Philippe Silar

Marguerite Picard

Professeure De

Génétique : Concepts de Base et Notions Approfondies

Merci à Stéphan d'avoir été patient pendant que je rédigeais ce livre, souvent le matin très tôt ou le weekend ! Un grand merci à Geneviève Gonzy-Treboul pour m'avoir laissé l'utilisation libre de son cours.

Préambule

La génétique occupe une place importante dans notre société. De fait, les médias relaient souvent des découvertes "génétiques" et débattent sur leurs conséquences potentiellement néfastes pour notre vie quotidienne (clonage, OGM, résistance aux antibiotiques ou prions pour citer les plus célèbres). Au contraire, la détermination de la séquence complète du génome humain et celles d'autres organismes a encouragé certains à un optimisme sans borne et à clamer la compréhension complète du vivant via la connaissance de la séquence de leur génome (et donc la possibilité de soigner rapidement toutes nos maladies…). L'arrivée des nouvelles technologies de séquençage à haut débit n'a fait que renforcer cette idée: il serait maintenant possible de savoir qui nous sommes et quel sera notre santé future pour environ 500 €, le coût actuel (toujours en décroissance) du séquençage d'un génome humain. Même si les optimistes ont partiellement raison (la génétique a effectivement permis d'identifier un grand nombre de déterminants génétique de maladies), la séquence du génome ne permet de tout expliquer, comme l'a montré l'épigénétique. De plus, ces débats masquent la réalité de la recherche en biologie et le rôle qu'a eu et a toujours la génétique. En effet, il ne faut pas oublier que la génétique est, avec la biochimie, la discipline biologique qui a permis de comprendre comment fonctionne le vivant et son efficacité fait qu'elle est encore largement utilisée dans les laboratoires de recherche.

Si la biochimie s'intéresse principalement à la structure et aux propriétés des molécules biologiques, la génétique s'intéresse à replacer ces même molécules dans le contexte de la cellule, de l'organisme ou des populations. Il va sans dire que seule la jonction des deux disciplines permet une description complète des mécanismes du vivant. C'est vers cette synthèse que la biologie se dirige actuellement, synthèse réalisée par le biais de disciplines qui portent des noms différents (biologie moléculaire, génétique moléculaire ou génomique) mais qui sur le fond utilisent les mêmes méthodes. Il est donc impératif que tout étudiant de biologie/biochimie du niveau de la licence possède des solides notions de cette biologie intégrée afin de comprendre clairement les résultats, les enjeux et les limites de la biologie moderne. 10 Par le biais de ce cours, j'ai donc voulu donner aux étudiants de licence des bases solides sur l'historique, la "philosophie" et la méthodologie génétique. Ce cours a été conçu dans l'optique que des étudiants venant d'horizons différents, ayant ou n'ayant pas eu au préalable des notions de génétique, puissent le suivre facilement. Néanmoins, ce cours ne pourra être bien compris que si certaines notions scientifiques de bases ont été acquises.

Liste des notions pré-requises de ce cours

Introduction générale

De nos jours, tout le monde sait qu'il est impossible de faire se reproduire ensemble un chien et un chat (notez que dans l'antiquité de tels croisements monstrueux étaient fréquemment évoqués !).

Chiens et chats font partie de deux espèces différentes. Cette notion est en fait plutôt récente et la définition d'une espèce, en tant que groupe d'organismes inter fertiles produisant des descendants fertiles, a été défendue par le naturaliste français Buffon (1707Buffon ( -1788)). Même de nos jours, cette notion de l'espèce n'est pas encore complètement établie et il existe des cas où elle est matière à débat (par exemple : qu'est-ce qu'une espèce de bactérie?).

De même nous savons qu'un couple de chats engendre uniquement des chats et un couple de chiens uniquement des chiens. A chaque espèce sont associés des "caractères particuliers" qui se conservent au cours de la reproduction engagée par deux individus de la même espèce. Mais, nous savons qu'à l'intérieur d'une espèce, il existe différents caractères. Cependant, on observe aussi dans certains cas la transmission d'une génération à l'autre de ces caractères plus subtils. Citons :

• coloration du pelage des chats siamois

• teneur en amidon du pois lui donnant un aspect lisse ou rugueux

• chez l'homme, la morphologie jusque dans ses plus fins détails comme l'existence de vrais jumeaux, difficilement distinguables même par leurs proches, le montrent Conclusion : Au cours de la reproduction, les parents transmettent à leur descendance une information qui permet la "construction de l'individu". Il y a une transmission quasi à l'identique de cette information : la transmission est donc en très grande partie INVARIANTE. Pour une espèce donnée, l'information est quasi constante, elle présente néanmoins des petites VARIATIONS d'un individu à l'autre. On définit la génétique comme la science qui a pour but d'étudier cette information.

Il existe deux aspects distincts à la génétique :

• l'étude du mode de transmission de cette information (aspect formel)

• l'étude de la nature de cette information et de la façon dont elle s'exprime (aspect moléculaire) 16 C'est le premier aspect qui se base sur l'analyse de croisements dirigés qui sont la caractéristique la plus connue de la génétique (rappelez-vous vos cours de lycée !). Outre cet aspect fondamental, la génétique a aussi offert à la Biologie une méthodologie très puissante pour résoudre certains problèmes, en particulier ceux qui traitent de la fonction des macromolécules biologiques.

Rappels Biologiques

Avant de rentrer plus avant dans l'analyse génétique, nous allons avoir besoin d'un certain nombre de rappels biologiques. En effet, comment discuter la transmission de l'information au cours de générations, si l'on ne connaît les mécanismes biologiques qui opèrent au cours de la reproduction ! Rappelons d'abord que :

Tout organisme est constitué de cellules : Les premières cellules ont été décrites par Robert Hooke en 1665 (figure 1). La théorie actuelle a été formulée par Mathias-Jacob Schleiden et Théodore Schwann en 1837-1839 (figure 2). 3: en l'absence de stérilisation (pas de chauffage), Pasteur observe une putréfaction (ou fermentation) avec une apparition de microorganismes. Après une stérilisation par chauffage, Pasteur n'observe pas de putréfaction. Par contre après cassure du tube de verre et exposition de la matière à l'air, les microorganismes apparaissent entraînant la putréfaction. L'explication qu'il donne est la suivante: les particules présentes dans l'air se déposent dans le tube avant d'avoir atteint la matière. Si celle-ci est stérile, il n'y a pas de putréfaction. La cassure du tube permet à ces germes d'atteindre la matière et de démarrer le processus. Notez que dans cette expérience de l'air "non altéré" passe sans problème dans la fiole à tout moment, il n'y a donc pas altération de "principe de l'air" qui empêcherait l'apparition spontanée de cellules. Cette expérience prouve qu'il y a besoin de germes pour initier la putréfaction et donc que la génération spontanée n'existe pas.

Toute cellule naît d'une cellule : La génération spontanée des "gros organismes" a été abandonnée grâce à Francesco Redi (1626-1694), même si Buffon la défend encore un siècle plus tard. En effet, avant cette époque, on faisait naître des souris de tas de grains et des "vers" de la putréfaction. L'expérience de Redi montre que si on met de la viande dans une fiole bouchée par de la gaze fine, il n'apparaît jamais de vers. Le problème est plus complexe pour les organismes microscopiques et il faut attendre Louis Pasteur (1860) pour que la question soit définitivement tranchée (figure 3).

Conclusion

Les cellules procaryotes

On les regroupe souvent sous le terme générique de "bactéries". Il en existe en fait deux grands groupes, les vraies bactéries (appelées parfois eubactéries, maintenant le plus souvent simplement bactéries) et les archées, qui ont des fonctionnements différents au niveau moléculaire. Cependant, les cellules des deux groupes possèdent une organisation similaire (figure 4).

Structure:

• Ces cellules sont généralement de petite taille (attention, il existe des exceptions !)

• Leur structure est très simple, le plus souvent sans cytosquelette ni réseau de membrane interne: la production d'énergie n'est pas compartimentée, elle se produit au niveau de la membrane plasmique. Autour de la cellule, on note la présence d'une enveloppe complexe. Dans le cytoplasme, il y a présence des ribosomes et d'une masse "plus claire", le nucléoïde qui contient l'ADN. Attention le nucléoïde n'est pas un noyau car il n'est pas entouré par une membrane. Il existe de ce fait un couplage entre transcription et traduction. L'ADN est présent sous forme d'un ou quelques chromosomes, le plus souvent circulaire(s), mais pas toujours.

• Ces bactéries n'ont pas de processus d'endocytose et "n'ingèrent" donc que des molécules solubles qui pénètrent à l'intérieur de la cellule via les transporteurs membranaires.

• Elles ne forment jamais d'organismes pluricellulaires complexes, mais néanmoins les cellules sont capables de se différencier pour former des spores ou des colonies contenant des cellules de morphologies différentes.

• Leur unité de structure cache une grande complexité de métabolisme et de fonctionnement au niveau moléculaire. Ceci entraîne une diversité biologique très importante. Les procaryotes ont ainsi pu coloniser quasiment tous les milieux : des plus froids (mers polaires à la limite de la congélation) aux plus chauds (sources thermales à plus de 120°C), sous la croûte terrestre ou à l'intérieur du corps humain.

Division

• Elles se divisent simplement par fission binaire, en général pour donner deux cellules identiques. Il n'y a pas d'individualisation de chromosomes visibles en cytologie à aucun moment de leur cycle de vie. Attention, le processus de division est cependant hautement contrôlé par des structures particulières; la petitesse des cellules empêche leur visualisation facile avec un microscope optique.

• Il n'existe pas de reproduction sexuée au sens usuel du terme. Il est cependant possible pour des cellules procaryotes d'échanger de l'ADN grâce aux phénomènes de conjugaison, de transduction et de transformation.

Les cellules eucaryotes

Cet ensemble regroupe une variété de cellules présentant des organisations plus ou moins complexes.

Cependant, elles ont toute la caractéristique d'avoir un noyau, composé d'une double membrane entourant l'ADN. Celui-ci présente une organisation complexe (figure 5).

Philippe Silar

Génétique : Concepts de Base et Notions Approfondies 20 Structure:

• Le plus souvent, outre le noyau, elles présentent une structure interne complexe avec un cytosquelette vrai (microtubules, filaments d'actine etc.) et un système de membranes délimitant de nombreuses organelles (réticulum associé au noyau, appareil de Golgi, mitochondrie, lysosome / vacuole, peroxysome, etc.). De plus, chez de nombreux protistes et chez les plantes, des plastes assurent la photosynthèse. Il y a donc une compartimentation de la production d'énergie dans les mitochondries et les plastes, et des réactions enzymatiques (faites dans le cytosol, les peroxysomes, les lysosomes, etc.).

La présence du noyau, caractéristique des eucaryotes, entraîne un découplage entre transcription et traduction. Ceci permet des niveaux de régulation supplémentaires par rapport aux procaryotes.

Division:

Leur processus de division est complexe ce qui résulte en une transmission plus complexe de l'information génétique au cours des générations. Il en existe deux types : les mitoses et les méioses.

La mitose

C'est la division la plus courante pour les cellules eucaryotes, aussi bien chez les unicellulaires que chez les pluricellulaires. Sa découverte ainsi que la généralisation de sa présence chez tous les eucaryotes se sont faites progressivement au XVIIème et XIXème siècles, le terme de mitose ayant été utilisé pour la première fois en 1882 par Walther Fleming.

Je rappelle que toutes les cellules d'un organisme pluricellulaire sont issues par mitose d'une cellule unique (l'oeuf chez les animaux, l'ovule fécondée à l'origine de la graine chez les plantes et la spore chez les champignons). Elles constituent un clone (note : ce terme s'applique aussi aux cellules procaryotes issues d'une même cellule initiale: une colonie bactérienne est un clone). La mitose est une étape du cycle cellulaire : celui-ci se décompose comme indiqué dans la figure 6.

Classiquement, quatre phases sont définies: S: phase de synthèse. C'est à ce moment que l'information est dupliquée (= réplication de l'ADN !) Figure 10: une méiose typique commence par une première division (Méiose I) qui voit lors de la prophase I la condensation des chromosomes (étape du leptotène), suivie de leur association en bivalents: c'est à dire que les chromosomes "homologues" vont s'associer dans un premier temps grâce à un complexe protéique: le complexe synaptonémal (étape du zygotène). L'association est suivie de recombinaison entre les chromatides des deux chromosomes des bivalents (étape du pachytène). Ceux-ci sont visibles cytologiquement: il s'agit des chiasmas. Ces chiasmas maintiennent entre eux les deux chromosomes lorsque le complexe synaptonémal se résorbe en fin de prophase I (étape du diplotène). Les bivalents vont ensuite se positionner sur la plaque équatoriale. Une fois en position, l'étape de métaphase I est atteinte. Lors de l'étape suivante (anaphase I), la résolution des chiasmas permets aux deux chromosomes (chacun ayant deux chromatides) de se séparer et de s'éloigner à chacun des pôles du noyau. La télophase I voit la décondensation partielle des chromosomes. Elle est immédiatement suivie de leur recondensation nécessaire pour la deuxième division de méiose (Méiose II) qui est une mitose classique. Notez que chez de nombreux eucaryotes, la méiose peut être suivie de mitoses dites postméiotiques comme chez les champignons ascomycètes filamenteux. Pour les organelles situées dans le cytoplasme et contenant leur propre génome (mitochondrie, plastes, etc.), il n'existe pas en général de mécanismes particuliers qui vont permettre leur transmission préférentielle (attention, il existe des exceptions), mais si l'organisme différentie des gamètes morphologiquement différents (mâles notés ♂ et femelles notés ♀) il va y a voir un biais de transmission aux gamètes. le cas le plus commun est que seul le gamète femelle transmet l'ADN des organelles.

G1
La figure 9 décrit la terminologie utilisée de manière générale concernant le cycle de vie des eucaryotes. En fait à pour chaque groupe d'eucaryote, il existe une terminologie particulière pour les gamètes et le zygote. Notez que la fécondation s'appelle conjugaison lorsque les deux gamètes ont la même taille. La fécondation/conjugaison permet de réunir deux génomes haploïdes dits parentaux pour redonner un diploïde. Elle se décompose en deux étapes: la fusion des gamètes ou plasmogamie puis la fusion des noyaux ou caryogamie. Chez certains eucaryotes, la fusion cellulaire n'est pas toujours immédiatement suivie de la fusion des noyaux. Il se produit alors une dicaryophase avec des cellules binucléées.

La méiose est la division particulière qui permet le passage de la phase diploïde à la phase haploïde (figure 10). Pour effectuer la méiose, il faut donc partir d'une cellule diploïde à 2n chromosomes. Cette division est précédée comme pour la mitose de la duplication du matériel génétique (réplication de l'ADN). Au cours de la méiose, il y a deux divisions successives qui aboutissent à la production de 4 cellules haploïdes à n chromosomes suivant le schéma général décrit dans la figure 10.

Quelques organismes modèles en génétique

La durée des phases haploïdes et diploïdes est variable en fonction des organismes. Cela veut donc dire que pour chaque organisme, l'analyse génétique des croisements suivra des modalités différentes en fonction de la phase qui peut être observée facilement. Les cycles décrits ci-dessous présentent les trois grands groupes de cycles qui sont distingués, en prenant les exemples des organismes les plus étudiés en génétique. Ensuite, vous sont données quelques caractéristiques génétiques de ces organismes.

Saccharomyces cerevisiae

Si la phase haploïde est aussi longue que la phase diploïde, le cycle est dit haplodiplobiontique.

Ce type de cycle est présent chez quelques levures dont la levure de boulanger Saccharomyces cerevisiae (figure 11). Cette levure se divise par bourgeonnement d'une cellule fille à partir de la cellule mère, ce qui veut dire que le cytoplasme n'est pas réparti équitablement entre les deux cellules issues de la mitose. Par contre, la conjugaison entre gamètes se fait entre deux cellules non distinguables morphologiquement mais génétiquement différentes: on dit que Saccharomyces cerevisiae est hétérothallique. De même, la méiose produit quatre ascospores identiques morphologiquement dont deux sont d'un type sexuel (mata) est les deux autres de l'autre type (matα). On dit que le type sexuel de Neurospora crassa est un hétérothallique bipolaire avec deux types sexuels appelés mata et matA et qui différencie des gamètes mâles et femelles (figure 12). La fécondation ne peut se produire qu'entre deux gamètes de types sexuels opposés: ♂ mata x ♀ matA et ♂ matA x ♀ mata. Comme chez les autres champignons ascomycètes Pezizomycotina, la plasmogamie est suivie d'une étape de dicaryose ou dicaryophase aboutissant à l'amplification des cellules binucléées avant la caryogamie: à partir d'une fécondation, plusieurs centaines d'asques vont être produits. Notez que la position des ascospores dans les asques reflète la position des fuseaux de division: on dit que les asques sont ordonnés. Le cycle dure deux à trois semaines.

Le génome de

Les animaux et les plantes

Chez les animaux et les plantes supérieures, la phase diploïde dure très longtemps alors que la phase haploïde est réduite au minimum. On parle de cycle diplobiontique. Il en existe beaucoup de variations.

Caenorhabditis elegans

Chez le nématode Caenorhabditis elegans (figure 14), il existe des individus hermaphrodites avec deux chromosomes X qui peuvent s'autoféconder pour donner naissance principalement à des hermaphrodites. Rarement, un accident de méiose aboutit à la perte du chromosome X dans un gamète.

L'oeuf résultant de la fécondation d'un gamète normal avec ce gamète donne naissance à un mâle incapable de s'autoféconder mais qui peut produire des spermatozoïdes fécondant les hermaphrodites.

Le cycle dure trois jours. Caenorhabditis elegans possède un génome 97 Mb répartis sur cinq paires d'autosomes, un chromosome sexuel X (les hermaphrodites sont noté X X et les mâles X 0), et un génome mitochondrial circulaire. La transformation génétique de ce ver est possible, mais la méthode privilégiée pour inactiver les gènes est l'interférence à ARN, qui est facile à mettre en oeuvre car il suffit d'exprimer l'ARN interférent double brin dans les bactéries qui servent de source de nutriments pour inactiver les gènes "cognate" dans le ver! La stratégie CRISPR/CAS0 a aussi été développée pour Caenorhabditis elegans.

Homo sapiens

Il n'est pas, je pense nécessaire de revenir sur la biologie humaine car vous devez être familier

Arabidopsis thaliana

Les plantes à fleur sont diploïdes et produisent des gamètes mâles et femelles sur/dans des organes reproducteurs spéciaux : étamines pour les gamètes mâles et ovaires pour les gamètes femelles.

Les sexes sont soit séparés dans les plantes dites dioïques (voire sur des plants différents dans les dioïques stricts) ou dans les mêmes fleurs chez les plantes monoïques. L'espèce modèle la plus utilisée est Arabidospsis thaliana ou l'arabette des dames (figure 17).

Les virus

Finalement, il existe un groupe Pour ses expériences, Mendel a choisi des plantes possédant des propriétés particulières qui lui ont facilité l'analyse.

• Il fallait qu'elles arborent des caractères constants et facilement différentiables.

• Il fallait qu'il puisse contrôler les croisements et en particulier qu'il puisse éviter les contaminations de pollen venant de l'extérieur.

• Les hybrides fabriqués devaient être aussi fertiles que les parents.

Ceci a conduit aux définitions suivantes (en gras) que nous utilisons encore actuellement : le phénotype de la F1 peut être l'expression simultanée de celui des deux parents. Par exemple chez l'homme, un homme de groupe sanguin AA x une femme de sanguin groupe BB donne des enfants de groupe sanguin AB. On dit que le caractère est co-dominant.

• Lorsqu'il croise les descendants F1 par autofécondation: F1 x F1 (pour obtenir la génération qu'il appelle F2), il obtient 75% de pois jaunes et 25 % de pois verts.

• Lorsqu'il croise cette F2 par autofécondation: F2 x F2 (pour obtenir la génération qu'il appelle F3), il constate que les individus "pois verts" donnent naissance uniquement à des individus "pois verts".

Par contre 1/3 des individus pois jaunes donnent naissance uniquement à des individus pois jaunes alors que 2/3 des individus se comportent comme ceux de la génération F1 (c.a.d., donnant 25% d'individus "pois verts" et 75% d'individus "pois jaunes").

L'interprétation qu'il donne est la suivante: le pois possède deux copies de l'information (nous savons maintenant qu'il est diploïde!!) et reçoit une copie de chacun de ses parents avec la même probabilité. Ceci peut se formaliser de la manière résumée sur la figure 20. Comme pour le phénotype, on ne donne en général qu'un génotype partiel correspondant à ce que l'on veut étudier. On étend aux allèles les notions de dominance et récessivité. Maintenant que nous disposons d'un vocabulaire, nous allons répondre à deux questions.

1°) est-ce qu'un même phénotype observé pour deux individus indépendants est forcément causé par un même génotype ?

La réponse est NON ! exemple: au phénotype "pois jaune" correspondent deux génotypes v/J et J/J. Nous verrons par la suite que des allèles de gènes différents peuvent aussi être responsables de phénotypes identiques.

2°) est-ce qu'un même génotype assure toujours un même phénotype ?

La réponse est NON ! Le phénotype résulte de l'interaction entre le génotype et l'environnement. Pour certains caractères, la part prise par l'environnement est négligeable, alors que pour d'autre elle peut être prépondérante:

exemples:

• dans le système des groupes sanguins ABO ou rh+/rh-, la part de l'environnement est inexistante.

• le nombre des facettes des yeux de la drosophile fluctue en fonction de la température (figure 21). Cette définition est beaucoup trop restrictive pour les généticiens car il est possible de détecter des caractères qui ne sont pas directement reliés à un segment d'ADN (en fait, on en découvre actuellement de plus en plus !!).

Quelles est la nature chimique de l'information génétique ?

Après la jonction effectuée entre phénotype et génotype se pose la question de la nature chimique de l'information génétique. Deux étapes essentielles ont mené à la découverte de l'ADN en tant que support principal de l'information génétique. Néanmoins, d'autres arguments ont été apportés par différents chercheurs afin de convaincre la communauté scientifique. • des souches virulentes létales pour les souris qu'il appelle "S" car elles ont un aspect lisse lorsqu'elles forment des colonies sur boite de Pétri (s = smooth).

• des souches non virulentes "R" donnant des colonies rugueuses sur boite de Pétri (r = rough).

La différence de morphologie est due à la présence de polysaccharides protecteurs autour de la cellule chez les souches S. Ces polysaccharides ont différentes compositions qui spécifient le type des pneumocoques (I, II, III etc.). Ils sont facilement visualisables par l'utilisation d'anticorps spécifiques. 27).

Quelque chose qui porte l'information "S III" dans les cellules S tuées se transmet aux cellules "R" vivantes et les transforme en S ! Il a donc découvert le principe de la transformation génétique.

Celle-ci consiste en l'introduction à l'intérieur de la cellule d'une information exogène provenant d'une autre cellule. On exclut évidemment dans cette définition, l'introduction d'information virale pour laquelle on utilise plutôt le terme de transfection. -Le plasmide Ti: ce plasmide présent chez la bactérie Agrobacterium tumefaciens porte la région T-DNA qui est injectée dans les cellules de plantes par la bactérie lorsque celle-ci infecte les plantes.

Ce plasmide a permis de mettre au point des méthodes pour transformer les cellules végétales ou fongiques.

Les mini et les microsatellites

Chez de nombreuses espèces (et en particulier chez les vertébrés), on note la présence de séquences répétées en tandem que l'on appelle satellites car généralement elles ne migrent pas à la même position que l'ADN génomique classique dans les centrifugations en gradients de césium, utilisées pour purifier l'ADN. Ces séquences en général ne codent pour rien (les gènes d'ARN ribosomaux en sont des contre-exemples). Ce qui est intéressant est que ces séquences présentent le plus souvent une variation du nombre de motifs. On distingue particulièrement deux types de séquences en fonction de la taille de l'unité répétée:

• Les microsatellites qui ont quelques nucléotides de longueur comme par exemple le trinucléotide GTT du microsatellite 1D25 de Podospora anserina (figure 41).

• Les minisatellites qui ont de 10 à 30 nucléotides de longueur. 43).

Les haplotypes et idiomorphes

Les variations chromosomiques

Celles-ci sont variées. Citons entre autre des modifications de la structure des chromosomes telle que les délétions, les duplications de certaines régions, les inversions ou les translocations (voir figure 59). A ceci, il faut ajouter les variations du nombre de chromosomes telles que :

• des modifications du taux de ploïdie: c'est dire des individus qui comportent 3 génomes haploïdes (triploïdes) ou 4 génomes haploïdes (tétraploïdes) au lieu de deux génomes. Ces phénomènes sont fréquents chez les plantes.

• des différences dans le nombre de chromosomes liées à des chromosomes optionnels (chez certaines plantes) ou qui ont été perdus ou gagnés par rapport au génome normal (triploïde partiel ou haploïde partiel: dans ce cas on parle d'aneuploïde) ou à des fusions de chromosomes.

Citons un cas de fusion qui est très utilisé en génétique de la drosophile. On dispose de souches Nous voyons par exemple que dans ce type de croisements le mâle hérite son chromosome Y de sa mère et son chromosome X de son père, à l'inverse des croisements normaux.

L'épigénétique

Une partie des polymorphismes héritables présents dans les populations n'est pas liée à des polymorphismes classiques, c'est à dire résultants de variations de la séquence primaire de l'ADN. Ces polymorphismes ont souvent des modalités de transmission qui n'obéissent pas aux lois de Mendel. On dit qu'ils proviennent de modifications épigénétiques et leur apparition est liée à ce qu'on appelle des épimutations. Il existe une grande variété de mécanismes conduisant à ces polymorphismes épigénétiques qui peuvent être classés sous deux grandes bannières: hérédité de structure et hérédité de régulation. Les modifications épigénétiques les plus connues sont à la charnière de ces deux groupes car elles résultent de modifications de structure de la chromatine, ce qui a un impact sur la régulation des gènes affectés. Nous allons voir quelques exemples emblématiques qui permettent de montrer la variété des mécanismes épigénétiques. Comme on le voit avec l'exemple des fleurs normales versus peloric l'état de méthylation est héritable. On note cependant une certaine instabilité des états de méthylation qui sont donc réversibles.

Il existe d'autres types de phénomènes qui ressemblent à celui-ci, dans le sens qu'il s'agit de modifications structurales de l'ADN (le plus souvent de la chromatine chez les eucaryotes) sans changement de séquence, aboutissant à une hétérochromatinisation des gènes et leur inactivation transcriptionnelle. On parle alors de mécanismes dit de TGS (pour Transciptional Gene Silencing) qui sont donc liés soit à de la méthylation de l'ADN soit à des modifications de structure de la chromatine.

Les différents types de mutations

Les mutations sont souvent qualifiées par le polymorphisme qu'elles créent (SNR, inversion, insertion etc.) ou les caractères qu'elles entraînent. Voici quelques types de mutations classées en fonction de leurs effets physiologiques :

• les mutations létales qui entraînent la létalité des souches qui les portent. Il est évident que de telles mutations ne peuvent apparaître dans une population que si elles sont récessives ou conditionnelles.

• les mutations d'auxotrophie qui ne permettent plus aux souches qui les portent de pousser sur milieu minimum Attention une mutation qui apparaît dans une cellule somatique se transmet à tous les descendants de cette cellule, elle ne sera par contre pas transmise à la génération suivante aux descendants issus de la lignée germinale. Ces mutations ne sont cependant pas négligeables biologiquement car une catégorie importante regroupe les mutations somatiques qui conduisent à la formation de tumeurs cancéreuses!

Les modalités d'apparition des mutations

Les mutations résultent de deux grands types de phénomènes.

• la fidélité de la transmission du matériel génétique n'est pas de 100%. Ceci dérive de plusieurs processus intrinsèquement liées aux propriétés physico-chimiques de la matière.

exemples :

-La tautomérisation de certaines bases qui peuvent entraîner des appariements illégitimes qui ne -L'éthyl-méthylsulfonate réagit avec la guanine et la transforme en O6-ethylguanine qui va s'hybrider au cours de la réplication avec la thymine.

la colchicine empêche la formation des fuseaux et cause ainsi des pertes de chromosomes ou alors des polyploïdisations.

Notez que ces produits mutagènes sont très toxiques car ils ont des activités cancérigènes ou tératogènes. Il est aussi possible de baisser le taux de mutations spontanées grâce à certains composés.

On sait par exemple, que l'adjonction de produits ayant des activités antioxydantes permet de limiter le taux de mutations en particulier au niveau de l'ADN mitochondrial.

Les fréquences de ces dommages sont impressionnantes; on estime en effet qu'une cellule animale par génération subit:

-20 000 cassures simple-brin -10 000 dépurinations de bases Voyons maintenant plus en détail l'aspect génétique du phénomène en commençant par les modalités de leur apparition.

Le problème de l'apparition des mutations n'est pas trivial et il est encore débattu aujourd'hui.

En effet, si la majorité des généticiens s'accordent pour dire que les mutations se produisent au hasard, il en existe quelques-uns qui pensent que celles-ci pourraient être induites par le milieu. Il faut comprendre induite non pas comme "ayant une fréquence augmentée par le milieu" car nous avons vu qu'effectivement des conditions de milieu peuvent augmenter de manière considérable le taux de mutation, mais plutôt dirigées par le milieu. Des expériences ont fait resurgir de manière épisodique ce débat qui malheureusement sort du cadre de ce cours. Quoi qu'il en soit, des expériences ont clairement montré que les mutations apparaissent spontanément. La première démonstration convaincante de ceci a été faite grâce à ce que l'on appelle aujourd'hui le test de fluctuation.

