Alan Serafin

Matteo Fadel

Philipp Treutlein

Alice Sinatra

Nuclear spin squeezing in Helium-3 by continuous quantum nondemolition measurement

We propose a technique to control the macroscopic collective nuclear spin of a Helium-3 vapor in the quantum regime using light. The scheme relies on metastability exchange collisions to mediate interactions between optically accessible metastable states and the ground-state nuclear spin, giving rise to an effective nuclear spin-light quantum nondemolition interaction of the Faraday form. Our technique enables measurement-based quantum control of nuclear spins, such as the preparation of spin-squeezed states. This, combined with the day-long coherence time of nuclear spin states in Helium-3, opens the possibility for a number of applications in quantum technology.

Introduction. The nuclear spin of Helium-3 atoms in a room-temperature gas is a very well isolated quantum system featuring record-long coherence times of up to several days [START_REF] Gentile | Optically polarized 3He[END_REF]. It is nowadays used in a variety of applications, such as magnetometry [START_REF] Heil | Helium Magnetometers[END_REF], gyroscopes for navigation [START_REF] Kitching | Atomic Sensors -A Review[END_REF], as target in particle physics experiments [START_REF] Gentile | Optically polarized 3He[END_REF], and even in medicine for magnetic resonance imaging of the human respiratory system [START_REF] Couch | Hyperpolarized and Inert Gas MRI: The Future[END_REF]. Moreover, Helium-3 gas cells are used for precision measurements in fundamental physics, e.g. in the search for anomalous forces [START_REF] Vasilakis | Limits on New Long Range Nuclear Spin-Dependent Forces Set with a K-3He Comagnetometer[END_REF] or violations of fundamental symmetries in nature [START_REF] Heil | Spin clocks: Probing fundamental symmetries in nature[END_REF].

While the exceptional isolation of Helium-3 nuclear spins is key to achieving long coherence times, it renders measurement and control difficult. Remarkably, noble gas nuclear spins can be polarized by metastabilityexchange or spin-exchange optical pumping, harnessing collisions between atoms in different states or of different species that transfer the optically induced electronic polarisation to the nuclei [START_REF] Gentile | Optically polarized 3He[END_REF][START_REF] Batz | Fundamentals of metastability exchange optical pumping in helium[END_REF]. However, the role of quantum coherence, quantum noise and many-body quantum correlations in this process is only beginning to be studied [START_REF] Dantan | Long-lived quantum memory with nuclear atomic spins[END_REF][START_REF] Reinaudi | Squeezing and entangling nuclear spins in helium 3[END_REF][START_REF] Katz | Quantum interface for noble-gas spins[END_REF]. Optical quantum control of noble gas nuclear spin ensembles is still in an early stage of development, and key concepts of quantum technology such as the generation of non-classical states for quantum metrology [START_REF] Pezzè | Quantum metrology with non-classical states of atomic ensembles[END_REF] or the storage of quantum states of light [START_REF] Bussières | Prospective applications of optical quantum memories[END_REF] have not yet been demonstrated.

In this paper we propose a technique for the optical manipulation of Helium-3 nuclear spins in the quantum regime. As the nuclear spin state cannot be directly manipulated with light, our approach makes use of metastability exchange collisions to map optically accessible electronic states into the nuclear state, thereby mediating an effective coupling between the light and the nuclear spin. In contrast to earlier ideas put forward by one of us [START_REF] Dantan | Long-lived quantum memory with nuclear atomic spins[END_REF][START_REF] Reinaudi | Squeezing and entangling nuclear spins in helium 3[END_REF], the scheme considered here results in a Faraday interaction [START_REF] Hammerer | Quantum interface between light and atomic ensembles[END_REF] coupling the fluctuations of the light and of the nuclear spin. This interaction is nowadays routinely used as a powerful and versatile spin-light quantum interface

x y z B κ 1083 nm λ 2 ϕ FIG.
1. Illustration of the proposed setup. A Helium-3 vapor cell is placed inside an asymmetric optical cavity, ensuring that photons leave the cavity at rate κ predominantly through the out-coupling mirror. A (switchable) discharge maintains a small fraction of the atoms in a metastable state. The atomic metastable and nuclear spins are oriented in the x direction beforehand by optical pumping. The light polarization, initially along x, is rotated by an angle ϕ due to the Faraday effect, performing a quantum nondemolition measurement of the nuclear spin fluctuations along the light propagation direction. This polarization rotation is continuously monitored via homodyne measurement.

in experiments with alkali vapours [START_REF] Hammerer | Quantum interface between light and atomic ensembles[END_REF][START_REF] Vasilakis | Generation of a squeezed state of an oscillator by stroboscopic back-action-evading measurement[END_REF]. Since our scheme does not require other atomic species as mediator [START_REF] Katz | Quantum interface for noble-gas spins[END_REF][START_REF] Katz | Long-Lived Entanglement Generation of Nuclear Spins Using Coherent Light[END_REF] and the rate constants of metastability exchange collisions are comparatively high [START_REF] Gentile | Optically polarized 3He[END_REF], it can operate at room temperature and millibar pressures as commonly used in experiments with Helium-3. Moreover, the interaction can be switched on and off, by switching the week discharge that maintains a population in the metastable state. Our scheme will allow to develop quantum-enhanced technologies with Helium-3, such as measurement devices with sensitivity beyond the standard quantum limit [START_REF] Pezzè | Quantum metrology with non-classical states of atomic ensembles[END_REF].

Semiclassical three-mode model. We consider the setup in Fig. 1, where a gas cell containing N cell Helium-3 atoms in the ground state and a small fraction n cell ∼ 10 -6 N cell in the metastable state is placed inside an optical cavity. In the theoretical treatment we assume that the metastable atoms are homogeneously illuminated by the 1 1 S 0 cavity mode and the magnetic field is zero. Effects of a small guiding field and the spatial profile of the cavity mode will be discussed at the end of the paper. The relevant level scheme is illustrated in Fig. 2. We introduce the collective spin operators I and K for the (nuclear) ground state and for the F = 1/2 metastable manifold, respectively. For the cavity light, propagating in the z-direction and addressing the 2 3 S 1 -2 3 P 0 C 8 transition at 1083 nm, we introduce the Stokes spin operators as a function of the x-and y-polarized modes as

2 3 P 0 2 3 S 1 S K I F = 3/2 F =
S x = (c † x c x -c † y c y )/2, S y = (c † x c y + c † y c x )/2 and S z = (c † x c y -c † y c x )/(2i).
For a large detuning ∆ and in the low-saturation limit, the excited state 2 3 P 0 can be adiabatically eliminated, resulting in the Faraday interaction Hamiltonian [START_REF] Hammerer | Quantum interface between light and atomic ensembles[END_REF]

H = χK z S z (1)
with coupling strength χ = g 2 c /∆. Here,

g c = d 8 E c / and E c = ω 2 0Vc
, where V c is the cavity mode volume, ω the angular frequency and d 8 the dipole matrix element of the chosen transition.

The coupling between K and I is provided by metastability exchange collisions, occurring at rate 1/τ for a metastable atom, and 1/T for a ground state atom, with T /τ = N cell /n cell [START_REF] Dupont-Roc | Contribution à l'étude du pompage optique par échange de métastabilité dans 3He. -Première Partie[END_REF]. Metastability exchange collisions can be thought of as an instantaneous exchange of the electronic excitation between a ground state and a metastable atom that leaves nuclear and electronic spins individually unchanged. They are routinely used to transfer orientation between the metastable and the nuclear spins and, as it was shown theoretically, they can also transfer quantum correlations [START_REF] Dantan | Long-lived quantum memory with nuclear atomic spins[END_REF][START_REF] Reinaudi | Squeezing and entangling nuclear spins in helium 3[END_REF]. Starting from metastabiliy exchange equations for the metastable and nuclear variables [START_REF] Dupont-Roc | Contribution à l'étude du pompage optique par échange de métastabilité dans 3He. -Première Partie[END_REF] plus the Faraday interaction (1) between K and S, we write a set of nonlinear equations for the mean values of the collective operators that describe the system dynamics in the semiclassical approximation, i.e. neglecting quantum fluctuations and correlations. For x-polarized nuclear and light spins

I x s = P N cell 2 ≡ N 2 and S x s = n ph 2 , (2)
where P ∈ [0, 1] is the nuclear polarisation and n ph the number of photons in the c x cavity mode in steady state without atoms, the nonlinear equations of motion admit a stationary solution. In particular, we find

K x s = P 1 -P 2 3 + P 2 n cell 2 ≡ n 2 . ( 3
)
The nonlinear equations of motion can now be linearized around this stationary solution by setting A = A s + δA, with A a collective operator and δA a classical fluctuation. By performing an adiabatic elimination of the F = 3/2 metastable manifold, we obtain the reduced set of coupled differential equations for the classical fluctuations of the transverse components of three spins

δS z = - κ 2 δS z (4a) δS y = - κ 2 δS y + χ S x s δK z (4b) δ I z = -γ f δI z + γ m δK z (4c) δ I y = -γ f δI y + γ m δK y (4d) δK z = -γ m δK z + γ f δI z (4e) δK y = -γ m δK y + γ f δI y + χ K x s δS z . (4f)
Here, decay rate and the effective metastability exchange rates for the ground state and metastable atoms are

γ f = 4+P 2 8-P 2 1-P 2 3+P 2 1 T and γ m = 4+P 2 8-P 2 1 τ , respec- tively. Note that γ m /γ f = N/n
1. We proceed now with a full quantum treatment of the reduced system of three collective spins.

Quantum three-mode model. Since S, K and I are xpolarized and will maintain a large polarization throughout the entire protocol, we can perform the Holstein-Primakoff approximation by replacing

I y / √ N X a , I z / √ N P a , K y / √ n X b , K z / √ n P b , S y / √ n ph X c
, and S z / √ n ph P c where we have introduced the bosonic quadratures X ν = (ν +ν † )/2, P ν = (ν -ν † )/(2i), [X ν , P ν ] = i/2 for ν = a, b, c, that describe the transverse fluctuations of the collective spins. Note that within the Primakoff approximation the mode c c y is associated to the y-polarized photons inside the cavity. The Faraday Hamiltonian (1) becomes

H = ΩP b P c , (5)
with Ω = χ √ nn ph . In a fully quantum treatment [START_REF] Dantan | Long-lived quantum memory with nuclear atomic spins[END_REF],

one adds appropriate Langevin forces representing quantum noise to the semiclassical equations (4). To this approach however, we prefer here an equivalent formulation in terms of a quantum master equation (QME) for the density operator ρ describing the three bosonic modes a (nuclear), b (metastable) and c (cavity),

ρ = 1 i [H, ρ] + w=c,m C w ρC † w - 1 2 {C † w C w , ρ} . (6)
Besides the interaction Hamiltonian Eq. ( 5), it includes jump operators for the cavity losses C c = √ κc and for metastability exchange collisions

C m = - √ 2γ m b + 2γ f a.
Initially, the three modes are in the vacuum state. Due to the Faraday effect caused by quantum fluctuations of the spin, the polarization of the light is slightly turned and, after a transient time of order 1/κ, the number of y-polarized photons in the cavity reaches the steady state

c † c (t) → Ω 2κ 2 1 - 2γ m κ + 2(γ m + γ f ) . (7)
The metastability exchange collisions lead to a hybridization of the nuclear spin and metastable modes. Their contribution to the three-mode QME is diagonalised introducing the rotated basis

α = γ m γ m + γ f a + γ f γ m + γ f b , (8)
β = γ m γ m + γ f b - γ f γ m + γ f a . (9)
In practice, as γ m γ f , α ≈ a and β ≈ b. In the rotated basis, the system can be reduced to a one-mode model.

