289A and one TR34/L98H, were grouped together and differed only by 38 repeats in STRAf 3A locus. No link was found between resistance/susceptibility profile and genotype.

Dosage of DMI in surface samples

Concerning the dosage of DMIs in drilled soil cores, no azoles were detected in the two market gardens (A and B) that had declared no use of azoles on the initial questionnaire. DFC was only detected in the soil of market gardens D and E, with 1/12 and 3/12 positive samples, respectively. No DFC was detected in market gardens C and F while both used this molecule to treat crops.

The dosage of DMI in the surface samples was carried out for all the samples containing resistant strains: seven in market garden D and three in E; and in the surface samples without resistant strains, three in D and seven in E (Table 3). Only DFC was detected in all of the 20 surface samples, with quantities ranging from 4.6 to 414.5 ng g -1 of soil. In market garden E samples, there was no significant difference in DFC concentrations between substrates with and without resistant strains. Conversely, in market garden D, a slight significant difference was established (Wilcoxon test, p value = 0.0497), with the two higher DFC concentrations (360.9 and 414.5 ng g -1 of soil) in substrates without resistant strains.

Discussion

This study, carried out in market gardens, showed the presence of aR-Afs harboring TR34/L98H and TR46/Y121F/T289A mutations, with a diversity of genotypes between susceptible and resistant strains and also between aR-Afs. These strains were found only in crops using azole-based fungicides and for which DFC was found in soils.

The primary mutation was TR34/L98H (77.3% of cases), which is actually the most common environmental mutation (Berger et al. 2017). Other aR-Afs had the TR46/Y121F/ T289A mutation, more recently discribed and less common, and one did not have a mutation on cyp51A. Observed differences between MIC for medical azoles (higher for VRC in strains with TR46/Y121F/T289A and higher for ITC for strains withTR34/L98H) have already been described in publications [START_REF] Garcia-Rubio | Triazole resistance in Aspergillus species: an emerging problem[END_REF];H o w a r de ta l .2009; [START_REF] Lavergne | First description of azole-resistant Aspergillus fumigatus due to TR46/Y121F/T289A mutation in France[END_REF]. In our study, TR46/Y121F/T289A strains also showed high MIC for DFC. In our previous study in sawmills, where TBC and PPC were detected in soils, no TR46/Y121F/T289A strains were isolated (Jeanvoine et al. 2017). Thus, perhaps depending on the type of fungicide used, the adaptation of exposed strains could be different, with more serious consequences if the selected mutation is correlated A few publications have advanced the hypothesis of a common ancestor of TR34/L98H aR-Afs spreading across countries (Badali et al. 2013;Chowdhary et al. 2015), and Alvarez-Moreno et al., for example, found genotypically undistinguishable isolates in different sites in Colombia, thus promoting a clonal spread of aR-Afs (Alvarez-Moreno et al. 2017).

In our study, the genotypic diversity observed between aR-Afs in market gardens is actually quite different. Even if greater diversity was found between susceptible genotypes, there does not seem to be any genotype related to resistance level. We did not find any genotypically undistinguishable isolates in different market gardens but only one common genotype in two different fields (1.5 km apart) of the same market garden (D). Some isolates detected from the same field (not in the same sample) had the same genotype and the same mutations but not exactly the same resistance profile. STRAf loci 3A showed the greatest diversity, as has already been shown for agricultural strains (Ashu et al. 2018). This microsatellite is located on chromosome 4, like the cyp51A gene. However, we will probably never be able to find a link between STRAf loci 3A and resistance profile because of an important number of possible recombinations during sexual reproduction.

Few studies have been carried out on vegetable and/or fruit crops [START_REF] Chowdhary | Multi-azole-resistant Aspergillus fumigatus in the environment in Tanzania[END_REF]Prigitano et al. 2014;Sharma et al. 2015). In a Chinese study conducted in a market garden with fields sprayed with fungicides [START_REF] Ren | Fungicides induced triazole-resistance in Aspergillus fumigatus associated with mutations of TR46/Y121F/T289A and its appearance in agricultural fields[END_REF], three resistant isolates (two TR46/Y121F/T298A and one TR34/L98H/S297T/F495I) were found in greenhouses with Luffa and strawberry plants. In this study, only 2% (3/144) of fungicide-sprayed soils had resistance, with A. fumigatus isolated in 40.3% of soil samples. In our study, results were different with 17.9% of soils containing A. fumigatus and 10% of soils with aR-Afs. This percentage of soils with resistance varies according to the studies, depending on the number of samples and probably depending on the type of soils, crops, and fungicides. Moreover, the detection of aR-Afs on DG18 (and not by means of a pre-selection with azole-supplemented media) showed that we globally underestimate the presence of aR-Afs.

The four MG-DMI sprayed fungicides contained DFC. Market gardens C, E, and F used fungicides with the same formulation, but aR-Afs were only detected in market garden E. AR-Afs were primarily detected in market garden D which used another fungicide with DFC mixed with azoxystrobin, an inhibitor of mitochondrial respiration. By analogy with SOS response in bacteria [START_REF] Baharoglu | SOS, the formidable strategy of bacteria against aggressions[END_REF], which allows adaptation and evolution when environmental conditions require them, we hypothesize that the observed differences in resistance between the D sites Therefore, azoles are more diluted due to their hydrophobicity [START_REF] Komarek | Contamination of vineyard soils with fungicides: a review of environmental and toxicological aspects[END_REF]. Water and azole molecules do not remain on the surface for very long, which may not allow enough time for aR-Af development. Other aR-Afs (n = 37) were isolated in D soils, which contained a considerable amount of clay. This probably facilitated contact between DFC and A. fumigatus.

The presence of aR-Afs in market gardens raises the question of workers' exposure. We published a case of immunocompromised farmer who live near his fields and develop an IA with aR-Afs (Rocchi et al. 2014). But, IA does not concern only patients with hematological malignancies and can occur in immunocompetent host after work-related accident in a professional activity using DMIs, as was the case for a wood-worker in our region (Jeanvoine et al. 2016). These two case reports showed that professional activities using DMIs, such as farming or sawmills, may represent a risk of developing infection with aR-Afs.

Market gardens can, indeed, be even more worrying because fields of crops are sometimes closely surrounded by houses. We now isolate resistant strains even in the corridors of the University hospital of Besançon (11 aR-Afs from 1248 air samples (0.9%) in the last 3 years) (unpublished personnal data). Several factors could play an important role for infection with aR-Afs including distance to occupational sites where DMI are used, rural, peri urban or urban habitat, occupational activities, level of succeptibility to infection (pulmonary diseases, immunosupression). Infection with resitant strains could be possible near occupational sites in rural area, with high abundance of aR-Afs but low density of at risk population, or also in hospital, with higher number of at risk subjets but lower abundance of aR-Afs.

Conclusion

Although further studies are clearly needed to identify all possible sources of resistance selection, from our point of view, it is also important to better understand why in some cases, using DMIs does not promote a resistant population. Studies like this one, including detection and genotyping of aR-Afs and quantification of residual DMI in soils, are necessary along with a pedological analysis to define the different types of soils. As therapeutic options for treatment of severe invasive fungal infection in human are very few, better knowledge of parameters involved in resistance, better management of azole fungicides environmental use, and even prohibition of those able to promote cross-resistance in pathogenic fungi are necessary to preserve efficiency of azole medical antifungals. Hypothèses de travail :

• La provenance des isolats d'Aspergillus fumigatus résistants présents dans les couloirs du CHU est attribuée à une source extérieure à l'établissement.

• La source de ces isolats peut potentiellement être liée à la présence de massif de plantes ornementales aux abords du CHU.

• Un risque plus important de détecter des résistances est lié à la présence de bulbes de fleurs traitées aux triazolés.

Résumé en français :

La recherche d'Aspergillus fumigatus résistants aux triazolés (aR-Af) est réalisée dans l'air intérieur de l'hôpital de Besançon depuis 2015 et a été faite dans des échantillons de sol et de poussière en 2019. Au total, 83 aR-Af présentent une mutation TR34/L98H : 1 dans l'air de l'unité de réanimation médicale, 16 dans les couloirs principaux, 59 issus de prélèvements de terre réalisés dans des bacs de fleurs contenant des tulipes importées des Pays-Bas, et 5 provenant de prélèvements de terre réalisés dans des bacs contenant des arbustes cultivés en pots.

Eléments essentiels :

• Un nombre croissant d'A. fumigatus résistants a été détecté dans les couloirs du CHU de Besançon au fil des années ;

• Des prélèvements environnementaux (air et sol de parterres de fleurs) ont été réalisés aux abords du CHU afin de les analyser par culture pour déterminer les sources potentielles des isolats résistants ;

Azole-resistant Aspergillus fumigatus (ARAf) have emerged worldwide over the last 20 years and pose an increasing public health problem. ARAf emerge principally in situations in which fungicides with chemical structures similar to medical compounds are used for the treatment of crops and materials in the environment.

The number of clinical cases involving these strains is increasing at the University Hospital of Besançon (UHB), particularly in cystic fibrosis patients (16% of patients with A fumigatus-positive cultures in 2017). Since 2015, the number of ARAf isolates obtained in air of corridors has also increased.

There are 2 possible reasons for this increase in the number of ARAf: (1) the location of the hospital in a geographic area, with high levels of agricultural activity and hotspots of resistance, 1,2 and (2) the presence of flower beds in the outdoor spaces of the hospital (flowers have been banned in hospital corridors and rooms since 1982), because bulbs have been reported to be a source of ARAf. 3,4 Therefore, the primary objective of this study was to develop new measurements of air contamination to determine whether ARAf are brought to the hospital from the rural environment (with resistance hotspots) by prevailing winds. We also investigated the possible role of plants, trees, and flower beds within and around the hospital as sources for ARAf and the spread of these fungi to the hospital.

METHODS

Over the last 17 years, weekly air samples have been collected from the hematology departments and corridors of the hospital (n = 25 air samples per week). 5 Since December 2018, air samples have also been collected monthly from the intensive care unit.

Since January 2019, external samples have been collected with a homemade dust vane sensor equipped with 2 wipes, placed on a second floor terrace (the hematology units being located on this floor), to capture dust carried by the prevailing westerly wind (Fig 1). This easy-to-use inexpensive device was developed for this study to be able to collect outdoor dust for 1 month, even in windy conditions, and allowed both culture and qPCR analyses to detect A fumigatus, according to a previously described protocol. 6 Dust samples were also collected by aspiration on a filter placed at the end of a vacuum cleaner, close to the emergency door of the intensive care hematology department, in the corridor along zone A, and in an area in which hematology consultations take place.

We identified 4 soil sampling areas within the hospital and in the surrounding environment. Zone A corresponds to an outdoor relaxation area within the hospital with flowerbeds, zone B consists of the flowerbeds in front of the hospital entrance, zone C is an indoor area below the hospital reception area, in which there are trees grown in pots, and zone D corresponds to an outdoor area, at level -1, below zone A, with flower beds (Fig 1).

ARAf were screened (in the air, dust, and soil samples) by culture on 2 media containing itraconazole (2 mg/L) and voriconazole (1 mg/L). The EUCAST method was used to test for resistance. Aspergillus identification and cyp51A gene mutation were assessed by sequencing the b-tubulin gene and cyp51A and its promoter and/or with the Fungiplex Aspergillus and Fungiplex Azole-R Bruker kits (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany).

RESULTS

Several cases of IA are diagnosed annually at UHB (eg, 6 in 2016, 16 in 2017, 12 in 2018, and 6 in 2019), and 3 cases of IA owing to ARAf (TR 34 /L98H mutation) have been diagnosed since 2012: 2 in immunocompromised patients from hematology department (1 farmer using triazoles and 1 living in a farm in the middle of cultivated fields) and 1 immunocompetent woodworker who suffered facial destruction as a result of a work accident with a piece of wood. 2,7,8 For now, we did not change antifungal regiments for prophylaxis or treatment, however, since 2015 we have extended the antifungal susceptibility testing (E-test) to every A fumigatus strains isolated in at-risk patients.

Seventeen ARAf isolates have been obtained from the indoor air of UHB: 1 in 2015, 1 in 2016, 7 in 2017, 3 in 2018, and 5 in 2019 (first half of the year). All of the isolates had the TR 34 /L98H mutation (cyp51A sequencing). One was detected in the intensive care unit, and the other 16 were found in the main corridors. Two ARAf isolates with the TR 34 /L98H mutation were also detected in dust collected by aspiration at the front of the intensive care hematology department and in the corridor along zone A.

The 85 soil samples yielded 137 isolates from zones A, B, and D that grew on azole media: 90 A fumigatus and 47 Neosartorya fisheri (zone B). Overall, 71% (64/90) of the A fumigatus isolates were resistant to at least 1 azole, and all of the isolates had the TR 34 /L98H mutation: 59 ARAf were obtained from tulip pots imported from the Netherlands, and 5 were found in the soil of pots containing trees.

The external sensor detected no ARAf, suggesting that the ARAf detected in the hospital are not carried in by the prevailing winds from surrounding hotspots of resistance.

DISCUSSION

The configuration of the area experiencing ARAf contamination (zones A and D) and the absence of ARAf detection by the outdoor sensor suggest that the prevailing wind is blocked by the walls of the buildings around the esplanade, which create an obstacle, and that this results in the resuspension of ARAf spores from the flower beds into the air. To confirm the hypothesis that the flower beds or imported tulips were the actual 'source' of ARAf isolates obtained from hospital corridors or patient clinical specimens, typing analysis (genotyping or whole-genome sequencing) are needed. The results showed the interest of increasing vigilance on the surveillance of resistant strains in our hospital. The hospital committee for the control of nosocomial infections has already decided to stop planting bulbs in the outdoor areas surrounding the hospital. In 2020, other alternatives will be proposed, such as the planting of other types of flowers of controlled origin or of bulbs produced through organic farming methods. Hypothèses de travail :

• La présence de bulbes traités aux triazolés dans les massifs de fleurs situé aux abords du CHU est la source de diffusion d'isolats d'Aspergillus fumigatus résistants.

• En remplaçant les bulbes de fleurs traités aux fongicides azolés par des bulbes issus de l'agriculture biologique, la source d'isolats résistants sera stoppée.

• Une population d'isolats sensibles remplacera la population résistante en l'absence de cette pression.

Résumé en français :

Les bulbes de plantes traités aux azolés ont déjà été évoqués comme une explication potentielle de la diffusion mondiale d'Aspergillus fumigatus résistants aux azolés (aR-Af). Nous avons précédemment souligné la présence d'un taux élevé d'aR-Af (71% des A.fumigatus isolés de milieux supplémentés en azolés) dans des parterres de fleurs contenant des bulbes traités aux azolés aux abords de l'hôpital. Ici nous montrons que la plantation de bulbes d'origine biologique peut être une solution pour réduire le taux d'aR-Af (passant de 71% à moins de 3%).

Ces résultats suggèrent que le remplacement des bulbes traités par des bulbes biologiques peut être suffisant pour retrouver une population majoritairement sensible en seulement 1 an.

Eléments essentiels :

• Une analyse des sols provenant de pots de fleurs bordant le CHU de Besançon a été effectuée un an auparavant. Sur les isolats d'A. fumigatus retrouvés, 71% étaient résistants aux triazolés (cf. partie 4.1) ;

• Les isolats ont été principalement retrouvés dans des pots de terre contenant des bulbes de tulipes traités aux triazolés. La décision a été prise de les remplacer par des bulbes issus de l'agriculture biologique sans pour autant changer le sol ;

• Un an plus tard, le même protocole a été réalisé sur ces mêmes pots de fleurs : seulement 3% des isolats d'Aspergillus fumigatus retrouvés dans les sols étaient alors résistants ;

• Le remplacement des bulbes traités par des bulbes issus d'agriculture biologique semble favoriser le rétablissement d'une population sensible (wild type) en un an. Fungal aerocontamination monitoring is carried out for 18 years in our hospital, with weekly air samples collected from the haematology departments and general corridors. 1 Given the global emergence of triazole resistance in Aspergillus fumigatus, in both clinical as well as environmental isolates and extension of the phenomenon to all countries in Europe and to all continents, this environmental air monitoring has been extended in 2015 to include research on azole-resistant A. fumigatus (ARAf). Since 2017, several ARAf with TR 34 /L98H mutation were detected in the air of general corridors each year: 7 in 2017, 3 in 2018 and 5 in 2019.

In 2019, a study was conducted to determine whether plant, tree and flower beds, ornamenting a new terrace at a central location in hospital, could be sources of ARAf, especially since the presence of tulip bulbs was described as a potential route of ARAf dissemination. 2,3 We performed 85 soil samples and 71% (64/90) of A. fumigatus detected on azole-supplemented media were resistant, had TR 34 /L98H mutation and most of them (92%) were detected in pots containing tulips. 4 After information taken from the gardener and ornamental plant seller, we knew that the bulbs had been treated with azole fungicides.

Following these results, it was decided to order bulbs from organic farming through the same plant manufacturer. Since soil in the pots had not been changed, we expected a similar resistance rate, or at best, a small decrease in the number of resistant strains. The objective at this stage was to annually monitor the pots in order to assess (or not) the presence of ARAF and evaluate the fungal contamination induced by organic plants.

In February 2020, controls were made in 10 pots, already sampled in 2019, containing or not ARAf (Table 1). The isolation of A. fumigatus was carried out as previously described on malt agar supplemented by itraconazole (2 mg l -1 ) and voriconazole (1 mg l -1 ) at 48°C. 4 The EUCAST method (broth microdilution) was used to assess minimal inhibition concentration (MIC). 5 The DNA of azole-resistant isolates characterized by EUCAST was extracted using the DNeasy Plant Mini Kit TM (Qiagen®, Milan, Italy) and identification of A. fumigatus isolates was validated by PCR amplification and sequencing a part of beta-tubulin gene. 6 The search for the main 'environmental' mutations on cyp51A gene (TR 34 /L98H and TR 46 /Y121A/T289A) was done with the Fungiplex Azole-R Bruker kit (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany). This kit has been previously evaluated on 97 DNA extracts of our ARAF collection for which cyp51A gene sequencing 6,7 was previously performed (84 TR 34 /L98H, 9 TR 46 /Y121A/T289A and four resistant isolates without cyp51A mutation, from clinical and environmental samples). After various DNA dilution tests, qPCR was validated for an optimal DNA concentration between 0.2 and 10 ng/μl, with 100% of strains carrying TR 34 /L98H or TR 46 /Y121A/T289A detected and 100% of resistant strains without TR mutation not detected.

In the 2020 sampling campaign, only two pots (Table 1) present one ARAf identified with MIC of 4 mg l -1 for voriconazole and >16 mg l -1 for itraconazole. Both strains had TR 34 /L98H mutation.

Hypothesis was that ARAf was brought by tulip bulbs and could spread in pots, resistant isolates may be able to persist over months in the environment, 8 with duration of persistence not known. In our study, the number of ARAf found in flowers beds had greatly decreased, from 71% (rate of resistant isolates out of the number of isolates detected on antifungal media) in 2019 to <3% in 2020. It seems that the simple act of removing the azole-treated bulbs is enough for a susceptible population to re-establish itself in 1 year, gaining the upper hand over the resistant ones that were largely dominant.

For TR 34 /L98H isolates, fitness cost has never been described yet. For others ARAf (mutations from patients acquired resistance route or other mechanisms without cyp51A mutations) observations are more mixed: In vitro, the growth of the mutants (G54W and M220K) was similar to those of the parental strain. 9 In opposition, azole-resistant isolates (from patient-acquired resistance route) showed reduced growth rates, abnormal colony morphology or lack of sporulation when grown in the absence of triazoles. 10 In these cases, ARAf are not able to compete with wild-type isolates in non-azole environment. 11 It is possible that the same thing happened in the flower pots, where, when the source of azole (bulb) is removed, a sensitive population becomes dominant.

For now, only four studies were interested in the ARAf linked to the bulbs. 2-4,12 and they emphasized that ARAf can be disseminated by international trade. Although the observation of resistance related to bulbs is not observed everywhere, 13 it may be time to find ways to limit this diffusion. This study was limited to one hospital and even if the decrease in ARAf rate may also be favored by environmental factors that occurred in 2020 (such as weather) the results justify a precautionary principle, to stop putting fungicide-treated bulbs in hospital surroundings.

Conversely, in the most recent study on bulbs conducted in Japan, the authors have also investigated a method of disinfecting plant bulbs contaminated with ARAfs, using benomyl and prochloraz. 12 But, in this context where we show that fungicides in agrosystems have an unintentional impact on public health, the overuse of fungicides is certainly not a good way to go in the long term. However, the planting of ornamental plants from organic agriculture could be a good alternative to reduce risk to dissipate ARAf in the hospital environment where numerous patients at risk are hospitalized in hematology ICU.

Le changement des pratiques d'une agriculture intensive (utilisant les triazolés) vers une agriculture biologique a permis, pour le cas des plantes ornementales, de réduire les quantités d'A. fumigatus résistantes. Endiguer le phénomène de cette diffusion de la résistance est particulièrement important quand il est associé à l'exposition directe d'une population à risque de développer des pathologies fongiques graves, par exemple aux alentours de l'hôpital. Dans

Cyclodextrines, présentation et intérêt pour un usage environnemental

Limiter la pollution environnementale qui touche tous les compartiments et peut trouver sa source dans de nombreux domaines, l'industrialisation, l'agriculture intensive, la déforestation ou encore l'utilisation des combustibles fossiles (Hayzoun et al., 2014 ;Perera, 2018 ;[START_REF] Kopittke | Soil and the intensification of agriculture for global food security[END_REF][START_REF] Sánchez-Bayo | Worldwide decline of the entomofauna: A review of its drivers[END_REF][START_REF] Austin | What causes deforestation in Indonesia?[END_REF] est devenu une nécessité.

La contamination des sols par les fongicides triazolés s'inscrit pleinement dans cette problématique. Des « technologies vertes » sont ainsi à développer dans le but de répondre à ce défi. Le cahier des charges du développement de ces technologies réside dans le fait de diminuer l'exposition des écosystèmes aux polluants en utilisant des ressources renouvelables et des biomatériaux [START_REF] Fenyvesi | Cyclodextrin-enabled green environmental biotechnologies[END_REF]. Dans cette optique, nous nous sommes intéressés aux cyclodextrines, des molécules cages issues de la dégradation de l'amidon, afin d'évaluer leur potentielle capacité à limiter la pollution environnementale aux triazolés.

Les cyclodextrines.

Les cyclodextrines (CD) sont des molécules cages composées de résidus glucopyranoses. Ces molécules sont produites grâce à la digestion enzymatique de l'amidon (e.g. de maïs ou de pomme de terre) [START_REF] Slomińska | Studies on Cyclodextrin Synthesis by Novel Cyclodextrin Glucosyl Transferase[END_REF] CDs [START_REF] Yoshida | Improvement of Chemical Instability of Digitoxin in Aqueous Solution by Complexation with β-Cyclodextrin Derivatives[END_REF][START_REF] Eastburn | Applications of modified cyclodextrins[END_REF][START_REF] Frank | Temperature induced crystallization transition in aqueous solutions of β-Cyclodextrin, Heptakis(2,6-di-O-methyl)-βcyclodextrin (DIMEB), and Heptakis(2,3,6-tri-O-methyl)-β-cyclodextrin (TRIMEB) studied by differential scanning calorimetry[END_REF][START_REF] Liu | Cyclodextrin polymers: Structure, synthesis, and use as drug carriers[END_REF]. Leurs caractéristiques en font des molécules de choix qui ont trouvé leur place, depuis les années 1970, dans de nombreux domaines d'applications [START_REF] Szejtli | Cyclodextrin Technology[END_REF][START_REF] Szejtli | Introduction and General Overview of Cyclodextrin Chemistry[END_REF].

Les domaines d'application des cyclodextrines.

Les CDs présentent de nombreux avantages pour une utilisation dans les domaines pharmaceutiques. Leurs capacités d'inclusion en font des véhicules particulièrement efficaces pour le transport des molécules actives des médicaments [START_REF] Bibby | Mechanisms by which cyclodextrins modify drug release from polymeric drug delivery systems[END_REF]Bilensoy, 2011).

Les CDs permettent également d'atténuer les goûts désagréables et les mauvaises odeurs, mais aussi d'augmenter la biodisponibilité des principes actifs qu'elles contiennent en les rendant plus solubles [START_REF] Duchene | Industrial uses of cyclodextrins and their derivatives[END_REF][START_REF] Uekama | Cyclodextrin Drug Carrier Systems[END_REF]. Leur flexibilité dans les voies d'administration et leur non toxicité font qu'elles sont actuellement utilisées dans une quarantaine de formulations (Morin- [START_REF] Morin-Crini | Cyclodextrines. Histoire, propriétés, chimie & applications[END_REF]. Certaines de leurs propriétés sont également utilisées dans le domaine de la cosmétique [START_REF] Buschmann | Applications of cyclodextrins in cosmetic products: A review[END_REF][START_REF] Dodziuk | Cyclodextrins and Their Complexes: Chemistry, Analytical Methods, Applications[END_REF].

Le secteur alimentaire est également un domaine où les cyclodextrines sont largement mises à profit depuis plusieurs décennies. Elles trouvent un intérêt dans la préservation des arômes, en tant qu'exhausteurs de goût ou comme outils de préservation des saveurs [START_REF] Goubet | Retention of Aroma Compounds by Carbohydrates: Influence of Their Physicochemical Characteristics and of Their Physical State. A Review[END_REF][START_REF] Astray | A review on the use of cyclodextrins in foods[END_REF]. Comme dans les autres domaines, les CDs peuvent également permettre de limiter les odeurs de certains aliments et d'éviter l'amertume. Les 3 cyclodextrines natives sont répertoriées comme additifs alimentaires sous les numéros E457, E459 et E458 pour l'α-CD, la β-CD et la γ-CD respectivement [START_REF] Mortensen | Re-evaluation of β-cyclodextrin (E 459) as a food additive[END_REF][START_REF] Matencio | Applications of cyclodextrins in food science. A review[END_REF].

Les CDs peuvent également être utilisées dans les secteurs du textile, du plastique, du papier ou bien encore de la photographie [START_REF] Szejtli | Past, present and futute of cyclodextrin research[END_REF][START_REF] Dodziuk | Cyclodextrins and Their Complexes: Chemistry, Analytical Methods, Applications[END_REF][START_REF] Bhaskara-Amrit | Applications of B-cyclodextrins in textiles[END_REF]Voncina & Vivod, 2013).

L'usage des CDs concerne de nombreux champs d'application, mais leur emploi pour la préservation de l'environnement n'a commencé que dans la fin des années 1990 [START_REF] Morin-Crini | Cyclodextrines. Histoire, propriétés, chimie & applications[END_REF]. Pourtant ces molécules sont biodégradables, non toxiques et leur coût a été largement diminué au fil du temps, parallèlement à l'augmentation de leur production.

Les effets bénéfiques qu'elles peuvent avoir dans la dépollution des eaux sont largement décrits dans la littérature [START_REF] Boving | Cyclodextrin-enhanced remediation of organic and metal contaminants in porous media and groundwater[END_REF][START_REF] Landy | Remediation technologies using cyclodextrins: An overview[END_REF][START_REF] Montfort | Effects of two triazole seed treatments, triticonazole and triadimenol, on growth and development of wheat[END_REF][START_REF] Sikder | Remediation of water pollution with native cyclodextrins and modified cyclodextrins: A comparative overview and perspectives[END_REF][START_REF] Tian | Cyclodextrin-based adsorbents for the removal of pollutants from wastewater: A review[END_REF][START_REF] Cova | Cyclodextrin Polymers and Cyclodextrin-Containing Polysaccharides for Water Remediation[END_REF]. Leur capacité à dépolluer l'eau en agissant comme des filtres contre les résidus de pesticides, les métaux lourds ou bien encore les perturbateurs endocriniens a été démontrée [START_REF] Salipira | Carbon nanotubes and cyclodextrin polymers for removing organic pollutants from water[END_REF][START_REF] Mahlambi | β-Cyclodextrinionic liquid polyurethanes for the removal of organic pollutants and heavy metals from water: Synthesis and characterization[END_REF][START_REF] Sikder | Remediation of water pollution with native cyclodextrins and modified cyclodextrins: A comparative overview and perspectives[END_REF][START_REF] Pedrazzo | Eco-Friendly β-cyclodextrin and Linecaps Polymers for the Removal of Heavy Metals[END_REF][START_REF] Song | β-Cyclodextrin-Polyacrylamide hydrogel for removal of organic micropollutants from water[END_REF].

110

Malgré ces constats sur leur efficacité, les CDs sont sous-utilisées dans le domaine de la protection et de la dépollution de l'environnement. Peu d'études ont été menées sur leur capacité à interagir avec les fongicides triazolés afin d'éviter leur diffusion environnementale [START_REF] Stepniak | Study on a host-guest interaction of β-cyclodextrin with tebuconazole in water[END_REF]. Pourtant, disposer de ce genre « d'outils » ouvrirait de nouvelles perspectives indispensables concernant la protection des écosystèmes.

4.4.3.

Evaluation de l'interaction potentielle cyclodextrines/triazolés grâce au modèle biologique A. fumigatus et à la modélisation moléculaire

Introduction

Pesticides use is increasing worldwide, to intensify agricultural production to meet the needs of growing populations requiring more and more food [1].

Fungicides are widely used in agricultural development, to prevent or cure fungal infections of plants that can decrease production yields [2].

Triazole fungicides are often the treatment of choice, because of their broad spectrum of action and their specific targeting of fungi [3,4]. Almost 30 different molecules have been authorized by national, European and international agencies (e.g. the US Food and Drug Administration) and are used to protect crops or materials against fungal damage [5,6]. New formulations are continually being released onto the market [7].

Following their application on crops, triazoles act on the aerial parts of the plant and persist in soils for a few days to several months, depending on the molecule used, the characteristics of the soil and meteorological conditions [8,9]. During this period, these fungicides may have unintended effects on

Aspergillus fumigatus, a non-phytopathogenic fungus naturally present in soils, through the exertion of selection pressure [10]. This can lead to an increase in the size of the population of A. fumigatus strains with pan-resistance to triazoles [11].

This resistance phenomenon is a matter of concern, because this fungus can cause disease in humans [12].

Indeed, A. fumigatus is an opportunistic pathogen, and is the fungus most frequently implicated in invasive pulmonary aspergillosis, a fungal infection with a high mortality rate [13,14]. The phenomenon of resistance to medical treatments based on triazoles has been known for more than 20 years and is frequently described [START_REF] Jeanvoine | Sinus aspergillosis due to an azole-resistant Aspergillus fumigatus strain carrying the TR 34 /L98H mutation in immunocompetent host[END_REF]. This resistance has been reported

worldwide and is linked to the use of triazole fungicides in the environment, given the close chemical similarities of medical and agricultural triazoles [START_REF]European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST)[END_REF][START_REF] Rocchi | Determination of azole fungal residues in soils and detection of Aspergillus fumigatus-resistant strains in market gardens of Eastern France[END_REF][START_REF] Chowdhary | Clonal Expansion and Emergence of Environmental Multiple-Triazole-Resistant Aspergillus fumigatus Strains Carrying the TR 34 /L98H Mutations in the cyp51A Gene in India[END_REF][START_REF] Chang | Diversity and origins of Indian multi-triazole resistant strains of Aspergillus fumigatus[END_REF]. The number of people at risk of developing opportunistic diseases is steadily increasing around the world. Over the last decade, medical advances in immunosuppression techniques, chemotherapy, organ transplantation and the use of biotherapies in chronic inflammatory diseases, in particular, have resulted in a major expansion of the population of immunocompromised individuals [START_REF] De Groot | Microsatellite Stability in STR Analysis Aspergillus fumigatus Depends on Number of Repeat Units[END_REF].

This observation highlights the importance of limiting the emergence of resistance in opportunistic pathogens. New solutions to limit the spread of triazole resistance are therefore required, to limit public health implications [START_REF] Badali | Environmental study of azole-resistant Aspergillus fumigatus with TR 34 /L98H mutations in the cyp51A gene in Iran[END_REF].