Le test de fluctuation

du milieu avec (+ streptomycine) ou sans antibiotique (-streptomycine). Sur le milieu + antibiotique (boite n°1), des bactéries résistantes génèrent des colonies contenant des millions d'individus résistants. S'ils sont étalés sur du milieu avec de l'antibiotique, chacun de ces descendants résistants va former de nouvelles colonies (boite n°2), montrant l'héritabilité de la mutation conférant la résistance. Sur le milieu sans antibiotique (boite n°3), toutes les bactéries qu'elles soient résistantes ou sensibles donnent naissance à des colonies. Joshua et Esther Lederberg ont utilisé la méthode des répliques au velours pour former une copie de ces colonies sur du milieu avec de la streptomycine (boite n°4). Le tissu de velours permet en effet de prélever une partie des cellules des colonies s'il est appliqué sur la boite n°3 et de transférer ensuite une fraction de celles-ci sur du milieu frais par simple contact. Seules les colonies contenant des individus résistants vont alors donner naissance sur la boite n°4 à des nouvelles colonies. Comme précédemment, si ces descendants sont de nouveau étalés sur du milieu avec de l'antibiotique (boite n°5), ils vont tous donner naissance à de nouvelles colonies. Il est maintenant simple de savoir si la mutation de résistance à la streptomycine de la boite n°4 est apparue avant le contact des bactéries avec l'antibiotique. En effet, la colonie de la boite n°3 qui a donné naissance à la colonie résistante de la boite n°4 n'a jamais vu l'antibiotique. Contenant des bactéries déjà résistantes, leur étalement sur du milieu avec antibiotique donnera naissance à des colonies nombreuses (boite n°6). Un témoin avec une colonie qui n'a pas donné naissance à une colonie résistante sur la boite n°4 confirme qu'aucune des bactéries qui la composent n'est résistante (boite n°7). Le résultat de ce test a toujours conduit à la conclusion que les bactéries résistantes détectées sur la boite n°4 étaient en fait déjà présentes sur la boite n°3.

Ce résultat est l'un des plus fondamental de la biologie car, combiné avec le processus de sélection naturelle énoncé par Darwin, il a permis de proposer une hypothèse non finaliste de l'évolution de la vie que l'on désigne sous le terme de néodarwinisme. En effet, "un oeil n'a pas été créé dans le but de voir" même s'il sert à ça, mais les organismes possèdes des yeux car (1) aléatoirement par le biais de mutations, certains ont acquis la capacité de détecter la lumière et ( 2

Fréquences d'apparition des mutations

Les différents types moléculaires de mutations et leurs effets phénotypiques

Nous allons rapidement mentionner les mutations les plus importantes car cette partie est redondante avec votre cours de biologie moléculaire.

Les mutations ponctuelles

Ces mutations modifient un ou quelques nucléotides (changement de la nature de nucléotides ou insertion/délétion de nucléotides).

• On appelle transitions les changements de purines en purines (ou pyrimidines en pyridmidines) nucléotide initial ou bien restaurer le même acide aminé mais codé par un autre codon (ou rétablir la phase un peu plus en amont ou en aval du lieu du premier changement de phase).

et

La recombinaison comme générateur de variation

Lorsque l'on compare les génomes d'espèces proches, voire de souches différentes d'une même espèce, on constate qu'ils ont souvent divergé via la présence de modifications de la structure des chromosomes (figure 58).

De même, les cellules cancéreuses ou des mutants présentent de nombreuses modifications de caryotypes avec en particulier des altérations de la structure de chromosomes (figure 59). La première étape relève de votre cours de biologie moléculaire et je n'insisterai pas sur les moyens d'obtenir les cassettes. J'insisterai donc plus sur les stratégies à utiliser et leurs limites.

Comment inactiver un gène

Actuellement, il existe de nombreuses techniques pour inactiver des gènes et ainsi obtenir des organismes récalcitrants, des cassettes permettant l'expression des ARN double brin sont intégrées au génome en utilisant la recombinaison non-homologue.

L'arrivée de la technologie CRISPR/CAS9 a révolutionné l'obtention de mutants nuls pour les organismes chez qui les mutations sont difficiles à obtenir, ce qui inclut les plantes supérieures chez qui la recombinaison homologue est nulle, mais aussi la drosophile et la plupart des animaux pour lesquels l'obtention de mutant est, bien que faisable, compliquée. Elle facilite aussi l'obtention de mutants aussi chez des champignons, des algues, des protistes parasites ou libres, etc. Je reviendrai sur cette méthode dans la section sur la modification d'un seul nucléotide car CRISPR/CAS9 permet ce genre de modifications.

Comment sur-exprimer un gène

La surexpression d'un gène permet aussi d'avoir des informations sur son rôle. En effet, en général la surexpression provoque un phénotype opposé à l'inactivation (attention, il y a des cas où cela n'est pas le cas et la sur-expression peut par exemple entraîner le même phénotype que la délétion…).

On connaît deux stratégies pour sur-exprimer un gène.

Le criblage de banques de mutants

La disponibilité de collections extensives de mutants générés par mutagenèse inverse permet d'envisager leur criblage direct. Pour rappel, de telles banques sont disponibles chez plusieurs bactéries (banques obtenues par plasmide suicide chez Escherichia coli, Bacillus subtilis…), Caenorhabditis elegans Les généticiens de drosophile ont donc mis au point une armada d'outils pratiques pour effectuer des mutagenèses dans de bonnes conditions (figure 97).

Chez les organismes diplobiontiques comme la drosophile, la révélation des mutations récessives prend donc au moins deux générations. Il va de soi que ce type de crible implique un travail considérable.

• Ce système a donc permis de sélectionner des nouveaux gènes qui ont une influence plus subtile sur la régulation par la lumière bleue.

Ces trois exemples montrent donc la diversité des méthodes utilisées pour obtenir des mutants. 166 pour que la fusion nucléaire ait lieu. Ceux-ci ne diffusant pas entre les noyaux après la plasmogamie, il n'y aura pas de fusion nucléaire dans les mutants nuls de ces gènes. On aura donc l'impression qu'il n'y a pas de complémentation bien que les mutations soient récessives (figure 105).

Conditions d'application

Dans le cas de protéines hétéro-multimériques, des mutations qui altèrent la fonctionnalité des multimères peuvent avoir des effets coopératifs et ainsi aboutir à un effet supérieur à ceux créés par chacune des mutations, cela peut se faire parce que le produit présent dans la souche portant les deux mutations est un poison ou parce que dans le double mutant, il n'y a plus suffisamment de produits fonctionnels pour assurer la fonction cellulaire requise (figure 106). Dans ces conditions, on voit que la distance sera sous-estimée car il faudrait compter deux fois les doubles crossing-over, alors que ceci ne seront seront pas comptés. Ce biais est de plus en plus important quand la distance entre les deux régions augmente. Deux approches sont possibles pour contourner ce problème. On peut essayer de cartographier à l'aide de marqueurs intermédiaires de façon à ne prendre en compte que des petites distances. Les distances ainsi calculées peuvent être additionnées pour donner la distance réelle entre les deux marqueurs les plus éloignés (dit les marqueurs distaux). Cette addition peut conduire à une distance supérieure à 50 cM qui indique donc que plusieurs crossing-over par méiose se produisent entre les marqueurs distaux. On peut aussi extrapoler la distance en supposant que l'apparition des crossing-over est aléatoire. Voyons comment procéder.

Le terme de complémentation a été adapté à trois autres situations

Lorsqu'il se produit plus d'un crossing-over, la fréquence des produits de méiose recombinés que l'on peut détecter (FR) est la moitié du nombre réel quel que soit le nombre de crossing-over (figure 108). D'après la figure 108, on voit donc que si deux gènes sont éloignées et que plusieurs crossing-over se produisent entre eux en moyenne par méiose, la fréquence des méioses qui n'ont pas subi de crossing-over, c'est à dire celles ou F(X = 0), est reliée à la fréquence des recombinants car elle est égale à 1 -2 x FR. Si on trouve 38 % de chromatides recombinées à l'issue du croisement que l'on analyse, la vraie distance est probablement proche de -0.5 x ln (1-2 x 0.38) = 0.71, soit une distance génétique de 71 cM. Vous voyez donc que si on ne corrige pas la distance, on la sous-estime grandement. Cette distance plus grande que 50 cM reflète le fait qu'il se produit en moyenne plus d'un crossing-over par méiose entre les deux gènes, comme dans le cas où on utilise des marqueurs intermédiaires pour calculer la distance entre marqueurs distaux.

Mais attention, ce calcul n'est valide que si les crossing-over se produisent indépendamment les uns des autres. Ceci n'est pas le cas pour de nombreux organismes car il existe des interférences de crossing-over. Le plus souvent, la présence d'un premier crossing-over inhibe la production d'un deuxième dans les régions proches. De plus, nous allons voir que chez certains organismes, où l'analyse des produits de la méiose est possible, nous pouvons avoir accès aux doubles crossing-over. Cette formule ne s'applique pas pour l'estimation à partir de la distance qui prend en compte déjà les doubles crossing-over.

Les organismes haplobiontiques: Neurospora crassa et les champignons filamenteux ascomycètes ayant des asques ordonnés

Nous avons vu dans l'introduction Générale, que chez les champignons du type de Neurospora crassa, la structure de l'asque donne directement accès aux phénomènes de ségrégation qui se sont produits au cours de la méiose car ces asques ont une mémoire de l'orientation des fuseaux aux cours de la méiose :

on parle d'asques ordonnés. Chez ce champignon, il est donc possible de faire trois types d'analyse, l'analyse de spores en vrac, l'analyse d'asques non ordonnés et l'analyse d'asques ordonnés. Après la méiose chez ce champignon, il se produit une mitose qui conduit à des asques contenant huit spores.

Cela n'est pas gênant car les 2 spores issues d'une mitose sont a priori identiques et cote à cote (figure 109). Que se passe-t-il si le gène est très proche du centromère ?

-Dans ce cas, on n'obtient que des asques préréduits, et la distance est nulle.

Que se passe-t-il si le gène est très éloigné de son centromère ?

-Dans ce cas, on obtient un mélange d'asques préréduits et postréduits dans une proportion respectivement de 1/3 et 2/3. En effet:

-si pas de crossing-over entre le gène et son centromère: 100% des asques sont Figure 112: ségrégation de deux gènes localisés sur des chromosomes différents dans les tétrades de levure sans ou avec un seul crossing-over. Sans crossing-over, comme chaque association de chromosomes est équiprobable au cours de la première division de la méiose, on obtient autant de tétrades avec uniquement des associations parentales dites ditypes parentaux que de tétrades contenant uniquement des associations recombinées dites ditypes recombinés. Avec un crossing-over entre l'un des gènes et son centromère, on obtient uniquement des asques contenant une spore de chacune des 4 associations dits tétratypes.

Les organismes haplodiplobiontiques: Saccharomyces cerevisiae et les levures ascomycètes

Nous avons vu dans l'introduction que chez les levures du type de Saccharomyces cerevisiae, il est possible d'observer les résultats de la méiose dans des asques non ordonnés. Ceux-ci contiennent 4 spores d'où leur nom de tétrades. Comme, elles ne sont pas ordonnées, l'information de position par rapport au centromère est perdue. Cette analyse fournit donc moins de renseignements que l'analyse des asques ordonnés. On peut alors construire la suite: Mais, le fait de ne pas considérer les asques fait que de l'information est perdue (en particulier, on ne peut pas évaluer les doubles crossing-over entre deux gènes). Ce type d'analyse fourni donc moins d'information que l'analyse de tétrades ordonnées ou non. L'analyse des spores en vrac est par contre souvent beaucoup plus facile à mettre en oeuvre pratiquement et suffit souvent en première approche.

T n = DP n-1 + DR n-1 + 1/2 T n-1 = DP n-1 + 1 -(DP n-1 + T n-1 ) + 1/2 T n-1 = 1 -1/2 T n
• Si un gène est en jeu au cours du croisement (a -x a + ), on récupère en théorie 50% spores a -et 50% de spores a Nous voyons que si les gènes sont liés, les doubles-homozygotes récessifs vont diminuer car dans ce cas les proportions de gamètes recombinés diminuent alors que les parentaux augmentent. Dans le cas extrême, où il n'y a pas de recombinant, alors en F2, 25% des descendants ont le phénotype mutant de a -, 25% des descendants ont le phénotype mutant de b -et 50% descendants sont sauvages et il n'y a pas de doubles-homozygotes récessifs.

Un moyen simple de voir si les gènes sont liés ou non est donc de compter les nombre de doubles-homozygotes récessifs:

• S'ils sont en proportion égale à 1/16 de l'effectif total de la descendance alors les gènes sont indépendants.

• S'ils ont en proportion inférieure à 1/16 de l'effectif total de la descendance alors les gènes sont liés. Il est alors possible de calculer la distance génétique: d= 2 x √p̅ x 100 cM ou p est la proportion des doubles-homozygotes récessifs.

Notez que si les deux mutations sont dominantes, la case diagnostique sera celle des sauvages l'analyse des trois mutations ensembles permet de les ordonner sur les chromosomes (figure 116).

La ségrégation extrachromosomique méiotique

Chez la plupart des organismes, il existe une différence entre le gamète apporté par le mâle et 117). Le diploïde peut respirer ainsi que les quatre spores issues de la méiose. La ségrégation est de type 4:0. constant même si localement il existe des régions avec peu de crossing-over (où 1 cM représente plus de 2 kb) et des "points chauds" (où 1 cM représente moins de 2 kb).

• chez les drosophiles mâles, les crossing-over sont très rares. Chez les femelles, on estime le rapport à environ 1 cM ~ 500 kb. Chacun des gros chromosomes subit donc environ un crossing-over par méiose.

• chez l'homme, l'estimation actuelle est de 1 cM pour 1 Mb (= 10 6 pb). Ceci a pour conséquence que chaque chromosome subit entre un et trois crossing-over par méiose. Donc, chacun des chromosomes, que vous avez hérités de vos parents, est une mosaïque des chromosomes de vos grandsparents ! Vous êtes donc réellement génétiquement uniques, sauf si vous avez un vrai jumeau (et encore nous avons vu qu'il existe des événements génétiques somatiques par exemple !).

• chez Podospora anserina, la carte génétique ne reflète pas la carte physique (figure 118). En effet, les crossing-over ne sont pas indépendants et il existe des interférences très fortes, c'est à dire que la probabilité qu'il se produise un crossing-over supplémentaire sur un chromosome dépend de la préexistence d'autres crossing-over. De plus, les crossing-over se produisent uniquement dans certaines régions. Cela aboutit à une carte génétique où les gènes ne sont pas espacés régulièrement mais à une 188 carte où ils sont groupés en paquets. En particulier sur le chromosome 1, il ne se produit qu'un seul crossing-over entre le centromère et l'idiomorphe du type sexuel mat. Sur ce chromosome, il existe d'autres gènes (comme AS4 ou modC) qui co-ségrègent avec mat (d<<0.1 cM) et qui présentent aussi des ségrégations distordues. En effet, le pourcentage de post-réduction de mat et AS4 est de 98 %.

Les eucaryotes: la mitose

Nous avons vu dans l'Introduction Générale qu'au cours d'une mitose, il ne se produit pas (en théorie !) de changements du matériel génétique; chaque cellule fille recevant la même information de la cellule mère.

Il existe cependant quelques cas, où des changements se produisent et où ceux-ci peuvent être utilisés par les généticiens pour faire de la cartographie.

Ségrégation des chromosomes nucléaires

Non-disjonction en mitose

Nous avons vu qu'il peut se produire des anomalies de ségrégation des chromosomes nucléaires comme la non-disjonction. Si ceci est le plus souvent létal chez les haploïdes, chez les diploïdes les cellules déficientes pour un chromosome ou avec un chromosome surnuméraire peuvent survivre. Ce type d'événements est en général très rare (mais il peut être provoqué par divers traitement, dont la colchicine). Par exemple, chez un hétérozygote a -/a + (avec a-récessif), la non-disjonction du chromosome portant l'allèle a + permet de voir apparaître des cellules avec un phénotype mutant (figure 119).

Dans le cas d'une colonie de levure, on voit apparaître un secteur mutant au sein d'une colonie sauvage (à gauche dans la figure 119). Dans le cas d'un animal, on obtient ce que l'on appelle une mosaïque, c'est à dire un individu avec un mélange de cellules ayant des compositions génétiques différentes. Deux gènes situés sur le même chromosome vont co-ségréger au cours des non-disjonctions.

Cycle parasexuel

Chez les champignons haploïdes et plus particulièrement chez Aspergillus nidulans, il existe un cycle que l'on qualifie de cycle parasexuel (voir figure 13). Chez cette espèce, il est donc possible de sélectionner des noyaux diploïdes qui sont générés spontanément et qui se propagent de manière assez stable surtout s'il existe une pression de sélection. Ceux-ci retournent cependant rapidement à l'état haploïde en absence de pression de sélection. Il en résulte des ré-associations aléatoires des chromosomes présents dans les souches utilisées initialement pour fabriquer le diploïde. Ceci permet de cartographier rapidement les gènes sur les différents chromosomes. De fait, pour localiser les gènes, on 190 dispose de souches "plurimarquées" sur tous les chromosomes qui permettent en un seul croisement de cartographier les gènes sur un des 8 chromosomes.

Prenons l'exemple pour localiser un gène sur le chromosome II d'un gène "a" avec 2 allèles (a + et a -). Le chromosome II porte w (white) un marqueur de coloration blanche des conidies, les conidies sauvages w + étant vertes. Pour la localisation, on construit dans un premier temps un hétérocaryon avec des noyaux <a -, y, w + > et des noyaux <a + , y + , w> où y (=yellow) est un marqueur de coloration qui donne des conidies jaunes et qui n'est pas situé sur le chromosome II. L'hétérocaryon produit des conidies qui sont soit blanches soit jaunes, car les conidies possèdent un seul noyau. Ensuite, on sélectionne facilement un diploïde qui a des conidies vertes. Si les conidies sont vertes, c'est que le noyau est diploïde et qu'il se produit de la complémentation entre les couples y/y+ et w/w+. Puis, on attend l'haploïdisation et on regarde le phénotype des souches qui ont des conidies blanches:

• Si toutes ces souches ont le phénotype apporté par a -, c'est que le gène "a" se trouve aussi sur le chromosome II.

• Si la moitié des souches ont le phénotype a -et l'autre moitié le phénotype a + , alors le gène "a" ne se trouve pas sur le chromosome II.

Crossing-over mitotiques

Finalement, il se produit au cours de la mitose de rares crossing-over dit crossing-over mitotiques (que l'on peut induire par des traitements appropriés en cassant l'ADN par exemple). On

La conjugaison

Les bactéries peuvent contenir des plasmides conjugatifs (tels que le plasmide F chez Escherichia coli, figure 37). Ces plasmides conjugatifs ont permis le développement de systèmes de cartographie. En effet, ces plasmides ont la capacité de s'intégrer dans le chromosome bactérien par recombinaison, ce sont des épisomes (figure 122). Les souches ayant un plasmide intégré sont appelées Hfr (pour haute fréquence de recombinaison). Elles ont toutes les caractéristiques de bactéries F + si ce n'est que lors du transfert de F vers une bactérie F -, ce transfert s'accompagne de celui de l'ADN du chromosome (figure 122). Après cette conjugaison, il se produit une recombinaison dans la bactérie F -entre l'ADN du chromosome et l'ADN nouvellement introduit (figure 122). Chez Escherichia coli, l'insertion du plasmide F dans le chromosome peut se faire à différents endroits (figure 122). Ceci permet de cartographier à partir de plusieurs origines. Les données obtenues montrent alors que les ordres obtenus pour les mêmes marqueurs diffèrent mais ne sont pas aléatoires.

L'analyse de l'ensemble des résultats a permis de conclure qu'en fait le chromosome de Escherichia coli est circulaire (figure 124). Le principe par conjugaison permet donc de cartographier facilement des mutations nouvellement obtenues en se servant des mutants comme réceptrices et de souches Hfr sauvages comme donneuses.

Le clonage par expression

Aussi souvent appelé clonage par complémentation (voir le chapitre 4), cette méthode de clonage ne peut se faire que chez les organismes transformables facilement et pour lesquels il est possible de cribler un grand nombre de transformants, soit essentiellement des bactéries, des levures et avec quelques adaptations les champignons filamenteux. Elle repose sur l'utilisation d'une banque génomique (figure 126).

Pour identifier le gène mutant, la stratégie dépend de la dominance/récessivité de la mutation. Le produit du gène participe à l'élaboration du phénotype, qui est le résultat visible de l'action de toutes les protéines et de tous les ARN actifs, présents à un moment donné de la vie de l'organisme ou de la cellule. Nous avons vu que les effets des mutations sur le phénotype va dépendre de leur nature mais aussi des produits qu'elles altèrent. Réciproquement, une analyse fine des phénotypes permet d'obtenir des informations sur la nature de la mutation mais aussi éventuellement sur le type de produits codé par le gène qu'elle perturbe.

Pléiotropie ou mutations multiples?

Nous avons vu au chapitre 1 qu'il existe des mutations dites pléiotropes qui peuvent entraîner des phénotypes multiples. L'analyse de la ségrégation permet souvent de savoir si des altérations • Si la régulation est négative, c'est à dire que le partenaire situé en amont réprime celui situé en aval, une mutation nulle dans le gène amont codant donc un répresseur entraîne que la partie de la voie de signalisation située en dessous est active en l'absence de signal : on dit que l'expression de la voie est constitutive.

On voit maintenant facilement que:

• un double mutant affecté pour un répresseur et un activateur situé en amont de celui-ci aura une activation constitutive de la partie de la voie située en aval du répresseur.

La suppression

Le

Figure 1 :

 1 Figure 1: première représentation de cellules par Robert Hooke dans son "Micrographia" publié en 1665.

Figure 2 :

 2 Figure 2: représentation de cellules végétales et animales pour étayer la théorie cellulaire dans le livre de Theodor Schwann "Mikroskopische Untersuchungen" publié en 1839.

Figure

  Figure 3: en l'absence de stérilisation (pas de chauffage), Pasteur observe une putréfaction (ou fermentation) avec une apparition de microorganismes. Après une stérilisation par chauffage, Pasteur n'observe pas de putréfaction. Par contre après cassure du tube de verre et exposition de la matière à l'air, les microorganismes apparaissent entraînant la putréfaction. L'explication qu'il donne est la suivante: les particules présentes dans l'air se déposent dans le tube avant d'avoir atteint la matière. Si celle-ci est stérile, il n'y a pas de putréfaction. La cassure du tube permet à ces germes d'atteindre la matière et de démarrer le processus. Notez que dans cette expérience de l'air "non altéré" passe sans problème dans la fiole à tout moment, il n'y a donc pas altération de "principe de l'air" qui empêcherait l'apparition spontanée de cellules. Cette expérience prouve qu'il y a besoin de germes pour initier la putréfaction et donc que la génération spontanée n'existe pas.

:

  si toute cellule naît d'une cellule, d'un point de vue génétique, cela veut dire que l'information présente dans un organisme n'apparaît pas spontanément ! Elle est produite à partir d'une information préexistante. Celle-ci doit donc être dupliquée avant d'être transmise.

Figure 4 :

 4 Figure 4: structure d'une cellule procaryote typique.

Figure 5 :

 5 Figure 5: structure d'une cellule eucaryote typique.

•

  Elles ont la possibilité de faire des endocytoses, ce qui permet des échanges additionnels avec le milieu extérieur, mais aussi des régulations supplémentaires. • Ces cellules peuvent se différencier et donner naissance à des organismes pluricellulaires. Ils ont une grande diversité au niveau du métabolisme (mais moindre que chez les bactéries) et de leur fonctionnement au niveau moléculaire. Je vous renvoie aux cours de biologie moléculaire, biochimie et microbiologie de maîtrise pour approfondir vos connaissances sur le sujet. Vous pouvez aussi consulter le livre de microbiologie eucaryote qui donne un aperçu de la diversité des eucaryotes "simples". • Leur matériel génétique est présent dans plusieurs compartiments. La plus grosse partie se trouve dans le noyau sous forme de plusieurs molécules d'ADN linéaires double brins ou chromosomes et dont le nombre est défini. Si un seul lot de chromosomes est présent, la cellule est dite haploïde, si deux lots identiques sont présents la cellule est dite diploïde, avec trois lots, elle est triploïde et avec quatre elle est tétraploïde. L'autre compartiment qui contient de l'ADN et la mitochondrie. L'ADN y est présent sous formes de plusieurs molécules de structures très variables en fonction des lignées d'eucaryotes (voir le livre de microbiologie eucaryote) et dont le nombre varie en fonction des étapes du cycle de vie et/ou des conditions de l'environnement. Chez les plantes et certains protozoaires, de l'ADN est aussi présents dans les plastes ou d'autres organelles (voir le livre de microbiologie eucaryote).

Figure 6 :

 6 Figure 6: le cycle cellulaire d'une cellule eucaryote.

Figure 7 :

 7 Figure 7: la mitose chez Saccharomyces cerevisiae. Au cours de la prophase, les chromosomes se condensent et les deux chromatides qui les composent et qui sont chacune des molécules filles issues de la réplication sont bien visibles. Les chromosomes s'alignent via leur centromère sur la plaque équatoriale. Lorsqu'ils sont bien alignés, l'étape dite métaphase est atteinte. Les centromères se clivent et chacune des chromatides pour chaque chromosome se dirigent vers un pôle opposé du noyau. C'est l'étape dite d'anaphase. Notez qu'à ce moment, chaque chromatide devient un chromosome. Au cours de la télophase les noyaux se divisent et les chromosomes se décondensent. Puis la cellule se divise, c'est l'étape de cytodiérese. Pour les mitochondries, qui chez la levure Saccharomyces cerevisiae porte un génome circulaire, l'entrée dans le bourgeon est contrôlée par un système qui assure une partition correcte des mitochondries entre la cellule mère et le bourgeon.

  et G2 sont des phases d'attente (ou GAP). Pendant les phases G1 et G2, un certain nombre de décisions sont prises (Y-a-t-il assez d'énergie pour se diviser ?…) et des contrôles sont faits (l'ADN est-il bien répliqué ? …) M: Mitose qui intervient entre les phases G2 et G1 et qui est le moment exact où le matériel génétique est réparti dans les deux cellules filles. C'est un processus dynamique dont la durée est variable d'un organisme à un autre mais qui prend en général moins d'une heure. Elle a été découverte chez les plantes par Edouard Stasburger (1875). Flemming (1880) montre qu'elle existe aussi chez les animaux et appelle chromatine la substance dont sont faites les particules "colorantes" du noyau. Waldeyer (1888) donne le nom de chromosome à ces particules. La figure 7 en donne les principales étapes. Il existe de nombreuses variations sur ce schéma. Par exemple, chez les animaux et les plantes, la membrane nucléaire disparaît pendant le processus. Il y a des "asters" plutôt qu'un "Spindle Pole Body" ou SPB. La cytologie a aussi permis de décrire différents types de chromosomes (figure 8) en fonction de la position de leur centromère. Tailles et types des chromosomes permettent donc de les différencier et d'en établir un catalogue ou caryotype.

Figure 8 :

 8 Figure 8: les principaux types de chromosomes définis par les analyses cytologiques.

Figure 9 :

 9 cycle de vie d'un eucaryote.

  Le brassage aléatoire des chromosomes et les crossing-over sont les deux mécanismes qui vont participer à la recombinaison entre les deux génomes parentaux. La recombinaison au sens génétique du terme est le fait que des informations provenant des deux parents d'un individu se retrouve associés dans ses gamètes. Les descendants que va générer cet individu vont donc être formés d'une mosaïque des chromosomes provenant de chacun de ses parents. Ce qu'il faut donc retenir c'est que la méiose permet de restaurer l'état haploïde chez les eucaryotes et que cela s'accompagne de la recombinaison des informations génétiques due au brassage chromosomique et aux crossing-over. Elle n'est qu'une des étapes du cycle de vie des eucaryotes dont la diploïdie va être restaurée par la fécondation/conjugaison.

Figure 11 :

 11 Figure 11: la levure de boulanger Saccharomyces cerevisiae. Pour cette levure, il existe 2 types sexuels appelé mata et matα. Les cellules haploïdes mata ou matα, peuvent se diviser par mitose et générer des clones. La division s'effectue par bourgeonnement donnant deux cellules de tailles différentes : la cellule mère et la cellule fille (visible dans l'mage à gauche). La conjugaison (équivalent à la fécondation) ne peut avoir lieu qu'entre une cellule haploïde mata et une cellule haploïde matα. La cellule diploïde résultant de la fusion peut aussi se diviser par mitose. Lorsque se produit une carence en nutriments, la cellule effectue une méiose. Celle-ci ne peut se produire que dans une cellule diploïde mata/matα. Elle produit 4 spores haploïdes empaquetées dans un asque que l'on appelle une tétrade; les spores sont alors appelées des ascospores. Deux ascospores seront mata et les deux autres matα.

  Neurospora crassa est constitué de sept chromosomes nucléaires et d'un chromosome mitochondrial circulaire. Il mesure 43 Mb et code pour environ 11 000 gènes. La transformation génétique de Neurospora crassa est facile et une banque de mutants de délétion de chaque gène est disponible. De nombreux mutants affectant ce champignon ont été sélectionnés. Plus d'informations sur la génétique de ce champignon sont disponibles sur le site du FGSC (pour Fungal

Figure 12 :

 12 Figure 12: Neurospora crassa possède deux types sexuels appelés mata et matA. Le mycélium du champignon est haploïde et différencie des organes mâles ou spermaties et femelles ou ascogones. La fécondation se produit entre un organe mâle d'un type sexuel et un organe femelle du type sexuel opposé. La fécondation est suivie d'une étape dicaryotique qui permet de multiplier le nombre de cellules issues de la fécondation et dans lesquelles auront lieu les caryogamies qui sont immédiatement suivies des méioses et d'une mitose post-méiotique supplémentaire donnant naissance à des asques contenant 8 ascospores ordonnées. Toutes ces étapes de développement sexuel se produisent dans une fructification appelée périthèce (en haut à gauche). Le champignon est aussi capable de différencier des spores de dispersion asexuelle. Il en existe de deux types: certaines sont uninucléées, les microconidies, qui peuvent aussi servir de gamètes mâles, les autres sont plurinucléées et sont appelées les macroconides. Elles accumulent des carotènes orangés (en bas à gauche).

Figure 13 :

 13 Figure 13: Aspergillus nidulans n'a pas de type sexuel et les ascogones engagent seuls le processus sexuel en s'autofécondant. Comme pour Neurospora crassa, la plasmogamie est suivie d'une phase dicaryotique qui permet d'amplifier le nombre d'asques obtenus après un seul évènement de fécondation.La fructification est fermée et s'appelle un cléistothèce (en bas à gauche). Comme Neurospora crassa, Aspergillus nidulans différencie des conidies uninucléées qui assurent une reproduction asexuelle (en haut à gauche, différents mutants de coloration des conidies de Aspergillus nidulans).Le cycle parasexuel, très efficace chez ce champignon permet une alternance de générations haploïdes et diploïdes sans sexualité (encadré bleu). Il débute par une anastomose entre hyphes mycéliens, c'est à dire la plasmogamie de deux cellules haploïdes. L'hétérocaryon résultant peut subir une caryogamie (fusion de noyaux) pour donner des noyaux diploïdes. Ceux-ci sont très instables et redonnent rapidement après pertes aléatoires de chromosomes des noyaux haploïdes. Les recombinants ainsi obtenu vont présenter une mosaïque aléatoire des chromosomes des deux « parents ». Il arrive aussi que des évènements de réparation des dommages à l'ADN conduisent dans le noyau diploïde à des crossing-over mitotiques, ce qui va ajouter à la diversité génétique des recombinants.

