Présentations Orales

E N Entreprise

M1 Deborah Garcia

Ada Roy

Quynh-Anh Mai

Colin Lam

Ayumi Yu

M2 (Informel David Bikard

M1 (Informel Antoine Marmignon

TRAJECTOIRE SCIENTIFIQUE

Etudes pré-doctorales

Au cours de mes études en classe préparatoire (Biologie-Chimie-Physique-Sciences de la Terre) puis en école d'ingénieur agronomique (INA-PG, maintenant AgroParisTech), j'ai compris que ma passion consistait à remettre en question et repousser les limites de la connaissance. J'ai donc suivi une formation initiale aussi orientée que possible vers la recherche.

J'ai rapidement éprouvé une attirance particulière pour ce qui touchait à la théorie de l'évolution, qui offre à mes yeux une véritable grille de lecture pour appréhender le monde qui nous entoure. Sans certitude concernant la discipline particulière vers laquelle m'orienter, j'ai profité d'une année de césure pour suivre une formation interdisciplinaire alors en cours de création (désormais master AIRE-LiSc des universités Paris Diderot et Descartes). Ce choix m'a permis, à travers 3 stages consécutifs, de toucher à des disciplines aussi différentes que l'éthologie, la neuroscience et la microbiologie.

C'est à travers ces expériences que j'ai pu forger un intérêt marqué pour les approches expérimentales permettant de manipuler un système complexe de manière profonde et contrôlée, afin de répondre à des hypothèses bien définies. J'ai ainsi choisi de réaliser mon stage de master 2 puis ma thèse sur des problématique d'évolution moléculaire chez les bactéries.

Travaux doctoraux

J'ai réalisé mes travaux doctoraux à l'Institut Pasteur dans le laboratoire de Didier Mazel. Le laboratoire s'intéressait à l'époque principalement à l'étude de systèmes génétiques appelés « intégrons », qui sont largement responsable de l'acquisition rapide de résistances à de multiples antibiotiques par les bactéries. J'ai pourtant initialement rejoint le laboratoire sur un sujet annexe, que j'ai initié au cours de deux stages successifs puis développé sur la première moitié de ma thèse. Je ne me suis tourné vers l'étude des intégrons que dans un second temps, après avoir identifié une question évolutive en lien avec mes intérêts scientifiques. Mes travaux doctoraux ont ainsi porté sur deux projets distincts, ayant comme point commun de s'intéresser à la modulation des capacités d'évolution moléculaire.

2.2.a Manipulation des perspectives évolutive d'un protéine

Code génétique et paysages évolutifs

Le code génétique est redondant : chacun des 20 acides aminés est codé par un groupe de 1, 2, 3, 4 ou 6 codons parmi les 61 codons sens. Les codons du même groupe, dit synonymes, peuvent à priori être remplacé l'un par l'autre sans impact immédiat pour la protéine. Nous verrons plus tard que de tels changement peuvent néanmoins avoir des effets fonctionnels marqué. A une autre échelle, les changements synonymes peuvent également avoir des conséquences en termes de possibilités évolutives. Le code génétique est en effet structuré de telle manière que certains codons synonymes peuvent atteindre des sous-ensembles d'acides aminés différent les uns des autres par simple mutation ponctuelle (voir Figure 1). En fonction des acides aminés, il est ainsi possible de distinguer jusqu'à 4 sous-ensembles.

Paysagisme évolutif et preuve de principe

J'ai développé l'algorithme « Evolutionary Landscape Painter » (ELP) pour générer jusqu'à 3 séquences synonymes à une séquence de référence. Collectivement, ces séquences permettent d'atteindre l'ensemble des acide-aminés atteignables par mutation ponctuelle à partir d'une séquence protéique donnée. En soumettant en parallèle un tel ensemble de séquences synonymes au même protocoles d'évolution dirigée, il est ainsi possible d'étendre l'espace de séquence et donc de fonction exploré.

J'ai utilisé ELP pour définir une version synonyme d'un gène de résistance aux antibiotiques. Cette version synthétique a été assemblé à partir d'oligonucléotides conçu pour s'hybrider en se chevauchant de proche en proche tout au long de la séquence. Aujourd'hui, ce type de gène synthétique peut être commandé en ligne et reçu en quelques jours pour quelques dizaines d'euros. Les gènes sauvage et synthétique ont par la suite été soumis aux mêmes protocoles de PCRs mutagènes et de sélection sur un panel d'antibiotiques différents. Les clones présentant une plus forte résistance ont été isolés puis séquencés. Cette procédure à effectivement mené à l'isolation de mutants différents selon la version du gène, démontrant que l'utilisation de séquence synonyme judicieusement définies permet de découvrir davantage de variants d'intérêts.

Chemin évolutif et dérive génétique

D'un point de vue plus théorique, ces résultats m'ont mené à approfondir le lien avec la dérive génétique neutre. Les mutations synonymes sont souvent considérées comme neutres. Ne changeant pas la séquence protéique, elles ne devraient en effet fournir ni avantage ni désavantage sélectif à l'organisme. L'exploration de l'espace de séquence neutre est soumise au seul phénomène de dérive génétique [START_REF] Bulmer | The selection-mutation-drift theory of synonymous codon usage[END_REF] . Que des séquences puissent passer par un intermédiaire synonyme pour arriver à un acide-aminé inaccessible directement est alors une question de taille de population, de chance et donc de temps. En réalité, les séquences de codons synonymes peuvent contenir d'autres types d'informations que l'encodage des acides aminés, menant par exemple à la modulation de l'expression ou du reploiement des protéines 2 .

Je me suis appuyé sur des simulations informatiques pour évaluer l'impact du passage par un intermédiaire faiblement délétère sur le suivi d'un chemin évolutif. Ces simulations ont pu montrer qu'en fonction de la taille de population, des effet intermédiaires même minimes peuvent considérablement retarder l'apparition d'une mutation avantageuse ultérieure.

Publication

Nous avions initialement considéré publier ce travail dans la revue Nature Biotechnology. L'éditeur nous avait alors demandé de démontrer le principe inverse, selon lequel la manipulation de l'usage de codon pourrait retarder l'apparition de mutation. D'une certaine manière, nous l'avions déjà fait : que certaines mutations ne soient obtenues que par une séquence synonyme alternatives et non par la séquence sauvage montre bien qu'utiliser la séquence sauvage contraint l'apparition de la mutation en question. L'éditeur souhaitait néanmoins une démonstration plus concrète, sur un système moins artificiel. Ayant déjà travaillé près de trois ans sur ce projet, je n'ai pas souhaité lancer d'autre expériences. Ce travail a finalement été publié dans PLoS genetics 3 , qui jouissait alors de meilleurs indicateurs bibliométriques que présentement. Il est à cet égard intéressant de constater que l'« impact » de beaucoup des journaux en accès ouvert suit une courbe caractéristique, avec une envolée sur une petite dizaine d'année suivie d'une forte chute.

Le principe de manipulation de séquences synonymes, ainsi que le programme ELP en découlant, ont fait l'objet d'un brevet international (Mazel D, Cambray G, Institut Pasteur, #EP1799823 B1). Celui n'a jamais été exploité. Le principe en est tellement simple qu'il est de fait très difficile d'en empêcher l'utilisation par des tiers. D'un point de vue de valorisation mercantile, il aurait probablement été plus judicieux de ne pas breveter, ni publier ce principe pour l'exploiter comme secret industriel.

Travaux complémentaires

Que les mutations synonymes puissent avoir des effets sur l'expression des protéines constitue l'un des centres d'intérêt de mes travaux postdoctoraux et actuels. La séquence synonyme synthétisée au cours de ce projet avait elle-même un fort effet négatif sur la résistance à l'antibiotique utilisé en routine avec ce gène. Cet effet était vraisemblablement lié à un défaut d'expression. Bien que nous n'ayons pas cherché à le caractériser plus avant, cette observation avait piqué mon intérêt. Pour un autre gène, le désavantage de l'un des gènes synonymes était tel que la protéine n'était pas détectable. Des travaux ultérieurs dans le laboratoire de Didier Mazel ont permis de circoncire le problème au tout début de la séquence synonyme en question. Mes travaux postdoctoraux m'avait alors amenés à clairement identifier un impact très négatif de structures secondaires de l'ARN sur l'initiation de la traduction [START_REF] Mutalik | Precise and reliable gene expression via standard transcription and translation initiation elements[END_REF][START_REF] Mutalik | Quantitative estimation of activity and quality for collections of functional genetic elements[END_REF][START_REF] Cambray | Evaluation of 244,000 synthetic sequences reveals design principles to optimize translation in Escherichia coli[END_REF] . Des mutations synonymes en début de gène peuvent facilement mener à la formation de telles structures.

Ces observations m'ont conduit, près de 10 ans plus tard, à améliorer l'algorithme ELP en introduisant une option permettant de contraindre les structures secondaires en début de gène. Ce travail a été publié dans Biotechnology and Bioenginnering 7 .

2.2.b Élucidation de la dynamique adaptative des intégrons

Le système intégron

Les intégrons sont des systèmes génétiques assurant capture et expression de régions codantes exogènes et généralement sans promoteur connues sous le nom de cassettes 8 . Ces éléments ont été décrits vers la fin des années 1980, suite à l'isolation de plasmides conférant de multiples résistances aux antibiotiques. Trois éléments essentiels constituent la plate-forme fonctionnelle commune à tous les intégrons : i) Un gène codant une intégrase responsable de la mobilisation des cassettes par recombinaison spécifique de site (intI) ii) Un site de recombinaison dit primaire (attI) iii) Un promoteur orienté dans le sens opposé par rapport à l'intégrase (Pc).

A cette plateforme fonctionnelle stable est associé un ensemble de cassettes dont la composition varie fortement selon les isolats. Une cassette est composée d'un gène sans promoteur flanqué de deux sites de recombinaison secondaire dit attC. Les intégrases d'intégrons sont capable de catalyser la recombinaison entre deux sites attCs menant à l'excision de cassettes sous forme d'intermédiaires circulaires, puis leur réintégration subséquente (voir Figure 2).

Ce processus assure à la fois le réarrangement des cassettes présentes dans un génome et l'échange de cassettes entre individus, qu'ils soient de la même espèce ou d'espèces différentes. Ce mécanisme de variation sophistiqué explique la forte diversité génétique associée à ce locus. Il est important de noter que l'intégration de cassettes circularisées se fait préférentiellement au site attI, immédiatement en aval du promoteur Pc. En permettant un niveau d'expression maximal aux gènes nouvellement insérés, cette propriété assure l'expression phénotypique d'une diversité auparavant cachée. Elle est associée à un ensemble de cassettes dédiées, qui consistent essentiellement en une séquence codante flanquée de deux sites de recombinaisons secondaires, attC. Seules les quelques premières cassettes sont exprimées par Pc et participent ainsi au phénotype. Les autres forment un réservoir de diversité génétique silencieuse. Ces traits potentiellement adaptatif peuvent être amené sous expression par excision aléatoire puis réintégration au site attI, le tout catalysé par l'intégrase. La recombinaison est contrôlée par le système SOS de réponse au stress, permettant ainsi aux intégrons d'exercer une forme de mutation dirigée dans l'espace et dans le temps.

On distingue deux types d'intégrons : les intégrons de multi résistance (MRI) et les intégrons chromosomiques de type super-intégrons (SI). Les MRI sont généralement portés par des plasmides ou des transposons, ce qui leur confère une forte mobilité et favorise leur dissémination horizontale (i.e. entre bactéries non-apparentées). Ces MRIs contiennent un nombre limité de cassettes codant essentiellement pour des phénotypes de résistances aux antibiotiques. Ils se trouvent principalement chez des bactéries à Gram négatif. Des SIs ont quant à eux été identifiés chez environ 10% des bactéries séquencées. Les exemples prototypiques se trouvent chez les Vibrionaceae, dont les génomes peuvent porter plus de 200 cassettes [START_REF] Mazel | Integrons: agents of bacterial evolution[END_REF] . Les fonctions associées à ces cassettes sont pour la plupart inconnues. Leur importance adaptative semble cependant incontestable, sachant qu'elles peuvent collectivement représenter une fraction non-négligeable de génomes bactériens, qui se trouvent par ailleurs sous pression de sélection réductrice. Leur rôle serait d'assurer l'adaptation de leurs hôtes face à certains environnements naturels fluctuant. Ils seraient les ancêtres et la source d'approvisionnement des MRIs.

Nécessité ́ d'une régulation

Les cassettes de gènes ne portant généralement pas de promoteur propre, l'expression des cassettes associées à un intégron dépend de leur éloignement vis-à-vis du promoter Pc, et donc de leurs positions respectives dans l'intégron (voir Figure 2). De cette manière, la recombinaison de cassettes s'apparente à un type sophistiqué de mutation. Ces mutations se caractérisent par un réarrangement génétique (l'ordre des séquences), immédiatement corrélé à un changement phénotypique (la mise sous expression d'une cassette préalablement peu ou pas exprimée au niveau du promoteur Pc). Le résultat d'un tel changement phénotypique peut être positif-si le produit de la cassette nouvellement recombinée confère un avantage adaptatif à l'organisme dans son environnement actuel-ou délétère-si le nouvel arrangement abaisse le niveau d'expression d'une cassette nécessaire à la survie en la repoussant plus loin du promoteur Pc, ou plus simplement si le produit de la cassette nouvellement exprimée s'avère toxique dans les conditions du moment. La fréquence des évènements de mutations-recombinaisons est ainsi soumise à sélection. Plus précisément, le gène modificateur que constitue l'intégrase est soumis à sélection de par son impact indirect sur la fitness relatif aux changements du niveau d'expression des cassettes.

De manière étonnante pour un système génétique spécialisé dans la génération de diversité, les fréquences de recombinaison au sein des intégrons était -jusqu'à ce travail -inconnues. Toutes les expériences visant à décortiquer le fonctionnement du système ont en effet été effectuées en surexprimant artificiellement l'intégrase 8 . De fait et malgré nombreuses tentatives, aucune recombinaison n'a jamais été observée dans un environnement génétique naturel. Malgré son importance pour la compréhension du système, l'étude expérimentale de la dynamique de recombinaison des intégrons était donc difficile.

Détermination théorique du taux de recombinaison optimal

En collaboration avec Luis Miguel Chevin, je me suis dans un premier temps, attaché à développer une simulation informatique dans le but de déterminer la valeur théorique du taux de recombinaison optimal. Ce modèle-que nous n'avons jamais publié-nous a permis de montrer que l'intégrase idéale doit assurer un taux de recombinaison égal à la fréquence moyenne des changements environnementaux (voir Figure 3). Une fréquence de recombinaison trop élevée mène en effet à plus de changements phénotypiques que nécessaire et donc à l'élimination continue et en pure perte d'une trop grande partie de la population. En revanche, un taux de recombinaison trop faible par rapport aux variations environnementales, diminue la probabilité de générer un mutant favorable lorsque nécessaire, et augmente ainsi les chances d'extinction de la population. Ce type de scénario rappelle celui d'un jeu d'argent dans lequel il faudrait en début de partie déterminer la mise avancée à chaque tour en fonction des risques et gains potentiels, de manière à gagner sur le long terme. Cela correspond à un modèle dans lequel coexistent différents allèles d'intégrase, assurant chacun un taux de recombinaison constant mais différent. La sélection de second ordre assure alors le succès des allèles d'intégrase présentant les taux de recombinaison les plus proches du taux de fluctuation environnemental moyen.

L'incapacité à observer un évènement de recombinaison en laboratoire suggérerait alors que l'intégrase ait été sélectionnée pour assurer un très faible taux de recombinaison, correspondant à des changements environnementaux hypothétiques rares. Dans le monde réel, il n'est pas évident que la notion de « taux de fluctuation environnemental moyen » soit pertinente. Par exemple, des périodes d'intenses changements successifs peuvent en effet succéder à des périodes de stase prolongées. Cela implique que l'allèle qui serait optimal globalement, ne le serait jamais ponctuellement. Il n'est par ailleurs pas évident que la distribution des valeurs de recombinaison accessible par l'intégrase soit suffisamment continue pour permettre la génération d'un allèle adéquat. Une population contenant initialement 30 geńotypes en frequences eǵales (5 cassettes diffeŕentes x 6 alleles d'integrase) a eté soumise à une simulation evolutive de type Monte-Carlo selon trois reǵimes de fluctuations environnementales successifs et caracteŕiseś par des frequences de plus en plus faible (taux de changement environmental de 10 -2.5 , 10 -3 , puis 10 -3.5 par geńeŕation). La valeur geńetique optimale pour chacun des 75 environnements succesifs est indiqueé dans le bandeau du haut par les point blancs cercleś de vert. Le graphique A montre l'evolution au fil des geńeŕations de la frequence des 6 alleles de l'inteǵrase. Chacun de ces alleles authorise une frequence de recombinaison diffeŕente, ainsi qu'indiqué dans l'encadré à droite de la figure. Ces frequences varient en fonction du reǵime de fluctuation de l'environnement. Des peŕiodes de stases environnementale prolongeés entrainent l'augmentation en frequence de l'allele nul (en noir). Le graphique B montre l'evolution de la frequence de recombinaison moyenne de la population, calculeé à partir des donneés du graphique A. La frequence de recombinaison moyenne seĺectionneé dans la population tend a eǵaler la frequence des changements environnementaux.