Reduction to a one-mode model. We consider the regime κ γ m γ f , all being larger than the timescale of the nuclear spin evolution. During the evolution, the number of excitations in the "hybridized nuclear" mode α grows linearly in time, while the "hybridyzed metastable" mode β as well as the cavity mode c will rapidly tend to a stationary value, allowing their adiabatic elimination.

Following a similar procedure as in Ref. [START_REF] Castin | Monte Carlo Wave-Function Analysis of 3D Optical Molasses[END_REF] within the Monte-Carlo wavefunction description, we obtain to leading order in the coupling Ω a one-mode QME describing the slow evolution of the hybridized nuclear mode α ρα = w=s,d

C w ρC † w - 1 2 [C † w C w , ρ] . (10)
This QME involves two jump operators, C d = Ω 2 /4κ I with I the identity, and C s = Γ sq P α with

Γ sq = Ω 2 κ γ f γ m . ( 11
)
It appears from the adiabatic elimination that C d is related to "double jumps" where a photon and a metastable excitation are annihilated at the same time. This process does not affect the nuclear state vector and it does not play any role in the homodyne-measurement squeezing scheme we consider [28]. On the contrary we will see that C s , related to single cavity jumps, is responsible for the generation of nuclear spin squeezing at rate Γ sq . Eqs. [START_REF] Katz | Quantum interface for noble-gas spins[END_REF][START_REF] Katz | Long-Lived Entanglement Generation of Nuclear Spins Using Coherent Light[END_REF] are one of the main results of our work. The factor γ f /γ m = n/N in Eq. ( 11), absent in the squeezing rates obtained for alkali atoms using Faraday interactions, reflects the fact that we optically address n metastable atoms to manipulate N nuclear spins.

Quantum non-demolition measurement of the nuclear spin. We now study the evolution of the system in a single experimental realisation, conditioned on the result of a continuous homodyne measurement performed on the small y-polarized field leaking out of the cavity, the local oscillator phase being chosen to measure X c [29]. This is described at the level of the QME by appropriate jump operators. A density matrix conditioned on the measurement can be reconstructed in the Monte Carlo wavefunction method by averaging over stochastic realizations with different histories for metastability exchange collisions but same history for the homodyne detection. In the limit of a local oscillator with large amplitude, the evolution of the Monte Carlo wavefunction can be approximated by a nonlinear continuous stochastic evolution [START_REF] Castin | A Wave Function approach to dissipative processes[END_REF][START_REF] Gisin | Quantum Measurements and Stochastic Processes[END_REF]. We apply this approach to both the one-mode model and the three-mode model.

In the case of the one-mode model Eq. ( 10), the corresponding stochastic evolution reads

d|φ(t) = - dt 2 Γ sq Q 2 |φ(t) + Γ sq dζ s Q|φ(t) , (12)
where Q ≡ P α -φ|P α |φ and dζ s is a real Gaussian random noise of zero mean and variance dt. The stochastic equation ( 12) describes the evolution of the quantum state of the nuclear spin in a single realization of the experiment. The deterministic term proportional to Γ sq dt and the random noise proportional to Γ sq dζ s are issued from the jump operator C s in the original one mode QME [START_REF] Katz | Quantum interface for noble-gas spins[END_REF] and are physically associated to the measurement process on the nuclear spin [START_REF] Gisin | Stochastic quantum dynamics and relativity[END_REF][START_REF] Percival | The quantum-state diffusion model applied to open systems[END_REF][START_REF] Thomsen | Spin squeezing via quantum feedback[END_REF]. For our initial conditions, the time evolution described by Eq. ( 12) can be solved analytically. For a single realization φ(t) of the stochastic evolution, corresponding to a particular history of homodyne detection, we find that for long times the average P α φ ≡ φ|P α |φ stabilizes to a (random) constant value, and the variance Var φ (P α ) tends to zero as (Γ sq t) -1 . Going back to the original three-mode basis, the single realisation variance of the nuclear spin quadrature P a corresponding to 13) of the one-mode model. (d) Effect of decoherence. Black: three-mode model with an additional relaxation rate γ0/κ = 1/1000 in the metastable state, where we now average over 8 realizations of the stochastic noises related to metastability exchange and wall relaxation in the metastable state. Green : one-mode model with the corresponding effective relaxation in the ground state γ 0 = Γsq/10. Dashed horizontal line: analytical prediction [START_REF] Dupont-Roc | Contribution à l'étude du pompage optique par échange de métastabilité dans 3He. -Première Partie[END_REF].

I z reads Var φ (P a )(t) = 1 4 1 + γ f γm Γ sq t 1 + Γ sq t , (13)
and the time average of the homodyne signal is proportional to the fixed (random) value of P a φ of that realisation

c + c † φ t→∞ -→ 2 Γ sq κ P a φ . (14)
Note that Var φ (P a )(t) tends to γ f /(4γ m ) in the t → ∞ limit, which is the theoretical spin squeezing limit intrinsic to this method that uses the metastable state to mediate the interaction. In Fig. 3b-c we compare the analytical predictions ( 14) and ( 13) with the numerical solution of the three-mode model. We note that the limit γ f /γ m → 0 of equation ( 13) coincides with the result that one would obtain from a nuclear spin-light interaction of the quantum nondemolition or Faraday form

H eff = Ω n N P a P c or H eff = χ n N I z S z . (15)
Effect of decoherence. Due to the long coherence time of the nuclear spin, we can ignore its decoherence on the time scale of squeezing generation. On the other hand, decoherence in the metastable state, including spontanous emission and collisions with the cell walls, will affect the performance of the squeezing protocol. From analytical calculations we can show that a relaxation with rate γ 0 in the metastable state appears in the ground state as an effective relaxation with reduced rate γ 0 = γ 0 γ f γm . We thus expect the effect of metastable relaxation to become negligible for Γ sq γ 0 . By inserting this effective relaxation in the one-mode model ( 10), we calculated the squeezing limit in a single realisation in the presence of metastable decoherence for γ m γ f and Γ sq γ 0 , Var φ (P a ) t→∞ -→ 1 4

γ 0 Γ sq and Var φ (X a ) t→∞ -→ 1 4
Γ sq γ 0 .

(16) This kind of scaling, already found for alkali atoms [START_REF] Madsen | Spin squeezing and precision probing with light and samples of atoms in the gaussian approximation[END_REF], is further confirmed by our numerical simulations where we introduce an additional jump operator √ γ 0 b in the threemode QME [START_REF] Heil | Spin clocks: Probing fundamental symmetries in nature[END_REF], see Fig. 3d. An extended theoretical treatment will be published in a separate paper [25]. Experimental proposal. We consider a cylindrical vapor cell 20 mm long and 5 mm in diameter, filled with N cell = 2.5 × 10 16 3 He atoms at a pressure of p = 2 Torr. For a polarization of P = 0.4 this gives an effective number of ground state atoms N = 1.0 × 10 16 . We take n cell N cell = 5 × 10 -6 , giving an effective number of metastable atoms n = 1.3 × 10 10 . From the metastability exchange rate coefficient [START_REF] Gentile | Optically polarized 3He[END_REF], we determine effective metastability exchange rates γ m = 5.2 × 10 6 s -1 and γ f = 7.0 s -1 . The cell is placed inside an optical cavity to enhance the atom-light interaction [START_REF] Vasilakis | Generation of a squeezed state of an oscillator by stroboscopic back-action-evading measurement[END_REF]. For a finesse of F = 50 and a cavity length of 3 cm, we obtain κ = 2π 1.0 × 10 8 Hz. The cavity is laser driven on the x-polarization mode so that 5 mW of light exit the cavity in this polarization, and we take the light to be detuned by ∆ = 2π 2.0 GHz from the C 8 transition. This results in Ω = 2π 4.1 × 10 6 Hz. In steady state, 6.5 × 10 5 s -1 y-polarized photons leave the cavity, Eq. [START_REF] Batz | Fundamentals of metastability exchange optical pumping in helium[END_REF]. The nuclear spin squeezing rate is evaluated from Eq. ( 11) to Γ sq = 1.4 s -1 . We have assumed that atomic motion averages over spatial inhomogeneities of the cavity mode, effectively coupling the light homogeneously to all atoms in the cell [30]. From the diffusion coefficient of metastable atoms [26], we estimate the metastable relaxation rate due to wall collisions to be γ wall 0 = 2.6 × 10 4 s -1 [27]. The off-resonant photon scattering rate in the metastable state, averaged over the cell, is γ scat 0 ≈ 2.4 × 10 3 s -1 γ wall 0 . According to (16), the squeezing limit for these parameters is -8 dB. We note that the squeezing limit imposed by photon scattering is the same as for alkali atoms, since the factor n/N appears both in the effective coupling [START_REF] Vasilakis | Generation of a squeezed state of an oscillator by stroboscopic back-action-evading measurement[END_REF] and in the effective nuclear spin decoherence rate γ 0 in terms of the metastable decoherence rate γ 0 . For such squeezing levels, we estimate that the Larmor precession in a small guiding field of 10 -7 G for t = 10 s, approximately the whole duration of the experiment, can be neglected [31]. For larger guiding fields of order 10 mG, stroboscopic measurements can be used to evade quantum back-action [START_REF] Vasilakis | Generation of a squeezed state of an oscillator by stroboscopic back-action-evading measurement[END_REF].

Conclusions. In this work we proposed a technique for the optical manipulation of the 3 He collective nuclear spin in the quantum regime. In particular, we have shown that QND measurement techniques previously developed for alkali atoms can be generalized to this system, giving access to a measurement-based preparation of nonclassical nuclear spin states, and thus constituting a fundamental building block for Helium-spin based quantum technologies. Concrete examples that are realistic for the near future include measurement devices with a sensitivity beyond the classical limit and quantum memories for light with ultra-long (several days) storage times. in preparation.

[26] W. A. Fitzsimmons,N. F. Lane, and G. K. Walters, Diffusion of He(2 3 S1) in Helium Gas; 2 ] This is because the produced photon is in this case incoherent with the pump and does not contibute to the homodyne signal. It would on the contrary play a role in a scheme based on photon counting as in [START_REF] Wiseman | Quantum theory of fieldquadrature measurement[END_REF].

[29] Being the conjugate quadrature to Pc, Xc carries the information about Pα (see Eqs. ( 5) and ( 8)-( 9)).

[30] The squeezing time scale 1/Γsq is long compared to the time scale 1/γ wall 0 for atomic motion between cell walls, γ wall 0 /Γsq ∼ 10 4 . The atomic motion thus averages over the spatial variations of the cavity mode, ensuring the validity of a description in terms of collective interactions.

[31] We consider that the effect of a magnetic field B over a time t is negligible if the precession of the noise ellipse of a 10 dB squeezed state degrades the squeezed variance by less than 10% (this corresponds to an angle of 1.8 degrees). Given that the Larmor frequency in the ground state is 3.24 kHz/G, we obtain the condition B[G] × t[s] ≤ 1.5 × 10 -6 . Although the Larmor frequency in the metastable state is much larger, 1.87 MHz/G, the precession in this state is negligible for magnetic fields up to ∼ 10 mG since the rotation in the zy plane occurs only during the short time 1/γm between two metastability exchange collisions, corresponding to an angle of order 1 degree.

FIG. 3 .