Figure 14 :

 14 Figure 14: les individus hermaphrodites de Caenorhabditis elegans produisent des oeufs par autofécondation. Ceux-ci éclosent pour donner naissance à une larve qui subit quatre métamorphoses pour redonner un adulte hermaphrodite. En cas de carence nutritionnelle, les larves L1 peuvent se différencier en forme de résistance dite dauer. Au retour de la présence de nutriments, les larves dauer redonnent des larves L4. Les rares individus mâles sont obtenus spontanément par perte d'un chromosome X. Lorsqu'un hermaphrodite est fécondé par un mâle, la majorité de sa descendance sera issue de fécondation croisée et donc hermaphrodite pour environ 50% et mâle pour 50%.

  Figure 15: le cycle de l'homme est un cycle avec sexes séparés mâles et femelles qui produisent spécifiquement des gamètes mâles (spermatozoïdes) ou bien femelles (ovules).

Figure 16 :

 16 Figure 16: codes pour l'établissement des pédigrees.

Figure 17 :

 17 Figure 17: les fleurs d'Arabidopsis thaliana sont le lieu où se tiennent les méioses. Celles-ci sont suivies de mitoses. Le gamète femelle ou ovule est donc entouré de ses cellules soeurs (6 au total), en particulier la cellule centrale diploïde issue des deux noyaux polaires. Le grain de pollen mâle germe et le noyau haploïde se divise. Un des noyaux obtenus va féconder le noyau de l'ovule femelle, un autre féconde une cellule centrale diploïde qui se retrouve donc triploïde. Dans la graine finale, l'ovule donne naissance à l'embryon et la cellule triploïde donne naissance à l'albumen nourricier.

  "d'organismes" avec lequel il est possible d'effectuer des analyses génétiques : les bactériophages (= phages = virus de bactéries) et les virus. Il existe de nombreux cycles d'infection pour ces virus et je vous renvoie aux cours de virologie pour approfondir vos connaissances. La figure 18 résume deux cycles classiques d'un virus infectant une cellule eucaryote et d'un phage attaquant une bactérie. Les génomes viraux présentent une grande variété de tailles et de structures. Le plus petit, celui du circovirus porcin, ne fait que 1759 nucléotides et code pour trois protéines. Il se présente sous forme d'une molécule d'ADN circulaire simple brin dans les particules virales infectieuses. A l'opposé, le génome du virus géant "Megavirus chilensis" infectant des amibes mesure 1.26 Mb et code pour 1120 protéines. Dans les particules virales, il est sous forme d'ADN linéaire double brin. Les génomes peuvent aussi être linéaires et/ou composés de plusieurs molécules. Enfin, certains ne sont pas fait d'ADN mais d'ARN simple ou double brin, linéaires ou circulaires. Pour faire des analyses génétiques, il est possible de faire des infections virales multiples. Plusieurs génomes viraux sont alors présents dans la même cellule. C'est l'équivalent de croisements. On peut ensuite observer le processus d'infection ou analyser la descendance produite. génétique formelle traitait quantitativement de la manière dont les caractères sont transmis d'une génération à l'autre. Elle a été initiée par Gregor Mendel vers 1860 avec des études sur les pois. Elle a été redécouverte au début du siècle par Hugo de Vries, Carl Correns et Erich

Figure 18 :

 18 Figure 18: cycles d'un virus attaquant une cellule eucaryote à gauche et d'un phage attaquant une bactérie à droite. Les deux suivent les mêmes étapes.

Figure 19 :

 19 Figure 19: les sept caractères analysés par Mendel.

Figure 20 :

 20 Figure20: formalisation des résultats de Mendel lorsqu'il croise des souches qui diffèrent par un seul caractère. Les parents portent deux copies identiques de l'information codant la couleur des pois, soit vert (v) soit jaune (J). En F1, les descendants portent aussi deux copies, une verte provenant du parent vert et une jaune provenant du parent jaune. Le caractère jaune est dominant et donc tous les descendants F1 sont jaunes. L'autofécondation des F1 donne en F2 25% de pois vert et 75% de pois jaunes, ce qui est prédit par le tableau de gamète où chaque information de caractère au une équiprobabilité d'être transmise; dans ce tableau la couleur des cases donne la couleur prédite pour le descendant. Le même tableau permet de prédire qu'un tiers des descendants F2 à pois jaunes, ceux qui sont J/J, donneront par autofécondation une descendance F3 100% à pois jaune et les deux autres tiers, ceux qui sont v/J, donneront une descendance identique à la F1.

Figure 21 :

 21 Figure 21: nombre de facette des yeux de drosophiles pour trois souches (A, B & C) en fonction de la température d'élevage.

Figure 22 :

 22 Figure 22: chez le champignon Podospora anserina, le mutant spod1 est thermosensible pour la production d'ascospores.

Figure 23 :

 23 Figure 23: chez le chien beagle, l'allèle Sp a une expressivité variable, entrainant de grandes fluctuations dans les tâches pie du pelage.

Figure 24 :

 24 Figure 24: résumé des effets d'une expressivité variable et/ou d'une pénétrance incomplète d'allèle sur le phénotype. Plus le rectangle est foncé, plus le phénotype est prononcé.

Figure 25 :

 25 Figure 25: chez le champignon Podospora anserina, la délétion du gène codant le transporteur de potassium PaTrk1 crée une dégénérescence cellulaire uniquement dans une partie des descendants (= pénétrance incomplète) et présente différentes sévérités (= expressivité variable). La souche 1 n'est pas atteinte alors que les souches de 2 à 5 ont des atteintes variables. La souche sauvage présente au contraire toujours le même phénotype.

Figure 26 :

 26 Figure 26: voie de biosynthèse de l'arginine.

Figure 27 :

 27 Figure 27 : l'expérience de Griffiths. Voir texte pour les détails de la démarche.

Figure 33 :

 33 Figure 33: structure des transposons de groupe II.

Figure 34 :

 34 Figure 34: tailles des génomes versus taille des séquences répétées constituées principalement de transposons. • chez les mammifères, plus d'un million de transposons se sont accumulés dans le génome. Ils représentent au moins 35% du génome humain. Les "rétroéléments" L1 (pour line 1) et Alu sont les plus fréquents.

F

  possède aussi plusieurs régions qui permettent son insertion dans le chromosome: il s'agit donc d'un épisome. Nous verrons comment l'utiliser pour la cartographie de gènes dans les bactéries.

Figure 37 :Figure 38 :

 3738 Figure 37: l'épisome F et le mécanisme de conjugaison bactérienne.

Figure 40 :

 40 Figure 40: les plasmides mitochondriaux de Podospora anserina.

Figure 41 :Figure 42 :

 4142 Figure 41: le microsatellite 1D25 de Podospora anserina présente un fort polymorphisme entre les souches S, D, E M, U, et avec la souche T de l'espèce jumelle Podospora comata.

Figure 43 :

 43 Figure 43: une empreinte génétique. Seul un jumeau monozygote aura une empreinte identique.

  Certains polymorphismes affectent plusieurs gènes d'un seul coup. D'autres sont retrouvés regroupés dans différents individus d'une population et se séparent rarement. On ne parle alors pas d'allèles pour ces polymorphismes complexes mais d'haplotypes.

Figure 44 :

 44 Figure 44: évolution des haplotypes mitochondriaux et exemple de l'haplotype L, M, N en Afrique et hors d'Afrique.

  Figure 46: résultats d'un croisement ♀ X^X Y x ♂ XY.

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  Le plus vieux polymorphisme héritable et encore présent dans les collections a été découvert chez la plante Linaria vulgaris par Linnée (celui qui a inventé la nomenclature binomiale), il y a maintenant environ 250 ans! Il affecte la forme des fleurs (figure47). Les analyses génétiques ont montré qu'en F1 d'un croisement normale x peloric, la descendance est normale et qu'en F2, le caractère ségrège de manière quasi mendélienne comme étant dû à un couple d'allèle d'un gène appelé lcyc. Néanmoins, le caractère est plus instable qu'un caractère lié à une mutation traditionnelle et les réversions de la forme peloric vers normale sont assez fréquentes, en particulier sur une même plante qui peut donc présenter un mélange de fleurs normales et de fleurs peloric. Les 2 allèles ont été clonés et aucune différence de la séquence primaire en acide nucléique pouvant expliquer le phénotype n'a été détectée.Des analyses de l'ADN de lcyc avec des enzymes de restriction sensibles à la méthylation ont permis de montrer que dans les individus peloric l'ADN est méthylé alors qu'il ne l'est pas dans les individus normaux. Pour voir l'état de méthylation, on utilise des enzymes de restriction isoschizomères reconnaissant le même site de coupure mais qui sont sensibles différentiellement à la méthylation. Par exemple, MboI coupe l'ADN non méthylé et méthylé alors que Sau3A1 coupe uniquement l'ADN non méthylé, les deux enzymes reconnaissant la séquence GATC. La méthylation de l'ADN est associée à une

Figure 47 :

 47 Figure 47: à gauche Linaria vulgaris et ses deux formes de fleurs: "normale" et "peloric". A droite les mécanismes d'acquisition et de maintien de l'état de méthylation au cours de la réplication de l'ADN via l'action respectivement d'une méthylase de novo qui méthyle l'ADN non méthylé et de méthylases de maintenance dont l'activité consiste à terminer la méthylation d'ADN hémiméthylé.

Figure 48 :

 48 Figure 48: en haut mécanisme de PTGS. Dans le cas du PTGS, le gène endogène (ChsA) est transcrit normalement et le transgène produit, outre des messagers normaux, des ARNs aberrants, le plus souvent partiellement double brin. Ces ARNs double brin sont reconnus par l'enzyme DICER qui les clive en ARNsi d'une vingtaine de nucléotides. Les ARNsi se dissocient et se réassocient avec l'enzyme RISC qui cible les messagers normaux grâce à l'homologie de séquence entre l'ARNsi et le messager et catalyse leur dégradation. Notez que si la reconnaissance est incomplète parce que les séquences ne sont pas parfaitement homologues, cela aboutit à l'inactivation de la traduction plutôt que la dégradation du messager. Le phénomène est probablement amplifié par une ARN polymérase ARN-dépendante (RDRP) qui amplifie la quantité d'ARN aberrants en utilisant l'ARN normal comme matrice, comme cela a été montré chez Arabidopsis thaliana. En bas, pétunia sauvage à gauche et deux souches présentant de la cosuppression au centre et à droite.

Figure 49 :

 49 Figure 49: à gauche, la transmission via les anastomoses et la ségrégation non mendélienne du caractère het-s. A droite, explication du comportement de l'allèle het-s. Après traduction, la protéine het-s est soluble et n'interagit pas avec het-S. En absence de fibre amyloïde, les souches sont donc sous forme hets. L'apparition spontanée d'une première fibre, entraîne de manière autocatalytique l'incorporation de het-s dans la fibre qui interagit alors avec het-S et démasque un domaine de mort cellulaire présent dans het-S.

Figure 50 :

 50 Figure 50: le calcul des fréquences alléliques de la génération n+1 à partir des fréquences de la génération n en absence de phénomènes biaisant la transmission mendélienne des caractères.

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  les mutations thermosensibles ou cryosensibles • les mutations pléiotropes qui affectent plusieurs caractères en même temps etc. Ici nous devons faire la distinction entre deux types de mutations différentes. Dans la nature, il existe grosso modo deux types d'organismes: ceux pour lesquels toute cellule peut assurer sa descendance (exemple: les bactéries, les champignons, les protistes, etc.) et ceux pour lesquels il existe deux types de cellules : les cellules somatiques qui n'assure pas la descendance et les cellules germinales qui assurent la descendance (exemple: les animaux et les plantes supérieures). Dans le premier groupe d'organismes, toute mutation est susceptible de se transmettre à la génération suivante par contre dans le deuxième groupe seule celles affectant la lignée germinale se transmettront à la descendance, ce sont les mutations germinales. Il existe d'autres mutations qui affectent spécifiquement les cellules somatiques dites mutations somatiques.

  seront pas détectés et qui pourront donc donner naissance à des mutations au tour de réplication suivant. Ce phénomène intéresse toute les bases la cytosine (figure 51) mais aussi l'adénine avec l'iminoadénine qui s'hybride avec la cytosine, la thymine avec l'énol-thymine qui s'hybride mieux avec la guanine que l'adénine et la guanine avec l'énol-guanine se s'associe avec avec la thymine en préférence à la cytosine. -La désamination des bases : la cytosine se transforme en uracile qui s'hybride avec l'adénine, l'adénine se transforme en hypoxanthine qui s'hybride préférentiellement avec la cytosine, la guanine en xanthine qui s'associe soit avec la thymine soit avec la cytosine, et la 5-methylcytosine donne de la thymine. -la perte de bases par dépurination et dépyrimidination qui a lieu surtout à pH acide. Dans ce cas, la polymérase ne sait pas quoi ajouter comme base complémentaire… • l'ADN subit aussi d'autres lésions qui sont réparées plus ou moins efficacement. Celles-ci peuvent résulter de la production normale des radicaux libres dans les cellules aérobies. En effet, la chaîne respiratoire génère constamment des radicaux hydroxyl OH°, des ions superoxydes O2-et du

Figure 51 :

 51 Figure 51: les formes cérones et imino de la cytosine s'inter-convertissent spontanément. La forme cétone s'apparie avec la guanine, la forme imino plus rare avec l'adénine conduisant potentiellement à des mutations si ce phénomène se produit pendant la réplication.

  évident que les cellules ont de multiples mécanismes pour éliminer les dommages que subit l'ADN, mais les mécanismes de réparation ne sont pas parfaits, surtout si les altérations se sont produites juste avant la réplication et/ou qu'elles sont présentes en trop grands nombres et que les systèmes de réparation sont débordés. De même, les dommages qui affectent un seul des deux brins de l'ADN peuvent être facilement réparés alors que ceux qui affectent les deux brins le seront plus difficilement, en particulier chez les cellules haploïdes, car chez les cellules diploïdes, il existe des mécanismes qui vont utiliser la copie intacte d'ADN pour réparer la copie endommagée. Des mutations peuvent alors se produire à cause de mauvaises réparations ou par "erreurs de réplication" faites par la polymérase. L'apparition des mutations, bien que rare, est donc un phénomène spontané et continuel.Néanmoins, leur fréquence peut être augmentée par la présence d'agents mutagènes. L'analyse détaillée des multiples mécanismes moléculaires de réparation des dommages à l'ADN est en dehors du cadre de ce livre et je vous renvoie vers des cours de biologie moléculaire pour en savoir plus. Nous reviendrons cependant au cours de l'étude de la recombinaison sur certains mécanismes de réparation car les deux phénomènes sont liés et partagent les mêmes acteurs moléculaires.

  Prenons l'exemple qu'étudiait Salvator Luria et Max Delbrück (1943) et qui a permis d'apporter la première démonstration que les mutations apparaissent spontanément avant le traitement qui permet de les révéler. Ces chercheurs étudiaient la résistance d'Escherichia coli B au phage α. Pour révéler les bactéries résistantes, ils mettaient en cultures des bactéries sensibles, les laissaient pousser, puis ajoutaient des phages et étalaient la culture sur des boites de Petri. Seules les bactéries résistantes donnaient naissance à des colonies (facilement comptables !). Ils essayaient de mesurer la fréquence d'apparition de bactéries résistantes au phage et observaient de grandes fluctuations dans leurs résultats. Ils ont raisonné justement que cette fluctuation était en fait due à l'apparition stochastique des mutations et pourrait donc permettre de trancher entre les deux hypothèses du moment: Hypothèse I: les mutations sont induites avec une certaine probabilité dans la bactérie par le contact avec le phage. En d'autre terme, il existe une petite probabilité qu'une bactérie résiste à l'attaque d'un phage et si elle résiste, elle et ses descendants acquièrent alors une immunité contre le phage.Hypothèse II: les mutations de résistance apparaissent dans la bactérie spontanément avec une probabilité fixe avant leur exposition au phage.Dans le cas de la première hypothèse, l'étalement de cultures indépendantes de bactéries traitées par le phage devrait donner toujours la même quantité de bactéries résistantes qui dépend de la probabilité que la bactérie résiste au phage. Comme celle-ci est très petite et l'effectif est très grand, la loi de probabilité attendue est donc une loi de Poisson qui a pour caractéristique que sa moyenne égale sa variance. Au contraire, dans le cas de la deuxième hypothèse, le moment d'apparition des mutations va varier en fonction des cultures, entraînant une grande différence entre les cultures ou l'évènement a eu lieu tôt et ceux où il a eu lieu tard (figure52). Dans ce cas, la variance sera très supérieure à la moyenne. Pour éliminer un biais expérimental de mortalité différentielle liée aux conditions expérimentales, une culture contrôle est aliquotée sur plusieurs boites: normalement le nombre de bactéries résistantes doit dans ce cas suivre une loi de Poisson.

Figure 52 :

 52 Figure 52: le principe du test de fluctuation de Luria et Delbrück.

Figure 53 :

 53 Figure 53: le principe de l'expérience des époux Lederberg. Une culture de bactéries sensibles est étalée sur du milieu avec (+ streptomycine) ou sans antibiotique (-streptomycine). Sur le milieu + antibiotique (boite n°1), des bactéries résistantes génèrent des colonies contenant des millions d'individus résistants. S'ils sont étalés sur du milieu avec de l'antibiotique, chacun de ces descendants résistants va former de nouvelles colonies (boite n°2), montrant l'héritabilité de la mutation conférant la résistance. Sur le milieu sans antibiotique (boite n°3), toutes les bactéries qu'elles soient résistantes ou sensibles donnent naissance à des colonies. Joshua et Esther Lederberg ont utilisé la méthode des répliques au velours pour former une copie de ces colonies sur du milieu avec de la streptomycine (boite n°4). Le tissu de velours permet en effet de prélever une partie des cellules des colonies s'il est appliqué sur la boite n°3 et de transférer ensuite une fraction de celles-ci sur du milieu frais par simple contact. Seules les colonies contenant des individus résistants vont alors donner naissance sur la boite n°4 à des nouvelles colonies.Comme précédemment, si ces descendants sont de nouveau étalés sur du milieu avec de l'antibiotique (boite n°5), ils vont tous donner naissance à de nouvelles colonies. Il est maintenant simple de savoir si la mutation de résistance à la streptomycine de la boite n°4 est apparue avant le contact des bactéries avec l'antibiotique. En effet, la colonie de la boite n°3 qui a donné naissance à la colonie résistante de la boite n°4 n'a jamais vu l'antibiotique. Contenant des bactéries déjà résistantes, leur étalement sur du milieu avec antibiotique donnera naissance à des colonies nombreuses (boite n°6). Un témoin avec une colonie qui n'a pas donné naissance à une colonie résistante sur la boite n°4 confirme qu'aucune des bactéries qui la composent n'est résistante (boite n°7). Le résultat de ce test a toujours conduit à la conclusion que les bactéries résistantes détectées sur la boite n°4 étaient en fait déjà présentes sur la boite n°3.

  ) par ce fait, ils ont été avantagés par rapport à ceux qui en étaient dépourvus au niveau de leur reproduction, probablement parce que les yeux leur permettaient une meilleure connaissance du milieu alentour. Notez que le débat fait toujours rage pour savoir si cette évolution est obligatoirement progressive (c.a.d. que l'établissement de l'oeil résulte de la succession de plusieurs mutations) ou s'il est possible de faire des sauts (c.a.d. qu'un "protooeil" efficace est apparu à la suite d'une seule mutation).

Figure 54 :

 54 Figure 54: en haut, structure du cluster des β-globines et du gène de la β-globine; en bas, tables répertoriant les polymorphismes et mutations des différents gènes de globines (à gauche) et plus particulièrement de ceux du gène de β-globine (à droite).

  transversions les changements de purines en pyridmidines (ou pyrimidines en purines). Ces mutations sont générées par de nombreux mécanismes différents. En fonction de leurs localisations, elles vont avoir des effets différents sur l'expression des gènes. Prenons des exemples dans le cas du gène de la βglobine humaine (figure 54). Ce gène fait partie d'un des deux clusters de gènes codant des sous-unités de l'hémoglobine et de nombreux polymorphismes sont connus dans ces gènes (figure 54, pour un catalogue exhaustif, je vous invite à aller visiter le site http://globin.cse.psu.edu/). Chez l'homme, il est très rare d'observer l'apparition de novo de mutations. La plupart des variations dans ce gène sont silencieuses. Cependant comme environ 200 allèles différents allèles de ce gène provoquent des βthalassémies, maladies qui sont clairement délétères pour les individus qui sont affectés, on considère que ces allèles dérivent par mutations d'un allèle sauvage.

Figure 55 :

 55 Figure 55: effets des transitions et des transversions sur le fonctionnement des protéines.

Figure 56 :

 56 Figure 56: effets potentiels des frameshifts sur le fonctionnement des protéines.

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  Chez la souris, l'insertion d'un rétroélément IAP (intracisternal-A particle) dans un exon non codant, en 5' du gène Agouti dérégule l'expression de la protéine ce qui conduit à des souris à poil jaune. cette mutation est bien évidemment dominante.Les excisions de transposons peuvent aussi conduire à des changements de phénotypes. Par exemple, si un gène est dérégulé par la présence d'un transposon dans son promoteur ou un de ses introns, l'excision du transposon peut conduire à un retour à une expression sauvage. Néanmoins, la majorité des transposons laissent des cicatrices après leur excision, souvent une duplication de quelques paires de bases. L'excision de transposons présents dans des séquences codantes peut donc aboutir à des frameshifts, ce qui souvent ne permet pas une restauration d'un phénotype sauvage. Si l'ADN ajouté est un multiple de trois bases, cela peut aboutir à l'ajout d'un ou plusieurs acides aminés, et donc éventuellement une restauration d'un phénotype sauvage ou proche du sauvage.

98 Figure 59 :

 9859 Figure 58: comparaison entre les sept chromosomes nucléaires des génomes de Podospora anserina (en haut) et Podospora comata (en bas). En rouge, les séquences très similaires, en bleu les séquences inversées ou transloquées et les triangles blancs représentent des indels. Les points verts sont les centromères.

Figure 61 :

 61 Figure 61: un crossing-over entre une région inversée sur les deux chromosomes homologues d'un diploïde aboutit à deux chromosomes défectueux manquant des gènes (G, E et F pour le chromosome en haut, A et B pour celui du bas) et qui produiront vraisemblablement des gamètes incapables d'engager une fécondation réussie. La présence de deux centromères pour un des chromosomes et l'absence decentromère pour l'autre conduiront aussi à une mauvaise ségrégation en mitose et la perte rapide des chromosomes.

Figure 62 :

 62 Figure 62: croix de translocation en première division de méiose. Chaque chromosome 1 ou 2 a autant de chance de partir avec l'autre chromosome initial ou transloqué. Si les deux chromosomes initiaux partent ensembles en première division (les deux chromosomes transloqués partiront donc aussi ensembles), les gamètes produits seront viables. Au contraire, si un chromosome initial migre avec un chromosome transloqué, les 4 gamètes produits seront nonviables car dans chacun des noyaux finaux, il manquera un morceau de chromosome.

Figure 64 :

 64 Figure 64: phylogénie globale du monde cellulaire.

Figure 65 :Figure 66 :

 6566 Figure 65: le génome de Escherichia coli, un génome procaryote circulaire typique. En bleu, les séquences codant pour des protéines.Les gènes sont proches les uns des autres et organisés en opéron (notez la position des gènes sur les brins d'ADN; les gènes proches sont souvent sur le même brin, ce qui indique la présence probable d'un opéron). Il n'y a pas d'introns; En fait, il en existe néanmoins quelques-uns qui ont des structures différentes de celles présents dans les génomes nucléaires des eucaryotes.

Figure 67 :

 67 Figure 67: le génome de Saccharomyces cerevisiae. Chez cette espèces, les introns sont rares (indiqués par les flèches rouges) et de petite taille (souvent quelques dizaines de nucléotides; voir le gène en bas qui contient un intron). Les séquences intergéniques sont aussi de petites tailles (quelques dizaines à quelques centaines de nucléotides).

Figure 68 :

 68 Figure 68: le génome de Podospora anserina. Chez cette espèce, les gènes contiennent plus d'introns (souvent un à deux par gène), mais ils sont toujours de petite taille (entre 50 et 100 nucléotides). les régions intergéniques, bien qu'un peu plus grandes que chez saccharomyces cerevisiae sont toujours petites (souvent de l'ordre d'un kb ou moins). On note la présence de transposons (boites colorées) et de pseudogènes en rouge.

Figure 69 :

 69 Figure 69: le génome humain. Dans notre génome, les introns sont très nombreux (>10/gènes), très grands (>5-10 kb) et les régions intergéniques peuvent aussi être très grandes (>50 kb), expliquant la grande taille du génome, bien qu'il ne contienne probablement que deux fois plus de gènes que Podospora anserina pour un génome 100 fois plus grand! La plus grande partie du génome est constitué de relique de transposons inactifs (pseudogénisés). Chez l'homme le plus grand gène mesurerait 2.474 Mb!

Figure 71 :

 71 Figure 71: pan génomes en vert et core génomes en rose de quatre champignons: pour le pan génome les chiffres entre parenthèse indiquent les nombres maximum et minimum de gènes additionnels trouvés dans les différentes souches.

Figure 72 :

 72 Figure 72: démarches suivies au cours des analyses de génétique classique ou inverse. Pour la génétique classique, la démarche démarre par la recherche de mutants sur des critères phénotypiques intéressants pour le processus étudié (mutants d'auxotrophie pour la biosynthèse des acides aminés, mutants de longévité pour le vieillissement, mutants arrêtés à une étape embryonnaire pour l'analyse du développement, etc.); c'est ce l'on appelle une mutagenèse qui aboutit à l'obtention de mutants indépendants. Il faut ensuite caractériser les mutations par les méthodes de la génétique classique. Ensuite, les différents gènes ainsi identifiés par des mutations et qui interviennent dans le processus sont clonés par des démarches de génétique moléculaire (clonage positionnel, par expression fonctionnelle ou séquences complètes des génomes mutants). La formulation de modèles passe par la caractérisation fine des mutants qui fait appel aux méthodes de la biochimie et biologie moléculaire, de la cytologie, de la génétique des interactions afin d'obtenir des mutants supplémentaires, et éventuellement de la génétique inverse pour vérifier certaines hypothèses. La génétique inverse consiste dans l'obtention par les techniques de l'ADN recombinant in vitro de mutations spécifiques dans des gènes dont on connait la séquence mais généralement pas le rôle, et la réintroduction de ceux-ci par transformation ou transfection dans un organisme afin d'obtenir des mutants de ces gènes; les effets obtenus sont ensuiteanalysés par les mêmes techniques que ceux obtenus par mutagenèse classique afin de formuler des modèles de fonctionnement. Ceci aboutit souvent à l'identification de nouveaux gènes candidats qui vont pouvoir à leur tour être analysés par génétique inverse.

  Figure 75: mécanisme principal de transformation chez Saccharomyces cerevisiae. Le passage de la paroi n'est pas encore clairement expliqué. Il n'est pas exclu qu'il existe une autre voie mineure d'entrée.

Figure 76 :

 76 Figure 76: plasmide typique utilisé pour transformer des cellules eucaryotes via Agrobacterium tumefaciens. Le plasmide porte un marqueur de sélection (résistance) qui permet la sélection à la fois dans Escherichia coli et dans Agrobacterium tumefaciens. Une origine de réplication permet la réplication dans Escherichia coli et une autre la réplication dans Agrobacterium tumefaciens. La région STA assure la stabilité du plasmide dans Agrobacterium tumefaciens. Ces régions vont permettre d'amplifier le plasmide dans un premier temps en utilisant Escherichia coli et dans un second de le transférer dans Agrobacterium tumefaciens. La région transférée dans la cellule eucaryote est délimitée par deux frontières de séquences spécifiques. Entre ces deux frontières sont introduits un marqueur de sélection qui fonctionne dans l'organisme à transformer (un gène de résistance à un antifongique ou un herbicide par exemple) et des sites de clonage multiple qui vont permettre d'insérer les cassettes. L'ADN est donc transféré sous forme linéaire double brin.

Figure 77 :

 77 Figure 77: la transformation par biolistique. A gauche la machine et à droite son principe de fonctionnement. Les paramètres à optimiser incluent la vitesse d'éjection (qui se règle en faisant varier la finesse (=solidité) de la membrane), la nature des billes (or ou tungstène, diamètres plus ou moins grands mais de l'ordre du micron), et le protocole de fixation de l'ADN sur les billes (tampon utilisé…).

Figure 78 :

 78 Figure 78: le Double Strand Break Repair entraîne soit la production de conversions soit de crossing over. Lorsqu'un ADN subit une cassure double brin, il peut être réparé en utilisant une molécule d'ADN homologue, c'est à dire possédant la même séquence. Cela peut être le cas dans une cellule diploïde et dans ce cas la deuxième copie peut servir de matrice.Mais c'est aussi le cas après réplication chez les bactéries et les eucaryotes haploïde (en phase G2). Éventuellement, une séquence homologue/homéologue située ailleurs dans le génome peut être utilisée, ce qui conduira à un réarrangement (voir figure 60). La réparation commence par la résection simple brin au niveau de la cassure par une nucléase spécifique et la reconnaissance et l'appariement des deux séquences. Puis, l'ADN du brin intact est ouvert et la portion simple brin d'une des deux extrémités libre du brin à réparer vient s'hybrider avec le brin intact. Le remplissage des "trous" par une polymérase et la fermeture dessimples-brins par une ligase conduit à une structure possédant deux jonctions de Holliday. Cette double jonction est résolue par une résolvase et conduit en fonction de l'action de la résolvase au niveau de chaque jonction soit à une conversion soit à un crossing-over (voir figure79). Les enzymes impliqués dans ce mécanismes sont très conservés au cours de l'évolution: système RecA,B,C,D chez les bactéries et gènes rad/XP/ERCC chez les eucaryotes.