One possible approach to preventing triazole selection pressure would be to limit the overdispersion of triazole fungicides in the soil, which isn't needed, and to prevent contact between active fungicides and A.

fumigatus. Cyclodextrins (CDs), synthetic cyclic molecules derived from starch by enzymatic degradation [START_REF] Alvarez-Moreno | Azole-resistant Aspergillus fumigatus harboring TR 34 /L98H, TR 46 /Y121F/T289A and TR 53 mutations related to flower fields in Colombia[END_REF][START_REF] Korfanty | Contemporary Gene Flow is a Major Force Shaping the Aspergillus fumigatus Population in Auckland, New Zealand[END_REF], can be used to catch fungicides before their uncontrolled dissipation in the environment. These oligosaccharides have a remarkable ability to form host-guest interactions in solution and in the solid state (possible formation of inclusion complex). Their specific properties and their lack of toxicity and biocompatibility with humans have led to their use in numerous applications in the food industry, pharmaceuticals, medicine, biotechnology, cosmetics, hygiene and toiletries, the textile industry, catalysis, chromatography, and remediation, for example [START_REF] Sewell | Nonrandom Distribution of Azole Resistance across the Global Population of Aspergillus fumigatus[END_REF][START_REF] Meis | Clinical implications of globally emerging azole resistance in Aspergillus fumigatus[END_REF][26][27][28][29][30][31][32][START_REF]()* +, --.' / 0 .1, +23 .' 54897 I7G@ W909B@ I0?J7 $% 34% 4 XV 43% 4% ; L 4% A 74% 9 74% 7J= 890>897; % % 4 = @ @ ; 9 @ 91; 919G@ E[END_REF][START_REF]% % 4 = @ @ ; 9 @ 91; 91J"@ E 3@ 9G1 29 % 4 4 V8 2 3 F8 3 : B Y9 8 9 $6: I$ 3 A 8 A 34 4 V8 79 49 $4 2 ! 0191# F4U 9 44% 3 % $5 H 36 : 9 % 34% &' ()* +[END_REF]. Crini et al. [35] have shown that cyclodextrin polymers can interact Here, we pursue our work on this topic, broadening the experimental conditions used and performing A.

fumigatus growth tests to assess the impact of linear and cyclic dextrins and their interaction with two triazole fungicides, difenoconazole (DIFENO) and tebuconazole (TEBU), which are particularly widely used in the environment. Molecular dynamics simulations are also conducted to better investigate interactions between cyclodextrins and these fungicides.

Materials and Methods

Fungal strains

Twenty A. fumigatus strains were used, isolated in 2017 from a sampling campaign carried out on market gardens in the east of France. These strains were characterized by sequencing the β-tubulin and cyp51A

genes, to check species identification and the absence of genetic mutations conferring triazole resistance [42][43]. 2.

Fungicides

Difenoconazole (DIFENO, 1-[[2-[2-chloro-4-(4- chlorophenoxy) phenyl]-4-methyl-1,3-dioxolan-2- yl]methyl]-1,

Determination of minimum inhibitory concentrations

All 20 strains were tested with the EUCAST method to determine minimum inhibitory concentrations (MICs) for medical triazoles [44]. For itraconazole and voriconazole, clinical breakpoints were used to define resistance (a strain was defined as resistant if the MIC for these two molecules exceeded 2 mg/L [START_REF][END_REF]).

In each EUCAST plate, two reference strains were used (a sensitive strain: CBS 101355, and an environmental strain with the TR34/L98H We then performed the EUCAST method with DIFENO and TEBU in same conditions, to measure the MICs of triazole fungicides for the same strains.

In addition to the reference RPMI medium used for the EUCAST method, we used RPMI medium supplemented with maltodextrin and each of the five CDs to estimate the dextrin/triazole interaction potential and its limits. These media were prepared such that there were 10 molecules of dextrin per molecule of fungicide, in accordance with our preliminary results [36]. The MICs obtained with culture medium consisting solely of RPMI with DIFENO or TEBU were compared with those obtained with each of the dextrin-supplemented media. For each fungicide, we assessed the impact of MALTO or CDs in culture media by observing the increase in MIC (Figure 2).

Cyclodextrin

Microscopy analysis of fungal growth

The effect of each culture medium on fungal strain growth was also investigated in more detail, by performing a microscopy analysis. After the 48 hours of incubation required for the susceptibility test, 40 µL of culture medium present in the well were transferred to a microscope slide and the slide was sealed. The slides were observed under a light microscope (Leica microsystems, France), and image analysis was performed with Leica LAS V4.9 software. Microscopy observations were performed in every media at the concentration of fungicides determined as MIC for the strain concerned with the medium containing only RPMI: 1 mg/L for DIFENO and 2 mg/L for TEBU.

Statistical analysis

Log2-transformed MIC values were used for statistical analysis. The Akaike information criterion strain, to assess differences in fungal growth according to the dextrin used (relative to RMPI medium without dextrins) and fungicides. Statistical analyses were performed, and table and graphical display were generated with R-3.4.4 statistical software for Microsoft® Windows and lme4 [START_REF] Bates | Fitting linear mixed-effects models using lme4[END_REF],

nlme [START_REF] Pinheiro | nlme: Linear and nonlinear mixed effects models[END_REF], MuMIn [START_REF] Bartoń | Multi-Model Inference[END_REF], gtsummary and ggeffects [START_REF] Lüdecke | ggeffects: Tidy data frames of marginal effects from regression models[END_REF] libraries.

Simulation methodology

Simulations were conducted between α-CD, β-CD, γ-CD or HPβ-CD on the one hand and TEBU or DIFENO on the other hand. The high-resolution Xray structures of α-CD, β-CD and γ-CD were used as initial 3D models for molecular dynamics simulations.

The following protein data bank (PDB) codes were taken from research collaboratory for structural bioinformatics (RCSB) as 2XFY for α-CD [START_REF] Rejzek | Chemical genetics and cereal starch metabolism: structural basis of the noncovalent and covalent inhibition of barley βamylase[END_REF],

5MK9 for β-CD and 5MKA for γ-CD [START_REF] Homburg | Inducer exclusion in Firmicutes: insights into the regulation of a carbohydrate ATP binding cassette transporter from Lactobacillus casei BL23 by the signal transducing protein P-Ser46-HPr[END_REF]. The structures of TEBU and DIFENO molecules were also downloaded from RCSB [START_REF] Tyndall | Structural and functional elucidation of yeast lanosterol 14α-demethylase in complex with agrochemical antifungals[END_REF]. HP-β-CD structure used had one side substitution of seven hydroxypropyl, it was converted from PubChem to PDB format using Online SMILES Translator of NIH site (https://cactus.nci.nih.gov/). All structures were then subjected to quantum chemistry calculations using the Gaussian09 suite of programs [START_REF] Frisch | Gaussian 09 Programmer ' s Reference[END_REF].

Optimization of all molecules was done at DFT/B3LYP /6-31g* level of theory. Partial charges were calculated within the same level of theory using the restrained electrostatic potential scheme [START_REF] Bayly | A well-behaved electrostatic potential based method using charge restraints for deriving atomic charges: The RESP model[END_REF]. The software package Antechamber [START_REF] Wang | Automatic atom type and bond type perception in molecular mechanical calculations[END_REF] was used for the automatic parameterization of force field parameters with general Amber force field atom type [START_REF] Wang | Development and testing of a general Amber force field[END_REF][START_REF] Kutzner | Best bang for your buck: GPU nodes for GROMACS biomolecular simulations[END_REF].

Several systems were built for molecular dynamics (MD) which are presented in supplementary data (Table S-2) together with their equilibrium protocol.

Finally, production runs for the complexes of each systems were performed for 200 nanoseconds (ns)

under the condition of constant pressure and temperature. An integration step of 2 femtoseconds was used in all simulations with the bonds to hydrogen atoms converted to rigid constraints. The trajectories for structural coordinates were saved every 1 picosecond for data analysis. MD trajectories were analysed using visual molecular dynamics [START_REF] Humphrey | VMD: Visual molecular dynamics[END_REF] and Chimera [START_REF] Pettersen | UCSF Chimera -A visualization system for exploratory research and analysis[END_REF]. The molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area (MM-PBSA) method [START_REF] Kumari | G-mmpbsa -A GROMACS tool for high-throughput MM-PBSA calculations[END_REF][START_REF] Baker | Electrostatics of nanosystems: Application to microtubules and the ribosome[END_REF] were applied to estimate the binding free energy of the complexes.

Results

Characteristics of the fungal strains

The susceptible reference strain, CBS 101355, had a MIC of 4 mg/L for both fungicides, whereas the resistant reference strain had a MIC of 16 mg/L for both fungicides. The 20 strains tested had MICs no higher than that of the susceptible reference strain, for both DIFENO and TEBU. MICs were between 1 (12/20 strains) and 2 (8/20 strains) mg/L for DIFENO, and between 2 (12/20 strains) and 4 (8/20 strains) mg/L for TEBU, depending on the strain tested. Thus, for statistical analysis, strains were considered to be the random factor accounting for MIC variations and were added to the random part of the model.

Effect of the presence of cyclodextrins in the culture medium

The presented in the supplemental data (Table S-1).

Strains (random effects) accounted for 0.40 of the variance, and the fixed model accounted for 0.396.

The predicted MICs for the fixed part of the model (medium) are shown in Figure 3.

In several strains, the MICs of both DIFENO and TEBU were higher in media supplemented with TRIMEB, β-CD, or HP-β-CD than in dextrin-free RPMI medium (Table 3). For DIFENO, an increase in DIFENO. MICs for DIFENO were higher in γ-CDsupplemented medium than in the reference medium (higher MICs for 12/20 strains), whereas no effect on the MIC of TEBU was observed. Overall, increase in MICs were larger for DIFENO than for TEBU.

Regardless of the fungicide considered, an order of effectiveness, in terms of the increase in MIC, was observed for the dextrins added to the culture medium: MALTO  α-CD < γ-CD < TRIMEB < β-CD << HP-β-CD (Figure 3). MICs were measured in the presence of four cyclodextrins added to the culture media at a molar ratio of 10:1. For β-CD and its derivatives, in the presence of DIFENO or TEBU, fungal growth was greater in medium supplemented with HP-β-CD than in media supplemented with β-CD or TRIMEB, in accordance with Table 3. Similar increases in MIC relative to the reference medium were observed with β-CD, TRIMEB and HP-β-CD with TEBU for the 4E026 strain (Table 3), but microscopy revealed more extensive hyphal development with HP-β-CD.

Media supplemented with cyclodextrins* γ-CD TRIMEB β-CD HP-β-CD

Strains TEBU DIFENO TEBU DIFENO TEBU DIFENO TEBU DIFENO 4E007 - x2 - x2 x2 x2 x2 x4 4E008 - - - - x2 x2 x2 x2 4E009 - x2 x2 x2 x2 x2 x2 x4 4E010 - - - - x2 x2 x2 x4 4E011 - x2 x2 - x2 x2 x2 x4 4E012 - - x2 x2 x2 - x2 x2 4E013 - - - - x2 x2 x4 x4 4E014 - x2 - x2 x2 x2 x2 x2 4E015 - x2 - x2 - x2 x2 x2 4E016 - x2 x2 x2 - x2 x2 x4 4E017 - x2 - x2 - x2 x2 x2 4E018 - - x2 - x2 x2 x2 x4 4E019 - x2 - x2 x2 x2 x2 x2 4E020 - - - - x2 - x2 x2 4E022 - - x2 x2 - x2 x2 x2 4E023 - x2 - x2 x2 - x2 x2 4E024 - - x2 x2 x2 x2 x2 x2 4E025 - x2 - x2 x2 x2 x2 x2 4E026 - x2 x2 x2 x2 x2 x2 x4 4E027 - x2 x2

Incorporation of antifungal agents in cyclodextrins

In order to test the stability of cyclodextrins in our simulations, the root mean square deviation was

Discussion

An effect of the interaction between dextrins and triazole molecules on the growth of A. fumigatus was in the presence of cyclodextrins was observed in vitro.

The inhibitory effect was greatest for HP-β-CD, whereas maltodextrin had no effect. A lower biocidal activity in the presence of CDs than in the presence of the biocide alone has already been reported in several studies reviewed by Nardello-Rataj and Leclercq [62].

The authors reported an antagonistic effect of the formation of a complex between HP-β-CD and a series of p-hydroxybenzoic acid esters against Candida albicans: antimicrobial activity was lower in the presence of the CD, whereas solubility in water was higher and the concentration of free phydroxybenzoic acid esters was lower, with an increase in the binding constant, suggesting that the degree of inactivation depended entirely on the proportion of the biocide encapsulated. The authors also reported that biocides with a higher solubility in water (e.g. thimerosal and bronopol) displayed only slight inactivation, whereas lipophilic substances (e.g. phenolic residues) were strongly inactivated in the presence of HP-β-CD, in assays with various strains.

In details, with native cyclodextrins, fungal growth remained inhibited with α-CD sign that there is probably no interaction with fungicides, surely because its cavity is too small for the formation of complexes with these two triazole molecules. For γ-CD, a resumption of fungal growth was visible only with DIFENO, suggesting that the cavity of this molecule is too large and too flexible for the formation of a stable inclusion compound with TEBU but more appropriate for the inclusion of DIFENO.

Indeed, the binding energies obtained in the present work for DIFENO are larger than those obtained for TEBU. The effect on fungal growth was greatest in the presence of β-CD, resulting in an increase in MIC for 17/20 strains for DIFENO and 16/20 strains for TEBU. The β-CD cavity size was, therefore, considered optimal relative to the other native cyclodextrins. We infer from these results that a cyclodextrin/triazole interaction occurs, potentially through the formation of an inclusion complex in the hydrophobic cavities of the cyclodextrin molecules.

This mechanism would also explain the lack of effect of linear maltodextrin, which has no cavity. [69]. These authors examined the effect of TEBU within β-CD macromolecules in cultures of only one strain of A. fumigatus; they observed a toxic action not only of the free fungicide at a given dose, but also of the fungicide included in β-CD at the same dose.

We found that DIFENO and TEBU had clear fungicidal activity against 20 strains of A. fumigatus, but that this activity was weaker in the presence of β-CD, as shown by increases in both MICs (Table 3) and hyphal development, as observed under the microscope (Figure 4, comparison between reference medium and medium implemented with β-CD). However, the presence of β-CD molecules in the culture medium had a statistically significant effect on fungal growth.

J Environ Sci Public

These observations led us to test two β-CD derivatives, TRIMEB and HP-β-CD, both of which allowed a recovery of fungal growth. TRIMEB was less efficient than β-CD, but the hydroxypropyl groups grafted onto the glucose units in HP-β-CD seemed to promote interactions with TEBU and DIFENO (Table 3). Indeed, HP-β-CD had an effect on all strains, with both fungicides, resulting in a loss of antifungal efficacy against A. fumigatus. This effect was particularly marked with DIFENO, and this interaction was probably the most favorable theoretical "host-guest" interaction in this study.

Indeed, DIFENO has a higher electron density than TEBU and is more lipophilic (see log K OW values in Table 2), favoring its interaction with the hydrophobic cavities of CDs. The HP-β-CD-DIFENO system showed the highest binding energy value (-30.46 ±0.1

Kcal/mol) in molecular simulation in the open state, supporting the hypothesis of the formation of an inclusion complex between these two molecules. It results in the significant loss of antifungal efficiency observed, reflected in the higher MICs obtained (Table 3), together with the higher rates of spore germination and hyphal development (Figure 4). The interaction rendered the fungicides less effective, probably by blocking their active sites.

Conclusion

Triazoles are used for the treatment of foliar fungal diseases. Their presence in the soil is not required and has an undesirable side effect on A. fumigatus, * α-cyclodextrin (α-CD), β-cyclodextrin (β-CD), γ-cyclodextrin (γ-CD), hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD), difenoconazole (DIFENO), tebuconazole (TEBU). For all systems, the following equilibration protocol was applied. All simulations were performed using the Gromacs 5.1.2 MD package [1] with the AMBER14sb force field [2]. All systems were immersed into a cubic periodic box of approximately 14 nanometer (nm) side filled of TIP3P water molecules [3]. The cut-off distance for nonbonded interactions was set to 1.2 nm. All systems were first relaxed by steepest descent method at 5000step with an energy convergence criterion of 10 kJ/mol. . They were then heated from 0 K to 310 K for 100 picoseconds (ps) and equilibrated at 1 atmosphere (atm) with a relaxation time of 2 ps for 150 ps at the NPT ensemble. Pressure of 1 atm was maintained by the isotropic Parrinello-Rhaman barostat [4] using Langevin dynamics. Velocity rescale thermostat [5] was used at the temperature of 310 K. All bonds were constrained using the LINCS algorithm [6].

potentially

Résultats complémentaires de l'article :

Objectif

Metconazole Propiconazole Bromuconazole Epoxiconazole

Souche

β-CD HP-β-CD β-CD HP-β-CD β-CD HP-β-CD β-CD HP-β-CD 4E007 - x2 x2 x2 - - - x2 4E009 - x2 x2 x2 - x2 - x2 4E011 x2 x2 x2 x2 - - - x2 4E016 x2 x2 x2 x2 - - x2 x2 4E026 - x2 x2 x2 - - x2 x2 4E027 x2 x2 x2 x2 - - - x2
La présence de β-CD dans le milieu de culture inhibe l'action fongistatique du propiconazole • Le chanvre est un matériau susceptible de bloquer la diffusion des molécules triazolées dans les sols après leur application.

• Les capacités d'adsorption de ces supports de chanvre peuvent être améliorées par un « greffage » de cyclodextrines en surface.

• L'utilisation environnementale de ces matériaux de chanvre greffés peut diminuer la diffusion environnementale des triazolés et limiter la pression de sélection de ces molécules sur les espèces fongiques des sols.

Résumé en français :

Le difénoconazole est un fongicide triazolé largement utilisé en agriculture pour la protection de diverses cultures. La présente étude a évalué, par une technique en batch, la capacité de deux sols à adsorber le difénoconazole. Les modèles de Freundlich et de Henry (modèles d'isothermes d'adsorption) répondent bien aux données d'adsorption, ce qui suggère une adsorption multicouche du difénoconazole. Les indices d'ubiquité des eaux souterraines (GUS) sont compris entre 1,8 et 2,8, ce qui indique que le difénoconazole présente un risque modéré de contamination des ressources en eaux souterraines. L'adsorption, dans les expériences de percolation et de lixiviation a également été testée en laboratoire sur une colonne de sol. Nous avons effectué des tests sur des sols seuls, sur des sols recouverts de feutre de chanvre (brut ou modifié chimiquement par le greffage de molécules de cyclodextrines) comme matériau adsorbant pour limiter la dissipation de cette molécule dans le sol, et également sur les feutres seuls. Le sol seul a adsorbé jusqu'à 99% du difénoconazole, alors que le dépôt du feutre de chanvre modifié sur le sol a permis de limiter le stockage dans le sol à 26%, probablement en raison de la formation d'un complexe d'inclusion avec les cyclodextrines au sein du feutre. Le piégeage des molécules de difénoconazole par le feutre n'est pas irréversible, puisque le lavage de celui-ci avec une solution de CaCl2 a entraîné la libération de 60% de la quantité initialement fixée sur le chanvre brut. Cependant, seulement 22% de la quantité fixée sur le chanvre modifié a été libérée, en raison d'interactions potentiellement plus fortes avec ce matériau (interactions type hôte/invité entre le difénoconazole et cyclodextrine). Ces mêmes lavages, réalisés à l'eau, entraînent une lixiviation du difénoconazole nettement plus réduite qu'avec la solution de chlorure de calcium (conditions extrêmes). En conclusion, cette étude a montré que l'utilisation de matériaux innovants à base de chanvre pourrait permettre de limiter l'accumulation de fongicides dans les sols.

Eléments essentiels :

• Le difénoconazole est une molécule triazolée très utilisée dans l'environnement comme fongicide, induisant une forte pollution environnementale ;

• L'adsorption de ce composé dans les sols semble suivre le modèle théorique de Freundlich et être particulièrement influencée par la quantité de matière organique du sol ;

• Lors de la percolation d'une solution de difénoconazole à travers le sol, plus de 85% de la quantité introduite se fixe dans le sol, signe de sa forte affinité pour ce dernier et de son potentiel contaminant ;

• Le risque de pollution peut potentiellement également concerner les eaux souterraines, du fait d'une lixiviation, avec un indice GUS calculé jusqu'à 2,6 ;

• L'utilisation, en surface du sol, d'un matériau de chanvre greffé par des cyclodextrines permet de limiter l'adsorption du triazolé par le sol à 26%, le matériau piégeant une grande partie du difénoconazole ;

• Ces matériaux de chanvre présentent de bonnes capacités de rétention des triazolés permettant de limiter la pollution environnementale malgré un phénomène de désorption constaté.

Introduction

Azoles are very versatile fungicides widely used to control fungal infestations in crops. Triazole fungicides are commonly used in agricultural systems, such as market gardening, cereal crops, ornamental cultures and vineyards, commonly because they have a very broad spectrum of efficiency, against the main diseases of wheat, barley, rye, oat and triticale, for example. Indeed, triazole fungicides are essential to ensure global food security, and their use is forecasted to intensify. In Europe, triazole-based formulations are the most widely used plant protection products (on grains, cereals, fruits and vegetables), due to their protective and curative actions (Zubrod et al., 2019;[START_REF] Jorgensen | Four azoles' profile in the control of septoria, yellow rust and brown rust in wheat across Europe[END_REF].

In France, various triazoles are available. Difenoconazole, the second molecule of this family to be released on the market, is widely used as a broad-spectrum environmental fungicide, particularly since the withdrawal of epoxiconazole and propiconazole (Chowdhary and Meis, 2018;European Crop Protection, 2016). The dissipation of this type of fungicide in treated fruits, for example, seems inevitable, as does contamination of the soil, water (including drinking water) and other environmental compartments, as suggested by [START_REF] Agnihotri | Organochlorine insecticide residues in Ganga river water near Farrukhabad, India[END_REF], who reported that 70% of the pesticide applied inevitably reaches the soil during the spraying process, or by El [START_REF] Azhari | The dissipation and microbial ecotoxicity of tebuconazole and its transformation products in soil under standard laboratory and simulated winter conditions[END_REF], who reported that pesticides enter the soil with precipitation, reaching aquatic ecosystems. Due to their particular physicochemical properties, such as lipophilicity and stability (e.g. against hydrolytic degradation), fungicides have a moderate-to-high potential to interact with organic carbon and may, therefore, also be adsorbed by sediments. [START_REF] Elfikrie | Occurrence of pesticides in surface water, pesticides removal efficiency in drinking water treatment plant and potential health risk to consumers in tengi river basin, Malaysia[END_REF] found pesticides in the Tengi river basin in Malaysia, the highest mean concentration (4493.1 ng g -1 ) being recorded for propiconazole. Fungicides have also been identified in foods. Difenoconazole and propiconazole residue levels in wheat grain have been found to be below 0.01 mg kg -1 , in China, suggesting that the use of these two pesticides can be considered safe in conditions of good agricultural practice in Chinese fields [START_REF] Zhang | Residues and dissipation kinetics of triazole fungicides difenoconazole and propiconazole in wheat and soil in Chinese fields[END_REF]. By contrast, levels of difenoconazole residues in peaches, which are widely grown around the world, range from 0.054 to 0.11 mg kg -1 [START_REF] Dong | Dissipation rates and residue levels of diflubenzuron and difenoconazole on peaches and dietary risk assessment[END_REF]. For the highest values in this range, the possibility of a risk to human health of consuming peaches cannot be excluded. Difenoconazole residues are also found in soils, chilli peppers, tomatoes and lettuces for example, posing potential risks to human health (Mukhopadhyay et al., 2011;[START_REF] Elgueta | Pesticide residues and health risk assessment in Tomatoes and Lettuces from farms of metropolitan region Chile[END_REF].

With regard to health, [START_REF] Pereira | Sperm quality of rats exposed to difenoconazole using classical parameters and surface-enhanced Raman scattering: classification performance by machine learning methods[END_REF] evaluated the sperm quality of rats exposed to difenoconazole. Sperm number in the testis and the caput/corpus of the epididymis, daily sperm production, progressive motility, acrosomal integrity, and percentage of morphologically normal spermatozoa were all lower in rats exposed to difenoconazole than in unexposed rats.

The intensive use of triazole fungicides, such as difenoconazole, has also created a problem of resistance in fungal pathogens of plants. Brazil is one of the largest producers of papaya worldwide. Stem-end rot, caused by Lasiodiplodia theobromae, is one of the most important diseases of papaya. It can be controlled effectively with demethylation inhibitor (DMI) fungicides, but the occurrence of DMI resistance decreases fungicide efficiency. Difenoconazole has been one of the most widely used DMIs in papaya orchards since the start of the 2000s. [START_REF] Li | Characterization of difenoconazole resistance in Lasiodiplodia theobromae from papaya in Brazil[END_REF] reported that the most tolerant isolates of this pathogen have a resistance factor for difenoconazole 240 times that of the most sensitive isolates, necessitating the implementation of resistance management strategies. Rotations and the use of mixtures of fungicides with different modes of action has frequently been used to manage fungicide resistance in many crop systems. However, the use of these phytosanitary agents has also resulted in resistance phenomena in fungi other than plant pathogens. Indeed, triazoles are also used as antifungal agents in human medicine, to treat serious fungal infections caused by Aspergillus fumigatus, in particular, a microscopic fungus ubiquitous in the environment and capable of causing respiratory disease. The triazole fungicides used in agriculture to protect cereals, vegetables, grapevines and horticultural crops can accumulate in the soil, with ecotoxicological effects on soil microbial communities, leading to the unintentional and undesirable selection of resistant A. fumigatus populations (Rocchi et al., 2018).

Various strategies can be adopted to limit the diffusion and accumulation of triazoles in soils. When used as a soil amendment, biochar (a form of charcoal) enhances plant growth and soil fertility and can sequester contaminants. [START_REF] Cheng | Effect of biochar on the bioavailibility of difenoconazole and microbial community composition in a pesticide-contaminated soil[END_REF] studied the effect of biochar on difenoconazole bioavailability and the composition of the microbial community in contaminated soils. They demonstrated that soil applications of biochar significantly decreased the bioavailability of difenoconazole to plant and soil microbial communities, and minimized the amounts of difenoconazole residues in agricultural produce. More recently, [START_REF] Wang | Adsorption behavior and mechanism of five pesticides on microplastics from agricultural polyethylene films[END_REF] reported the adsorption of difenoconazole onto agricultural polyethylene film used in the dryland cultivation of vegetables and other crops for its ability to store water and enhance moisture levels, thereby increasing crop yield. The authors suggested that strong hydrophobic interactions between the polyethylene film and difenoconazole molecules could account for their findings.

In a previous work, an innovative hemp-based material in the felt form was used as an efficient filter for the removal of triazole fungicides by a batch technique. Adsorption results showed its good ability to retain fungicides [START_REF] Lechenault-Bergerot | Hemp to limit diffusion of difenoconazole in vegetable garden soils[END_REF]. Here we studied two agricultural plots in the Franche-Comté region dedicated to cereal crops, for which treatment with difenoconazole-based formulations was envisaged. It was, therefore, essential to have prior knowledge of how the molecule was likely to behave in these soils. Thus firstly, the physicochemical properties of the soils, which are known to regulate the processes involved in the dissipation of pesticides, were determined. Secondly, the difenoconazole adsorption onto soils and its desorption process were studied using two methods: a batch technique and a percolation method, in the absence or presence of a hemp felt used as a barrier against the penetration of difenoconazole in soil. In the batch method, the fungicide and the soil remained in constant contact for a fixed period of time, whereas, in the percolation method, the fungicide infiltrates the soil. The percolation method more closely resembles the real-life situation in the field (spraying of the treatment solution, gradual penetration into the soil). Hemp is already used in horticulture and agriculture, as a mulch to prevent weed growth and to retain soil moisture. In this study, we investigate the development and application of an innovative product, i.e. hemp felt, for environmental benefits, in order to retain pesticides, and thus to control their accumulation in the soil. This could indirectly reduce the risks of bioavailability and toxicity soil fauna, or underground water contamination. Two hemp-based materials were used, namely a felt made of 100% hemp fiber, and a felt of the same composition coated with cross-linked cyclodextrin-1,2,3,4-butanetetracarboxylic polymer, to provide inclusion properties. Indeed, cyclodextrins, biosynthetic molecules derived from starch, have the remarkable ability of forming host-guest interactions with organic substances in solution or in the solid state. To our knowledge, this is the first report of fungicide removal with a modified hemp-based material in felt form.

Difenoconazole solution

A stock solution of difenoconazole in methanol (Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) was prepared at a concentration of 100 mg L -1 . Aqueous solutions in 0.01 M CaCl 2 (ProLabo, Paris, France) were prepared by diluting the stock solution to concentrations between 1 and 15 mg L -1 .

Soil characterization

Soil samples were collected from two agricultural plots (Douce Terre (DTP) and Champ Marie (CMP), GAEC du bas des Champs, Brussey, France) of a cereal farm likely to use triazole fungicides to protect its wheat and rapeseed crops (10 points per plot, approximately every 15 or 20 m, 2 to 3 kg of soil per point), freeze-dried and ground to 2 mm before use. Quantification revealed an absence of triazoles, except for trace amounts of tebuconazole (mean concentrations of 8.65 and 9.91 and ng g -1 for DTP and CPM, respectively).

The mixture of the 10 samples from each plot formed a composite soil sample, which was then used for the determination of total element concentrations by inductively coupled plasma atomic emission spectrometry (ICP-AES, Thermo Fischer Scientific, iCAP 6500 radial model, Courtaboeuf, France). The protocol was as follows: 500 mg of sample was mineralized with a mixture of 2 mL of 65% nitric acid and 5 mL of 37% hydrochloric acid in closed tubes placed in a block digestion system (DigiPREP system, SCP Sciences, Courtaboeuf, France). The sample was gradually heated to a final temperature of 100 • C. Then, ultrapure water (Millipore Milli-Q Integral 3 system, Molsheim, France) was added to a final volume of 50 mL. Finally, the solution was passed through a filter with 1 µm pores before analysis. The organic matter (OM) content of the composite soil samples was estimated by comparing mass before and after the calcination of 10 g of dried soil at 550 • C for 4 h. The pH was also measured with a WTW R ⃝ -pH meter, after shaking 10 mL of dry soil in 50 mL of reverse osmosis (RO) water (1:5 suspension, v:v) for 20 min and then allowing the suspension to rest overnight. Granulometric analyses were performed with a LS 230 laser diffraction particle size analyzer (Beckman Coulter, Villepinte, France). The physicochemical properties and metal contents of the composite soils are summarized in Table 1. A preliminary detailed ICP analysis showed that concentrations were similar for the two soils. The main elements present were Al, Fe, Ca, K and Mg.

Hemp material

Hemp was kindly provided by Eurochanvre, a hemp processing company in Franche-Comté (Arc-les-Gray, Haute-Saône, France). The raw hemp (RH) consisted of a felt made of 100% hemp fiber. It had the following characteristics: thickness of 5 mm, fibers composed of 65% cellulose, 20% hemicellulose, 8% lignin, 5% pectin, and 2% impurities. Before use or chemical modification, this material was thoroughly washed in RO water and dried at 60 • C until a constant weight was reached (chemical analysis: 41.4% C, 0.28% N, and 0.06% S) (Loiacono et al., 2017a).

Modified hemp felt with inclusion properties was synthetized by introducing molecules of hydroxypropyl-βcyclodextrin (HPβCD, Roquette, Lestrem, France) through a cross-linking reaction with 1,2,3,4-butanetetracarboxylic acid (BTCA). The method used to produce a hemp felt coated with hydroxypropyl-β-cyclodextrin-1,2,3,4-butanetetracarboxylic cross-linked polymer (modified hemp, MH) and its chemical and spectroscopic characterization have been described in detail elsewhere (Loiacono et al., 2017b[START_REF] Loiacono | Metals in aqueous solutions and real effluents: biosorption behavior of a hemp-based felt[END_REF]. Briefly, the RH sample was impregnated and roll-squeezed in a roll padder, in an aqueous solution containing sodium hypophosphite as a catalyst, BTCA as the crosslinking agent, and HPβCD. A crosslinking reaction based on esterification (Fig. 1) occurred during the synthesis, such that the carboxyl groups of BTCA, the hydroxyl groups of HPβCD hydroxyl and the cellulose hydroxyl groups of the hemp fibers (in the RH) were cross-linked. This resulted in a cross-linked polysaccharide network containing cyclodextrin molecules and carboxyl groups. We used a modified hemp felt (MH) with a coating rate of 35 ± 5%, assessed on the basis of the weight gain of the sample (elemental analysis: 51.3% C, 0.27% N, and 0.05% S). RH and MH disks of 2.5 cm in diameter were used in the adsorption experiments. These disks had a mass of 0.277 ± 0.069 g for RH and 0.408 ± 0.042 g for MH.

Adsorption test

The experiments were conducted with two adsorption-oriented methods: a batch method and a percolation technique. The first set of experiments was performed with a batch method, in which the kinetic and adsorption isotherms of the soils were determined. In each experiment, 10.000 ± 0.001 g of each soil was added to 50 mL of aqueous difenoconazole solution in 0.01 M CaCl 2 in a tightly closed amber glass flask, and the mixture was stirred with a magnetic stirrer. The experiments were conducted at 25 ± 1 • C, in triplicate (repeatability was checked; relative standard deviation below 20%).