 3 FIG. 3. (a) Time evolution of the homodyne signal c + c † φ (blue) and of the nuclear spin quadrature 2 Γsq κ Pa φ (orange) in a single realization of the experiment where a continuous homodyne measurement of the y-polarized field leaking out of the cavity is performed. (b) Time average of the same quantities. The curves are obtained from the continuous stochastic equation derived from the three-mode QME (6), for a single realization of the stochastic noise describing homodyne detection (the equivalent of dζs of the one-mode model) and averaged over 5 realization of the stochastic noise describing metastability exchange. Parameters: Ω/κ = 1/10, γm/κ = 1/10, γ f /κ = 1/100, Γsq/κ = 1/1000. (c) Conditional variance of the nuclear spin quadrature Pa as a function of time. Black: three-mode model with same parameters as (a), Green: analytical prediction (13) of the one-mode model. (d) Effect of decoherence. Black: three-mode model with an additional relaxation rate γ0/κ = 1/1000 in the metastable state, where we now average over 8 realizations of the stochastic noises related to metastability exchange and wall relaxation in the metastable state. Green : one-mode model with the corresponding effective relaxation in the ground state γ 0 = Γsq/10. Dashed horizontal line: analytical prediction (16).

  3 S1 -1 1 S0 Interaction Potentials at Long Range, Phys. Rev. 174 193 (1968). [27] W. Franzen, Spin Relaxation of Optically Aligned Rubidium Vapor, Phys. Rev. 115, 850 (1959) [28

Acknowledgments. We thank Y. Castin, P.-J. Nacher, G. Tastevin, W. Heil, O. Firstenberg and F. Laloë for the useful discussions. All authors acknowledge funding from the project macQsimal of the EU Quantum Flagship. MF was supported by the Research Fund of the University of Basel for Excellent Junior Researchers.


Ksenia Ermoshina

Francesca Musiani

Ruser sur les réseaux : Résistances « par l'infrastructure » des fournisseurs d'accès Internet en Russie

des fournisseurs d'accès Internet en Russie ............

Introduction

Le marché des fournisseurs de services Internet (FAI) s'est développé de façon décentralisée en Russie, à l'initiative d'ingénieurs-entrepreneurs qui travaillaient au sein d'institutions scientifiques et étaient en relation étroite avec les pays de l'aire occidentale, dans un contexte presque « anarchique » [START_REF] Kuznetsov | Oshchupyvaia slona. Zametki po istorii russkogo internet[END_REF], c'est à dire sans leaders prédominants, contrôle centralisé ou primauté des intérêts marchands. En effet, la Russie n'a pas connu un projet de développement centralisé des infrastructures informationnelles au niveau national, malgré le projet d'un réseau à l'échelle de l'URSS (intitulé OGAS) dans les années 1960-1970s ; les réseaux numériques en Russie ont le plus souvent pris la forme d'un "patchwork" de réseaux locaux, ou de communications à des fins purement militaires, plutôt que d'un réseau global interconnecté ouvert aux civils [START_REF] Peters | How Not to Network a Nation: The Uneasy History of the Soviet Internet[END_REF]. Les premières années du RuNet se sont ainsi déroulées sous la bannière de l'auto-régulation, avec notamment un accord sur l'administration de la zone ".ru" signé en 1993 par les FAI les plus importants.

A ce stade, l'État n'est intervenu dans le développement et la régulation du marché des services Internet que de façon très limitée. Les tentatives de réguler les activités des FAI dans les années 1990-2000 ont été cantonnées à des aspects tels que la distribution des licences, l'attribution des noms de domaine. Lorsqu'en décembre 1999 Vladimir Poutine, alors Premier Ministre, convoque une réunion avec des "experts d'Internet" afin de discuter d'un projet de loi pour déléguer l'administration et la régulation du RuNet au gouvernement, la proposition est vivement critiquée par les "élites d'Internet" [START_REF] Asmolov | The imaginaries of RuNet: the change of the elites and the construction of online space[END_REF] ingénieurs, propriétaires des premières grandes plateformes numériques russes et journalistes, et elle est rejetée.

Le marché des services Internet se développait alors dans une optique d'autorégulation et de ce qu'on pourrait appeler un « multi-parties-prenantes sauvage »1 , avec une concurrence dynamique et une grande diversité d'acteurs mais sans institutions de régulation formelles. Cette décentralisation, ainsi que la topologie des réseaux russes, très connectés à et dépendants de l'étranger, rendaient le contrôle de l'Internet russe compliqué. Un ensemble de lois marquant un tournant autoritaire et centralisateur pour le RuNet, et sous-tendant une vision d'"Internet souverain" [START_REF] Nocetti | Russia's 'dictatorship-of-the-law' approach to internet policy[END_REF][START_REF] Freiberg | Putin's Russiaon a path to cyber sovereignty?[END_REF], n'est arrivé qu'au début des années 2010. Cette gouvernance de plus en plus centralisée s'incarne en deux niveaux principaux : la censure et la surveillance [START_REF] Ermoshina | Migrating Servers, Elusive Users: Reconfigurations of the Russian Internet in the Post-Snowden Era[END_REF]. Une liste noire répertorie désormais les pages web dont l'accès doit être restreint ; le système d'interception légale dit "SORM-3" oblige les fournisseurs d'accès à conserver le trafic de leurs clients pendant au moins 30 jours, et les métadonnées pendant 1 an ; des boîtiers d'analyse de trafic sophistiqués sont développés, et une copie de la structure du Domain Name System (DNS), qui devrait permettre de "boucler" le trafic à l'intérieur du réseau national, est également envisagée. L'application de ces mesures nécessite l'intégration d'équipements très coûteux chez les FAI, qui doivent assurer les coûts d'achat, d'installation et de maintenance de ces dispositifs, aussi appelés « boîtiers intermédiaires ». Des dizaines de fabricants sont apparus sur ce marché ces dernières années, laissant les FAI perplexes face à une offre de solutions non-certifiées : en effet, les standards, spécifications et prescriptions techniques précises pour ces dispositifs n'apparaissent que très tard, ouvrant la voie à des longues périodes d'incertitude techno-juridique. En réponse à cette gouvernance à la fois floue et de plus en plus centralisée, et face à des risques économiques importants, les FAI développent de nombreuses techniques de résistance afin d'éviter les amendes ou de minimiser les dépenses associées à l'installation des boîtiers. On appelle ces résistances, ensemble de techniques et de pratiques, « ruses sur les réseaux », nous appuyant sur la conceptualisation de ruse développée par [START_REF] Détienne | Les Ruses de l'intelligence[END_REF] : un ensemble de stratagèmes ancrés dans la pratique quotidienne qui mêlent l'expertise au sens de l'opportunité et de la débrouillardise.

Ces ruses se déploient selon différents répertoires d'action [START_REF] Tilly | Stories, Identities, and Political Change[END_REF] des moyens d'agir sur la base d'intérêts partagés afin de « se faire entendre » sur des problématiques spécifiqueset peuvent se dérouler à des niveaux très différents. Certains de ces répertoires sont d'ordre juridiquenotamment entre les "très petits FAIs" et les agents du FSB (Bureau Fédéral de Sécurité) locauxou économiques, tels que les arrangements entre FAIs afin de partager les coûts de l'équipement SORM nécessaire à la surveillance. D'autres ruses se concentrent sur les usages créatifs de la technique, véritables bricolages [START_REF] Akrich | Les utilisateurs, acteurs de l'innovation[END_REF], tels que des scripts artisanaux, permettant d'économiser sur les solutions extérieures, et des actions directes relevant de l'hacking voir du « hacktivisme », telles que les usages détournés du système de noms de domaine qu'on a pu qualifier de « guérilla DNS » (selon l'expression employée par les acteurs).

Cet article propose de se concentrer sur ce dernier type de stratégie, relevant du bricolage numérique2 . On cherchera à souligner en quoi le hacking et le hacktivisme , ainsi que d'autres ruses comme la mise en place de sous-réseaux dédiés au contrôle, font partie intégrante de l'action des FAI, et à montrer comment les pratiques de ces acteurs relèvent de la « ruse » au sens de Détienne et Vernant (1974). Si les nombreuses études de l'histoire du RuNet se focalisent le plus souvent sur le rôle des "élites culturelles" ou économiques, on se concentre ici sur les acteurs techniques et leurs résistances au quotidien, ancrées dans la technique, aux dispositifs techno-juridiques d'administration des réseaux. Les petits et moyens FAI sont donc les principaux protagonistes de cette étude.

Cette enquête est menée depuis 2018 dans le cadre du projet ANR ResisTIC et en collaboration avec le Citizen Lab (Université de Toronto). Elle s'appuie sur les entretiens effectués avec des fournisseurs d'accès Internet russes, des fabricants de boîtiers intermédiaires, des juristes spécialisés en droit du numérique, des militants pour les "libertés d'Internet", mais aussi sur des observations lors des réunions informelles de FAIs et lors des conférences spécialisées à Saint-Pétersbourg. Notre terrain nous a amené à participer à plusieurs rencontres intitulées "Les Jeudis du Beering" en 2019 où des représentants des petits et moyens FAIs et des Internet Exchange Points (entre douze et quinze en moyenne) se réunissent pour discuter de façon semi-informelle les évolutions et péripéties de l'industrie. Les récits du quotidien des ingénieurs réseau ont été au centre de ces rencontres fermées, y compris le partage des savoir-faire et ruses face aux contraintes de la régulation. Nous avons également mené une analyse des forums spécialisés et des chats des FAIs sur Telegram, la messagerie la plus utilisée par les experts techniques russes. L'étude est ancrée dans une perspective qui puise à la fois dans la sociologie pragmatiste et les science and technology studies, ainsi que dans la sociologie des mouvements sociaux, de la participation et de l'activisme numérique (e.g. [START_REF] Milan | Social movements and their technologies: Wiring social change[END_REF].

La pomme de discorde : surveillance et censure "par l'infrastructure" dans le RuNet Avant l'introduction, en 2012, de la liste noire par RosKomNadzor (RKN, l'entité fédérale russe responsable des actions de restriction et censure sur les technologies de communication), l'échange entre les FAI et les régulateurs était sporadique : en juillet 2007, la « liste des ressources extrémistes » contenant alors 14 documents (livres, tractes, vidéos classifiées surtout de l'idéologie nationaliste ou islamiste) fut créée par le Ministère de la Justice. En mars 2008 le Procureur Général délégua la responsabilité de restreindre l'accès à ces sites aux hébergeurs et aux FAIs. A partir de 2008, les opérateurs ont effectivement commencé à recevoir, de temps en temps, des demandes de blocage de certains contenus numériques, et ils disposaient d'un délai de plusieurs jours pour leur donner suite. À cette période-là, les FAI avaient également une possibilité de contester ce genre de demandes en justice3 .

Pendant les premières années qui ont suivi la création de cette "liste noire", les fournisseurs d'accès n'ont pas été très nombreux à manifester leur mécontentement, selon nos différents entretiens. Les premières actions contestataires ont été entreprises surtout par les acteurs que Asmolov et Kolozaridi appellent les "élites culturelles" (2017), bien que par des moyens déjà ancrés dans la technique : ainsi, par exemple, le fondateur de la plus grande bibliothèque russe en ligne, Maksim Moshkov, répondit au blocage de son site par un « hack », en bloquant en retour le site du Ministère de Justice. Pour cela, il utilisa la méthode désormais connue sous le nom de « DNS guérilla » : il modifia les adresses IP associées au DNS de son site en adresses IP du site du Ministère4 .