Figure 79 :

 79 Figure 79: la résolution de la jonction de Holliday se fait par deux nouvelles coupures des simples brins. Suivant la position de ces coupures on aura ou non échange de séquences flanquantes. Par exemple, s'il y a coupure et raboutage des deux brins qui ont subi l'échange (flèches orangées), il n'y aura pas de crossing-over visible et seul un très petit fragment est échangé sur un seul brin. En revanche si les deux coupures ont lieu sur les deux brins qui n'ont pas subi l'échange (flèches roses), un crossing-over se produira.

Figure 80 :Figure 81 :

 8081 Figure 80: modes d'intégration d'ADNs exogènes par recombinaison homologue.

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  La recombinaison "site-spécifique" La recombinaison site-spécifique, comme son nom l'indique, se fait entre deux séquences spécifiques, souvent identiques. Elle nécessite un couple d'acteur comprenant une recombinase et un site de reconnaissance sur l'ADN au niveau duquel elle coupe. Ce type de système a souvent évolué dans des systèmes viraux ou épisomiques pour catalyser l'intégration de l'ADN infectieux dans le génome, ce qui au cours de l'évolution permet leur maintien fidèle au cours des générations. Il en existe plusieurs exemples dont certains sont mis à profit en génétique moléculaire pour faire de la recombinaison dirigée, comme le système de l'intégrase Int/xis et les sites attB/attP pour l'insertion du phage λ dans le chromosome d'Escherichia coli, et surtout la recombinase Cre et son site de reconnaissance site loxP qui dérivent du phage P1 (système CRE/LOX) et la "flipase" FLP du plasmide 2µ de Saccharomyces cerevisiae et son site FRT (système FLP/FRT). La taille des sites de reconnaissance est en général variable mesurant de quelques paires de bases à quelques dizaines de paires de bases; notez que que les sites FRT et loxP mesurent la même taille de 34 pb et ont la même structure car ils sont constitués de deux régions 133 palindromiques de 13 bp séparée par un espace de 8 pb ou spacer (figure 82). Deux sites FRT sont en positions inversées sur le plasmide 2µ. La recombinaison permet donc d'inverser une région du plasmide (figure 82). Dans le cas de loxP, la recombinaison permet d'intégrer inefficacement P1 dans le chromosome d'Escherichia coli à un site variant appelé loxB (figure 82). Par contre, la recombinaison entre deux sites loxP est très efficace.

Figure 82 :Figure 83 :

 8283 Figure 82: les systèmes CRE/LOX et FLP/FRT. En haut, les sites reconnus FRT et loxP. En bas, les réactions catalysées naturellement par FLP et CRE.

  allèles nuls. La technologie utilisée dépend de l'organisme et de ses propriétés biologiques. La première méthode mise au point consistait à transformer la cellule avec une molécule d'ADN circulaire portant un petit morceau du gène à inactiver pour obtenir ce que l'on appelle une disruption (figure 83). Cependant, ce type de mutation peut dans certains cas ne pas être nul car un petit morceau de la protéine est 135 fabriquée. Il est donc conseillé de faire plutôt un remplacement de gène (figure 83) ce qui implique la transformation avec un fragment d'ADN linéaire et deux crossing-over. Dans les deux cas, il faut sélectionner les transformants, ce qui est fait le plus souvent grâce aux deux systèmes de sélection présentés ci-dessus et qui sont pour rappel: • la présence dans l'ADN à transformer d'un marqueur de résistance à une substance toxique et l'utilisation comme réceptrice d'une souche sensible à cette substance. Les transformants sont sélectionnés sur leur résistance.

Figure 84 :

 84 Figure 84: remplacement de gènes chez Saccharomyces cerevisiae en utilisant le marqueur d'auxotrophie à l'uracile URA3. Il est possible de faire le remplacement directement sur une souche haploïde mais si le gène est essentiel, aucun mutant ne sera obtenu. Il est donc conseillé comme sur le schéma de transformer avec la cassette de remplacement une souche diploïde. Dans ce cas, une seule des deux copies est remplacée car le remplacement simultané des deux copies est extrêmement rare. Les transformants sont sélectionnés sur leur retour à la prototrophie alors que la souche de départ est auxotrophe pour l'uracile.L'efficacité du remplacement est telle que seule une vérification par PCR est nécessaire pour s'assurer que le remplacement a bien été fait. Pour ceci, il faut utiliser des amorces situées à l'extérieur de la région d'homologie utilisée pour faire le remplacement (amorces 1 et 2). Seuls les transformants ayant un remplacement correct donneront des bandes de tailles connues en utilisant les couples d'amorces 1+3 et 2+4. Une méiose permet d'obtenir des tétrades. Si les 4 ascospores sont viables alors le gène n'est pas essentiel. Si seulement les deux spores URA3-sont viables alors le gène est

  pour tous les gènes non essentiels chez de nombreuses bactéries dont Escherichia coli, Bacillus subtilis ou encore Acinetobacter baylyi.Enfin, il est possible de raffiner ces méthodes (figure87), en particulier chez la souris chez qui il est possible de fabriquer des souches où le gène à déléter est entouré de sites loxP. L'action de la recombinase CRE est alors contrôlée spécifiquement dans un tissu grâce à un promoteur spécifique ou par l'ajout d'une molécule provoquant la délétion seulement dans un tissu ou au moment voulu.

Figure 86 :Figure 87 :

 8687 Figure 86: remplacement de gènes chez Bacillus subtilis. Voir texte pour le détail de la stratégie.

Figure 90 :

 90 Figure 90: modification de gènes utilisant une co-transformation.

Figure 92 :

 92 Figure 92: la mutagenèse insertionnelle par transposition chez les champignons. La souche de départ contient un transposon modifié contenant un marqueur de résistance bactérien et une origine de réplication fonctionnelle chez Escherichia coli. Il est inséré entre le promoteur et la séquence codante du gène nia codant pour la réductase des nitrates. Elle contient aussi la transposase sous le contrôle d'un promoteur modulable. Du fait de l'insertion du transposons, le gène nia n'est pas exprimé; la souche est donc incapable d'utiliser le nitrate comme source d'azote (elle est aussi résistante au chlorate ce qui a permis de sélectionner l'insertion du transposon dans le gène nia). L'expression de la transposase est induite via le promoteur modulable. Elle permet l'excision du transposon, ce qui est facilement sélectionnable en recherchant les souches capable d'utiliser le nitrate comme source d'azote. Dans une large fraction de ces souches excisées, le transposon s'est réinséré au hasard dans le génome. L'identification de la région dans laquelle le transposons s'est réinséré est facile grâce au marqueur de résistance bactérien et à l'origine de réplication (voir figure 84).

Figure 93 :

 93 Figure 93: la transformation et la mutagenèse par transposition de l'élément P chez la drosophile. Deux plasmides différents sont co-injectés dans des oeufs de drosophile 1h à 1h30 après la ponte, à l'aide d'un micromanipulateur. Un porte un transposon modifié, l'autre la source de transposase produite via un promoteur fort. A cet âge les embryons sont sous forme de syncytium. Le transposon modifié porte au minimum un site de clonage et un marqueur de transgénèse (ici le gène white, la souche réceptrice étant alors mutante white avec des yeux blancs et de type M, c'est à dire dépourvue de l'élément P), placés entre les pieds de l'élément P. Le plasmide portant le gène de la transposase pénètre dans les noyaux, y est transcrit et ensuite l'ARNm produit est traduit dans le cytoplasme syncytial de l'embryon. La transposase entre dans les noyaux des cellules souches à l'origine de la lignée germinale en même temps que le plasmide contenant le transgène; elle catalyse à la fois la coupure du plasmide vecteur contenant le transgène au niveau des "pieds de P" et de l'ADN chromosomique au hasard, et y insère le transgène. Le transfert de gènes est accompli avec une efficacité raisonnable qui fait que l'inspection visuelle des mouches provenant des oeufs injectés est suffisante pour obtenir des embryons avec des yeux rouges dans lesquels le transposon s'est inséré avec succès. Le transposons transféré est alors stable et se transmet fidèlement aux générations suivantes. La transposase fortement exprimée peut aussi être

Figure 94 :

 94 Figure 94: deux méthodes pour identifier les sites d'insertion. En haut, si la séquence insérée contient un marqueur bactérien de résistance à un antibiotique et une origine de réplication (voir figure 92 et 93), il suffit de couper l'ADN génomique de la souche d'intérêt porteuse de l'insertion avec un enzyme de restriction qui ne coupe pas dans l'ADN inséré et de religuer les ADN. Le mélange est ensuite transformé dans Escherichia coli. Seul le plasmide porteur de l'origine de réplication va pouvoir se propager dans la bactérie. Il rendra les bactéries résistantes à l'antibiotique et pourra facilement être purifié et séquencé. En bas, si les régions permettant un clonage dans une bactérie ne sont pas présentes, il suffit de faire une "PCR inverse". Pour ceci, il faut couper l'ADN de la souche porteuse de l'insertion par un enzyme de restriction et recirculariser l'ADN avec une ligase. Une amplification par PCR avec des amorces judicieusement placées permet d'amplifier un fragment d'ADN contenant la jonction.

Figure 95 :

 95 Figure 95: en haut, structure des cassettes de délétion; les uptag et downtag sont des séquences de 20 pb spécifiques à chacune des délétions. Elles permettent donc d'amplifier spécifiquement les jonctions des délétions dans un mélange en utilisant les couples d'amorces rouge ou bleu. Les régions en bleu de part et d'autre des uptag et downtag sont communes à toutes les délétions et permettent d'amplifier les délétions marquées pour le séquençage à haut débit. En bas, en partant d'un mélange où chaque souche mutante est présente en même quantité, l'application d'une sélection va modifier les proportions des différentes souches en fonction du rôle de chacun des gènes délétés. Il est simple de savoir les souches favorisées ou défavorisées en analysant l'ADN du mélange final en comparaison avec celui du mélange initial, soit par hybridation sur micropuces des uptag et downtag, soit par séquençage à haut débit en utilisant les régions communes à toutes les délétions pour amorcer les réactions.

Figure 96 :

 96 Figure 96: en haut, crible de sélection positif pour sélectionner des mutants résistants; en bas, crible de sélection négatif pour sélectionner des mutants hypersensibles.

  La sélection de mutations qui affectent la régulation par la lumière bleue chez Neurospora crassa Parfois, le criblage de mutations passe par la construction d'outils appropriés. Examinons plus en détail un exemple très élégant chez le champignon filamenteux Neurospora crassa qui présente un rythme circadien de la production de conidies. Ce rythme est contrôlé par la lumière dans la zone du spectre qui donne la lumière bleue. Des gènes régulés par la lumière bleue ont été isolés et deux premiers gènes de régulation avait été identifiés (wc-1 et wc-2). Il semblait aux expérimentateurs que plusieurs gènes de régulation devaient encore être identifiés. Pour ceci le système décrit sur la figure 98 a été mis au point. Ce système fourni deux cribles de sélection positifs : • Premièrement, Il est possible de cribler des mutants qui poussent sur milieu + tryptophane dans le noir. Ces mutants ont une expression constitutive à partir du promoteur al-3. Avec ce système, il est Philippe Silar Génétique : Concepts de Base et Notions Approfondies 157 donc facile d'obtenir des mutations dans des répresseurs de al-3. C'est ainsi qu'a été obtenu le gène ccb-1 qui semble être un répresseur de certains gènes régulés par la lumière. • Deuxièmement, il existe un analogue toxique de la phénylalanine, la p-fluorophenylalanine qui entre dans la cellule via le transporteur mtr. La croissance des transformants est donc inhibée à la lumière si l'on met de la p-fluorophenylalanine dans le milieu. Ceci donne un deuxième moyen de sélection positif. Il suffit de sélectionner des mutants qui poussent dans ces conditions. Ceux-ci n'expriment plus mtr à partir du promoteur al-3. Il est de plus possible de faire varier la quantité de pfluorophenylalanine, ce qui permet d'obtenir des mutants ayant des effets plus ou moins importants. Les cibles des mutations dans ce cas sont donc des activateurs d'al-3. Comme prévu, les gènes wc-1 et wc-2 ont été retrouvés en utilisant ce crible et c'est ainsi qu'ont été identifiés deux nouveaux gènes blr-1 et blr-2. Ces deux gènes ont des effets moins importants que wc-1 et wc-2 qui semblent être les seuls gènes dont les mutations rendent les souches complètement aveugles à la lumière bleue.

Figure 98 :

 98 Figure 98: mise au point d'un crible de sélection de mutants de régulation par la lumière chez Neurospora crassa. Le promoteur du gène al-3 qui est régulé par la lumière a été fusionné à la séquence codante du gène mtr. Ce gène code une perméase qui permet l'entrée de certains acides aminés dont le tryptophane et la phénylalanine. Une souche mtr -et trp -est transformée avec cette construction. Les transformants obtenus peuvent pousser sur du milieu + tryptophane que si le champignon est éclairé ! Deux types de cribles positifs vont pouvoir être menés (voir texte).

Figure 99 :

 99 Figure 99: l'obtention des mutants est la première étape de l'analyse génétique.

  issue d'une mutagenèse, on dispose d'une collection d'allèles mutants. Dans ce chapitre, nous partons du fait que chacun des mutants analysés obtenus porte une seule mutation indépendante de celles présentes dans les autres mutants. Pour voir comment déterminer si une seule mutation est bien à l'origine du phénotype, il suffit d'appliquer les règles de ségrégation de Mendel. Nous reviendrons sur ce point dans le chapitre suivant. En général, ces allèles confèrent le même phénotype. La question se pose alors de savoir combien de gènes sont mis en jeu pour obtenir cette collection d'allèles. La génétique a développé des méthodes qui permettent de répondre à cette question dont le test de complémentation qui est le plus rapide à mettre en oeuvre. Son application permet d'avoir une bonne idée du nombre de gènes. Le test consiste dans la fabrication d'une souche pour laquelle les allèles mutants sont associés deux à deux en configuration trans et en l'observation du phénotype (figure 100). Pour ceci, il suffit de croiser les mutants entre eux et de regarder le phénotype de souches F1 diploïdes obtenues.

Figure 100 :

 100 Figure 100: principe du test de complémentation. • Si les deux allèles sont allèles d'un même gène, cela aboutit au schéma de gauche de la figure 100. Dans ces conditions, aucun allèle sauvage n'est présent dans la souche et l'on peut raisonnablement suspecter que le phénotype de la souche sera mutant.

L

  'application du test se fait différemment en fonction du type d'organisme. En effet, la construction des souches est simple si on est chez un organisme diplobiontique ou haplodiplobiontique. Il suffit dans ce cas de croiser des parents purs pour chacun des allèles mutants et d'observer la F1 ou les diploïdes produits. Chez les organismes haplobiontique, comme Podospora anserina, ou dans les cellules en culture, il est souvent impossible de fabriquer des noyaux diploïdes. On a donc comme expliqué ci-dessus recourt à la fabrication d'hétérocaryons. Mais les résultats obtenus sont plus aléatoire. En effet, dans un noyau diploïde, les allèles sont certainement présents à l'état "hétérozygotes" avec un nombre fixe de copies. Chez les hétérocaryons, le rapport des noyaux peut varier, voire à l'extrême un des deux types de noyau peut se perdre. La construction d'hétérocaryons dit balancés peut compenser ceci. Un des noyaux possède un marqueur d'auxotrophie ou de résistance à un antibiotique. L'autre possède un autre marqueur d'auxotrophie ou une autre résistance. Par exemple, chez Podospora anserina, on dispose d'une souche leu1-1 qui est auxotrophe pour la leucine et d'une souche lys2-1 qui est auxotrophe pour la lysine. On sait que si l'on forme un hétérocaryon leu1-1/lys2-1, celui pousse sur milieu minimum (figure 101). Cela veut donc dire que les deux mutations complémentent et qu'elles affectent des gènes différents, ce que l'on pouvait présager! Ceci permet donc de conserver les deux types de noyaux. Si l'on veut tester la complémentation de deux mutations m1 et m2, il suffit de construire l'hétérocaryon (leu1-1, m1)/(lys2-1, m2) et de le faire pousser sur milieu minimum. Celui-ci conservera les noyaux avec m1 et ceux avec m2. Dans certains systèmes génétiques et il est difficile de maintenir les mutations en position trans à cause des recombinaisons. Cela aboutit à la formation de configurations où les mutations sont en positions cis (figure 102). On ré-obtient donc dans ce cas un allèle sauvage qui a toutes les chances de conférer un phénotype sauvage et ceci bien que les 2 mutations soient initialement dans le même gène. Les génomes mitochondriaux et plastidiques sont sujets à ce type d'évènement. Par exemple, dans le génome mitochondrial de levure, la recombinaison est très rapide. Si l'on veut tester la complémentation de mutations mitochondriales affectant la respiration, il faut donc procéder comme décrit dans la figure 103 à gauche. En effet, le protocole décrit dans la figure 103 à droite va entraîner la sélection des recombinants sauvages et non pas celle des diploïdes où se produit la complémentation: Des problèmes similaires peuvent se rencontrer dans le cas de l'étude des mutations dans des phages ou des virus.

Figure 102 :

 102 Figure 102: réassociation de mutations de positions trans en position cis via un crossing-over.

Figure 101 :

 101 Figure 101: principe de la complémentation dans les hétérocaryons balancés.

Figure 103 :Figure 104 :

 103104 Figure 103: le protocole de gauche teste la complémentation; celui de droite la recombinaison.

Figure 105 :

 105 Figure 105: absence de complémentation de mutations récessives dans les gènes impliqués dans la caryogamie.

Figure 106 :

 106 Figure 106: absence de complémentation entre mutations dans des gènes codants des composants de complexes hétéromultimériques.

  Le terme de complémentation n'est pas restreint à la génétique formelle et est utilisé dans un contexte différent par d'autres biologistes. Dans tous les cas, il s'agit de restaurer un état sauvage dans un mutant.•Le terme a été coopté par les biochimistes, pour identifier une protéine responsable d'une fonction particulière. Par exemple, le groupe de Kornberg qui travaillait sur l'initiation de la réplication chez Escherichia coli, disposait de mutants d'initiation de la réplication(dnaB, etc.). Le groupe avait aussi un test d'initiation in vitro à partir d'un extrait acellulaire de la souche sauvage. Pour identifier les protéines affectées dans les différents mutants, par exemple dnaB. Les chercheurs du groupe ont fait un extrait acellulaire de la souche mutante dnaB et ont montré qu'il ne permettait pas la réplication in vitro.Ils ont ensuite fractionné l'extrait acellulaire issu de la souche sauvage et ont ajouté séparément les différentes fractions à leur extrait de dnaB. Ils ont ainsi pu caractériser la fraction qui contenait la protéine dnaBp sur le critère de restauration de l'initiation de la réplication. On dit qu'ils ont identifié par complémentation in vitro la protéine dnaB. Des fractionnements successifs de ce type ont ainsi permis de purifier différentes protéines impliquées dans l'initiation de la réplication chez Escherichia coli. • Le terme a aussi été co-opté par les généticiens moléculaires, pour le clonage des gènes par expression, qui est un terme plus correct que le terme de clonage par complémentation. Lorsque l'on dispose d'une souche qui n'exprime pas un caractère (parce qu'elle contient un allèle mutant d'un gène ou parce que l'organisme ne possède pas le gène), il est possible de trouver des gènes qui restaurent le caractère. Il faut pour cela fabriquer une banque à partir d'une souche qui présente le caractère et transformer la souche qui ne le possède pas. L'isolement de transformants qui ont le caractère recherché permet de conclure que ceux-ci contiennent un fragment d'ADN qui restaure le caractère et donc le gène responsable (attention, il peut aussi s'agir de réversions). Par exemple, nous avons déjà vu ce principe pour les plasmides contenant un gène capable de restaurer la prototrophie à des mutants et qui sert de marqueur de sélection. Voici un autre exemple tiré de mon laboratoire. Nous possédons des souches qui ne différencient plus de périthèces (organes femelles) à cause de la présence d'un allèle mutant du gène IDC1. Nous voulions cloner l'allèle sauvage du gène. Pour ceci nous disposions d'une banque de cosmides fabriquée à partir de la souche sauvage. Nous avons transformé la souche mutante IDC1 par les cosmides de cette banque. Nous avons testé la fertilité des transformants et avons trouvé un transformant qui était fertile. Celui-ci avait intégré l'ADN qui contenait l'allèle sauvage du gène IDC1. Nous disons donc que nous avons cloné par complémentation ou par expression le gène IDC1 + . Notez que pour que ce type de clonage marche, il faut que la souche réceptrice porte l'allèle récessif et la banque contiennent l'allèle dominant. Nous reviendrons sur ce point dans la section dédiée au clonage des gènes lorsque l'on dispose de mutant. • Le terme est aussi utilisé pour la validation du rôle des mutations construites par mutagenèse dirigée dans les phénotypes observés. En effet, nous avons vu que l'intégration de l'ADN transformé dans une cellule ne se passe pas toujours de manière simple. Si des mutations sont construites en utilisant la transformation, il n'est pas toujours assuré que la mutation construite soit à l'origine de tous les phénotypes observés. C'est aussi potentiellement le cas avec le système CRISPR/CAS9 si la nucléase CRISPR clive d'autres cibles que celle choisie. Pour vérifier si la mutation construite est bien à l'origine de tous les phénotypes, il suffit de réintroduire l'allèle sauvage dans la souche mutante. Si on observe un retour à l'état sauvage pour tous les phénotypes, on dit qu'on a procédé à la complémentation de la souche mutante pour prouver que la mutation construite est bien à l'origine des phénotypes. Chapitre 5: La recombinaison et l'établissement de cartes génétiques Utilité des cartes génétiques La cartographie permet de positionner des gènes sur les chromosomes. A l'issue de mutagenèse, cette méthode permet d'analyser le contenu en mutation(s) des souches obtenues (en effet, à l'issue de la mutagenèse, il n'est pas rare qu'un mutant contiennent plusieurs mutations). Elle permet aussi de ranger les différentes mutations dans des locus (ou loci) sur les chromosomes et donc d'estimer le nombre de ces locus et par extension donc le nombre de gènes. Contrairement à la complémentation, cette méthode fonctionne avec les allèles récessifs ou dominants. Toutefois, elle a aussi ses limites en particulier, elle ne permet pas de différencier si des mutations proches sont effectivement dans un même gène ou deux gènes proches. De même, deux mutations situées aux deux extrémités d'un grand gène peuvent recombiner. Cette méthode doit donc s'utiliser si possible en association avec un test de complémentation et l'interprétation des deux tests simultanément permet généralement de conclure avec grande certitude sur le nombre de gènes et leurs positions dans le génome. Pour la mettre en oeuvre, il faut croiser les mutants par la souche sauvage puis croiser les mutants entre eux et analyser la descendance. Ceci se réalise très bien chez les eucaryotes au moment de la reproduction sexuée, mais il existe d'autres méthodes (en particulier chez les procaryotes) qui ne mettent pas en jeu la reproduction sexuée. Les eucaryotes: la méiose La plupart des analyses cartographiques chez les eucaryotes utilisent la méiose. L'analyse diffère bien évidemment entre les organismes haplobiontiques, où l'on observe principalement les résultats de la méiose, diplobiontiques, où l'on observe les résultats du réassortiment des gamètes au cours des fécondations, et les haplodiplobiontiques chez qui il est possible d'observer à la fois les résultats des méioses et des fécondations. Nous allons analyser chacun de ces types d'organismes. Mais avant, nous allons analyser quelques grands principe de ségrégation des gènes et des chromosomes. Chez tous les organismes, nous avons vu que l'on définit deux grands phénomènes de recombinaison génétique qui permettent de réassortir différents allèles. Le premier phénomène provient de la ségrégation indépendante des chromosomes homologues et des chromatides au moment des deux divisions de la méiose, il s'agit du brassage chromosomique. Dans ses expériences Mendel n'a utilisé que des gènes localisés sur des chromosomes différents; ce qui l'a conduit à énoncer sa deuxième loi d'indépendance de ségrégations des caractères. Cependant, rapidement, on s'est aperçu que certains gènes ne ségrégeaient pas indépendamment les uns des autres (et donc que la deuxième loi de Mendel était fausse dans certains cas). Rapidement, il a été établi qu'ils se trouvaient sur les mêmes chromosomes et qu'ils pouvaient être dissociés par le deuxième type d'évènement de recombinaison au sein d'un chromosome auxquels le nom de crossing-over a été donné.La fréquence de ces crossing-over peut servir à mesurer la distance entre deux régions de l'ADN située sur un même chromosome. En effet, plus ces régions sont éloignées, plus la fréquence des crossing-over entre ces régions sera élevée. Par convention, on définit 1 unité de distance génétique (que l'on mesure en centimorgan, cM) comme la distance entre deux régions pour lesquelles en moyenne 1 produit de la méiose sur 100 est recombiné. En d'autre terme, pour deux régions d'un même chromosome (chromatide) séparées de 1 cM, il y a une chance sur cent que les deux régions se retrouvent sur 2 chromatides différentes après la méiose. Pour calculer les distances entre deux régions, il faut donc calculer le pourcentage de chromatides recombinées parmi la totalité des chromatides. Pour calculer la distance entre deux gènes, il faut donc déterminer le nombre de chromatides ayant une des deux combinaisons parentales (P1 et P2) et le nombre de celles ayant une des deux combinaisons recombinées (R1 et R2). La distante génétique en cM sera alors égale à 100 x (R1+R2)/(P1+P2+R1+R2). Notez que si les allèles ségrègent indépendamment les effectifs de chacune des combinaisons sont identiques (P1= P2 = R1 = R2). En appliquant la formule ci-dessus, on voit donc que la "distance génétique" calculable culmine à 50 cM. Dans ce cas, il y a indépendance génétique et on ne peut pas formellement calculer de distance! Notez le cas où on observe une indépendance génétique entre deux gènes, cela ne veut pas forcémment dire que les gènes sont sur des chromosomes différents. En effet, deux gènes suffisamment éloignés sur un même chromosome peuvent ségréger indépendamment l'un de l'autre si suffisamment de crossing-over ont lieu entre eux à chaque méiose. Dans les calculs ci-dessus, on ne tient compte que des recombinants détectables. Mais, s'il se produit un deuxième crossing-over entre les locus examinés, cela va entraîner un retour à une combinaison d'aspect parental, bien qu'il y ait eu une recombinaison (figure 107).

Figure 107 :

 107 Figure 107: un crossing-over (en haut) permet de recombiner les allèles. La présence d'un deuxième crossing-over (en bas) restaure la combinaison parentale des allèles.

Figure 108 :

 108 Figure 108: calcul de FR= fréquence de produits de méiose recombinés apparents. Sans crossing-over, FR= 0%; avec un crossing-over, FR= 50%; FR= 50 % aussi avec deux crossing-over. En effet, si on fixe le premier crossing-over (flèche rose), il existe quatre possibilités pour les chromatides impliquées dans le deuxième crossing-over. Deux des possibilités conduisent à la détection de recombinants et les deux autres à une absence de détection. Au total, la moitié des recombinants seront donc détectables si deux crossing-over sont en jeu.

Figure 109 :

 109 Figure 109: formation de l'asque ordonné chez Neurospora crassa.

Figure 110 :

 110 Figure 110: schéma de la ségrégation d'un gène en méiose dans les asques ordonnés.

préréduits-

  si 1 crossing-over entre le gène et son centromère: 100% des asques sont postréduits -si 2 crossing-over entre le gène et son centromère: 50 % d'asques préréduits et 50 % d'asques postréduits (figure 111) On voit donc que : -Si on part d'un asque préréduit et que l'on fait 1 crossing-over supplémentaire, on obtient un asque postréduit. -Si on part d'un asque postréduit et que l'on fait 1 crossing-over, on obtient dans un cas sur deux un asque postréduit et dans un cas sur deux un asque préréduit. On peut donc construire ainsi la suite suivante: (% d'asques postréduits) n = (% d'asques préréduits) n-1 + 1/2 (% d'asques postréduits) n-1 et comme (% d'asques préréduits) n-1 = 1-(% d'asques postréduits) n-1 , on en déduit que : (% d'asques postréduits) n = 1 -1/2 (% d'asques postréduits) n-1 et donc lorsque n est très grand, la proportion d'asques postréduits converge vers 2/3 qui est la limite à l'infinie de cette suite. Donc si le pourcentage d'asques postréduits est de 66%, cela veut dire que le gène est éloigné de son centromère est qu'il ségrège indépendamment du centromère ! Attention dans ces conditions, on ne peut pas calculer une distance Lorsque plusieurs gènes sont en jeu (ségrégation de type 3:1 ou 4:0), je vous conseille de traiter les données pour chaque gène par rapport à son centromère indépendamment

Figure 111 :

 111 Figure 111: asques ordonnés obtenus après deux crossingover entre un gène et son centromère.

Figure 113 : 3 •

 1133 Figure 113: ségrégation de deux gènes localisés sur des chromosomes différents dans les tétrades de levure avec deux crossing-over entre chacun des gènes et son centromère respectif.

- 1 D

 1 'où la convergence du nombre de T vers 2/3. De même, on voit que DP = DR = 1/6 lorsque de nombreux crossing-over se produisent entre les deux gènes. Donc, pour l'analyse de tétrades, il faut caractériser les DP, DR et T, ensuite deux cas: 1°) DP = DR alors les deux gènes sont indépendants si la fréquence de tétratypes est inférieure à 66%, les gènes sont sur des chromosomes différents si la fréquence de tétratypes est égale à 66%, on ne peut pas conclure 2°) DP > DR alors les deux gènes sont liés et on peut calculer la distance d = (T + 6 DR)/2 x Ntot x 100 cM L'analyse de spores en vrac Dans certains cas, il n'est pas possible d'effectuer des analyses en asques ordonnés ou même en tétrades, par exemple chez certains champignons comme Aspergillus nidulans pour lesquels les asques sont trop fragiles pour être récoltés individuellement (voir dans l'Introduction Générale le cycle de cette espèce). Il est évident que l'on peut faire de même pour Neurospora crassa et Saccharomyces cerevisiae.

  Figure 115: ségrégation de deux gènes localisés sur des autosomes chez Caenorbaditis elegans après autofécondation d'un hermaphrodite F1.