The soil was allowed to sediment out and the supernatant was collected, centrifuged for 10 min at 2800 g and subjected to extraction and chromatographic analyses. For kinetic experiments, two concentrations were tested: 1 and 15 mg L -1 (the first being a commonly used per-hectare rate, and the second being an extreme rate), for various times, ranging from 15 to 480 min, to determine equilibrium. For adsorption isotherms, the effect of difenoconazole concentration was tested for various doses (1, 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5 and 15 mg L -1 ) and a contact time of 2 h (this time is sufficient to reach equilibrium).

For the percolation procedure (Scheme 2), we used a glass column with an internal diameter of 2.5 cm and a height of 22 cm, with a Teflon tap, which was filled from bottom to top with the following materials: first a piece of glass wool, then glass beads to one third of the total height of the column and finally either in the first case the dried soil (10.000 ± 0.001 g), whether or not surmounted by hemp felt disks, or in the second case one or two hemp felt disks only (without soil). Fifty milliliters of aqueous difenoconazole solution at a concentration of 1 or 15 mg L -1 in 0.01 M CaCl 2 were introduced dropwise via a glass burette (percolation time = 2 h). Control experiments (without soil and hemp felt) were also carried out in the same conditions, to check that the device itself did not adsorb the fungicide.

Difenoconazole removal is expressed as the percentage abatement, defined as the ratio of the amount of pollutant absorbed to the initial amount of pollutant (C 0 ). Experiments were performed in triplicate.

C. Godeau, N. Morin-Crini, J.-N. Staelens et al. Environmental Technology & Innovation 22 (2021) 1013942.5. Desorption test Desorption was studied by percolation, with hemp felt disks or soils alone and with the combination of hemp felt disks and soil after the adsorption study. Fifty milliliters of 0.01 M CaCl 2 , without difenoconazole, dropwise, was added to the wet hemp, soil or hemp/soil combination (lixiviation time = 2 h). This procedure was carried out once, or three times. Experiments were performed in triplicate. Difenoconazole desorption is expressed as a percentage of the previously adsorbed pesticide.

Extraction in aqueous solution

An aliquot of 10 mL of aqueous difenoconazole solution (initial solutions and solutions obtained in adsorption or desorption tests) was transferred into a 250 mL closed amber glass flask and 20 mL acetonitrile was added (Acetonitrile Distol R ⃝ , Fisher Scientific, Illkirch, France). The solutions were stirred with a magnetic stirrer for 10 min. Then, 3 g sodium chloride (purity: 99.5%) was added (Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) and the agitation was maintained for 10 min again. The organic supernatant layers were recovered with a separating funnel and transferred to a volumetric flask, for adjustment of the final volume to 25 mL. Volumes of 475 µL were collected and transferred to a vial syringeless filter (Mini-Uniprep 12 × 32 PTFE 0.45 µm silicone/PTFE clear housing, Interchim, Montluçon, France) containing 25 µL of deuterated internal standard, tebuconazole d 6 , at a concentration of 2 mg L -1 (Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France).

Analysis

Sample extracts were analyzed with a GC-MS/MS apparatus (Agilent, Massy, France), consisting of a 7890A GC system, a 7000 GC triple quadrupole mass spectrometer, and an 80 GC CombiPAL autosampler. One microliter of the extract was injected at a temperature of 300 • C, in splitless mode, under a constant flow of He (purity 99.9999%) at 1.5 mL min -1 , followed by a purge flow to split vent after 0.5 min. We used a (5% phenyl)-methylpolysiloxane HP5MS column (30 m×0.25 mm I.D., 0.25 µm film thickness, Agilent 19091J-433). The total run time was 42.27 min. The temperatures of the transfer line, ion source and quadrupoles were 300, 300, and 150 • C, respectively. An electron-impact ion source at 70 eV was required. Nitrogen, with a purity of 99.9%, was produced with a NiGenLC-MS40-1Claind generator (Gengaz, Wasquehal, France) and used as the collision gas, at a flow rate of 1.5 mL min -1 . The optimized mass parameters in multiple reaction monitoring mode were previously described by [START_REF] Crini | Simultaneous removal of five triazole fungicides from synthetic solutions on activated carbons and cyclodextrin-based adsorbents[END_REF].

Modeling

Difenoconazole adsorption data were analyzed with Henry, Freundlich and Langmuir models [START_REF] Romita | Operational parameters affecting the atrazine removal from water by using cyclodextrin based polymers as efficient adsorbents for cleaner technologies[END_REF]. The linear Henry equation is described by Eq. ( 1) (Conde-Cid et al., 2019):

q e = K D C e (1)
where q e (µg g -1 ) is the amount of difenoconazole retained by the soil, C e (µg L -1 ) is the difenoconazole equilibrium concentration and K D (L g -1 ) is the coefficient of distribution.

The Freundlich isotherm equation (Eq. ( 2)) can be log-linearized, as reported in Eq. ( 3):

q e = K F C 1/n e ( 2
)
log q e = log K F +

1 n log C e ( 3
)
where K F [(µg g -1 )(L µg -1 ) 1/n ] is the Freundlich adsorption equilibrium constant representing the adsorption capacity constant. The n parameter is also a constant, representing adsorption intensity: n < 1 means that the process is unfavored, at n = 1 it is linear and at n > 1 it is favored.

The Langmuir adsorption theory is described by the following equation (Eq. ( 4)), which can be linearized (Eq. ( 5)):

q e = qmK L C e 1 + K L C e ( 4
)

C e q e = 1 q m C e + 1 q m K L ( 5
)
where K L (L µg -1 ) is the Langmuir equilibrium constant related to the adsorption energy and q m is the maximum amount adsorbed per unit mass of adsorbent.

The soil organic carbon-adsorption coefficient K OC , used to control the adsorption capacity of the soil, was determined from the K D values, with Eq. ( 6) [START_REF] Mosquera-Vivas | Adsorption-desorption and hysteresis phenomenon of tebuconazole in Colombian agricultural soils: Experimental assays and mathematical approaches[END_REF]: where the units of K D and K OC are L g -1 . Higher K OC values indicate stronger adsorption of the pesticide and, thus, lower levels of pesticide mobility.

K OC = K D .100 %OM (6)
The GUS index developed by [START_REF] Gustafson | Groundwater ubiquity score: A simple method for assessing pesticide leachability[END_REF][START_REF] Gustafson | Groundwater ubiquity score: A simple method for assessing pesticide leachability[END_REF] was also calculated, as an empirical model based on the persistence of pesticides (half-life DT 50 or t 1/2 ) and K OC . The relationship between these two parameters is as follows (Eq. ( 7)):

GUS index = log(t 1/2 )x[4 -log(K OC )] (7)
where K OC is expressed in mL g -1 and t 1/2 in days.

The potential for movement toward groundwater was classified on the basis of GUS index, as follows: extremely low below 0, low between 0 and 1.8, moderate in the range 1.8-2.8 and high above 2.8.

Results and discussion

Kinetics of soil adsorption in batch experiments

Fig. 2 shows the removal of difenoconazole adsorbed in both Douce Terre (DTP) and Champ Marie (CMP) soils against contact time (t) for concentrations of 1 and 15 mg L -1 . Whatever the soil or fungicide concentration, the kinetic results indicated that adsorption was very fast, indeed, it was almost instantaneous (t < 0.5 h). Similar results were published by [START_REF] Paszko | Modeling the effect of adsorption on the degradation rate of propiconazole in profiles of Polish Luvisols[END_REF], who modeled the effect of propiconazole adsorption in Polish luvisol profiles and by [START_REF] Siek | Factors affecting coupled degradation and time-dependent sorption processes of tebuconazole in mineral soil profiles[END_REF], who assessed tebuconazole adsorption in mineral soil profiles. In less than two hours, the amount of fungicide adsorbed attended to a constant value, with no more fungicide retained by the soil (abatement > 80%), indicating strong interactions between difenoconazole molecules and binding sites in the soil. The number of binding sites for difenoconazole in the soil was not a limiting factor for adsorption, because the percentage removal was highest for the highest difenoconazole concentration (means of 84% (DTP) and 79% (CMP), versus 86% (DTP) and 81% (CMP), for 1 and 15 mg L -1 , respectively). Abatement was always slightly higher in the DTP soil than in the CMP soil, probably due to the slightly higher organic matter content of the DTP soil, as pointed out by [START_REF] Arias-Estévez | The mobility and degradation of pesticides in soils and the pollution of groundwater resources[END_REF] and by [START_REF] Lechenault-Bergerot | Hemp to limit diffusion of difenoconazole in vegetable garden soils[END_REF].

Adsorption isotherms in batch experiments

Difenoconazole adsorption data were analyzed with Henry, Freundlich and Langmuir models [START_REF] Romita | Operational parameters affecting the atrazine removal from water by using cyclodextrin based polymers as efficient adsorbents for cleaner technologies[END_REF]. The Langmuir model was not suitable for either soil ( Ce qe was not a linear function of C e ,r 2 < 0.76), indicating that a monolayer adsorption model was not realistic. Other adsorption parameters, from Henry and Freundlich models, are presented in Table 2. The K D values obtained with the linear Henry model were of the same order of magnitude as those reported by [START_REF] Mosquera-Vivas | Adsorption-desorption and hysteresis phenomenon of tebuconazole in Colombian agricultural soils: Experimental assays and mathematical approaches[END_REF] for the adsorption of tebuconazole on Colombian agricultural soils. Determination coefficients (r 2 ) were good, especially for the Freundlich model, reflecting a favorable multi-layer adsorption of difenoconazole. This result suggests that π-π interactions occur between the aromatic rings of several molecules of difenoconazole. The K D C. Godeau, N. Morin-Crini, J.-N. Staelens et al. Environmental Technology & Innovation 22 (2021) 101394

Table 2

Comparison of distribution coefficient (Henry model, K D ), Freundlich isotherm parameters (K F , n), K OC values and GUS index (mean values, n = 3) for Douce Terre (DTP) and Champ Marie (CMP) soils (r 2 = determination coefficient). a Expressed in (µg g -1 )(L µg -1 ) 1/n . and K F values were higher for the DTP soil than for the CMP soil. This order is consistent with the findings of [START_REF] Hammi | Effect of peat addition on sorption and leaching of triazole fungicides in oran, soils[END_REF], who observed that the clay fraction present in the soils studied was irrelevant to pentaconazole adsorption (in our case, 7.73% versus 10.66% for DTP and CMP, respectively, Table 1), and highlighted the predominant role of organic matter (OM) (in our case, 3.86% versus 3.51% for DTP and CMP, respectively, Table 1). The DTP soil had a K OC value (Eq. ( 6)) 1.4 times higher than that of the CMP soil. Difenoconazole was therefore less mobile in the DTP soil. We checked that this was, indeed, the case, by calculating the GUS index (Eq. ( 7)). The reported half-life of triazoles in the soil differs between studies. For example, [START_REF] Wu | Simultaneous determination and method validation of difenoconazole, propiconazole and pyraclostrobin in pepper and soil by LC-MS/MS in field trial samples from three provinces, china[END_REF] reported values of 6.8 to 32.5 days, whereas Guo et al. (2010) reported values of 9.6 to 68.4 days, and values as high as 1600 days have been proposed in some marketing reports. Taking the half-life of difenoconazole as 315 days, as reported by the European Food Safety Authority ( 2011), DTP and CMP can both be considered to be soils associated with a moderate risk of difenoconazole leaching into groundwater (GUS index <2.8, Table 2). [START_REF] Maznah | Evaluating hexaconazole leaching in laboratory and field experiments: Effects of application rate, soil type, and simulated rainfall[END_REF] study reported a higher GUS index (4.61) for hexaconazole, classified as a leacher, for cultivated soil under Malaysian tropical conditions and referred to other studies reporting that the triazole groups of propiconazole, triticonazole and penconazole gave rise to GUS index values of 2.04, 3.08 and 3.50, respectively.

K D (L g -1 ) r 2 K F a n r 2 K OC (mL g -

Percolation experiments

Firstly, the adsorption of difenoconazole on soils alone and on a single piece of hemp felt alone was studied (RH or MH). The experiments were conducted at two difenoconazole concentrations (1 and 15 mg L -1 ), for a percolation time of 2 h, similar to the batch time used. The results are reported in Fig. 3. For soils, percolation gave slightly better abatements than the batch method (83%-93% versus 81%-86% for the batch method). However, the DTP and CMP soils yielded different patterns of results for the percolation and batch experiments. Indeed, for percolation, whatever the concentration of difenoconazole, the CMP soil retained more fungicide than the DTP soil, probably due to the greater draining power of sand, the proportion of which was higher in the DTP soil (Table 1). The use of a higher concentration of fungicide did not limit the adsorption of difenoconazole to soils in experiments performed by the batch method, but such limitation did appear to occur in percolation experiments. This finding can be explained by a lack of prolonged contact of the soil binding sites with the difenoconazole molecules, which pass through the soil rapidly (absence of continuous exchange during the entire flow). For hemp felts, regardless of the nature of the material (raw or modified), adsorption capacity decreased with increasing difenoconazole concentration, but abatement was higher with MH than with RH felt (39% versus 25%, mean values for the two concentrations tested). The modified material was, therefore, able to retain more difenoconazole molecules, suggesting that difenoconazole/HPβCD inclusion complexes may have formed in this material [START_REF] Crini | Simultaneous removal of five triazole fungicides from synthetic solutions on activated carbons and cyclodextrin-based adsorbents[END_REF].

Secondly, the adsorption of difenoconazole on two pieces of hemp felt and combinations of two piece of hemp felt plus soil, was studied at a difenoconazole concentration of 1 mg L -1 , for a percolation time of 2 h, to compare the results with those of the previous experiment with only one hemp disk. The results are reported in Table 3. The superimposition of two RH disks increased difenoconazole elimination by +21% relative to a single disk, and significantly higher levels of elimination (+72%) were achieved with two disks of modified hemp. In the soil systems topped with 2 hemp disks, in which all the difenoconazole was retained (abatement of ∼ 100%), one third of the total amount eliminated was stored in the raw hemp, whereas the modified hemp trapped more than two thirds. This finding further demonstrates the potential of modified hemp for eliminating difenoconazole through the formation of host-guest interactions via cyclodextrins grafted onto the hemp.

Leaching experiments

Fig. 4 shows the percentage difenoconazole desorbed from soils (1 wash) and one piece of hemp felt (1 or 3 washes) for samples previously used in adsorption experiments. The total amount of difenoconazole desorbed depended on the amount previously added. For soils, the percentage desorption was low, and the values obtained were consistent with those reported by Conde-Cid et al. (2019) for propiconazole desorption on 10 acid sandy-loam soils with different organic matter contents. Desorption increased with the amount of difenoconazole initially fixed (1%-3% versus 9%-12% for C 0 initial solutions of difenoconazole at concentrations of 1 and 15 mg L -1 respectively). For RH and MH felts, the opposite phenomenon was observed. However, whatever the initial concentration of fungicide and the type of felt, most of the fixed difenoconazole was removed in the first wash (61 to 75% of the total value for the three successive washes). The first wash with 0.01M CaCl 2 , following the percolation of a 1 mg L -1 difenoconazole solution, removed just under 60% of the amount fixed on one piece of RH felt, and just over 60% of the amount fixed on one piece of MH felt (Fig. 4), but similar leaching experiments on two pieces of hemp felt gave more contrasting results: again, about 60% was removed from the RH felt, but only 22% was removed from the MH felt (results not shown). This finding indicates that the interactions between difenoconazole and hemp felt were stronger for MH than for RH, due to the presence of cyclodextrin molecules (formation of more stable inclusion complexes with 2 pieces of MH than with one piece of this material). Washing one hemp disk with RO water (simulating rainwater) rather than CaCl 2 solution reduced fungicide leaching by a factor of 2 for RH and 4 for MH. This can be explained by the difference in ionic strength of the washing solution used, again revealing the high stability of the difenoconazole-CD complexes formed on MH, whereas the interactions established between difenoconazole and RH were weaker.

The leaching of the fungicide in 0.01M CaCl 2 from combinations of two pieces of hemp felt plus soil previously exposed to the percolation of a 1 mg L -1 difenoconazole solution was extremely low (range: 0.24 to 3.31%, results not shown). Together, all these results suggest that, under the action of leaching, the difenoconazole molecules trapped on the hemp felt (the first compartment to be crossed) were able to migrate into the soil and remained strongly bound to it.

Conclusions

We describe here the adsorption of difenoconazole to two soils from a cereal farm. In the batch method, fungicide retention, which was consistent with the Freundlich model, was dependent on the amount of organic matter, with larger amounts of organic carbon in the soil associated with higher rates of adsorption. In the percolation procedure, adsorption decreased with increasing sand content in the soil. However, due to the high retention capacity of difenoconazole in both soils (maximum observed in this study: 677 µg of 750 µg, adsorbed by 10 g of the dried soil for CMP in the percolation method), we considered, for the first time, covering the soil with a natural felt with proven adsorbent properties, to prevent the migration into the soil of difenoconazole molecules sprayed on the plants for antifungal treatment. In a hemp plus soil system exposed to the percolation of a 1 mg L -1 difenoconazole solution, the best results were obtained with a double thickness of modified hemp felt on top of the soil: only 13 µg of the 50 µg of difenoconazole applied was stored in the soil, versus 49.5 µg in the absence of felt. This material was, thus, considered effective, as it retained 37 µg of difenoconazole, limiting the diffusion of this molecule deep into the soil by trapping it on the felt through the formation of inclusion complexes with the cyclodextrins grafted onto the material. This limiting of difenoconazole residues in soils should have the benefit of limiting the indirect effect of triazole fungicides on soil fungi and, thus, the development of resistance. However, as the desorption of difenoconazole adsorbed onto these materials was not null (the lowest levels of leaching from modified hemp were achieved with RO water), it would be appropriate, in field conditions, to deploy the adsorbent material on the soil during crop spraying to trap excess fungicide, and then to remove it, before the next rainfall. C. Godeau, N. Morin-Crini, J.-N. Staelens et al. Environmental Technology & Innovation 22 (2021) 101394Zhang, Z.Y., Jiang, W., Jian, Q., Song, W.C., Zheng, Z.T., Wang, D.L., Liu, X.J., 2015. Residues and dissipation kinetics of triazole fungicides difenoconazole and propiconazole in wheat and soil in Chinese fields. Food Chem. 168, 396-403. http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2014.07.087. Zubrod, J.P., Bundschuh, M., Arts, G., Bruhl, C.A., Imfeld, G., Knabel, A., Payraudeau, S., Rasmussen, J.J., Rohr, J., Scharmuller, A., Smalling, K., Stehle, S., Schulz, R., Schafer, R.B., 2019. Fungicides: An overlooked pesticide class? Environ. Sci. Technol. 53, 3347-3365. http://dx.doi.org/10.1021/acs.est. 8b04392.

CRediT authorship contribution statement

151 5. Travaux en lien avec la thèse D'autres travaux auxquels j'ai largement participé, en lien direct avec les problématiques présentées dans ce travail, ont été effectués et sont présentés ci-après.

Titre du chapitre :

Emergence of a pathogenic fungus resistant to triazole antifungal drugs.

Présentation succincte :

Dans cette revue, la problématique de la résistance aux triazolées chez A. fumigatus est discutée.

Un état des lieux des connaissances concernant l'évolution de cette résistance tant sur le plan clinique qu'environnemental est présenté. Les paramètres qui influencent ce phénomène au niveau environnemental sont mis en avant et décrits comme des « hotspot » de la résistance. 012 3 567 89 6 97 7 9 7 7 7 7 9 7 7 8 ! 0 " # $ % 7 " 7 " &'() *+ ,*-./,0 1'+ ,1,0 2 -3/4 5 -6 7 87 %678 9 : 9 ; 7 < 12 4 52 9 48 9 8 2 4 4 567 48 4 5 9 2 9 9 4 8 4 4 9 4 4 4 77 2 9 7 89 :;; < => #"$?@> A "= B34 6 7 4 7 48 9 8 2 4 2 7 9 79 48 7 4 6 2 9 2 7 2 9 9 79 8 7 4 8 9 42 9 78 7 9 8 8 2 4 9 9 8 48 9 6 8 9 2 48 C48 9 8 2 4 7 2 2 8 4 D 7 9 8 8 4 7 2 9 9 79 8 48 2 7 48 9 8 2 4 B34 78 2 4 E7 8 4 9 8 2 4 9 48 9 8 2 4 34 4 2 34 9 8 8 4 7 2 9 9 72 9 8 9 9 3 34 2 3 38 4 2 7 2 9 48 9 8 2 2 3 G 9 8 2 9 7 6 7 8 52 9 9 79 48 9 8 2 4 2 3 42 48 2 34 34 2 7 74 49 9 4 2 34 7 2 4 8 8 2 9 9 9 2 7 4 42 9 4 7 6 9 34 2 3 48 678 4 2 7 2 34 78 2 2 2 3 42 7 9 42 9 78 9 8 48 48 B34 M7 N4 2 3 G 9 62 9 7 762 4 7 6 7 2 9 7 9 8 2 2 9 9 79 48 9 8 2 4 2 7 9 2 9 2 34 69 2 2 7 2 42 6 4 42 9 42 9 78 9 8 48 48 8 7 8 678 8 9 4 2 3 73 4 42 9 4 8 48 678 9 8 4 48 8 9 4 2 7 2 378 4 37 44 2 34 B34 O 7 52 9 9 79 C48 9 8 2 4 P 49 4 P8 2 4 Q OR5PPS 8 34 9 HI0T 2 34 M7 N4 2 3 G 9 62 9 7 2 7 8 667 2 8 2 9 64 66 73 2 7 7 2 9 9 79 48 9 8 2 4 2 7 42 9 7 8 9 8 467 2 9 2 7 8 667 2 49 8 9 7 E9 72 9 2 4 7 2 9 7 49 7 2 9 78 6 79 4 2 34 49 44 8 4 7 2 9 7 7 Q B7 9 44 42 J HI0US 52 9 9 72 9 48 9 8 2 4 9 8 7 479 64 8 6 9 34 2 3 9 8 8 4 9 2 3 7 42 4 9 6 442 4 2 9 78 8 49 4D 6 442 9 7 6 7 8 9 42 9 48 8 3 8 6 739 9 2 9 2 34 8 4 7 4 2 9 2 9 9 72 9 8 8 9 2 9 48 9 44 9 8 2 8 G 2 34 72 7 HIJ 4 8 44 9 2 9 48 9 8 2 4 38 44 78 4 4 2 49 8 4 42 4 9 2 34 74 2 9 9 79 48 9 8 2 4 72 42 B3 44 9 7 74 4 4 3744 42 9 74 9 2 34 467 2 7 2 34 8 47 O 7 52 9 9 79 C48 9 8 2 4 P 49 4 P8 2 4 442 8 9 ^9 2 78 8 9 8 48 678 9 4 7 9 4 8 642 7 6 7 62 37 79 48 9 7 3 79 7 9 7 4 9 7 8 2 7 8 44 4 9 8 9 8 8 98 8 7 9 8 7 8 7 8 ! 8 7 8 9 8 98 75 8 8 8 8 7 7 8 9 78 9 8 7 " 7 79 8 8 7 7 8 9 8 7 8 7 98 5 7 8 78 7 8 7 8 98 8 7 9 7 7 8 7 8 79 8 7 8 7 7 7 5 8 ! 9 7 7 8 8 8 9 9 8 8 8 97! 7 8 97! 5 , 8 ! 8 7 78 78 98 8 9 8 7 8 7 78 77 9 9 8 7 8 40 8 9 5 -7 8 7 7 8 7 8 8 9 9 7 78 97 9 8 9 8 7 9 8 5 7 8 8 7 8 8 8 9 8 7 8 8 7 8 7 9 8 79 7 8 7 8 79 8 7 8 8 7 7 8 " 7 7 7 8 75 8 7 78 8 7 7 8 7 7 8 7 ; . -7 7 8 7 598 <7 = 678 9 -5<6 / 78 ! 5 0 5 12024 7 798 8 ;7 8 7 7 8 8 9 8 8 79 8 7 4 8 4 4 5 9 : 345 8 345 3 : 3 4 9 5 5 34 9 4 4 5 9 3" 4 54 ;5 4 +, -. /01 234 /5 $%&'0( 4< 9 3 3" 3 4 ;34 3 4 34 3 9 5 45 * 4 9 3 < 4 4 5 9 5 3 ;5 4 3 8 : # 0 = 3 3 5 34 5 > 3 45 9 343 9 9 4 8 5 ;3 4 9 3 " 9 >3 : 345 9 34 9 3 5 9 3 9 34 3 345 9 49 4 3! 34? 3 4 3 3 3 3 5 34 4 9 34 9 3" 4 9 4 5 5? 3 4 3 3" 4 9 3 3 3 4 4 9 8 3 4 3 4 4 3 4 9 44 3 4: 3 3" 4 9 45 4 345 34 3 4 345 34 9 4 4 5 5 3 3 5 27 3 9 9 5 37 8 34 5 639 59 8 9 9 9 3 34 7 7 9 9 89 7 7 5 4 0 667 9 8 7 7 9 2 9 3 3 9 34 9 8 9 4 4 3 9 234 5637 289 6 3 7 7 9 34 7 9 5 3 7 5 6 9 3 6 7 2 324 37 3 9 8 9 4 4 3 9 234 5637 289 6 3!7 "27 9 3 3 8 #$%&0' 3 7 64 9 ( 7 9 34 ( 7 9 283 52 )3 7 9 " 6 7 2 6 9 3 8! 7 937 3 4 4701 + 047 27 4 4700 4 4 667 9 8 7 7 9 2 9 3 3 64 9 ( 7 9 34 ( 7 9 9 34 9 8 6 9 3 324 9 3 8 9 4 4 3 9 234 5637 289 6 6 7 2 5 3 7 5 6 9 3 : 87 $%;<=( 9 2 7 9 689 6 8! 7 9 7 4 3 838 3 7 23 9 4 37 87 2 9 9 4 7 >9 7 834 ? 7 34 7 9 9 3 5 3 4 4 5 7 M3 6 9 3 3 89 7 9 9 9 3!7 "27 9 3 3 9 8 7 237 9 367 9 7 9 23 9 9 3 3 6 9 3 7 7 27 5 !7 9 4 4 9 9 8 39 7 9 3 3 #$%;<= 8 8 7 4 7 9 8 69 3 9 3 8 9 4 8 67 8 23 9 9 3 3 8 8 3 4 7 8 69 3 9 7 4 9 7 36 8 6 338 8 7 9 X 9 9 8 637 8 3 69 3 9 639 9 3 9 23 9 4 L67 3 ? 839 5 + 9 3 7 9 34 ' 9 4 , 0<<2 = > ? ! 2@@<" -, 2@@2 A BC D > ? ! 2@@E" F G , 2@@1H2@@< I J > ? ! 2@00" D , 2@00H2@02 K > ? ! 2@0E" 9L 2@02 K > ? ! 2@0M" , 2@0@ K > ? ! 2@02" / 9L 2@0EH2@0N -> ? ! 2@0M" -B 9L 2@0M / > ? ! 2@0O" P :-P , 2@@E Q > ? ! 2@@E" P , 2@0E J > ? ! 2@01" R , 2@0SH2@01 K > ? ! 2@2@" P T , 0<<OH2@@0 F > ? ! 2@02" , , 2@@2U 2@@E , > ? ! 2@@M" .

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Introduction

Aspergillus fumigatus is a saprophytic fungus that is widespread in the environment with an ecological niche of decaying vegetation and soil [1]. It is also a ubiquitously opportunistic pathogen responsible for aspergillosis, notably invasive aspergillosis (IA)-the most severe form of the disease [2]. Indeed, the IA mortality rate is high and can reach 65% [3].

Although azole antifungals improve the management of Aspergillus-disease, this clinical advance might be threatened by the emergence of azole-resistant A. fumigatus (ARAf ) worldwide [4,5]. Over the past 20 years, there have been increasing reports of ARAf recovered on the five continents both in clinical and environmental samples [4]. The environmental route of resistance, based on the wide scale use of azole fungicides in the environment, plays a significant role [6]. Two main mechanisms of resistance that are probably of environmental origin, TR 34 /L98H and TR 46 /Y121F/T289A mutations, have commonly been described in strains from azole-naïve patients and from the environment [4,5].

Over the past few years, several environmental areas have been reported as potential hotspots for the selection of ARAf. In the Netherlands, composts containing azole residues constitute a potential hotspot for the emergence of new mutations conferring resistance [7]. Recently, wastes originating from flower bulbs, green materials, and wood chippings have been reported to be three new hotspots containing azole fungicides with the highest proportion of ARAf, as compared to wheat cereals, animal manure, grain, maize silage, fruit storage or regional and exotic fruit waste [8]. ARAf have been identified in wood environments for some years now. In fact, ARAf carrying TR 34 /L98H and TR 46 /Y121F/T289A have been described in wood debris of tree trunk hollows in Tanzania and Romania [9]. We also previously described the presence of ARAf in the wood environment, namely sawmills of Eastern France, most of which carried the TR 34 /L98H mutation [10]. In this previous study, the presence of ARAf carrying the TR 34 /L98H mutation seemed to greatly depend on the azole fungicide formulation and the quantity in substrates [10].

Consequently, the azole fungicide selection pressure could occur in different environments and in different countries and seems to play an important role in the selection of ARAf. Although typing of A. fumigatus isolates could provide insights into the dynamics of azole resistance development, the origin and global diffusion of azole-resistant A. fumigatus with TR 34 /L98H and TR 46 /Y121F/T289A are still unclear [11,12]. Currently, short tandem repeat for A. fumigatus assay (STRAf ), based on a nine microsatellite analysis, is accepted as the reference and robust typing method for this species [13,14].

The aim of this study was to genotype ARAf and azole-susceptible A. fumigatus (ASAf ), previously isolated from sawmills of Eastern France, by using STRAf typing in order to study their genetic relatedness and to describe the potential clustering of isolates according to their susceptibility profile [10]. In addition, the clinical isolates (sensitive and TR 34 /L98H) previously described in an immunocompetent woodworker with invasive sinusal aspergillosis were compared to the sawmill isolates [START_REF] Jeanvoine | Sinus aspergillosis due to an azole-resistant Aspergillus fumigatus strain carrying the TR 34 /L98H mutation in immunocompetent host[END_REF].

Materials and Methods

Collection of A. fumigatus Strains

A total of 64 environmental A. fumigatus strains, isolated from 18 French sawmills (Eastern France) between September 2014 and April 2016, were analyzed (Table 1). Among them, 23 ARAf isolates had previously been isolated by using two selective homemade malt extract agar (ThermoFisher, Waltham, MA, USA) media containing azole antifungals: itraconazole called "Maltitra" and voriconazole called "Maltvori" [10]. The 41 selected ASAf isolates matched according to the location of ARAf isolates for each sawmill. Two clinical isolates (one ARAf and one ASAf ), isolated from sinus samples in an immunocompetent woodworker who developed an invasive sinusal aspergillosis following facial injuries from a work-related accident, were also included (Table 1) [START_REF] Jeanvoine | Sinus aspergillosis due to an azole-resistant Aspergillus fumigatus strain carrying the TR 34 /L98H mutation in immunocompetent host[END_REF].

All A. fumigatus isolates were identified to the species level by PCR amplification and sequencing a part of the highly conserved β-tubulin gene [10].

For all ARAf, minimal inhibitory concentrations (MIC) of four medical azoles (itraconazole, voriconazole, posaconazole and isavuconazole) and two azoles used in agriculture and sawmills (propiconazole and tebuconazole) were obtained by using the EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility) microdilution method [START_REF]European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST)[END_REF].

Amplification and sequencing of the cyp51A gene were performed as previously described [10]. Among the 23 environmental ARAf, 20 carried the TR 34 /L98H mutation, two the TR 34 /L98H/S297T/F495I mutation and one the P216L mutation [10]. The clinical ARAf, one of the two isolates recovered in the woodworker, also carried the TR 34 /L98H mutation [START_REF] Jeanvoine | Sinus aspergillosis due to an azole-resistant Aspergillus fumigatus strain carrying the TR 34 /L98H mutation in immunocompetent host[END_REF].

MIC of voriconazole and itraconazole for environmental and clinical ASAf isolates were measured by the EUCAST method [START_REF]European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST)[END_REF].

Short Tandem Repeat for A. fumigatus (STRAf) Typing and Analysis

STRAf typing is based on the amplification of nine highly polymorphic microsatellite markers (STRAfs 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 4A, 4B, 4C). These nine STRAf loci were amplified with three triplexed PCRs as previously described [13].

PCR products were diluted 10-fold with water for molecular biology and then analyzed on the Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (ThermoFisher, Waltham, MA, USA) with GeneScan™ 400 HD ROX™ size standard according to the manufacturer's instructions (Thermofisher ® , Waltham, MA, USA).