Certains FAI avaient déjà riposté à l'introduction des listes noires en utilisant leurs pages de blocage en tant qu'espace d'expression critique [START_REF] Ermoshina | Migrating Servers, Elusive Users: Reconfigurations of the Russian Internet in the Post-Snowden Era[END_REF] (Figure 1).

Figure 1. Page conçue par le FAI "Tchélyabinskie Interaktivnye Kabelnye Seti". Le site "fastdie.kiev.ua", dédié au suicide et figurant sur la liste noire du RKN, renvoie l'usager sur une page de blocage avec la fameuse illustration issue du livre de George Orwell "1984"

Or, le mécontentement des FAI a grandi au fur et à mesure que les lois se sont multipliées, et que les modalités de contrôle de leurs activités se sont durcies et se sont concrétisées. Il faut préciser que, dans le cas russe, les rapports entre la "loi" et le "code" (au sens de Lessig, 1999) L'analyse des tchats professionnels montre l'usage de l'expression « barres obliques inversées » dans des contextes où les FAIs parlent des nouvelles mesures de régulation, comme métaphore de solution technique inefficace, voire, destructrice introduite par les agents du gouvernement.

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Les exemples cités par les FAI incluent des urls comme http://vse-soski.ru/category\\kurganskayaobl/vargashi/, http://ximikstyle.com/katalog\\metan/metanabol-ot-british-dragon/, http://www.alcomas.ru/katalog\\nujnoe.html, http://pro100farma.net\\stanozolol\\ et autres.

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RGGU signifie Université d'Etat des Sciences Humaines de Russie. Selon la législation, les universités publiques peuvent avoir l'obligation de passer par la procédure des achats publics afin de se procurer et d'installer l'équipement SORM. économiques, mais également pour des raisons techniques. Un FAI de la région de Saint-Pétersbourg remarque que « lorsqu'il y a beaucoup de petits FAI, c'est mieux pour la qualité de la connectivité. […] Puis c'est aussi bien pour les abonnés, car les plus gros FAI ne peuvent pas offrir de la bonne qualité de service technique aux abonnés. Le client doit toujours pouvoir choisir ».

Bricolages techniques, hacktivisme et ruses numériques

Face à cette situation, inédite jusqu'à il y a quelques années, la majorité des FAI reste « silencieuse » politiquement. Les formes de participation tenant du répertoire militant traditionnel, comme les manifestations de rue, ou même les débats avec les représentants du gouvernement [START_REF] Ermoshina | Au code, citoyens : la mise en technologies des problèmes publics, thèse de doctorat sous la direction de Cécile Méadel[END_REF], sont considérées comme beaucoup moins efficaces que des outils techniques offrant une possibilité d'agir sur un cas précis. Les « petites choses » qui ne marchent pas deviennent la base sur laquelle ces acteurs techniques se regroupent, et parviennent à dialoguer, à se mettre d'accord au cas par cas, à partager et construire, petit à petit, des répertoires de ruses techniques et des connaissances tacites leur permettant d'alléger leur sort et défendre leurs intérêts économiques.

C'est donc par la technique que prennent forme les « politisations » particulières des technologues et ingénieurs russes. En effet, les acteurs techniques, les FAI en tout premier lieu, introduisent des éléments de ruse et résistance dans leurs pratiques quotidiennes, dans l'architecture de leurs installations et réseaux mêmes. C'est leur expérience ordinaire en tant qu'opérateurs de télécommunications qui se voit modifiée en réponse à la régulation de plus en plus stricte, et face à cette situation, même les FAI les moins « politisés » sont amenés à se lancer dans des bricolages techniques souvent très ingénieux, afin de pouvoir contourner au quotidien les contraintes posées par les régulateurs. La résistance la plus créative et active ne se déploie donc pas tant dans les tribunaux, ni dans la rue : elle se déplace au niveau des agencements techniques des installations réseau ou même des bricolages au niveau des protocoles. La partie suivante du papier explore ce répertoire d'action et met en lumière son potentiel de « ruse numérique ».

Revizor et son « bac à sable »

En analysant les différentes formes de contournement des contraintes techniques (installation des boîtiers SORM et application de la censure), on a pu constater que les FAI appliquent leur « intelligence rusée » à ces endroits physiques et virtuels où le régulateur n'a pas tout prévu, en se fabriquant des marges de manoeuvre et d'action. Ce qui est considéré comme un manque d'expertise chez les régulateurs devient alors une source d'inspiration pour les opérateurs. Les résistances techniques se dessinent alors en fonction des caractéristiques techniques des dispositifs de contrôle. Par exemple, de nombreux opérateurs témoignent (dans les entretiens mais aussi dans les groupes de discussion spécialisés) d'une pratique répandue qui consiste à développer un réseau parallèle où se branche le système automatique de contrôle « Revizor » :

« Certains opérateurs appliquent la censure seulement dans un sous-réseau séparé, où ils installent le boîtier Revizor. Revizor consulte des pages web et pense que tout est bloqué, alors que pour leurs utilisateurs finaux il existe un autre réseau où il n'y a pas de censure, ou il y en a mais beaucoup moins » [Entretien avec le directeur de SkyDNS]

Ce sous-réseau est également appelé de façon ironique un « bac à sable »12 (pesotchnitsa). Revizor devient lui-même objet de nombreuses blagues. Le système est critiqué pour sa « stupidité », ses dysfonctionnements fréquents et erreurs récurrentes qui conduisent à des amendes injustifiées. Un groupe de discussion dédié, « J'aime l'AS Revizor » , a été créé dans Telegram (615 membres en mai 2019) où les FAI partagent leurs problèmes avec cet instrument. De plus, juste après son introduction en 2016, un ingénieur a fait une étude poussée de « reverse engineering » afin de montrer de quoi se compose cette « boîte noire » qui s'est avérée être un simple routeur TP-Link avec un logiciel. Cette analyse technique 13 avait comme objectif la critique à la fois technique et économique du marché des solutions régulatrices, le coût de cette solution très simple et peu efficace étant de 80 millions de roubles.

Une autre façon de contourner la censure au quotidien consiste à utiliser le protocole IPv6, faiblement adopté en Russie et où la censure ne s'applique pas encore de la même façon :

Utilisateur 1 : EN 2019 ipv6 peut vous protéger contre les blocages. Pas à 100 pour cent bien sûr, mais ça peut aider. Le "Ministère de la Vérité" 14 n'a pas encore entendu parler de ipv6 et pense qu'il n'existe pas.

Utilisateur 2 : Tous les FAI doivent implémenter ipv6 mais ne dire à Revizor que les adresses ipv4" (source : tchat Nag.Ru, 5 mai 2019).

Guérilla DNS

Les failles dans le système de blocage des sites web implémenté par RKN ont été explorées et exploitées dans le cadre de ce qui a été appelé « Guérilla DNS », pour la première fois en 2012 par Maksim Moshkov, puis en 2017 et 2018. Ce mode d'action exploite le mécanisme d'envoi automatisé de la "liste noire" aux opérateurs. La blacklist compilée par le RKN, qui compte à ce jour 32 267 URLs15 est mise à jour de façon automatique presque toutes les 10 minutes. Seul le « delta » (la différence entre l'ancienne et la nouvelle liste) est envoyée aux opérateurs ; les FAI doivent alors appliquer la nouvelle liste. Les noms de domaines de la liste noire sont associés à des adresses IP, parfois plusieurs adresses IP sont https://habr.com/ru/post/282087 14 "Ministère de la Vérité" -surnom ironique du RosKomNadzor inventé par les FAI, en référence au livre 1984 de George Orwell.

associées au même DNS. Toutes ces adresses sont automatiquement communiquées aux FAI qui doivent alors les bloquer. Il faut noter que de nombreux sites de la liste noire sont abandonnés depuis des années.

La « Guérilla DNS » consiste alors à racheter les noms de domaine "orphelins" et à modifier les adresses IP associées à ces noms de domaine, ce qui permet alors de bloquer des sites web stratégiques (comme les sites des banques ou ministères), voire, le site du RKN lui-même. Cette faille fut exploitée en 2017 : Revizor fut bloqué le 15 mai et entre le 4 et le 9 juin, une véritable campagne menée par plusieurs ingénieurs conduisit au blocage de ressources numériques importantes telles que OK.ru, VK.com, Rostelecom, RZD, RBC, Microsoft Office 365, AS Revizor, COMODO, badoo.com, booking.com, facebook.com, mail.ru, nic.ru, ntv.ru, pikabu.ru, reg.ru, nag.ru, sipnet.ru, skbkontur.ru, vasexperts.ru 16 , des serveurs racine DNS et d'autres sites.

Le RKN et le Ministère de la Communication ont alors réagi en urgence, en imposant aux opérateurs d'arrêter de bloquer quoi que ce soit, et en introduisant des "listes blanches" de ressources à ne jamais bloquer. À la veille de l'émission « Ligne Directe avec Vladimir Poutine » (un événement médiatique majeur de « rencontre en direct » entre le président et le peuple russes, qui s'est tenu en mai 2017), les régulateurs ont craint que les adresses IP utilisées par les installations de la transmission de la ligne ne soient bloquées de la même manière. Les auteurs de la « guérilla DNS » ont alors fui la Russie par précaution et se sont cachés pendant plusieurs semaines en Europe. Cette action a mené à un changement dans la régulation du RuNet, car elle a forcé RKN à changer les normes de fonctionnement de la liste noire et à prescrire des méthodes de blocage plus précises aux opérateurs.

La « performance hacktiviste » comme ruse : le code Morse de Leonid Evdokimov

Cependant, la faille a persisté. Et un an plus tard, le 6 mai 2018, Léonid Evdokimovdéveloppeur, mathématicien et hacker -l'exploita de nouveau afin d'organiser ce qui fut par la suite qualifié de performance hacktiviste, et qui était également une ruse de contournement très efficace. Evdokimov racheta plusieurs noms de domaine orphelins qui figuraient toujours dans la liste noire, et écrivit un script en Python qui lui permit de modifier de façon automatique les adresses IP associées à ces noms de domaine. Il parvint ainsi à écrire en code Morse la phrase "Digital Resistance 5, 4, 3, 2, 1, 0" sur le graphique des IP bloquées maintenu par le site Usher.Club dédié au monitoring et à l'analyse de la liste noire (Figure 2).

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Il est intéressant de remarquer que Vasexpert est un des fabricants les plus connus des boîtiers DPI et des solutions pour le filtrage de trafic et censure. Le choix du site de ce fabricant placé dans la même liste avec les sites du gouvernement et des institutions financières témoigne de l'intention des organisateurs de la guérilla DNS de critiquer les acteurs de l'industrie de censure et surveillance. « C'était tout d'abord pour rigoler, de façon dadaïste. J'ai été un peu inspiré par les trucs que j'ai vus sur le site Beautiful Trouble, qui répertorie des actions un peu créatives, artistiques. Et puis surtout c'était pour attirer l'attention sur le problème potentiel de ce système des listes noires énormes. J'ai déjà évoqué ça pendant mon intervention à la Douma ».

En effet, les failles qui permettent de saturer la liste noire par des milliers d'adresses IP peuvent conduire à des incidents majeurs sur les réseaux, car les boîtiers de filtrage de trafic (même les installations coûteuses de DPI) ont des limites de traitement. Le 14 mars 2018 un inconnu exploita cette même faille en produisant une panne des réseaux de l'un des plus gros opérateurs de Russie, TTK (Figure 3). Ce qui est particulièrement intéressant dans le cas de la « guérilla DNS », au-delà des façons créatives d'exploiter les failles dans les infrastructures de contrôle, c'est l'intention des acteurs, leur positionnement spécifique par rapport aux régulateurs. Il s'agit pour eux d'utiliser ces attaques non pas pour s'opposer au gouvernement, mais plutôt afin de provoquer des changements dans les façons de gouverner : attirer l'attention, de facto, sur la nécessité de revoir et affiner les lois et les mécanismes techniques en oeuvre. Si le RuNet doit être gouverné, il doit être gouverné par des expertset sans risque d'abîmer les réseaux : ainsi pourrait-on résumer la thèse que ces stratégies, mêlant à la fois prouesse technique et sens du spectacle, essaient de transmettre.