Un modèle alternatif -et plus satisfaisant biologiquement -permet de satisfaire à la même relation que le modèle des paris à taux fixes. On peut en effet obtenir un taux de recombinaison égal à la fréquence moyenne des changements environnementaux si l'on considère une intégrase recombinant à 100%, mais qui ne serait exprimée que lors des fluctuations. Dans cette perspective, les mutationsrecombinaisons ne seraient générées que lorsqu'elles sont nécessaires, réduisant ainsi les pertes dans la population au minimum.

Validation expérimentale d'un branchement au système SOS

Guidé par ces réflexions, j'ai entrepris une analyse détaillée de la région promotrice de l'intégrase afin d'en identifier les éventuels opérateurs de régulation. Ce travail s'est fait en collaboration avec le laboratoire de Marie-Cécile Ploy, qui travaillait plus particulièrement sur les intégrants multi-résistant. Cela nous a amené à mettre en évidence qu'une séquence correspondant au motif reconnu par la protéine LexA chevauche le promoteur de l'intégrase des MRIs de classe 1 (intI1) et du SI de Vibrio cholerae (vchIntIA).

La boite LexA est le motif opérateur du système SOS, un regulon de réponse générale au stress [START_REF] Friedberg | The SOS response of prokaryotes to DNA damage[END_REF] . Ce motif est reconnu spécifiquement par la protéine LexA. Lorsqu'il est localisé dans la région promotrice d'un gène, l'association de LexA à ce motif empêche l'initiation de la transcription, et donc réprime l'expression du gène en question. Nombre de conditions stressantes peuvent conduire à la formation d'ADN simple brin, et ce, selon des modalités variées. La présence d'ADN simple brin en excès est reconnue par le système SOS comme un indice signalant des conditions adverses pour la cellule. Il a par exemple été établi que certains antibiotiques étaient capables d'activer la réponse SOS, directement ou indirectement [START_REF] Aertsen | Upstream of the SOS response: figure out the trigger[END_REF] . L'intégration de ce signal s'effectue par la protéine RecA qui, s'associant à l'ADN simple brin sous forme d'un nucléofilament protéique, est capable d'activer l'auto-protéolyse de LexA. Le clivage de LexA entraîne la libération de ces sites de fixation et permet ainsi l'expression des gènes du régulon SOS. Chez E. coli, ce régulon comprend environ 40 gènes qui sont notamment impliqués dans la réparation de dommages occasionné à l'ADN. La dynamique d'activation de ces gènes après exposition à un stress dépend de l'affinité des motifs opérateurs vis-à-vis de LexA, de leur nombre et de leurs positions. Ceci autorise une réponse étagée dans le temps et différentes selon la gravité du stress. La diade RecA/LexA est très largement distribuée dans le règne bactérien, bien que les motifs opérateurs reconnu par LexA ainsi que la composition du régulon s'avèrent très variables selon les espèces. La réponse SOS a été impliquée dans l'activation et la dissémination de facteurs de virulence (phages, transposons...). Par ailleurs, la réparation de dommages infligés à l'ADN (e.g. par exposition aux ultraviolet) par les polymérases translésionnelles du système permet la survie des cellules au prix d'un taux de mutagénèse élevé. De manière incidentes, ces mutations peuvent ainsi accélérer la vitesse dévolution des bactéries en conditions adverses.

La présence d'un site de fixation potentiel de LexA chevauchant le promoteur du gène intI dans les SIs et les MRIs suggère donc fortement une régulation de l'expression des intégrases d'intégrons par la réponse SOS via LexA. Nous avons tout d'abord vérifié la fonctionnalité des sites de fixation de LexA dans les MRIs de classe 1 et dans le SI de V. Cholerae in vitro par des expériences de retard sur gel. Grâce à des rapporteurs LacZ, nous avons ensuite analysé l'expression de ces intégrases in vivo en culture planctonique chez les bactéries sauvages et ce pour différents mutants du système SOS. Nous avons ainsi pu montrer que l'expression de l'intégrase était spécifiquement et directement induite en réponse à des agents chimiques, en particulier des antibiotiques. La simulation présentée plus haut identifie toutefois clairement le taux de recombinaison comme le paramètre essentiel gouvernant le comportement du système. Nous avons donc vérifié que l'induction de la synthèse de l'intégrase se traduisait bien en une augmentation de l'activité recombinase de cette protéine in vivo. De cette manière, la connexion de l'intégron au système SOS entraîne une diversification phénotypique immédiate par réarrangement ou acquisition de cassettes dans la population stressée, tout en garantissant la stabilité de leur agencement dans des conditions normales.

Généralisation par étude bioinformatique

Afin d'évaluer la valeur générale de ses résultats, nous avons entrepris une analyse bioinformatique à plus grande échelle. Nous avons ainsi identifié plus de 600 séquences d'intégrases sur la base de données GenBank et les avons ré-annotées de manière cohérente. Nous avons également recherché la présence de boite LexA, et propagé un modèle basé sur la structure tridimensionnelle d'une intégrase afin de déterminer le statut fonctionnel de chacun de ces gènes. Selon ces données, environ 50% des intégrases présentent une boite LexA, et près de la moitié des protéines correspondantes ne seraient pas fonctionnelles. Nous avons observé que la majorité des intégrases fonctionnelles sont contrôlées par une boite LexA, alors que la majorité des intégrases inactivées après des mutations ne le sont pas. Cette corrélation suggère un lien causal entre régulation de l'expression et fonctionnalité de la protéine. Dans la simulation informatique présentée plus haut (voir Figure 3), des périodes de stase environnementale prolongées s'accompagnent d'une monté en fréquence de l'alléle d'intégrase inactif. Il est en effet délétère de recombiner si les conditions environnementales ne changent pas. En l'absence d'un système de régulation pertinent, cette pression de sélection peut mener à l'inactivation pur et simple de l'intégrase. Il est également possible que l'inactivation de l'intégrase mène à la dégénérescence du motif opérateur. Quelle que soit le sens de la relation de causalité, ces résultats montrent l'importance de la régulation SOS pour le système des intégrons. Nous avons également reporté ces données sur un arbre phylogénétique des intégrases. Cela nous a permis de montrer que la régulation SOS constitue très probablement l'état ancestral du système, bien qu'un clade entier semble avoir perdu cette caractéristique. Il est important de noter que toute les classes de MRIs cliniquement importantes portent des boite LexA, même si deux d'entre elles (classes 1 et 3) branchent dans le clade autrement dénué de régulation. Cette observation souligne l'importance fonctionnelle de la régulation par le système SOS dans le cadre des résistances aux antibiotiques.

Publications

La partie la plus expérimentale de ces résultats a été publiée dans la revue Science 12 . L'analyse bioinformatique, jugée trop longue pour le format très court imposé par ce journal, a par la suite été publié dans la revue plus spécialisée Mobile DNA [START_REF] Cambray | Prevalence of SOS-mediated control of integron integrase expression as an adaptive trait of chromosomal and mobile integrons[END_REF] . Le chapitre introductif de ma thèse consacré aux intégrons a été publié comme article de revue 8 .

2.2.c Bilan des travaux de thèse

Mes travaux de thèse ont été récompensé par le prix Louis Forest décerné par la Chancellerie des Universités de Paris. Ces travaux m'avaient montré deux choses : i) L'importance évolutive de la régulation de l'expression génique ii) La puissance méthodologique d'une discipline naissante, la biologie synthétique. Pour mon post-doctorat, j'ai donc choisi de me joindre à un projet atypique dont le but était de produire une collection ouverte d'éléments standardisés de contrôle de l'expression génique chez la bactérie modèle E. coli. J'ai pour cela été soutenu par le prix « jeunes chercheurs » de la fondation Bettencourt-Schueller.

Travaux post-doctoraux

2.3.a Standardisation du contrôle de l'expression génique bactérienne

Contexte

Dès la fin des années 90s, Adam Arkin (Université de Californie, Berkeley) et Drew Endy (Université ́ Stanford) avaient produit un manifeste argumentant le besoin de créer des collections d'élément génétique standardisés, dans le but de faciliter les entreprises d'ingénierie génétique [START_REF] Arkin | A Standard Parts List for Biological Circuitry[END_REF] . Il aura fallu une dizaine d'année et la montée en puissance disciplinaire de la biologie synthétique pour que ce projet voit le jour. Le « BIOFAB : International Open Facility Advancing Biotechnology » a été financé par la National Science Foundation (NSF), dans le cadre plus général du récemment créé consortium de recherche américain en biologie synthétique, SynBERC. Un consortium similaire a été crée quelques années plus tard en Grande-Bretagne [START_REF] Clarke | Synthetic biology in the UK -An outline of plans and progress[END_REF] . Rien de comparable n'a été initié en France, avec pour conséquence un retard et un manque de soutien envers la biologie synthétique que l'on ne peut que regretter.

J'ai rejoint le projet BIOFAB quelques mois après son lancement en tant que chef d'équipe postdoctorant. Je partageai cette fonction avec Vivek Mutalik, un autre post-doc plus sénior en poste dans le laboratoire d'Adam Arkin depuis quelques années. Le but était de caractériser des éléments de contrôle de l'expression génique-composants fonctionnels nécessaire à toute entreprise d'ingénierie génétique.

BIOFAB s'est rapidement avérée une entreprise assez compliquée, tiraillé entre statut de plateforme de production d'un côté et de développement technologique de l'autre. Dans une large mesure, Drew Endy prônait une approche pragmatique visant dans un premier temps à produire et caractériser le plus d'éléments génétique possible, pour éventuellement déterminer d'éventuelles limitations par la suite. Adam Arkin avait quand a lui une vision plus théorique et consciente d'un problème fondamental : les séquences biologiques interagissent entre elles et leur modularité ne représente qu'une abstraction limitée. Que de telles interactions s'avérèrent trop importante-ne serait-ce qu'un pour type d'élément-nierai l'utilité de caractériser finement des collections d'éléments génétique standard. Un autre type de doute entourait l'entreprise de caractérisation : pourquoi vouloir développer des composants génétiques capable de performances prédictibles en termes d'expression alors que dans la grande majorité des cas les expérimentateurs n'ont aucune idée du niveau d'expression optimale qu'il faudrait atteindre ? La question se posait de savoir s'il fallait que l'on établisse une preuve de principe de l'utilité de ce genre de collections en la comparant, par exemple à des approches d'évolution dirigée.

Le cumul de ces tensions et du décalage culturel m'a initialement beaucoup déstabilisé. Nous avons malgré tout réussi à produire un ensemble d'articles cohérents, présentant des avancées méthodologiques majeures.

Projet pilote : identification des interactions majeures entre éléments

Notre premier projet a consisté en la définition et l'implémentation d'une méthode pour mesurer de manière rigoureuse la performance intrinsèque d'un élément génétique (son activité biologique d'intérêt) ainsi que l'étendue des interactions possible avec d'autres composants génétiques (la dépendance au contexte). Les résultats obtenus devaient permettre de prioritériser nos efforts ultérieurs. Nous avons établi une collection de 7 « promoteurs » et 11 « 5'UTR » très utilisés dans la littérature. Ces éléments correspondent ici plus à des concepts qu'à de véritable séquence bien définie. Un 5'UTR représente formellement la séquence non traduite d'un transcrit située en amont d'une séquence codante. Une définition simple et cohérente d'un promoteur concernerait la séquence en amont du point de départ de la transcription et contenant les signaux nécessaire et suffisant à l'initiation de la transcription. Sans préjuger de la difficulté à définir exactement les limites exactes de ces signaux, la notion même de point de départ de la transcription est problématique car celui-ci n'est pas nécessairement absolu dans une construction donnée (plusieurs sites peuvent être initié), mais il dépend également du contexte de séquence de sorte que composer un « promoteur » donné avec diverse « 5'UTRs » peut changer la définition exacte de leurs séquences respectives.

Pragmatiquement, nous avons choisi d'ignorer ce problème et de construire toutes les combinaisons possibles entre 7 séquences contenant un promoteur, 11 séquences correspondant approximativement à un 5'UTR et deux gènes rapporteurs très différent en termes de séquence (sfgfp et mrfp). Ces 154 assemblages ont été obtenu en utilisant la méthode de clonage Golden Gate, qui venait alors tout juste d'être décrite. Ces combinaisons ont également été assemblée dans des vecteurs intégratifs afin de comparer niveaux d'expression plasmidiques et chromosomiques. Nous avons par la suite mesuré les niveaux de fluorescences produit par chacune de ces constructions en cinétique à l'échelle populationnelle sur des lecteurs de plaque et à l'échelle cellulaire à l'équilibre en milieu de phase exponentielle par cytométrie de flux.

L'avancé majeure de cette étude a consisté à introduire l'utilisation formelle de l'Analyse de Variance (ANOVA) pour décrire le comportement des éléments génétiques. Les traitements étudiés par ce type d'analyse sont souvent des facteurs extrinsèques appliqués de manière différentielle aux individus formant l'échantillon étudié-par exemple, des facteurs environnementaux. Ici, les facteurs étaient la composition même des individus, les éléments génétiques avec lesquels ils avaient été composés. Dans ce cadre les effets principaux de l'ANOVA-pour un élément donné, la moyenne des mesures sur l'ensemble des constructions comprenant cet élément-permet d'estimer la performance intrinsèque des éléments. Les écarts moyens par rapport aux attendus-en considérant un modèle additif basé sur ces effets principaux-mesure alors de manière effective les interactions entre différents types d'éléments. Ces analyses ont permis de quantifier la qualité la fiabilité des éléments génétiques testés, montrant ainsi que certains éléments aux performances similaires pouvait présenter des dépendances au contexte plus ou moins marquées (Figure 4). Bien entendu, plus un élément est testé en combinaisons avec un nombre important d'éléments de contexte, plus ces estimations seront représentatives de la réalité.

Bien que le nombre d'éléments génétiques testés dans ce projet fût relativement limité, nos résultats ont clairement montré un faible niveau d'interaction entre promoteurs et 5'UTR, reléguant ainsi le problème de la standardisation du point de départ de transcription au second plan. L'interaction entre 5'UTR et séquences codantes s'est en revanche avéré très importante (Figure 4), ce qui nous a amené à nous focaliser sur cet aspect.

Pour environ deux tiers des intégrations chromosomiques, nous n'avons pu mesurer de fluorescence de manière fiable, le signal étant trop faible. Pour les autres, les données étaient très bien corrélées aux mesures plasmidiques. Outre l'abondance de protéines rapporteur fluorescents, nous avions aussi quantifié l'abondance des transcrits par RT-qPCR et analysés les résultats par ANOVA. Les données en question souffraient cependant d'une forte erreur expérimentale, la RT-qPCR étant une technique assez délicate à mettre en oeuvre à l'échelle de 462 échantillons.

Changement d'échelle : synthèse, clonage et séquençage à haut-débit

Au travers d'une collaboration avec Sri Kosuri et George Church (Harvard Medical School, Cambridge, États-Unis d'Amérique), j'ai participé au développement d'une approche à plus haut-débit pour cette méthode. Ce projet a permis d'évaluer 114 « promoteurs » et 111 « 5'UTR ». Les combinaisons d'éléments génétique ont pour cela été programmées directement dans des oligonucléotide simple brin synthétisé à haut-débit sur une surface solide, puis récupéré en un unique soluté complexe. Ces séquences ont alors été amplifiées par PCR de manière à obtenir quantité d'ADN double brin puis introduite par clonage enzymatique dans des vecteurs rapporteurs pour former une bibliothèque de souches portant chacune une unique construction.

L'abondance des transcrits pour chaque construit de la bibliothèque a alors pu être quantifié en une seule expérience de RNA-Seq, de manière beaucoup plus robuste et rapide que nous n'avions pu l'effectuer à plus petite échelle par RT-qPCR. La séquence d'un promoteur n'étant pas accessible dans la séquence des transcrit produit, l'assignement d'un transcrit donné à son promoteur d'origine reposait sur l'introduction lors du design des séquence synthétique de code barres spécifique au niveau du 3'UTR. Les mesures de RNA-Seq sont également normalisée par des données de DNA-Seq pour corriger d'éventuel biais compositionnel de la bibliothèque.

L'abondance des rapporteurs produits a été quantifié par FACS-Seq, une technique qui consiste à fractionner la bibliothèque de souches en plusieurs groupes discrets de fluorescence croissante. Une bibliothèque de séquençage à haut-débit est alors construite par PCR à partir de chacun de ces sous groupe en prenant soin d'introduire un index renseignant l'identité du groupe. Après séquençage, le dénombrement de ces index pour chaque construit de référence permet de reconstruire un profil rugueux de fluorescence suffisant pour estimer des moments de premier-voire de second-ordre (voir Figure 5).