Amplicon sizes were determined with GeneMapper software (version 5, ThermoFisher, Waltham, MA, USA) and then transformed in repeat number.

STRAf analysis was then performed using RStudio software (version 3.2.2, Boston, MA, USA). Microsatellite genotype distances were calculated using Bruvo's distance (cutoff value = 0.2) and a minimum spanning network was calculated via the bruvo.msn function on the poppr library [START_REF] Rocchi | Determination of azole fungal residues in soils and detection of Aspergillus fumigatus-resistant strains in market gardens of Eastern France[END_REF]. Finally, allelic diversity was calculated for the nine STRAf loci for ARAf and ASAf isolates by using the Simpson index of diversity (D).

Results

A total of 54 STRAf unique multilocus genotypes (MLGs) were described among the 66 typed A. fumigatus: 13 for the 24 ARAf and 41 for the 42 ASAf. None of the ARAf isolates had MLGs close to those that of the ASAf isolates, and the sensitive clinical isolate identified in the woodworker before the resistant one revealed a completely different MLG.

The nine microsatellite markers including STRAf genotypes, allele count, repeat range, median repeat number and allelic diversity are summarized in Table 2. All loci were polymorphic with a number of alleles ranging from 3 (loci 3B and 4B) to 11 (locus 3A) and from 9 (locus 4B) to 19 (loci 3A and 3C) for ARAf and ASAf isolates, respectively. Loci 3A and 3C displayed the highest polymorphism and allelic diversity for both ARAf and ASAf isolates, whereas locus 4B was the least discriminating with the lowest number of alleles (Table 2). For all microsatellite markers, allelic diversity was higher for ASAf isolates (average D = 0.811) than for ARAf isolates (average D = 0.518) (Table 2). Among the 42 ASAf, 41 MLGs were identified, with two isolates from two different sawmills (A and D, 60 km away) sharing the same genotype (A177 and D159, Figure 1). Thirty-two MLGs (76%) were very distinct and could not be grouped with the Bruvo distance cutoff used. However, four groups of two ASAf were found: D161 and R12P, E21P and O166, S179 and C1P, F20P and F19P (genotypes connected by lines in Figure 1). These ASAf were isolated from different sawmills, except for isolates F20P and F19P which were recovered in the same sawmill (F) at different locations. Among the 24 ARAf, 13 MLGs were characterized. Four isolates with the TR 34 /L98H mutation (genotype numbers Q10, M18, D8 and F13, Figure 1) and one with the P216L mutation (genotype S24) had their own MLGs and could not be grouped with Bruvos's distance. The others were recovered for several isolates grouped in the same circles within the minimum spanning network (Figure 1).

For TR 34 /L98H isolates, two MLGs that were genotypically distinct from others were identified: genotypes D3 and D4 with the TR 34 /L98H mutation, found in the same soil sample, and D5 and F14 with the TR 34 /L98H/S297T/F495I, taken from two geographically distant sawmills (170 km).

Moreover, two groups of MLGs were found with Bruvo's distance (Figure 1). The first group was composed of four MLGs, including 13/24 ARAf (54%, genotype numbers A25, R21, G15, P12 / D2, D7, S23, O20, P11 / D6, O19, H16 and K17). Among these four closely related STRAf genotypes, three differed by only one repetition of the microsatellite marker 3A; the fourth (K17 ARAf ) differed from the three others by the number of repetitions of microsatellite markers 3A and 3C. These four genotypes included TR 34 /L98H ARAf isolated from different sawmills that could be located as far as 200 km from each other; two of these genotypically similar ARAf (P11 and P12) were isolated in one sawmill that imported wood from Russia. The second group consisted of one clinical TR 34 /L98H isolate responsible for invasive sinusal aspergillosis in an immunocompetent woodworker and had a genotype close to a sawmill ARAf also carrying the TR 34 /L98H mutation (genotype R22 in Figure 1). It differed by the number of repetitions on microsatellite markers 3A and 4A. However, the woodworker did not work in sawmill R.

Identical MLGs were thus found in different sawmills, but different MLGs were also found in one sawmill: five different MLGs were identified among the seven ARAf found in sawmill D. This sawmill shared one MLG (genotype D5, mutation TR 34 /L98H/S297T/F495I) with another sawmill. Sawmill D shared MLGs with other sawmills and genotypes that closely resembled each other (genotypes D2, D7 and D6). It also had one MLG (genotypes D3 and D4) that was different from all other MLGs.

Discussion

In this study, we reported the presence of both common and different genotypes in ARAf and ASAf from sawmills of Eastern France by using STRAf typing. Our findings are similar to those of several other studies, as we reported that ASAf had a greater genotypic diversity than ARAf [14,[START_REF] Chowdhary | Clonal Expansion and Emergence of Environmental Multiple-Triazole-Resistant Aspergillus fumigatus Strains Carrying the TR 34 /L98H Mutations in the cyp51A Gene in India[END_REF][START_REF] Chang | Diversity and origins of Indian multi-triazole resistant strains of Aspergillus fumigatus[END_REF]. This could suggest a predominantly clonal expansion of ARAf in the environment. In fact, contrary to ASAf, more than half of ARAf (54%) belonged to the same group with the Bruvo's distance cutoff used and seemed to be genotypically close. These ARAf came from different sawmills that were geographically far from one another (up to 200 km) and for which a selection pressure by azole fungicide was reported. Direct or indirect contact with azole fungicide was shown, and azole fungicides were detected in substrate samples in these sawmills [10].

This study has some limitations. First, we describe here the genotypic structure of isolates coming from only one region in France and one type of environment. A broader study including genotyping of isolates from other regions, environments and countries would make it possible to know if the genotypes of ARAf and ASAf from Eastern France are shared by isolates in other regions of the world; this could help to improve our understanding of the emergence, diffusion and distribution of ARAf.

In addition, we used STRAf typing which is widely accepted as the reference typing method for A. fumigatus [14]. However, two of the nine microsatellite markers, 3A and 3C, show a lower level of stability which has to be taken into account when interpreting STRAf data during molecular epidemiological analysis [START_REF] De Groot | Microsatellite Stability in STR Analysis Aspergillus fumigatus Depends on Number of Repeat Units[END_REF]. This is illustrated by the greater polymorphisms for these two markers described in our study. Moreover, three genotypes differed by only one repetition on marker 3A and grouped isolates coming from the same sawmill or the same samples (P11 and P12). The difference between these three genotypes might be valid but we cannot exclude a bias in the genotyping method used. Despite the high discriminatory power of STRAf typing, it remains lower than that of whole genome sequencing (WGS). So, it would be interesting to determine whether or not ARAf with the same genotype, revealed using STRAf typing, would reveal exactly the same genotype when using WGS. Likewise, exploring genotypic diversity with WGS could be useful.

It is important to emphasize that 13 STRAf genotypes were found among the 24 ARAf. Moreover, some ARAf had their own genotypes and were genotypically distinct from others despite sharing the same mechanism of resistance (mutation TR 34 /L98H). It is interesting to note that this diversity was reported in one sawmill (D), without any particular characteristics when compared to other sawmills using a dip processing tank, and where five MLGs were reported among the seven ARAf genotyped. These findings contrast with those of some studies describing only one clone of TR 34 /L98H ARAf strains [START_REF] Chowdhary | Clonal Expansion and Emergence of Environmental Multiple-Triazole-Resistant Aspergillus fumigatus Strains Carrying the TR 34 /L98H Mutations in the cyp51A Gene in India[END_REF][START_REF] Badali | Environmental study of azole-resistant Aspergillus fumigatus with TR 34 /L98H mutations in the cyp51A gene in Iran[END_REF]. The local diversity of the genotype reported here was also highlighted for ARAf isolates in market gardens of the same region in Eastern France. In this study, 22 STRAf genotypes among 44 analyzed ARAf and six groups of genotypically close ARAf were recorded. ARAf isolates could be more diverse in other countries such as Colombia where 19 MLGs were identified in 21 ARAf isolates in the environment [START_REF] Rocchi | Determination of azole fungal residues in soils and detection of Aspergillus fumigatus-resistant strains in market gardens of Eastern France[END_REF][START_REF] Alvarez-Moreno | Azole-resistant Aspergillus fumigatus harboring TR 34 /L98H, TR 46 /Y121F/T289A and TR 53 mutations related to flower fields in Colombia[END_REF]. Additionally, it has also been shown by STRAf typing that resistant isolates, coming from several countries, belonged to several groups. Similarly, some authors have reported a dispersed structure in ARAf with tandem repeat (TR) mutations [11,14]. Thus, it seems unlikely that the emergence of azole-resistant strains could be the work of a single clone.

The population structure of A. fumigatus is very complex and is likely to be due to several past and current events: historical differentiation, contemporary gene flow, sexual reproduction, recombination, and the localized azole fungicide selection that could drive expansion of ARAf genotypes [11,12]. It was recently reported that certain practices like composting (i.e., stockpiling plant waste) might be the key to resistance selection in A. fumigatus [8]. Some environments supporting the growth, sexual reproduction, genetic variation and containing residues of azole fungicides could cause these complex mutations to emerge, amplify and spread. So, ARAf may very well emerge in specific environments and spread to other countries due to natural factors such as wind, or anthropogenic factors such as human travel and commercial trade [11,[START_REF] Korfanty | Contemporary Gene Flow is a Major Force Shaping the Aspergillus fumigatus Population in Auckland, New Zealand[END_REF]. This gene flow could explain the fact that genotypically close ARAf, or those having the same genotype, were found in different countries [START_REF] Chowdhary | Clonal Expansion and Emergence of Environmental Multiple-Triazole-Resistant Aspergillus fumigatus Strains Carrying the TR 34 /L98H Mutations in the cyp51A Gene in India[END_REF][START_REF] Chang | Diversity and origins of Indian multi-triazole resistant strains of Aspergillus fumigatus[END_REF][START_REF] Badali | Environmental study of azole-resistant Aspergillus fumigatus with TR 34 /L98H mutations in the cyp51A gene in Iran[END_REF].

A comparison of genotypes from sawmill ARAf with genotypes from other A. fumigatus isolates in a London database (https://afumid.shinyapps.io/afumID/, 4049 A. fumigatus isolates collected worldwide) showed that some sawmill ARAf (A25, R21, G15, P12 with the same MLG) presented the same genotype as a clinical Australian isolate (data not shown). Among them, isolate P12 is one of the two isolates found in one sawmill that did not treat wood, but rather imported foreign wood from Russia that had already been treated with fungicides (sawmill P). Curiously, these two ARAf shared the same MLG as other sawmills ARAf. According to these results, the gene flow could not be excluded here and it may be possible that these ARAf emerged in a favorable environment outside of France and then, when imported, spread to the Eastern France sawmills. Conversely, an MLG identified twice in a single sawmill (D) is not linked to any profile in the London database.

The distribution of sawmill ARAf and ASAf genotypes, with a lower diversity of ARAf isolates, also seems to concur with two hypotheses reported by other authors to explain the emergence and distribution of ARAf : the specific genetic background and predisposition of some clones to develop azole-resistance, and the better ability of ARAf isolates to accept the azole-resistant genes via mating and recombination [11,14]. ARAf with TR 34 /L98H and TR 46 /Y121F/T289A mutations may have a genetic component that is restricting the resistance genotype to certain strains [START_REF] Sewell | Nonrandom Distribution of Azole Resistance across the Global Population of Aspergillus fumigatus[END_REF]. It has also been reported that the genetic backgrounds of TR 34 /L98H and TR 46 /Y121F/T289A ARAf were less diversified than those of wild-type isolates [START_REF] Sewell | Nonrandom Distribution of Azole Resistance across the Global Population of Aspergillus fumigatus[END_REF]. This is compatible with selective gene sweeps accompanying the selection of beneficial mutations and the genetic adaptation of A. fumigatus which enable it to survive and reproduce in prevailing or new environments, such as those with azole fungicides [START_REF] Sewell | Nonrandom Distribution of Azole Resistance across the Global Population of Aspergillus fumigatus[END_REF][START_REF] Meis | Clinical implications of globally emerging azole resistance in Aspergillus fumigatus[END_REF]. Selective sweeps would reduce allelic diversity and one, or a limited number, of clones would predominate locally [START_REF] Korfanty | Contemporary Gene Flow is a Major Force Shaping the Aspergillus fumigatus Population in Auckland, New Zealand[END_REF]. The lower allelic and STRAf genotype diversity reported for ARAf isolates from sawmills in our study make this hypothesis likely. So, according to their genetic background, some strains could adapt more easily than others to a given environment and could be more able to develop and persist in an environment where the azole fungicide selection pressure is substantial. Moreover, the lower diversity of the ARAf, despite their different origin and the fact that they have been isolated in different sawmills, could suggest that ARAf belonging to the same group (with the Bruvo's distance cutoff used) are genotypically closed and probably evolved from each other.

In conclusion, in this study we reported both common and different genotypes on a regional scale. Despite having lower allelic diversity than ASAf isolates, some ARAf could not be grouped together with other sawmill ARAf isolates. The diversity of genotypes described here, at a local level, seems to support the multiple origins hypothesis, thus suggesting that the hypothesis of clonal expansion from a common strain is now probably obsolete and insufficient to explain ARAf emergence and distribution. The evolution of ARAf from different origins could also be involved.

INTRODUCTION

Fungal pathogens pose a growing threat to the health of humans, animals, ecosystems, food security, and the global economy, making their effective control necessary [START_REF] Fisher | Emerging Fungal Threats to Animal, Plant and Ecosystem Health[END_REF]. Azoles fungicides, with more than 30 compounds available [START_REF] Fisher | Worldwide Emergence of Resistance to Antifungal Drugs Challenges Human Health and Food Security[END_REF], are widely used in agriculture to protect cereal, vegetables, and vines from phytopathogenic fungi, as well as in the cultivation of ornamental plants and to preserve materials such as timber. These fungicides are used worldwide, particularly in Europe and Asia, where they represent one of the most commonly used classes of pesticides (Chowdhary et al., 2015;[START_REF] Chen | Epidemiology and Molecular Characterizations of Azole Resistance in Clinical and Environmental Aspergillus Fumigatus Isolates From China[END_REF]. Due to their broad-spectrum action across the fungal kingdom, the azoles are also widely used as first-line drugs in medicine (human and animals) for the treatment of superficial and invasive fungal infections. Within this context of widespread use of antifungals across different compartments, the occurrence of multi-resistant pathogenic fungi represents an emerging threat to the control of plant, animal, and human diseases [START_REF] Fisher | Worldwide Emergence of Resistance to Antifungal Drugs Challenges Human Health and Food Security[END_REF]. Recently reviewed [START_REF] Verweij | The One Health Problem of Azole Resistance in Aspergillus Fumigatus: Current Insights and Future Research Agenda[END_REF], substantial progress has been made towards building the argument that ecological "hotspots" occur where biotic and abiotic conditions converge to allow the growth of the thermophilic Aspergillus fumigatus in contact with sub-MIC concentrations of agricultural triazoles, generating conditions that are suitable for adaptation to drug pressure. Specifically, highly related genotypes of azole-resistant A. fumigatus have now been described in clinical and environmental samples, suggesting that humans are increasingly exposed to drugresistant aerosolized A. fumigatus spores with broad public health consequences (Sewell et al., 2019;[START_REF] Rhodes | Tracing Patterns of Evolution and Acquisition of Drug Resistant Aspergillus Fumigatus Infection From the Environment Using Population Genomics[END_REF].

Studying the population genetics and evolution of pathogens can help further our understanding of the evolution and spread of antimicrobial resistance, including tracing potential sources of inocula using molecular epidemiology. Specifically, for azoleresistant A fumigatus (ARAf), it is important to understand whether genotypes are randomly distributed or cluster geographically, and whether a common source of colonization may exist [START_REF] Van Der Linden | Aspergillosis Due to Voriconazole Highly Resistant Aspergillus Fumigatus and Recovery of Genetically Related Resistant Isolates From Domiciles[END_REF]. In 2012, we described a first case of invasive aspergillosis caused by TR 34 /L98H ARAf in a farmer (Rocchi et al., 2014). In 2013, we described a second case, in a woodworker, who developed sinus aspergillosis due to TR 34 / L98H A. fumigatus (Jeanvoine et al., 2016). Motivated by these findings, the mycology team of Besancon (Eastern France) undertook a systematic screening of A. fumigatus to assess the burden of azole resistance across both clinical and environmental samples. In 2017, we observed an increase in the number of cystic fibrosis (CF) patients colonized with ARAf, with 16% of patients with A. fumigatus-positive cultures observed carrying the TR 34 / L98H resistance allele [START_REF] Godeau | Azole-Resistant Aspergillus Fumigatus in the Hospital: Surveillance From Flower Beds to Corridors[END_REF] whereas previously, only one patient had this type of isolate in 2015. This percentage of resistance mirrors that reported by a British team [START_REF] Abdolrasouli | High Prevalence of Triazole Resistance in Clinical Aspergillus Fumigatus Isolates in a Specialist Cardiothoracic Centre[END_REF] and is among the highest occurrence in CF patients observed in European studies [START_REF] Amorim | Susceptibility to Five Antifungals of Aspergillus Fumigatus Strains Isolated From Chronically Colonised Cystic Fibrosis Patients Receiving Azole Therapy[END_REF][START_REF] Mortensen | Aspergillus Species and Other Molds in Respiratory Samples From Patients With Cystic Fibrosis: A Laboratory-Based Study With Focus on Aspergillus Fumigatus Azole Resistance[END_REF][START_REF] Burgel | High Prevalence of Azole-Resistant Aspergillus Fumigatus in Adults With Cystic Fibrosis Exposed to Itraconazole[END_REF][START_REF] Morio | High Prevalence of Triazole Resistance in Aspergillus Fumigatus, Especially Mediated by TR/L98H, in a French Cohort of Patients With Cystic Fibrosis[END_REF][START_REF] Fischer | Prevalence and Molecular Characterization of Azole Resistance in Aspergillus Spp. Isolates From German Cystic Fibrosis Patients[END_REF][START_REF] Prigitano | Triazole Resistance in Aspergillus Fumigatus Isolates From Patients With Cystic Fibrosis in Italy[END_REF][START_REF] Guegan | Performance of Molecular Approaches for Aspergillus D e t e c t i o na n dA z o l eR e s i s t a n c eS u r v e i l l a n c ei nC y s t i cF i b r o s i s[END_REF][START_REF] Seufert | Prevalence and Characterization of Azole-Resistant Aspergillus Fumigatus in Patients With Cystic Fibrosis: A Prospective Multicentre Study in Germany[END_REF][START_REF] Lavergne | One Year Prospective Survey of Azole Resistance in Aspergillus Fumigatus at a French Cystic Fibrosis Reference Centre: Prevalence and Mechanisms of Resistance[END_REF].

Since 2017, a number of ARAf baring the TR 34 /L98H allele were detected in the air of Besancon hospital following fungal aerocontamination monitoring. Undertaken weekly using seven air sample locations in general hospital corridors, our surveillance has detected ARAf periodically between 2017 and 2019 (Rocchi et al., 2021). In parallel, two environmental studies were conducted in agricultural fields where azoles had been sprayed, in sawmills (Jeanvoine et al., 2017)a n dm a r k e t gardens (Rocchi et al., 2018).

Across our team, we have collected 1,100 strains of the Aspergilli complex (A. fumigatus and cryptic species) isolated in our region (rural landscape in Eastern France). Here, we assess the genetic relatedness among a retrospective sample of 225 susceptible and resistant A. fumigatus from our collection for both clinical and environmental samples by comparing them to data (worldwide scale) held within pre-existing genotype databases.

MATERIALS AND METHODS

Current Systematic Screening in Besancon Hospital

For both clinical and environmental samples, A. fumigatus were first isolated on malt agar media supplemented by itraconazole (2 mg L -1 ) or voriconazole (1 mg L -1 )( van der Linden et al., 2013;[START_REF] Bader | Environmental Isolates of Azole-Resistant Aspergillus Fumigatus in Germany[END_REF] at 37°C for clinical ones and 48°C for environmental ones. Subsequently, resistance was measured by concentration gradient Etest strip technique (Etest, bioMeŕieux, France) and/or checked by European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) broth microdilution method (Arendrup et al., 2013). In case of azole-resistant isolate, a 495bp section of the beta-tubulin gene (Glass and Donaldson, 1995) and the cyp51A gene and its promoter were amplified and sequenced (Mellado et al., 2001;Alanio et al., 2011).

PCRs were carried out in a 50-µl volume, containing 25 µl of GoTaq ® G2 Hot Start Green Master Mix, 2 µl of each set of primers (10 µM, Table 1), 50-100 ng of genomic DNA, and water (molecular biology quality) to 50 µl. Amplification was performed in a C1000 Touch ™ thermal cycler (BIORAD) with 2 min at 95°C, and 34 cycles of 15 s at 95°C, 15 s at 61°C (for betatubulin primer sets), or 15 s at 55°C (for cyp51A primer sets), 10 s at 72°C, and one final cycle of 5 min at 72°C. The PCR products were analyzed by electrophoresis on 1% agarose gels, visualized with SYBR ™ Safe DNA Gel Stain (ThermoFisher Scientific), and then purified (NucleoSpin ® Gel and PCR clean-up, Macherey-Nagel) to Sanger sequencing (Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer).

Selection of Isolates for Genetic Relatedness Analysis

All ARAf obtained from April 2012 to December 2018, 113 isolates in total, were included in the genetic relatedness analysis. Azole-susceptible isolates (ASAf), isolated on azole or azole-free media, were retrospectively selected (see below) from the available collection according to the origin of resistant ones and to have groups with a comparable number of isolates between the different environments. For clinical isolates, especially those from CF patients, sensitivity to azoles was assayed using Etest strip technique and confirmed by EUCAST method for only one colony growing on medium with azole from sputum until 2018. For environmental analysis, sensitivity of all strains growing on medium with azole were assayed with EUCAST method and we inoculated the samples in parallel on azole free media (DG18). Due to the large number of A. fumigatus isolated on DG18, we selected only one isolate for every 10 growing on media to test their sensitivity. Isolates growing on medium with azoles but with EUCAST MIC > 2 µg/ml were stored as susceptible strains.

The majority of environmental resistant ARAf isolates came from market gardens (n=43), sawmills (n=24), and air of hospital (n=12). For sawmills and market gardens, we chose ASAf to match the location of ARAf isolates for each professional field (preferably within the same sample when possible, or in the same field or building for sawmills or, if not possible, on the same farm). In total, we analyzed a total of 63 isolates from market gardens (43 ARAf and 20 ASAf) and 65 from sawmills (24 ARAf and 42 ASAf).

With respect to isolates from hospital air sampling, as the detection of ARAf did not always coincide with an increase in the total number of A. fumigatus in hospital corridors, we selected 45 ASAf in the following way: ASAf isolated from a contamination peak in June 2017, localized in one hospitalization ward (after a heating system malfunction), with a selection of 24 ASAf in six rooms and bathrooms of the department. ASAf were isolated during a general contamination peak in December 2018 (68 colony forming units/m 3 of air) in the general corridors of the hospital where we selected 12 ASAf. Six ASAf were isolated in June 2018, on the same day as a TR 34 /L98H ARAf and three ASAf were isolated the following week.

In total, we analyzed 112 ASAf coming from 5 clinical and 107 environmental samples and 113 ARAf coming from 29 clinical and 84 environmental samples (Figure 1).

Genotyping Method

Microsatellite genotyping by short tandem repeats for A. fumigatus (STRAf) assay (de Valk et al., 2005) was performed to assess the genetic relatedness between 225 susceptible and resistant A. fumigatus.

We modified the method developed by de Valk et al. (2005) by changing the fluorochrome TET (tetrachlorofluorescein) to NED (2.7',8'-benzo-5'-fluoro-2',4,7-tricloro-5-carboxyfluorescein). Diluted PCR products were combined with GeneScan ™ 400 HD ROX ™ size standard (ThermoFisher, Waltham, MA, USA) for fragment detection by capillary electrophoresis (Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer device, ThermoFisher, Waltham, MA, USA).

Peaks were visualized with Microsatellite analysis application on ThermoFisher cloud dashboard (https://apps.thermofisher. com/apps/spa/#/dashboard). For each marker, the correct peak was selected and transformed into a repeat number based on the Af293 STRAf genotype. The number of repeats was inferred from the available genome for this strain by an automated script using R Studio software.

Data Analysis

Microsatellite genotype distances were calculated using Bruvo's distance (Bruvo et al., 2004). The analyses were done in three steps. Firstly, all susceptible and resistant isolates from the mycology team of Besancon were used. Genotypic richness was assessed by the total number of unique multilocus genotypes (MLGs) or expected MLGs (eMLGs), which approximates the number of genotypes that would be expected at the largest, shared sample size based on rarefaction. Diversity (Simpson's, Shannon-Wiener, or Stoddart and Taylor's Indexes) and evenness were also calculated for each type of isolate (azole susceptible and resistant) with the R package poppr (Kamvar et al., 2015).

Secondly, only local TR 34 /L98H isolates were analyzed in order to see the proximity according to their origin. Thirdly, we compared our local TR 34 /L98H isolates to those with available data worldwide. For this, we used a global dataset housed within the online AfumID application (https://afumid.shinyapps.io/ afumID/) (Sewell et al., 2019). We thus included a further 194 isolates that had previously been isolated and genotyped from 16 countries. In order to ensure harmonization, the number of alleles was recalibrated between the two databases using the reference strain Af293.

Data were represented by circular genetic tree build by a Neighbor-Joining method clustering from a matrix of bruvo distance (Bruvo et al., 2004) using ape library (Paradis and Schliep, 2019)a n di n t e r a c t i v et r e eo fl i f e( i T O L )s o f t w a r e (https://itol.embl.de/) and by minimum spanning networks, calculated via the bruvo.msn function on the poppr library (Kamvar et al., 2015).

RESULTS

Cyp51A Gene Mutations

Genotyping Results: Besancon Local Scale

The total number of MLGs was higher in the sensitive group than in the resistant group with 102 MLGs found in the 112 ASAf isolates and 53 MLGs observed among the 113 barcoded ARAf.

When comparing the two most abundant groups (ASAf and TR 34 /L98H ARAf), it was apparent that genotypic richness, represented by the total number of MLG or expected MLG (eMLG), was lower in the TR 34 /L98H ARAf group (Table 2). Regardless of the index used (Simpson's, Shannon-Wiener, or Stoddart and Taylor's Indexes), the genotype diversity was also lower in the TR 34 /L98H ARAf group. The evenness measure (Table 2) indicates that the MLGs observed in the ASAf population are closer to equal abundance (which would be equal to 1) than those in the TR 34 /L98H ARAf population. Indeed, when we look at the distribution of MLGs for each group, there are many more unique ASAf profiles than ARAf profiles.

When one MLG was shared by isolates of ASAf, it was only shared by two isolates and from a similar source (clinical or environmental). Only one MLG was found both in a clinical isolate (1E005, CF patient June 2017) and in an environmental isolate (2E042, hospital air June 2018).

One MLG was shared by sensitive and resistant A. fumigatus isolated from one CF patient: one susceptible (1E007) and two resistant (2E022 and 1E008) isolates. These three strains had F46Y/M172V/N248T/D255E/E427K polymorphism in cyp51A. For ARAf, five MLGs corresponding to TR 34 /L98H allele were share by several isolates (Table 3). Two main MLGs (A and B in Figure 2), differing only by a single repeat at the STRAf 3A loci and corresponding to 17 and 12 isolates, respectively, were shared by isolates recovered from both clinical and environmental samples. In addition to being isolated both in the clinic and in the environment, these isolates were also widely found in different environments across our region and also from different categories of patients or date of sampling (Figure 3 and Table 3).

Two highly dissimilar MLGs of eight and six isolates (MLG C and D, Figure 3) were also found in the same market garden, in six different soil samples coming from two different sites where difenoconazole was used to treat vegetable fields. These fields were found 1.5 km apart. In this market garden, we also recovered 14 different MLGs, with one MLG (MLG E, Figure 3) shared with one sawmill 40 km away (all green MLG in Figure 3, except MLG B and 1E073 MLG, which were found in another market garden). Genotyping Results for TR 34 /L98H Isolates: Global Scale A subset of the dominant MLGs in the Franche-Comtéarea were commonly shared with isolates found worldwide: MLG B (found in CF patients, hospital air, sawmills, and market gardens) was also detected in Australia and Ireland and MLG E (detected in market gardens and sawmills) was also isolated in Denmark (Figure 4). In comparison, MLG A, C, and D, while common in our dataset, were not observed in the global dataset, suggesting that they are geographically spatially constrained.

Other MLGs found in Eastern France were also closely related to those occurring more widely including those found in the Netherlands (links between the MLG on the Figure 4). One MLG was shared by four isolates in Besancon (a sawmill, twice in hospital air and once in a CF patient) and one isolate in the Netherlands. Another MLG is common with Ireland and Iran isolates and one is common with the Netherlands and another country (not known in the AfumID application). Nine MLG corresponding to nine isolates (five from market gardens, two from sawmills, one from hospital air, and one from CF patient) appear to be completely different (no link in Figure 4 with fixed cutoff) and were only found in the Besancon collection of isolates

DISCUSSION

In our study, we describe linked patient sampling, healthcare bioaerosol monitoring, and environmental sampling of A. fumigatus in order to explore potential links using molecular epidemiology. STRAf genotyping that we undertook demonstrated spatial heterogeneity, with some clones occurring far more widely than others. These data highlight the importance of incorporating spatial scale towards understanding of the local population genetic structure of A. fumigatus and the epidemiology ARAf. Currently, the modes of dissemination, the occurrence of resistant genotypes in the environment, and the likelihood of exposure to at-risk patients remain poorly known. When applied locally, genotyping methods can shed light into the source of infection with various studies showing possible nosocomial acquisition of A. fumigatus and potentially ARAf (van der Torre et al., 2021). Three studies have suggested that dissemination from patient to patient occurs, as well as from patient to the healthcare environment [START_REF] Pegues | Cluster of Cases of Invasive Aspergillosis in a Transplant Intensive Care Unit: Evidence of Person-to-Person Airborne Transmission[END_REF][START_REF] Lemaire | Hospitalized Patient as Source of Aspergillus Fumigatu[END_REF][START_REF] Engel | Aerosol Transmission of Aspergillus Fumigatus in Cystic Fibrosis Patients in the Netherlands[END_REF]. For animals, the dynamics of resistant animal populations in livestock in relation to the environment (except for poultry) are poorly described and are unknown in wildlife. In both cases, it is likely that exposure to ARAf genotypes is higher for individuals in environment that are frequently exposed to fungicides and/or also to organic matter (leaf litter, compost, and cultivated soils rich in organic matter). Clearly, studies to assess the extent that resistant genotypes are stratified by region and environment will lend nuanced understanding to the ecological processes that are thought to generate ARAf.

In this study, as in others, we observe a reduced genetic diversity of TR 34 /L98H isolates (the most common resistance mechanism) compared to susceptible strains, suggesting a more recent emergence of this genotype (Camps et al., 2012). This allele is suggested to have emerged around 1997, perhaps in the Netherlands and dispersed across Europe, although other regions of origin are possible (Snelders et al., 2012;[START_REF] Abdolrasouli | Genomic Context of Azole Resistance Mutations in Aspergillus fumigatus Determined Using Whole-Genome Sequencing[END_REF][START_REF] Bader | Environmental Isolates of Azole-Resistant Aspergillus Fumigatus in Germany[END_REF]Garcia-Rubio et al., 2018). Currently, TR 34 /L98H is increasingly described in other global settings and the occurrence of TR 34 /L98H genotypes does not seem to be limited to Europe. Aerial dispersal is most likely a major contributor to the long-distance migration of airborne A. fumigatus conidia owing to the widespread detection of aerosolized A. fumigatus spores [START_REF] Shelton | Campaign-Based Citizen Science for Environmental Mycology: The Science Solstice and Summer Soil-Stice Projects to Assess Drug Resistance in Air-and Soil-Borne Aspergillus Fumigatus[END_REF], which can also be moved in traded products (Dunne et al., 2017). Indeed, identical genotypes were described in several centers and countries, sometimes separated by thousands of kilometres (Chowdhary et al., 2012;Sewell et al., 2019). In 2012, a study of environmental isolates from Iran reported a TR 34 /L98H MLG closely related to Dutch and Indian isolates (Badali et al., 2013). A recent Japanese publication described TR 34 /L98H isolates clustering with strains from the Netherlands and France [START_REF] Tsuchido | Prospective Multicenter Surveillance of Clinically Isolated Aspergillus Species Revealed Azole-Resistant Aspergillus Fumigatus Isolates With TR34/L98H Mutation in the Kyoto and Shiga Regions of Japan[END_REF].