(

  case orange qui dans ce cas est celle des doubles-homozygotes récessifs) et les mêmes observations s'appliqueront. Dans le cas, de croisements avec une mutation récessive et une mutation dominante, il faut choisir la bonne case diagnostique, c'est à dire celle où les individus portent à l'état homozygote l'allèle récessif et l'allèle sauvage pour le gène portant la mutation dominante. Enfin, le tableau de la figure 115 est celui de la ségrégation de gènes autosomaux. Si un des gènes est cependant un cas, celui dit du test trois points, où

Figure 116 :

 116 Figure 116: test 3-points: dans un croisement d'une F1 hétérozygote par elle-même, la fréquence d'un double crossing-over entre a et b et entre b et c est le produit de la fréquence d'un crossing-over entre a et b avec celle d'un crossing-over entre b et c. Elle est donc très inférieure à ces deux dernières fréquences. Dans les descendants les chromatides portant (a1 b2 c1) et (a2 b1 c2) sera la plus faible. En résumé, le gène qui recombine avec les deux autres avec la plus faible fréquence se trouve au milieu.

Figure 117 :

 117 Figure 117: ségrégation de type 4:0 d'un croisement mata sauvage x matα rho° chez Saccharomyces cerevisiae. La souche rho° est représentée avec des mitochondries blanches dépourvues de génome. Dans le diploïde, la fusion des mitochondries va aboutir à des mitochondries toutes pourvues de génomes.Notez que les mitochondries ont la possibilité non seulement de fusionner, mais aussi de se scinder et qu'elles contiennent plusieurs copies, voire dizaines de copies du génome mitochondrial.

Figure 118 :

 118 Figure 118: carte génétique de Podospora anserina. L'idiomorphe du type sexuel est noté mt.

Figure 119 :

 119 Figure 119: non-disjonction en mitose (à droite) du chromosome portant un allèle sauvage donne une cellule hémizygote a -mutante. A gauche, colonie sectorisée par non-disjonction.

  Figure 120: effets des crossing-over mitotiques. Après un crossing-over entre le gène Sn et le centromère, dans le cas de gauche avec ségrégation de la chromatide 1 avec la chromatide 4 et donc de la chromatide 2 avec la chromatide 3, deux cellules sauvages sont obtenues. Au contraire, dans le cas de droite, où la chromatide 1 ségrège avec la chromatide 3 et donc de la chromatide 2 avec la chromatide 4, les cellules filles seront pour l'une homozygote pour Sn et l'autre homozygote pour y. Chacune va donner naissance à un clone ce qui va aboutir à ce que l'on appelle des clones ou spots jumeaux.

Figure 122 :

 122 Figure 122: souche Hfr et principe de la conjugaison chez Escherichia coli. La conjugaison a lieu avec une souche donneuse Hfr sensible à un antibiotique et une souche receveuse qui y est résistante (comme la streptomycine). Ici la souche donneuse est sauvage et donc prototrophe pour l'histidine (his+), alors que la réceptrice est auxotrophe pour cet acide aminé. Le transfert du chromosome bactérien de la souche donneuse vers la souche receveuse peut se voir par l'obtention de conjugants résistants à la streptomycine (et donc ayant le génome de la receveuse) et qui sont devenus prototrophes grâce à un double crossing-over qui a permis le remplacement de l'allèle hi s-par l'allèle his + .

Figure 123 :

 123 Figure 123: principe de la cartographie par conjugaison. A gauche, cinétique observée d'apparition des différents conjugants présentant un retour à la prototrophie pour le caractère indiqué entre crochet. A droite, la carte que l'on peut déduire de la cinétique, ici représentée sous forme circulaire.

Figure 124 :

 124 Figure 124: carte génétique de Escherichia coli obtenue par conjugaison.

Figure 125 :

 125 Figure 125: principe de la cartographie par transduction avec le phage P1. Le phage P1 peut emporter un fragment du génome bactérien de la bactérie donneuse et l'injecter à la bactérie receveuse. Les phages emportant un morceau de chromosome bactérien n'empaquètent pas leur propre ADN correctement et sont donc souvent défectifs. La fréquence de ce processus est très faible. Il faut donc pouvoir sélectionner facilement la bactérie transduite (par un retour au phénotype sauvage a + et/ou b + par exemple). Le principe de la cartographie est alors très simple. Si on part d'une souche donneuse a + b + c + et que l'on transduit une bactérie réceptrice a -b -c -, les bactéries "co-transduite" a + b + seront d'autant plus fréquentes que les gènes a et b sont proches. Le gène c étant éloignés des deux autres, il ne sera jamais co-transduit. Notez que pour que les gènes soient co-transduits, il faut qu'ils soient sur un fragment suffisamment petit pour qu'il puisse être emporté par le phage P1, soit espacés au maximum de 60 kb.

Figure 126 :

 126 Figure 126: principe de la construction d'une banque d'ADN génomique. L'ADN de l'organisme pour lequel on souhaite construire une banque est extrait et fragmenté (par digestion enzymatique partielle, fragmentation physique…). Il est ensuite cloné dans un vecteur bactérien. Chacun des clones contient un plasmide portant un fragment d'ADN génomique. La collection des clones obtenus s'appelle une banque d'ADN génomique. Elle est complète si elle contient au moins une fois chacun des gènes de l'organisme de départ. Comme le clonage est normalement aléatoire, cela sera vrai s'il y a suffisamment de clones. On appelle couverture le nombre de fois ou une région d'ADN est présente dans les clones; elle est représentée par la lettre X: une couverture de 1X veut dire que la taille combinée des inserts de la banque est identique à la taille du génome et donc que les gènes sont représentés une seule fois en moyenne dans la banque. Pour être complète, la couverture d'une banque doit être d'au moins 5X à 10X.

Figure 127 :

 127 Figure 127: principe du clonage par expression de gènes portant des mutations récessives.

Figure 130 :Figure 131 :Figure 132 :

 130131132 Figure 130: stratégies pour simplifier l'identification de mutations par séquençage complet de génomes mutants. A gauche, stratégie utilisée si les espèces peuvent devenir rapidement homozygotes.

  pas à l'extérieur de la cellule et des gènes dits non autonomes cellulaires pour lesquels les produits qu'ils codent diffusent à l'extérieur de la cellule. Il existe des techniques simples qui permettent de déterminer le mode de fonctionnement des gènes et le lieu d'action des produits qu'ils codent.Nous prendrons l'exemple du développement du périthèce chez Podospora anserina (figure133). Pour rappel, le périthèce est la fructification de cette espèce de champignon dans laquelle a lieu la reproduction sexuée.

Figure 133 :

 133 Figure 133: développement du périthèce chez Podospora anserina.

Figure 134 :

 134 Figure 134: greffes de périthèces chez Podospora anserina.

Figure 135 :

 135 Figure 135: Mosaïque avec une souche Δmat chez Podospora anserina.

Figure 136 :

 136 Figure 136: mosaïque avec une souche PaPks1 chez Podospora anserina.

•

  un double mutant affecté pour un répresseur et un activateur situé en aval de celui-ci n'aura pas d'activation de la voie. En effet, le signal constitutif d'activation de la voie sera arrêté par l'absence de l'activateur situé en dessous.

Figure 138 :

 138 Figure 138: épistasie dans une voie de signalisation. Les doubles mutants dans une voie de signalisation linéaire auront le phénotype de celui du mutant du gène le plus en aval.

Figure

  Figure 139: épistasie dans une voie de biosynthèse branchée et complexe. Dans cette voie, deux précurseurs produisent deux pigments (ici un jaune, le pigment 1, et un bleu, le pigment 2) via deux voies linéaires.Les mutants dans les gènes de biosynthèse du pigment 1 sont donc bleus et ceux dans les gènes de biosynthèse du pigment 2 sont jaunes, alors que le sauvage sera vert. Il y a en plus des gènes codant pour des enzymes impliqués dans le dépôt correct des pigments; leurs mutants seront blancs car les pigments ne seront pas correctement déposés. On voit clairement que dès qu'un des gènes impliqués dans le dépôt des pigments est muté, la souche sera blanche, peu importe le(s) pigment(s) fabriqué(s).Ces gènes sont donc épistatiques sur les gènes de fabrication des pigments 1 et 2, bien qu'ils agissent en aval.

  deuxième type de relation entre mutations concerne les effets antagonistes. Notez qu'une mutation épistatique peut avoir un effet antagoniste sur une autre rien qu'en masquant son phénotype. Néanmoins, il existe d'autres manières pour une mutation d'annuler le phénotype d'une autre. Généralement, l'antagonisme entre mutations n'est pas testé de manière dirigée comme dans le cas de l'épistasie, mais se constate, voire s'utilise, au cours d'expériences de mutagenèse. En effet, une technique classique de génétique consiste à sélectionner des mutations ayant des effets antagonistes d'une autre mutation dans un gène déjà bien caractérisé afin d'identifier d'autres gènes impliqués dans le même processus physiologique: on dit alors que l'on fait une recherche de suppresseurs. Prenons un exemple chez mon champignon favori, Podospora anserina. Ce champignon produit des ascospores noires (en fait vertes très foncées) grâce à un dépôt de mélanine. Nous avons vu qu'il existe des mutants, dont le mutant PaPks1-193 (voir section du chapitre 7 sur l'Autonomie cellulaire de l'expression d'un gène), qui produisent des ascospores dépourvues des pigments (figure 140). premier croisement avec la souche PaPks1-193 doit être fait afin de voir s'il y a une deuxième mutation dans ces souches à pigmentation restaurée (figure 140). En effet, dans ce cas il y a une ségrégation 50% de spores blanche et 50% de spores colorées dans la descendance. C'est ce que qui est observé dans une majorité des souches ayant une pigmentation restaurée, indiquant que le retour de la pigmentation est bien lié à la présence d'une deuxième mutation ayant un effet antagoniste ou suppresseur de la mutation PaPks1-193. Un deuxième croisement est réalisé entre les descendants révertants et la souche sauvage et dans la descendance deux types de ségrégation sont observés (figure 140):

Figure 140 :.

 140 Figure 140: identification de révertant du défaut de coloration de spores du mutant PaPks1 chez Podospora anserina; voir le texte pour détail. Pour des raisons de simplicité, les asques représentent la ségrégation des caractères après la méiose et avant la mitose postméiotique. En effet, chez Podospora anserina, la mitose postméotique est suivie d'un arrangement particulier des noyaux qui entraîne la formation d'ascospores binuclées contenant des noyaux non-frères.

Figure 143 :

 143 Figure 143: ARNt suppresseurs, l'exemple de su4-1 et su8-1 de Podospora anserina. La mutation suppresseur est en rose et le codon qu'elle permet de décoder est en orange.

Figure 144 :

 144 Figure 144: schéma d'analyse des suppresseurs.

Figure 145 :

 145 Figure 145: stratégie de recherche de co-létaux chez Saccharomyces cerevisiae. La souche de départ porte des mutations dans les gènes ADE2, ADE3 et ADE8, ce qui lui confère une couleur blanche car le pigment rouge qui s'accumule dans les mutants ADE2 -n'est pas produit. En effet, les gènes ADE3 et ADE8 codent pour des enzymes agissant en amont de l'enzyme codé par le gène ADE2; c'est le substrat de l'enzyme codé par ADE2 qui est transformé en métabolite rouge. Cette souche est aussi mutée pour le gène URA3 qui va servir de marqueur de sélection pour introduire un plasmide et permettre une contre-sélection pour vérifier la présence d'une mutation co-létale. Dans cette souche est introduite la mutation pour laquelle on souhaite obtenir des mutations co-létales (croix rouge). Puis, un plasmide portant les allèles sauvages des gènes ADE3, ADE8 et URA3, ainsi que l'allèle sauvage du gène qui porte dans le génome la mutation pour laquelle on souhaite trouver des mutations co-létales est introduit par transformation en sélectionnant les transformants devenu prototrophes pour l'uracile. Cette souche est rouge (car le pigment rouge caractéristique des souches mutantes pour ADE2 est fabriqué) mais va présenter de nombreux secteurs blanc indicatif de la perte du plasmide, puisque le gène qu'il porte n'est pas essentiel. Après traitement mutagène, les souches ne pouvant plus perdre le plasmide, et donc l'allèle sauvage du gène d'intérêt, ne présenteront donc plus de secteurs blancs. Ce crible positif permet de sélectionner rapidement des candidats porteurs de mutations co-létales. Pour valider la présence d'une mutation co-

Notions de Biologie Générale •

  Connaître les grandes lignes de la structure et du développement des animaux • Connaître les grandes lignes de la structure et du développement des plantes supérieures • Connaître les grandes lignes de la structure et du développement des champignons • Connaître les mécanismes de la fécondation chez les animaux, les plantes et les champignons • Savoir décrire une courbe de croissance d'une population de micro-organismes • Définir la notion de virus en tant que parasite

	Notions de Mathématiques
	•	Savoir calculer une moyenne, une variance et une fréquence
	•	Savoir calculer une probabilité simple et une probabilité conditionnelle
	•	Connaître la loi Binomiale, la loi de Poisson et la loi Normale
	•	Comprendre ce qu'est un test statistique
	•	Appliquer le test du chi2 pour tester la conformité des résultats expérimentaux à une hypothèse
	•	Appliquer le test du chi2 pour tester l'homogénéité de deux populations

Notion de Chimie/Biochimie élémentaire

	•	Donner la structure générale des nucléotides, des bases puriques et pyrimidiques
	•	Connaître la réplication (réplicon, origine de réplication, ADN polymérase)
	•	Connaître la transcription (promoteur, transcrit, ARN polymérase)
	•	Connaître la réaction catalysée par une ADN (ARN) polymérase
	•	Connaître la maturation des transcrits (intron, exon)
	•	Connaître la traduction (ARNt, ARNr, ARNm, ribosome)
	•	Connaître le code génétique (codon)
	•	Donner l'ordre de grandeur du nombre de nucléotides constitutifs d'un gène
	•	Connaître les enzymes de restriction
	•	Connaître le principe et le but d'une centrifugation, d'une électrophorèse
	A l'
	•	Définir les termes de liaisons covalentes, fortes, faibles, d'hydrolyse et de dénaturation
	•	Donner la structure générale d'un acide aminé et les principales familles chimiques
	•	Connaître la liaison peptidique
	•	Connaître les structures primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire d'une protéine
	•	Savoir l'importance de la structure d'une macromolécule pour sa fonction
	•	Savoir ce qu'est un site antigénique
	•	Définir les moyens de production et de transfert d'énergie dans la cellule
	•	Savoir ce qu'est une catalyse enzymatique et un site actif
	Notions Biologie Moléculaire élémentaire
	•	Décrire la composition et la structure de l'ADN et des différents ARN

issue du cours, les étudiants devraient en théorie pouvoir répondre la liste des objectifs suivants :

  Donner un exemple de deux cas particuliers suivants: complémentation entre deux génomes portant des mutations récessives dans un même gène; non-complémentation entre deux génomes portant des mutations récessives dans des gènes différents

	•	• •	Savoir ce qu'est une mutation germinale et une mutation somatique Savoir interpréter les tests de dominance/récessivité
		• •	Connaître le principe du calcul d'un taux de mutation Définir l'autonomie cellulaire d'expression d'un gène
		• •	Savoir ce qu'est un mutagène Savoir interpréter les expériences de greffes et de mosaïque génétique
		•	Décrire les différents types de mutations ponctuelles
	• Chapitre 5 Expliquer les différentes conséquences possibles des mutations ponctuelles sur les produits des Chapitre 8 gènes • • Savoir comment cartographier un gène par conjugaison et par transduction • Savoir définir l'épistasie Savoir définir les critères génétiques qui permettent de distinguer les délétions des mutations • Savoir comment ségrège(nt) un gène, deux gènes indépendants et deux gènes liés au cours des • Savoir interpréter les analyses phénotypiques de double mutants affectant des gènes impliqués ponctuelles • mitoses et méioses dans une voie de signalisation Expliquer l'origine de l'aneuploïdie • • Prévoir les génotypes et les phénotypes des individus (haploïdes et diploïdes), ainsi que leurs • Savoir définir ce que sont des groupes d'épistasie Définir des mutations conditionnelles, expliquer leur intérêt pour l'analyse génétique • proportions dans les divers croisements impliquant deux couples d'allèles pour des gènes gouvernant • Savoir définir ce qu'est une réversion intragénique et un suppresseur extragénique et savoir Expliquer les conséquences des recombinaisons le même caractère comment faire expérimentalement la différence entre les deux
	• diplobiontiques à reproduction sexuée Calculer la distance génétique entre deux gènes chez des organismes haplobiontiques et • Connaître les différents types de suppresseurs Chapitre 2 • Savoir comment analyser des suppresseurs issus d'une mutagenèse
	• • Introduction générale Définir les tailles et les caractéristiques des principaux génomes • Ordonner trois gènes sur le même chromosome; appliquer notamment le test trois points chez Connaître les différents types de mutations accentuatrices • Définir orthologues et paralogues, la redondance génétique, la néo-fonctionnalisation et des organismes à reproduction sexuée • Savoir comment isoler des mutants co-létaux chez une levure
	• •	Connaître les différences entre cellules procaryotes et eucaryotes l'introgression Savoir utiliser les délétions ou les pertes de chromosomes pour cartographier
	• •	•	connaître les différentes étapes du cycle cellulaire chez les eucaryotes Définir un pseudogène, le pan génome et le core génome Calculer la distance d'un gène à son centromère à partir de l'observation d'asques ordonnés
	• issus d'un croisement mutant x sauvage Savoir schématiser une division bactérienne
	• • • récessivité, expressivité, pénétrance, allèles conditionnels, thermosensibilité, cryosensibilité, Savoir schématiser une mitose et une méiose Connaître les cycles des principaux organismes utilisés pour les études génétiques Connaître les principales définitions : caractère, gène, allèle, génotype, phénotype, dominance, auxotrophie et prototrophie • Savoir ce qu'est la transformation génétique • Expliquer la formation des trois types de tétrades non-ordonnées issues d'un croisement mutant Chapitre 3 • x mutant dans le cas de gènes physiquement indépendants et dans le cas de gènes physiquement liés Connaître les mécanismes de transformation chez les bactéries et les champignons • • Expliquer l'indépendance génétique dans le cas de gènes physiquement liés Connaître les mécanismes de recombinaison par jonction d'extrémités non homologues et par • Établir une carte génétique à partir de l'analyse de tétrades réparation des cassures double-brin • • Décrire les tests génétiques qui permettent de distinguer une mutation nucléaire d'une Savoir les proportions de recombinaison homologue versus non-homologue chez les principaux organismes modèles de génétique mutation mitochondriale ou chloroplastique
	Chapitre 1 • Connaître une méthode pour inactiver un gène, pour surexprimer une protéine, pour changer un nucléotide in situ Chapitre 6
	• •	•	Savoir ce qu'est le polymorphisme Expliquer la signification des techniques de cribles de sélection Savoir ce qu'est une banque d'ADN génomique et comment on en construit une
	• •	•	Savoir calculer un taux d'hétérozygotie Donner un exemple de stratégie d'isolement de mutations appliquée à un organisme haploïde, Savoir cloner par expression les allèles sauvage et mutant de gènes portant une mutation
	• récessive Donner deux méthodes moléculaires d'analyse du polymorphisme un organisme diploïde
	• •		Savoir ce qu'est un transposon et connaître les deux modes de leur propagation Savoir cloner par expression les allèles sauvage et mutant de gènes portant une mutation
	• • • • dominante Savoir ce qu'est un plasmide Savoir ce qu'est un microsatellite et un minisatellite Savoir ce qu'est un haplotype et un idiomorphe Savoir ce qu'est la ploïdie, l'aneuploïdie, la polyploïdie Chapitre 4 • • Connaître le principe du clonage positionnel Définir le principe du test de complémentation • Préciser les conditions pratiques d'application du test de complémentation aux différents types • Connaître les précautions à prendre pour analyser les séquençages de génomes de mutants
	• • Chapitre 7 Savoir ce qu'est une délétion, une insertion, une inversion, une duplication et une translocation Pouvoir donner un exemple de transmission non-conventionnelle d'information épigénétique d'organismes (eucaryotes haplobiontiques et diplobiontiques) • Être capable, à partir de n'importe quelle situation simple, de définir des groupes de
	• •	Savoir démontrer la loi de Hardy-Weinberg complémentation Connaître comment faire la différence entre plusieurs mutations et une mutation à effet
	• pléiotrope Connaître les modalités d'apparition des mutations

• Savoir ce qu'est le fond génétique et l'impact qu'il a sur le phénotype des mutations

Définition d'un caractère : C'est une caractéristique morphologique ou biologique pour laquelle on dispose de spécimens qui montrent une différence plus ou moins héritable, c'est à dire se transmettant d'une génération à une autre Exemples

	•	la taille
	•	le poids
	•	la couleur des yeux et des cheveux
	•	les nuances de la peau (peau blanche ou mate)
		pour ces caractères l'hérédité est moins stricte ou plus complexe
	Contre exemples :
	•	le bronzage !
		Certains caractères montrent des variations discontinues alors que d'autres montrent des
	variations continues. Ces derniers sont plus difficiles à étudier et nécessitent une analyse statistique
	poussée. Nous n'en parlerons pas dans ce livre à moins que nous puissions définir des classes bien
	différenciées et les considérer comme des caractères discontinus.

: • le système des groupes sanguins ABO ou rh+/rh-, pour ce caractère, l'hérédité est stricte • la langue parlée. Même si son environnement culturel influence grandement la langue qu'il parle voire celle qu'il peut apprendre, chaque être humain a la possibilité d'apprendre toutes les langues. La langue n'est donc pas un caractère héritable au sens génétique du terme. Certains caractères se transmettent à l'identique au cours des générations. On parle de caractères simples (groupes sanguins par exemple). D'autres ne se conservent pas aussi simplement: il s'agit des caractères complexes (la forme ou la couleur des yeux). En général, ceux-ci peuvent se décomposer en caractères simples. Pratiquement, on étudie d'abord les caractères simples et on complexifie par la suite: la génétique est donc une science réductrice. Définition du phénotype : c'est l'ensemble des caractères d'un individu. Le plus souvent on ne décrit que les phénotypes intéressants pour l'étude que l'on veut mener ! Définition d'

une lignée pure : une lignée pure est une lignée pour laquelle les caractères se retrouvent inchangés

d'une génération à l'autre. Pratiquement, cela n'est souvent réalisable que sur des organismes modèles et souvent uniquement sur certains caractères. Exemples: • On dispose de lignée de Drosophile avec des yeux de différentes couleurs. Le type le plus répandu dans la nature a des yeux rouge brique, Dans les laboratoires des lignées pures de mouches ayant des phénotypes différents, avec des yeux blancs, oranges, marrons ou rouge vif sont fréquemment utilisées. • Mendel pour ses expériences a choisi des pois du genre Pisum dont nous savons maintenant qu'ils ont un cycle diplobiontique. Les autofécondations sont possibles et très facilement réalisées, les fécondations "parasites" sont très rares. Mendel disposait pour ces pois de lignées pures ayant différents caractères qui se conservaient à l'identique au cours des générations par autofécondation. Les caractères qu'il a choisis d'analyser sont décrits dans la figure 19.

Les lois de Mendel et les gènes Attachons

-nous avec Mendel à un de ces caractères, la couleur du pois. Il a en effet observé les mêmes résultats pour tous les caractères. Il a effectué trois générations de croisements impliquant ce caractère.

•

Lorsqu'il croise des plantes donnant des pois verts avec d'autres donnant des pois jaunes, 100%

de la descendance (qu'il appelle génération F1) donne des pois jaunes. Il ne constate pas de forme intermédiaire. Il définit alors le terme de caractère dominant (celui qui domine dans la génération F1: ici pois jaune) et de caractère récessif (celui qui disparaît dans la F1: ici pois vert). D'un point de vue des

de réaction qui est l'ensemble des valeurs que peut prendre le phénotype en fonction des conditions de milieu

  Dans cet exemple, on constate un effet non négligeable de l'environnement (la température d'élevage). Il est alors possible de définir la norme

. Ici de 650 à 850 facettes pour la souche A, de 550 à 700 pour la souche B et de 250 à 300 pour la souche C. L'existence de normes de réaction montre qu'il existe des allèles qui ne s'expriment que dans certaines conditions. On parle alors d'allèles conditionnels. Certains allèles entraînent par exemple une létalité dans certaines conditions alors qu'ils n'ont pas d'effet dans d'autres conditions. Ce genre d'allèles est très important car il permet d'étudier des processus vitaux pour la cellule ou l'organisme. La température est la condition qui a souvent le plus d'importance. On définit classiquement 2 types d'allèles : • Si les allèles sont létaux à haute température on dit qu'ils sont thermosensibles. • Si les allèles sont létaux à basse température on dit qu'ils sont cryosensibles. La figure 22 montre les effets d'un allèle conditionnel thermosensible de Podospora anserina à deux températures: 18°C qui est la température permissive à laquelle le mutant produit des ascospores et 22°C qui est la température non-permissive à laquelle il n'en produit pas. Pour certains allèles, on constate que différents individus ayant les mêmes allèles peuvent exprimer une gamme de phénotype. Cela peut être dû par exemple à des facteurs environnementaux qui étaient présents pendant le développement de l'organisme ou à la présence d'autres allèles dans le génome et qui interfèrent avec l'allèle étudié pour en varier les effets. On définit alors l'expressivité d'un génotype pour chaque individu qui est le degré d'expression de son génotype. Si l'expressivité est forte cela veut dire que le phénotype est bien exprimé. Cette définition n'a d'intérêt que si l'expressivité est variable !

  Lorsque Griffith chauffe les cellules S de type III et qu'il les injecte à des souris, celles-ci ne meurent pas, le chauffage ayant tué les pneumocoques (on peut le vérifier après étalement sur milieu gélosé). De même, l'injection de cellules R de type II vivantes ne provoque pas la mort des souris. Par

contre s'il injecte des cellules S III chauffées avec des cellules R II, il constate la mort rapide des souris. Il extrait les bactéries des cadavres et les étales sur boîte de Pétri: certaines des bactéries qui poussent ont un aspect lisse, elles sont S de type III (figure

Avery, Mc Leod et Mc Carthy en 1943 purifient le principe transformant

  'étape suivante de la compréhension de ce qu'est l'information génétique est passée par la détermination de la structure de l'ADN par Watson et Crick en 1953. D'un point de vue génétique, elle a permis de proposer des mécanismes pour expliquer comment l'information génétique est codée dans l'ADN et comment elle est transmise au cours des générations. Je vous renvoie à des cours de Biologie Moléculaire pour approfondir vos connaissances sur les structures de l'ADN, de l'ARN, comment ils sont répliqués et transcrits et comment est exprimé l'information, en particulier comment les messagers sont décodés par le ribosome et les ARNts en utilisant le code génétique.

	définir le lot minimum de gènes présent dans toutes ces bactéries (l'analyse a été faite initialement avec
	le génome de Haemophilus influenza). Ce lot de gènes doit en théorie être le lot de gènes minimum qui
	permet d'assurer la vie d'une cellule procaryote (il va manquer les gènes responsables des fonctions
	assurées par des protéines différentes entre organismes, on connaît de tels exemples pour la charge des
	tRNA par exemple). Cette comparaison aboutit pour l'instant à environ 250 gènes. Des analyses
	fonctionnelles du génome de Bacillus subtilis aboutissent au même ordre de grandeur (un peu moins de
	300 gènes sont essentiels).
	A l'inverse des chercheurs américains ont créé des bactéries "synthétiques" qui présentent un
	lot minimal de gènes, en remplaçant dans des cellules de Mycoplasma capricolum le génome par des
	chromosomes fabriqués in vitro. La souche JCVI-syn3A ainsi obtenu contient un génome de 543 kilobases
	codant pour 493 gènes, dont 452 codant pour des protéines. Les cellules JCV-syn3A ont un temps de
	doublement de 2 heures en milieu complet, indiquant qu'elles ont toujours une division efficace.
	Nous reviendrons dans la suite de ce livre sur quelques notions de génomique qui est la partie
	de la génétique qui traite de l'organisation des génomes et du fonctionnement cellulaire global.
	d'information
	nécessaire à l'élaboration d'une cellule (nous devrions d'ailleurs plutôt parler de la quantité
	d'information nécessaire à son intégrité).
	Cependant, la connaissance du génome complet d'un organisme peut permettre d'évaluer le
	nombre de gènes (et donc grosso modo de protéines) nécessaires à sa propagation. Pour l'instant, le
	génome contenant le plus petit nombre de gènes est celui de Mycosplasma genitalium, une bactérie
	parasite intracellulaire appartenant au groupe des Mollicutes. Il contient environ 520 gènes dont 480
	codent pour des protéines. En comparant ce génome avec ceux d'autres bactéries, il est possible de

Partant des expériences de Griffith et en utilisant le système in vitro, ces chercheurs purifient par des techniques de biochimie le principe transformant mis en évidence par Griffith. Leurs résultats montrent clairement et de manière surprenante pour l'époque que l'ADN est le principe transformant. En effet, l'hypothèse la plus en vogue était que les protéines étaient le support de l'information génétique: elles représentent la plus grande fraction des chromosomes et elles sont beaucoup plus diverses et complexes que l'ADN. Les expériences d'Avery et ses collaborateurs montrent clairement que les gènes sont faits d'ADN. Il faut en particulier noter que le polysaccharide constituant la capside protectrice des cellules S n'est pas capable de transformer les cellules R en S. Maintenant, nous savons transformer pratiquement tous les types de cellules procaryotes et eucaryotes. Pour les organismes bien étudiés, il existe même plusieurs méthodes. Par exemple, pour transformer Escherichia coli, il existe au moins une dizaine de protocoles efficaces ! Ces expériences ont donc conduit au développement ultérieurs des technologies de transgenèse et donc de création d'organismes génétiquement modifiés ou OGM. Nous reviendrons sur ce point lors de la partie sur la "génétique réverse". LQuelles sont les quantités d'information nécessaires pour fabriquer les différents organismes ? Récemment, une grande publicité a été donnée à l'ADN en tant que seul support de l'information génétique. En effet, on parle du gène de l'alcoolisme, de l'homosexualité, de la schizophrénie etc. Nous avons déjà vu plus haut que la relation gène/phénotype n'est pas absolue et que le milieu (soit au cours du développement, soit plus tard) peut influer fortement sur l'expression des différents allèles. De même, nous savons que certaines structures cellulaires ne peuvent se former qu'à partir de structures préexistantes (c'est le cas par exemple des mitochondries) et nous verrons avec l'épigénétique d'autres exemples où l'information génétique n'est pas directement codée par les acides nucléiques. Pour l'instant, la proportion réciproque de l'information contenue dans l'ADN et celle qui doit se transmettre par continuité cellulaire n'est pas connue. Les deux informations sont essentielles: une cellule ne peut survivre très longtemps sans son ADN, mais la présence de l'ADN et des constituants cellulaires sous une forme désorganisée ne produit pas spontanément une cellule ! Il est donc pour l'instant très difficile de répondre à la question de la quantité