Résolution partielle des interactions entre 5'UTR et séquences codantes

Des travaux datant de la seconde moitié des années 80s avaient identifiés l'implication potentielle de structures secondaires des transcrits dans l'initiation de la traduction [START_REF] Smit | Secondary structure of the ribosome binding site determines translational efficiency: a quantitative analysis[END_REF][START_REF] Schmidt | Determination of the RNA secondary structure that regulates lysis gene expression in bacteriophage MS2[END_REF] . Ces structures empêcheraient la reconnaissance de la séquence dit de Shine-Dalgarno, située une dizaine de nucléotide en amont du codon initiateur de la traduction, par la séquence complémentaire de l'ARN ribosomale 16S. De telles structures secondaires avait par la suite été identifiées dans le mécanisme de régulation de la traduction par des riboswitchs [START_REF] Sherwood | Riboswitch-Mediated Gene Regulation: Novel RNA Architectures Dictate Gene Expression Responses[END_REF] . Des travaux tout récents venaient également de les impliquer dans l'expression différentielle de séquences synonymes [START_REF] Kudla | Coding-Sequence Determinants of Gene Expression in Escherichia coli[END_REF] , ce qui m'avait particulièrement interpellé vers la fin de ma thèse. Il semblait ainsi probable que l'émergence de structures secondaires aux jonctions entre 5'UTR et séquences codantes puisse être la cause de l'interaction observée.

Dans cette perspective, il s'agissait pour nous de trouver une stratégie à même de limiter la formation de telles structures. Quelques études datant elles aussi des année 80s avaient montrée que des systèmes bicistroniques-dans lesquels le codon d'initiation d'un gène d'intérêt était chevauché par le codon stop d'un court cadre de lecture ouvert situé en amont-pouvaient conduire à une augmentation de niveau d'expression d'un gène d'intérêt [START_REF] Schoner | Translation of a synthetic two-cistron mRNA in Escherichia coli[END_REF][START_REF] Makoff | The use of two-cistron constructions in improving the expression of a heterologous gene in E.coli[END_REF] . Depuis lors, l'activité hélicase des ribosomes avait été clairement démontrée [START_REF] Takyar | mRNA helicase activity of the ribosome[END_REF] . Il nous est donc apparu que l'effet de ces système bicistroniques était lié à la déstructuration de structures restreignant l'initiation de la traduction du gène d'intérêt par des ribosomes traduisant la séquence codante située juste en amont. Après traduction de cette séquence en amont, les ribosomes pourraient alors initier la traduction du gène d'intérêt de manière facilité dans un contexte déstructuré et selon un mécanisme de couplage traductionnel [START_REF] Adhin | Scanning model for translational reinitiation in eubacteria[END_REF] .

Nous nous sommes donc employés à caractériser une collection de 5'UTRs contenant un court cistron dont la traduction serait couplée à celle de la séquence codante d'intérêt. Nous avons comparé les performances de cette collection a celles d'une collection composée de séquence 5'UTRs identiques dans leur partie aval, mais écourté du début du premier cistron dans leur partie la plus en amont (voir Figure 6). Nos résultats ont permis de clairement montrer que les constructions bicistroniques offraient un comportement normalisé, et donc une bien meilleure fiabilité entre séquences codantes. Ce problème d'interaction largement résolu, la caractérisation fine d'une de 5'UTRs et de promoteurs prenait tout son sens.

A mon sens, deux points importants ont cependant été largement passé sous silence dans l'article résultant de ce travail : i) La comparaison monocistronique/bicistronique présentée plus haut n'est pas des plus exactes. Les structures secondaires sont très sensibles aux changements de contexte de séquence. Par ailleurs, le début d'un 5'UTR peut influencer la stabilité des transcrits de manière importante. Il aurait donc fallu comparer des séquences les moins différentes possibles, plutôt que des séquences tronquées de plusieurs dizaines de nucléotides dans le cas des versions monocistroniques. Cela aurait pu être accompli assez simplement en mutant le codon initiateur du premier cistron, afin que ce dernier ne soit pas traduit, abolissant ainsi l'effet du couplage traductionnel. L'urgence du moment avait conduit à rejeter cette suggestion. ii) Les données d'expression brutes montrent un effet très important des séquences codantes. Certaines sont systématiquement exprimées de manière faible, quelle que soit le 5'UTR bicistronique avec lequel elles sont composées. Cela ne remet pas en question l'effet normalisateur de l'organisation bicistronique sur le rang des 5'UTRs, un élément plus performant menant toujours à davantage de protéines produites. Mais pour certaines séquences codantes, cela peut ne représenter qu'une faible quantité dans l'absolu. Ces deux points ont joué un rôle important dans la maturation de mon projet individuel de post-doctorat.

Terminateurs et interférences structurales

Les terminateurs déterminent l'arrêt de la transcription et donc l'identité des 3'UTRs des transcrits. Dans le cadre d'opérons, une activité partielle peut mener à la production de transcrits isoformes. Chez E. coli, il existe des terminateurs Rho-dépendant, dont l'activité dépend du recrutement de la protéine Rho selon un mécanisme complexe ne se prêtant pas à l'ingénierie d'éléments standardisés. Un autre type de terminateurs-dit intrinsèques-ne nécessite pas l'intervention de facteur tiers. Leur mécanisme met en jeu la formation d'une courte structure secondaire capable de tirer le transcrit hors du complexe de transcription en brisant les liaisons faibles de l'hétérodimère ADN:ARN au niveau d'une répétition de U situé immédiatement en aval de la structure secondaire [START_REF] Carafa | Prediction of rho-independent Escherichia coli transcription terminators[END_REF][START_REF] Peters | Bacterial Transcription Terminators: The RNA 3'-end Chronicles[END_REF] .

Avec le recul, je pense que l'efficacité et la position exacte du site de terminaison aurait pu être déterminé à haut-débit en développant une approche de type RNA-Seq dédiée. Je n'avais à l'époque aucune connaissance dans ce domaine et nous avions donc choisi de nous appuyer sur un système composé de deux rapporteurs situés de part et d'autre du terminateur à tester. Le rapport entre les mesures de fluorescences issues de ce deux rapporteurs permet d'estimer l'efficacité de la terminaison. Ce choix d'une mesure indirecte introduit plusieurs complications : i) Le calcul d'une efficacité de terminaison absolue repose sur la normalisation par une séquence de référence supposée n'avoir aucune activité terminatrice. De manière surprenante, une telle séquence n'est pas facile a identifier, la plupart des séquences testée ayant montrée une faible activité terminatrice. En pratique, nous avons choisi la séquence avec la plus faible activité, mais cela introduit un caractère relatif aux quantifications.

ii) Une forte efficacité de terminaison se traduit par l'absence de production du second rapporteur fluorescent. La qualité de l'évaluation dans éléments le plus performants dépend donc d'une absence de signal et de la sensibilité de la machine utilisée pour faire la mesure.

iii) Les structures secondaires pouvant limiter l'action des exonucléases, la présence de terminateurs en fin de transcrits pourrait en influencer la stabilité des isoformes produit par le système rapporteur de manière différentielle, confondant ainsi la quantité de rapporteurs produits. Dans le but de limiter ce facteur, je me suis attaché à standardiser les transcrits produit en introduisant des sites de coupure de l'ARN de part en d'autre de la séquence testée. Nos résultats ont montré que cette standardisation est essentielle, confirmant ainsi indirectement que les terminateurs influencent la stabilité des transcrits. Nous n'avons cependant pas mesuré l'effet stabilisateur directement.

Nous avons mesuré l'activité de 61 terminateurs (voir figure 7). Nous avons utilisé ces données pour construire un modèle statistique de l'activité de terminaison, mais les résultats ce sont avérés assez décevant en terme de prédiction ab initio. Le nombre de U et leur proximité de la structure secondaire a été identifié comme l'un des meilleurs prédicteurs. L'énergie libre de la structure du terminateur n'est en revanche pas un très bon prédicteur. Le peu de mutant inclus dans ce jeu de données n'étaient pas bien décrit par le modèle.

L'un des aspects les plus intéressant de ce travail concernait l'étude des l'interférence potentielles avec les séquences immédiatement en amont du terminateur. Nous avions pour hypothèse que ces séquences puissent interférer avec la formation de la structure secondaire du terminateur. Pour étudier cet aspect, certain terminateurs naturels avait été cloné en version minimale ou en présence des 30 nucléotides issues de leur contexte naturel en amont en en aval. Pour certains de ces terminateurs, nous avons en effet observé une plus faible efficacité de terminaison du terminateur minimal. Des simulations de reploiement co-transcriptionnel ont montrées que la formation de la structure terminatrice adéquate pouvait prendre davantage de temps dans un contexte minimal en raison de structures parasites n'existant pas dans la version plus étendue. Ces résultats suggèrent que les contextes naturels sont optimisés pour ne pas interférer avec le processus de terminaison et gagneraient à être inclus dans les éléments standardisés. Cette conclusion ne saurait néanmoins être systématisée. En effet, pour l'un des terminateurs la version étendue présente une bien plus faible efficacité de terminaison. Dans cet exemple, la séquence en amont s'est révélé contenir une séquence anti-terminatrice dont la fonction biologique est précisément d'interférer avec la formation du terminateur. Cette interférence fait partie d'un mécanisme complexe d'antiterminaison permettant de réguler l'expression d'une voie métabolique [START_REF] Chan | Dissection of the his leader pause site by base substitution reveals a multipartite signal that includes a pause RNA hairpin[END_REF] .

Publications

Tous les articles issus de BIOFAB ont été publiés le même mois. L'article sur le projet pilote et celui sur la standardisation par l'utilisation de bicistron ont été publié conjointement dans Nature Methods [START_REF] Mutalik | Precise and reliable gene expression via standard transcription and translation initiation elements[END_REF][START_REF] Mutalik | Quantitative estimation of activity and quality for collections of functional genetic elements[END_REF] . Celui sur les terminateurs a été publié dans Nucleic Acid Research [START_REF] Cambray | Measurement and modeling of intrinsic transcription terminators[END_REF] . Les travaux menés en collaboration avec l'équipe de George Church ont été publiés quelques mois plus tard dans PNAS [START_REF] Kosuri | Composability of regulatory sequences controlling transcription and translation in Escherichia coli[END_REF] .

2.3.b Test d'hypothèse sur l'efficacité de la traduction à l'échelle génomique

Contexte

J'avais initialement rejoint le projet BIOFAB suite à une visite du laboratoire d'Adam Arkin. Mes motivations personnelles-consistant à utiliser la caractérisation d'un grand nombre de séquences pour mieux en comprendre le mécanisme fonctionnel et éventuellement le lien avec l'évolution de l'expression-étaient plus proche de celles d'Adam. Face à l'orientation un peu trop pragmatique initialement imprimée à BIOFAB, j'ai rapidement oeuvré à l'obtention d'une bourse de post-doctorat me garantissant une certaine indépendance scientifique.

Une année après mon arrivé en Californie, j'ai ainsi été l'heureux lauréat d'une bourse de 3 ans du Human Frontier Science Program (HFSP). J'ai continué pendant 6 mois, à travailler dans le giron de BIOFAB, physiquement situé dans le très récent Joint BioEnergy Institute à Emeryville (commune limitrophe de Berkeley). Cela m'a permis de terminer les projets en cours et de bien identifier le problème scientifique auquel je souhaitais répondre. C'est aux alentours de cette période que nous avons été amené à collaborer avec le laboratoire de Church, dont les approches consistant à marier synthèse et séquençage de l'ADN à haut-débit m'ont ouvert de nouveaux horizons méthodologiques. J'ai ensuite rejoint le laboratoire d'Adam Arkin situé dans un vieux bâtiment de UC Berkeley, juste avant que celuici ne déménage dans un flambant neuf Energy Biosciences Building. L'implication du laboratoire dans l'Energy Biosciences Institute, m'a offert un accès gracieux à la technologie de synthèse d'ADN à hautdébit développé par Agilent, l'un de ces partenaires industriels.

J'ai souhaité développer un projet mettant à profit ces nouvelles capacités de synthèse pour explorer de manière aussi rationnelle et extensive que possible l'espace des séquences, et utilisant ensuite le séquençage au haut-débit pour évaluer les conséquences de ses variations de manière systémique, en mesurant mesurant autant de phénotypes d'intérêt que possible. La question sur laquelle j'ai choisi de me focaliser a été dictée par des observations issues de mes travaux doctoraux et postdoctoraux.

Implémentation de plan d'expérimentation statistique dans des séquences d'ADN

Contrairement aux éléments génétiques traités plus haut, les séquences codantes ne peuvent être abstraites en tant que collection d'élément réutilisable. En effet, chaque nouvelle application suppose l'utilisation de fonctions et donc de protéines différentes. Dans le cadre d'un contrôle intégré de l'expression génique, il s'agit donc de comprendre les principes régissant l'efficacité de la traduction des protéines pour mieux pouvoir les maitriser.

Le recodage de séquences synonymes effectué durant ma thèse, m'avait sensibilisé à l'importance présumé de l'usage de codon sur l'efficacité de la traduction. Des travaux très récents, venaient pourtant de suggérer l'importance primordiale des structures secondaires du transcrit sur l'initiation de la traduction [START_REF] Kudla | Coding-Sequence Determinants of Gene Expression in Escherichia coli[END_REF] . Le système bicistronique que nous étions en train de valider à BIOFAB pour en contrecarrer l'effet était néanmoins en train de mettre en évidence le fort impact de la séquence codante sur le niveau d'expression (Figure 6, panneau de droite). Une nouvelle théorie, concernant l'existence d'une rampe d'accélération traductionnelle universellement présente en début de gène pour réguler le trafic des ribosomes, venait renforcer l'idée selon laquelle l'usage de codon et leur agencement les uns par rapport aux autres était important pour contrôler la dynamique traductionnelle [START_REF] Tuller | An Evolutionarily Conserved Mechanism for Controlling the Efficiency of Protein Translation[END_REF] . D'autres travaux avaient conclu au rôle de la composition en nucléotide des séquences 30 ou encore à celui de la nature des acides-aminés encodés [START_REF] Tuller | Composite effects of gene determinants on the translation speed and density of ribosomes[END_REF] .

La plupart des propriétés de séquence ainsi étudiées sont définies à partir de la même séquence sous-jacente. Ces propriétés sont ainsi des facteurs confondants les uns envers les autres. Chaque jeu de données présente ces propres biais s'opposant à la résolution de ces facteurs confondants. Dans de rare cas, des études mécanistiques s'appuyant sur des mutations avaient pu tenter de contrôler plusieurs propriétés [START_REF] Allert | Multifactorial determinants of protein expression in prokaryotic open reading frames[END_REF] , mais le faible nombre de séquences étudiées (de l'ordre d'une centaine au maximum) ne permettait pas d'aller très loin dans ce sens. Les données de génomiques fonctionnelles offrent des tailles d'échantillon plus importantes, mais celles-ci restent néanmoins très modérées et la composition et le contexte des séquence y est fortement biaisée. Ces limitations sont communes à l'étude de nombre de processus biologiques. La conception à façon d'un grand nombre de séquences permet d'y répondre de manière particulièrement élégante par la programmation de véritables plans d'expérimentation statistiques.

J'ai ainsi entrepris de ré-analyser des données de génomique fonctionnelle publiées chez E. coli 32 pour obtenir une image cohérente des impacts croisés des différentes propriétés de séquence décrites comme ayant un effet sur la traduction. Au terme d'un effort de près d'un an, j'avais défini une liste de 8 propriétés les plus prometteuses à mon sens, définissant méthodes de calcul, positions sur la séquence, distributions génomique et corrélations les unes envers les autres. Ce travail en lui-même aurai certainement justifié une publication. En me basant sur la distribution génomique de ces propriétés, j'ai pu définir des seuils délimitant des catégories discrètes (niveaux). Le but était de produire des séquences explorant systématiquement toutes les combinaisons possibles des ces niveaux pour toutes les propriétés d'intérêt. Ce type de plan d'expérimentation-appelé factoriel plein-permet d'extraire des estimations non-biaisées des effets principaux et interactions des propriétés d'intérêt [START_REF] Ilzarbe | Practical applications of design of experiments in the field of engineering: a bibliographical review[END_REF][START_REF] Montgomery | Design and Analysis of Experiments[END_REF] . Cette approche correspond à celle utilisée pour la caractérisation d'éléments génétiques (Figure 4) mais à un niveau d'organisation inférieur, celui des propriétés de séquence.

Tout en contrôlant l'effet de chaque mutation sur l'ensemble des propriétés, je souhaitais reproduire l'équivalent d'études mécanistique dans lesquelles des mutations ciblées sont introduites dans une séquence de référence pour en évaluer les conséquences. L'explication d'un phénotype donné par les propriétés choisies devrait être comparable entre des séries mutationnelles issue de séquences de référence indépendantes, à moins que des propriétés non considérées dans le plan expérimental ne soient également importantes. A ce stade, nos collaborateurs à Agilent nous ont annoncé qu'ils étaient désormais capables de produire des bibliothèques d'oligonucléotide de synthèse atteignant une complexité de 244,000 séquences uniques. Mon plan d'expérimentation définissant 1,458 combinaisons possibles de niveaux de propriétés, il était donc envisageable d'en produire 167 réplicas indépendants. Au lieu de 167 séries mutationnelles complétement indépendante, j'ai décidé d'ajouter un niveau de réplication additionnel, dans l'objectif de quantifier la validité des méthodes de mesure définies pour les propriétés. Pour chaque séquence synthétique, deux autres lui différant par 1 à 4 nucléotides seraient générées tout en maintenant la combinaison de niveaux de propriétés caractéristique de cette séquence. Si la méthode de calcul utilisée pour mesurer ces propriétés en fournit une description adéquate, on s'attend à ce que ces proches séquences se comporte de manière comparable au niveau phénotypique.