L'affaire Telegram et ses ruses D'autres types de ruses techniques se sont développées en réponse à la décision de bloquer Telegram, la messagerie la plus populaire parmi les opposants, journalistes et ingénieurs russes. Lorsque, le 16 avril 2018, le RKN ordonne le blocage de cet outil, une course-poursuite commença entre le régulateur et les résistants : l'équipe technique qui développait l'outil, les FAI qui s'opposaient au blocage, les nombreux administrateurs des services Proxy et VPN et autres enthousiastes techniques, qui déployèrent alors de nombreux protocoles et applications permettant de contourner les blocages. Une campagne fut lancée par le créateur de Telegram Pavel Durov, soutenue dans tout le pays, sous le nom de « Digital Resistance ». Celle-ci comprenait une variété d'actions hors ligne, des flashmobs ironiques (jeter en même temps dans toutes les villes de la Russie un avion en papier par la fenêtre en signe de contestation) aux manifestations de rue (la plus grande comptant douze mille personnes à Moscou), et incluait également un large volet de ruses techniques.

Par exemple, l'équipe Telegram intègre des solutions de contournement dans son code, comme le IPhopping 17 , qui consiste à changer d'IP toutes les x minutes et à le communiquer par des notifications push aux clients mobiles. Une autre technique largement employée fut le domain fronting, un mécanisme de contournement de la censure qui dissimule la véritable destination d'une connexion ; le mécanisme permet à un utilisateur de se connecter par HTTPS à un site interdit tout en paraissant communiquer avec un site différent, par exemple les serveurs cloud de google.com, software-download.microsoft.com, amazon.com et autres. Enfin, les mobilisations utilisaient des protocoles comme Obfuscated2 18 qui permettent de camoufler le protocole MTProto utilisé par Telegram.

L'usage des services intermédiaires, comme les plateformes des géants du Net -Google, Amazon, Microsoftpar Telegram eut un effet collatéral sur le fonctionnement du RuNet, connu maintenant sous le nom des « blocage en tapis de bombes » (kovrovaya bombardirovka). Ainsi, en une semaine seulement, 18 millions d'adresses IP furent bloquées ; parmi elles, des centaines de milliers d'adresses associées à des services tels que Google, AWS, Microsoft, Digital Ocean, et même le serveur NTP (Network Time Protocol). Cela a impliqué des dysfonctionnements chez de nombreux utilisateurs des services en ligne hébergés sur les mêmes IP.

Les « blocages en tapis de bombes » pendant l'affaire Telegram ont eu des effets, probablement inattendus, sur la société civile, dans la mesure où ils ont aidé à faire apparaître le problème de censure Internet en tant que problème public, qui touche non seulement les experts, ingénieurs, ou FAI, mais également des acteurs qui ne se sentaient pas concernés auparavant. Les blocages collatéraux ont produit des « nouveaux résistants », notamment parmi les petits entrepreneurs dont les entreprises en ligne étaient hébergées sur des serveurs cloud touchés accidentellement par les blocages Telegram. Thème auparavant réservé aux tchats des experts, les activités des régulateurs du RuNet sont devenues alors un sujet médiatique à destination de la société civile engagée. En ce sens, l'étude des effets de la régulation du RuNet sur la société civile russe permet de comprendre comment « certaines situations, qui ne sont pas d'emblée perçues comme 'politiques', sont susceptibles d'être recadrées dans ce sens » (Berger et al., 2011) grâce à un ensemble de stratégies guidées par l' « intelligence rusée » : des stratagèmes qui puisent dans la longue expérience d'un environnement à haute technicité, guidés par la curiosité et la volonté de subvertir par la technique propres du hacking, afin de maintenir ou reprendre la maîtrise sur un système auquel on tient et qu'on perçoit comme menacé.

Conclusion

Ainsi que le démontre Ermoshina (2019) dans le cas des « civic hackers » qui ont développé des plateformes pour signaler les défaillances voire la corruption des autorités locales (travaux de voirie), le mouvement d'hacking russe n'est pas homogène, et ne s'identifie pas seulement avec ses aspects plus « révolutionnaires » qui consistent à coder des systèmes complexes, à inventer de nouveaux langages de programmation ou à commettre des cyber-crimes. Alors que la figure de l'hacker russe est bien connue à l'international en lien avec des cyber-attaques, infiltrations et manipulations, d'autres formes d'hacking ont fait l'objet de cette enquête. Nos interlocuteurs se démarquent par ailleurs de la réputation des « Russian hackers » et, par ailleurs, de leurs collègues-ingénieurs qui travaillent pour le gouvernement.

Les pratiques d'hacking présentées dans cet article sont synonyme d'expérimentation, dans un sens proche de celui du mot français « bricolage » ; le terme russe smekalka le saisit également. Dérivé d'un ancien verbe, smekat' (« comprendre » ou, familièrement, « y arriver »), le smekalka est une qualité que les Russes revendiquent pour eux-mêmes, déjà présent dans les contes de fées comme pouvoir surnaturel pour trouver une solution rapidement, dans des endroits très contraints, lorsqu'on n'a pas d'outils ou de moyens adéquats et qu'on ne peut utiliser que ce qui est disponible. Les hackers sont ceux qui ont les compétences et l'inventivité -l'« intelligence rusée »de rapidement concevoir un nouveau moyen intelligent et peu coûteux pour mettre en lumière et contourner des formes de contrôle au moyen des technologies informatiques.

Les stratégies, ruses, smekalka qu'on a vues se déployer au cours de cet article s'inscrivent dans cette acception de « hacking » et de « hacktivisme », deux mots aux significations variées, comme le montrent bien les coordinateurs de ce numéro dans leur introduction. En réponse à une gouvernance du RuNet qui comporte de nombreuses zones grises mais qui est en même temps de plus en plus centralisée, les FAIs russes réagissent en développant des techniques de résistance. Cette étude s'est donnée pour objectif d'analyser ce répertoire de ruses, en se focalisant sur la dimension des bricolages techniques. En proposant une description analytique de ces nombreuses pratiques de contournement, nous avons cherché à comprendre comment les ingénieurs et les informaticiens russes deviennent acteurs, parfois malgré eux, de la gouvernance et d'une « contre-gouvernance » du RuNet. Suite à cette enquête, il est possible d'identifier un certain nombre d'éléments qui contribuent à tracer le portrait des acteurs techniques de l'Internet russe face aux évolutions de sa gouvernance.

En premier lieu, une grande majorité des FAI, notamment ceux qui sont actifs dans des associations et à l'occasion des débats en ligne, ne croient pas que la finalité politique est prédominante dans les lois les plus récentes qui visent à « brider » le RuNet. Pour ces FAI, c'est la finalité économique qui prime : il s'agit de reconfigurer les équilibres de marché du RuNet et avec eux, les équilibres de pouvoir (voir Ermoshina, Loveluck et Musiani, 2021). Par leurs stratégies de résistance et de ruse, les FAI se battent pour leur survie en tant qu'acteurs dans ce marché ; hormis les intérêts économiques, certains visent également à défendre une certaine vision nostalgique de l'âge d'or d'un RuNet libre et décentralisé.

Deuxièmement, on peut reconnaître une certaine logique du « care » (qu'on retrouve notamment dans les travaux STS concernant d'autres types d'infrastructures ; voir par exemple [START_REF] Denis | Material ordering and the care of things[END_REF] : par leurs ruses, les acteurs techniques du RuNet souhaitent défendre la qualité de la connectivité, et l'état des réseaux en général. Les régulateurs sont souvent appréhendés comme des entités qui, par incompétence, « abîment » l'Internet que les ingénieurs doivent alors « protéger ». Comme le dit le directeur de la Société de Protection de l'Internet, « l'incompétence, la corruption et l'inefficacité des régulateurs protègent le RuNet de la dégradation » au sens où, malgré le discours fort de la « souverainisation » du RuNet, et une panoplie de lois visant à le réguler, très peu est mis en application.

Enfin, l'analyse de ces ruses numériques et du contexte dans lequel elles se déploient amène à y voir plus clair sur les formes de politisation particulière de ces « publics experts » que sont les ingénieurs et les acteurs techniques de l'internet russe. Celles-ci incluent l'évitement de ce qui est explicitement politique [START_REF] Eliasoph | L'évitement du politique. Comment les Américains produisent l'apathie dans la vie quotidienne[END_REF], en faveur de la préoccupation et de l'investissement dans des cas concrets ; une opposition du politique « traditionnel » et du technologique, par des visions du type « on était bien avant que l'Etat n'intervienne… » ; et enfin, une vision du marché comme protecteur naturel de l'internet, estimant que les intérêts économiques des acteurs, y compris ceux des acteurs internationaux, peuvent défendre le RuNet mieux qu'une mobilisation de masse.

Les ruses quotidiennes sur l'internet russe -mises en oeuvre par des techniciens face à une gouvernance d'internet qui ressemble de plus en plus à du gouvernementont leur fondement dans tous ces éléments. Les intermédiaires techniques du RuNet préfèrent mettre en oeuvre leurs luttes pour les libertés en ligne via des pratiques de résistance invisible [START_REF] De Certeau | L'Invention du quotidien[END_REF], plutôt que par le biais d'une confrontation ouverte. La clé pour une « guerre de la gouvernance d'Internet » (DeNardis, 2014) efficace réside, pour ces acteurs, dans des pratiques cachées, partagées, distribuéesdans le tacit knowledge que permet la ruse et le contournement. Notre terrain révèle ainsi peut-être une nouvelle facette de l'hacking comme ruse. Si d'un côté il aide les acteurs techniques à continuer à exister sur le plan économiqueen se

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  Notre analyse est basée sur les données ouvertes de « goszakupki.ru », un site Web qui publie des procédures d'appel d'offres et des résultats pour les marchés publics. En utilisant le mot clé « SORM », nous avons analysé les achats entre 2016 et 2018. 10 Les coûts pour tout le secteur sont évalués à 4,5 trillions de roubles selon FSB et Ministère de Communication, et à 17,5 trillions selon l'Union des Industriels et Entrepreneurs de Russie [ https://www.rbc.ru/newspaper/2017/11/09/5a03187e9a7947d88f988f53]

Figure 2 .

 2 Figure 2. Une capture d'écran du Usher.Club. Action de Evdokimov "Digital Resistance", 6 mai 2018

Figure 3 .