Chapitre 1: La variation Le polymorphisme

		Ces fréquences sont une mesure du polymorphisme existant pour un gène dans la population.
	Elles fluctuent en fonction du gène étudiée. Une autre mesure, plus utilisée car elle reflète mieux le
	polymorphisme, est le pourcentage d'hétérozygotes présent dans la population, c'est ce que l'on appelle
	le taux d
		Nous avons vu dans l'introduction que la reproduction est invariante. Cependant, lorsque l'on
	regarde des individus pris dans la nature, on constate que ceux-ci montrent une variabilité phénotypique.
	Cette variabilité peut être due à des facteurs environnementaux ou historiques mais elle peut aussi
	provenir de la présence d'allèles différents de certains gènes.
	exemple:
	•	Chez l'homme, il existe dans les populations de nombreuses différences héréditaires liées à la
	présence d'allèles différents de gènes contrôlant des caractères visibles (couleur de la peau, des cheveux
	ou des yeux, taille, poids, etc.) ou invisibles (groupes sanguins etc.).
	On dit que les populations présentent un polymorphisme pour les caractères/gènes en question. Les
	gènes sont dits polymorphes (= qui possèdent plusieurs formes).
		On peut alors définir les fréquences alléliques des différents allèles du gène qui sont les
	proportions des différents allèles dans la population. Pour les calculer, il faut estimer les fréquences des
	différents génotypes et ensuite en déduire la fréquence de chacun des allèles.
	exemple:
		Dans une population d'esquimaux, le groupe sanguin M/N a été étudié. Ce groupe sanguin
	possède deux allèles M et N. Les résultats obtenus sont les suivants :
		génotype	MM	MN	NN
		proportion observée	0,835	0,156	0,009
	La fréquence de M = 0,835 + 0,156/2 = 0,913, celle de N = 0,009 + 0,156/2
		51

'hétérozygotie. Les moyens d'étude du polymorphisme

		Il est possible d'explorer le polymorphisme à différents niveaux. Le premier niveau est
	l'exploration de l'aspect phénotypique que l'on peut apprécier par diverses techniques (observation
	directe, détection immunologique, etc.). Ce que l'on constate c'est que le polymorphisme est
	extrêmement variable en fonction du type d'organisme étudié, de la population et du caractère.
	exemple:
	•	Si nous reprenons l'analyse des groupes sanguins M/N étendue à plusieurs populations, nous
	arrivons aux résultats consignés dans le tableau suivants qui donne les proportions observées des
	individus MM, MN et NN dans plusieurs populations et les fréquences alléliques calculées à partir de ces
	proportions:
			MM	MN	NN	M	N
		esquimaux 0,835 0,156 0,009 0,913 0,087
		aborigènes 0,024 0,304 0,672 0,176 0,824
		égyptiens	0,278 0,489 0,233 0,523 0,477
		allemands 0,297 0,507 0,196 0,550 0,450
		chinois	0,332 0,486 0,182 0,575 0,425
		nigérians	0,301 0,495 0,204 0,548 0,452
	Vous voyez que les populations sont très variables quant à la présence des deux allèles M et N.
		Il est possible de détecter des différences de structure pour de nombreux enzymes en les faisant
	migrer sur des gels d'acrylamide non-dénaturants (figure 28). Les enzymes sont ensuite révélés in situ

Figure 28: zymogramme

	invisibles et n'entraînent pas de phénotype : Ils seraient donc "neutres" ou "silencieux" d'un point de
	vue évolutif. Nous allons voir dans les paragraphes suivants qu'effectivement de nombreux
	polymorphismes sont neutres.
	Un autre niveau d'observation se situe directement au niveau du matériel génétique. Il est
	possible de le subdiviser en 3 sous-niveaux d'observations: les chromosomes, des caractéristiques
	moléculaires de la séquence (sites de restriction, etc.) et enfin la séquence elle-même.
	Dans un premier temps, les chercheurs ont observé les caryotypes des individus d'une même
	espèce. Ils ont vu que certaines populations naturelles (surtout de plantes) contiennent des
	modifications de caryotype très importantes: présence de chromosomes surnuméraires, fusion de
	chromosomes (et réciproquement !), altérations de la structure de certains chromosomes,
	éventuellement polyploïdie. Nous n'entrerons pas le détail des techniques d'observation car celles-ci
	relèvent de la cytogénétique.

révélant des polymorphismes cachés chez un organisme diploïde. Les individus 4 et 7 sont hétérozygotes alors que les autres sont homozygotes. dans le gel grâce à un test coloré: on obtient ce que l'on appelle un zymogramme. Ceci permet de détecter de nombreux polymorphismes qui ne sont pas directement apparents au moment de l'observation macroscopique des individus. Ceci a suggéré que de nombreux polymorphismes sont en fait Figure 29: principe de la RAPD (Random Amplification Polymorphism DNA). La RAPD utilise la méthode de la PCR mais avec un seul oligonucléotide d'une dizaine de nucléotides de long. Mis en présence d'un ADN génomique dans des conditions de faible stringence, cet oligonucléotide va s'hybrider avec de nombreuses séquences. L'hybridation est imparfaite mais suffisante pour que les amorces puissent être utilisées par la Taq DNA polymérase. Pour les souches 1 et 2 dont les génomes sont schématisés à gauche, l'

amplification par PCR va permettre de faire apparaître un certain nombre de bandes (ici celles générées par les amorces surlignées en orange, pratiquement on utilise des conditions qui permettent d'amplifier une dizaine de bandes). L'utilisation de plusieurs oligonucléotides de séquences différentes et des modifications de la stringence permet d'obtenir des profils en "RAPD" des souches. Si des polymorphismes

	•	Le deuxième niveau d'accès se fait via l'utilisation de techniques moléculaires qui permettent de Le project ENCODE (https://www.encodeproject.org/) a permis de détecter 1,5 million de
	détecter de nombreux polymorphismes silencieux ou non. De nombreuses techniques sont disponibles et polymorphismes n'affectant qu'une seule base ou
	nous en verrons seulement quelques-unes parmi la panoplie qui est disponible actuellement.
	-	Le RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). Il est possible par exemple pour détecter
	des polymorphismes de faire des Southern Blots à partir d'ADN provenant de souches différentes et
	d'hybrider les filtres obtenus avec des sondes appropriées. Des polymorphismes de présence / absence
	de sites de restriction sont alors détectables. Cette technique maintenant ancienne n'est plus
	couramment utilisée du fait de sa lourdeur
	-	Les PCR et RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). L'utilisation de la PCR du fait de sa
	rapidité permet de détecter facilement des polymorphismes de taille. En effet, des couples d'amorces
	permettent d'amplifier des régions données du génome. Celles-ci peuvent contenir des polymorphismes
	de taille avec des insertions ou délétion de séquences; ce que l'on appelle maintenant des indels. Les
	produits résultant de l'amplification auront alors des tailles différentes. Nous reviendrons sur ce genre de
	polymorphisme un peu plus loin car ce sont eux qui sont utilisés pour faire les empreintes génétiques. La
	PCR permet aussi de détecter d'autres polymorphismes plus subtils. Il existe de nombreuses méthodes
	utilisant la PCR; une fréquemment utilisée est la RAPD (Random Amplification Polymorphism DNA, figure
	29).
	•	Enfin, la détermination directe des séquences d'ADN provenant d'individus ou de souches
	différentes permet de détecter de nombreux polymorphismes.
	exemples:
	•	La protéine P53 est une protéine impliquée dans le contrôle de la prolifération
	cellulaire et qui empêche la formation de tumeurs cancéreuses. Du fait de son implication dans la
	sont présents entre des souches, ils permettront des hybridations différentielles des amorces (ici en rouge) formation de cancers, les séquences du gène codant cette protéine ont été obtenues chez de nombreux
	et conduiront à des modifications des profils RAPD. Ce type de technique est très utilisé pour "génotyper" individus. Dans la séquence codante du gène, il a pu être trouvé un certain nombre de polymorphismes
	des souches.Dans certains cas, les polymorphismes sont associés à des caractéristiques des souches (qui n'ont pas d'effet sur le fonctionnement de la protéine bien que certains changent un acide aminé (comme la virulence pour des souches de bactéries ou de champignons pathogènes ou encore la productivité de certaines plantes d'intérêt agronomique, etc.). La photo à droite montre un exemple de dans la séquence de la protéine). La table ci-dessous donne les variations rencontrées les plus
	RAPD produite à partir d'ADN de souches de la nature de l'escargot, Biomphalaria glabrata, qui sont fréquemment.
	résistantes (B et 10-R2) ou sensible (M) au ver parasite Schistosoma mansoni. Cet escargot est un hôte N°du codon nucléotide acide aminé
	intermédiaire de ce ver trématode qui infecte aussi l'homme; 600 millions de personnes vivent dans les 213 CAG ou CGG Arg
	zones à risque où réside ce pathogène. 72	CGC ou CCC	Arg ou Pro
		47	CCG ou TCG	Pro ou Ser
			54 55

SNP (pour Single Nucleotide Polymorphism) dans le

		De fait, ils sont dans la plupart des cas localisés dans des régions qui "ne s'expriment pas" (régions
		intergéniques ou introns). Nous reviendrons sur ces problèmes d'effets des polymorphismes dans la
	génome humain, ce qui veut dire que deux génomes humains pris au hasard diffèrent par environ une section qui traite de la mutation.
	base sur deux mille! Ce chiffre ne prend pas en compte les différences de nombres de copies de
	séquence répétées et des indels! Ces valeurs de l'ordre du ‰ sont couramment retrouvées lorsque des
	souches différentes pour une espèce données sont comparées. Au contraire, lorsque des souches
	provenant d'espèces proches (comme les espèces jumelles appartenant au même complexe), les valeurs
	de polymorphismes sont souvent 10 fois supérieures et donc de l'ordre du %. Par exemple, les
	différences entre les génomes de l'homme moderne et de l'homme de Néandertal sont quatre à six fois
	supérieures à celles trouvées entre humains modernes, soit un pourcentage d'identité de 99.5%. Avec le
	chimpanzé, ce pourcentage descend à environ 98%.
		Localisation des polymorphismes
		Les polymorphismes peuvent être localisés dans les gènes. Dans ce cas, ils peuvent avoir des
	effets sur le fonctionnement des gènes et entraîneront des variations détectables au niveau de
	l'organisme. Dans beaucoup de cas, ils n'entraînent cependant aucune modification de fonctionnement
	et n'auront pas d'effet.
	exemples:
	-	nous avons vu que le gène codant la protéine P53 possède des polymorphismes nucléotidiques
	qui ne se retrouvent pas au niveau de la protéine. Il est donc raisonnable de penser que ces
	polymorphismes n'ont aucun effet phénotypique au niveau de l'organisme. Dans le même gène, il existe
	d'autres polymorphismes qui modifient le fonctionnement de la protéine. Les porteurs de certains allèles
	présentent des prédispositions à développer des cancers.
	-	les polymorphismes présent dans les introns sont en général silencieux, sauf s'ils perturbent
	l'épissage de l'intron.
		Les polymorphismes localisés entre les gènes n'auront en général pas d'effet au niveau de
	l'organisme, sauf s'ils touchent des régions qui régulent l'expression des gènes.
		On admet maintenant que la plupart des polymorphismes présents dans les génomes sont
	neutres d'un point de vue évolutif, c'est à dire qu'ils n'entraînent ni avantages ni désavantages sélectifs.
		56

Les différents types de polymorphismes moléculaires

	Il existe de très nombreux types polymorphismes. Ce qui suit concerne principalement les
	polymorphismes qui sont retrouvés de manière abondante dans la nature.

Les modifications ponctuelles ou SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

	On appelle ponctuelles des modifications qui n'affectent que un ou quelques nucléotides. Ces
	modifications ne sont en général détectables au niveau de la molécule d'ADN que par séquençage. Ce
	sont soit des variations de nucléotides (sans changement du nombre de nucléotides) soit des
	insertions/délétions de 1 ou quelques nucléotides. Elles sont très fréquentes (voir plus haut).

Les Indels: duplication segmentales et transposons

	Très souvent des séquences diffèrent par la présence d'insertions / délétions de longues
	séquences d'ADN ou indel. Ceux-ci sont facilement détectables par PCR ou si la taille de la modification
	est importante, directement sur le caryotype (cf. variations chromosomiques). Certains de ces indels sont
	des duplications, voire des amplifications plus importantes de séquences du génome contenant
	éventuellement des gènes. On appelle ces séquences des duplications segmentales. Lorsque les
	séquences dupliquées sont les unes à la suite des autres, c'est à dire en tandem, le nombre de répétition
	est souvent très variable. Nous reverrons ceci plus en détail dans le paragraphe sur les
	mini/microsatellites.
	Cependant, dans la très grande majorité des cas, les indels sont dû à la présence absence de
	séquences d'ADN

mobiles que l'on appelle ""éléments transposables" ou transposons. Ces

  , qui se différencient des rétrotransposons par le fait que les rétrovirus ont une phase extracellulaire, alors que les rétrotransposons ne sortent pas de leur cellule hôte. Actuellement, il n'est pas clair de savoir si les rétrotransposons ont généré les rétrovirus ou l'inverse! Quoi qu'il en soit, ces transposons ont donc de grandes capacités d'envahissement des génomes car leur mécanisme de transposition est de type copier/coller.

	a pu montrer en détail comment les éléments Ds et Ac transposaient et comment ils altéraient
	l'expression des gènes voisins. Son travail a révolutionné les idées précédemment admises sur la stabilité
	du génome et ouvert la voie aux conceptions modernes sur la fluidité, la variabilité, la constante
	réorganisation des génomes (voir plus loin). Actuellement, suivant les modalités de leur déplacement, on
	distingue deux grands groupes principaux de transposons
	•	les transposons de type I ou rétrotransposons (= rétroposons) où la séquence du transposon se
	trouve amplifiée par des étapes de transcription et reverse transcription (figure 30). Certains sont
	apparentés aux rétrovirus
		morceaux
		d'ADN ont la propriété de pouvoir se répliquer indépendamment du chromosome et de s'insérer à
		différents endroits du génome. Ils peuvent donc "sauter" d'une région à une autre, ce qui explique le
		polymorphisme de leur présence ou absence à certains locus. Ils ont été découverts par Barbara Mc
		Clintock en étudiant chez le maïs des phénomènes d'instabilité génétique qu'elle a attribué à un élément
		mobile Ds (pour dissociation ) et à son compagnon l'élément Ac (pour activateur). Après plusieurs
		décennies d'études génétiques et moléculaires (travail commencé en 1940 jusqu'à sa mort en 1992), elle
		57

Figure 30: cycle

  des rétrotransposons et de rétrovirus. L'élément initial est présent dans le génome de l'hôte où il s'est intégré par recombinaison. Cet élément possède son propre promoteur ce qui permet sa transcription. L'ARN messager maturé est exporté dans le cytoplasme où il est traduit, ce qui permet la production d'une transcriptase inverse et/ou de protéines de capside. Dans le cas des rétrotransposons, la transcriptase inverse se sert immédiatement de l'ARN pour refaire un ADN double brin qui une fois importé dans le noyau peut se réinsérer. Dans le cas des rétrovirus, l'ARN est encapsidé et la particule virale exportée. Elle pourra alors infecter une nouvelle cellule hôte. Notez que l'on connaît des exemples où l'ARN du rétrotransposons est encapsidé mais la particule pseudovirale obtenue ne quitte pas la cellule.58 Il existe deux grands groupe de ces transposons de type I: les rétrotransposons à LTR qui sont proches des rétrovirus et les rétrotransposons sans LTR (figure31). La transposition des rétrotransposons à LTR est bien comprise; celle de ceux sans LTR l'est moins.

Figure 31: les deux grands types de rétrotransposons avec ou sans LTR. Les LTR pour Long Terminal Repeat sont de séquences d'ADN de quelques dizaines/centaines de paires de base, identiques et situées

  aux extrémités du transposons dans le même sens. Elles contiennent des séquences impliquées dans la transcription et la transcription inverse de l'élément. En général, ces rétrotransposons codent pour une protéine de capside (gag) et la transcriptase inverse pol. Les deux phases codantes sont généralement séparées par un codon stop ou un décalage de cadre d'une paire de base. La protéine pol est donc souvent traduite grâce à une erreur de traduction ce qui permet d'assurer un rapport correct de protéines de capside versus polymérase pour assurer un empaquetage correct d'une particule virale. D'autres rétrotransposons ont la même structure que les rétrotransposons à LTR mais n'ont pas de LTR. D'autres ont des structures plus simples et ne codent pas pour des protéines. Dans ce cas, il existe des éléments ailleurs dans le génome qui fournissent les enzymes nécessaires à la transposition. Lors de leur insertion,

les rétrotransposons provoquent des petites répétitions de l'ADN du site cible (DR) de quelques paires de bases.

Figure 32: les deux types de mode de transposition des transposons à ADN et le mécanisme d'intégration des transposons.

  Notez que les deux copies de LTR bordant les rétrotransposons du premier type peuvent être le siège d'un évènement de recombinaison, ce qui va aboutir à l'excision du transposon et au maintien dans le génome d'une seule copie de LTR (voir plus bas le mécanisme d'excision). Il ne reste donc que ce que qui possède des activités endonuncléase/recombinase, entouré de deux séquences répétées inversées ou ITR pour Inverted terminal Repeat. Ces transposons sont sujet à de nombreuses mutations et dans les génomes, il en existe souvent de copies tronquées. Elles sont incapables de bouger seules et ont besoin de transposases codées par les transposons pleine longueur. Les plus petits sont appelé MITE pour Miniature Inverted-Repeat Transposable Elements.

		lorsque les transposons de ce type s'excise, suivant le mécanisme mis en jeu, ils peuvent ou non laisser
		une "cicatrice". La cicatrice est variable en fonction de l'élément et peut être composée de quelques
		nucléotides provenant de l'élément ou d'une duplication de la région où l'élément est inséré. La
		transposition peut aussi être réplicative et ces transposons ont des potentialités plus importantes
		d'envahissement des génomes. Au moment de leur intégration, ces transposons créent, comme les
		transposons précédents, des petites duplications au point d'insertion qui vont laisser les cicatrices
		observées lors de leur excision.
		la structure de ces éléments est simple car ils sont composés d'un gène codant une
		'transposase'
	l'on appelle alors un "solo LTR". Ces solo LTR peuvent être très fréquents dans les génomes.
	•	Les transposons à ADN ou transposons de type II qui ne passent pas par un intermédiaire ARN
	(figure 32). La transposition peut être conservative (de type couper/coller): le transposon s'excise du
	fragment d'ADN et se réintègre à un autre endroit. Ces transposons n'ont donc pas a priori des grandes
	potentialités d'envahissement du génome. Ce qui est important d'un point de vue génétique, c'est que
		60

Figure 35: en haut, répartition des transposons dans différents génomes. En bas, un nid à transposon dans le génome de Podospora anserina. métabolismes particuliers. L'ensemble se comporte alors comme un transposon géant et se transfère éventuellement horizontalement entre bactéries.

		transposons peuvent s'insérer virtuellement bactéries qui le portent. Il existe de nombreux autres types de gènes pouvant être portés par des
		partout dans le génome et leur insertion peut plasmides: gènes de résistance à des antibiotiques, gènes de virulence, gènes d'enzymes de dégradation
		de substrats divers…	causer des inactivations de gènes ou des
		modifications de leur expression. -L'épisome F: Le plasmide F est circulaire double brin, fait 94,5 kb et se trouve à 1 copie par cellule
		Les éléments génétiques extrachromosomiques (figure 37). Il ne porte pas de gène de résistance ou autre mais il code pour de nombreux gènes
		Il s'agit principalement de plasmides et impliqués dans la formation de contacts entre cellules et du transfert du plasmide pendant la
		"conjugaison". En effet, on appelle F	autres épisomes. Néanmoins, dans certains cas il + les souches qui portent le plasmide F et F -celles qui ne le portent
		pas. Les souches F	peut s'agit d'ARN doubles brin apparentés à + ont de long "poils" sexuels qui permettent d'établir des ponts cytoplasmiques avec
		des souches F	certains -. Après établissement du contact entre une cellule F virus, + et une cellule F voire des -, le plasmide F est bactéries
		transféré uni-directionnellement de la souche F	endosymbiotiques. + vers la souche F -aboutissant à sa transformation en Par exemple, chez
		souche F	Saccharomyces cerevisiae le caractère "killer" est + . On appelle ce processus conjugaison ou abusivement cycle parasexuel et les F + sont alors
		appelées mâles et les F	conféré par des ARNs double brin alors que chez
		Figure 36: le plasmide pBR322, un des premiers	la paramécie, il est conféré par des bactéries
		plasmides de clonage chez Escherichia coli.
	•	chez les plantes, l'accumulation de transposons est extrême puisqu'ils peuvent représenter la
	fraction majoritaire du génome (60-80%); dans certains cas, comme chez le pin, où ils représenteraient Les plasmides sont surtout présents chez les bactéries où ils confèrent des résistances à divers
	100 000 MB d'ADN soit 50 fois le génome humain !!! antibiotiques et les archées, mais ils sont aussi détectés chez les eucaryotes. Chez les eucaryotes avec
	• quelques exceptions, ils sont localisés dans la mitochondrie ou le chloroplaste où ils ne semblent pas chez la drosophile, ils représentent 18% du génome.
	• promouvoir des avantages mais plutôt des inconvénients. Je vous rappelle que les plasmides ont permis chez le champignon Podospora anserina, on estime qu'il représente 5-10% du génome
	• le développement de systèmes de manipulation de l'ADN in vitro et de la technologie de l'ADN chez Saccharomyces cerevisiae qui est pauvre en transposon, il n'existe que 5 rétrotransposons
	(appelés Ty1 à Ty5 pour Transposons of Yeast) dont le nombre de copie varie en fonction des souches de recombinant en permettant le clonage et l'analyse des gènes. Pour plus de détail, je vous renvoie à vos
	quelques copies à plusieurs centaines, en particulier de solo LTR. • chez les bactéries, les transposons semblent plus rares, comme chez Escherichia coli, où ils représentent moins de 1% du génome. Chez les procaryotes, les transposons sont souvent modulaires. L'unité de base est appelée séquence IS pour séquence d'insertion. Formellement, elles sont l'équivalent des transposons eucaryote de type II. Des séquences IS peuvent encadrer des régions d'ADN contenant des gènes responsables de résistances à des produits toxiques (comme les antibiotiques) ou de cours de Biologie Moléculaire. Cette technologie sera considérée comme acquise dans ce livre dans le cas Dans la plupart des génomes, les transposons ne sont pas répartis au hasard (figure 35). En effet, des bactéries. Voici quelques exemples de plasmides et autres éléments génétiques facultatifs. ils sont concentrés au centromère dont ils constituent souvent la majeure partie. Ils sont aussi présents Chez Escherichia coli aux télomères et chez certains eucaryotes qui n'ont pas de télomérase, leur transposition permet le -ColE1 : Ce plasmide est circulaire double brin, mesure 9 kb et est présent à 10-30 copies par cellules. Il maintien de l'intégrité des extrémités des chromosomes. Ils sont enfin présents sous forme de "nids à est connu pour avoir donné son origine de réplication qui est à la base de la majorité des vecteurs que transposons" dans des régions situées au sein des bras chromosomiques. La plupart de ces nids à nous utilisons (pBR322, Puc18, pBluescript, etc.; figure 36). Il porte un gène de production de transposons sont empaquetés dans de hétérochromatine qui va inhiber leur expression. Néanmoins, les bactériocine (ici la colicine E1) qui est une protéine bactéricide et qui assure donc un avantage aux
			64

endosymbiotiques. Le caractère "killer" permet aux souches qui le portent de tuer les souches sensibles en secrétant une toxine à laquelle elles résistent.

Les facteurs de résistance ou antitoxines sont souvent portées par le même élément que celui qui porte les toxines. -femelles (figure

37

).

  'amplifier via la présence d'une origine de réplication. La vitesse de l'amplification de cet élément dépend des souches, mais son amplification semble une constante de toutes les souches sauvages étudiées. Cet élément permet de montrer les limites de la notion de polymorphisme des

	ensuite peut séléments génétiques extrachromosomiques. En bon franglais, on parle donc plutôt d'un élément
	"plasmid-like".
	Chez Saccharomyces cerevisiae une ADN polymérase et une ARN polymérase probablement impliquées dans l'expression et la
	-2µ : Le plasmide 2µ est circulaire double brin et fait 6,3 kb (figure 39). Il se trouve dans le noyau de réplication du plasmide. pAL2-1 confère un allongement de la longévité des souches qui le porte, ce qui
	levure à 20/30 copies par cellule. On ne comprend pas bien pourquoi il est maintenu dans les est en opposition à des plasmides similaires présents chez Neurospora crassa qui eux causent au
	populations, car il ne semble pas conférer d'avantage (résistance ou autres) aux souches qui le portent et contraire des syndromes dégénératifs accélérés.
	ne semble pas avoir de système de propagation efficace comme F. Pourtant, il est présent dans environ -senDNAα: nous avons vu dans la section précédente que le gène codant la sous-unité I de l'oxydase du
	70% des souches et se perd avec une fréquence inférieure à 0.001 %. Outre une origine de réplication cytochrome C chez Podospora anserina contient un intron original qui a la capacité de transposer (figure
	(ORI) et une région cis qui confère la stabilité du plasmide (STB), il possède quatre gènes codant pour des 40). Les copies transposées sont présentes dans une minorité des molécules de génomes et ne sont
	protéines dont deux (REP1 et REP2) sont impliquées avec STB dans l'équipartition du plasmide entre détectables que par PCR. Il a aussi la capacité de se retrouver sous forme de molécules circulaires extra-
	cellules mères et cellules filles et une (FLP1) dans un mécanisme de recombinaison spécifique qui permet chromosomiques qui s'amplifie au fur et à mesure que les souches sénescent. En particulier, il est
	l'interconversion du plasmide entre deux formes en catalysant la recombinaison entre les deux indétectable dans les souches jeunes, alors qu'il peut remplacer l'ADN mitochondrial dans la plupart des
	séquences FRT, ce qui permet de changer de mode de réplication et donc participe au contrôle du souches sénescentes. Le modèle pour expliquer la genèse de la première molécule extrachromosomique
	nombre de copies du plasmide. La dernière RAF1 contrôle aussi la stabilité et le nombre de copies du est basée sur la transposition de l'intron en amont de sa position, créant ainsi un doublet d'intron en
	plasmide. Le plasmide 2µ a servi de base pour générer de nombreux vecteurs pour introduire de l'ADN tandem direct. Une recombinaison entre les deux copies permet de libérer une molécule circulaire (voir
	chez la levure et le système FLP/FRT a permis la construction de systèmes de mutations conditionnelles. plus loin dans le livre, ce qu'il se passe lorsque deux séquences répétées en tandem recombinent) et qui
	67

Figure 39: le plasmide nucléaire 2µ de Saccharomyces cerevisiae. Chez Podospora anserina -pAL2-1: ce plasmide de 9.3 kb est localisé dans la mitochondrie de quelques souches de Podospora anserina (figure 40). Contrairement aux plasmides précédents, il est linéaire. Il code pour deux protéines:

  En effet, lorsqu'un gène est introduit par transformation dans une plante pour en multiplier le nombre de copies, il est très fréquent que toutes les copies, y compris celles déjà présentes dans la plante soient inactives, bien que les gènes soient dépourvus de mutations et soient transcrits normalement. L'extinction se situe au niveau de la stabilité des messagers qui sont dégradés par un mécanisme maintenant bien connu et qui implique une RNAase dont la spécificité est conférée par un ARNsi (figure48). On appelle ce phénomène la cosuppression. Il a été décrit pour la première fois chez des pétunias transformés par le gène de la synthase de chalcone, un enzyme impliqué dans la biosynthèse de pigment flavonoïdes, ou il altère la coloration des fleurs (figure48). Ce phénomène est cependant très général chez la plupart des eucaryotes où il est souvent connu sous le nom d'interférence à ARN. Il existe par exemple dans certains isolats naturels de pétunias qui n'ont pas de pigments au

• Les mécanismes dit de PTGS (pour Post Transciptional Gene Silencing) sont liés à des états régulatoires alternatifs (présence ou absence d'une nucléase spécifique) liés à des ARNs double brin. Ce mécanisme est par exemple responsable de l'extinction fréquente des transgènes dans les OGM de plantes. centre des fleurs. Nous reviendrons sur ce mécanisme qui est fréquemment utilisé pour inactiver les gènes chez de nombreux eucaryotes. • Chez Podospora anserina, il existe deux types de souches dans la nature qui diffèrent par la présence de deux allèles du gène het-S/s appelés, het-s et het-S. Comme pour le type sexuel de Neurospora crassa, le gène het-S/s contrôle l'incompatibilité végétative (voir ci-dessus). Quand des cellules het-s et het-S fusionnent; l'hétérocaryon het-s + het-S formé meurt rapidement. En fait, les souches portant l'allèle het-s présentent des propriétés particulières. Elles se présentent naturellement sous deux formes : sous la forme het-s pour 70% d'entre elles, elles sont incompatibles avec les souches het-S, mais elles peuvent se présenter aussi dans 30% des cas sous la forme het-s* qui n'est pas incompatible avec les souches het-S (figure 49). Ce qui est très surprenant, c'est que lorsque l'on prend ses souches het-s* et qu'on les met en contact avec une souche het-s alors elles deviennent het-s ! Cela s'explique par la transmission des souches het-s vers les souches het-s* d'un élément cytoplasmique et infectieux (figure 48) qui envahit donc le mycélium het-s* et le convertit en het-s. L'analyse génétique montre une ségrégation étrange non mendélienne, puisque: lors d'un croisement ♀ het-s* x ♂ het-s, 100% de la descendance est het-s* lors d'un croisement ♀ het-s x ♂ het-s*, 100% de la descendance est het-s confirmant une ségrégation avec le cytoplasme puisque le gamète femelle transmet l'état het-s* ou hets. Plus étrange, lors de croisements entre souches het-s et het-S, la descendance portant l'allèle het-s est het-s* dans 100% des cas (figure 49), comme si het-s avait disparu! Le caractère peut réapparaître, le passage d'une souche het-s* vers une souche het-s, se faisant spontanément avec une fréquence faible.