In our study, one of the two dominant MLGs (MLG B) isolated in different environments in the Besancon region and isolated from different patients over several years was identical to an MLG in Australia and Ireland. Owing to the highly diverse nature of the STRAf barcoding loci, the likelihood by these MLGs being identical by chance rather than by descent is vanishingly unlikely (Sewell et al., 2019). Conversely, we have also found MLGs that have so far not been found in other countries. This is particularly the case for MLG A, which has high frequency in varied environments (sawmills and hospital air) as well as in different patients over several years. In Taiwan, a team has observed a potential global spread of TR 34 /L98H isolates but also a local genetic clustering of some clinical and environmental TR 34 /L98H [START_REF] Wang | Prevalence, Mechanisms and Genetic Relatedness of the Human Pathogenic Fungus Aspergillus Fumigatus Exhibiting Resistance to Medical Azoles in the Environment of Taiwan[END_REF]. Other works have also reported local clusters, as in China with clinical and environmental TR 34 /L98H/S297T/F495I isolates [START_REF] Deng | Triazole Phenotypes and Genotypic Characterization of Clinical Aspergillus Fumigatus Isolates in China[END_REF][START_REF] Chen | Elevated MIC Values of Imidazole Drugs Against Aspergillus Fumigatus Isolates With TR (34)/L98H/S297T/F495I Mutation[END_REF]. The two isolates carrying this mutation found in the French sawmill do not have the same STRAf profiles as those described in these works. In Germany, local factors have been evoked as the reason for the increased prevalence of specific genotypes [START_REF] Bader | Environmental Isolates of Azole-Resistant Aspergillus Fumigatus in Germany[END_REF]. Resistance could therefore also result from the appearance of different clones located in different countries or regions when there is sufficient selection pressure. This could explain the greater diversity of genotypes found in vegetable crops in the market gardens, for example.

I no u rs t u d y ,w eh a v es h o w nt h a tA R Af occurs in the air of hospital and, in this case, could be acquired by patients during episodes of immunosuppression. In our hospital, resistant isolates were found in the general corridors, not in the hematology departments, thus reducing the risk of acquiring invasive aspergillosis caused by a resistant genotype. However, we described MLGs found in CF patients and in environments such as hospital air, and also with hospital visits coinciding with the isolation of certain resistant genotypes; this is the case, for example, for MLGs A and B. However, the wide distribution of these MLGs, both locally for MLG A (different environments) and globally for MLG B (different environments and in other countries), prevents us from conclusively asserting nosocomial acquisition of these isolates in CF patients. This is because, on a probabilistic basis, there is a non-negligible likelihood that these dominant genotypes may have been acquired through exposures outside of the hospital. However, a single MLG found only in Besancon was isolated from hospital air (1E023) and from sputum of a CF patient (1E017) 1.5 months apart. Even if we do not have the analytical power to definitively prove this, the potential for nosocomial contamination ofth ehealth careenvironmentcannot currently be excluded.

Microsatellite genotyping is widely used in eukaryotes. In A. fumigatus, it has been used to identify the potential origins of resistant genotypes, and how genotypes are shared between patients, geographical regions, countries, and continents (Korfanty et al., 2019). Genotyping analyses with the ninemicrosatellite-based method in A. fumigatus (de Valk et al., 2005) provide high discriminatory power and reproducibility [START_REF] Klaassen | Aspergillus Strain Typing in the Genomics Era[END_REF]. For our local isolate comparisons, wecanbesurethatMLGAandBoftheBesancon region isolates a r ed i f f e r e n t ,a st h e yw e r ea n a l y z e dw i t ht h es a m em e t h o d o l o g y (PCR, fragment analysis, and copy number transformation). However, when we compare the profiles of isolates analyzed in different laboratories, how can we be sure that two isolates with only one microsatellite difference, for example, are indeed different or that the difference is due to interlaboratory variations? MLG A (only local isolates) and MLG B (local and found in Australia and Ireland) only differ by one repeat on a microsatellite, STRAf 3A, which is the loci showing the greatest diversity, as has already been shown for agricultural strains (Ashu et al., 2018). It is therefore important to secure or find ways to harmonize methods of analysis on a large scale so that results can be reliably compared, and ensure i no u rc a s et h a ti ti si n d e e dt h eM L GAt h a ti sl o c a la n dt h a tt h e MLG B has a global distribution. Interlaboratory controls should also be considered with, in particular, the implementation of standardization of sizing data by using allelic ladders [START_REF] De Valk | Interlaboratory Reproducibility of a Microsatellite-Based Typing Assay for Aspergillus Fumigatus Through the Use of Allelic Ladders: Proof of Concept[END_REF]. Moreover, microsatellite genotyping does not provide sufficiently fine-grained information on the degree of proximity of two strains with two MLG, for example, whereas whole genome sequencing (WGS) can [START_REF] Hagiwara | Whole-Genome Comparison of Aspergillus Fumigatus Strains Serially Isolated From Patients With Aspergillosis[END_REF][START_REF] Rhodes | Tracing Patterns of Evolution and Acquisition of Drug Resistant Aspergillus Fumigatus Infection From the Environment Using Population Genomics[END_REF]. High-throughput WGS techniques are now poised to surpass other typing methods because of the high resolution of the data generated and the decreasing costs as performance increases. Better genetic knowledge of resistant strains through genomic approaches will help define the population structure of A. fumigatus and inform the future evolutionary trajectory of resistant phenotypes.

While WGS techniques have a higher analysis resolution than other genotyping techniques, the STRAf method, coupled with mutation screening and even mating type characterization, appears to be a good compromise to rapidly and simply screen relatively large numbers of isolates that have resulted from surveillance programs [START_REF] Van Der Linden | Aspergillosis Due to Voriconazole Highly Resistant Aspergillus Fumigatus and Recovery of Genetically Related Resistant Isolates From Domiciles[END_REF]. Then, as in our case, where a "super clone" emerges from the analysis, it would be judicious to use WGS analysis to refine analyses in order to further explore patient-environmental links. Going forward, there is a need to continue to study the environmental conditions (both in host and in the environment) that facilitate the development, selection, and spread of resistance genotypes with large-scale multidisciplinary collaborations. preparation: SR. Writing, review, and editing: SR, MF, TS, CG, BV, and LM. Funding acquisition: SR and LM. All authors contributed to the article and approved the submitted version. fumigatus (Vanbreuseghem et al., 1978). Des analyses des communautés par qPCR ont par ailleurs montré que les sols issus des pots de fleurs contenaient en moyenne 5000 fois plus d'ADN d'A. fumigatus que les sols des cultures céréalières. Le terreau utilisé pour ces plantations semble donc être un terrain particulièrement propice au développement de ces espèces fongiques.

L'évaluation de la contamination des sols en triazolés a montré que les sols des cultures céréalières contenaient tous des résidus de tébuconazole avec une médiane située à 7,05 ng.g -1 .

Les parcelles qui n'avaient pas été traitées l'année des prélèvements et les parcelles en agriculture biologique présentaient, elles aussi, des résidus détectables, signe de la grande persistance de ces molécules et d'une potentielle diffusion provenant des parcelles voisines. En comparaison, 88% des sols étudiés issus des cultures maraichères contenaient quant à eux du difénoconazole mais dans des valeurs allant jusqu'à 414 ng.g -1 , ce qui semble dépendant de la formulation et/ou molécule appliquée et du nombre de traitements (plus important chez les maraichers).

Concernant la présence des A. fumigatus résistants aux triazolés, elle semble être fonction de l'échelle considérée et des quantités et de la nature des molécules triazolées appliquées. Les fleurs dans les massifs de plantes ornementales constituent, parmi les systèmes étudiés dans ce travail de thèse, la plus importante niche de souches résistantes. Cet environnement est considéré, en comparaison des différents autres domaines, comme un « hotspot » de résistance, ce qui est cohérent avec les observations issues de la littérature [START_REF] Doughty | Selection and amplification of fungicide resistance in Aspergillus fumigatus in relation to DMI fungicide use in agronomic settings: Hotspots versus coldspots[END_REF]. La provenance des bulbes et les traitements qu'ils ont reçus avant leur exportation, paraissent déterminants pour expliquer la présence de résistance dans les pots de fleurs, puisque ces bulbes sont la source de diffusion de ces isolats dans les sols et plus globalement dans l'environnement.

Dans cette étude les bulbes provenaient des Pays-Bas, où la résistance aux triazolés chez A. fumigatus dans l'environnement est largement décrite, ces bulbes de fleurs ont d'ailleurs déjà été décrit comme pouvant être une source de cette diffusion de résistance (Dunne et al., 2017).

Pour appuyer cette observation, le remplacement l'année N+1, des bulbes de fleurs traités aux triazolés, par des bulbes de fleurs issus de l'agriculture biologique, sans changement de sol, a permis de considérablement diminuer le niveau de résistance observé dans ces pots (passage de 71% de souches résistantes dans les sols ayant contenu des bulbes traités aux triazolés à 3% de souches résistantes dans ces mêmes sols contenant des bulbes issus de l'agriculture biologique), signe que ces bulbes semblent être la source directe de cette résistance.

Une différence en termes de proportion d'isolats résistants a également été observée entre les cultures céréalières (0% d'aR-Af) et les cultures maraichères (6% d'aR-Af). Cet écart pourrait en partie être expliqué par les réglementations en termes de traitements, les cultures maraichères peuvent être traitées jusqu'à 4 fois par an avec des formulations à base de triazolés d'après l'Anses, là où le nombre de traitement sur les cultures céréalière est limité à 2 par an. Cet écart, ainsi que l'influence du type de culture sur la présence des isolats fongiques dans les sols peuvent en partie expliquer les différences observées en termes de résistance entre les cultures maraîchères et céréalières. Ce constat souligne l'importance de l'effet dose concernant l'impact non intentionnel des résidus de fongicides dans les sols sur A. fumigatus, conséquence de l'émergence de résistance. La présence d'isolats d'A. fumigatus résistants a d'ailleurs déjà été décrite dans les champs agricoles en Asie [START_REF] Chen | high azole resistance in Aspergillus fumigatus isolates from strawberry fields, China, 2018[END_REF][START_REF] Cao | Prevalence of Azole-Resistant Aspergillus fumigatus is Highly Associated with Azole Fungicide Residues in the Fields[END_REF]. Cependant les normes applicables aux conditions de traitement sont différentes en fonction des pays et ce phénomène n'a jamais été décrit à cette échelle dans des pays européens.

Concernant les causes de la résistance, les analyses effectuées sur les isolats résistants retrouvés dans les cultures maraîchères et dans les pots de fleurs ont montré que la mutation TR34/L98H sur le gène Cyp51A, le mécanisme de résistance le plus décrit dans les isolats environnementaux (Sharma et al., 2015), est le plus largement retrouvé dans les isolats issus des sols étudiés (90,74%). Une autre mutation déjà décrite dans l'environnement (Chowdhary et al., 2013), TR46/Y121F/T289A, a également été retrouvée (8,33% des isolats résistants) dans les cultures maraîchères de notre région. L'isolat résistant restant (0,93%) ne présentait aucune mutation dans le gène Cyp51A. D'autres mécanismes, comme la surexpression de pompes d'efflux par exemple, peuvent être la source de cette résistance [START_REF] Meneau | Identification of Aspergillus fumigatus multidrug transporter genes and their potential involvement in antifungal resistance[END_REF]. La contamination des sols par les triazolés, notamment sur les cultures en pleine terre, implique des dommages écosystémiques au-delà de l'impact que l'on peut observer sur les populations d'A. fumigatus. Leur diffusion dans les sols, l'eau et l'air entraîne un risque d'exposition pour d'autres organismes non cibles, des microorganismes du sol notamment mais également des micromammifères, des oiseaux voire l'Homme [START_REF] Souders | Sub-lethal effects of the triazole fungicide propiconazole on zebrafish (Danio rerio) development, oxidative respiration, and larval locomotor activity[END_REF][START_REF] Béranger | Multiple pesticide analysis in hair samples of pregnant French women: Results from the ELFE national birth cohort[END_REF].

Trouver des moyens pour limiter la diffusion de ces molécules dans l'environnement est les sols, contrairement à d'autres matériaux adsorbants tels que les charbons actifs [START_REF] Landy | Remediation technologies using cyclodextrins: An overview[END_REF][START_REF] Yehya | Activated carbon, a useful medium to bind chlordecone in soil and limit its transfer to growing goat kids[END_REF][START_REF] Cova | Cyclodextrin Polymers and Cyclodextrin-Containing Polysaccharides for Water Remediation[END_REF]. D'un point de vue pratique, leur utilisation afin de limiter le transfert des fongicides vers les sols pourrait être envisagée en les greffant sur un tapis adsorbant dans lequel elles seraient piégées. Cette « barrière » sur laquelle elles seraient immobilisées pourrait être un matériau de type feutrine de chanvre. En effet, des tests in vitro sur le chanvre modifié ont montré que les capacités d'adsorption de ces feutrines étaient de l'ordre de 74% de rétention d'une solution de difénoconazole contre 33% pour le chanvre brut [START_REF] Godeau | Adsorption of a triazole antifungal agent, difenoconazole, on soils from a cereal farm: Protective effect of hemp felt[END_REF].

L'application de ces feutrines adsorbantes « vertes » serait envisageable dans certains domaines où la présence à la fois de résidus de triazolés et de souches d'A. fumigatus résistantes est avérée.

Ils pourraient ainsi être par exemple envisagés dans les scieries, pour limiter l'écoulement des solutions de traitement à base de triazolés vers les sols, durant l'étape d'égouttage des planches de bois après trempage dans les cuves (Jeanvoine et al., 2017).

Pour conclure, le développement de résistance aux triazolés chez A.fumigatus est un problème global qui nécessite que l'on comprenne le fonctionnement de cette moisissure au-delà de la sphère clinique. De nombreuses études démontrent le fonctionnement de cette moisissure dans les poumons, et son adaptation à l'hôte dans les cas d'infection [START_REF] Osherov | Interaction of the pathogenic mold Aspergillus fumigatus with lung epithelial cells[END_REF][START_REF] Gago | Lung colonization by Aspergillus fumigatus is controlled by ZNF77[END_REF][START_REF] Kirkland | Host lung environment limits Aspergillus fumigatus germination through an SskA-Dependent Signaling Response[END_REF]Fuller et al., 2022). Mais les données disponibles sur l'écologie même de cette espèce sont relativement faibles. Trop peu de données sont disponibles, hors cas cliniques, concernant l'écologie et l'habitat des pathogènes fongiques (A. fumigatus et mucorales notamment) alors que les résultats présentés ici permettent de conclure qu'il existe des différences en termes de population fongique selon les types de culture notamment.

Développer des études scientifiques dans le but de mieux comprendre quelles sont les conditions et processus qui favorisent le développement de ces populations fongiques dans les sols est indispensable afin de mieux comprendre, et donc de mieux faire face à l'émergence de ces résistances.

En ce qui concerne la contamination environnementale aux triazolés, l'emploi de feutrines de chanvre associées à une utilisation raisonnée de ces molécules peuvent permettre en partie d'éviter l'apparition d'un problème de santé publique. Bloquer la diffusion des fongicides triazolés dans les sols est une approche prometteuse pour limiter la pression de sélection qu'ils induisent sur les souches fongiques.

Perspectives

Etude des populations d'A. fumigatus en fonction des conditions environnementales :

Concernant les isolats d'A. fumigatus retrouvés dans ce travail de thèse, qu'ils soient résistants ou sensibles, un séquençage des gènes connus comme étant impliqués dans la résistance (Cyp51A ; Cyp51B ; HapE ; AtrI …) pourrait permettre de détecter des mutations.

D'éventuelles mutations qui ne permettent pas forcément de développer de la résistance à elles seules pourraient être identifiées et mises en lien avec l'émergence de la résistance via la reproduction de cette espèce par exemple.

Un génotypage par microsatellites sur l'ensemble des isolats résistants pourrait potentiellement permettre d'identifier des clusters, et d'évaluer la diffusion de ces derniers à différentes échelles, à l'intérieur d'une zone, entre les différentes zones, à l'échelle nationale et mondiale (Rocchi et al., 2021). Faire des liens entre les populations résistantes d'A.fumigatus est une nécessité pour mieux comprendre leur diffusion, particulièrement dans un contexte où la proximité génétique entre les souches résistantes retrouvées dans l'environnement et celles responsables d'infection chez les patients est avérée [START_REF] Rhodes | Population genomics confirms acquisition of drug-resistant Aspergillus fumigatus infection by humans from the environment[END_REF].

Afin de mieux comprendre l'écologie des populations d'A. fumigatus dans les sols, un suivi des communautés fongiques sur les mêmes parcelles dans le temps semble indispensable, parallèlement au suivi des traitements appliqués. Des analyses de métagénomique sur les sols, pourraient permettre de faciliter ces observations [START_REF] Sota | Metagenomic approach yields insights into fungal diversity and functioning[END_REF]. Bien que cette technique ne permette pas actuellement d'avoir la précision nécessaire pour identifier les communautés au niveau de l'espèce, elle donne une vue d'ensemble des populations présentes et pourrait permettre d'établir un suivi selon les conditions environnementales qui s'appliquent [START_REF] Sumbula | Impact of foliar application of fungicides on tomato leaf fungal community structure revealed by metagenomic analysis[END_REF].

Etude de l'inclusion entre les cyclodextrines et les molécules triazolées :

Afin de confirmer l'inclusion entre les cyclodextrines et les molécules triazolées mise en évidence par modélisation moléculaire, des analyses de spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) doivent être réalisées. A partir de cette technique, les constantes d'associations des différentes molécules pourraient être déterminées, ce qui permettrait d'évaluer l'impact de la structure géométrique de chaque molécule sur la capacité d'inclusion [START_REF] Zhao | NMR study on the inclusion complexes of β-Cyclodextrin with isoflavones[END_REF]. Les données spectroscopiques sur les (tri)azolés sont rares dans la bibliographie. Une technique particulière pourrait être la RMN DOSY (Diffusion Ordered Spectroscopy). Cette séquence RMN est actuellement très utilisée pour l'étude de la formation des complexes d'inclusion des cyclodextrines vis-à-vis de molécules pharmaceutiques et alimentaires, permettant la détermination de la constante d'association des complexes d'inclusion des molécules ayant des variations de déplacement chimique très faibles [START_REF] Ferrazza | DOSY-NMR and Raman investigations on the self-aggregation and cyclodextrin complexation of vanillin[END_REF]Chatzigiannis et al., 2021). Même dans le cas d'interaction faible entre la

Elément dosable

Limite de détection (µg.g -1 ) Limite de quantification (µg.g -

Techniques de microbiologie

Mise en culture des Aspergillus fumigatus

Pour les prélèvements de terre, 2 grammes de chaque prélèvement ont été re-suspendus dans 10 mL d'une solution de Tween 80 à 0,1%. Le mélange a été agité pendant 1 minute puis 100 µL ont été ensemencés sur différents milieux de culture :

• Milieu Dichloran-Glycérol (DG18) comme milieu de référence ;

• Milieux malt supplémentés des deux antifongiques médicaux itraconazole et Analyse des communautés par génotypage Titre : Evaluation de l'impact de la dissémination des fongicides triazolés en agriculture sur Aspergillus fumigatus et proposition de solutions.

Mots clés : triazolés, Aspergillus fumigatus, pollution environnementale, résistance aux antifongiques, cyclodextrines, agriculture Résumé : L'impact des activités anthropiques sur les services écosystémiques est avéré. Les études tournées vers l'environnement dans des approches pluridisciplinaires sont nécessaires pour mieux comprendre et limiter cet impact. L'une des problématiques majeures est le développement de la résistance aux antimicrobiens, dont un des exemples est la résistance d'Aspergillus fumigatus aux triazolés. Cette espèce de moisissure ubiquiste est un pathogène opportuniste pour l'Homme et les animaux. Les alternatives thérapeutiques pour combattre cette moisissure sont minces et sont essentiellement basées sur une famille de molécules, les triazolés. Des mécanismes de résistance à ces traitements sont décrits sur tous les continents et sont liés, en partie, à l'utilisation, dans l'environnement, de molécules triazolées pour combattre les moisissures phytopathogènes, dont les structures chimiques sont très proches des triazolés à usage médical. Cet impact, qualifié de non intentionnel, est une source d'émergence et de diffusion de souches fongiques résistantes. Ce travail de recherche vise à comparer différents domaines d'application des molécules triazolées, allant des champs de cultures céréalières aux exploitations maraîchères et aux parterres de plantes ornementales, afin de mieux comprendre les conditions d'émergence et/ou de diffusion de cette résistance. Cette approche multi-échelle a permis de mettre en évidence un gradient de résistance en fonction des domaines étudiés. Ainsi, alors que les sols des cultures céréalières ne présentent aucun isolat résistant, 71% des isolats retrouvés dans les plantes ornementales entourant le centre hospitalier de Besançon se sont avérés résistants aux triazolés, classifiant les bulbes de ces plantes traitées aux triazolés comme des « hotspots » potentiels de résistance. La transition vers l'utilisation de plantes à bulbes issues de l'agriculture biologique est nécessaire pour éviter l'exposition de populations à risque autour de l'hôpital notamment. Dans d'autres types d'agriculture où ces fongicides garantissent de bons rendements de production, des approches innovantes doivent être développées pour limiter l'émergence de ce problème de santé publique. Les cyclodextrines, molécules cages issues de la dégradation de l'amidon, semblent être une piste intéressante.

Title: Evaluation of the impact of the dissemination of triazole fungicides in agriculture on Aspergillus fumigatus and proposal of solutions.

Keywords: triazoles, Aspergillus fumigatus, environmental pollution, antifungal resistance, cyclodextrins, agriculture Abstract: The negative impact of human activities on the ecosystem is significant. Environmentally oriented studies in multidisciplinary approaches are needed to better understand and limit this impact. One of the major issues is the development of antimicrobial resistance, of which one example is the resistance of Aspergillus fumigatus to triazoles. This ubiquitous mould species is an opportunistic pathogen for humans and animals. The therapeutic alternatives to combat this fungus are few and essentially based on triazoles. However, mechanisms of resistance to these treatments have been described worldwide and are partly linked to the excessive use of triazole molecules in the environment to fight against phytopathogenic moulds, whose chemical structures are very close to those of triazoles in medical use. This impact, described as unintended, is a source of emergence and spread of resistant fungal strains. The aim of this research was to compare different areas of application of triazole molecules, ranging from cereal crop fields to vegetable farms and ornamental plant beds, in order to better understand the conditions in which this resistance develops. This multiscale approach enabled us to highlight a gradient of resistance according to the areas studied. Thus, while the soils of cereal crops did not present any resistant isolates, 71% of the isolates found in the ornamental plants surrounding Besancon hospital centre proved to be resistant to triazoles, classifying the bulbs of these triazole-treated plants as potential resistance "hotspot". Therefore, the transition to the use of organically grown bulbous plants is necessary to avoid exposure of populations at risk, especially around the hospital. While in certain agricultural types where these fungicides guarantee good production yields, innovative approaches must be developed to limit the emergence of this public health problem. Cyclodextrins, cage molecules resulting from the degradation of starch, seem to be an interesting avenue.

Université Bourgogne Franche-Comté 32, avenue de l'Observatoire 25000 Besançon

Figure 1 :Figure 2 :

 12 Figure 1 : Diffusion des pesticides dans l'environnement suite aux traitements des cultures. 30 Figure 2 : Les cycles triazolés[START_REF] Ram | Chapter 5-Five-membered heterocycles[END_REF] ________________________________ 33

Figure 5 :Figure 6 :Figure 7 :

 567 Figure 5: Principaux types de cultures traitées avec des molécules triazolées dans les pays d'Europe. D'après les données de l'European Crop Protection (2016) ________________ 38Figure 6 : Augmentation de l'usage estimé de 5 molécules triazolées dans le domaine agricole aux Etats-Unis entre 1992 et 2019. D'après les valeurs de l'U.S.G.S. _________________ 39 Figure 7 : Distribution des différentes substances actives retrouvées dans l'atmosphère avec des concentrations inférieures à 1 ng.m -3 , comprises entre 0,1 et 1 ng.m -3 et supérieures à 1 ng.m -3. Les nombres entre parenthèses correspondent aux nombres totaux d'échantillons dans lesquels la substance active concernée a été retrouvée. Encadrées en rouge et de haut en bas, les molécules triazolées époxiconazole, tétraconazole, tébuconazole et difénoconazole[START_REF] Désert | Spatial and temporal distribution of current-use pesticides in ambient air of Provence-Alpes-Côte-d'Azur Region and Corsica, France[END_REF]. _______________________________________________________________ 40

Figure 17 :Figure 18 :Figure 19 :Figure 20 :Figure 21 :Figure 22 :Figure 23 :Figure 24 :Figure 25 :

 171819202122232425 Figure 17 : Structures chimiques des molécules triazolées à usage environnemental (gauche) et à usage médical (droite). ___________________________________________________ 62 Figure 18 : Organisation du travail de thèse. Réalisé avec Biorender _________________ 66 Figure 19 : Cartographie des 11 parcelles prélevées en Lorraine (Zone Atelier Moselle). Les parcelles en agriculture biologique sont représentées en vert, celles en rose ont reçu un traitement au tébuconazole. Les agglomérations apparaissent en gris. Le fond de carte est issu d'OpenStreetMap. __________________________________________________________ 69Figure 20 : Cartographie des 11 parcelles prélevées en Bourgogne (zone d'étude gérée par l'UMR 1347 Agroécologie de Dijon). Les parcelles en rouge ont reçu du metconazole, celle en bleu du prothioconazole, celles en rose un mélange de prothioconazole et de tébuconazole. Les agglomérations apparaissent en gris. Le fond de carte est issu d'OpenStreetMap. _______ 70 Figure 21 : Diagramme en violon de la répartition des sols pour chaque région en fonction des valeurs de capacité d'échange cationique (cmole(+).kg -1 ), de matière organique (en %) et de pH. ___________________________________________________________________ 71 Figure 22 : Triangle de texture des sols de Bourgogne et de Lorraine et diagramme à bulles du carbone organique total retrouvé dans les 22 sols analysés. _________________________ 72 Figure 23 : Dosage en chromatographie phase gazeuse triple quadripôle (GC-MS/MS) des résidus de fongicides triazolés (en ng.g-1 MS de sol) présents dans chaque parcelle. Les parcelles en agriculture biologique sont encadrées en vert ; * : parcelles n'ayant pas été traitées avec la molécule retrouvée l'année concernée. _____________________________ 73 Figure 24 : Quantités de résidus de tébuconazole dans les 22 parcelles étudiées (de Lorraine et Bourgogne) en fonction du traitement appliqué sur les cultures. ____________________ 74 Figure 25 : Exemples de boîtes de culture obtenues après ensemencement de sol et incubation à l'étuve à 48°C (DG18 = Dichloran-Glycérol ; Mitra = milieu malt supplémenté en itraconazole ; Mvori = milieu malt supplémenté en voriconazole), les isolats de la section Fumigati sont entourés en rouge. ______________________________________________ 76 Figure 26 : Nombre d'isolats de la section Fumigati retrouvés dans les sols des 2 régions prélevées, les parcelles encadrées en vert sont les parcelles en agriculture biologique. ____ 76 Figure 27 : Nombre d'isolats de la section Fumigati retrouvés dans les 22 parcelles étudiées en fonction de la culture en place sur ces parcelles ou du traitement fongicide appliqué. __ 78 Figure 28 : ADN fongique total retrouvé dans chaque sol des grandes cultures, la moyenne des quantités pour chaque région est représentée par une ligne horizontale (exprimé en ng.µL -1 ) et quantité d'ADN d'Aspergillus fumigatus correspondante (exprimée en fg.µL -1 ). __________ 79 Figure 29 : Quantité d'ADN fongique totale dans les sols en fonction du traitement fongicide appliqué. _________________________________________________________ 80 Figure 30 : Cercle des corrélations issu de l'analyse en composante principale des données obtenues sur les sols des cultures céréalières. ____________________________________ 81 Figure 31 : ADN fongique total (exprimé en ng.µL -1 ) retrouvé dans 7 sols issus des pots de fleurs des zones A et D et quantité d'ADN d'Aspergillus fumigatus correspondante (exprimée en fg.µL -1 ). Les sols ont été classés par ordre croissant de souche(s) d'Aspergillus fumigatus résistantes retrouvées en culture. _____________________________________________ 100

Tableau 9 :

 9 Détails des données des 11 parcelles prélevées en Lorraine (Zone Atelier Moselle). _________________________________________________________________________ 70 Tableau 10 : Détails des données des 11 parcelles prélevées en Lorraine (zone d'étude gérée par l'UMR 1347 Agroécologie de Dijon).________________________________________ 71 Tableau 11: Extrait des valeurs des éléments traces retrouvés dans les sols (en mg.kg -1 MS) pour la Lorraine et la Bourgogne. <LDM = inférieur à la limite de détection). __________ 75 Tableau 12 : Facteur d'augmentation des concentrations minimales inhibitrices (CMI) observées pour 6 souches d'Aspergillus fumigatus testées selon la méthode EUCAST en présence des fongicides metconazole, propiconazole, bromuconazole et époxiconazole. Les CMIs ont été mesurées en présence des cyclodextrines β-CD et HP-β-CD ajoutées au milieu de culture à un rapport molaire de 10 :1. _______________________________________ 136 Tableau 13 : Bilan des résultats observés dans les différents domaines étudiés. _________ 219 Tableau 14 : Paramètres optimisés de la mesure des triazoles étudiés en GC-MS/MS ____ 270 Tableau 15 : Liste des éléments dosés en ICP-AES et limites de détection et de quantification correspondantes. __________________________________________________________ 271 Tableau 16 : Résultats du dosage par ICP-AES (en µg.g -1 ) de 25 éléments recherchés dans 11 sols de cultures céréalières de Lorraine. _______________________________________ 278 Tableau 17 : Résultats du dosage par ICP-AES (en µg.g -1 ) de 25 éléments recherchés dans 11 sols de cultures céréalières de Bourgogne. _____________________________________ 280 20 Liste des abréviations ADN : acide désoxyribonucléique AI : aspergillose invasive Anses : Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail aR-Af : Aspergillus fumigatus résistant aux azolés CD : cyclodextrine CDC : Center for Disease Control and prevention CEC : capacité d'échange cationique CHU : centre hospitalier universitaire CMI : concentration minimale inhibitrice DIMEB : Heptakis(2,6-di-O-methyl)-β-cyclodextrine DG18 : dichloran-glycérol DMI : inhibiteur de la déméthylation DOSY : diffusion ordered spectroscopy ECDC : European Center for Disease prevention and Control EFSA : European Food Safety Authority EUCAST : European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing FRAC : Fungicide Resistance Action Committee GC-MS-MS : chromatographie gazeuse triple quadripôle GUS : indice d'ubiquité dans l'eau souterraine de Gustafson HP-β-CD : 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrine ICP-AES : inductively coupled plasma-atomic emission spectroscopy Mitra : malt-itraconazole Mvori : malt-voriconazole MO : matière organique M€ : million d'euros ONU : Organisation des Nations Unies PCR : polymerase chain reaction qPCR : quantitative-polymerase chain reaction RMN : spectroscopie de résonance magnétique nucléaire RPMI : milieu de culture Roswell Park Memorial Institute STRAf : short tandem repeat for A. fumigatus TB : tuberculose TRIMEB : heptakis-(2,3,6-tri-O-méthyl)-β-cyclodextrine USGS : United States geological survey Résumé L'impact des activités anthropiques sur les services écosystémiques est avéré. Les études tournées vers l'environnement dans des approches pluridisciplinaires sont nécessaires pour mieux comprendre et limiter cet impact. L'une des problématiques majeures est le développement de la résistance aux antimicrobiens, dont un des exemples est la résistance d'Aspergillus fumigatus aux triazolés. Cette espèce de moisissure ubiquiste est un pathogène opportuniste pour l'Homme et les animaux. Les alternatives thérapeutiques pour combattre cette moisissure sont minces et sont essentiellement basées sur une famille de molécules, les

Figure 1 :

 1 Figure 1 : Diffusion des pesticides dans l'environnement suite aux traitements des cultures.

2. 1 .

 1 Fongicides (tri)azolés 2.1.1. Historique de l'utilisation des (tri)azolés en agriculture Les fongicides azolés sont des composés organiques hétérocycliques constitués de 5 atomes avec au moins un atome d'azote. Cette famille chimique regroupe différentes sous-familles dont les triazolés qui se caractérisent par la présence de 3 atomes d'azote et de 2 atomes de carbone sur leur cycle insaturé (Figure 2).