Le plan expérimental consistait donc à générer 56 séries mutationnelle indépendantes, chacune construite autour d'une séquence de référence et explorant en triplicat toutes les 1,458 combinaisons de propriété dans un point focal de l'espace des séquences. L'implémentation d'un plan expérimental d'une telle complexité n'est pas envisageable à la main, d'autant que certaine propriété étant naturellement corrélées, certaines combinaisons sont très difficiles à atteindre. Il n'existait aucun outil pour accomplir cette tâche. Je me suis donc associé à Joao Guimaraes, étudiant en informatique faisant jusqu'alors sa thèse dans le cadre de BIOFAB pour développer D-Tailor (voir Figure 8).

Il est très difficile de prédire l'effet des mutations en prenant en compte leur effet sur l'ensemble des propriétés d'interets. D-Tailor est donc bâti autour d'un algorithme génétique dans lequel des mutations aléatoires sont introduites dans une séquence. Leurs effets sur les différentes propriétés sont alors calculés et les mutations ne sont conservées que si elles permettent de se rapprocher d'une combinaison de propriétés cibles non encore satisfaite. Toutes les séquences évaluées sont stockées dans une base de données et peuvent être accédé à tout moment par l'algorithme. Un système d'opérateur mutationnels permet d'orienter les mutations pour certaines propriétés qui peuvent s'y prêter. Nous avons construit cet outil d'optimisation multiple de manière à pouvoir être facilement étendu à d'autres propriétés. Nous avons également intégré un mode d'analyse de génome qui permet de reproduire les données nécessaires à la définition initiales des propriétés d'intérêt et de leur catégorisation en niveaux discret.

Il aura fallu plus de 3 mois pour générer l'ensemble des séquences désirées. Les séquence servant de point de départ à l'algorithme on été produites au hasard avec pour contrainte d'être équidistante les unes par rapport au autre dans l'espace de séquence (Hamming). Pour nombre de ces séquences initiales, il s'est avéré impossible de dériver un plan d'expérimentation complet. Il aura en tout fallu essayer 387 séquences initiales pour dériver les 56 séries mutationnelles comprenant au moins une séquence pour chacune des 1,458 combinaison. Les deux séquences distantes de 1 à 4 nucléotides ont alors été générées, si elles n'étaient pas déjà présentes dans la base de données. Pour chacune des séries, les séquences finales ont été choisie de manière à minimiser la distance moyenne entre séquences. Il nous sera plus tard reproché de ne pas avoir utilisé de séquences naturelles comme point de départ. Je ne pense pas que cela soit une critique légitime était donné l'artificialité du rapporteur utilisé pour évaluer ces séquences.

Évaluation multi-phénotypique de 244,000 séquences

Les séquences synthétiques générées par D-tailor ont été synthétisées par Agilent, amplifiées par PCR, clonées sous forme de fusions N-terminales à un rapporteur fluorescent et transformées dans E. coli. La taille maximale de ce type d'oligonucléotides de synthèse était à l'époque de 150 nucléotides. Les extrémités de ces oligos devant servir de site d'hybridation pour l'amplification par PCR, la taille utile de programmation était donc de l'ordre de 100 nucléotides. Ces contraintes avaient fait partie du choix de l'initiation de la traduction comme système d'étude. Le calcul de certaines des propriétés d'intérêts (une des structures secondaires ainsi que la position et force d'un goulot d'étranglement du flux présumé de ribosome défini par l'ordre des codons) prenait en compte une partie de la séquence constante du vecteur. Il a donc fallu que le système rapporteur soit construit et validé avant la génération de la bibliothèque synthétique.

La construction et la validation de ce système rapporteur aura été étalée sur plus d'une année. Je me permets ici d'insister sur ces caractéristiques car l'article résultant de ce travail ne rend pas justice au cahier des charges drastique que je m'étais imposé : i) Je voulais éviter des effets sélectifs sur la bibliothèque en dehors des phases de tests phénotypiques. J'ai pour cela utilisé le plus fort des promoteurs inductibles identifié dans le cadre de BIOFAB pour contrôler l'expression du système rapporteur [START_REF] Mutalik | Precise and reliable gene expression via standard transcription and translation initiation elements[END_REF] . Ce promoteur comportant un operateur LacO, j'ai cloné l'allèle de répresseur LacI q directement sur le plasmide de manière à garantir la plus forte répression possible. ii) Je souhaitais établir un contexte 5'UTR intrinsèquement optimal pour l'initiation. J'ai pour cela introduit une séquence Shine-Dalgarno parfaite à diverses distances du codon initiateur de la traduction, puis déterminé la distance idéale en clonant des séquences aléatoires en fusion N-terminale. iii) Je tenais aussi à ce que les fusions N-terminales puissent être clivée du rapporteur fluorescent après traduction, de manière à éviter qu'une possible influence sur la stabilité des protéines ne confondent les résultats. J'ai pour cela utilisé la protéase TEV [START_REF] Kapust | Controlled Intracellular Processing of Fusion Proteins by TEV Protease[END_REF] placée sous le contrôle d'un promoteur inductible et vérifié son efficacité pour diverse fusion N-terminales. Le site de coupure de TEV a été placé après une séquence codant pour un chaine polypeptidique flexible de manière à éviter que la coupure ne dépende de la nature du peptide synthétique. Je pensais comparer les résultats obtenus sur la bibliothèque de variants synthétique avec et sans induction de TEV, pour vérifier l'impact des séquences synthétique sur la stabilité des protéine produites, mais n'ai finalement jamais réalisé cette comparaison, toutes les expériences ayant finalement été conduites sous induction de TEV. iv) Mécontent de la manière dont avait été testées les constructions bicistroniques dans le cadre de BIOFAB, je me suis attaché à développer un système bicistronique inductible. Le but était d'en contrôler l'effet sur les structures secondaires sans altérer les séquences sous-jacentes. Il s'agissait pour ce faire de contrôler la traduction du premier cistron. Deux possibilités s'offraient à moi : l'utilisation d'un système de riboswitch ou l'utilisation d'un système de réassignement de codon stop. Les riboswitchs supposant des changements structuraux qui aurait pu interférer avec les structures secondaires d'intérêt, j'ai opté pour le second choix. J'ai donc utilisé un système inductible d'incorporation d'acide aminé non-naturel au codon amber [START_REF] Young | An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli[END_REF] . Il a fallu introduire toute la machinerie nécessaire à ce système puis déterminer le point d'insertion de ce codon donnant le meilleur signal lorsque ce système était activé, tout en garantissant l'absence de couplage lorsqu'il ne l'était pas. v) Afin de contrôler pour des facteurs de bruit extrinsèque [START_REF] Elowitz | Stochastic gene expression in a single cell[END_REF] , un autre gène fluorescent sous expression constitutive de niveau intermédiaire a été introduit sur le même plasmide que le système rapporteur.

Certains des fonctions nécessaires au fonctionnement de ce système rapporteur ont été introduite sur un plasmide accessoire de manière à diminuer la taille du plasmide portant le système rapporteur principal et d'ainsi garantir des efficacités de transformation importantes.

J'avais séparé les séquences synthétiques en trois groupes distincts. Chacun de ces groupes était mobilisable à partir du mélange d'oligonucléotide de synthèse par PCR, avec un couple d'amorce spécifique. Deux de ces groupes étaient constitués de séquences suffisamment distantes les unes des autres pour que chaque 18-mers n'y soit présent que dans une unique séquence. Le but de cette partition était de permettre de conduire des expériences de profilage de ribosome. Dans ce type d'expérience les ribosomes protègent des fragments de transcrit sur lesquels ils sont immobilisé et les fragments protégés sont ensuite séquencés [START_REF] Ingolia | Genome-Wide Analysis in Vivo of Translation with Nucleotide Resolution Using Ribosome Profiling[END_REF] . Si ces fragments ne sont pas assignables à une séquence unique ils ne peuvent être utilisés. Ce genre de situation arrive rarement dans des génomes naturels, mais est très fréquente dans nos séries mutationnelles. En fin de compte, je n'ai jamais eut le loisir de réaliser ces expériences de profilage, et cette séparation en trois groupes a juste introduit des contraintes supplémentaire en terme de construction et recomposition de la bibliothèque finale.

J'ai utilisé, adapté ou développé des protocoles de séquençage à haut débit ciblé sur la séquence synthétique pour mesurer les phénotypes suivants : i) Abondance de protéine : j'ai utilisé une version un peu plus résolutive que celle présenté Figure 5, catégorisant la plage d'expression en 16 groupes. Ce phénotype a été mesuré avec ou sans induction du couplage traductionnel.

ii) Abondance et stabilités des ARN : il s'agit essentiellement d'un RNA-seq ciblé. La transcription a été arrêté par antibiotique et des aliquots ont été prélevé sur des intervalles de temps distribué exponentiellement. Avant l'extraction de l'ARN, un volume constant d'un mélange de souche comprenant des séquences de référence dans des ratios bien défini a été ajouté à chaque échantillon. Ces références sont essentielles pour normaliser les données de séquençage et comparer l'évolution des échantillons au cours du temps. Il n'est possible de mesurer la stabilité du transcrit rapporteur qu'au niveau de la séquence synthétique, d'éventuelles dégradations différentielles ne sont pas accessibles par cette méthode. Cette expérience étant particulièrement lourde, elle n'a pas été réalisé en condition de couplage traductionnel. Elle s'est par ailleurs révélée assez peu reproductible entre réplicas biologiques, de sorte qu'il m'a été impossible de calculer des demi-vies robustes. J'ai donc essentiellement utilisé les données des premiers et derniers points de temps, me permettant respectivement de décrire l'abondance a l'équilibre et la fraction résistante à la dégradation de chaque transcrit.

iii) Distribution des polysomes : les cellules en phase de croissance exponentielle ont été congelée et broyée dans un pétrin en présence d'azote liquide, puis lysé davantage dans un broyeur de cellule a bille, le tout en présence d'antibiotique bloquant la traduction. Ce broyat a été soumis à ultracentrifugation sur un gradient de sucrose de manière à séparer les ARNs par leur charge en ribosomes. Après indexage, le séquençage de ces différentes fractions permet de reconstruire des profils de polysome pour chacune des séquences. Lors de cette expérience, j'ai omis d'isoler et de séquencer les transcrits libres. Cette donnée aurait portant été intéressante. iv) Taux de croissance : celui-ci est est lié à l'évolution de la fréquence des séquences synthétique au cours du temps [START_REF] Opijnen | Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms[END_REF] . Les séquences imposant les coûts les plus important sont rapidement éliminée de la population. Des différences plus minimes demandent une plus faible résolution temporelle. Des échantillons ont donc été prélevé à différents point de temps. Les estimations issues de leur analyse ont alors pu être combiné en une mesure de croissance intégrée.

Comparativement aux étapes de conceptions, les mesures expérimentales ont été accomplie rapidement en l'espace de quelques mois. Il s'agit d'une particularité de ce type d'approche : si l'investissement initial est lourd, le retour sur investissement en termes de facilité, reproductibilité et volume de données généré est important.

Complexité de l'intégration systémique

Ce projet à permis de générer un jeu de données unique de part la taille d'échantillon (244,000), sa structuration et le nombre de mesures effectuées (plus d'une dizaine). Établir, donner sens et mettre en forme l'analyse de ces données m'aura pris plus de 3 ans, le processus ayant été ralenti par l'inopportune nécessité de mon rapatriement en France. Les observations intéressantes ne manquaient pas. La difficulté principale a été d'intégrer ces observations dans un cadre explicatif cohérent. Cet exercice m'a fait prendre conscience de la place prépondérante de l'interprétation dans l'analyse des données scientifique. Au gré de l'incorporation de nouvelles données, j'ai dû à maintes reprises déconstruire le cadre explicatif apparemment cohérent que j'avais pu forger et qui était jusqu'alors. Hors changement de paradigme majeur, Il est bien entendu que l'entreprise scientifique fonctionne par affinement successifs et réfutation graduelle des modèles en place. Dans le cadre de ce projet, les réfutations successives brutales m'ont donné l'impression assez désagréable d'être continuellement en train d'inventer une explication relative, qui-si elle se rapprochait peu être de plus en plus d'une véritéserait bientôt infirmé par une nouvelle observation. Le cadre explicatif le plus cohérent que j'ai pu bâtir autour de l'ensemble des données collecté est résumé ci-après. Il ne fait pour moi aucun doute que l'incorporation d'une nouvelle mesure phénotypique remettrait certaines de ces conclusions en question.

Les structures secondaires de l'ARNm jouent des rôles multiples et prévalant dans le déterminisme du régime de traduction et, par extension, sur la physiologie cellulaire. Les structures secondaires limitant les taux d'initiation de la traduction via l'occlusion des sites de liaison aux ribosomes (Shine-Dalgarno) représentent le déterminant le plus important de la production protéique. L'activation du mécanisme de couplage bicistronique permet de lever cette limitation sur l'initiation, mais seulement partiellement. Ces résultats suggèrent que ces mêmes structures limitent l'élongation du premier cistron, abaissant ainsi l'efficacité du couplage. Nos résultats de couplage ont également révélé l'impact de structures secondaires situées vers le début de la séquence codante mais ne mobilisant pas le motif Shine-Dalgarno, ainsi que l'existence et l'impact fonctionnel de fluctuations dynamiques entre structure alternatives.

La levée partielle des contraintes d'initiation par couplage traductionnel révèle un impact clair mais modeste de l'usage de codons, qui n'était pas détectable autrement (Figure 9A). En outre, l'amélioration de l'usage de codon conduit à une charge de ribosome sur les transcrits légèrement inferieure, témoignant ainsi d'un temps de résidence moindre sur les transcrits. La composition en AT des séquences synthétiques influence également légèrement initiation, indépendamment des structures secondaires (Figure 10). Il est possible que ce paramètre capture une information structurale mal décrite par les prédictions thermodynamiques.

Les taux de traduction effectifs déterminés par les séquences synthétiques affectent le taux de croissance des différentes souches de manière non-monotone (Figure 9B). Un régime de traduction faible est le résultat de fortes structures secondaires au niveau du codon initiateur. Les transcrits qui montrent en outre de fortes structures dans le gène en aval sont beaucoup moins labiles et s'accumulent dans la cellule, entrainant ainsi et de manière inattendue un faible taux de croissance, bien que très peu de protéines ne soit produites. Ces transcrits sont associés à un seul ribosome (monosomes), qui semble être bloqué à l'étape d'initiation. Les faibles taux de croissance apparaît donc comme la conséquence d'une séquestration ribosomale par des transcrits anormalement abondants et lents à l'initiation (Figure 9C). L'augmentation du taux d'initiation, naturel ou artificiel par couplage traductionnel, permet d'atténuer ce coût par l'augmentation du flux ribosomique ainsi que la diminution de la stabilité ́ des transcrits lié à la déstabilisation des structures secondaire. Au delà ̀ d'un certain point, l'augmentation du régime de traduction détermine une diminution quasi-linéaire du taux de croissance liée au coût de biosynthèse des protéines. Pour ces raisons mécanistiques complexes, le taux de croissance optimal se trouve donc à un régime de production de protéique intermédiaire.