  On constate une variabilité entre organismes mais aussi pour différents caractères à l'intérieur d'une même espèce. En fait ces données sont globales et ne tiennent pas en compte un certain nombre Escherichia coli avec les séquences IS. Dans un génome "non stabilisé", c'est à dire en voie d'envahissement par un transposon, la fréquence de transposition peut être beaucoup plus élevée : 10 Drosophila melanogaster est un transposon à ADN de type II nouvellement arrivée chez cette mouche. Avant 1940, les souches de drosophile collectées dans la nature et cultivées dans les laboratoires sont toutes de type M c'est-à-dire dépourvues d'éléments P. Depuis 1960 les souches naturelles sont envahies d'éléments P, sur toute la planète, même dans des endroits très reculés. Elles sont dites de type P. L'élément P provient d'une autre espèce: Drosophila willistoni, dans un foyer d'Amérique centrale où ces deux espèces cohabitent. Quand on croise des souches M avec des

				-3
	de données, dont: à 10 -4 .
	• Exemples	le nombre de gènes différents qu'il est possible de muter pour obtenir le caractère en question.
	différents organismes: organisme exemples -Chez Escherichia coli, le taux de mutations spontanées pour obtenir des souches résistantes à la changement de phénotype taux de mutation streptomycine est de l'ordre de 10 -12 par réplication, car la résistance ne peut être obtenue que grâce à quelques mutations affectant quelques codons d'un seul gène codant une protéine ribosomale. Au contraire, le taux de mutation pour le caractère croissance lente est de l'ordre de 10 -6 car plusieurs centaines de gènes sont impliqués dans la croissance d'Escherichia coli. • L'élément P de plus forte 10 -5 à 10 -6
	bactériophage T2	inhibition de la lyse changement spécificité d'hôte	10 -8 gènes mutants/réplication 3.10 -9 gènes mutants/réplication
	Escherichia coli Enfin, une mention particulière doit être fait pour les transposons car ils sont la cause de capacité à fermenter lactose vers incapacité 2.10 -7 cellules mutantes/division cellulaire
	Chlamydomonas nombreuses mutations. En fait chez de nombreux organismes, les transposons sont les principales sensible à la streptomycine vers résistant 10 -8 cellules mutantes/division
	reinhardtii Neurospora crassa sources de mutations spontanées. Chez la drosophile, on estime par exemple que 50% des mutations cellulaire prototrophie pour l'inositol vers auxotrophie 8.10 -8 spores mutantes/spores totales
	Drosophila melanogaster spontanées sont dues à des transposons. Dans un génome "stabilisé", la fréquence de transposition est oeil rouge brique oeil blanc 4.10 -5 gamètes mutants/gamètes totaux Homo sapiens Chorée de Hungtington (maladie autosomale 10 -8 gamètes mutants/gamètes donc du même ordre de grandeur que celle des mutations spontanées soit environ 10 -6 . De même, la
	dominante) dystrophie musculaire de Duchenne (maladie fréquence de réversion, correspondant à l'excision d'un transposon qui causait une mutation, et qui totaux 4-10.10 -5 gamètes mutants/gamètes
			récessive)	totaux

L'exemple du test de fluctuation de Luria et Delbrück semble indiquer que le taux des mutations spontanées est très faible en conditions normales (c'est à dire en l'absence des agents mutagènes mentionnés plus haut), d'autant plus que la résistance au bactériophage pourrait être causée par des mutations localisées dans de nombreux gènes différents et que donc le taux de mutation pour chaque gène est encore plus faible. En fait les taux de mutation peuvent varier grandement en fonction de nombreux paramètres. Par exemple, voyons quelques taux de mutations pour certains caractères chez -De même, si on part d'une souche de levure Saccharomyces cerevisiae prototrophe, il est possible de trouver avec une fréquence assez élevée des souches auxotrophes car on estime à environ 200 le nombre de gènes impliqués dans les biosynthèses de métabolites. Une mutation, qui inactive l'un de ces gènes, est suffisante pour entraîner l'auxotrophie. Par contre, si on recherche une auxotrophie pour un métabolite particulier (acide aminé ou base), ce taux sera beaucoup plus faible. • la redondance des gènes. En effet, s'il existe deux copies (ou plus) du même gène dans le génome il sera très difficile de trouver des mutations qui abolissent le fonctionnement des deux gènes en même temps (celles-ci sont en général récessives). Souvent les mutations obtenues dans ce cas altèrent la régulation des gènes en abolissant simultanément l'expression de toutes les copies. Elles ne sont donc pas localisées dans les gènes en question mais dans leur régulateur ! Par contre, pour chacun des gènes, il est possible d'obtenir des mutations dominantes. Si on considère le taux de mutation par gène, il existe aussi une variabilité entre gènes liée à la taille du gène, à la sensibilité du produit codé aux changements d'acides aminés (ou des bases !), etc. entraîne donc retour au phénotype sauvage, est de l'ordre de 10 exemple chez mouches de type P on reconstitue l'envahissement, et les éléments P qui transposent provoquent un taux de mutations 1000 fois supérieur au taux de mutation spontané usuel. Dans certaines conditions, en laboratoire, la fréquence d'excision et de transposition de P peut aller jusqu'à quelques pourcents. • Chez les plantes, certains transposons sont exceptionnellement mobiles : c'est le cas de Tam4 chez la gueule-de-loup Antirrhinum majus où les fréquences de transposition et d'excision atteignent quelques pourcents ; de plus il y a des transpositions fréquentes dans les cellules somatiques, ce qui peut se voir phénotypiquement, par exemple par des feuilles ou des fleurs tachetées. • Dans le cas des transposons de type I de la levure Saccharomyces cerevisiae (transposons Ty), on estime la fréquence de transposition à un événement toutes les 20 générations, soit une fréquence d'environ 10 -6 par génération. La fréquence d' "excision" mesurée expérimentalement est légèrement . Cette fréquence mesure en fait la fréquence de recombinaison entre les deux LTR pour générer des solo LTR. En résumé, il n'existe pas de règle fixe. Cependant, à l'intérieur d'une lignée pure, le taux de mutation se maintient dans une certaine fourchette et il est possible de caractériser certains types d'organismes comme mutant facilement et d'autres difficilement, en relation vraisemblablement avec la présence de transposons plus ou moins actifs. Néanmoins, il est possible de détecter à l'intérieur d'une même espèce des individus qui présentent des taux de mutations différents. En particulier, chez certains individus, il existe des mutations qui augmentent dramatiquement le taux de mutations pour tous les caractères. Ces mutations sont appelées mutateurs ou hypermutateurs. Elles ont été bien décrites chez

  pas essentiels. C'est à dire que la cellule survie très bien s'ils sont délétés. Cela provient le plus souvent de la redondance des gènes et des systèmes dans la cellule.Les délétions peuvent aussi servir pour la cartographie. Je vous conseille de résoudre le problème de TD pour comprendre comment cela fonctionne.Nous avons vu que ces évènements sont très fréquents et une bonne partie des mutations dans les populations naturelles est en fait liée à des évènements de transposition. Les effets sont de deux types. Le transposon peut s'insérer dans un gène et l'inactiver. Mais, il peut aussi s'insérer dans ses régions régulatrices et en déréguler l'expression.

	Philippe Silar	Génétique : Concepts de Base et Notions Approfondies
	individuellement ne sont Les transpositions
	présence d'un codon stop au début de la phase codante ou une mutation dans l'ATG initiateur sont aussi
	en théorie des allèles nuls, mais ce type de mutations peut réserver des surprises). On sait maintenant
	les créer à volonté comme indiqué dans le chapitre 3. De manière surprenante la plupart des gènes pris
		96

exemples • AAG → AAC → AAG qui donne lysine → asparagine → lysine. Il s'agit d'une réversion vraie • AAG → AAC → AAA qui donne lysine → asparagine → lysine qui est une réversion Les délétions Celles-ci peuvent englober une partie d'un gène, un gène entier ou plusieurs gènes. Leurs effets sont souvent drastiques. Si la délétion est de grande taille, elle englobe plusieurs gènes dont certains peuvent être essentiels. Les grandes délétions sont donc, en général, létales chez les haploïdes. Leur intérêt réside dans le fait que si un gène est délété (et uniquement ce gène), on peut connaître grâce au phénotype que cela entraîne le rôle de ce gène. On dit qu'on est en présence de l'allèle nul (notez que la exemples • Chez Saccharomyces cerevisiae, l'insertion d'un transposon Ty en amont du gène ADH2, normalement induit par l'éthanol et réprimé par le glucose, rend la synthèse de l'alcool déhydrogénase constitutive. • Chez la drosophile: insertion d'un transposon copia dans le deuxième intron du gène white perturbe la transcription et provoque l'apparition d'yeux orange au lieu de rouge brique.

Quelques notions de génomique Qu'est-ce que la génomique ?

  102 causent le syndrome de Patau et la trisomie du chromosome 18 le syndrome d'Edwards qui sont létales très tôt chez les enfants atteints. Les individus XXY ont le syndrome de Klinefelter. Ils sont de sexe masculin mais présentent plusieurs problèmes dont la stérilité. Les individus XYY ou "double Y" sont quant à eux quasi indistinguables des hommes XY; ils sont souvent un peu plus grands que les individus XY. Le fait que ces individus auraient des tendances plus agressives et auraient des tendances criminelles est faux! Les monosomies autosomales de chromosomes complets sont létales chez l'homme. Celle du chromosome X entraîne le syndrome de Turner. La plupart des embryons atteints avortent et les individus porteurs du syndrome et qui naissent ont des problèmes multiples, incluant la stérilité. Les aneuploïdies peuvent aussi se produire en mitose au cours du développement embryonnaire et dans ce cas, seule une partie des cellules de l'individu sera affectée: on dit qu'il est formé d'une mosaïque Initié par la détermination des séquences complètes des génomes de divers organismes (voir la table suivante qui donne les étapes importantes jusqu'à la publication du génome humain en 2001), la génomique est la sous-discipline de la génétique qui regroupe les connaissances génétiques sur un

	Philippe Silar	Génétique : Concepts de Base et Notions Approfondies
	malheureusement donné des plantes avec des racines de choux et des feuilles de radis, sans donc aucun Espèce Date de publication Taille
	intérêt agronomique !!! Bacteriophage phi X174	2/24/1977 -1er virus	5,375
	2n = 6x = 42) et le seigle (qui est un diploïde: 2n = 2x = 14). La F1 de ce croisement comporte 21 + 7 chromosomes qui malheureusement ne séparent pas à la mitose. On obtient ainsi des amphiploïdes (2n = 2x 28) qui sont fertiles et qui ont la une idée des mécanismes d'adaptation des organismes à leur environnement. le nombre de chromosomes car sans fuseau, il n'y a pas d'anaphase et donc les chromosomes ne se dire de profils d'expression transcriptionnelle de tous les gènes, dans différentes conditions afin d'avoir peuvent faire une méiose car chaque chromosome est unique. L'ajout de colchicine a permis de doubler Génome mitochondrial humain 4/9/1981 -1er génome mitochondrial 16,569 Bacteriophage Lambda 12/25/1982 48,502 Virus d'Epstein-Barr 7/19/1984 172,281 Human cytomegalovirus AD169 12/6/1989 229,354 Haemophilus influenzae 7/28/1995 -1ère cellule 1,830,138 Synechocystis sp. 6/30/1996 3,573,471 Saccharomyces cerevisiae 5/29/1997 (publication Nature) -1er eucaryote ~12 000 000 Escherichia coli 9/5/1997 4,639,221 Chapitre 2: Enfin, une large part actuelle de la génomique consiste dans la détermination de transcriptomes, c'est à Génome nucléaire humain 2/15/2001 3 200 000 000 x 2
	résistance du seigle et le rendement du blé. La même technique avec le chou et le radis a
		103 104 105

génétique. Les individus affectés peuvent avoir des problèmes plus ou moins importants en fonction de la proportion de ses cellules aneuploïdes. Souvent, seule une partie des chromosomes est manquante ou surnuméraire; ils ont des aneuploïdies partielle. Là encore les individus porteurs ont des problèmes variés en fonction des fragments de chromosomes impliqués.

Nous avons vu avec les X attachés que chez la drosophile le chromosome X peut se trouver en trois copies (dont deux attachés). Chez la levure par contre les aneuploïdies sont viables (à conditions d'avoir au moins un jeu complet de chromosomes !) et très fréquentes dans les populations naturelles, en particulier dans certaines souches que l'on utilise pour faire du vin. Souvent ces aneuploïdies créent des difficultés d'appariement au niveau de la prophase de la première division de la méiose et entraînent ainsi des diminutions de la fertilité.

Un autre phénomène assez fréquent est la polyploïdisation. Celle-ci se produit lorsqu'il y a duplication du jeu de chromosome sans division du noyau. Je vous rappelle que la colchicine entraîne ce genre d'anomalies. On a ainsi cherché à créer de nouvelles plantes d'intérêt agricole. Par exemple, le triticale a été obtenu en croisant le blé (qui est en fait un hexaploïde: organisme et tente de les synthétiser. Elle traite en particulier de l'organisation globale des génomes. Un génome est alors défini principalement par les généticiens moléculaires: il s'agit de la totalité des séquences d'ADN et d'ARN qui font partie de l'information transmise aux descendants par les parents. Notez qu'il est possible maintenant d'avoir accès aux changements structuraux de l'ADN associés aux séquences génomiques comme la méthylation de l'ADN ou les modifications des histones favorisant ou défavorisant la formation hétérochromatine. La génomique s'intéresse donc aussi à certains mécanismes épigénétiques qui vont structurer le génome et avoir un impact sur son expression. La génomique nous permet par exemple d'analyser et de comparer les génomes des différents organismes (au sein d'une même espèce ou entre espèces différentes) et donc de mieux comprendre leur fonctionnement, (aussi bien dans leur ressemblance que leur dissemblance) et leur évolution. La disponibilité de la séquence facilite aussi les analyses de génétique dirigée, comme expliqué dans le chapitre suivant. Cette facilité a été poussée jusqu'au point où des collections de souches inactivées pour chacun des gènes non essentiels sont disponibles pour plusieurs organismes, voir tous les gènes chez certains diploïdes où les inactivations peuvent être conservées à l'état hétérozygote comme Saccharomyces cerevisiae (consultez le site du SGD pour en savoir plus: https://www.yeastgenome.org/). Actuellement, les coûts et efficacités de ces techniques sont tels, qu'il est possible de faire séquencer son génome pour quelques centaines d'euros. Des grands programmes visant à établir des génomes et transcriptomes à haut débit sont en cours. Souvent appelé "1000 génomes", ils se déclinent par exemple chez l'homme (1000 human genomes: https://www.internationalgenome.org/), les champignons (1000 fungal genomes: https://mycocosm.jgi.doe.gov/mycocosm/home) ou les animaux avec cette fois 10 000 génomes (https://genome10k.soe.ucsc.edu/). Pourtant, les premiers génomes séquencés l'ont été au prix d'efforts pécuniaires et humains considérables. Nous allons voir donc les deux stratégies principales utilisées pour établir les séquences des génomes. Pour l'aspect technique du séquençage, je vous renvoie aux cours de biologie moléculaires Stratégies

pour séquencer des génomes complets Première stratégie

  Cette stratégie est plus longue mais plus sûre ! C'est celle adoptée par les consortiums publics de séquençage du génome de Saccharomyces cerevisiae ou du génome humain. 1°) cloner dans des cosmides ou des BAC (Bacterial Artificial Chromosome) des longs fragments du génome. Les BAC sont des plasmides simple-copie dérivés du plasmide F qui peuvent accepter jusqu'à bactérie) et la représentativité du génome (peu de chance d'avoir un gène trop exprimé et délétère pour la bactérie), ce qui n'est pas forcément le cas avec les cosmides qui recombinent plus dans Escherichia Cela revient à obtenir les séquences pour chaque cosmide/BAC. L'arrangement final des séquences se faisant grâce à la carte. Cette méthodologie n'est plus vraiment utilisée. Elle a été remplacée par la stratégie suivante moins demandeuse en temps, mais qui est moins fiable.Cette méthode est rapide mais nécessite des outils informatiques très puissants, ce qui n'est plus un problème grâce à l'augmentation des performances des ordinateurs. Par exemple pour le génome humain, il faut comparer 32 000 000 séquences entre elles ! Elle suppose aussi qu'il n'y a pas trop de séquences répétées car dans ce cas, l'analyse informatique ne permettra pas facilement de donner la séquence dans le bon ordre ! on dit par exemple que Celera s'est "aidé" du génome "publique" pour établir sa séquence ! De toute manière, il faut vérifier qu'il n'y a pas eu d'erreurs à l'assemblage en comparant cette séquence avec soit une carte de restriction, soit une carte génétique.Il existe maintenant des machines capables de générer plusieurs dizaines de millions de séquences de cours fragments d'ADN de quelques dizaines à quelques centaines de nucléotides à partir d'ADN génomique fragmenté. La méthode la plus utilisées actuellement est celle d'Illumina Prédictions de novo des régions potentiellement codantes. Il est possible maintenant de prédire les régions codant pour des protéines, des ARNt, des snRNA… en se basant sur des caractéristiques de ces régions. Pour les ARNt, il s'agit des structures secondaires et de l'anticodon, pour les protéines, il s'agit des consensus de démarrage et fin de traduction, de biais de codons, de signaux d'épissage etc.•Utilisation de la conservation évolutive des régions codantes. Pour ceci, il faut comparer les ORF (Open Reading Frames qui sont les séquences situées entre deux codons stop) présentes dans la séquence avec les banques de données afin d'identifier celles conservées au cours de l'évolution et qui ont donc de grandes chances de coder pour une information. Cette étape permet en même temps de prédire la fonction potentielle des gènes ainsi détectés.Le plus souvent, les trois méthodes sont appliquées et un consensus des trois prédictions est

	Philippe Silar	Génétique : Concepts de Base et Notions Approfondies
	coli.
	2°) cartographier ces cosmides et/ou BAC soit moléculairement avec des enzymes de restrictions ou des
	amplifications PCR (il existe de nombreuses méthodes !), soit en s'ancrant sur une carte génétique, si
	celle-ci est suffisamment dense.
	3°) séquencer les cosmides/BACs adjacents en utilisant la première méthode.
	champignons filamenteux, protistes et algues à petits génomes (< 100 Mb). Les génomes plus gros Deuxième 3°) séquencer automatiquement les inserts et rapatrier les séquences dans des fichiers. demandent toujours des gros ordinateurs…
	4°) utiliser des programmes qui permettent à partir des fragments de séquence de faire des contigs. Enfin, les séquences des ARN par "RNAseq" (voir vos cours de BM) sont généralement réalisées
	5°) combler les trous soit en clonant de manière dirigée les régions manquantes, soit par PCR en afin de pouvoir annoter correctement le génome. En effet, nous n'avons pas discuté cette étape finale du
	amplifiant à l'aide d'amorces localisées au bord des contigs. Il faut bien sûr ensuite séquencer ces travail: la définition des gènes présents dans le génome. Il existe trois types d'annotation:
	régions.
		107

stratégie

Cette stratégie a été utilisé pour la première fois par la compagnie privée Celera pour séquencer le génome de drosophile et le génome humain. Dans sa première version, elle utilisait toujours le séquençage de Sanger classique: 1°) fragmenter aléatoirement le génome par des méthodes physiques (qui sont plus aléatoires que l'utilisation de méthodes enzymatiques), tel que les ultrasons ou la nébulisation (utilisation d'un gaz sous pression) pour générer des fragments d'environ 1 kb (je vous rappelle que c'est la taille maximum de séquence fiable obtenue en une seule réaction avec les technologies disponibles). Cela évite aussi l'apparition de "gènes" qui serait toxique pour la bactérie qui est utilisée à la deuxième étape (c'est à dire Escherichia coli !). 2°) cloner les fragments dans un vecteur plasmidique et obtenir une banque totale du génome (on estime qu'il faut une couverture d'au moins 10 X le génome, c'est à dire que la taille combinée des inserts présents dans la banque doit être 10 fois plus importante que la taille du génome, un peu de statistique montre que dans ces conditions, environ 99,9% du génome devrait être séquencé une fois.

(https://www.illumina.com/). Des améliorations permettent de plus par exemple de séquencer le génome d'une seule cellule par cette méthode (https://www.illumina.com/content/dam/illuminamarketing/documents/products/research_reviews/single-cell-sequencing-research-review.pdf)! Des programmes informatiques permettent ensuite de reconstituer le génome, mais celui-ci est souvent très fragmenté (plusieurs milliers de morceaux…). Pour pallier à ce problème, des méthodes comme celle du PacBio (https://www.pacb.com/) ou du Nanopore (https://nanoporetech.com/) permettent de séquencer plusieurs milliers de nucléotides en continu, ce qui va permettre d'améliorer les assemblages. Malheureusement, les séquences obtenues contiennent de nombreuses erreurs et ces techniques appliquées seules ne donnent pas de bons résultats. Actuellement, la méthode de choix est donc la suivante: 1°) séquencer par Illumina et PacBio ou Nanopore 2°) assembler en utilisant des programmes dédiés qui permettent de combiner les deux types de séquençage comme Unicycler. Cette étape peut maintenant se faire sur un ordinateur de bureau en quelques heures pour des génomes bactériens ou des "petits eucaryotes" comme les levures, • L'utilisation de séquences d'ARN; c'est à dire maintenant de données de RNAseq. • retenu. Les programmes de séquençage proposent donc souvent deux listes: celles de toutes les prédictions qui est la réunion des CDS (= séquences potentiellement codantes) obtenues par les trois méthodes et celles qui sont les plus probables (qui correspondent grosso modo plutôt à l'intersection des trois méthodes). Il ne reste plus ensuite qu'à déposer la séquence dans les banques de données comme GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), ENA de l'EMBL (https://www.ebi.ac.uk/ena) ou DDJB (https://www.ddbj.nig.ac.jp/index-e.html). Ces trois banques échanges leurs données de manière régulière et contiennent les mêmes données mais présentées de manières différentes. Depuis quelques années, elles ne contiennent plus la totalité des séquences disponibles et il faut maintenant naviguer sur de nombreux sites pour accéder aux séquences… Il existe de nombreux programmes qui permettent la visualisation de ces séquences (voir par exemple le "genome data viewer" du NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/gdv/). Un programme de visualisation en local (artemis; https://www.sanger.ac.uk/science/tools/artemis) lit facilement les fichiers d'annotation téléchargeables à partir des banques de données (GenBank ou EMBL) et permet de voir simplement les caractéristiques des génomes sur votre ordinateur personnel, ce que la section suivante va faire! 109

  La figure 64 présente la phylogénie globale actuelle. Pour rappel, les animaux font partie des Holozoa, les plantes des Archaeplastida et les champignons des Holomycota, le reste des eucaryotes étant des "protistes".La table suivante vous donnent un ordre de grandeur des génomes, en paire de bases et en gènes, ainsi que la taille moyenne des gènes chez quelques organismes -le plus souvent utilisés comme Chez les procaryotes, les génomes sont compacts et leur capacité codante est utilisée au mieux.Le génome est généralement un chromosome circulaire (figure65), mais dans certains cas plusieurs chromosomes peuvent être présents et certains chromosomes bactériens sont linéaires (chez Streptomyces lividans par exemple). Les gènes sont regroupés en opérons. L'évolution des génomes procaryotes se fait principalement par des évènements de recombinaisons, générateurs d'inversions et de délétions. Les analyses phylogénétiques de comparaison de séquence montrent aussi que les

		Amoebozoa	Dictyostelium	34	~12 500		1.9 kb
			discoideum
		Microsporidia	Encephalitozoon	2.9	~2 000		1.1 kb
			cuniculi
		Eumycota	Saccharomyces	12	~6 400		2 kb
			cerevisiae
			Podospora anserina	35.5	~11 700		1.8 kb
	modèles pour les analyses génétiques -appartenant aux différents groupes biologiques mentionnés dans Neurospora crassa 41 ~10 700 2.5 kb
	la figure 64.
		Metazoa	Caenorhabditis	100	~18 000		3 kb
			elegans
			Drosophila	~140	nb de gènes ~18 000	taille 3 kb
			melanogaster	taille	codant	des	moyenne des
			Danio rerio	(Mb) ~1	protéines ~25 600		gènes 11 kb
	Eubactéries		Escherichia coli	4.6 400	~4 400		1 kb
			Mus musculus	~2	19000 -24 500		10.5 kb
			Streptomyces lividans	8.3 700	~7 300		1 kb
			Homo sapiens	3 286	~20 000		14 kb
			Mycoplasma	0.58	483		1 kb
			genitalium
	Archées		Pyrococcus abyssi	1.7	1 765		1 kb
			Archeoglobus fulgidus	2.2	2 437		0,8 kb
	Eucaryotes	Excavata	Giardia lamblia	12	~6 500		1.3 kb
		Heterokonta	Ectocarpus silicosus	196	~12 200		6.8 kb
		Hacrobia	Emiliania huxleyi	168	~40 000		1.6 kb
		Dinoflagellata	Symbiodinium	808	~43 000		12.2 kb
			microadriaticum
		Apicomplexa (SAR) Plasmodium	23	~5 200		2.2 kb
			falciparum
		Ciliophora (SAR)	Paramecium	72	~40 000		1.6 kb
			tetraurelia
			(macronoyau)
		Plantae	Chlamydomonas	111	~16 400		5.4 kb
		(Archaeplastida)	reinhardtii
			Physcomitrella patens	~500	~36 000		2.4 kb
			•	Homme : 3 200 Mb
			• Populus trichocarpa	Protoptère : 140 000 Mb ~500 ~45 500	2.2 kb
			Arabidopsis thaliana	138	~27 600		2.0 kb
			110 111

Notez que ces chiffres peuvent être amenés à changer car il s'agit d'estimations et les tailles et contenus en gènes varient en fonction des souches (voir plus bas). De plus, si pour certains génomes comme celui de Saccharomyces cerevisiae le génome et le contenu codant sont bien connus, pour d'autres espèces, les données sont plus incertaines: on ne sait par exemple toujours pas le nombre exact de gènes chez l'homme! La séquence complète des génomes de nombreux organismes permet maintenant de mieux comprendre comment ils évoluent. De ces études qui dépassent le cadre de ce cours, nous retiendrons cependant quelques tendances marquantes :

• génomes procaryotes ne sont pas complètement imperméables: il existe de nombreux transferts latéraux de gènes. Chez les archées on peut retrouver des gènes dont la séquence est plus proche de

table suivante

 suivante

		% d'intégration homologue
	Chlamydomonas reinhardtii	1‰ à 2.5%
	Physcomitrella patens	>50% dès que la région d'homologie > 1 kb
	Arabidopsis thaliana	0% (situation de toutes les plantes "supérieures")
	Dictyostelium discoideum	~1%
	Saccharomyces cerevisiae	>90% dès que la région d'homologie >50 bp
	Podospora anserina	1-10% si taille de la région d'homologie <10 kb, 30% si taille >20 kb
	Neurospora crassa	1-20% en fonction de la taille
	Alternaria alternata	30-80% molécules circulaires -100% molécules linéaires
	Caenorhabditis elegans	1‰-1%
	Drosophila melanogaster	<1‰
	Danio rerio	10-50%
	Mus musculus	<1%
		:

Dans le cas où le pourcentage de recombinaison homologue est faible, les généticiens utilisent maintenant des souches receveuses dans lesquels les gènes codant les sous-unités ku70 ou ku80 ont été inactivés. Dans de telles souches, la fréquence de recombinaison homologue dépasse le plus souvent 90% voire 99%.

  Le croisement des descendants hétérozygotes entre eux permet d'obtenir les homozygotes afin d'évaluer leur phénotype. La présence du remplacement et de l'allèle sauvage par PCR permet de déterminer le statut des descendants F2 car ceux-ci peuvent toujours être hétérozygotes ou homozygotes sauvages.

	•	la présence dans l'ADN d'un gène impliqué dans la biosynthèse d'un métabolite et l'utilisation
	comme réceptrice d'une souche auxotrophe mutée pour ce gène. Les transformants sont sélectionnés
	sur leur retour à la prototrophie.
		Ce système est largement utilisé chez les champignons (levures et filamenteux; figure 84),
	Chlamydomonas ou même la souris chez qui l'inactivation de gènes prend plus d'étapes du fait qu'il faut
	transformer des cellules en culture et ensuite les réintroduire dans des embryons afin d'obtenir des
	souris mutantes (figure 85).
		Ces méthodes de remplacement de gènes sont maintenant bien maîtrisées chez de nombreux
	organismes eucaryotes, en particulier chez Saccharomyces cerevisiae, chez qui les collections des
	délétions de tous les gènes ont été générées de cette manière en utilisant le marqueur de résistance à la
	sélection" de l'intégration, ici le gène sacB qui permet la production d'une substance toxique en
	présence de saccharose chez Bacillus subtilis. Cela va permettre de sélectionner des évènements de
	recombinaison entre les copies intactes et délétées qui vont conduire à l'élimination le gène sacB. En
	fonction des sites du crossing-over (indiqués dans la figure par les extrémités des accolades), il y a le

Il est possible de faire le remplacement directement sur une souche haploïde mais si le gène est essentiel, aucun mutant ne sera obtenu. Il est donc conseillé comme sur le schéma de transformer avec la cassette de remplacement une souche diploïde. Dans ce cas, une seule des deux copies est remplacée car le remplacement simultané des deux copies est extrêmement rare. Les transformants sont sélectionnés sur leur retour à la prototrophie alors que la souche de départ est auxotrophe pour l'uracile. L'efficacité du remplacement est telle que seule une vérification par PCR est nécessaire pour s'assurer que le remplacement a bien été fait. Pour ceci, il faut utiliser des amorces situées à l'extérieur de la région d'homologie utilisée pour faire le remplacement (amorces 1 et 2). Seuls les transformants ayant un remplacement correct donneront des bandes de tailles connues en utilisant les couples d'amorces 1+3 et 2+4. Une méiose permet d'obtenir des tétrades. Si les 4 ascospores sont viables alors le gène n'est pas essentiel. Si seulement les deux spores URA3 -sont viables alors le gène est essentiel. Chez les champignons filamenteux, il est recommandé de vérifier la délétion par Southern blot car il existe des évènements d'insertion complexes ou l'allèle remplacé et l'allèle sauvage sont tous les deux présents. De même, la plupart étant essentiellement haploïdes, l'obtention de remplacement de gènes essentiels est plus difficile mais pas impossible. kanamycine A. Je reviendrai sur ces collections dans la section sur la mutagenèse classique car elles peuvent être utilisées pour sélectionner des mutants facilement. De même une collection de délétion de la majorité des gènes de Neurospora crassa est aussi disponible. Chez la souris, il existe des compagnies de biotechnologie qui font le travail pour vous… Dans le cas des bactéries, la stratégie est légèrement différentes (figure

86

).