Figure 2 :

 2 Figure 2 : Les cycles triazolés[START_REF] Ram | Chapter 5-Five-membered heterocycles[END_REF]

Figure 3 :

 3 Figure 3 : Voie de synthèse de l'ergostérol et action des antifongiques (tri)azolés.

Figure 4 :

 4 Figure 4 : Action des molécules azolées sur la membrane fongique. Une accumulation de stérols toxiques dans la membrane induit un effet fongistatique (Mycoses Study Group Education and Research Consortium, 2014).

Figure 5 :

 5 Figure 5: Principaux types de cultures traitées avec des molécules triazolées dans les pays d'Europe. D'après les données de l'European Crop Protection (2016)

Figure 6 :

 6 Figure 6 : Augmentation de l'usage estimé de 5 molécules triazolées dans le domaine agricole aux Etats-Unis entre 1992 et 2019. D'après les valeurs de l'U.S.G.S.

Figure 7 :

 7 Figure 7 : Distribution des différentes substances actives retrouvées dans l'atmosphère avec des concentrations inférieures à 1 ng.m -3 , comprises entre 0,1 et 1 ng.m -3 et supérieures à 1 ng.m -3 . Les nombres entre parenthèses correspondent aux nombres totaux d'échantillons dans lesquels la substance active concernée a été retrouvée.Encadrées en rouge et de haut en bas, les molécules triazolées époxiconazole, tétraconazole, tébuconazole et difénoconazole[START_REF] Désert | Spatial and temporal distribution of current-use pesticides in ambient air of Provence-Alpes-Côte-d'Azur Region and Corsica, France[END_REF].

  . Le difénoconazole et le tébuconazole ont aussi été mis en évidence par Pan et al. (2019) comme étant parmi les molécules les plus fréquemment retrouvées dans les sols agricoles du nord de la Chine (Figure 8). Mais la plupart des données proviennent d'études européennes. Hvězdová et al. (2018) ont par exemple montré que plus de 70% des sols de République Tchèque qu'ils ont étudiés contenaient des triazolés. L'époxiconazole, le tébuconazole, le flusilazole et le propiconazole étaient les molécules les plus retrouvées avec 48%, 36%, 23% et 13% des sols contaminés respectivement. Une étude menée par Silva et al. (2019) sur 317 sols d'Europe a montré que l'époxiconazole et le tébuconazole faisaient partie des 7 composés les plus fréquemment retrouvés dans les sols sur les 76 molécules dont les résidus ont été dosés, avec respectivement les 3 e et 7 e position (Figure 9 A). Les résultats observés pour certains pays d'Europe sont présentés (Figure 9 B). Les triazolés sont fréquemment retrouvés dans les sols en mélange avec d'autres familles de pesticides, notamment les carboxamides comme le boscalid, ou bien les organophosphorés comme le glyphosate. Plusieurs molécules triazolées peuvent également être retrouvées ensemble dans le même prélèvement de sol : c'est souvent le cas de l'époxiconazole et du tébuconazole.

Figure 8 :Figure 9 :

 89 Figure 8 : Distribution des résidus de difénoconazole (A) et de tébuconazole (B) dans des sols agricoles de Chine en mg.kg -1 (Pan et al., 2019).

  les triazolés, Conde-Cid et al. (2019) ont montré que la MO augmentait les capacités d'adsorption du propiconazole dans les sols. Ces résultats ont également été observés par Gondar et al. (2013) qui ont souligné l'importance des groupes carboxyliques présents dans la MO pour l'adsorption du penconazole. Des tests d'adsorption in vitro sur cette même molécule dans des sols amendés en MO ont montré que ce paramètre jouait un rôle dominant dans l'adsorption du penconazole dans les sols (Aït Hammi et al., 2019). Sánchez-Martín et al. (2000) ont décrit l'importance de la MO dans l'adsorption des triazolés, soulignant le risque d'accumulation en surface des sols. Siek et al. (2021) ont caractérisé cette adsorption : le tébuconazole interagit avec la MO par la formation d'interactions hydrophobe, de liaisons hydrogènes et d'interactions π-π (Figure 10).

  (A) : attraction mutuelle de 2 molécules ayant peu d'affinité pour l'eau par des forces de van der Waals (forces de dispersion, forces de London…) (B) : liaison intermoléculaire entre un atome d'hydrogène lié de façon covalente à un atome très électronégatif et un atome électronégatif porteur d'un doublet non liant (C) : interactions non covalentes entre des cycles aromatiques contenant des liaisons π

Figure 10 :

 10 Figure 10 : Représentations schématiques de (A) l'interaction hydrophobe (B) la liaison hydrogène et (C) les interactions π-π. Réalisé avec Biorender

Tableau 5 :

 5 Date de réévaluation de l'agrément de molécules triazolées et leurs classifications en Europe, en rouge les molécules retirées du marché, en vert les molécules dont l'agrément peut encore être renouvelé. D'après l'European Comission of Food Safety, Règlement (CE) 1272/2008en cas d'ingestion H317 : peut provoquer une réaction allergique de la peau H319 : provoque une grave irritation des yeux H332 : nocif en cas d'inhalation H351 : susceptible de provoquer le cancer H360D : peut nuire à l'enfant à naître H360Df : peut nuire à l'enfant à naître, susceptible de nuire à la fertilité H361d : suspecté de nuire à l'enfant à naître H400 : très toxique pour la vie aquatique H410 : très toxique pour la vie aquatique avec des effets à long terme H411 : toxique pour la vie aquatique avec des effets à long terme La présence des triazolés dans tous les compartiments eau, air et sol intensifie les risques d'exposition : ces molécules peuvent ainsi avoir des effets néfastes sur les animaux aquatiques, les oiseaux ou bien encore les mammifères. Le risque de bioaccumulation de ces résidus dans

  triazoles sont considérés comme une classe de pesticides pouvant également induire des symptômes aigus. La présence de résidus dans l'environnement et l'ingestion de nourriture contaminée peuvent avoir des conséquences néfastes sur la santé humaine. Un rapport de l'EFSA publié en 2018 montre en effet que sur 12 168 échantillons de nourriture provenant de plus de 30 pays d'Europe, la moitié présentait des quantités détectables pour certains des 157 pesticides étudiés. Le tébuconazole et le difénoconazole faisaient partie des pesticides les plus fréquemment retrouvés dans les choux, les poireaux, les pêches ou bien encore les fraises (EFSA authority, 2018). De nombreux modèles visant à évaluer le risque toxique lié à l'exposition aux triazolés ont été établis (van der Ven et al., 2020). Ces études soulignent le nombre important de fonctions biologiques qui peuvent être perturbées chez l'Homme et entrainer différentes pathologies et/ou symptômes (Figure 11).

Figure 11 :

 11 Figure 11 : Exemples de risques liés à une exposition aux pesticides, dont les triazolés, chez l'Homme. D'après Yura et al. 2021. Réalisé avec Biorender

Figure 12 :

 12 Figure 12 : Modification de la sensibilité des populations de Zymoseptoria tritici isolées dans le nord de l'Allemagne entre 1999 et 2020, aux triazolés,tébuconazole (AI ; BI) et propiconazole (AII ; BII). Les données sur l'efficacité des différentes concentrations de fongicides sont exprimées en pourcentage de réduction de la croissance fongique par rapport au témoin non traité. (BI-BII) Comparaison des valeurs de la EC50 (mg.L -1 ). Lesvaleurs de la EC50 ont été déterminées comme étant la concentration de fongicide réduisant la croissance fongiquede 50 % (p ≤ 0,05).[START_REF] Birr | Temporal Changes in Sensitivity of Zymoseptoria tritici Field Populations to Different Fungicidal Modes of Action[END_REF].

Figure 13 :

 13 Figure 13 : Observations macroscopique (après culture sur gélose DG18 pendant 4 jours à 37°C) et microscopique (coloration au bleu de lactophénol) de colonies d'Aspergillus fumigatus.

  Aujourd'hui, un nombre relativement faible de molécules aux modes d'action différents sont disponibles pour le traitement des pathologies fongiques chez l'Homme. Les pathologies causées par A. fumigatus sont principalement traitées par des perturbateurs de l'intégrité membranaire. L'arsenal thérapeutique disponible contre A. fumigatus est donc restreint (Figure15). La découverte de nouvelles molécules antimicrobiennes d'origine naturelle est rare et le développement de dérivés d'origine synthétique est un processus long s'appuyant souvent sur des molécules déjà commercialisées.

Figure 14 :

 14 Figure 14 : Principales pathologies causées par Aspergillus fumigatus et leurs incidences. D'après Bowyer & Denning, 2014.

Figure 15 :

 15 Figure 15 : Les modes d'actions des différentes familles d'antifongiques sur la cellule fongique. Encadrées en rouge les familles de molécules utilisées préférentiellement dans le traitement des pathologies aspergillaires. Réalisé avec Biorender.

Figure 16 :

 16 Figure 16 : Épidémiologie mondiale des fréquences de résistance (en %) aux azolés dans les isolats cliniques et environnementaux d'Aspergillus fumigatus.(Lestrade et al., 2019b)

Figure 17 :

 17 Figure 17 : Structures chimiques des molécules triazolées à usage environnemental (gauche) et à usage médical (droite).

Figure 18 : 4 .

 184 Figure 18 : Organisation du travail de thèse. Réalisé avec Biorender

Figure 21 :

 21 Figure 21 : Diagramme en violon de la répartition des sols pour chaque région en fonction des valeurs de capacité d'échange cationique (cmole(+).kg -1 ), de matière organique (en %) et de pH.

Figure 22 :

 22 Figure 22 : Triangle de texture des sols de Bourgogne et de Lorraine et diagramme à bulles du carbone organique total retrouvé dans les 22 sols analysés.

Figure 23 :

 23 Figure 23 : Dosage en chromatographie phase gazeuse triple quadripôle (GC-MS/MS) des résidus de fongicides triazolés (en ng.g -1 MS de sol) présents dans chaque parcelle. Les parcelles en agriculture biologique sont encadrées en vert ; * : parcelles n'ayant pas été traitées avec la molécule retrouvée l'année concernée.

  a été réalisée afin de pouvoir corréler la présence de résidus de tébuconazole dans les sols avec le traitement appliqué sur les cultures.Bien qu'aucune différence statistiquement significative n'ait été mise en évidence, des tendances montrent que les sols non traités l'année des prélèvements et ceux en agriculture biologique sont globalement peu contaminés en tébuconazole (Figure24). Le même constat peut être fait pour les parcelles traitées au prothioconazole. Le sol le plus contaminé au tébuconazole avait été traité avec cette molécule l'année concernée. Cependant, les autres sols traités au tébuconazole semblent présenter des quantités de résidus de cette molécule plus faible que les sols ayant été traités au metconazole. Une diffusion depuis des parcelles voisines, ou bien une contamination suite à l'utilisation de matériel de traitement commun aux deux molécules pourraient expliquer ces observations. Un dosage par ICP-AES des éléments dits majeurs et des éléments traces a été réalisé pour 25 éléments dans chaque parcelle dans l'objectif d'évaluer si la présence de ces éléments dans les sols était susceptible d'influencer l'adsorption des triazolés.

  l'arsenic pour DJP, LIP et SFP et le cuivre pour PP, TP, GCP, BP et LIP). Leur utilisation dans d'anciennes formulations fongicides pourrait expliquer ces observations, malgré l'interdiction de leur utilisation en grandes cultures depuis 2016.

Figure 24 :

 24 Figure 24 : Quantités de résidus de tébuconazole dans les 22 parcelles étudiées (de Lorraine et Bourgogne) en fonction du traitement appliqué sur les cultures.

Figure 25 :

 25 Figure 25 : Exemples de boîtes de culture obtenues après ensemencement de sol et incubation à l'étuve à 48°C (DG18 = Dichloran-Glycérol ; Mitra = milieu malt supplémenté en itraconazole ; Mvori = milieu malt supplémenté en voriconazole), les isolats de la section Fumigati sont entourés en rouge.

Figure 26 :

 26 Figure 26 : Nombre d'isolats de la section Fumigati retrouvés dans les sols des 2 régions prélevées, les parcelles encadrées en vert sont les parcelles en agriculture biologique.

Figure 27 :

 27 Figure 27 : Nombre d'isolats de la section Fumigati retrouvés dans les 22 parcelles étudiées en fonction de la culture en place sur ces parcelles ou du traitement fongicide appliqué.

Figure 28 :

 28 Figure 28 : ADN fongique total retrouvé dans chaque sol des grandes cultures, la moyenne des quantités pour chaque région est représentée par une ligne horizontale (exprimé en ng.µL -1 ) et quantité d'ADN d'Aspergillusfumigatus correspondante (exprimée en fg.µL-1 ).

Figure 29 :

 29 Figure 29 : Quantité d'ADN fongique totale dans les sols en fonction du traitement fongicide appliqué.

Figure 30 :

 30 Figure 30 : Cercle des corrélations issu de l'analyse en composante principale des données obtenues sur les sols des cultures céréalières.

4. 3 .

 3 Origine de la présence de souches d'Aspergillus fumigatus résistantes dans les massifs de tulipes Titre de l'article: Azole-resistant Aspergillus fumigatus in the hospital: Surveillance from flower beds to corridors Revue : American Journal of Infection Control, volume 48 Indices de publication : IF=1,92 -Q1 Etat : Publié, 2019

2 1

 2 Medical Mycology, 2021, 59, 741-743 doi:10.1093/mmy/myab007 Advance Access Publication Date: 4 March 2021 Brief Report Brief Report One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate Steffi Rocchi 1,2, * , Chloé Godeau 2 , Emeline Scherer 1,2 , Gabriel Reboux 1,2 and Laurence Millon 1,Parasitology-Mycology Department, University Hospital, 25000, Besançon, France and 2 Chrono-Environnement UMR 6249 CNRS, Bourgogne Franche-Comté University, 25000, Besançon, France

  d'autres types d'agriculture, les alternatives d'agriculture biologique ne sont pas si aisées à mettre en place de façon systématique. Il apparaît cependant indispensable de prendre conscience qu'un usage plus raisonné de ces molécules est essentiel, par exemple en culture céréalière. De plus, trouver des moyens applicables à plus petite échelle (e.g. industrie du bois, cultures maraîchères) pour limiter la diffusion de ces molécules triazolées et éviter les impacts dont elles sont responsables est également nécessaire.

.

  Elles présentent une structure de cylindre conique avec une cavité indéformable et hydrophobe qui leur confère la capacité d'encapsuler d'autres molécules au moyen de relation de type « hôte-invité ». constituent, l'α-CD, la β-CD et la γ-CD (D'Souza & Lipkowitz, 1998).

Figure 32 :

 32 Figure 32: Représentation schématique de (a) la structure chimique et (b) de la structure tridimensionnelle des cyclodextrines ; (c) structures chimiques et dimensions des α-; β-et γ-cyclodextrines (n= 6,7 et 8 respectivement).[START_REF] Crini | Cyclodextrins, from molecules to applications[END_REF]

Titre•

  de l'article : Reducing the unintentional impact of triazole fungicides on Aspergillus fumigatus: are cyclodextrins a solution? Revue : Journal of Environnemental Science and Public Health, volume 5 Indices de publication : IF=3,6 Etat : Publié, 2021 Hypothèses de travail : • Les cyclodextrines sont des molécules capables d'interagir avec les triazolés par formation d'un complexe d'inclusion.• Ce complexe d'inclusion empêche l'action fongistatique des molécules triazolées sur des isolats d'Aspergillus fumigatus.• L'usage environnemental des cyclodextrines pourrait permettre de limiter la diffusion des triazolés dans les écosystèmes.Résumé en français :Les triazolés comptent parmi les fongicides les plus utilisés en agriculture, pour la protection des matériaux et des cultures. Leur large spectre d'action en fait des substances de choix pour la prévention et le traitement de maladies fongiques telles que la septoriose ou la fusariose.Cependant, leur diffusion dans l'environnement peut conduire à la sélection de résistance aux triazolés non seulement chez les pathogènes des cultures, mais aussi chez des organismes non ciblés, comme un champignon non phytopathogène, Aspergillus fumigatus. Ce champignon est un pathogène humain opportuniste associé à une mortalité élevée en cas de résistance aux traitements pharmacologiques à base de triazolés. Il est donc nécessaire de trouver des moyens pour limiter l'impact involontaire des fongicides sur ce pathogène. Nous décrivons ici l'impact des dextrines linéaires (maltodextrine) ou cycliques (cyclodextrines, CDs) et leur interaction avec deux fongicides (difénoconazole et tébuconazole), à travers des mesures de croissance de 20 souches d'A. fumigatus. Trois dextrines natives (α-CD, β-CD et γ-CD) et deux modifiées (hydroxypropyl-β-CD (HP-β-CD) et heptakis-(2,3,6-tri-O-méthyl)-β-CD (TRIMEB)) ont été utilisées. Dans chaque expérience, la concentration minimale inhibitrice (CMI) a été déterminée selon la méthode préconisée par l'European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). Des observations microscopiques ont également été réalisées pour mettre en évidence l'effet de la présence des dextrines par rapport à des milieux classiques sans dextrines. L'HP-β-CD est la dextrine cyclique la plus efficace. Elle a réduit l'activité antifongique des triazolés, alors que la maltodextrine et l'α-CD n'ont eu aucun effet. Ces observations ont été approfondies grâce à la modélisation moléculaire afin de clarifier les interactions cyclodextrine/fongicide. L'utilisation de cyclodextrines est une approche prometteuse pour limiter l'émergence de la résistance aux fongicides de type triazolés. Eléments essentiels : • Les cyclodextrines sont étudiées afin d'évaluer leur capacité à interagir avec 2 triazolés, le difénoconazole et le tébuconazole en utilisant A. fumigatus comme modèle biologique ; Une diminution de l'activité des triazolés (et donc une augmentation de la concentration minimale inhibitrice (CMI)) sur la moisissure en présence de cyclodextrine est le signe d'une interaction cyclodextrine/triazolé potentielle ; • Une dextrine linéaire (maltodextrine) et 5 cyclodextrines (α-CD ; β-CD ; γ-CD ; HP-β-CD et TRIMEB) ont été étudiées ; • L'HP-β-CD induit l'augmentation de CMI la plus importante alors que la dextrine linéaire n'a pas d'effet, signe d'une inclusion potentielle du triazolé dans la cavité de l'HP-β-CD, inclusion confirmée par modélisation moléculaire ; • Le piégeage des triazolés au sein de la cavité de l'HP-β-CD par formation d'un complexe d'inclusion semble être une bonne piste d'étude pour limiter la diffusion environnementale de ces composés ; substances of choice for preventing and curing fungal diseases such as Septoria or Fusarium wilt. However, their spread in the environment can lead to the selection of triazole resistance not only in crop pathogens, but also in non-target organisms, such as a non-phytopathogenic fungus Aspergillus fumigatus. This fungus is an opportunistic human pathogen associated with high mortality in cases of resistance to pharmacological treatments based on triazoles. There is therefore a need to find ways of limiting the unintended impact of fungicides on this pathogen. We describe here the impact of linear (maltodextrin) or cyclic (cyclodextrins, CDs) dextrins and their interaction with two fungicides (difenoconazole and tebuconazole), through measurements of growth in 20 A. fumigatus strains. Three native (α-CD, β-CD and -CD) and two modified (hydroxypropyl-β-CD (HP-βperformed to highlight the effect of the presence of dextrins. HP-β-CD was the most effective cyclic dextrin. It reduced the antifungal activity of triazoles, whereas maltodextrin and α-CD had no effect. Those observations were more investigated thanks to molecular modeling in order to clarify cyclodextrin/fungicide interactions. The use of cyclodextrins is a promising approach for limiting the emergence of resistance to triazole antifungal drugs.

  2,4-triazole) and tebuconazole (TEBU, 1-(4-chlorophenyl)-4,4-dimethyl-3-(1,2,4-triazol-1ylmethyl)pentan-3-ol) were purchased from Sigma Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). Their structure and main characteristics are presented in

2. 3

 3 Figure 1 and they are described in Table2.

Figure 1 :1

 1 Figure 1: Chemical structures of linear and cyclic dextrins; a) maltodextrin (MALTO; n  6); b) α-cyclodextrin (α-CD, n = 6), β-cyclodextrin (β-CD, n = 7) and γ-cyclodextrin (γ-CD, n = 8); c) general structure of native α-, β-, and γ-cyclodextrins; and of two modified β-cyclodextrins: d) hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD) and e) heptakis-(2,3,6-tri-O-methyl)-β-cyclodextrin (TRIMEB).

Figure 2 :

 2 Figure 2: Picture of part of the EUCAST plate for the 4E007 strain with difenoconazole in (A) RPMI medium, (B) medium supplemented by HP-β-CD at a molar ratio of 10 dextrin molecules per molecule of fungicide. Minimum inhibitory concentrations are indicated by a red circle for each set of conditions: "x4" (increase by a factor of 4), corresponding to the increase in MIC relative to the triazole in RPMI alone.

(

  AIC) was used to select the most parsimonious models (including random effects and/or interactions between variables). A linear mixed-effects model (LMM) was applied incorporating a random effect of

Figure 3 :

 3 Figure 3: Predicted values of minimum inhibitory concentrations as a function of medium (RPMI reference medium or RPMI supplemented with dextrins), with strain integrated into the mixed-effects model as a random effect. The dextrins used were MALTO: maltodextrin; α-CD: α-cyclodextrin; γ-CD: γ-cyclodextrin; TRIMEB: heptakis-(2,3,6tri-O-methyl)-β-cyclodextrin; β-CD: β-cyclodextrin; and HP-β-CD: hydroxypropyl-β-cyclodextrin.

  MIC was observed for 14/20, 17/20 and 20/20 for TRIMEB, β-CD and HP-β-CD, respectively. The effect seemed particularly strong with HP-β-CD, increasing MICs relative to TRIMEB and β-CD.For TEBU, the effects on growth of TRIMEB, β-CD and HP-β-CD were less pronounced than for strains, respectively. Only one strain displayed an increase in MIC by a factor of 4, on medium supplemented with HP-β-CD against 9 for

3 :

 3 CD: γ-cyclodextrin; TRIMEB: heptakis-(2,3,6-tri-O-methyl)-β-cyclodextrin; β-CD: β-cyclodextrin; HP-β-CD: hydroxypropyl-β-cyclodextrin "x2" or "x4" indicates the factor increase in MIC in each set of conditions Table Increases in minimum inhibitory concentrations (MICs) observed on EUCAST plates for 20 A. fumigatus strains in different conditions, in the presence of the fungicide difenoconazole (DIFENO) or tebuconazole (TEBU).

Figure 4 :

 4 Figure 4: Micrographs of A. fumigatus(strain 4E026), comparing its growth between dextrin-free RPMI medium and RPMI medium supplemented with linear or cyclic dextrins at a molar ratio of 10:1. The observations presented were obtained with a fungicide concentration of 2 mg/L for tebuconazole and 1 mg/L for difenoconazole, corresponding to the MICs of these fungicides in dextrin-free RMPI medium. The slides were observed under a light microscope, at a magnification of x 400.

  calculated (RMSD) for the optimized CDs as a function of MD simulations time. Whatever the system, cyclodextrins were found very stable since RMSD displayed values less than 2Å. -CD and HPβ-CD being a bit more mobile due to the larger diameter of -CD and the high flexibility of hydroxypropyl groups of HP-β-CD. The interaction of antifungal agents with cyclodextrins and their random incorporation were investigated on the course of the MD simulation runs. Distances between the centers of mass of the CDs and the ligands were analyzed as a function of time (Figure 5). During the 200 ns of MD simulation, DIFENO was found to enter in β-CD, γ-CD and HP-β -CD but not in α-CD. The time scale necessary for the molecules to incorporate into CDs is also a marker of the strength of the interaction between antifungals and CDs. Lesser this time is and stronger the antifungal/CD interaction is. DIFENO incorporated β-CD after about 70 ns, γ-CD after 20 ns and bound in less than 10 ns to HP-β-CD.

Figure 5 :

 5 Figure 5: Distance between the center of mass of cyclodextrins (α-CD, β-CD, γ-CD and HP-β-CD) and difenoconazole.

Figure 6 :

 6 Figure 6: Most favorable configurations of DIFENO obtained in (A) β-CD, (B) γ-CD and (C) HP-β-CD.

  demonstrated in this study. A decrease in the antifungal activity of DIFENO and TEBU fungicides

  Several studies have already reported interactions between CDs and fungicides[63][64][65][66][67][START_REF]68 0 P & 4 P$ 0 I6! 4 1 I!8 I 01-Q8 9% 8 8 9% 8 6% 8 6[END_REF]. However, to our knowledge, publications on the interaction between triazole fungicides and CDs are rare. Our results are consistent with those ofStepniak et al. [69], who studied the host-guest interaction of β-CD with TEBU and demonstrated, by calculating the constant for complex formation, a high affinity of β-CD molecules for the non-polar functional groups of TEBU (parachlorobenzyl and tert-butyl groups) present in the hydrophobic cavity.Balmas et al. [70] also demonstrated the formation of a stable complex between TEBU and β-CD, arguing that this complex could be used to control plant diseases in agriculture through the prolonged release of fungicide. However, our results temper the statements ofStepniak et al.

  favoring the emergence of resistance in this microorganism. In this study, we highlight the potential role of cyclodextrins in limiting this phenomenon. Indeed, cyclodextrins can encapsulate triazoles before they spread in the soil, without affecting the efficacy of foliar treatment. This would eliminate the potential selection pressure exerted on A. fumigatus by triazoles in the soil. This study sheds light on the cyclodextrin/triazole interaction and the effect on A. fumigatus, providing a strong first argument in favor of their use in the environment. Molecular modeling confirmed the interaction between cyclodextrins and fungicides. They reveal that the binding energy of fungicides to HP-β-CD is significantly larger than to β-CD and -CD, -CD being not favorable at all. DIFENO has a better affinity than TEBU to these CDs. The chlorobenzene group of this fungicide appears to be a key chemical group for their binding to CDs. Other experiments are underway to investigate the interaction between cyclodextrins and other triazoles.

2

  RPMI (reference medium used), supplemented with α-cyclodextrin (α-CD), β-cyclodextrin (β-CD), γcyclodextrin (γ-CD), hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD) or heptakis-(2,3,6-tri-O-methyl)-βcyclodextrin (TRIMEB).

  pour toutes les souches testées. Son action est en revanche partielle concernant le metconazole et l'époxiconazole. Aucun effet n'a été observé concernant le bromuconazole. La comparaison des deux cyclodextrines concernées a permis de confirmer que l'HP-β-CD semble être la plus efficace, un effet de la présence de cette cyclodextrine étant observé pour trois des quatre triazolés testés pour toutes les souches. Seul le bromuconazole ne voit pas son action modifiée sur les souches fongiques. Ces résultats ont été confirmés par microscopie avec une absence d'effet de la présence des cyclodextrines en présence de bromuconazole sur la pousse fongique en comparaison des autres triazolés testés. Contrairement aux autres triazolés étudiés, la structure même de la molécule de bromuconazole semble peu favorable à la création d'une interaction de type hôte-invité avec les cyclodextrines testées, probablement en raison de la présence de l'atome de brome de rayon ionique élevé (196 pm) générant un encombrement stérique plus important.4.4.4.Rôle potentiel du chanvre dans la lutte contre la pollution environnementale aux triazolés Titre de l'article : Adsorption of a triazole antifungal agent, difenoconazole, on soils from a cereal farm: Protective effect of hemp felt Revue : Environmental Technology and Innovation, volume 22 Indices de publication : IF= 5,7 -Q1 Etat : Publié, 2021 Hypothèses de travail :

Scheme 1 .

 1 Scheme 1. Chemical structure of difenoconazole

Fig. 1 .Scheme 2 .

 12 Fig. 1. Possible reactions between 1,2,3,4-butanetetracarboxylic acid (BTCA) and anhydro glucose units of (left) two hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD) molecules and (right) one HPβCD molecule and one cellulose chain.

Fig. 2 .

 2 Fig. 2. Effect of contact time on difenoconazole adsorption (in %) on Douce Terre (DTP, blue curve) and Champ Marie (CMP, black curve) soils (conditions: volume 50 mL; soil 10 g; temperature 25 • C; n = 3; difenoconazole concentration C 0 1 mg L -1 (a) and 15 mg L -1 (b)). (For interpretation of the references to color in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)

Fig. 3 .

 3 Fig. 3. Mean removal (%) of difenoconazole from Douce Terre (DTP) and Champ Marie (CMP) soils, one disk of raw (1RH) and modified (1MH) hemp felt; conditions: percolation (contact time = 2 h); volume 50 mL; soil 10 g; temperature 25 • C; n = 3; difenoconazole concentration C 0 1 mg L -1 (blue bars) and 15 mg L -1 (black bars).. (For interpretation of the references to color in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)

Fig. 4 .

 4 Fig. 4. Mean desorption (%) of difenoconazole on Douce Terre (DTP) and Champ Marie (CMP) soils, RH and MH disks (1 disk, 1 or 3 washes); conditions: percolation (contact time = 2 h); volume 50 mL; CaCl 2 0.01 M after adsorption of difenoconazole solutions C 0 at 1 mg L -1 (blue bar chart) and 15 mg L -1 (black bar chart) in the initial solution; soil 10 g; temperature 25 • C; n = 3. (For interpretation of the references to color in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)

Chloé Godeau :

 Godeau Investigation, Formal analysis, Validation, Writing. Nadia Morin-Crini: Supervision, Funding acquisition, Validation, Review. Jean-Noël Staelens: Resources, Review. Bernard Martel: Resources, Review. Steffi Rocchi: Supervision, Funding acquisition, Review. Gilles Chanet: Resources, Review. Marc Fourmentin: Visualization, Review. Grégorio Crini: Conceptualization, Validation, Review.

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Figure 1 .

 1 Figure 1. Minimum spanning network of nine microsatellite loci STRAf using Bruvo's distance. Letters correspond to sawmill and the following numbers ± letters are genotype numbers. Each circle represents one multilocus genotype, the size of which is proportional to frequency. Different colors represent the different isolates (susceptible or resistant, and their mutations on the Cyp51A gene and its promoter). Link thickness is proportional to genotype similarity.

FIGURE 1 |

 1 FIGURE 1 | Diagram with type of sampling, azole resistance, and cyp51A mutations of analyzed isolates.

FIGURE 2 |

 2 FIGURE 2 | Circular dendrogram illustrating relationship among 113 azole-resistant (with details of tandem repeat and cyp51A SNP) and 112 azole-susceptible Aspergillus fumigatus, isolated from clinical or environmental samples. Genetic relationships are based on short tandem repeat at nine loci, using Bruvo's distance and Neighbor-Joining clustering. The two most common multilocus genotypes (MLG) are denoted by the letters A and B Numbers are ID isolates. The stars provide information on the TR or SNP present on the cyp51A gene.

FIGURE 3 |

 3 FIGURE 3 | Minimum spanning network for TR34/L98H isolates (nine microsatellite loci STRAf using Bruvo's distance, with distance cutoff < 0.2). Colors represent the origin of sampling and numbers are ID isolates. Link thickness is proportional to genotype similarity. The most common multilocus genotypes (MLG) are denoted by the letters A, B, C, D, and E.

FIGURE 4 |

 4 FIGURE 4 | Minimum spanning network for TR 34 /L98H isolates (nine microsatellite loci STRAf using Bruvo's distance, with distance cutoff < 0.2) from Besancon mycology team and from the world (AfumID application). Colors represent the origin of sampling and numbers are ID isolates. Link thickness is proportional to genotype similarity. The most common multilocus genotypes (MLGs) found in Besancon laboratory are denoted by the letters A, B, C, D, and E.

217 6 .

 6 Discussion et Conclusion générale Le bilan des résultats pour les différents domaines étudiés, cultures céréalières, maraîchères ou plantes ornementales, est présenté dans le Tableau 13. Concernant les études des communautés ciblées sur A. fumigatus, le type de cultures du domaine étudié (différentes céréales, fruits, légumes, fleurs…) et les quantités de molécules triazolées appliquées (nombre de traitement annuel ; concentration appliquée lors des traitements) peuvent influencer la microbiologie des sols. Ces conclusions expliqueraient les différences observées en termes de nombre d'A. fumigatus détectés. Les sols des cultures maraîchères étaient en effet plus de 4 fois plus riches en isolats d'A. fumigatus que les sols de cultures céréalières. A noter que certains milieux de culture utilisés en microbiologie pour favoriser la reproduction sexuée des moisissures sont particulièrement riches en légumes (le milieu V8 notamment), ce qui laisse à penser que certaines cultures en place dans les exploitations maraichères, pourraient potentiellement favoriser le développement d'A.