La production de protéine représente environ la moitié des dépenses énergétiques d'une cellule. Près des 40% de ces dépenses sont utilisées à maintenir la machinerie traductionnelle. Les ribosomes Chaque point représente une des 237,644 constructions pour lesquelles nous avons pu mesurer la production de protéine en absence et présence de couplage traductionnel. L'induction du couplage permet de lever la contrainte majeure imposée par les structures secondaires sur l'initiation de la traduction sans introduire de mutation, révélant ainsi des contrainte secondaires. Chaque point est coloré en fonction du CAI de la séquence synthétique correspondante. Le CAI est une mesure normalisée utilisée couramment pour prédire l'efficacité de traduction. Pour une production de protéine donnée en condition normale, l'induction du couplage augmente d'autant la production de protéine que la séquence présente un fort CAI. B. Impact physiologique négatif de faibles taux d'initiation traductionnel. Le nuage de point montre une association non-monotone entre production de protéine et taux de croissance. Que des fortes productions aient un impact négatif sur la croissance est attendu. De faibles taux de production peuvent occasionner des impacts tout aussi négatifs. Les points sont colorés en fonction de la stabilité des structures secondaire localisées dans la partie le plus en aval des séquences synthétiques. Les courbes de tendances cyan et jaune représentent le taux de croissance médian à chaque percentile de production protéique pour les 10% de la population programmés avec des structure secondaires les plus et moins stable à cette position, respectivement. Ces données suggèrent que de fortes structures secondaires dans les séquences codantes en abaisse l'efficacité de traduction, et ce de manière particulièrement marquée pour de faible taux d'initiation. C. Modèle explicatif de l'effet physiologique négatif d'une forte structuration des transcrits. Les transcrits non-traduits mais déterminants un faible taux de croissance sont les plus abondants à l'équilibre. Ces transcrits présentent une combinaison de forte structures secondaires en début de séquence synthétique (limitant l'initiation) et de forte structure secondaire non chevauchante en aval de la séquence synthétique (favorisant la stabilité des transcrits). Chaque transcrit peut mobiliser un unique ribosome dans un processus d'initiation inefficace et particulièrement lent. Puisque ces transcrits sont très stable cela mène a la séquestration effective d'un grand nombre de ribosome. En déstabilisant les structure, chaque événement traductionnel abaisse la stabilité des transcrits. La séquestration nonproductive de ribosome abaisse d'autant les taux de traduction, renforçant ainsi la stabilité des transcrit et ce phénomène de séquestration en un cercle vicieux.

coûtent donc cher et doivent être utilisé de manière parcimonieuse et efficace. L'existence de biais d'usage de codon est généralement interprétée dans cette optique. Les protéines le plus exprimées seraient codées par les codons les plus performants qui-parce qu'ils seraient traduits plus rapidement-mobiliseraient les ribosomes de la manière la plus efficaces possible. A l'inverse, des protéine fortement exprimées codées par des codons peu efficaces mèneraient à des séquestrations de ribosome impactant négativement la cellule dans son ensemble. Dans mes données, il n'existe aucune association entre les descripteurs d'usage de codons utilisés dans ce projet (qu'ils soient globaux ou locaux) et le taux de croissance. Ainsi que présenté plus haut, de telle associations existent néanmoins avec les structures secondaires.

Dans l'ensemble, cette étude indique que l'importance accordée dans la littérature aux biais d'usage de codon reflète davantage la facilité avec laquelle ce type d'indicateurs peuvent être calculées qu'à leur prévalence mécanistique véritable. La prédiction de structures secondaires in vivo est en effet un exercice particulièrement délicat. J'ai dans ce travail principalement utilisé la minimisation de l'énergie libre comme paramètre permettant de décrire les structures. J'ai pu réaliser de nombreuses observations indiquant que ce paramètre, et plus généralement la justesse des prédictions structurale, pouvait largement être remis en question. Cela est certainement d'avantage le cas pour des séquences naturelles. Il est donc probable la difficulté à obtenir des indicateurs structuraux fiable limite considérablement la reconnaissance du rôle prépondérant de ces structures secondaires, ainsi que l'établissement de prédictions fonctionnelles fines.

De manière générale, nos observations confirment que l'étape d'initiation est bien le facteur limitant de la cinétique du processus de traduction. La mobilisation de ribosome lié à la lenteur de cette étape n'avait jusqu'alors pas été associé à un fardeau cellulaire. Ce dernier est très apparent dans le cas de transcrit très abondant mais non traduit, mais semble néanmoins général. La lenteur de l'initiation reflète en grande partie les mécanismes de contrôle mis en place pour discriminer un véritable codon initiateur. Son coût est vraisemblablement contre balancé par l'évitement d'évènements de traduction non-ciblées menant à la production de polypeptides sans fonctions, voire associé a des effets délétères et au gaspillage de ressources.

Quantifier ce qu'on ne comprend pas

Lors de la conception de ce projet, je m'imaginais que focaliser autant de séquences, construites rationnellement en prenant en compte l'état de l'art dans le domaine, sur une si petite région et dans un contexte contrôlé me permettrait de construire des modèles explicatifs très performants. J'ai été profondément affecté de réaliser que ce n'était pas le cas. Dans une large mesure cela met en exergue la complexité de ce genre d'entreprise. Aussi raffiné soit-t-il, mon plan expérimental ne permet par exemple d'expliquer qu'environ 1/3 de la variance en fluorescence mesurée à l'échelle de la bibliothèque. De manière particulièrement intéressante, ce plan expérimental permet néanmoins d'estimer l'origine de ce qu'on n'explique pas (Figure 10) : i) Environ 10% de la variance correspond à des impacts différentiels des propriétés d'intérêt entre séries mutationnelles. Cela signifie que selon les séquences, certaines propriétés pourraient avoir plus d'impact que d'autre. Cela peut aussi vouloir dire que dans certaines séries mutationnelles, certaines propriétés sont systématiquement mal prédites : je pense que c'est particulièrement le cas par les structures secondaires. ii) Un autre 10% correspond à des différences de comportement entre séries mutationnelles non liées aux propriétés d'intérêt. Cela signifie que certaine série comporte des facteurs non-identifié influençant la grande majorité de leurs membres. Je n'ai néanmoins pas réussi à identifier de tel facteurs. iii) Près de 7% de la variance correspond à des différences de fluorescence entre séquences distantes de 1 à 4 nucléotide censée représenter la même combinaison de propriété d'intérêts. Cela montre que le calcul des propriétés d'intérêt n'est pas dénué d'erreurs et n'arrive pas à capturer de manière adéquate l'effet d'un faible nombre de mutations. A nouveau, je pense que la source principale de ces erreurs concerne la prédication des structures secondaire. iv) Près de 50% de la variance correspond à des comportements inexpliqués des séquences, ce qui suggère qu'il reste beaucoup de facteurs que nous ne connaissons ou ne maitrisons pas. v) En comparaison à peine 1% de la variance est lié est des erreurs de mesure expérimentale. Malgré tout mes efforts je n'ai pu produire de modèle prédictif plus performant. L'application d'approches d'apprentissage machine n'a pas donné de résultats satisfaisants. Pour aller plus loin, il faudrait à mon sens réussir à coupler de telle approches, dans lesquelles un nombre important de descripteurs peuvent être utilisés, avec des modèles mécanistiques capable de guider l'identification de relations privilégiés entre observables.

Je pense en effet que des boucles de rétroaction complexes entre diverses conséquences phénotypiques obscurcissent la notion de cause et conséquence dans le système étudié et donc l'interprétation des résultats. Si l'introduction de mutation est indubitablement la perturbation initiale, l'effet de ces mutations a des conséquence complexes qui devienne elle-même des causes intermédiaires pouvant influencer des processus en aval et en amont [START_REF] Noble | A theory of biological relativity: no privileged level of causation[END_REF] . Par exemple, l'impact final d'une mutation sur le taux de croissance peut influencer la production et la dilution de ribosome, donc les taux de traduction, la stabilité des transcrit, etc... Il est possible que ce type de système complexe soit sujet à des effets chaotiques : une simple mutation ponctuelle pourrait avoir un effet différentiel initial infime (donc difficile à prédire ou capturer) par la suite amplifié par le bien de rétroaction en des réponses finales drastiquement différentes.

Publication

La mise en forme de ce travail a été très compliquée. Plutôt que de découper l'analyse en une multitude de petites histoires déconnectées, je souhaitais un tout cohérent permettant de donner une vue d'ensemble sans sacrifier les détails. Cela m'a initialement amené à rédiger deux manuscrits que je pensais publier de manière jointe dans le même journal. L'un présentait le système expérimental et l'analyse des données de production de protéines [START_REF] Cambray | Massive Factorial Design Untangles Coding Sequences Determinants Of Translation Efficacy[END_REF] . L'autre présentait la mesure des autres phénotype et l'intégration systémique des données [START_REF] Arkin | Massive Phenotypic Measurements Reveal Complex Physiological Consequences Of Differential Translation Efficacies[END_REF] . Ces manuscrits ont été soumis à un comité de relecture par le journal Cell pendant un certain temps. Les critiques étaient plutôt bonnes dans l'ensemble. L'un des relecteurs insistait pour que l'on produise un modèle explicatif du comportement de gènes naturels chez E. coli. L'éditeur nous poussait à répondre d'une manière ou d'un autre à cette demande. Il aurait été tout à fait possible d'accéder à cette requête en produisant une illusion d'explication. A cette échelle, il est possible de trouver un support statistique généralement considéré comme satisfaisant pour tout et n'importe quoi. Nous avons tous lu des articles excellents, publiés dans des journaux du plus haut niveau, mais pour lesquels on ne peut s'empêcher de penser que la toute dernière figure est vraiment tirée par les cheveux. Après avoir fourni tant d'efforts pour éviter incohérences et interprétations à l'emporte pièce, j'ai refusé de céder au chant de ces sirènes. Le système d'évaluation de la recherche actuel me l'aurait pourtant bien rendu… Après un travail de condensation difficile, ce projet a finalement été publié dans l'excellent Nature Biotechnology sous forme d'un unique article. Dans la lignée de la rigueur scientifique qui a guidé ce travail, j'ai fourni un effort important pour assurer la reproductibilité des analyses. L'ensemble des données brutes, traitées et intégrées ainsi que les scripts informatiques correspondant ont été annotés et mis à disposition. Il est ainsi possible de recréer n'importe quelle figure du papier en quelques cliques.

Travaux de chargé de recherche

2.4.a Contexte

Pour des raisons familiales, j'ai dû hâter mon retour en France alors que mon projet d'étude d'initiation de la traduction présenté plus haut n'était pas encore achevé. Cela n'a pas favorisé une transition des plus sereine. J'ai néanmoins voulu développer un nouveau projet me permettant d'appliquer mon expertise en biologie quantitative à haut-débit à un objet biologique plus complexe et naturel que les systèmes rapporteurs sur lesquels j'avais majoritairement travaillé au cours des années précédentes.

Suite à une rencontre fortuite avec Mylène Ogliastro, je me suis orienté vers de petit virus infectant les insectes, les densovirus. Ces modèles viraux me permettaient de travailler à l'échelle d'un organisme, sans trop de danger (comparé à d'autres virus d'intérêt médicaux) mais avec une perspective applicative intéressante : la reprogrammation rationnelle du spectre d'hôtes pour le bio-contrôle d'insectes nuisibles. Mon projet initial consistait à caractériser à haut-débit l'impact d'un grand nombre de mutations dans les protéines formant la capside virale.

Cette année là, le programme ANR dit « retour de post-doc » venait d'être remplacé par un programme plus large-« @raction » -visant à attirer les chercheurs en France. Plein d'espoir, j'ai écrit un long projet de 40 pages, qui n'a pas été retenu. De fait, environ 95% des projets acceptés dans le cadre de ce programme concernait des chercheurs confirmés aux groupes déjà bien établis. L'instrument facilitant le retour des post-docs n'existait plus : il aurait été judicieux que cela soit explicite.

Cette même année, une version de ce projet m'a néanmoins permis d'être reçu au concours CR1 dit « blanc » de l'INRA, ainsi que d'obtenir une bourse postdoctorale individuelle MSCA avec un classement très honorable (7 ème sur 1,545). C'est ainsi que j'ai rejoint l'équipe de Mylène Ogliastro au laboratoire « Diversité, Génome et Interactions Micro-organisme Insecte » situé dans le magnifique bâtiment 24 de l'Université de Montpellier.

La commission européenne ne voyait pas d'objection à ce que je reçoive la bourse MSCA conjointement à na prise de fonction à l'INRA. Mon salaire devait simplement être complété par les fonds européen à la hauteur de l'allocation postdoctorale prévue (c'est-à-dire doublé !) et le différentiel (de l'ordre de 100,000€) pouvait être transformé en frais de fonctionnement banalisé, ce qui aurait été très confortable. Fort de sa toute nouvelle labélisation « Excellence in Human Ressources », l'INRA n'a pourtant pas accepté ce montage. Après avoir profité de cette bourse pendant 3 mois en repoussant au maximum la date de ma prise de fonction, j'ai dû faire un choix : la bourse ou… le poste ! J'ai immédiatement pu prendre la mesure de l'excellence dans la gestion du personnel. Heureusement, le laboratoire avait reçu une allocation de 3,000€ pour accompagner mon installation, ce qui a véritablement aidé à lancer le projet pour lequel j'avais été recruté ! Inutile de préciser que l'absurdité patente de cette situation m'a profondément affectée.

J'ai finalement réussi à obtenir une bourse interne de 20,000€ sur deux ans auprès du département Santé des Plantes et Environnement. Cela m'a permis d'assurer le fonctionnement minimum pour pouvoir travailler (achat d'enzymes, de kit de miniprep et, luxe absolu, financement d'un stagiaire) ... L'absence de moyen m'a permis de me concentrer sur la fin de l'analyse et l'écriture de mon travail postdoctoral. J'ai aussi eu le loisir d'écrire un nombre conséquent de demandes de financements, malheureusement toutes infructueuses. Il m'aura fallu 5 années pour finalement obtenir un financement digne de ce nom pour une projet quelque peu modifié. L'approche que j'avais initialement proposée avait commencée à être développé dans un autre laboratoire américain deux ans après mon retour en France, et venais de faire l'objet d'un bel article dans Science [START_REF] Ogden | Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design[END_REF] … Le lecteur l'aura sans doute remarqué, cette période de transition aura été particulièrement difficile, et j'en garde une certaine amertume. Ce manuscrit portant le nom de mémoire, je me suis permis d'y épancher ce ressentiment en espérant profiter ainsi d'un éventuel effet cathartique.

2.4.a Implication des protéines de capside dans la réplication d'un parvovirus

Mise au point d'une méthode de manipulation moléculaire précise

Les parvovirus forment une famille de virus caractérisé par de petits génomes (4-6 kb) d'ADN simple brin portant des gènes codant pour la capside (VP) ainsi que des gènes impliqués dans la réplication (NS). Ces génomes sont flanqués de structure télomèriques inversées-répétées (ITRs) capable d'adopter des structures secondaires essentielles à la réplication virale 44 . Après clonage sur un plasmide bactérien, il est possible de propager un clone moléculaire de ces génomes, et théoriquement, de le modifier à façon.

Les manipulations génétiques effectuées classiquement sur ces virus reposent essentiellement sur l'utilisation d'enzymes de restriction naturellement présentent dans le génome, ce qui est contraignant et ne se prête pas à l'introduction de modifications ciblées. L'ensemble des techniques précises de clonage actuelles reposent-à un moment ou à un autre-sur la réaction de polymérisation en chaine (PCR). Malgré de nombreuses tentatives d'optimisation, il s'est avéré que les structures secondaires des ITRs sont si stables qu'elles occasionnent le décrochage des polymérases utilisées en PCR, et donc empêche l'amplification. J'ai bien réussi à obtenir des amplifications apparentes sous certaines conditions, pour finalement me rendre compte (parfois longtemps après) que ces amplifications reposent systématiquement sur de plus ou moins importante remaniement ou délétion dans les ITRs, ce qui empêche ou limite l'encapsidation ultérieure des génomes viraux.

L'impossibilité d'avoir recours à la PCR étant très limitant, j'ai dû définir une stratégie pour contourner le problème reposant sur la division du génome en blocs fonctionnels. Ces blocs-génomiques sont flanqués par des sites de restrictions de type IIs et clonés sur des vecteurs différents après amplification par PCR. Ces vecteurs ne possédant pas d'ITR sont indépendamment modifiables par PCR. Les ITRs ont été synthétisés de novo de manière chimique. Le génome entier a finalement été réassemblé à partir de ces constituants grâce aux sites de restriction définis dans cette optique (stratégie dite Golden Gate 45 ). Bien que longue et laborieuse, cette approche est flexible et permet la manipulation de tout le génome d'un parvovirus.

Construction d'un clone défectif de JcDV

Les densovirus représentent une sous-famille de parvovirus infectant les invertébrés [START_REF] Tijssen | Diversity of small, single-stranded DNA viruses of invertebrates and their chaotic evolutionary past[END_REF] . La spécificité d'un densovirus repose en tout premier lieu sur la reconnaissance des cellules cibles par des motifs structuraux exposés à la surface de la capside (1 seule protéine). Le but de mon projet était alors de mieux comprendre le déterminisme génétique et structural de la spécificité en introduisant des mutations contrôlées dans le gène codant pour la capside. Les densovirus ne sont pas des virus très régulation anti-sens semble en effet exister, elle produit des effet inverse a ceux observé dans le clone défectif.

Des expériences complémentaires ont permis de montrer que l'entièreté du 3'UTR du transcrit VP sauvage est nécessaire à l'expression des protéines VPs, des 3'UTRs tronqués réduisant la stabilité du transcrit. Le contexte génomique en aval du transcrit et par ailleurs nécessaire à la détermination du site de polyadénylation correct. L'introduction de codon stop ou d'indels en divers endroit de la séquence codante VP récapitule le défaut réplication observé chez le clone défectif, démontrant ainsi sans ambiguïté que ce phénotype est lié à l'absence de protéine de capside plutôt qu'à des altérations de la séquence en elle-même. Des expériences de complémentation et de quantification fines des protéines produites ont permis de montrer que la production de protéine VP n'avait que peu d'impact sur l'expression des gène NS.