 3 Figure 3. En rouge : pannes sur les réseaux TTK. Source : https://usher2.club/articles/ttk-strike/

  prennent une forme intéressante : notamment, les solutions techniques s'avèrent souvent être "en retard" par rapport à la régulation. Par exemple, même si les lois qui ordonnent le blocage du contenu web existent depuis 2012, les prescriptions précises quant aux modalités et formes de ce blocage n'ont été publiées qu'en mars 2018. Ainsi, pendant six ans, un certain "vide techno-juridique" a laissé les FAI dans le flou quant aux outils et méthodes nécessaires pour appliquer correctement la loi. dire, un pré-filtrage par l'opérateur qui revend le trafic à un plus petit FAI. Notre entretien avec le directeur de la Société de Défense d'Internet, ainsi que l'analyse du forum Nag.ru et du tchat homonyme sur Telegram, montrent que les plus petits fournisseurs d'accès perdent le plus souvent et sont les acteurs qui se trouvent le plus fréquemment à faire face aux amendes. En effet, la façon dont le blocage des sites web est implémenté en Russie comprend une liste noire centralisée compilée toutes les heures par RKN à partir de plusieurs sous-listes proposées par un ensemble d'institutions 5 . Chaque acteur peut, à son niveau, introduire des erreurs dans la liste. Un des cas les plus connus est représenté par lesdites « barres obliques inversées » ou « antislash », devenu, pour la communauté des petits et moyens FAIs, un qualificatif ironique de l'activité même de tout le RKN 6 . RKN avait introduit dans la liste noire plusieurs URL erronées contenant ces caractères, ce qui avait conduit à la pénalisation de certains FAI pour le non-blocage 7 . Un FAI de la région de Moscou (40 000+ abonnés) nous a parlé à ce propos du niveau de complication très élevé que représente désormais la gestion manuelle d'une liste noire de plus en plus longue et « bruyante ».Les FAI sont alors obligés d'assumer le coût d'installation de solutions techniques de plus en plus chères, ou bien de payer les amendes. L'analyse des achats publics entre 2016 et 2018 a montré que le coût des solutions pour interception légale (SORM) varient entre 105 mille roubles (RGGU 8 ) et 91 383 000 roubles (Rostelecom)9 . Pour les boîtiers ou solutions logicielles de filtrage de trafic, les prix peuvent aller jusqu'à 1 million de roubles. Tous les FAI interviewés remarquent alors des conséquences économiques très lourdes de cette régulation sur le marché, et certains parlent même de dépenses égales aux recettes annuelles Aussi variées que le Service Fédéral des Taxes, le Procureur Général, le Ministère de l'Intérieur, le Service Fédéral de Contrôle des Drogues et autres.

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De la même façon, l'industrie russe n'est toujours pas en mesure de proposer une solution suffisamment efficace pour mettre en oeuvre la loi Yarovaya, qui oblige les FAIs à stocker les métadonnées pendant 3 ans, et le trafic pendant 30 jours. La loi a même été modifiée à cause des difficultés techniques liées à sa mise en application. La certification des boîtiers pour interception légale "SORM" est également lente. SORM étant un objet techno-juridique distribué, qui se compose de commutateurs, serveurs, logiciels, de systèmes de stockage et d'un terminal d'accès à distance (situé au bureau local du FSB), son architecture même rend sa certification complexe puisqu'elle engage des acteurs nombreux et variés.

Ce vide techno-juridique produit à la fois des contraintes et des opportunités : il laisse des marges de manoeuvre aux FAI pour mettre en oeuvre des bricolages et des contournements. Il favorise l'apparition d'un marché florissant des fabricants de « boîtiers intermédiaires » pour la censure et la surveillance du trafic, mais place les FAI en situation de flou par rapport à la régulation, dans la mesure où ils risquent d'être pénalisés pour les usages incorrects des installations techniques. En l'absence de méthodes précises prescrites pour les blocages, de nombreux FAIs ont utilisé, pendant presque six ans, des scripts « faits maison » ; ou encore, ils ont adapté leurs installations existantes.

Cela a entraîné à son tour une réponse des régulateurs, qui ont cherché à contrôler l'efficacité de blocage des sites web de façon centralisée et automatisée, en introduisant en 2016 le système automatique Revizor. Cette solution, existant à la fois comme boîtier et logiciel, "imite" un utilisateur d'Internet en envoyant des requêtes vers des sites de la liste noire. Si les pages consultées ne s'avèrent pas être bloquées, les FAIs reçoivent un avertissement ou une amende qui peut varier entre 50 et 100 mille roubles. La responsabilité juridique pour un cas de non-blocage est cependant souvent difficile à établir, vu les arrangements entre des FAI de taille différente, et les pratiques de « filtrage upstream », c'est-à-L'automatisation du contrôle des FAI par RKN, ainsi que l'introduction de nouvelles lois qui, à leur tour, augmentent la taille de la liste noire des URL à bloquer, mettent les FAI dans une situation où il devient de plus en plus compliqué d'éviter l'installation d'une solution spécialisée (boîtier ou logiciel) pour le filtrage de trafic.

10

. Cela conduit à la diminution du nombre des FAI, à l'absorption des petits par les grands (par exemple Dom.ru, qui a racheté de nombreux petits FAI) et par conséquent à la centralisation du marché et à la consolidation de ses acteurs. Le directeur de SkyDNS parle des FAI qui comptent quelques milliers d'abonnés comme étant « candidat[s] à l'acquisition », ne pouvant pas couvrir la très importante augmentation de leurs dépenses.

Une autre conséquence concerne le prix des services pour les abonnés, en augmentation chez tous les FAI. Selon les données d'un sondage mené par la revue TelecomDaily auprès de 100 FAIs dans quinze villes russes (21 novembre 2018), 52 % prévoient une augmentation du prix des services Internet pour l'utilisateur final ; 29 % des FAIs envisagent une augmentation de plus de 10% 11 . Tous les FAI interviewés voient la centralisation du marché comme un facteur négatif, tout d'abord pour des raisons 5

Les expressions « multi-partisme » ou « multi-parties-prenantes » traduisent l'anglais multistakeholderism, vocable indiquant le principe selon lequel l'Internet est objet d'intérêt et d'action pour de nombreux acteurs aux alliances multiples et mouvantes. Ce principe a été identifié comme fondateur pour plusieurs institutions de gouvernance d'Internet, notamment l'Internet Governance Forum (IGF).

On rappellera ici la définition que Claude Lévi-Strauss (1962) fait de la « pensée sauvage » comme « bricoleuse » dans la mesure où elle est une science « du concret » qui construit du sens à partir de l'assemblage de parties de la matière sensible.

Entretien avec un FAI de la ville de Tambov, 2019.

https://tjournal.ru/46700-moshkov-minjust

L'augmentation a déjà commencé en 2018 (Rostelecom) ; https://telecomdaily.ru/news/2018/11/22/telecomdaily-operatory-obosnovali-povyshenie-tarifov-na-svyaz-na-10-ibolee

Un « bac à sable » (sandbox en anglais), en sécurité informatique, est un terme qui désigne un mécanisme utilisé pour améliorer la sécurité d'un logiciel et de pages web, d'habitude en créant un environnement isolé du reste du système. Pour un système d'exploitation, il diminue les risques lors de l'exécution d'un logiciel.

Données du 29 avril 2021, selon https://usher2.club/, le site dédié au monitoring et analyse de la blacklist, administré par Phil Kuline, un des résistants les plus actifs du RuNet.


Elsa Charifou

Jakub Sumbal

Zuzana Koledova

Han Li

Aurélie Chiche
email: aurelie.chiche@pasteur.fr

A Robust Mammary Organoid System to Model Lactation and Involution-like Processes

Keywords: Mammary gland organoid isolation and culture procedures Mouse, Mammary gland, 3D organoid, Ex vivo, Lactation, Involution

The mammary gland is a highly dynamic tissue that changes throughout reproductive life, including growth during puberty and repetitive cycles of pregnancy and involution. Mammary gland tumors represent the most common cancer diagnosed in women worldwide. Studying the regulatory mechanisms of mammary gland development is essential for understanding how dysregulation can lead to breast cancer initiation and progression. Three-dimensional (3D) mammary organoids offer many exciting possibilities for the study of tissue development and breast cancer. In the present protocol derived from Sumbal et al., we describe a straightforward 3D organoid system for the study of lactation and involution ex vivo. We use primary and passaged mouse mammary organoids stimulated with fibroblast growth factor 2 (FGF2) and prolactin to model the three cycles of mouse mammary gland lactation and involution processes. This 3D organoid model represents a valuable tool to study late postnatal mammary gland development and breast cancer, in particular postpartum-associated breast cancer.

[Background] The primary function of the mammary gland is to provide nutrition to newborns via milk production. The development of the mammary gland is a highly dynamic process that occurs mainly after birth and is regulated by several factors including hormones and growth factors [START_REF] Brisken | Alveolar and lactogenic differentiation[END_REF][START_REF] Sternlicht | Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis[END_REF]. During puberty, hormones and growth factors regulate ductal morphogenesis from a rudimentary embryonic ductal tree [START_REF] Brisken | Hormone action in the mammary gland[END_REF]. During each pregnancy, the mammary gland begins a new morphogenetic step initiated by hormonal stimulation, which is characterized by massive proliferation for epithelial expansion and alveolar development accompanied by adipocyte regression [START_REF] Brisken | Hormone action in the mammary gland[END_REF]. Importantly, prolactin signaling plays a crucial role in the terminal differentiation of luminal cells to enable milk production [START_REF] Ormandy | Null mutation of the prolactin receptor gene produces multiple reproductive defects in the mouse[END_REF]. At the end of lactation after weaning of the progeny, the mammary gland enters the involution stage characterized by programmed cell death, tissue remodeling, and redifferentiation of adipocytes [START_REF] Hughes | The spectrum of STAT functions in mammary gland development[END_REF][START_REF] Macias | Mammary gland development[END_REF][START_REF] Zwick | Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation[END_REF][START_REF] Jena | Molecular mechanism of mammary gland involution: An update[END_REF].

Histologically, the mammary gland is composed of a bilayered epithelium consisting of an inner layer of luminal cells (keratin 8+) and an outer layer of contractile basal cells (keratin 5+). Luminal cells are responsible for milk production during lactation, while basal cells aid milk ejection. The epithelium is surrounded by a stromal fat pad that comprises fibroblasts, nerves, vasculature, lymphatics, immune cells, adipocytes, and extracellular matrix (ECM) [START_REF] Richert | An atlas of mouse mammary gland development[END_REF].

Over the past decade, organoids of various tissues, such as stomach, colon, lung, and pancreas, have been developed [START_REF] Huch | Modeling mouse and human development using organoid cultures[END_REF], offering many exciting possibilities for the study of tissue development and disease. The organoid system is a powerful tool that combines the advantages of a 2D culture (easy manipulation, precise control of cell composition and microenvironment, live imaging) with the opportunity to study complex cell-cell and cell-ECM interactions in a more controlled ex vivo manner (Huch and Koo, 2015; Shamir and Ewald, 2015; Koledova, 2017; Artegiani and Clevers, 2018).

Several models have been developed to study the mechanisms of mammary branching morphogenesis in primary mammary epithelium using different protocols [START_REF] Ewald | Collective epithelial migration and cell rearrangements drive mammary branching morphogenesis[END_REF][START_REF] Huebner | Mammary epithelial tubes elongate through MAPK-dependent coordination of cell migration[END_REF][START_REF] Neumann | Coordination of Receptor Tyrosine Kinase Signaling and Interfacial Tension Dynamics Drives Radial Intercalation and Tube Elongation[END_REF], cell lines [START_REF] Xian | Pleiotropic effects of FGFR1 on cell proliferation, survival, and migration in a 3D mammary epithelial cell model[END_REF], sorted cells [START_REF] Jamieson | Derivation of a robust mouse mammary organoid system for studying tissue dynamics[END_REF][START_REF] Linnemann | Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells[END_REF], or induced pluripotent stem cells [START_REF] Qu | Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Mammary-like Organoids[END_REF]. However, an organoid system modeling key aspects of the late postnatal developmental stages of the mammary gland has remained challenging to establish.