Tableau 13 :

 13 Bilan des résultats observés dans les différents domaines étudiés.

  nécessaire. Dans les domaines où l'utilisation des (tri)azolés est considérée indispensable pour maintenir des rendements de production, le développement systématique de procédés de production sans ces molécules n'est pas aisé. Concernant la résistance chez A. fumigatus, éviter le contact permanent entre les souches fongiques et les (tri)azolés dans les sols constitue le meilleur moyen de limiter la pression de sélection. L'utilisation des cyclodextrines pourrait être particulièrement intéressante dans cette problématique. Des tests in vitro et des méthodes de modélisation moléculaire ont été utilisés pour confirmer qu'une inclusion potentielle des (tri)azolés au sein de ces molécules cages était possible. Ce complexe d'inclusion bloque l'action fongistatique de la molécule (tri)azolée, probablement en empêchant son import dans la cellule fongique. De fait, le risque de pression de sélection est diminué. Les utilisations environnementales de ces molécules cages se développent progressivement, notamment dans des démarches de décontamination des eaux, mais elles sont plus rares pour limiter les transferts de contaminants (dont les pesticides) dans

Figure 33 :

 33 Figure 33 : Photos des dispositifs de prélèvement de poussières (A) girouette placée sur le toit ; (B) capteur à poussière.

Tableau 14 :

 14 Paramètres optimisés de la mesure des triazoles étudiés en GC-MS/MS

  Minéralisation et dosage des métaux par ICP-AESLes concentrations en éléments totaux dans les sols ont été déterminées par spectrométrie d'émission atomique à plasma à couplage inductif (ICP-AES, Radial ICAP 6500 Model, Thermo Fisher Scientific, Courtaboeuf, France) via la minéralisation de 0,5 g de sol lyophilisé puis tamisé à 2 mm avec 2 mL d'acide nitrique et 5 mL d'acide chlorhydrique dans des tubes fermés placés dans un système de digestion en bloc (DigiPREP, SCP Sciences, Courtaboeuf, France). Un mode de chauffage progressif a été utilisé pour atteindre une température finale de 100°C (durée totale de 265 min). Ensuite, de l'eau ultrapure (système Millipore Milli-Q Integral 3, Molsheim, France) a été ajoutée pour obtenir un volume final de 50 mL. Enfin, une filtration à 1 µm a été effectuée. La liste des éléments qui ont été mesurés ainsi que les limites de détection et de quantification qui correspondent à chacun d'eux sont présentées dans le Tableau 15.

Tableau 15 :

 15 Liste des éléments dosés en ICP-AES et limites de détection et de quantification correspondantes.

  voriconazole : Mitra (Malt supplémenté en itraconazole à 2 mg.L -1 ) et Mvori (Malt supplémenté en voriconazole à 1 mg.L -1 ) ; Les boites ont ensuite été placées à 48°C pendant 48 heures, température sélectionnant préférentiellement les A. fumigatus ou bien à 37°C afin de cibler les espèces susceptibles d'être pathogènes pour l'Homme. Les lingettes des différents capteurs à poussière ont été rincées à l'aide d'une solution de Tween 80 à 0,1% (Merck, Darmstadt, Germany), agitées 10 minutes dans un stomacher (MIX2 AES laboratoire, France). Les liquides de rinçage ont été récupérés, puis 100 µL ont été ensemencés sur milieu Dichloran-Glycérol (DG18) incubé ensuite à 25°C, ainsi que sur milieu DG18, Mitra et Mvori incubés à 37°C et 48°C. Après la durée nécessaire à la pousse fongique, une identification est effectuée au moyen d'observations macroscopiques (couleur, taille, aspect des colonies) et microscopiques afin de distinguer les isolats d'intérêt. l'exception de la température d'hybridation des amorces qui est de 55°C. Les séquences ainsi obtenues ont été comparées à deux séquences de référence du gène cyp51A au moyen du logiciel Benchling (https://benchling.com/). Les souches de référence choisies sont des A. fumigatus sensibles aux antifongiques (souche n° AF 222068.1, GeneBank, pour la mutation TR34/L98H et la souche n° AF 3386659, GeneBank, pour la mutation TR46/Y21F/T289A). Détection des communautés fongiques par qPCR La détection par qPCR a été faite sur les sols des grandes cultures et des pots de plantes ornementales, après extraction d'ADN des sols avec le kit Nucleospin soil (Macherey-Nagel®, Düren, Germany). Les systèmes qPCR (amorces et sondes d'hydrolyse TaqMan) utilisés sont ceux décrits par Haugland et al. (2004) pour quantifier Aspergillus fumigatus et Liu et al. (2012) pour la quantité globale d'espèce fongiques. La qPCR a été réalisée sur les échantillons et sur une gamme de plasmides pour la cible qPCR A. fumigatus ou d'ADN pour la cible qPCR panfongique. Ces gammes, allant de 100 à 0,01 fg d'ADN ont servi de témoins positifs et à la réalisation d'une courbe standard nécessaire à la quantification de l'ADN. Chaque plaque a été validée grâce à un contrôle négatif de l'extraction et un contrôle négatif de la réaction de qPCR constitué d'eau pour biologie moléculaire (EBM). La réaction de qPCR s'est faite en plaque 96 puits, dans un volume final de 20 µL comprenant 10 µL de Master Mix taqman Gene Expression, 4 µL du mélange des amorces concentrées à 5 pM chacune, 0,8 µL de sondes pour chaque échantillon, 0,2 µL d'eau, et 5 µL de chaque échantillon. L'analyse a été faite sur un automate Applied Biosystem 7500 Fast, avec le programme suivant : 10 minutes à 95°C, 50 cycles composés de 15 secondes à 95°C et une minute à 60°C.Une séquence nucléotidique, nommée aléa, longue de 167 pb[START_REF] Knapp | Development of a Real-Time PCR for a sensitive one-step coprodiagnosis allowing both the identification of carnivore feces and the detection of Toxocara spp. and Echinococcus multilocularis[END_REF] a été testée comme contrôle interne en parallèle des autres cibles pour vérifier l'absence d'inhibiteur de PCR dans chaque échantillon.

  capteur à poussière. ____________________________________________________ 268 Figure 34 : Schéma d'une plaque EUCAST. Réalisé avec Biorender __________________ 273

  ; E-phy, Anses

	1990	Epoxicoanzole	céréales, betteraves, maïs	106
	1991	Bromuconazole	céréales, fruits, légumes, vignes, gazon, plantes ornementales	17
			céréales, colza, fruits, myrtille, cerises,
		Metconazole	groseilles, nectarines, pêches, prunes,	62
	1992		pistachier, gazon
		Fluquinconazole	céréales, traitements des semis	14
		Triticonazole	céréales, gazon, plantes ornementales	17
	2002	Prothioconazole	céréales, colza	124
	2011	Paclobutrazole	régulateur de croissance des plantes, mangues, coton, maïs, piments, raisins	8
	2019	Mefentrifluconazole	céréales, gazon	17
	Année de mise sur le marché	Nom du composé	Usages principaux	Nombre de formulations (selon l'Anses)
	1969	Triadimefon	céréales, pois, raisins, cucurbitacées, cannes à sucre	19

Tableau 2 :

 2 Synthèse non exhaustive des études montrant une contamination des eaux par les molécules triazolées.La persistance des triazolés dans l'environnement les rend particulièrement sujets au lessivage, ce qui peut toucher également les eaux souterraines qui sont une source essentielle dans la production d'eau potable[START_REF] Aliste | Risk Assessment of 1,2,4-Triazole-Typed Fungicides for Groundwater Pollution Using Leaching Potential Indices[END_REF].[START_REF] Chau | Pesticide pollution of multiple drinking water sources in the Mekong Delta, Vietnam: Evidence from two provinces[END_REF] ont montré, suite à une étude réalisée au Vietnam, que plus d'un tiers des bouteilles d'eau analysées contenaient des résidus d'hexaconazole présentant un risque pour la santé humaine.

	Molécule	Concentration (ng.l -1 )	Pays	Références
	Difénoconazole	807	Grèce	Papadakis et al., 2018
	Tetraconazole	47	Etats-Unis	Battaglin et al., 2011
	Epoxiconazole	55 5,14	Danemark Tunisie	McKnight et al., 2015 Necibi et al., 2021
	Myclobutanil	51 63	Chili Grèce	Climent, Herrero-Hernández, et al., 2019 Kapsi et al., 2019
		230	Etats-Unis	Glinski et al., 2018
		12	Canada	Metcalfe et al., 2019
	Metconazole	6	Etats-Unis	Battaglin et al., 2011
		72	Argentine	De Gerónimo et al., 2014
		178,3	Belgique	Van De Steene et al., 2010
		82	Danemark	McKnight et al., 2015
		0,60	Portugal	Gonzalez-Rey et al., 2015
	Propiconazole	307	Grèce	Papadakis et al., 2018
		810,38	Chine	Peng et al., 2018
		16	Canada	Metcalfe et al., 2019
		0,83	Tunisie	Necibi et al., 2021
		35	Argentine	De Gerónimo et al., 2014
		38	Danemark	McKnight et al., 2015
	Tébuconazole	15,38 300	Espagne Brésil	Ccanccapa et al., 2016 Caldas et al., 2019
		480	Etats-Unis	Glinski et al., 2018
		53	Etats-Unis	Battaglin et al., 2011

Molécule Demi-vie dans le sol (en jours) Références

  Tableau 3 : Caractéristiques chimiques des molécules triazolées époxiconazole, tébuconazole et difénoconazole.

		289 à 610		Strickland et al., 2004
		Formule chimique 4,9 à 5,8 4,68 à 8,09 Poids moléculaire (g.mol -1 )	Log Kow (à 25°C) Zhang et al., 2015 pKa Solubilité à 20°C (mg.L -1 ) Mukhopadhyay et al., 2011
		15,5 à 23			Huan et al., 2013
	Epoxiconazole	C17H13ClFN3O 2,82 à 23,26	329,7	3,3	5 Wang et al., 2012	29
	Tébuconazole Difénoconazole	C16H22ClN3O 21 à 27,7	307,8	3,7	NR He et al., 2016	6,63
		54,2 à 55			Wang et al., 2008
	Difénoconazole	C19H17Cl2N3O3 9,6 à 68,4	406,2	4,36	1,07 Guo et al., 2010	15
		130		Pesticide Properties Database
		142 à 1600	Health Canada's Pest Management Regulatory Agency, 2016
		178			Du et al., 2022
		78 à 184			Buerge et al., 2006
		52 à 354			Kaziem et al., 2020
	Epoxiconazole	120 à 354			Nélieu et al., 2016
		353,5		Pesticide Properties Database
		737 à 1004		Bromilow et al., 1999
		8,2 à 12,4		Herrero-Hernández et al., 2011
		11,2 à 14,4			Dong & Hu, 2014
		26,8 à 36,9		Matadha et al., 2019
	Tébuconazole	40,76 à 43,86			Ye et al., 2013
		63		Pesticide Properties Database
		32,2 à 216,6			Cui et al., 2018

NR : Non renseigné dans la littérature

La nature des molécules définit leur « affinité » pour les différents types de sol. L'adsorption d'une molécule plutôt hydrophobe et non ionisable sera influencée par la teneur en carbone organique total du sol

[START_REF] Sadegh-Zadeh | Sorption, degradation and leaching of pesticides in soils amended with organic matter: A review[END_REF]

tandis que l'adsorption d'une molécule plutôt ionisable sera plus sensible aux variations de pH et de CEC

[START_REF] Kah | Adsorption of ionisable pesticides in soils[END_REF][START_REF] Bošković | Adsorption of epoxiconazole and tebuconazole in twenty different agricultural soils in relation to their properties[END_REF]

.

La demi-vie dans le sol est également un paramètre à prendre en compte dans le potentiel contaminant d'un composé pour l'environnement. Pour les triazolés, ces valeurs sont très variables dans la littérature (de quelques jours à plusieurs mois ou années pour une même molécule). Ces variations s'expliquent notamment par des conditions de mesures différentes selon les études considérées (e.g. nature des sols, concentration appliquée, technique de mesure). Certaines d'entre elles sont présentées dans le Tableau 4.

Tableau 4 : Exemples de demi-vies décrites dans la littérature pour les molécules triazolées d'époxiconazole, de tébuconazole et de difénoconazole.

  [START_REF] Fantke | Estimating half-lives for pesticide dissipation from plants[END_REF] ont travaillé sur 333 pesticides dans le but de créer un modèle de prédiction

des risques associés à ces molécules. Sur ces 333 pesticides, l'époxiconazole, le tébuconazole et le difénoconazole ont été considérés comme les 18 e , 72 e et 136 e molécules avec la demi-vie la plus importante dans les sols respectivement. Ces valeurs témoignent de leur potentiel de persistance dans les sols en comparaison avec d'autres molécules.

  ont montré que sur 132 personnes, l'époxiconazole, le tébuconazole, le difénoconazole et le triadimefon étaient retrouvés dans 14%, 13%, 11% et 16% des échantillons de cheveux respectivement. Ces résultats ont démontré qu'outre les professionnels agricoles, le reste de la population subit aussi cette exposition probablement due à l'environnement et aux habitudes alimentaires.

Tableau 6 :

 6 Diagramme d'évaluation des risques de développement de résistance des moisissures phytopathogènes pour les (tri)azolés (inhibiteur de déméthylase). Le risque combiné est obtenu en multipliant lerisque lié au pathogène par le risque lié au fongicide. Adapté de[START_REF] Brent | Fungicide resistance: The assessment of risk[END_REF]

	Risque combiné : 0,5-1,5 = risque faible ; 2-6 = risque modéré ; 9 = risque élevé
	Cook et al. (2021) ont montré la présence de mutations dans le gène Cyp51 (codant pour
	l'enzyme 14-α-déméthylase, une enzyme clé de la synthèse de l'ergostérol) d'isolats issus de
	Chine et de Nouvelle Zélande de Puccinia striiformis responsables de la rouille jaune. Connues
	comme causant une diminution de la sensibilité aux triazolés, ces mutations peuvent être le
	point de départ de l'émergence de phénotypes de résistance.

concentrations de difénoconazole (500 mg.kg -1 ) provoque un stress qui conduit à une diminution de l'activité microbienne totale. Le stress induit se reflète notamment par un quotient respiratoire doublé en présence du fongicide. Ces résultats ont été confirmés par da Rocha et al. (2020) qui ont montré qu'une exposition à cette même molécule aux doses recommandées pour une application

  Tableau 7 : Effet d'une forte dose de fongicides triazolés sur les micro-organismes du sol[START_REF] Roman | Effects of triazole fungicides on soil microbiota and on the activities of enzymes found in soil: A review[END_REF]).

	environnementale pourrait être responsable d'une diminution de la biomasse microbienne
	globale de 30% après 84 jours de contact. Lors de l'exposition, les micro-organismes dépensent
	plus d'énergie dans la dégradation des composés que dans leur développement ce qui se traduit
	par une augmentation du quotient métabolique. Satapute et al. (2019), quant à eux, ont établi
	L'apparition de ce phénomène que le propiconazole, à hautes doses, peut également induire une diminution de la communauté
	en lien avec les molécules triazolées représenterait un risque important de pertes de rendement microbienne.
	de culture. Un usage plus raisonné et moins systématique de ces molécules est nécessaire pour De nombreuses études ont mis en évidence la toxicité du tébuconazole sur la diversité et la
	éviter ce phénomène. quantité de micro-organismes du sol, bien que cet effet soit dose-dépendant. Des doses élevées
	de cette molécule ont des effets sur les communautés bactériennes et la biodiversité des micro-

[START_REF] Muñoz-Leoz | Non-target effects of three formulated pesticides on microbiallymediated processes in a clay-loam soil[END_REF]

ont montré qu'une exposition des sols à de fortes

Cyp51A Phénotype de résistance Traitement au long court

		G54/W/R/E/V/A	Itraconazole/Posaconazole
		M220/V/L/T/I	Itraconazole/Posaconazole
		G138C	Pan-azolé
		G448S	Pan-azolé
		P216L	Itraconazole/Posaconazole
		Y431C	Itraconazole/Posaconazole/Voriconazole
		Y121F	Voriconazole
		TR34/L98H	Pan-azolé
	Environnementale	TR46/Y121F/T289A	Voriconazole/Posaconazole
		TR53	Pan-azolé

ETABLIR les phénotypes de résistance de ces isolats Sur des isolats issus des cultures sur milieux supplémentés en triazolés Au moyen de la technique de référence de test de sensibilité (EUCAST) ✓ CARACTERISER les mutations spécifiques impliquées dans cette résistance

	3. Objectifs
	Les objectifs de la thèse étaient d'évaluer la diffusion des fongicides triazolés
	environnementaux dans certains agroécosystèmes et de mesurer leur impact sur des populations
	fongiques d'A. fumigatus. Ce travail pluridisciplinaire allie chimie et mycologie. Pour ce faire,
	une analyse mycologique et/ou descriptive quantitative de la présence des triazolés a été réalisée
	dans différents domaines d'application de ces fongicides, que sont les grandes cultures, les
	cultures maraîchères et des pots de fleurs ornementales, afin de pouvoir intégrer une approche
	multi-échelle à l'étude. Quatre axes permettront de retranscrire les résultats obtenus. Trois
	autre aspect important à prendre en considération dans l'émergence de cette résistance est concernent la caractérisation des différents domaines d'étude précédemment cités, le dernier
	la capacité d'A. fumigatus à se reproduire de façon sexuée. Il existe 3 modes de reproduction axe permet de discuter de différents leviers d'action potentiels pour limiter l'émergence de
	potentiels pour cette moisissure : reproductions asexuée, parasexuée et sexuée (Verweij et al., populations résistantes d'Aspergillus fumigatus. Les objectifs de l'étude sont décrits ci-après,
	2016 ; Centers for Disease Control and Prevention (U.S.), 2019). La reproduction sexuée ainsi que les moyens mis en oeuvre pour les réaliser (Figure 18).
	semble se faire principalement dans l'environnement. Quand elle se produit, la méiose est source d'une grande variabilité génétique chez les souches environnementales (O'Gorman et ✓ EVALUER la diffusion et l'accumulation des fongicides triazolés dans l'environnement al., 2009 ; Stensvold et al., 2012). Du fait du grand nombre de générations qui sont synthétisées dans le temps, le risque de voir apparaître des mutations spontanées est relativement élevé. Ces Sur des prélèvements de sol Au moyen d'analyses en chromatographie gazeuse triple quadripôle
	mutations pourraient potentiellement par la suite être favorisées par la pression de sélection ✓ DETECTER la présence de souches d'Aspergillus fumigatus résistantes induite dans l'environnement. L'importance de l'utilisation des molécules triazolées, tant sur le plan environnemental que Sur des prélèvements de différentes matrices (sol/air) Au moyen de cultures sur milieux supplémentés en triazolés
	médical, n'est plus à prouver. Cependant, l'apparition globale d'une résistance d'ampleur grandissante complexifie grandement l'utilisation de ces composés. Les alternatives thérapeutiques chez l'Homme sont minces, particulièrement au vu du faible nombre de molécules autorisées. Dès 2013, l'European Centre for Disease prevention and Control (ECDC) souligne l'ampleur de cette résistance pouvant être considérée comme un risque émergent de santé publique (ECDC, 2013). Du fait de la diffusion globale de cette résistance, A. fumigatus ✓ Sur les isolats déterminés résistants en test de sensibilité Au moyen du séquençage de leur gène Cyp51A a également été introduit, en 2019, comme pathogène à surveiller par l'U.S. Centers for Disease ✓ COMPRENDRE les conditions « privilégiées » de la présence de cette résistance dans Control and Prevention (Centers for Disease Control and Prevention (U.S.), 2019). les sols
	Décrire ce phénomène dans l'environnement et mieux comprendre quelles sont les conditions qui semblent le favoriser représente un enjeu majeur pour pouvoir le contrôler et développer Sur des domaines d'application de ces fongicides à différentes échelles Au moyen d'analyses structurelles des sols et de comparaisons inter et intra échelles
	des méthodes afin de le limiter. C'est dans ce contexte que se situe ce travail de thèse. ✓ PROPOSER des méthodes de remédiation pour limiter ce phénomène
	Sur des sols contaminés Au moyen de supports biodégradables et innovants et/ou en modifiant les pratiques

Démarche d'échantillonnage et analyse structurelle des sols.

  Les prélèvements de sols ont été réalisés dans des parcelles agricoles faisant partie d'une zone d'étude gérée par l'UMR 1347 Agroécologie de Dijon ou de la Zone Atelier Moselle, dont les agriculteurs ont autorisé ces prélèvements. Dix prélèvements de surface ont été réalisés par parcelle en respectant un transect. Les données des différentes parcelles sélectionnées dans chacune des deux régions sont présentées dans les Tableaux 9 et 10 pour la Lorraine et la Bourgogne respectivement les cartographies de chaque zone sont présentées Figures 19 et 20. Pour rappel, l'ensemble du matériel et méthodes est détaillé en annexe. Tableau 9 : Détails des données des 11 parcelles prélevées en Lorraine (ZAM). Agroécologie de Dijon). Les parcelles en rouge ont reçu du metconazole, celle en bleu du prothioconazole, celles en rose un mélange de prothioconazole et de tébuconazole. Les agglomérations apparaissent en gris. Le fond de carte est issu d'OpenStreetMap. Une analyse des paramètres du sol a été réalisée dans le but de déterminer d'éventuelles différences entre les deux zones de prélèvements. Les répartitions des différents paramètres des sols, pourcentage de matière organique, pH et CEC sont présentées Figure 21.

	Eléments essentiels : Parcelle Tableau 10 : Détails des données des 11 parcelles prélevées en Bourgogne (zone d'étude gérée par l'UMR 1347 Culture (2019) Surface (ha) Matière active (2019) Agroécologie de Dijon). • Des prélèvements de sols ont été réalisés sur 22 parcelles de cultures céréalières réparties dans 2 régions différentes (Lorraine et Bourgogne) à raison de 10 prélèvements par parcelle. • Les analyses des paramètres du sol montrent moins de contraste qu'attendu entre les 2 régions, le paramètre le plus contrasté étant le pH. Une majorité de sol était de structure argile limoneuse. • Le dosage des pesticides a montré que tous les sols étaient contaminés par des triazolés. Le tébuconazole est aussi bien retrouvé dans les sols traités l'année concernée que dans Lorraine BP Blé 3,0 Agriculture biologique CBP Blé 3,1 Parcelle Culture (2021) Surface (ha) Matière active (2021) Agriculture biologique PP Blé 20,5 POP Jachère 16,3 Agriculture biologique Tébuconazole PCP Blé 9,3 MJP Maïs 4,4 Non traitée Tébuconazole RP Blé 12,6 CHP Maïs 3,0 Non traitée Tébuconazole DJP Blé 22,6 MOP Maïs 8,9 Non traitée Tébuconazole VSP Blé 7,9 PIV Blé 16,0 Prothioconazole Tébuconazole EP Blé 7,2 Bourgogne QUP Blé 12,0 Prothioconazole/Tébuconazole Tébuconazole TP Blé 1,5 MAP Blé 6,4 Prothioconazole/Tébuconazole Tébuconazole GCP Blé 12,1 BGP Blé 2,9 Prothioconazole/Tébuconazole Tébuconazole LIP Blé 7,3 PPF Colza 7,4 Metconazole Tébuconazole SFP Colza 16,3 Metconazole
	les sols non traités, ou que dans ceux en agriculture biologique. L'époxiconazole est LHP Colza 11,5 Metconazole
	uniquement présent dans 5 parcelles de Lorraine sur 11.
	• Des cultures fongiques ont été réalisées à partir des 220 prélèvements des sols : 166
	isolats ont été identifiés comme appartenant à la section Fumigati et aucun d'entre eux Lorraine et en Bourgogne. Les parcelles prélevées ont été sélectionnées en fonction des ne s'est avéré résistant aux triazolés. antécédents de traitement fongicide et des caractéristiques des sols obtenus auprès des • Les ADN totaux de chaque sol ont été extraits. Une qPCR panfongique a montré une agriculteurs. Des parcelles ayant reçu des fongicides triazolés ont été comparées avec des variabilité entre les échantillons. Une qPCR spécifique à Aspergillus fumigatus a parcelles en agriculture biologique pour chaque campagne. Différentes caractéristiques des sols également permis de quantifier la présence de cette espèce qui représente une très faible ont été mesurées (pH, matière organique, granulométrie, capacité d'échange cationique) afin d'évaluer leurs effets sur la persistance des fongicides. Le dosage des résidus de 5 molécules proportion de l'ADN fongique total pour chaque sol.
	triazolées (bromuconazole ; difénoconazole ; époxiconazole ; propiconazole et tébuconazole) a
	été réalisé par chromatographie gazeuse triple quadripôle et une analyse mycologique de chaque
	prélèvement a été effectuée. Des résidus de tébuconazole ont été retrouvés dans tous les sols
	prélevés (8,2 nanogrammes par gramme de sol en moyenne) alors que seulement quelques sols
	contenaient de l'époxiconazole. Les niveaux de concentrations de ces résidus n'ont pas pu être
	mis en relation avec les caractéristiques des sols (e.g. pH, taux de matière organique…), moins Les distributions des parcelles prélevées dans les 2 régions étaient comparables en termes de
	contrastées qu'attendu, que ce soit entre les régions ou entre les parcelles d'une même région. matière organique. Les valeurs étaient également relativement comparables entre les 2 régions
	Aucun isolat d'Aspergillus fumigatus résistant aux azolés (aR-Af) n'a pu être mis en évidence. pour la capacité d'échange cationique. Pour les pH les valeurs moyennes étaient de 6,5 et de
	Suite à une analyse globale de communauté fongique par PCR quantitative en temps réel, nous 7,5 pour la Lorraine et la Bourgogne respectivement, cette variable étant la plus contrastée.
	avons pu conclure que cet environnement ne semble pas être une niche de développement de D'autres mesures telles que la quantité d'azote total et de carbone total n'ont pas montré non cette moisissure. Il ne peut donc probablement pas constituer un « hotspot » de résistance. plus de contraste marqué entre les deux régions. Une analyse granulométrique a été réalisée sur
	chaque prélèvement (Figure

Figure 19 : Cartographie des 11 parcelles prélevées en Lorraine (Zone Atelier Moselle). Les parcelles en agriculture biologique sont représentées en vert, celles en rose ont reçu un traitement au tébuconazole. Les agglomérations apparaissent en gris. Le fond de carte est issu d'OpenStreetMap.

Figure 20 : Cartographie des 11 parcelles prélevées en Bourgogne (zone d'étude gérée par l'UMR 1347

Table 1

 1 Characteristics of market garden soils using DMIs and fungicide treatmentIn total, 566 A. fumigatus were detected among the 180 soil samples seeded on DG18 media. For market gardens without DMIs, 5 CFU were detected for garden A and 338 CFU for garden B on DG18 media and only 2 isolates on Maltitra for market garden B. In the four MG-DMIs, 223 A. fumigatus were detected on DG18 media, 152 isolated on Maltitra and Maltvori media. Forty isolates of A. fumigatus (verified by beta-tubulin sequencing) cultured on Malt supplemented by azoles were really ITC, VRC, and/or PSC-resistant according to breakpoints defined by the EUCAST committee. Other strains isolated on Malt supplemented by azoles had MIC ≤ 1mgL -1 for ITC and VRC, except for one strain with MIC = 2 mg L -1 for VRC.

	Environ Sci Pollut Res
	Market	Type	Organic	Type of treatment and uses (supplier recommendations)
	gardens	of soil	matter
			content	Product	Treatment	Frequency of	Sprayed
				fungicides	code	treatment	fungicide
				(concentrations)		(time year -1 )	quantity
							(L ha -1 )
	C	Grass	NA	DFC (250 mg L -1 )1	3	0 . 5
	DC l a y	1 . 6 -4.5%	DFC (125 mg L -1 )	23	1
				Azoxystrobin
				(200 mg L -1 )
	E	Sandy	1.5-2.5%	DFC (250 mg L -1 )3	3	0 . 5
	F	Sandy	0.2%	DFC (250 mg L -1 )1	3	0 . 5

Table 2

 2 Susceptible and resistant analyzed strains isolated in soils and their MIC for three medical antifungal treatments (itraconazole (ITC), voriconazole (VRC), posaconazole (PSC)) and three IDMs (tebuconazole (TBC), difenoconazole (DFC), propiconazole (PPC))

	Environ Sci Pollut Res

with strong cross-resistance to VRC, first line therapy treatment

[START_REF] Tissot | ECIL-6 guidelines for the treatment of invasive candidiasis, aspergillosis and mucormycosis in leukemia and hematopoietic stem cell transplant patients[END_REF]

. Globally, aR-Afs had high MIC for DFC (≥ 8m gL -1 ) and cross-resistance with medical azoles (ITC, VRC, PSC) with high MIC for ITC and/or VRC ≥ 16 mg L -1 . This cross-resistance has recently been discribed after exposure to DFC and TBC (and not for other DMIs) in experimental conditions (7 weeks under fungicide pressure)

(Zhang et al. 2017

).

Table 3

 3 Amounts of difenoconazole (DFC) in surface samples in market gardens D and E and number of resistant strains and their mutations on cyp51ASample number DFC concentration in surface samples (ng g -1 ) Number of resistant strains and mutationsMoreno et al. 2017). Types of soils in the four MG-DMIs were different (containing grass, clay, or sand), and this difference could account for the different results observed between markets C, E, and F. Soils in market garden C were covered with grass which could serve as a retention barrier for fungicide explaining why no aR-Afs were isolated. Soils E and F were very sandy, and only three aR-Afs were found in market garden E. These types of soils are very permeable to water providing better drainage.

	Environ Sci Pollut Res
	Market garden D
	25*	4 (<LD)	1 TR34/L98H
	28*	4.6	6 TR34/L98H
	24*	6.3	/
	21*	9.4	3 TR34/L98H-2 TR46/Y121F/T289A
	17	22.3	11 TR34/L98H-2 TR46/Y121F/T289A
	16	58.7	4 TR46/Y121F/T289A
	15	61.1	9 TR34/L98H
	19	90.6	1 TR34/L98H-1 TR46/Y121F/T289A
	13 6 0 . 9	/
	54 1 4 . 5	/
	Market garden E
	22 2 . 2	/
	83 3 . 9	/
	26	34.3	/
	16	37.5	1 TR34/L98H
	14	44.2	1 TR34/L98H-1 Ø mutation
	24	53.3	/
	23	66.9	/
	28	73.8	1 TR34/L98H
	58 6 . 3	/
	27	143.7	/

  strains in market gardens of Eastern France. Environ Sci Pollut Res Int 2018;25: 32015-23. 2. Jeanvoine A, Rocchi S,Reboux G, Crini N, Crini G, Millon L. Azole-resistant Aspergillus fumigatus in sawmills of Eastern France. J Appl Microbiol 2017;123:172-84. 3. Sewell TR, Zhang Y, Brackin AP, Shelton JMG, Rhodes J, Fisher MC. Elevated prevalence of azole resistant Aspergillus fumigatus in urban versus rural environments in the United Kingdom. Antimicrob Agents Chemother 2019;63:e00548-19. 4. Dunne K, Hagen F, Pomeroy N, Meis JF, Rogers TR. Intercountry transfer of triazoleresistant Aspergillus fumigatus on plant bulbs. Clin Infect Dis 2017;65:147-9. 5. Reboux G, Gbaguidi-Haore H, Bellanger AP, Demonmerot F, Houdrouge K, Deconinck E, et al. A 10-year survey of fungal aerocontamination in hospital corridors: a reliable sentinel to predict fungal exposure risk? J Hosp Infect 2014;87:34-40. 6. S c h e r e rE ,R o c c h iS ,R e b o u xG ,V a n d e n t o r r e nS ,R o u s s e lS ,V a c h e y r o uM ,e ta l . qPCR standard operating procedure for measuring microorganisms in dust from dwellings in large cohort studies. Sci Total Environ 2013;466-7: 716-24. 7. Rocchi S, Daguindau E, Grenouillet F, Deconinck E, Bellanger AP, Garcia-Hermoso D, et al. Azole-resistant Aspergillus fumigatus isolate with the TR34/L98H mutation in both a fungicide-sprayed field and the lung of a hematopoietic stem cell transplant recipient with invasive aspergillosis. J Clin Microbiol 2014;52:Objectif : Afin de pouvoir comparer les résultats de qPCR obtenus pour les sols des grandes cultures (ne présentant aucune résistance), des qPCR ont été réalisées sur certains sols des pots de tulipes (qui présentent globalement le plus de résistance).