Des observations éparses réalisées sur les AAVs, des parvovirus très étudiés car utilisés comme vecteurs de thérapie génique, laisse penser que la réplication puisse dans certaines conditions être lié à l'encapsidation [START_REF] Ward | cis Effects in Adeno-Associated Virus Type 2 Replication[END_REF] . Il semblerait aussi que les protéines de capside soit capable de packager préférentiellement le génome à partir duquel elles ont été exprimées [START_REF] Ward | cis Effects in Adeno-Associated Virus Type 2 Replication[END_REF][START_REF] Nonnenmacher | High Capsid-Genome Correlation Facilitates Creation of AAV Libraries for Directed Evolution[END_REF] . Aussi intrigante que puisse être cette observation, les bases mécanistiques sous jacente n'ont à ce jour pas été exploré plus avant. Le très fort lien entre capside et réplication observé chez JcDV laisse supposer que ce virus puisse faciliter l'étude de cette question. Des observations préliminaire montre ainsi que les protéines produites par JcDV tendent à localisées à la périphérie du noyau. La co-localisation possible des processus de réplication, transcription et traduction est hypothèse séduisante que je compte explorer en collaboration avec Christine Doucet, une collègue du Centre de Biologie Structurale experte des pores nucléaires.

Publication

L'article décrivant ces travaux vient d'être accepté pour publication dans Journal of Virology. Cette publication conforte mon expertise naissante dans le domaine de la virologie. Le manuscrit a initialement été soumis au début de la première vague de confinement de mars 2020. Faute de personnel plus impliqué dans le projet, la première autrice du manuscrit était alors une étudiante de M1, Déborah Garcia, qui avait fait preuve d'une grande motivation lors de son stage. Malgré les circonstances, des expériences complémentaires avaient été demandées par les relecteurs, spécialistes de la réplication chez les AAVs. Entre période de confinement successives et l'établissement de mon équipe au Centre de Biologie Structurale, il aura fallu un an pour que l'on puisse répondre à ces requêtes. J'ai chargé Thomas Labadie, virologue que je venais de recruter comme post-doc sur le contrat ATIP-Avenir, de conduire ces expériences complémentaires, ce qui lui a permis de prendre la place de premier auteur [START_REF] Labadie | Capsid Proteins are Necessary for Replication of a Parvovirus[END_REF] .

PROJETS EN COURS ET PERSPECTIVES SCIENTIFIQUES

Création de l'équipe «Génomique Synthétique, Fonctionnelle et Évolutive»

3.1.a Objectifs de l'équipe

Soutenue par une bourse ATIP-Avenir, j'ai établi l'équipe « Génomique synthétique, fonctionnelle et évolutive » au Centre de Biologie Structurale de Montpellier début 2020. Le but de l'équipe est d'explorer les relations entre séquences génétiques, leurs fonctions et d'intégrer leurs impacts collatéraux sur divers phénotypes. Nous utilisons par cela des technologies de synthèse et de phénotypage à hautdébit permettant de générer suffisamment de données pour obtenir une vision d'ensemble et non anecdotique des processus étudiés. De part la quantité et la diversité des séquences étudiées, l'échelle d'étude est bien celle du génome, même si le processus étudié peut-être très particulier. La capacité de générer quantité de mutations à façon permet par ailleurs d'approcher des questions évolutives de manière proactive.

Nous appliquons cette approche à différents processus et modèles. Les deux axes de recherche principaux concernent le contrôle de l'expression génique et l'étude intégrative de génome viraux. Bien que ces deux thématiques puissent paraitre disjointes, elles reposent sur des techniques expérimentales et analytique très proches, et j'envisage de développer des projets permettant d'en consolider les liens scientifiques.

3.1.b Composition et perspectives de l'équipe

ATIP-Avenir est un programme de soutien à la création de jeunes équipes de recherche à l'initiative du CNRS et de l'INSERM. Lors de mon retour en France, il était question que l'INRA rejoigne ce dispositif. Ce projet n'ayant pas abouti, il a donc fallu trouver une solution administrative pour que je puisse établir mon équipe au CBS. Dans la foulée de cette bourse, j'ai également obtenu un financement du programme de développement précompétitif proposé par le consortium industriel Toulouse White Biotechnology (TWB).

Entre lenteur administratives et crise sanitaire, le démarrage de l'équipe s'est avéré un peu délicat, mais progresse lentement. J'ai en Novembre 2019 débuté le co-encadrement d'une étudiante en thèse établie au CBS. J'ai pu recruter deux post-doctorants fin 2020, dans le cadre respectif des projets ATIP-Avenir et TWB. Je fais parti d'un consortium de trois laboratoires montpelliérains qui viens d'être retenu pour un appel à réseau doctoral de l'I-Site Montpellier University of Excellence (MUSE). J'ai ainsi obtenu un financement doctoral qui débutera fin 2021. J'accueillerai également fin 2021 un ingénieur de recherche recruté dans le cadre du projet ERC Rosalind obtenu par ma collaboratrice Julie Reveillaud (INRAE, MIVEGEC, Montpellier).

Dans le cadre d'une collaboration de longue durée, je suis partenaire d'un projet ANR porté par Jérôme Bonnet (INSERM, CBS), qui pourrait mener au recrutement d'un post-doctorant partagé entre nos deux équipes. Un projet d'accueil a également été déposé auprès du China Scholarship Council. Ce projet est issu d'une collaboration en gestation depuis plusieurs années avec Yue Shen du China National GeneBank qui ne s'est jusqu'à présent pas concrétisée, faute de moyen. Cette candidature, qui n'avait pas été fructueuse l'année dernière, me mettra dans une position délicate en termes de capacité d'accueil de doctorant si elle est retenue cette année. Une collaboration avec une entreprise pharmaceutique nippo-américaine (Takeda) est en cours de négociation. Cette dernière pourrait mener à l'embauche d'un post-doctorant. J'ai accompagné Thomas Labadie dans la rédaction d'un projet original portant sur le développement d'une plateforme virale oncolytique. L'obtention d'une bourse lui permettrait de rester dans le laboratoire plus longtemps. Ce projet a été soumis à l'ARC et à la Fondation de France.

L'obtention d'une aide technique permanente serait la bienvenue, mais mon détachement en temps que personnel INRAE dans une unité CNRS-INSERM ne favorise certainement pas cette éventualité. De la même manière, l'accompagnement de candidatures aux concours de chargés de recherche par les post-docs les plus séniors de l'équipe est délicate. De fait, la pérennisation de l'équipe et de ma propre situation au-delà de la durée de l'ATIP-Avenir ne cesse de me préoccuper.

3.1.b Financements

Le laboratoire est pour l'instant essentiellement financé par les fonds ATIP-Avenir, à hauteur de 60 k€/an. Ce financement est acquis pour une durée de 3 ans, extensible à 5 ans sous réserve de l'extension du contrat de collaboration établi entre INRAE et le CNRS. Puisqu'issu d'un financement industriel, le contrat TWB a été énormément taxé par le CNRS, ce dont je n'étais pas conscient lors de l'établissement du budget qui pré-date la gestion de mes contrats par cette institution. Les fonds de fonctionnement prévus s'en trouve très sensiblement impactés. Le projet Rosalind financera les coûts de fonctionnement qui lui seront associés. Je suis partenaire dans un projet ANR porté par mon ancienne équipe de rattachement. Si retenu, ce projet m'apportera un budget de fonctionnement complémentaire, ainsi que de quoi étendre le contrat de post-doc ATIP-Avenir de Thomas Labadie, qui n'est pour l'instant financé que pour 2 ans.

Projet ATIP-AVENIR : Profilage systématique de génomes viraux entiers

Ce projet représente une évolution de celui pour lequel j'ai initialement été recruté à l'INRA. Il consiste à construire tous les mutants ponctuels d'un génome entier en utilisant des bibliothèques d'oligonucléotides de synthèse, puis de mesurer précisément l'impact de chacune de ces mutations sur le plus de phénotypes possibles, afin de dégager une compréhension d'un système vivant-tout au moins réplicatif-aussi globale que possible.

Un projet de cette ampleur n'est envisageable que sur des génomes suffisamment petits. Le génome du densovirus JcDV ne mesure que 6,032 nucléotides [START_REF] Pham | Junonia coenia Densovirus (JcDNV) Genome Structure[END_REF] . L'ensemble de mutations ponctuelles, insertions et délétions comprises, représente très exactement 40,625 séquences non-redondantes. Pour certaines régions d'intérêt (e.g. séquences codantes se chevauchant entièrement sur différents cadres de lecture), je souhaite également explorer l'ensembles des codons, toujours en incluant substitution, insertion et délétions. Cela augmente considérablement l'espace des possibles et je me limiterai à environ 250,000 mutants. L'objectif est de mesurer des phénotypes aussi divers que l'efficacité de la transcription et de la traduction, la réplication, l'encapsidation, la stabilité des capsides, la capacité à franchir la barrière intestinale, à entrer dans différents types cellulaires et à transiter vers le noyau (figure 12). De telles connaissances permettrons d'évaluer le potentiel évolutif immédiat du virus et de donner une base pour manipuler rationnellement des caractéristiques d'intérêt dans un cadre d'utilisation en bio-contrôle, telle que virulence, spécificité ou rémanence.

Les mutations seront programmées dans une bibliothèque d'oligonucléotides de synthèse et cloné dans le contexte du génome sauvage. Chaque mutation sera associée à un code-barres, une petite séquence d'ADN l'identifiant de manière unique. Une bibliothèque de mutant pourra alors être soumise à un crible phénotypique menant à l'enrichissement des mutant les plus performants pour ce phénotype. Le séquençage des code-barres présents dans cette population enrichie et la comparaison de leur fréquence par rapport à la population initiale permet de construire une mesure de performances pour ce phénotype (figure 13). Les génomes de densovirus sont particulièrement intéressants car ils ne codent que deux transcrits se chevauchant partiellement. L'insertion d'un code-barres dans cette zone de chevauchement permet donc de marquer i) le génome lui-même ; ii) l'ensemble des transcrits du génome ; et iii) les virions produits par le virus (capside ayant empaqueté le génome marqué). L'insertion d'un unique code-barres lié à une mutation particulière permet ainsi le développement de cribles phénotypiques, tous basé sur le séquençage a haut débit, pour mesurer l'effet de chaque mutation sur des phénotype variés.

Pour mener à bien ce projet, il nous faudra surmonter un certain nombre de difficultés : i) Locus d'insertion des code-barres : Idéalement, les code-barres doivent n'exercer qu'un impact phénotypique minimal pour ne pas confondre l'effet des mutations avec lesquelles ils sont associés. La région de chevauchement des transcrits se trouvant dans leur régions 3'UTRs, les code-barres pourraient avoir un impact sur la terminaison de la transcription, et donc sur la stabilité et la traduction des transcrits (comme observé dans la partir terminale du 3'UTR de VP chez JcDV, voir Figure 11). Des expériences à haut débit visant a mesurer ce type de phénotype par séquençage de code-barres aléatoire inséré a différentes positions de la région d'intérêt sont en cours. Ces expériences ont été pensées pour que les données produites puissent être publiable indépendamment.

ii) Association entre codebarres et mutations. La stratégie privilégiée initialement consiste à construire les bibliothèques de mutants, puis à introduire des code-barres aléatoires dans un second temps. Une procédure de séquençage semialéatoire permettrait alors de relier code-barres et mutations (figure 13E) [START_REF] Kitzman | Massively parallel single-amino-acid mutagenesis[END_REF] . Une librairie compatible avec cette technique avait déjà été commandée. Cependant des échanges récents nous laissent penser que cette approche pourrait être sujette à des artefacts techniques, a cours desquels l'association entre codes barres et mutations est altérée. Nous considérons donc une approche alternative consistant à associer mutations et code-barres directement lors de la synthèse des oligonucléotide utilisés pour créer les mutations. Dans cet optique, nous n'utiliserons que des codes-barres identifiés comme ayant le moins d'impact dans l'étude présenté au point précédent. Cette approche est néanmoins plus laborieuse car elle suppose des étapes de clonage additionnelles. Elle coute également davantage car pour chaque mutations, 3 séquences avec des codes barres différents doivent être synthétisé afin de pouvoir estimer l'impact de ces derniers. iii) Liens entre génotypes et phénotypes. Pour que l'approche de criblage fonctionne sur certains phénotypes, il faudra éviter d'inopportunes complémentations entre mutants. Des expériences sont en cours pour déterminer si une compartimentalisation fonctionnelle entre plasmides, tel que mise en évidence chez de proche virus (AAV 52 ) existe aussi chez les densovirus. Si cela s'avère ne pas être le cas, il faudra mettre au point une stratégie de pseudotypage dans laquelle les génomes mutants seront empaquetés dans des capside sauvages qui pourront alors être utilisé pour établir une multiplicité effective d'infection inférieure à 1.

Le projet se focalise dans un premier temps sur le densovirus JcDV dont le génome et la stratégie d'expression sont bien décrit [START_REF] Wang | Analysis of the transcription strategy of the Junonia coenia densovirus (JcDNV) genome[END_REF][START_REF] Pham | Junonia coenia Densovirus (JcDNV) Genome Structure[END_REF] . Ce virus infecte des chenilles dont la taille facilite la dissection de tissus particulier, tel que les intestins [START_REF] Wang | Densovirus crosses the insect midgut by transcytosis and disturbs the epithelial barrier function[END_REF] . L'un de ces hôtes, le légionnaire d'automne (Spodoptera frugiperda) est une espèce invasive faisant actuellement preuve d'une d'expansion extrêmement rapide dans les pays africains et asiatiques [START_REF] Jeger | Pest risk assessment of Spodoptera frugiperda for the European Union[END_REF] . Thomas Labadie, virologue ayant réalisé sa thèse sur le virus de la grippe à l'institut Pasteur, puis sur celui de la Fièvre catarrhale lors d'un premier post-doc, a commencé a travailler sur ce projet fin 2020.

Il est aussi prévu d'appliquer cette approche sur un densovirus capable d'infecter les moustiques du genre Aedes. Il existe une dizaine de génome de densovirus fortement apparenté dont la plupart ont été isolés sur des culture de cellules issues du moustique tigres (Aedes albopictus). Ces derniers ne sont pas toujours complets (absence des ITRs). Ils sont invariablement plus petit (4kb) et plus simple en termes d'architecture que celui de JcDV. J'ai par le passé fait synthétiser l'un de ces génomes qui [START_REF] Carlson | Densoviruses for Control and Genetic Manipulation of Mosquitoes[END_REF][START_REF] Ledermann | Infection and pathogenicity of the mosquito densoviruses AeDNV, HeDNV, and APeDNV in Aedes aegypti mosquitoes (Diptera: Culicidae)[END_REF][START_REF] Ward | Aedes aegypti transducing densovirus pathogenesis and expression in Aedes aegypti and Anopheles gambiae larvae[END_REF] . Bien que le laboratoire ayant réalisé ces études ai n'existe plus, j'ai réussi à me procurer ce clone.

Yue Shen dirige la plateforme Genome Synthesis and Editing au China National GeneBank/BGI. Nous avons initié une collaboration il y a plusieurs années, mais celle-ci ne s'est pas encore vraiment concrétisé. Un projet d'accueil de doctorant Chinois a été déposé auprès du China Scholarship Council (CSC) pour Shihong Chen, qui travaille dans l'équipe de Yue Shen depuis de nombreuses années et souhaite réaliser une thèse. L'obtention de cette bourse permettrait de développer cette collaboration, notamment en utilisant les approches de séquençage mise en oeuvre par le BGI (le plus important centre de séquençage au monde).

Optimisation de la traduction chez E.coli

La maitrise de l'efficacité et du coût de production de protéines d'intérêt est un aspect essentiel à nombres d'applications biotechnologiques. Mes travaux postdoctoraux m'ont permis de confirmer que l'initiation était bien l'étape limitante de la traduction, d'en préciser les déterminants de séquence et d'en mettre en évidence le coût physiologique. Afin de pouvoir optimiser la production de protéine, il reste néanmoins important de comprendre ces aspects au niveau de l'élongation de la traduction pour un niveau d'initiation fort.

Le projets TOPs, financé par le consortium industriel TWB, en collaboration avec Luca Ciandrini (MC, UM2, CBS), Sébastien Nouaille et Laurence Gribal (IN-RAE et CNRS, TBI, Toulouse) consiste à construire de manière rationnelle une bibliothèque de 100,000 séquences synthétiques explorant de manière systématique un espace des paramètres décrivant usage de codon et structure secondaire de l'ARN.

Alexandre Deloupy a commencé son post-doc fin 2020 sur ce projet. Il s'attache à ré-analyser des données de génomique fonctionnelle publiées, afin d'extraire des fragments de séquence de 150 nucléotides du génome d'E. coli en fonction de leur caractère particulièrement structurés, leur biais d'usage de codon et/ou leur densité en couverture de ribosomes.

Pour chacun de ces fragments, un ensemble de mutants synonymes sera défini en vue d'altérer ces propriétés indépendamment les unes des autres. Dans cette optique, nous sommes en cours amélioration de l'algorithme D-tailor (Figure 8) afin que des propriétés plus complexes puissent être définie, et ce de manière plus conviviale. Un sous-ensemble de séquence comprendra des régions situées entre domaines fonctionnels afin de tester l'existence de pauses de traduction. Un autre sousensemble sera constitué de séquences hétérologues issues de divers organismes, afin de caractériser de manière cohérente les défauts d'élongation lié à l'éloignement génétique. Enfin, un sous-ensemble de séquences sera généré au hasard afin de faciliter l'apprentissage de nouvelles propriétés, ainsi que suggéré dans mes travaux antérieurs.