Previously, there have been several attempts to model lactation in 3D culture: spheroids of a breast adenoma cell line were used to study copper secretion into milk [START_REF] Freestone | Copper and lactational hormones influence the CTR1 copper transporter in PMC42-LA mammary epithelial cell culture models[END_REF]; organoids of primary epithelium were shown to produce milk following the administration of a lactogenic stimulus [START_REF] Mroue | Asymmetric expression of connexins between luminal epithelial-and myoepithelial-cells is essential for contractile function of the mammary gland[END_REF][START_REF] Jamieson | Derivation of a robust mouse mammary organoid system for studying tissue dynamics[END_REF]; and co-culture of breast epithelium and pre-adipocyte cell lines was shown to initiate an involution-like process [START_REF] Campbell | A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution[END_REF]. However, in-depth characterization of milk production and involution or the proper bilayered architecture of mammary epithelium remained to be carried out.

Recently, we developed a model of lactation and involution of mammary epithelium based on organoids of primary mammary gland tissue cultured in 3D Matrigel ® (Sumbal et al., 2020b). Under lactogenic stimuli, primary organoids maintain long-term milk production, retain the contractile www.bio-protocol.org/e3996 a. Euthanize the donor mouse using an ethically approved method (e.g., cervical dislocation) and immediately proceed to mammary gland collection.

Notes:

i. Cervical dislocation is a common method for animal euthanasia and provides a fast and painless death. With this method, cell/tissue survival in culture is not altered if collected immediately.

ii. In the case of processing multiple mice, euthanize one animal and collect the glands e. Using surgical scissors, make the first incision in the skin at point A.

Note: Be careful to incise only the skin and not rupture the underlying peritoneum.

f. Continue to incise the skin cranially to the throat of the animal (see Figure 1A, from point A to point B). g. From this median line, use forceps to grasp the skin and cut toward each of the four paws (see Figure 1A, incise to join the middle line to points C, D, E or F, respectively). h. Using forceps and a cotton swab, gently separate the skin from the peritoneum on one side of the animal. Attach the skin to the dissection board with three pins (see Figure 1B, pins 5-7).

i. Repeat step 8 on the other side of the animal (see Figure 1B, pins 8-10). The mammary glands are now exposed. j. Identify the lymph node of the mammary gland #4 (a small dense structure, round in shape; see Figure 1B,surrounded). Remove the lymph node from both glands using forceps and scissors and discard. k. Proceed to the harvest of the mammary glands #3 and #4. Using curved forceps, grasp the mammary glands and gently separate them from the skin and other tissues with scissors.

Note: Carefully separate the mammary glands #3 (whitish and shiny) from the muscles (light brown ribbed structure) since this protocol does not prevent muscle contamination.

l. Place all the collected glands in the same sterile Petri dish containing cold PBS (approximately 3 ml, previously stored at 4°C) for washing prior to tissue processing. m. Properly dispose of the animal corpse and continue with mechanical and enzymatic dissociation of the mammary glands.

Mechanical and enzymatic dissociation

Reminder: Work inside a laminar flow hood to maintain aseptic conditions. a. Freshly prepare 10 ml dissociation solution for the four glands collected from one mouse, pass through a 0.2-μm filter, and pre-heat at 37°C. ii. From here on, pre-coat all the pipettes, tips, and tubes with 2.5% BSA solution. Prepare the BSA solution in a 50-ml tube and aspirate/remove from every consumable following coating; this will prevent stickiness and loss of organoids. The BSA solution can then be filtered, stored at 4°C, and re-used.

f. After incubation, resuspend the dissociated mammary glands by performing ten up-anddown motions with a 10-ml pipette. Centrifuge for 10 min at 400 × g. g. After centrifugation, handle the 50-ml tube carefully to prevent disturbance of the three separated layers (see Figure 1C). Keep the epithelial pellet intact and transfer the middle aqueous phase and the top fatty layer into a clean 15-ml tube.

h. Resuspend the epithelial pellet in 5 ml DMEM/F12 and set it aside.

i. Focus on the fatty and aqueous solutions in the 15-ml tube: resuspend by performing ten up-and-down motions with a 10-ml pipette. Centrifuge for 10 min at 400 × g. Note: This step allows recovery of epithelial fragments trapped in the fatty layer. j. Again, handle the 15-ml tube carefully to avoid disturbing the three separated layers.

Discard the fatty and aqueous layers. k. Take the 5 ml resuspended pellet from the 50-ml tube to resuspend the pellet in the 15-ml tube.

l. Wash the 50-ml tube with 5 ml DMEM/F12, pool with the suspension in the 15-ml tube, and mix. m. Centrifuge for 10 min at 400 × g. n. Discard the supernatant. Use 4 ml DMEM/F12 to resuspend the pellet. Subsequently, add 80 μl DNAse I at 100 μg/ml and agitate for 5 min by hand or on an orbital shaker at 100 rpm. o. Add 6 ml DMEM/F12 and resuspend the solution by performing 5 up-and-down motions with a 10-ml pipette. p. Centrifuge for 10 min at 400 × g. q. Discard the supernatant. Use 4 ml DMEM/F12 to resuspend the pellet. Subsequently, add 150 μl dispase II at 0.5 mg/ml and incubate for 5 min at 37°C. r. Add 6 ml DMEM/F12 and resuspend the solution by performing 5 up-and-down motions with a 10-ml pipette. w. Resuspend the final pellet in 1 ml basal organoid medium (BOM) and place on ice. The organoids are now ready to be counted and cultured.

Note: Adjust the volume of resuspension according to pellet size. From a pool of 2-3 mice, the final pellet was resuspended in 1 ml basal organoid medium, for an expected range of 3,000-6,000 organoids. Adjust the volume of BOM for resuspension of the pellet according to the number of mice pooled. d. Count the organoids under the microscope at 4× magnification (see Figure 1D).

Notes:

i. Take each quarter of the cross as a landmark to avoid double-counting of the same organoid.

ii. Organoids appear as rounded structures with a smooth perimeter. Occasionally and unavoidably, nerves and endothelium are also present. The nerves appear as rope-like structures and can be organized in bundles (see Figure 1D). The endothelium has a somewhat ragged look in comparison with the smooth-looking organoids. The minor presence of primary nerves and endothelium does not interfere with organoid lactation or involution.

iii. Count only the organoids with a diameter greater than 30-50 μm since the smaller ones may not develop properly. e. Calculate the average of the two counts in 10 μl solution and multiply according to the volume of BOM used to resuspend the pellet to obtain the total number of organoids.

Note: Freshly isolated organoids can be viably frozen in a solution of FBS containing 10%

DMSO for long-term storage in liquid nitrogen and later use.

B. 3D culture of mammary organoids 1. Embedding in Matrigel ®

Reminder: Work inside a laminar flow hood to maintain aseptic conditions. Wash the ice bucket and heating plate thoroughly with 70% EtOH prior to placement in the laminar flow hood.

ii. Keep in mind that Matrigel ® thawing takes time; therefore, begin thawing prior to the procedure (2 h for a 1-ml aliquot, 6 h for a 10-ml bottle).

b. Place a 24-well plate on ice. Calculate the number of wells needed and spread 20-μl Matrigel ® in a round patch on the bottom of each well.

Note: Start by placing the tip containing Matrigel ® at the center of a well and expand circularly towards the edges of the well, without touching them. c. Incubate the 24-well plate in a cell incubator (5% CO2) for 15 min at 37°C. d. In the meantime, pre-heat a heating plate to 37°C. e. Prepare the organoid suspension in the Matrigel ® : calculate the volume of organoid suspension required to obtain the desired number of organoids. Pipette this volume of suspension into a fresh 1.5-ml tube and centrifuge for 3 min at 400 × g. Note: Adjust the number of organoids per well depending on the type of experiment: 200 organoids per well for morphology and histology, 400 for gene expression, and 1000 for western blotting analysis.

f. Carefully remove the supernatant and place the tube on ice. Subsequently, carefully resuspend the pellet in the required volume of cold Matrigel ® (50 μl per well), avoiding bubble formation. Keep on ice.

g. Remove the 24-well plate from the cell incubator and place on the 37°C heating plate. h. In each Matrigel ® -precoated well, cautiously seed the suspension of organoids (in Matrigel ® ) as a dome on top of the solidified Matrigel ® patch.

i. Place the 24-well plate back in the cell incubator (5% CO2) for 30 min at 37°C to solidify the Matrigel ® (see Figure 1D). j. In the meantime, pre-warm BOM at 37°C. k. Following incubation, carefully add 1 ml pre-heated BOM to each well and culture in the cell incubator at 37°C, 5% CO2.

Notes:

i. Add medium against the edges of the well to avoid disruption of the dome.

ii. Characterization of the organoids can be performed using regular histological stains (e.g., hematoxylin & eosin) or immunostaining on day 1 post-recovery in BOM (see

Figure 1E and Step B2 of the procedure).

Morphogenesis with FGF2

Reminder: Work inside a laminar flow hood to maintain aseptic conditions. Note: Overnight recovery is optimal for organoid culture; however, FGF2 treatment can be administered immediately after plating the organoids. c. Renew all medium with BOM every two days, for a total of 8 days of treatment.

Replating

Note: Use tips pre-coated with 2.5% BSA.

a. Aspirate the supernatant and wash the wells twice with 800 μl cold PBS. b. Add 1 ml cold PBS and disrupt the Matrigel ® dome using an up-and-down motion with a P1000 pipette. c. Check for successful disintegration of the Matrigel ® under a microscope. d. Transfer the suspension to a 15-ml tube and add cold PBS to a total volume of 10 ml. e. Centrifuge for 3 min at 400 × g. f. Carefully remove the supernatant, resuspend the organoid pellet in fresh Matrigel ® and plate as described in B1.

C. Organoid processing for further analysis

Note: We suggest carefully following organoid development under the microscope before renewing the media. Morphogenesis with FGF2 should induce branching after 3-4 days of treatment, while organoids in culture with BOM only, as the negative control, should remain round. Lactogenic differentiation can be confirmed by analysis of Csn2 mRNA using qPCR, comparing organoids before and after prolactin treatment (d6 versus d10). The involution process can also be confirmed using qPCR by detecting decreased expression of Csn2 mRNA following prolactin withdrawal (d10 f. Vortex the samples, cool on ice, and repeat the sonication according to Step C2e. g. Centrifuge for 20 min at >10,000 × g, 4°C.

h. Transfer the supernatant to a clean 1.5-ml tube.

i. Measure the protein concentration using a Coomassie Protein Assay Kit. ii. The fixed cultures can be stored in PBS at 4°C until embedding. c. Prepare 3% low gelling temperature agarose in PBS and melt slowly in a microwave for 1.5-2 min at 1000 W (homogenize every 30 s by hand rotation). d. Detach the fixed culture using the flat side of a spatula and transfer to a plastic histology mold containing melted agarose. Overlay with more agarose. e. After solidification of the agarose, unmold the block. Use a scalpel to remove the excess agarose surrounding the Matrigel ® dome and place in a plastic embedding cassette for histology.

Fixation and embedding for histology

f. Proceed to sample dehydration: incubate the embedding cassettes in successive 1-h baths of 70% EtOH, 95% EtOH, 100% EtOH (twice), xylene (twice), 50% xylene-50% melted paraffin, and 100% melted paraffin. g. Incubate overnight at 65°C in a second bath of 100% melted paraffin. h. Embed in a histology tissue mold using an embedding workstation.

i. Unmold the paraffin blocks after 24 h of solidification.