	704		C. Godeau et al. / American Journal of Infection Control 48 (2020) 702-704
	Résultats complémentaires de l'article :
					1724-6.
					8. Bellanger AP, Berceanu A, Scherer E, Desbrosses Y, Daguindau E, Rocchi S, et al. Inva-
					sive fungal disease, isavuconazole treatment failure, and death in acute myeloid
					leukemia patients. Emerg Infect Dis 2019;25:1778-9.
	Sur l'ensemble des sols des pots prélevés dans cette étude, 7 ont été choisis pour évaluer les
	quantités d'ADN fongique total et d'A. fumigatus que l'on pouvait retrouver dans ces sols par
	qPCR. Parmi ces sols, 6 présentaient des isolats d'A. fumigatus en culture et chacun d'eux
	contenait au moins un aR-Af (notés D3 ; D9 ; D10 ; A27 ; D8 et D2 dans la Figure 31). Le
	dernier sol choisi (A22) ne présentait aucun isolat d'A. fumigatus en culture.
	Quantité d'ADN fongique total (ng.µL -1 )	0 50 100 150 200 250 300						0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000	) Quantité d'ADN d'Aspergillus fumigatus (fg.µL -1
		A22	D3	D9	D8	D2	A27	D10
					Pots prélevés
				qPCR panfongique	qPCR spécifique à Aspergillus fumigatus
	A22 : Pas de souche résistante
	D3 : 1 souche résistante
	D9 : 3 souches résistantes
	D8 : 4 souches résistantes
	D2 : 4 souches résistantes
	A27 : 5 souches résistantes
	D10 : 8 souches résistantes

Le niveau d'ADN fongique retrouvé dans ces sols était de l'ordre de plusieurs centaines de ng.µL -1 ce qui est en moyenne 30 fois plus important que pour les sols des grandes cultures, probablement le signe d'une population fongique riche (Figure

31

). Les quantités d'ADN d'A.

fumigatus allaient jusqu'à plusieurs centaines de milliers de fg.µL -1 . En moyenne ces sols présentaient des quantités d'ADN d'A. fumigatus 5000 fois plus importantes que les sols des grandes cultures. Figure 31 : ADN fongique total (exprimé en ng.µL -1 ) retrouvé dans 7 sols issus des pots de fleurs des zones A et D et quantité d'ADN d'Aspergillus fumigatus correspondante (exprimée en fg.µL -1 ). Les sols ont été classés par ordre croissant de souche(s) d'Aspergillus fumigatus résistantes retrouvées en culture.

  L'ADN d'A. fumigatus a été retrouvé dans tous les sols analysés, avec une quantité beaucoup plus faible pour le sol noté « A22 » pour lequel aucun isolat n'avait été retrouvé en culture. La nature même du sol utilisé pour la plantation de ces fleurs en pot (terreau) semble particulièrement favoriser le développement des populations fongiques.One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate

	4.4. Quels moyens pour limiter l'émergence de la
	résistance environnementale ?
	4.4.1. rétablissement d'une population sensible aux fongicides en Les bulbes comme source de résistance,
	changeant les pratiques
	Titre de l'article :
	Revue : Medical Mycology, volume 59
	Indices de publication : IF=3,353 -Q1
	Etat : Publié, 2021

  Ta b l e 1 . Comparative distribution of A. fumigatus isolates found, including resistant ones (ARAF), between the 2019 sampling campaign (treated bulbs) and same sampling plots controlled in 2020 (organic bulbs)

		2019 sampling		2020 sampling
		Number of A. fumigatus		Number of A. fumigatus
		isolated on antifungal	Number of ARAf	isolated on antifungal	Number of ARAf
		supplemented media	per plate*	supplemented media	per plate*
	Pot 10-D	15	14	30	0
	Pot 11-D	9	81 3	1
	Pot 8-D	13	72 0	0
	Pot 9-D	13	691
	Pot 27-A	8	51 1	0
	Pot 6-A	1	110
	Pot 25-A	2	200
	Pot 4-D	2	270
	Pot 1-A	0	0	0	0
	Pot 15-A	0	0	0	0
	Total	63	45	91	2

* 2 g of each substrate, dissolved with 10 ml of 0.1% Tween-80 solution (Merck), vortexed for 1 min and seeded on media. Resistant isolates are higlighted with shaded entry.

J Environ Sci Public Health 2021;5 (1):114-136 DOI: 10.26502/jesph.96120120 Journal of Environmental Science and Public Health 117

	with five triazole molecules. In a preliminary study,
	we showed that some dextrins interacted with
	difenoconazole, limiting it antifungal activity [36].
	Complex formation and stability of inclusion
	compounds in CDs can be studied by molecular
	dynamics simulation [37-41], which are especially
	useful when guest solubility limits experimental
	investigations.

Table 1 .

 1 DifenoconazoleTebuconazole

	Chemical structure
	Molecular formula	C 19 H 17 Cl 2 N 3 O 3	C 16 H 22 ClN 3 O
	Molecular weight (g/mol)	406.2	307.82
	Solubility in water (mg/L at 20°C)	15	36
	Log K ow (at 25°C)	4.36	3.7

Table 1 :

 1 Chemical characteristics of difenoconazole and tebuconazole.

	J

Environ Sci Public Health 2021;5 (1):114-136 DOI: 10.26502/jesph.96120120 Journal of Environmental Science and Public Health 118

Table 2 :

 2 General description of cyclodextrins.

.26502/jesph.96120120 Journal of Environmental Science and Public Health 130 17

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J Environ

Sci Public Health 2021;5 (1):114-136 DOI: 10.26502/jesph.96120120 Journal of Environmental Science and Public Health 134 Supplementary Materials

	Effects	Characteristics	Estimates	95% CI 1	p-value
	Fixed
		Fungicides:
		Difenoconazole (reference)	-	-	-
		Tebuconazole	0.84	0.75, 0.94	<0.001
		Media 2 :
		RMPI (reference)	-	-	-
		MALTO	0.03	-0.15, 0.20	0.8
		α-CD	0.10	-0.07, 0.27	0.3
		β-CD	0.85	0.68, 1.0	<0.001
		-CD	0.38	0.20, 0.55	<0.001
		HP-β-CD	1.3	1.1, 1.4	<0.001
		TRIMEB	0.63	0.45, 0.80	<0.001
	Random
		Strains	0.40	-	-
		Residuals	0.396	-	-

1 CI = Confidence interval

Table S -1: Outputs

 S

of the linear mixed-effects model using strains, media and fungicides to explain observed minimal inhibitory concentrations. In the model, RMPI medium and difenoconazole were used as references. DOI: 10.

26502/jesph.96120120 Journal of Environmental Science and Public Health 135

	System*	Cyclodextrin	Ligand	Side of cubic box (Å)	Water
	αCD	α	-	13.31	75776
	βCD	β	-	13.51	78159
	γCD	γ	-	13.68	80987
	HPβCD	β	-	13.90	84595
	αCD-DIFENO	α	DIFENO	13.31	75249
	βCD-DIFENO	β	DIFENO	13.51	78141
	γCD-DIFENO	γ	DIFENO	13.68	80970
	αCD-TEBU	α	TEBU	13.31	75259
	βCD-TEBU	β	TEBU	13.51	78141
	γCD-TEBU	γ	TEBU	13.68	80969
	HPβCD-DIFENO	β	DIFENO	13.90	84579

Table S -

 S

2: Box size and molecular content of each studied system.

:

  Dans le but d'évaluer l'efficacité des cyclodextrines β-CD et HP-β-CD sur d'autres triazolés, des tests ont été réalisés sur 4 autres molécules : metconazole, propiconazole,

	bromuconazole et époxiconazole.
	L'efficacité de deux cyclodextrines, β-CD et HP-β-CD a été plus largement étudiée avec 4
	autres molécules triazolées fréquemment retrouvées dans l'environnement. Ainsi la sensibilité
	de 6 souches d'A. fumigatus parmi celles précédemment étudiées a été testée pour le
	metconazole, le propiconazole, le bromuconazole ou l'époxiconazole en présence ou en
	absence de cyclodextrines. Les tests ont été réalisés avec les mêmes ratios molaires que ceux
	étudiés précédemment (10 :1) pour chaque molécule triazolée (Tableau 12). Ces résultats ont
	confirmé les capacités des cyclodextrines à interagir avec elles.

Tableau 12 : Facteur d'augmentation des concentrations minimales inhibitrices (CMI) observées pour 6 souches d'Aspergillus fumigatus testées selon la méthode EUCAST en présence des fongicides metconazole, propiconazole, bromuconazole et époxiconazole. Les CMIs ont été mesurées en présence des cyclodextrines β-CD et HP-β-CD ajoutées au milieu de culture à un rapport molaire de 10 :1.

Table 1

 1 Physicochemical properties and total element analysis of soils (Douce Terre (DTP), Champ Marie (CMP)).

		DTP	CMP
	Clay (%)	7.73	10.66
	Silt (%)	69.68	74.67
	Sand (%)	22.61	14.71
	Texture	silt loam	silt loam
	pH water	6.70	6.10
	Organic matter (%)	3.86	3.51
	Elements (µg g -1 )
	Al	13399	9300
	As	7.69	8.93
	B	11.24	6.06
	Ca	2364	1400
	Cd	0.21	0.26
	Co	11.37	8.32
	Cr	25.69	18.49
	Cu	7.36	9.33
	Fe	15400	12845
	K	2725	1634
	Mg	1750	1327
	Mn	695	672
	Na	34.26	26.75
	Ni	13.71	10.37
	P	446	495
	Pb	17.32	16.60
	S	171	187
	Si	78.78	75.02
	Sr	9.84	7.36
	Ti	127.24	150.80
	Zn	36.64	35.63
	Hg, Sb, Se, Sn	<LDM a	< LDM

a Limit of detection

Table 3

 3 Mean removal (%) of difenoconazole on raw (RH) and modified (MH) hemp felt(1 disk for 1RH and 1MH, 2 disks for 2RH and 2MH)and Douce Terre (DTP) and Champ Marie (CMP) soils topped by two hemp disks; conditions: percolation (contact time = 2 h); volume 50 mL; soil 10 g; temperature 25 • C; n = 3; difenoconazole concentration C 0 1 mg L -1 .

		1RH	2RH	1MH	2MH
	Hemp alone	27.7	33.6	43	74
	Hemp + DTP	/	99.5	/	99.8
	Hemp + CMP	/	100	/	99.9

Table 2 .

 2 Polymorphism information for the nine microsatellite markers obtained after short tandem repeat for A. fumigatus (STRAf ) typing of sawmill azole-resistant (ARAf ) and azole-susceptible (ASAf ) A. fumigatus.

	Azole

-Resistant A. fumigatus (ARAf, n = 24) Azole-Susceptible A. fumigatus (ASAf, n = 42) Microsatellite Marker N Alleles Repeat Range Median Size Diversity (D) Microsatellite Marker N Alleles Repeat Range Median Size

  Allele counts; D = Simpson index of diversity; NR = non relevant.

										Diversity
										(D)
	2A	5	13-26	14	0.507	2A	11	10-27	18	0.768
	2B	4	10-24	21	0.462	2B	9	12-25	19	0.766
	2C	4	8-16	8	0.552	2C	11	8-20	12	0.868
	3A	11	10-119	32	0.872	3A	19	10-49	26	0.909
	3B	3	8-11	8	0.403	3B	10	8-22	9	0.771
	3C	7	6-32	6	0.649	3C	19	6-45	18	0.924
	4A	5	5-18	8	0.361	4A	13	7-26	9	0.774
	4B	3	7-10	10	0.392	4B	8	5-26	9	0.746
	4C	5	5-30	20	0.465	4C	9	5-36	7	0.770
	Total alleles	47	NR	NR	NR	Total alleles	109	NR	NR	NR
	Average D	NR	NR	NR	0.518	Average D	NR	NR	NR	0.811
		N Alleles =

TABLE 1 |

 1 Sequences of primers used for beta-tubulin and cyp51A and its promoter.

	Sequences

  Figure2and Supplementary Tabledata) did not contain any polymorphisms in the cyp51A gene.

	Among the 113 ARAf that were isolated, 90 isolates contained the
	TR 34 /L98 cyp51A allele, 2 TR 34 /L98/S297T/F495I, 10 TR 46 /Y121F/
	T289A, and 7 non-TR allele (F46Y/M172V/N248T/D255E/E427K,
	F46Y/M172V/E427K, P216L, or G434D). Four ARAf (1E010,
	1E011, and 1E081 from clinical samples and 1E085 from an
	environmental sample,

TABLE 2 |

 2 Genotypic richness, diversity, and evenness information for azole-susceptible and azole-resistant TR 34 /L98H isolates.

	Population	N	MLG	eMLG	L	HGE.5
	Azole-susceptible isolates	112	102	9.93	0.989	4.59	95.03	0.960
	Azole-resistant TR 34 /L98H isolates	90	37	7.80	0.923	3.07	12.98	0.583

N, Number of individuals observed; MLG, Number of multilocus genotypes observed; eMLG, The number of expected MLG at the smallest sample size based on rarefaction; l, Simpson's Index; H, Shannon-Wiener Index; G, Stoddart and Taylor's Index; E.5, Evenness mesure.

TABLE 3 |

 3 Multilocus genotypes (MLG) shared by isolates with TR 34 /L98H allele. In the same sawmill or market garden but different soil samples. Same market garden, in six different soil samples coming from two different sites found 1.5 km apart.

	MLG	Origin of sample	Type of patient or environment	Date of isolation	ID
	MLG A (17 isolates)	Clinic	Cystic fibrosis patient	09/09/2015 a	1E002
				13/12/2016 a	1E003
				10/01/2017 b	1E014
					1E015
				12/01/2017	1E016
				17/01/2017	1E004
				11/07/2017	1E013
				12/07/2017	1E005
				14/09/2017 a	1E071
				10/11/2017 a	1E075
		Environment	Hospital (air)	11/06/2015	1E024
				17/11/2017	1E078
				10/04/2018	1E087
			Sawmill (soil)	24/11/2014	2E007
				16/02/2015	2E017
				09/02/2016	2E008
				06/04/2016	2E014
	MLG B (12 isolates)	Clinic	Hematology	27/04/2012	1E021
				11/05/2012	1E022
			Cystic fibrosis	04/10/2016 a	1E001
		Environment	Hospital (air)	17/10/2017	1E074
				21/11/2017	1E079
			Sawmill (soil)	24/11/2014	2E006
				14/01/2016 c	1E099
					2E002
				31/03/2016	2E016
				21/04/2016	2E011
			Market garden (soil)	10/03/2017 c	1E069
					1E070
	MLG C (8 isolates)	Environment	Market garden (soil)	07/03/2017 d	1E012
					1E034
					1E038
					1E044
					1E050
					1E053
					1E058
					1E062
	MLG D (6 isolates)	Environment	Market garden (soil)	07/03/2017 d	1E033
					1E036
					1E046
					1E047
					1E049
					1E051
	MLG E (4 isolates)	Environment	Sawmill (soil)	14/01/2016	1E100
			Market garden (soil)	07/03/2017 c	1E006
					1E037
					1E052
	Date of isolation: Day/Month/Year.

a Same cystic fibrosis chronically colonized APBA patient. b Two different cystic fibrosis patients. c d

  Le dosage du metconazole et du prothioconazole qui n'avait pas été développé en interne au laboratoire a été sous-traité au groupe EUROFINS.

	Bromuconazole	173 173	145 109	26 30	28,312 ; 29,016	7,6
	Difénoconazole	265 265	202 139	36 40	34,366 ; 34,485	13,8
		Ion précurseur	Ion produit	Energie de collision (en V)	Temps de rétention (en min)	Limite de quantification (en ng.g -1 )
	Propiconazole	173	146	18	26,361 ; 27,066	9,0
		173	109	30
	Tébuconazole	125 125	99 89	20 20	27,353	2,7
	Epoxiconazole	192 192	138 111	12 32	26,648 ; 27,918	2,5
				271

  L'analyse a été réalisée grâce à un génotypage par microsatellite STRAf (short tandem repeat for A. fumigatus)(de Valk et al., 2005) dans le but d'évaluer la parenté génétique entre 65 isolats d'Aspergillus fumigatus résistants ou sensibles isolés dans les cultures maraîchères de l'Est de la France.Les valeurs obtenues pour le dosage des 25 éléments par ICP-AES pour les sols des grandes cultures prélevées en Lorraine et en Bourgogne sont présentées respectivement dans lesTableaux 16 et 17. Résultats du dosage par ICP-AES (en µg.g -1 ) de 25 éléments recherchés dans 11 sols de cultures céréalières de Lorraine.

		Zn Mg Zn	51,6 3501,2 79,7	54,3 2379,7 49,6	85,2 2454,4 46,1	57,3 3398,4 67,6	63,6 3209,2 74,0	74,9 2465,3 53,2	47,8 2646,5 63,7	55,3 2256,3 49,5	26,2 3117,8 62,9	45,4 3724,1 71,2	31,8 2481,7 47,7
		Mg Ti Sr K Ti Sr Sn Hg Sn	3472,0 218,9 15,7 5678,4 377,4 22,8 1,0 < LDM 1,7	3297,3 260,1 17,3 2587,6 62,7 57,1 1,2 < LQM < LQM	5412,3 238,7 33,0 3457,0 138,2 15,2 <LDM < LDM < LQM	3600,2 257,3 17,1 5093,9 250,9 21,3 1,2 < LDM 1,2	4873,1 196,1 9,9 5815,6 178,9 41,3 <LQM < LDM 1,2	21668,7 274,4 38,8 3213,8 153,7 40,2 1,8 < LDM LQM	58627,6 136,6 4975,7 161,5 26,4 125,8 <LDM < LDM 1,2	3592,1 211,2 19,8 2553,8 65,1 45,3 <LDM < LDM < LQM	1139,7 106,7 6,2 5015,0 193,6 17,9 <LQM < LDM 1,5	27563,8 179,8 28,4 5167,6 102,8 31,0 <LDM < LDM < LQM	116,0 10,1 132,2 3317,3 15,3 3477,9 1,0 < LDM 4,4
		K Si Fe Si	3863,9 180,4 29455,4 83,9	4000,9 228,9 25024,9 22,2	5474,6 158,2 22147,1 36,1	3787,6 199,1 28598,2 52,1	3615,7 224,5 36454,5 22,7	11519,9 201,8 16292,3 41,5	13083,7 114,5 30080,7 24,6	4310,4 167,4 17553,2 20,5	1272,7 253,1 28930,1 34,7	11505,6 137,4 31027,7 36,9	4556,9 189,5 21014,8 20,1
	Lorraine Bourgogne Bourgogne	Hg Fe Cu Se Cu Se Sb S Cr Co Cd Sb S	< LDM 24139,9 14,3 <LQM 18,2 LDM <LQM 337,4 < 49,5 14,3 3,0 < LQM 429,6	< LDM 22881,3 15,1 <LDM 10,3 LDM <LQM 368,6 < 34,5 9,1 1,3 < LDM 5596,9	< LDM 34533,2 21,0 <LDM 9,7 LDM 7,6 579,9 < 38,1 12,0 2,8 < LQM 231,6	< LDM 27077,9 17,2 <LDM 15,8 LDM <LQM 344,7 < 52,2 13,9 3,3 < LQM 782,9	< LDM 16249,3 11,1 <LQM 15,0 LDM <LQM 295,6 < 54,2 17,6 1,6 < LQM 1516,8	< LDM 27112,0 28,7 <LDM 17,2 LDM <LQM 1419,3 < 31,5 9,3 1,2 < LDM 4021,0	1,4 18907,4 23,3 <LQM 17,3 LDM 5,5 1763,7 < 46,2 17,3 3,4 < LQM 1098,8	< LDM 32962,2 16,8 <LDM 13,4 LDM 5,4 415,6 < 29,1 8,6 0,9 < LDM 4339,1	< LDM 8492,3 20,0 <LDM 13,7 LDM 3,5 212,6 < 47,6 13,5 2,8 < LQM 318,7	0,7 29676,2 40,2 <LQM 16,6 LDM 6,9 842,7 < 56,7 13,6 1,1 < LQM 1495,8	< LDM 18824,7 10,4 9,8 LDM <LDM <LQM 308,6 < 34,7 12,4 1,0 < LQM 276,4
	Lorraine	Cr Co Cd Pb P Ca Pb B P Ca Ni As Ni B Na Al Na As Mn Mn	38,9 19,0 <LDM 28,1 747,5 7457,8 34,3 8,8 1094,4 3052,0 35,4 15,6 33,8 14,5 66,6 35198,4 125,3 18,9 1015,6 POP 896,9	36,8 16,0 <LQM 28,2 768,4 150924,5 25,2 3,0 921,9 2982,4 30,5 16,1 21,5 17,0 70,2 27434,4 178,3 15,9 824,6 BGP 467,4	60,2 18,6 <LDM 35,3 1010,7 3979,4 28,2 5,4 493,5 7216,2 46,5 8,5 21,9 26,7 141,2 26284,1 84,8 18,9 736,4 CHP 757,2	42,8 20,7 <LDM 31,3 803,5 14419,5 34,7 9,1 1053,1 3089,3 33,3 15,6 33,5 15,2 72,7 36868,4 117,4 25,1 1094,9 PPF 643,5	23,9 9,3 <LDM 17,3 749,9 40559,3 35,7 6,1 1042,2 1649,8 20,5 23,7 40,1 12,1 95,6 36839,9 116,2 6,8 373,4 SFP 1326,2	42,4 16,7 <LDM 31,1 1064,8 114120,3 22,1 4,7 1100,9 24285,0 34,8 9,5 19,4 55,9 237,6 23213,9 140,2 11,4 920,9 MJP 568,3	33,6 12,1 <LDM 24,1 1369,5 29658,5 33,4 5,1 1048,9 85325,1 28,0 15,2 31,8 66,5 518,1 30355,3 96,6 <LQM 753,6 LHP 1679,6	39,9 26,2 <LDM 38,4 1234,2 114452,0 28,2 3,0 713,2 4064,56 35,1 8,2 19,2 15,7 108,6 22360,3 128,6 23,0 1614,7 MOP 466,0	18,1 5,3 <LDM 15,3 719,1 4592,3 32,4 5,2 680,8 1187,0 8,2 13,9 31,5 3,6 27,2 33212,6 99,4 26,8 505,5 MAP 828,2	41,6 16,8 <LDM 30,1 805,0 39109,9 34,7 7,9 690,5 38347,0 34,2 11,8 32,8 47,5 272,1 40959,4 86,6 3,9 1067,3 QUP 708,6	30,0 12,0 23,7 828,6 28,2 4063,8 1,3 574,8 <LDM 20,5 21,4 9,5 1827,5 80,4 67,8 24937,0 20,9 8,5 590,0 PIV 779,8
		Al	22190,1 VSP POP	20643,2 EP BGP	38374,2 TP CHP	21998,9 DJP PPF	12555,0 PCP SFP	33777,7 PP MJP	30301,5 GCP LHP	25586,7 RP MOP	9228,8 LIP MAP	32152,3 BP QUP	19979,3 CBP PIV
	VSP Tableau 16 : 279 EP TP DJP PCP 278 280	PP	GCP	RP	LIP	BP	CBP

Tableau 17 : Résultats du dosage par ICP-AES (en µg.g -1 ) de 25 éléments recherchés dans 11 sols de cultures céréalières de Bourgogne.

© The Author(s) 2021. Published by Oxford University Press on behalf of The International Society for Human and Animal Mycology. All rights reserved. For permissions, please e-mail: journals.permissions@oup.com

Journal of Environmental Science and Public Health

J. Fungi 2020, 6, 120; doi:10.3390/jof6030120 www.mdpi.com/journal/jof

Frontiers in Cellular and Infection Microbiology | www.frontiersin.org September 2021 | Volume 11 | Article 729476

Remerciements

Acknowledgments We are grateful to Pamela Albert for her editorial assistance. The work was financially supported by LTSER Zone Atelier Arc Jurassien and the Observatoire des Sciences de l'Univers Terre Homme Environnement Temps Astronomie de Franche-Comté-Bourgogne. We thank market gardeners who participated in this study.

DFC difenoconazole, NA not available LD limit of detection (4.2 ng g -1 )

Acknowledgments

The authors warmly thank the PEA²t platform (Chrono-environment, University of Bourgogne Franche-Comté, France), which manages and maintains the analytical equipment used in this study. They are especially grateful to Audrey Laboissière and Nathalie Borne for their assistance for sampling and analysis.

Acknowledgment

This work received financial support from the

Observatoire des Sciences de l'Univers Terre Homme

Environnement Temps Astronomie of Franche-Comté-Bourgogne, France. Numerical resources provided by the mesocentre de calcul de Franche-Comté are greatly acknowledged.

Acknowledgments

The authors would like to thank Caroline Amiot and Marguerite Perrey for their technical help and Benoit Renaudot and Guillaume Renaudot for making fields available on their farm. The authors warmly thank the PEA 2 t (Chrono-environment, University of Bourgogne Franche-Comté, France) platform, which manages and maintains the analytical equipment used in this study.

ACKNOWLEDGMENTS

MF is a fellow in the CIFAR Fungal Kingdoms program.

Funding

The study of pots was carried out with the department's own funds and Azole-R Bruker Kit evaluation was supported by a grant from the University Hospital of Besançon, France (CELIA 2019) to E. Scherer.

Funding

The authors would like to thank Observatoire des Sciences de l'Univers (OSU THETA) for funding this study via the ''Caractérisation chimique et physique de sols agricoles traités par des fongicides triazolés'' program.

Funding: This research received no external funding.

Acknowledgments:

We thank Pamela Albert for her editorial assistance.

FUNDING

The routine analyses were carried out within the framework of hospital activity, without external funding. The in-depth analysis of resistant strains was financially supported by LTSER "Zone Atelier Arc Jurassien", "Observatoire des Sciences de l'Univers Terre Homme Environnement Temps Astronomie", Bourgogne Franche-Comte-University, and RECOTOX network supported by AllEnvi and co-carried by INRAE and CNRS-INEE. MF and TS were supported by the UK Medical Research Council and the UK Natural Environmental Research Council.

DATA AVAILABILITY STATEMENT

The raw data supporting the conclusions of this article will be made available by the authors, without undue reservation.

Transparency declarations and Funding

S. Rocchi received meeting sponsorship from Bruker/Biocentrics.

Declaration of interest

The authors report no conflicts of interest. The authors alone are responsible for the content and the writing of the paper.

Conflict of Interest

The authors have no conflict of interest to declare.

Declaration of competing interest

The authors declare that they have no known competing financial interests or personal relationships that could have appeared to influence the work reported in this paper. 34546 78 9 5 7 4 9 6 8 34546 78 9 5 7 4 76 4 9 9 7 4 8 6 9 7 4 459 5 7 4 76 57 4 75 9 57 4 4 6 8 8 6 44 4 4 76 4 779 7 4 9 5 48 46 9 576 49 9 54 8 6 9 7 4 75 9 57 4 9 5 48 9 4 45 34546 78 9 5 9 48 57 4 76 48 4 6 75 75 759 7 9 57 8 4 8 6 9 7 4 !9 8 9 8 6 75 7 4 "57 4 6 9 57 4 757 4 75 9 757 4 76 4 8 4 8 9 6 345 46 78 9 5 539 9 4 6 8 76 4 !446 58 5 4 9 5 49 9 54 6 9 7 4 76 4 76 34 4 9 5 736 9 8 6 4 8 6 8 48 "!46 46 47 75 !9 54 6 6 8 78 3459 7 8 76 4 7 4 4 9 5 8 4 6 4 9 53 4348 7 4 6 75 8 6 4 46 4 7 76 9 48 78 46 9 7 7 ! . /46 !49 0 48 1 7 23324 59 9 23064 746 346 48 1 7 23089 6 9 7 4 7 48 75 9 6 8 758 8 4 8 4 46 38 46 9 58 48 9 78 !7 7 6 49 5758 8 46 75 4458 9 7 46 754 5458 4 9 5 78 06 7 7 758 46 448 74 454 8 4 ':;<= 3454 75 8 8 4 546 9 5 758 46 8 46 38 46 6 4 8 9 53 9 5 8 4 7 78 9 5 06 7 7 48 8 46 9 5 8 4 537 4 8 6 9 7 4 9 6 8 4 8 6 756 8 75 537 46 754 8 6 8 6 4 . /46 !49 0 48 1 7 23324 746 346 48 1 7 23089 >49 8 754 8 8 6 9 7 4 75 4 9 58 6 9 59 7 9 8 4 74 !9 8 4 6 8 9 49 4 8 46 4 9 7 7N9 6 4 6 49 8 754 !9 9 8 4 6 4 8 778 78 9 5 75 4 48 9 5 6 44 E 5 78 7 6 8 O9 9 4P 6 8 58 49 4 8 58 46 9 39 7 78 345 . 78 46 9 9 4 539 9 4 76 79 8 9 9 49 6 49 8 754 75 4 4 48 4 6 46 8 9 4 4 4 7 4 9 5 736 9 8 6 4 47 8 6 49 8 754 4 48 9 5 9 5 8 78 4C9 8 9 5 8 4 74 459 6 5458 9 9 6 7 445 6 4 76 4 6 7 4 8 78 76 4 9 53 4 9 8 4 9 59 9 8 6 75 74 8 76 348 9 53 78 345 8 78 74 46 9 6 8 758 6 46 8 9 5756 8 34546 78 9 58 9 4 YN9 6 46 49 8 754 9 454 !45 7 537 8 6 79 5 4 539 53 8 7 49 4 578 6 7 459 8 9 4 8 8 4 758 9 537 73458 9 7 4 8 8 46 78 4 9 359 758 9 346 5458 6 78 9 5 8 9 758 9 537 4 4 8 75 8 4 8 78 9 59 9 8 8 4 ( H@ Z( % & $ 36 ! 8 8 4 70 6 9 8 7 4 48 9 4 8 6 79 5 8 4 74 49 4 6 7 9 6 9 39 7 9 58 9 4! 8 4 7N9 6 4 6 49 8 754 6 4 8 9 5 75 9 56 474 9 5 9 59 7 9 59 9 8 6 545 8 6 78 9 5 E 5 8 4 9 59 7 9 8 78 9 5 8 9 6 49 8 754 75 47 8 8 46 748 9 79 6 4 6 9 5378 6 478 458 546 8 7576 59 8 9 59 5 9 534 6 4N4575 79 59 8 6 78 9 5 4 6 8 4 6 9 8 9 5 6 76 4 7 4 8 6 9 7 4 6 4 9 8 754 9 5 =? 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SUPPLEMENTARY MATERIAL

The Supplementary Material for this article can be found online at: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2021.

729476/full#supplementary-material

Conflict of Interest: The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest.

Publisher's Note: All claims expressed in this article are solely those of the authors and do not necessarily represent those of their affiliated organizations, or those of the publisher, the editors and the reviewers. Any product that may be evaluated in this article, or claim that may be made by its manufacturer, is not guaranteed or endorsed by the publisher.

Science

Dans les cultures

Dix prélèvements de sols ont été réalisés en surface (5 cm de profondeur) dans chaque parcelle.

Pour chacune des parcelles, un transect a été réalisé sur toute la longueur. Les prélèvements ont été effectués avec du matériel stérile, et conditionnés dans des contenants adéquats, soit des sachets de prélèvement stériles pour l'analyse chimique (lyophilisation préalable des échantillons) soit des pots stériles pour l'analyse microbiologique sur sol frais.

Dans les pots/parterres de fleurs

Quatre zones de prélèvements à l'intérieur de l'enceinte de l'hôpital et dans l'environnement

Prélèvements de poussières au CHU de Besançon

Des capteurs électrostatiques de poussières peuvent être utilisés pour évaluer la nature des communautés fongiques présentes dans un environnement intérieur [START_REF] Scherer | QPCR standard operating procedure for measuring microorganisms in dust from dwellings in large cohort studies[END_REF]. Ce procédé repose sur l'utilisation de lingettes stériles disposées à l'intérieur d'un boîtier qui vont collecter de façon passive les poussières (Figure 33 A). Ces capteurs ont été déposés dans le service de réanimation médicale, tous les mois en 2019.

Cette technique a également été adaptée à l'environnement extérieur, en plaçant 2 de ces lingettes stériles sur un dispositif mobile (Figure 33 B).

Détermination de la structure du sol par granulométrie

La mesure de la taille des particules présentes dans le sol a été réalisée par granulométrie selon

Test de sensibilité par méthode EUCAST

La technique EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) est la technique de référence pour mesurer la sensibilité des souches fongiques à un antifongique [START_REF] Guinea | Method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for conidia forming moulds[END_REF]. Elle fournit la valeur de la concentration minimale inhibitrice (CMI).

Analyse du gène cyp51A et de son promoteur

Comme les mutations sur le gène cyp51A seraient impliquées à 90% dans le développement de résistances aux antifongiques chez A. fumigatus, une amplification et un séquençage du gène et de son promoteur ont été réalisés. Pour permettre de couvrir la quasi-totalité du gène d'intérêt, un total de 5 couples d'amorces a été utilisé (Mellado et al., 2001 ;Alanio et al., 2011). Le programme de PCR est similaire à celui de la PCR β-tubuline précédemment décrit à