Les séquences synthétiques seront clonées entre deux rapporteurs fluorescents, de sorte que le rapport entre les deux niveaux de fluorescences permettra d'en quantifier précisément l'efficacité d'élongation par FACS-Seq. Ce système se rapproche de celui développé dans le cadre de l'étude de terminateurs (Figure 7). Différentes versions du système rapporteur, croisant différents niveaux de transcription et d'initiation de la traduction, seront évaluées. La charge ribosomale des ARNs correspondants sera évaluée après séparation des polysomes. La stabilité des ARNs au niveau de la région synthétique sera également quantifiée, ainsi que l'impact des séquences sur la croissance des cellules en conditions de compétition. Toutes ces mesures seront basées sur l'analyse de fréquences des séquences synthétiques obtenues par séquençage profond d'amplicons, ainsi que réalisé précédemment. Le profil de dégradation complet de certains ARNm sera établi par qPCR, afin de comprendre plus finement l'impact de la dynamique d'élongation sur la stabilité des transcrits.

Les données obtenues permettront de quantifier les impacts respectifs des paramètres d'intérêt sur le taux d'élongation, pour différent niveau de transcription et d'initiation de la traduction. Ces données seront croisées avec mes données sur l'initiation de la traduction afin de générer un modèle prédictif liant séquence, performance de production et coût métabolique. Un outil d'optimisation de séquence sera développé sur ce modèles et testé sur des séquences codantes d'intérêts industriels.

Contrôle de l'expression génique chez des bactéries non-modèles

Les étudiants de la première équipe iGEM Montpelliéraine, créée en 2017 avec mes collègues Luca Ciandrini et Jérôme Bonnet pour participer à ce concours d'ingénierie génétique, avaient choisi de travailler avec une bactérie lactique issue de la flore vaginale. Nous avons à cette occasion pu mesurer à quel point, au delà de quelques modèles très étudiés, les outils disponibles pour programmer de manière fine l'expression génique chez les bactéries restent limités. L'une de ces étudiantes, Elsa Fristot, a souhaité continuer le projet lors de son stage de master 2 qu'elle a effectué dans le laboratoire de Jérôme Bonnet. Elle a par la suite obtenu une bourse de thèse de l'école doctorale CBS2, sur un projet consistant à utiliser des lactobacilles comme outils pour combattre le cancer. Je codirige cette thèse, ma contribution consistant précisément à superviser le développement d'outils génétiques.

Dans le but d'établir une collection d'élément génétiques capable de contrôler transcription et traduction, toutes les séquences génomiques correspondant à 100 nucléotides en amont et 42 nucléotides en aval des codons initiateur de séquence codantes ont été synthétisé et cloné en fusion traductionnelle avec une protéine fluorescente. Afin d'étudier les interactions potentielles entre éléments génétique, nous nous sommes focalisés sur des éléments génétique a priori fortement exprimée identifiés par analyses de biais d'usage de codon ab initio [START_REF] Carbone | Codon adaptation index as a measure of dominating codon bias[END_REF] . Les 20 nucléotides immédiatement en amont des codons initiateurs ont été défini comme 5'UTR, et les 80 nucléotides encore en amont comme des région promotrices. Un ensemble de séquence chimère combinant promoteur, 5'UTR et séquence Nterminale ont ainsi été définie. Nous avons ainsi constitué une bibliothèque contrôlée de 3,600 séquence compatible avec nos capacités expérimentales. Comme pour beaucoup de cellules, la capacité à transformer les lactobacilles reste limité. Si Elsa a réussi à optimiser cette procédure de manière à obtenir quelques milliers de clones, il reste difficile d'imaginer des études à l'échelle de bactéries modèles.

Cette bibliothèque permettra d'évaluer performances, fiabilités et problèmes de composabilité entre composant chez ces lactobacilles, sur le modèle de ce que nous avions accompli chez E. coli avec BIOFAB (voir figure 4 et 5). Nous nous attacherons aussi à identifier des éléments réagissant aux conditions environnementales, notamment le pH. Cela permettra d'élaborer des circuits génétiques répondant aux microenvironnement tumoraux dans lesquels nous souhaitons utiliser ces bactéries.

Par le biais de collaborations, j'envisage d'entendre l'utilisation de ce pipeline à d'autres bactéries, avec pour perspective finale d'établir une étude comparative des mécanismes d'expression chez des bactéries phylogénétiquement éloignées. Je suis à cet effet en contact avec Alexandre Kaminski, chercheur à l'Institut Pasteur, pour appliquer ce genre d'approche chez Streptococcus agalactiae. Diego Catoni, chercheur au CBS, souhaite également développer cette approche dans le cadre d'un projet visant à étudier le sécrétome de la bactérie Mycobacterium tuberculosis dans l'hôte alternatif plus facile à manipuler Mycobacterium marinum. Suivant les résultats du projet présenté dans la section suivante, il serait envisageable d'accomplir ce travail chez des bactéries du genre Wolbachia.

Étude fonctionnelle d'un système plasmidique pour Wolbachia

Je suis étroitement associé à l'un des objectifs du projet ERC Starting Grant récemment obtenu par ma collaboratrice Julie Reveillaud (INRAE, MIVEGEC, Montpellier). Cet objectif consiste à caractériser pWCP, un plasmide putatif de bactéries Wolbachia identifié lors de l'assemblage de séquences métagénomique obtenue sur de ovaires de moustique Culex Pipiens [START_REF] Reveillaud | The Wolbachia mobilome in Culex pipiens includes a putative plasmid[END_REF] . La capacité des bactéries du genre Wolbachia à modifier le comportement reproducteur de leur l'hôte par le biais de son bactériophage tempéré WO a permis de développer de nouvelles stratégies de lutte contre les insectes vecteurs [START_REF] Lepage | Can we save lives with a great pandemic?[END_REF] . Étant des bactéries intracellulaires obligatoires, il est très difficile de manipuler les Wolbachia. La mise au point d'un système plasmidique serait une grande avancée méthodologique.

Pour l'instant, pWCP n'existe que sous forme de séquence virtuelle. Afin de le caractériser, nous comptons faire synthétiser des blocs fonctionnels comprenant séquences codantes et leur séquence régulatrice présumé. Ces blocs seront assemblés de manière combinatoire avec une origine de réplication d'E. coli, un gène de résistance et un gène rapporteur fluorescent. Des plasmides navettes comprenant l'intégralité ou divers fragment du pWCP seront ainsi construit chez E. coli puis testé chez Wolbachia après bombardement de cellule en culture contenant cette bactérie à laide d'un pistolet à gène. Cette approche permettra d'identifier les élément nécessaires et suffisants au maintien et à la réplication de ce plasmide chez Wolbachia. Une fois cet outil identifié nous l'utiliserons certainement pour définir des éléments de contrôle de la régulation suivant le pipeline présenté dans la section précédente. Nous l'utiliserons également pour des études fonctionnelles qui restent à définir, mais concernerons certainement les gènes impliqués dans l'incompatibilité cytoplasmique.

Un ingénieur de recherche ou un post-doc serait recruté fin 2021 pour une durée de 3 ans pour travailler sur ce projet. Il travaillera a l'interface entre mon laboratoire et celui de Julie.

Évaluation à haut-débit de mutant de récepteurs transmembranaires

Je collabore depuis plusieurs années avec l'équipe de Jérôme Bonnet (INSERM, CBS) dans le cadre de son projet ERC Starting Grant CompuCell. Le but de ce projet était d'établir des outils de diagnostique médicaux génériques basés sur l'intégration de signaux externes par des bactéries. Dans cette perspective, la mise au point d'une plateforme transmembranaire programmable capable de capter des signaux externes d'intérêt pour les transduire en réponses internes mesurable est centrale. Un manuscrit présentant la mise au point et l'application initiale d'un telle plateforme a très récemment été soumise pour publication [START_REF] Chang | A synthetic receptor platform enables rapid and portable monitoring of liver dysfunction via engineered bacteria[END_REF] . Dans ce manuscrit, l'utilisation de crible à haut-débit a permis d'identifier certains résidus du domaine périplasmique du récepteur utilisé comme nécessaire à la bonne transduction du signal.

Nous avons également débuté la caractérisation de la région cytosolique dite juxtamembrane localisé juste en aval du dernier domaine transmembranaire. La flexibilité de cette région était décrite comme pouvant influencer la transduction du signal [START_REF] Chang | A Modular Receptor Platform To Expand the Sensing Repertoire of Bacteria[END_REF] . A ce jour, nous avons cloné et caractérisé plus de 3,000 homologues naturels de cette région pour le récepteur CadC. Alors que le système comportant la région native de CadC fonctionne en activant l'expression d'un promoteur dans la cellule en présence de ligand, nous avons observé que certains homologues présentent le comportement logique inverse, induisant constitutivement l'expression du promoteur mais le réprimant en présence ligand (Figure 15). La possibilité de commuter entre deux comportement logique alternatifs est précisément ce que l'on attend et souhaite contrôler dans le cadre d'une plateforme programmable.

Afin d'améliorer les performances du système et de déchiffrer les règles déterminants ce type de comportement nous avons établi un plan d'expérience moléculaire combinant mutation ciblé, manipulation de certaines propriétés des acides aminés présent dans cette région et création de séquences chimères. Un projet ANR a été soumis pour financer le recrutement d'un post-doctorant sur cette thématique.

Optimisation de codons pour thérapies géniques

Je suis en cours de discussion avec la branche américaine de Takeda, une multinationale biopharmaceutique d'origine Japonaise. Celle-ci est intéressée à établir une méthode d'optimisation de la traduction de gène dans des cellules humaines dans le cadre du développement de thérapies géniques. Le principe serait inspiré du projet TOPs, avec une orientation plus pragmatique et opérationnelle. Je suis particulièrement intéressé par cette collaboration qui me permettrait de renforcer le lien entre contrôle de l'expression et systèmes viraux (les vecteurs de thérapies géniques AAV sont de proches cousins des densovirus).

Je reste néanmoins circonspect quant à la concrétisation de cette collaboration dans l'immédiat. Nous avions en effet validé un projet pilote, mais le programme de recherche relatif au gène choisi-qui pourtant était à un stade de développement avancé-a été arrêté du jour au lendemain pour des raisons budgétaires lié à la crise sanitaire. Bien qu'il soit tout à fait envisageable de transposer ce projet sur un autre gène, l'entreprise souhaite désormais raccourcir la durée de ses collaborations externes. Le projet initialement prévu sur deux ans devrait ainsi être accompli en moins d'un an, ce qui ne serait possible qu'en ayant recours a un personnel déjà formé. Une planification opportune pourrait permettre de réemployer un personnel de mon laboratoire en fin de contrat. Il faudra autrement attendre le retour de jours meilleurs.

Impact des G-quadruplex dans la performance des promoteurs humains

Malgré d'intensives recherches au cours des dernières décennies, notre compréhension des propriétés de séquences et de leur grammaire déterminant l'identité et l'activité des promoteurs eucaryotes reste très approximative. Le modèle de fonctionnement d'un promoteur minimal eucaryote est très largement calqué sur celui des promoteurs bactériens, le décrivant ainsi comme un ensemble de motifs d'ADN contigus, dont les affinités et activités collective sont responsables du recrutement des principaux composant de la machinerie de transcription. L'accumulation de données de génomiques fonctionnelles montrent cependant que les motifs canoniques en amont des sites d'initiation de la transcription mesurés expérimentalement ne présentent qu'une assez faible conservation sur l'ensemble des séquences et sont distribué de manière erratique. Il est ainsi difficile de mettre en évidence des association claires entre présence et agencement de ces motifs et activité promotrice [START_REF] Haberle | Eukaryotic core promoters and the functional basis of transcription initiation[END_REF] .

Certaines mesures expérimentales présentent en revanche une forte corrélation avec l'activité transrationnelle. C'est notamment le cas du positionnement des nucléosomes, qui sont nettement moins présent en amont des sites d'initiation de la transcription [START_REF] Jiang | Nucleosome positioning and gene regulation: advances through genomics[END_REF] . Cette observation est commune à un ensemble d'espèces diverses, ce qui laisse présumer d'une importance fonctionnelle universelle. Étant donné que les séquences et motifs sous jacent ne sont pas conservé, deux modèles explicatifs extrême peuvent être avancés : i) Le positionnement particulier des nucléosomes est une conséquence de l'activité transcriptionnelle elle-même déterminée par des motifs divergent selon les espèces. Dans cette otique un recrutement efficace de la machinerie de transcription dicterait le positionnement des nucléosomes.

ii) Ce positionnement est au contraire une cause de l'activité transcriptionnelle. Dans ce cas, l'activité d'exclusion des nucléosomes participerait de l'identité et de l'efficacité d'un promoteur. Deux hypothèse distinctes relatives au déterminisme de ce positionnement peuvent être considérées :

1) Certains motifs divergeant selon les espèces peuvent recruter des effecteurs capables de moduler le positionnement des ribosomes. 2) D'autres propriétés des séquences moins apparentes que des motifs traditionnels pourraient exercer cet effet.

Le Laboratoire de Jean-Christophe Andreau (CNRS, IGMM, Montpellier) à récemment montrée que des structures secondaires spécifique de l'ADN simple brin appelées G-quadruplexes (G4s) pourrait être chez l'homme des élément clés dans le cadre du seconde modèle. La conformation de l'ADN induit par ces structures favoriserait l'exclusion des nucléosomes et l'exposition des motifs nécessaire à l'activité promotrice. Ce mécanisme hypothétique, bien qu'il fonctionne dans une logique inverse, n'est pas sans rappeler celui par lequel les structures secondaires des transcrit bactériens peuvent moduler l'initiation de la traduction en masquant les motif Shine-Dalgarno capable de recruter les ribosomes (Figure 10). De manière générale la difficulté à prédire l'occurrence de telles structures secondaires des acides nucléique in vivo limite la description de tels phénomènes.

Dans la cadre d'un projet collaboratif développé par Jean-Christophe Andreau, Dom Helmlinger (CRBM, Montpellier) et moi-même, nous avons récemment obtenu le financement de 3 bourses de thèses par le réseau EpiGenMed de l'I-Site MUSE (Montpellier University of Excellence) pour approfondir cette idée. Avec le soutien de mes collaborateurs, nous établirons des séries mutationnelles dérivant de séquences promotrices humaines dans le but de renforcer ou d'affaiblir des G4s potentiels [START_REF] Bedrat | Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter[END_REF] . Nous construirons également des séquences complétement artificielles dans lesquelles nous introduirons des G4s à différentes positions, en contrôlant la présence de motifs recrutant les polymérases. A une échelle plus restreinte, nous effectuerons feront le même travail pour des promoteur de levure. Nous produirons ainsi environ 50,000 séquences qui seront synthétisées, clonées dans des vecteurs rapporteurs et finalement intégrées à un locus permissif du génome, dans des cellules de culture humaine et en levure. Nous mesurerons alors i) l'accessibilité de la chromatine autour de ces séquence synthétique en mettant au point une variante ciblé de l'ATAC-Seq ; ii) l'activité transcriptionnelle par séquençage ciblé de transcrits naissants ; ainsi que iii) la production d'un rapporteur fluorescent par FACS-Seq (selon le principe présenté Figure 5).

La manipulation contrôlée des propriétés des séquences promotrices et la mesure des phénotypes résultants permettra de vérifier avec le moins d'ambiguïté possible le sens des relations de cause a effet entre performance transcriptionnelle, présence de motif fonctionnels et accessibilité de l'ADN.

Figure 1 -

 1 Figure 1 -Code génétique et perspectives évolutives d'un codon. Chaque codon peut accéder à neuf autres codons par simple mutation ponctuelle, ce qui correspond en moyenne à seulement 5,8 acides aminés proximaux en raison de la redondance de code. A titre d'exemple, ces perspectives évolutives sont surlignées en jaune et bleu pour les codons arginine CGG et CGT, respectivement (le vert indique les codons accessible depuis les deux). Les acides amineś qui ne sont accessibles que par un seul de ces deux codons synonymes sont indiqués en gras et soulignés.

Figure 2 -

 2 Figure 2 -Organisation d'un intégron. La plateforme fonctionnelle d'un intégron se compose du gène intI codant pour une intégrase, d'un promoteur de cassette Pc et d'un site primaire de recombinaison, attI.Elle est associée à un ensemble de cassettes dédiées, qui consistent essentiellement en une séquence codante flanquée de deux sites de recombinaisons secondaires, attC. Seules les quelques premières cassettes sont exprimées par Pc et participent ainsi au phénotype. Les autres forment un réservoir de diversité génétique silencieuse. Ces traits potentiellement adaptatif peuvent être amené sous expression par excision aléatoire puis réintégration au site attI, le tout catalysé par l'intégrase. La recombinaison est contrôlée par le système SOS de réponse au stress, permettant ainsi aux intégrons d'exercer une forme de mutation dirigée dans l'espace et dans le temps.