Morphogenesis medium

Note: This solution is prepared inside a laminar flow hood under aseptic conditions and does not need to be filter-sterilized.

nM FGF2 in BOM

Lactation medium

Note: This solution is prepared inside a laminar flow hood under aseptic conditions and does not need to be filter-sterilized.

1 μg/ml prolactin 1 μg/ml hydrocortisone in BOM 6. 4% PFA Note: This solution is prepared inside a chemical hood and does not need to be filter-sterilized.

4% paraformaldehyde in PBS

RNA lysis buffer

Note: This solution is prepared inside a chemical hood and does not need to be filter-sterilized. 10 μl β-mercaptoethanol per 1 ml RLT lysis buffer (from the RNeasy Micro Kit; this solution can be stored for up to one month at room temperature).

Phosphatase inhibitor cocktail II

Note: This solution is prepared inside a chemical hood or on a bench and does not need to be filter-sterilized.

Bio-protocol 11

 11 (08): e3996. DOI:10.21769/BioProtoc.3996 Please cite this article as: Charifou et al., (2021). A Robust Mammary Organoid System to Model Lactation and Involution-like Processes. Bioprotocol 11(8): e3996. DOI: 10.21769/BioProtoc.3996. 10. Incubator for cell culture, 37°C, 5% CO2 (e.g., Thermo Scientific, model: HERAcell 150i) 11. Heating plate at 37°C (e.g., Techne DRI-Block DB-2A) 12. Microscope and camera (e.g., Olympus model: CKX41) 13. NanoDrop™ (e.g., Implen Nanophotomoter NP80) 14. Sonicator (e.g., Diagenode Bioruptor Pico) 15. Incubator at 65°C (e.g., Memmert Incubator I) 16. Embedding workstation (e.g., Leica EG1150C) Procedure A. Isolation of mammary primary organoids 1. Dissection of a virgin mouse to harvest mammary glands (see Video 1). Video 1. Mammary gland harvesting. This video was made at Pasteur Institute. according to guidelines from the regulations of Institut Pasteur Animal Care Committees (CETEA). on Animal Care and approved by the French legislation in compliance with European Communities Council Directives (A 75-15-01-3).

  Figure 1A, pins 1-4). d. Using forceps, tightly grasp the skin of the lower part of the abdomen at half the width (see Figure 1A, point A).

  Note: Do not exceed the maximum 30 ml dissociation solution in a 50-ml tube to ensure correct dissociation.b. Transfer the freshly collected mammary glands to a new sterile Petri dish. c. Use three scalpels to finely chop the mammary glands and obtain a homogeneous mince of 1-mm 3 mammary fragments (see Figure1C).

  d. Transfer the mince to a 50-ml tube containing the pre-warmed dissociation solution.e. Place the tube in a shaking incubator for 30 min at 37°C, 100 rpm. www.bio-protocol.org/e3996 Bio-protocol 11(08): e3996. DOI:10.21769/BioProtoc.3996 Please cite this article as: Charifou et al., (2021). A Robust Mammary Organoid System to Model Lactation and Involution-like Processes. Bioprotocol 11(8): e3996. DOI: 10.21769/BioProtoc.3996. Notes: i. All the following steps are performed at room temperature except incubation with dispase.

  s. Centrifuge for 10 min at 400 × g. t. Discard the supernatant. Resuspend the pellet in 9 ml DMEM/F12. u. Perform differential centrifugation to separate the mammary epithelium from the stromal fraction: centrifuge the suspension for 15 s at room temperature, 400 × g. Discard the supernatant containing the stromal fraction and resuspend the epithelial pellet in 9 ml DMEM/F12. www.bio-protocol.org/e3996 Bio-protocol 11(08): e3996. DOI:10.21769/BioProtoc.3996 Please cite this article as: Charifou et al., (2021). A Robust Mammary Organoid System to Model Lactation and Involution-like Processes. Bioprotocol 11(8): e3996. DOI: 10.21769/BioProtoc.3996. Note: Set the time on the centrifuge to 1 min. Once a speed of 400 × g is reached, time 15 s precisely and stop the centrifuge manually. v. Repeat the previous step (t) 4 times, for a total of 5 differential centrifugations, to efficiently remove stromal contamination.

Figure 1 .

 1 Figure 1. Key steps of mammary gland collection for organoid isolation and 3D culture. A,B. Images of mouse dissection to access the mammary gland. A. Needles 1-4 represent the points at which to pin the mouse. Needles 5-7 and 8-10 represent the points at which to pin the skin of the mouse. Letters A-F with the blue dotted lines indicate the cuts. B. Green dotted lines denote the mammary gland. The lymph node is denoted in red and must be removed. C. Mammary gland before (left panel) and after (middle panel) mincing with a scalpel. Mammary organoids after transfer to dissociation medium (right panel). D. Example of mammary organoid counting. Left panel: organoids are surrounded by dotted lines. Star represents nerves. Right panel: organoids after embedding in Matrigel ® . Arrow represents the edge of the Matrigel ® dome. Scale bar = 500 μm. E. Freshly isolated primary organoid. Left panel: image of a mammary

  a. Thaw the Matrigel ® on ice or at 4°C.Notes:i. Matrigel ® solidifies really fast at room temperature. Always keep it on ice before use and during the plating procedure. www.bio-protocol.org/e3996 Bio-protocol 11(08): e3996. DOI:10.21769/BioProtoc.3996 Please cite this article as: Charifou et al., (2021). A Robust Mammary Organoid System to Model Lactation and Involution-like Processes. Bioprotocol 11(8): e3996. DOI: 10.21769/BioProtoc.3996.

3 . 4 .

 34 a. Pre-heat the BOM at 37°C. b. Add fresh FGF2 at a final concentration of 2.5 nM to pre-heated BOM to obtain the morphogenesis medium. c. Aspirate the medium from the wells without touching the Matrigel ® dome and replace with www.bio-protocol.org/e3996 Bio-protocol 11(08): e3996. DOI:10.21769/BioProtoc.3996 Please cite this article as: Charifou et al., (2021). A Robust Mammary Organoid System to Model Lactation and Involution-like Processes. Bioprotocol 11(8): e3996. DOI: 10.21769/BioProtoc.3996. d. Renew all medium with fresh morphogenesis medium every 3 days, for a total of 6 days of treatment. Lactogenic differentiation with prolactin a. Pre-heat the BOM at 37°C. b. Add 1 μg/ml prolactin and 1 μg/ml hydrocortisone to the pre-heated BOM to obtain the lactation medium. c. Aspirate the medium from the wells without touching the Matrigel ® dome and replace with 800 μl fresh lactation medium. d. Renew all medium with fresh lactation medium every two days, for a total of 4 days of treatment. Myoepithelial cell contraction with oxytocin a. Prepare fresh lactation medium, filter, and pre-heat at 37°C. b. Add 40 μg/ml recombinant oxytocin to the lactation medium. c. Aspirate the medium from the wells without touching the Matrigel ® dome and replace with 800 μl fresh lactation medium supplemented with oxytocin. d. Using live cell imaging, record contraction images every second for 120 s.

5 .

 5 Mimicking involution by hormonal withdrawal a. Pre-heat the BOM at 37°C. b. Aspirate the medium from the wells without touching the Matrigel ® dome and replace with 800 μl fresh BOM.

  Figure 2B and Figure3B).

Figure 2 .

 2 Figure 2. Modeling lactation and involution-like processes in primary mammary organoids. A. Scheme depicting the experimental design. B. Morphology of primary mammary organoids during lactation and involution-like processes. Bright-field images of organoid morphology following morphogenic and lactogenic stimulation and on days 4 or 8 after hormonal withdrawal. Scale bar = 100 μm.

Figure 3 .

 3 Figure 3. Passage of involution-like organoids. A. Scheme depicting the experimental design. PRL: Prolactin; BOM: basal organoid medium. B. Morphology of passaged organoids during the lactation and involution-like processes. Brightfield images of passage 1 (upper panel) and passage 2 (lower panel) organoids following morphogenic and lactogenic stimulation and on days 4 or 8 after hormonal withdrawal. Scale bar = 100 μm.

  a. Aspirate the culture medium and rinse the culture twice with 800 μl cold PBS. www.bio-protocol.org/e3996 Bio-protocol 11(08): e3996. DOI:10.21769/BioProtoc.3996 Please cite this article as: Charifou et al., (2021). A Robust Mammary Organoid System to Model Lactation and Involution-like Processes. Bioprotocol 11(8): e3996. DOI: 10.21769/BioProtoc.3996. b. Incubate with 800 μl 4% PFA for 30 min. Following removal of the 4% PFA, wash twice with PBS. Notes: i. Domes should be entirely covered with the solution. Add a greater volume if required.

j. Cut 5 -

 5 μm sections and spread on microscope slides. Keep the slides at room temperature until further analysis. k. Remove the paraffin prior to any staining by successive 5-min baths of xylene (twice), 100% EtOH (twice), 95% EtOH, 70% EtOH, and H2O.Recipes1. Dissociation solutionNote: This solution is prepared inside a laminar flow hood under aseptic conditions and does not need to be filter-sterilized.Note: This solution can be filter-sterilized and reused several times when stored at 4°C.

2 .

 2 5% BSA in PBS 3. Basal organoid medium (BOM) www.bio-protocol.org/e3996 Bio-protocol 11(08): e3996. DOI:10.21769/BioProtoc.3996 Please cite this article as: Charifou et al., (2021). A Robust Mammary Organoid System to Model Lactation and Involution-like Processes. Bioprotocol 11(8): e3996. DOI: 10.21769/BioProtoc.3996. Note: This solution is prepared inside a laminar flow hood under aseptic conditions and does not need to be filter-sterilized. 1× insulin-transferrin-selenium (ITS) 100 U/ml penicillin 100 μg/ml streptomycin 2 mM glutamine in DMEM/F12

9 .

 9 Protease inhibitor cocktail I Note: This solution is prepared inside a chemical hood or on a bench and does not need to be filter-sterilized. 500 μM AEBSF hydrochloride 150 nM aprotinin 1 μM protease inhibitor E-64 www.bio-protocol.org/e3996 Bio-protocol 11(08): e3996. DOI:10.21769/BioProtoc.3996 Please cite this article as: Charifou et al., (2021). A Robust Mammary Organoid System to Model Lactation and Involution-like Processes. Bioprotocol 11(8): e3996. DOI: 10.21769/BioProtoc.3996. 0.5 mM EDTA 1 μM leupeptin hemisulfate in RIPA buffer

Acknowledgments

Work in the laboratory of HL is funded by the Pasteur, Centre National pour la Recherche the Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-LABX-73 and ANR-16-CE13-0017-01), Fondation ARC (PJA 20161205028 and 20181208231), Programme Barrande, and AFM-Telethon Foundation. AC was funded by postdoctoral fellowships from the Revive Consortium. EC was funded by a Ph.D. fellowship from Sorbonne Université. ZK was funded by the Grant Agency of Masaryk University (MUNI/G/1446/2018), Mobility grant by Ministry of Education, and Youth and Sports, and by funds from the Faculty of Medicine MU to the junior researcher (ROZV/28/LF/2020). JS was funded by the P-Pool (Faculty of Medicine MU) and the Grant Agency of Masaryk University (MUNI/A/1565/2018). This protocol was derived from the original research paper "Primary Mammary Organoid Model of Lactation and Involution" (Sumbal et al., 2020b).

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Ethics

The animal study was reviewed and approved by French legislation in compliance with European Communities Council Directives (A 75-15-01-3) and the regulations of the Institut Pasteur Animal Care Committees (CETEA).