Figure 3 -

 3 Figure 3 -Example du comportement évolutif du taux de recombinaison d'un inteǵron.Une population contenant initialement 30 geńotypes en frequences eǵales (5 cassettes diffeŕentes x 6 alleles d'integrase) a eté soumise à une simulation evolutive de type Monte-Carlo selon trois reǵimes de fluctuations environnementales successifs et caracteŕiseś par des frequences de plus en plus faible (taux de changement environmental de 10 -2.5 , 10 -3 , puis 10 -3.5 par geńeŕation). La valeur geńetique optimale pour chacun des 75 environnements succesifs est indiqueé dans le bandeau du haut par les point blancs cercleś de vert. Le graphique A montre l'evolution au fil des geńeŕations de la frequence des 6 alleles de l'inteǵrase. Chacun de ces alleles authorise une frequence de recombinaison diffeŕente, ainsi qu'indiqué dans l'encadré à droite de la figure. Ces frequences varient en fonction du reǵime de fluctuation de l'environnement. Des peŕiodes de stases environnementale prolongeés entrainent l'augmentation en frequence de l'allele nul (en noir). Le graphique B montre l'evolution de la frequence de recombinaison moyenne de la population, calculeé à partir des donneés du graphique A. La frequence de recombinaison moyenne seĺectionneé dans la population tend a eǵaler la frequence des changements environnementaux.

Figure 4 -

 4 Figure 4 -Estimation de la qualité et de la fiabilité de composant génétique. La construction et l'évaluation de toutes les combinaisons entre promoteurs, 5'UTR et séquences codantes permet d'estimer l'activité intrinsèque moyenne de chacun des ces éléments génétique ainsi que leur sensibilité aux variations de contexte. De fortes interactions entre 5'UTR et séquences codantes limitent la prévisibilité de nouvelles constructions et la programmation rationnelle de l'expression de circuit génétiques.

Figure 5 -

 5 Figure5-FACS-Seq pour évaluation à haut-débit de la production de protéine dans une bibliothèque de variants. Le fractionnement d'une bibliothèque de variants suivie de l'indexage des groupes ainsi obtenu lors de la préparation des libraries de séquencage permet de reconstruire des profils phénotypiques complexes. Ce principe illustré ici par le tri des cellules en fonction de leur niveau de fluorescence peut être appliqué à la mesure de phénotype divers.

Figure 6 -

 6 Figure 6 -Normalisation des interactions avec les séquences codantes par des 5'UTR bicistroniques.Quantification de l'abondance de protéine pour des constructions résultants de la combinaison de 22 5'UTR et 14 séquence issue de la fusion de domaine N-terminal variés avec GFP. Les 5'UTRs menant à des constructions monocistroniques tende à avoir un comportement disparate en fonction des séquence codantes (panneau de gauche), en raison de l'interaction (structure seconadiare) entre ces éléments. En revanche, les UTRs menant à des construction bicistroniques montre un comportement stable entre séquence codantes (panneau du milieu). Dans un système bicistronique, la traduction du gène d'intérêt est couplée a celle du premier cistron qui mène par ailleurs à la déstabilisation des structures secondaires éventuelles. Si l'effet normalisateur est réel (le rang des 5'UTR est stable d'une séquence codante à l'autre), sa mise en évidence graphique passe par une normalisation qui masque les fortes differences d'expressions moyennes entre séquence codantes. Les boites à moustaches du panneau de droite montrent l'entendu de ces variations entr les different 5'UTR bistronique pour chaque CDS.

Figure 7 -

 7 Figure 7 -Efficacité de terminaison et reploiement co-transcriptionel. Le panneau de gauche montre l'efficacité de terminaison calculée pour 61 sequences. En général, ainsi qu'exemplifié ici pour rnpb T1, des terminateurs flanqués de 30 nucléotides de leur contexte naturel (extended) sont plus efficaces, en particulier parce qu'en l'absence de ce contexte (min) des structures parasites peuvent empecher le reploiement rapide du terminateur. Dans le cas du terminateur his T, la version minimale se trouve plus efficace car la version étendue comporte un anti-terminateur normalement impliqué dans la régulation de la transcription.

Figure 8 -

 8 Figure 8 -Diagramme de l'algorithme d'optimisation multiple de D-Tailor. Une combinaison de propriétés cible est sélectionnée au hasard dans une liste décrivant le plan d'expérimentation souhaité. Une séquence proche de la cible dans l'espace euclidien est alors choisie comme point de départ évolutif dans la base de données des séquences préalablement évaluées. Des mutations successives sont alors appliquées jusqu'à ce que la séquence satisfasse la combinaison de propriétés cible.

Figure 9 -

 9 Figure 9 -Exemples d'intégration d'évaluations des séquences synthétiques. A. Le contrôle épigénétique du taux d'initiation traductionnelle montre un rôle modéré du biais d'usage de codon sur la production de protéine.Chaque point représente une des 237,644 constructions pour lesquelles nous avons pu mesurer la production de protéine en absence et présence de couplage traductionnel. L'induction du couplage permet de lever la contrainte majeure imposée par les structures secondaires sur l'initiation de la traduction sans introduire de mutation, révélant ainsi des contrainte secondaires. Chaque point est coloré en fonction du CAI de la séquence synthétique correspondante. Le CAI est une mesure normalisée utilisée couramment pour prédire l'efficacité de traduction. Pour une production de protéine donnée en condition normale, l'induction du couplage augmente d'autant la production de protéine que la séquence présente un fort CAI. B. Impact physiologique négatif de faibles taux d'initiation traductionnel. Le nuage de point montre une association non-monotone entre production de protéine et taux de croissance. Que des fortes productions aient un impact négatif sur la croissance est attendu. De faibles taux de production peuvent occasionner des impacts tout aussi négatifs. Les points sont colorés en fonction de la stabilité des structures secondaire localisées dans la partie le plus en aval des séquences synthétiques. Les courbes de tendances cyan et jaune représentent le taux de croissance médian à chaque percentile de production protéique pour les 10% de la population programmés avec des structure secondaires les plus et moins stable à cette position, respectivement. Ces données suggèrent que de fortes structures secondaires dans les séquences codantes en abaisse l'efficacité de traduction, et ce de manière particulièrement marquée pour de faible taux d'initiation. C. Modèle explicatif de l'effet physiologique négatif d'une forte structuration des transcrits. Les transcrits non-traduits mais déterminants un faible taux de croissance sont les plus abondants à l'équilibre. Ces transcrits présentent une combinaison de forte structures secondaires en début de séquence synthétique (limitant l'initiation) et de forte structure secondaire non chevauchante en aval de la séquence synthétique (favorisant la stabilité des transcrits). Chaque transcrit peut mobiliser un unique ribosome dans un processus d'initiation inefficace et particulièrement lent. Puisque ces transcrits sont très stable cela mène a la séquestration effective d'un grand nombre de ribosome. En déstabilisant les structure, chaque événement traductionnel abaisse la stabilité des transcrits. La séquestration nonproductive de ribosome abaisse d'autant les taux de traduction, renforçant ainsi la stabilité des transcrit et ce phénomène de séquestration en un cercle vicieux.

Figure 10 -

 10 Figure 10 -Quantification des connus et des inconnus.Les camemberts représentent une stratification par ANOVA de la variance en production de protéine observée sur l'ensemble de la bibliothèque synthétique. Les différentes propriétés de séquence et source d'erreurs implémentées dans le plan d'expérience sont annoté de la manière suivante : STR représentent différentes structures secondaire, l'indice correspondant à la position par rapport au codon initiateur ; %AT est la composition en AT ; MHI est l'index hydropathique moyen des acides aminé encodé par la séquence synthétique ; CAI est une mesure d'usage de codon ; X indique une interaction de premier ordre entre propriétés. Les effet principaux (M) et interactions (d'ordre 1 et supérieur) de tailles trop faibles sont regroupés ensemble. L'identité sérielle est une catégorisation des séquences par séries mutationnelles. Les interactions entre identité sérielle et propriétés sont interprétées comme des erreurs puisqu'elles capturent des comportements idiosyncratiques des séries mutationnelles. L'erreur de conception capture les différences entre séquences très proches implémentant les mêmes niveaux de propriétés. L'erreur expérimentale capture les différences entre réplicas biologique et est très faible. Les résidus représente la part de variabilité non expliqué par le modèle linéaire qu'est l'ANOVA.

Figure 12 -

 12 Figure 12 -Petits génomes mais cycle de vie complexe. Ce schéma présente les phénotypes qui pourrons être mesurés et intégrés pour chacun des mutants ponctuels accessibles depuis un génome viral. L'évaluation de ces phénotypes s'appuiera sur le séquençage à haut-débit d'un code-barres marquant différents objets moléculaires impliqués dans les étapes successives du cycle de vie : transcrit (bleu), génome (violet) et virions (orange).

Figure 13 -

 13 Figure 13 -Balayage mutationel contrôlé à l'échelle d'un génome viral entier

Figure 14 -

 14 Figure 14 -Vue d'ensemble du projet TOPs

Figure 15 -

 15 Figure 15 -Inversement de la logique de transduction d'un récepteur transmembranaire. Dans le cadre d'un récepteur transmembranaire chimérique capable de reconnaitre la molécule de caféine, la séquence juxtamembrane du récepteur CadC a été remplacée par 3,138 séquences homologues naturelles et leur effet sur l'activation d'un système rapporteur fluorescent a été mesuré par FACS-Seq. Alors que la séquence native détermine une activation du système en présence de ligand, certains homologues en déterminent la répression.

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  Je déclare avoir respecté, dans la conception et la rédactionde ce mémoire d'HDR, les valeurs et principes d'intégrité scientifique destinés à garantir le caractère honnête et scientifiquement rigoureux de tout travail de recherche, visés à l'article L.211-2 du Code de la recherche et énoncés par la Charte nationale de déontologie des métiers de la recherche et la Charte d'intégrité scientifique de l'Université de Montpellier. Je m'engage à les promouvoir dans le cadre de mes activités futures d'encadrement de recherche. Stéphane Julié -Galau, Guillaume Cambray, Didier Mazel (2010). The synthetic integron: an in vivo genetic shuffling device. Nucleic Acids Research, 38 (15), e153-e153 Émilie Guerin, Guillaume Cambray*, Sandra da Re, Didier Mazel, Marie-Cécile Ploy (2010-01). Les antibiotiques induisent la capture de gènes de résistance par les bactéries. médecine/sciences, 26 (1), 28-30 Émilie Guerin, Guillaume Cambray*, Neus Sanchez-Alberola, Susana Campoy, Ivan Erill, Sandra da Re, Bruno Gonzalez-Zorn, Jordi Barbé, Marie-Cécile Ploy, Didier Mazel (2009-05-21). The SOS Response Controls Integron Recombination. Science, 324 (5930)

	1. CURRICULUM VITAE Guillaume CAMBRAY Date de naissance : 23/01/1981 Nationalité : Française Courriel : guillaume.cambray@cbs.cnrs.fr Site web : http://www.cbs.cnrs.fr/index.php/en/home-equipec2 AUTRES SERVICES Reviewer for funding agencies MSCA fellowship (European Commission), Genopole (France) Reviewer for academic journals Nature Communication, Nucleic Acids Research, Bioinformatics, ACS Synthetic Biology, Journal of Biological Engineering, Virology Journal, David Bikard, Guillaume Cambray, Anne-Marie Guerout,, Didier Mazel (2010). Integrons. Annual Review of Genetics, iScience, Journal of Molecular Biology
	ÉDUCATION 44 (1), 141-166 CONTRIBUTIONS AU DOMAINE PUBLIC
	à Montpellier le 19/04/2021 Guillaume Cambray, Didier Mazel (2008-11-14). Synonymous Genes Explore Different Evolutionary 2009 Landscapes. PLoS Genetics, 4 (11), e1000256 D-Tailor Package (https://github.com/jcg/d-tailor) Doctorat de Génétique, Université Denis Diderot, Paris 2008 ELP software (https://galaxy.pasteur.fr/root?tool_id=toolshed.pasteur.fr/repos/odoppelt/elp/elp/3.0) Diplôme 'Informatique pour la Biologie', Institut Pasteur, Paris COMMUNICATIONS ORALES ACADÉMIQUES INVITÉES BIOFAB part distribution (https://www.addgene.org/kits/endy-biofab/)
	09/2019	International Workshop on Control Engineering and Synthetic Biology, Oxford,
	Guillaume Cambray Journées Ouvertes Biologie, Informatique et Mathématiques, Nantes, France Grande Bretagne AWARD AND HONORS 07/2019
	10/2018 2010	13 Prix pour jeunes scientifiques décerné par la fondation Bettencourt-Schueller
		Paris, France
	09/2014	Synthetic Biology Engineering Research Center Symposium, Boston, États-Unis
		d'Amérique
	09/2014	BIOLEDGE Workshop, Centre de recherche technique VTT, Espoo, Finlande
	07/2011	Synthetic Biology 5.0, Stanford University, Palo Alto, California, États-Unis d'Amé-
		rique
	06/2006	Conférence antibiotiques et évolution bactérienne, Paris, France
	AUTRES COMMUNICATIONS ORALES ACADÉMIQUES
	09/2016	17th International Conference on Systems Biology, Barcelone, Espagne.
	09/2015	1ère conférence annuelle du GDR BioSynSys, Paris, France
	07/2015	International Synthetic and Systems Biology Summer School, Taormina, Italy
	03/2015	Enabling Technologies for Eukaryotic Synthetic Biology Symposium, EMBL, Ger-
		many.
	02/2013	1st annual Quantiative Biology (qBio) meeting, Hawaï, USA
	08/2007	European Meeting of PhD Students in Evolutionary Biology, Lund, Suède
	COMMUNICATIONS ACADÉMIQUES SOUS FORME DE POSTER
	06/2017	Synthetic Biology 7.0, Singapour
	03/2014	Synthetic Biology Engineering Research Center (SynBERC) symposium, Berkeley,
		Californie, États-Unis d'Amérique
	06/2012	General Meeting of the American Society for Microbiology ASM2012, San Francisco,
		Californie, États-Unis d'Amérique
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th Annual Meeting of the International Conference on Genomics, Shenzen, Chine 10/2017 Réunion biennale du réseau national de recherche AdaLep, Montpellier, France 11/2015 Design, optimization and control for systems and synthetic biology Workshop, ENS, 2010 Prix de thèse Louis Forest décerné par la chancellerie des universités de Paris.

séquence issue de la fusion de domaine N-terminal variés avec GFP. Les 5'UTRs menant à des constructions monocistroniques tende à avoir un comportement disparate en fonction des séquence codantes (panneau de gauche), en raison de l'interaction (structure seconadiare) entre ces éléments. En revanche, les UTRs menant à des construction bicistroniques montre un comportement stable entre séquence codantes (panneau du milieu). Dans un système bicistronique, la traduction du gène d'intérêt est couplée a celle du premier cistron qui mène par ailleurs à la déstabilisation des structures secondaires éventuelles. Si l'effet normalisateur est réel (le rang des 5'UTR est stable d'une séquence codante à l'autre), sa mise en évidence graphique passe par une normalisation qui masque les fortes differences d'expressions moyennes entre séquence codantes. Les boites à moustaches du panneau de droite montrent l'entendu de ces variations entr les different 5'UTR bistronique pour chaque CDS.

Figure11-La production de protéines de capside est nécessaire à la réplication de JcDV. Une quantification de la réplication virale par qPCR est représentée sous forme de barres sur la panneau de droite pour diverses constructions et complémentations indiquées de manière schématique sur le panneau de gauche. La construction initiale (pDef-nf) d'un clone pour lequel le bloc fonctionnel NS codant pour les gènes réplicatifs a été cloné hors du génome et remplacé par un bloc rapporter (R) ne supporte pas de réplication. Des expériences de complémentation de plus en plus fine ont permis de circonscrire le problème à la troncation de la queue 3'UTR du gène VP (e.g. pVP-3p75). La réintroduction de cette queue dans le clone modifié rétabli bien la réplication (e.g. pDef-3p115). L'introduction de codon Stop ou d'indel dans la séquence codante des protéines VPs récapitule le phénotype non-réplicatif, démontrant le rôle des protéines VPs dans la réplication.Le problème s'est avéré être beaucoup plus intéressant. Des expériences de complémentation ont montrées que le phénotype non-fonctionnel ne pouvait être sauvé par les gènes NSs mais par les gènes de capside VPs (Figure11). Le génome de JcDV est ambisens : le transcrit portant le gène VP comporte une longue queue 3'UTR chevauchant les transcrits NS. Lorsque les gène NS ont été placés hors du génome, cette longue queue a été raccourcie. Une hypothèse attractive consistait à postuler qu'une interaction anti-sens entre les extrémités 3' chevauchantes des transcrits NS et VP avait un rôle dans le contrôle de l'expression des gènes NS. Une telle interaction serait complétement abolie dans le clone défectif. Des expériences de mutagenèse synonyme et de complémentation m'ont permis d'invalider le rôle d'un tel défaut de régulation dans le phénotype défectif observé. Si une