En effet, chez beaucoup de bactéries, les délétions passent par l'utilisation de plasmides "suicide", c'est à dire incapable de se répliquer, ce qui va forcer leur intégration dans le génome. Il existe plusieurs stratégies pour ce faire. On peut par exemple construire la cassette de délétion (une délétion interne du gène "rose" dans la figure

86

) dans un plasmide qui se réplique chez Escherichia coli mais qui ne se réplique pas chez la bactérie pour laquelle on souhaite déléter le gène (Bacillus subtilis dans la figure

86

). De manière alternative il existe des origines de réplication thermosensibles. Il suffit donc de passer les bactéries à température non permissive et de sélectionner le maintien du plasmide en incorporant l'antibiotique que le marqueur de résistance R sert à détoxiquer. Un évènement de recombinaison homologue permet d'obtenir l'intégration au gène et une structure où les copies délétées et intactes entourent le plasmide. Celui-ci porte un deuxième gène qui va permettre une "contre maintien de la copie sauvage ou le remplacement par la copie mutée. Il existe des collections de mutants Figure 85: remplacement de gènes chez la souris. Dans le cas d'organismes pluricellulaires, il faut transformer la lignée germinale, ce qui n'est pas simple même si des systèmes à base de virus peuvent être envisagés. Dans le cas de la souris, le plus simple est de faire le remplacement de gènes sur des cellules totipotentes en utilisant la résistance à la généticine (=G418). Comme dans le cas de la levure, une seule des deux copies est remplacée. La vérification d'abord par PCR comme chez la levure permet de trier les candidats. Il est recommander de vérifier ces candidats par Southern Blot car il existe des évènements d'intégration complexes que seul une analyse plus poussée permet de cribler. Une fois le remplacement assuré, la lignée totipotente mutante est injectée dans des embryons de souris; il est recommandé de choisir des souris de phénotypes différents pour faciliter la détection des souriceaux chimère ou mosaïques qui vont résulter de l'intégration des cellules injectées dans l'embryon; des souris ayant des différences de couleur de pelage offrent une façon simple de trier. Il faut aussi espérer que la lignée germinale des souris mosaïques F0 contient des cellules mutantes afin que leur descendance F1 contienne la mutation; sa présence peut être détectée par PCR comme indiqué figure 84. La descendance 138 F1 sera hétérozygote et devrait donc vivre.

  séquence PAM pour Protospacer Adjacent Motif: NGG) si la protéine CAS9 provient de Streptococcus pyogenes. Notez que cette séquence PAM est différente entre les différentes endonucléase CAS9 et il est donc possible de couper à différents endroits en utilisant différentes CAS9. Notez qu'il existe des programmes qui permettent de choisir le site de coupure idéal. Une fois la cassure double brin

	exécutée par la protéine CAS9 au niveau du 16	ème nucléotide hybridé, elle est réparé par la machinerie
	cellulaire, soit via le système de réparation des cassures double brin, soit via le système de non-
	homologous end joining. Si aucune matrice n'est fournie (cas n°1), la réparation à l'identique entraîne une
	nouvelle coupure et ce jusqu'à ce qu'une mutation (en bleu) au site de coupure empêchant l'hybridation
	se produise. Cela aboutit donc à la création de mutations ponctuelles (faux-sens, non-sens ou frameshift)
	au site de coupure. Si une cassette de délétion est fournie comme matrice pour exécuter la réparation,
	ceci peut aboutir au remplacement du gène par le marqueur de résistance (cas n°2), enfin une matrice
	portant une mutation désirée (en rouge) peut être fournie (cas n°3); dans ce cas la réparation peut
	aboutir à un changement précis de nucléotide ou par exemple à une délétion propre entre les codons start
	et stop d'un gène.
	cause de processus de régulation et qu'en particulier chez certains organismes, on constate une
	inactivation des gènes en plusieurs exemplaires par méthylation ou PTGS (voir la section sur
	l'épigénétique dans le chapitre 1). système CRISPR/CAS9 peut permettre la construction de multiples mutants en une seule étape, soit en
	• Alors qu'avec l'allèle solitaire toutes les quantités testées donnent des souches transformées avec un s'il s'agit d'un gène codant pour une protéine, il est possible de cloner la séquence codante du exprimant plusieurs ARN guides, soit en ciblant une région de séquences identiques dans plusieurs gènes
	gène dans une cassette d'expression forte. Cette cassette est constituée d'un fragment d'ADN comportement solitaire, dans le cas de l'allèle grégaire les seules les souches issues du traitement avec la (ce qui peut être le cas par exemple de gènes appartenant à des familles multigéniques).
	comprenant un promoteur fort (provenant d'un gène dont le produit intervient dans la glycolyse comme quantité la plus importante ont un comportement solitaire. Cela montre qu'effectivement l'allèle Malgré tout, il existe d'autres stratégies qui permettent d'introduire à volonté des mutations

• Il est possible d'introduire par transformation plusieurs copies du gène. La méthode la plus sure est de le mettre sur un plasmide multicopie mais ceci n'est possible que chez le nombre limité d'organismes où l'on dispose d'un tel outil comme les bactéries ou les levures Saccharomyces cerevisiae et Schizosaccharomyces pombe. Une seconde seconde méthode consiste à transformer les cellules avec des quantités importantes d'ADN. Chez certains organismes comme Caenorhabditis elegans, cela aboutit à l'intégration en tandem de plusieurs copies de cet ADN permettant ainsi en théorie la sur-expression. Je vous rappelle cependant qu'il n'y a pas toujours de relation entre le nombre de copie et l'expression à gpd, gène d'actine ou du facteur d'élongation de la traduction eEF1A) et d'un fragment d'ADN provenant 141 d'une région terminateur d'un gène (figure 88). Notez que la plupart des promoteurs utilisés sont nonseulement forts mais aussi constitutifs, c'est à dire qu'ils vont s'exprimer tout le temps. Le gène sera donc non seulement fortement exprimé mais aussi dérégulé.

Figure 88: cassette permettant la surexpression d'un gène. La séquence codante en rose est placée sous le contrôle d'un promoteur fort. Le terminateur est ajouté pour une terminaison correcte de la transcription, ce qui stabilise l'ARN messager. Pour ce genre d'expérience, il n'est évidemment pas nécessaire d'inactiver le(s) gène(s) déjà présents. Pour s'assurer de la sur-expression du produit, il faut regarder le niveau d'expression de la protéine dans des extraits de protéines totales (il est par exemple possible de le révéler dans certains cas par un traitement immunologique). Ce type d'expérience permet d'apporter des éléments sur la fonctionnalité de protéines. Par exemple, chez Caenorhabditis elegans, il existe deux types de vers qui ont un comportement soit solitaire, soit grégaire. La différence est liée à la présence dans les populations d'un gène polymorphe présentant deux allèles. Ce gène npr-1 code pour un produit qui ressemble à un récepteur de neuropeptides. L'allèle solitaire est dominant sur l'allèle grégaire. L'analyse moléculaire des deux allèles montre qu'ils sont tous les deux fonctionnels. L'hypothèse faite est donc que le produit de l'allèle grégaire fonctionne moins bien que celui de l'allèle solitaire. Pour tester ceci, des oeufs de la souche grégaire ont été injectés par différentes quantités d'ADN contenant les allèles grégaires ou solitaires. grégaire code probablement pour une protéine moins fonctionnelle que celle codée par l'allèle solitaire.

Figure 89: modification de gènes utilisant le système CRISPR/CAS9. Le système CRISPR/CAS9 dérive d'un mécanisme de défense bactérien vis à vis des bactériophages. Il aboutit à la coupure double brin d'un ADN de séquence spécifique via l'hybridation avec un ARN guide et un assemblage avec la nucléase CAS9. La longueur de la séquence qui s'hybride est de 20 nucléotides, ce qui est en général suffisant pour que l'ARN guide ne s'hybride qu'avec une seule séquence dans le génome, même si celui-ci est complexe comme le génome humain. Néanmoins, la reconnaissance des 7 premiers nucléotides étant moins importante, il est donc possible d'avoir des coupures indésirables. La seule contrainte pour la coupure est la présence après la séquence d'hybridation d'un dinucléotide GG espacé par un nucléotide de la région d'hybridation (Comment modifier un seul nucléotide dans un gène Pour analyser finement le rôle d'une protéine ou d'un ARN, il est souvent nécessaire de modifier un seul acide aminé ou nucléotide. Cela peut se faire soit en réintroduisant un allèle modifié comme voulu dans une souche délétée pour l'allèle sauvage du gène. Une autre possibilité rendue maintenant simple grâce au système CRISPR/CAS9 est de modifier in situ de manière dirigée le nucléotide (figure 89). Le système CRISPR/CAS9 est maintenant bien maîtrisé chez de nombreux organismes. Dans certains cas, la nucléase CAS9 et l'ARN guide sont exprimés via des transgènes, comme par exemple chez certains champignons. Dans ce cas, la nucléase CAS9 peut être contrôlé via un promoteur qui permet de réguler le timing et/ou le lieu de création des mutations, comme avec les systèmes CRE/LOX ou FLP/FRT. Il est aussi possible d'introduire dans les cellules par électroporation directement le complexe CAS9/ARN guide produit in vitro (des compagnies fournissent directement ce type de produits). Les généticiens travaillant sur les plantes et les animaux préfèrent généralement cette deuxième possibilité. De même, le dans un génome. Chez les bactéries, le système basé sur un plasmide suicide décrit figure 86 permet ce type de modification du génome. Chez les champignons, une méthode alternative consiste à co-

  Elle va alors provoquer la transposition de l'élément P à d'autres endroits du génome et donc faire le traitement mutagène. Il ne faut pas oublier que la drosophile est diplobiontique et que pour obtenir les mutations à l'état homozygote, il faudra faire deux séries de croisements. Au cours de ces croisements, il est simple d'identifier les descendants dépourvus de transposase afin que les insertions des transposons soient stables. Le transposon a été modifié pour faciliter son utilisation. Par exemple, on peut ajouter des séquences plasmidiques (ori et marqueur de résistance) qui permettront le clonage ultérieur des séquences génomiques flanquantes (figure94). On peut aussi ajouter des promoteurs forts ou un enhancer qui va déréguler les gènes environnants. L'ajout de la séquence codante de la GFP permet de voir l'expression des gènes au point d'insertion, etc.produit proprement (une seule copie de l'ADN est intégrée et l'insertion se fait sans délétion ou duplication à une séquence qui correspond à un site de restriction de l'enzyme utilisé (figure91). Ce type de mutagenèse est appelée REMI pour Restriction Enzyme Mediated Insertional mutagenesis.

Le transfert de gènes est accompli avec une efficacité raisonnable qui fait que l'inspection visuelle des mouches provenant des oeufs injectés est suffisante pour obtenir des embryons avec des yeux rouges dans lesquels le transposon s'est inséré avec succès. Le transposons transféré est alors stable et se transmet fidèlement aux générations suivantes. La transposase fortement exprimée peut aussi être 149 intégrée de la même manière dans le génome.

L'inactivation par insertion peut aussi se faire en utilisant des transposons. Chez les champignons, le système est basé sur les propriétés du gène codant la réductase du nitrate (figure

92

).

C'est néanmoins chez Drosophila melanogaster que le système a été perfectionné en utilisant l'élément P (figure

93

). Nous avons vu que ce transposon à ADN de type II est nouvellement arrivée chez cette mouche (voir section sur les fréquences d'apparition des mutations du chapitre 1). Il est capable de transposer d'un vecteur plasmidique dans l'ADN chromosomique des noyaux des cellules germinales. Ses propriétés en font un vecteur de choix pour introduire de l'ADN dans la drosophile et pour faire des mutants car il transpose à haute fréquence, dans des conditions bien contrôlables, il n'a besoin pour cela que de la transposase spécifique codée par l'élément P lui-même et des quelques dizaines de nucléotides présents à ses deux extrémités, les séquences ITR qu'on appelle les " pieds " de P.

Les mutagenèses insertionnelles génèrent donc comme leur nom l'indique des mutants d'insertion qui, le plus souvent, sont des allèles nuls ou ayant une expression modifiée. Le spectre est donc plus réduit que les traitements mutagènes classiques aux UV ou produits chimiques. Mais des méthodes simples permettent d'identifier rapidement les gènes dans lesquelles les insertions se sont produites (la figure 94 en donne deux exemples).

  fermentation en absence d'oxygène ou par la fermentation suivie de la respiration en présence d'oxygène. Il est possible de lui fournir des sources d'énergie non fermentable et donc uniquement utilisable par la respiration (glycérol ou lactate). Ce système est donc idéal pour sélectionner des mutants affectant la respiration et ainsi de décortiquer le système respiratoire. La recherche de mutants incapables de respirer se fait en recherchant après traitement mutagène des souches qui pousse sur un milieu fermentable (milieu contenant du glucose) mais qui ne pousse pas sur milieu uniquement respirable (milieu contenant du glycérol ou du lactate). Ce crible est donc un crible négatif. Il conduit à crible de sélection de mutants de stérilité femelle sur le chromosome X chez la drosophile. Le traitement mutagène a été effectué sur des mâles à l'aide de l'EMS (éthyle méthyle sulfonate). Ils portaient sur leur chromosome X un allèle vermillon qui donne une couleur rouge vive aux yeux et qui est facilement détectable (chromosome Xv en rouge qui portera donc les mutations). Ces mâles ont ensuite initié la série de croisements décrits afin in fine de sélectionner les mutants d'intérêt.doivent être traitées individuellement afin de les différencier et d'obtenir des allèles mutants indépendants. Dans le cas, de mutations de stérilité, le crible est en plus compliqué par le fait que les mouches femelles porteuses ne laisseront pas de descendance, en particulier des mutations de stérilité femelle dominante ne pourront être conservées à l'aide de mouches femelle ! Il faut donc un crible qui permet de mettre en évidence la stérilité tout en conservant les mutants! De même, la biologie des mouches (où des fécondations multiples se produisent) fait que l'on doit s'assurer dès le départ de l'expérience que les mouches femelles utilisées sont vierges, afin d'obtenir des résultats interprétables.

	l'isolement de mutants ayant acquis une mutation soit de l'ADN mitochondrial (mutant rho	-ou mit	-) ou
	de l'ADN nucléaire (mutant pet	-). D'autres cribles permettent d'obtenir des mutants plus spécifiques. Par
	exemple, c'est en utilisant le crible ci-dessus avec du lactate qu'ont été récupérés des mutants dans le
	•	La sélection de drosophiles femelle-stériles
	L'obtention de mutants de drosophile femelle-stériles permet d'identifier des gènes qui interviennent
	dans la fabrication des ovocytes. Plusieurs gènes sont impliqués. Certains sont localisés sur le
	chromosome X et d'autres sur les autosomes. Nous allons voir un crible qui permet d'identifier des gènes
	sur le chromosome X. L'utilisation de drosophiles pendant la mutagenèse est délicate. En effet, le
	traitement mutagène affecte la lignée germinale des mouches traitées et la révélation de l'effet

gène codant le cytochrome C (qui est un intermédiaire du transport des électrons dans la chaîne respiratoire). En fait, la levure possède 2 gènes qui codent pour le cytochrome C. L'un assure 95% de la production de cytochrome C (iso1) l'autre 5% (iso2). On s'est aperçu par hasard qu'un mutant déficient dans la production iso1 peut respirer en utilisant du glycérol comme source de carbone mais pas du lactate (il est probable que la respiration du glycérol nécessite moins de cytochrome C que celle du lactate et que les 5% iso2 suffisent pour permettre la respiration). Ceci n'est pas le cas de la majorité des mutants affectés dans la chaîne respiratoire. Il est donc possible de récupérer assez spécifiquement des mutants de l'iso1 en sélectionnant par réplique des souches qui respirent sur glycérol mais pas sur lactate. C'est toujours un crible négatif. Un autre crible disponible est l'utilisation de benzidine qui colore en bleu foncé les hémoprotéines. La coloration est plus sensible aux variations de la quantité de cytochrome C qu'à celles des autres cytochromes. Pour chercher des mutants déficients en cytochrome C, il suffit donc de rechercher des colonies bleu clair parmi les sauvages qui sont bleu foncé. Il s'agit donc là d'un crible positif. mutagène se fait sur les générations suivantes. Comme dans toutes les mutagenèses, les mouches Figure 97:

  En effet, la sélection des mutants n'est que la première partie du travail (voir figure 99 pour rappel détaillé de la démarche). Pour éviter du travail redondant, il est donc préférable de ne pas faire plusieurs fois le même travail sur des que le phénotype est bien la résultante d'une seule mutation. Pour ceci, il faut analyser la ségrégation des mutations. • répartir les mutations dans les différents gènes identifiés. Pour ceci, le généticien dispose de deux outils principaux, la complémentation et la cartographie. L'analyse génétique est suivie d'une analyse moléculaire afin d'identifier les gènes dans lesquels ont eu lieu les mutations. Ces trois étapes sont obligatoires avant de pouvoir formuler des modèles et d'entreprendre des analyses supplémentaires pour préciser et vérifier les modèles. Nous allons voir chacune de ces étapes dans les chapitres suivants en commençant par la complémentation.

Une des caractéristiques importantes de ces cribles génétiques est la production de mutants indépendants, c'est à dire provenant d'évènements mutationnels différents.

mutants qui ne seraient pas indépendants. En particulier, une fois que les mutants sont obtenus, il faut dans un premier temps les analyser génétiquement afin de: 159 • s'assurer

pour une combinaison le phénotype de la souche obtenue est mutant, on dit que les deux allèles ne complémentent pas et qu'ils sont probablement allèles d'un même gène. Si le phénotype de la souche obtenue est sauvage, on dit alors que les deux allèles complémentent et qu'ils sont probablement allèles de deux gènes différents

  allèles sont des allèles de gènes différents, cela aboutit au schéma de droite de la figure 100. Dans ces conditions, on voit qu'il y a présence d'allèles sauvages pour chacun des gènes. Donc, si les allèles mutants a et b sont récessifs vis à vis de leurs allèles sauvages respectifs, on peut cette fois raisonnablement suspecter que la souche sera de phénotype sauvage. Notez que ce test ne s'applique donc pas si les mutations sont dominantes.Le principe du test est donc le suivant. On fabrique les souches avec toutes les combinaisons d'allèles mutants obtenus après mutagenèse, associés deux à deux. Si

	Philippe Silar	Génétique : Concepts de Base et Notions Approfondies
	•	De ce tableau nous pouvons tirer que : • l'allèle m4 complémente avec tous les autres et donc qu'il caractérise un gène. • les allèles m1, m5 et m6 ne complémentent pas entre eux mais complémentent avec tous les autres et donc qu'ils caractérisent un deuxième gène • les allèles m2 et m3 ne complémentent pas entre eux mais complémentent avec tous les autres et donc qu'ils caractérisent un troisième gène. Au total, il est donc possible de définir trois groupes de complémentation. Il semble donc y avoir Si les deux m1 m2 m3 m4 m5 m6 trois gènes identifiables par cette méthode.
			m1 -	+	+	+	-	-
			m2	-	-	+	+	+
			m3		-	+	+	+
			m4			-	+	+
			m5				-	-
			m6				-
					161 162

. A l'aide de ceci, on construit un tableau. Il reste ensuite à déterminer le nombre de gènes. Le tableau suivant donne un exemple de tableau provenant d'une analyse faite dans mon laboratoire. Ces résultats ont été obtenus en analysant le champignon Podospora anserina, qui est haplobiontique. L'analyse des diploïdes n'est donc pas faisable sur les thalles végétatifs. Il est possible par contre d'analyser des dicaryons, chacun des noyaux portant une mutation. Le principe du test reste donc le même. Nous avons obtenu après mutagenèse 6 souches du portant chacune un allèle mutant indépendant. Ces 6 souches ne différencient pas d'organes femelles (périthèces). Nous avons associé dans des hétérocaryons les six allèles deux à deux et avons obtenu les résultats suivants : Le signe -indique que l'hétérocaryon avec mi dans un noyau et mj dans l'autre ne différencie pas de périthèce (phénotype mutant). Le signe + indique qu'il en différencie (phénotype sauvage).

  celui apporté par la femelle. Le plus souvent, le cytoplasme est apporté uniquement par la femelle. Il s'ensuit dans ces organismes une ségrégation des mitochondries (et des plastes) qui suit le plus souvent une hérédité strictement maternelle. Attention, il existe des exceptions. En particulier chez les moules les mitochondries peuvent être héritées du partenaire mâle ! Dans tous les cas, l'hérédité est dite nonmendélienne ou extrachromosomique. Je vous rappelle que nous avons déjà vu une hérédité nonmendélienne dans le chapitre des polymorphismes avec le système het-s / het-s* de Podospora anserina. Chez Saccharomyces cerevisiae, les deux cellules contribuent équitablement au cytoplasme au cours de la reproduction sexuée. Après méiose, le cytoplasme est divisé en quatre, ce qui aboutit le plus souvent à une absence de ségrégation des caractères pendant la méiose. L'exemple le plus extrême et le cas d'un croisement d'une souche sauvage avec une souche dépourvue d'ADN mitochondrial incapable de respirer (dite souche rho°) (figure

Chez l'homme, il existe un certain nombre de maladies pour laquelle l'hérédité est strictement maternelle comme des myopathies et des surdités. Nous avons aussi vu que cette hérédité strictement maternelle permet de retracer l'histoire de l'ADN mitochondrial (voir les haplotypes dans le paragraphe du polymorphisme) et par-là de retracer l'histoire des populations humaines. Voici d'autres exemples: • Chez certains champignons, nous avons vu qu'il existe une différenciation de gamètes mâles et femelles. Il est donc possible d'orienter des croisements. Chez Podospora anserina, il existe une souche résistante au chloramphénicol. Cette souche porte un allèle particulier (capR) du gène du grand ARN ribosomique mitochondrial codé par le génome mitochondrial. Il a été obtenu après une mutagenèse. L'allèle sauvage étant appelé capS. Il est possible (et techniquement facile) de croiser les souches de 2 façons, femelle capR x mâle capS ou femelle capS x mâle capR. Dans le premier cas, la descendance obtenue est entièrement capR dans le deuxième cas, elle est entièrement capS. •

physiologiques de la dominance et de la récessivité

  phénotypiques multiples sont bien dues à la présence d'une seule mutation, car dans ce cas toutes les différences phénotypiques vont co-ségréger ensembles au cours des générations. Néanmoins, même s'il y a co-ségrégation de toutes les différences phénotypiques et donc une seule mutation, il est possible que plusieurs gènes soient en jeu. C'est par exemple le cas si la mutation est une délétion qui englobe plusieurs gènes voisins. C'est aussi le cas, si la mutation modifie la structure de la chromatine et perturbe l'expression de plusieurs gènes.Si la mutation n'affecte qu'un seul gène il faut se demander si celui-ci donne naissance à une seule protéine ayant plusieurs fonctions ou à plusieurs protéines ayant des fonctions différentes (par exemple par épissage alternatif). S'il n'y a qu'une seule protéine affectée et que le phénotype est complexe on dit alors qu'il est pléiotrope, c'est-à-dire que la mutation d'un seul gène donne plusieurs phénotypes mutants. On en conclut que le produit du gène intervient dans un processus affectant plusieurs aspects de la physiologie comme la signalisation, une voie métabolique centrale, la transcription, la traduction, la dégradation des protéines, etc. La récessivité ou la dominance d'une mutation est une indication importante quant à la nature de la mutation et par ricochet quant à la fonction du gène altéré. En effet, on s'attend à ce qu'une mutation récessive soit plutôt une perte de fonction puisque la présence de l'allèle sauvage permet de la compenser. Au contraire, une mutation dominante serait plutôt un gain de fonction puisque la présence du produit sauvage ne permet pas d'éliminer son effet. Néanmoins, si le dosage du produit du gène muté est important, une perte de fonction de ce produit peut avoir un effet dominant ou le plus souvent semidominant, si dans l'hétérozygote mutant/sauvage, il n'y a pas assez de produit pour assurer une activité sauvage. On dit alors que ces allèles sont haplo-insuffisants. Nous avons vu dans le chapitre 1 quelques définitions concernant l'effet des allèles sur le fonctionnement des gènes. En revoici une liste exhaustive: Allèle hypomorphe appelé aussi "leaky" : le produit du gène est synthétisé et il a la même fonction que le produit sauvage, mais la mutation fait que, soit il est en quantité plus faible, soit il est Certains confèrent une létalité pendant le développement foetal. Si on autopsie les foetus, on constate que le décès a lieu à cause d'une anémie sévère. A ce stade, le développement du pelage n'est pas encore fait donc on ne peut donc pas savoir quelle aurait été la couleur du pelage chez ces embryons avortés. Chez les homozygotes viables, on voit que les taches blanches du pelage sont plus étendues que On a donc affaire à un locus dont les allèles donnent un phénotype pléiotrope c'est-à-dire que les mutations dans ce gène affectent plusieurs fonctions (couleur du pelage, différentiation des cellules sanguine et différentiation de la lignée germinale) qui à première vue n'ont rien à voir entre elles. Il faut donc trouver une explication: on a affaire à un seul gène, de nombreuses études l'ont montré, et il faut donc trouver pour le produit du gène une fonction qui permette de rendre compte des trois effets. Pour cela il faut commencer par examiner le plus finement possible les phénotypes. On va mettre en oeuvre . L'analyse de l'activité protéique montre que le faux-sens en position 790 qui change un acide aspartique en asparagine abolit l'activité d'autophosphorylation. Mais la protéine mutante est présente et sa présence diminue donc probablement l'activité de la protéine sauvage. Il s'agit d'un allèle dominant négatif ou antimorphe. On sait que la protéine codée par White spotting agit sous forme 'allèle nul, il doit donc y avoir là aussi interférence avec l'allèle sauvage. In vitro la protéine mutante a une activité d'autophosphorylation diminuée mais pas nulle. Ceci expliquerait que les individus homozygotes soient viables, bien qu'anémiés. Cependant l'interaction des monomères mutants avec les monomères sauvages dans les hétérozygotes n'aboutit qu'à une diminution partielle de l'activité. W41 est donc un allèle antimorphe ayant une perte de fonction partielle.Dans le même ordre d'idées que l'analyse fine de la dominance/récessivité des mutations, je vous rappelle que la présence d'exceptions à la complémentation (c'est à dire la complémentation interallélique et la non-complémentation intergénique) permet d'avoir quelques informations sur les rôles et la structure des produits codés par les gènes mutés: protéines ayant plusieurs fonctions, protéines homo-polymériques ou protéines hétéro-polymériques (voir la section sur les limites du test de complémentation dans le chapitre 4). En particulier, nous avons vu dans la section sur les crossing-over mitotiques du chapitre 6 qu'il existe des gènes dits autonomes cellulaires dont les produits qu'ils codent ne diffusent

	Philippe Silar Philippe Silar Philippe Silar	Génétique : Concepts de Base et Notions Approfondies Génétique : Concepts de Base et Notions Approfondies Génétique : Concepts de Base et Notions Approfondies
	-moins actif. • Allèles gain-de-fonction : -Allèle hypermorphe : le produit est fonctionnellement équivalent au produit sauvage mais il est Allèle Type de mutation m/m m/+ m/délétion amorphe perte de fonction totale (récessive ou semi-dominant*) mutant (0 dose) sauvage ou intermédiaire* (1 dose) mutant ou intermédiaire* (0 dose) hypomorphe perte de fonction partielle (récessive) mutant (2 fractions de dose) sauvage (1 dose + 1 fraction de dose) mutant plus fort (1 fraction de dose) hypermorphe gain de fonction davantage mutant mutant plus faible mutant plus faible ou allèle nature hétérozygotes Wx/+ homozygotes Wx/Wx W19H délétion totale grosses taches blanches létal après 12 jours in utero par anémie sévère W37 faux-sens 582 E-K grosses taches blanches létal après 12 jours in utero par anémie sévère l'hématopoièsedimérique : un monomère mutant peut donc s'associer avec un monomère sauvage pour donner un
	synthétisé en plus grande quantité. -Allèle néomorphe : le produit est fonctionnellement différent du sauvage ou bien il est équivalent au produit sauvage mais délivré au mauvais moment ou au mauvais endroit. de produit (dominante) (>>2 doses) (> 2 doses) tend vers sauvage (>1 dose) néomorphe gain d'une nouvelle fonction (dominante) mutant ou double mutant** mutant mutant différents niveaux d'analyse du phénotype: W délétion de 78 aa codon 513-590 taches blanches létal après 12 jours in utero par dimère inactif. anémie sévère W42 faux-sens 790 D-N tout blanc, anémie • L'allèle W44 est perturbé dans son expression: le taux de transcrit est de 20% du sauvage létal après 12 jours in utero par (double mutant)** • observation macroscopique: mesure de la superficie des taches blanches et mesure du nombre anémie sévère environ. Le phénotype est plus léger que chez l'allèle nul. Il s'agit donc d'un allèle hypomorphe. Autonomie cellulaire de l'expression d'un gène
	Allèles perte-de-fonction : Pour un allèle néomorphe, qui a une fonction nouvelle, l'addition de copies du gène sauvage ne change rien au phénotype mutant. • • Au contraire, un allèle antimorphe sera titré par l'addition de copies sauvage, ce qui atténuera le chez l'hétérozygote: parfois le pelage est complètement blanc, parfois non. Toutefois, l'intensité du montré qu'il codait pour une protéine de 975 acides aminés ayant les propriétés d'un récepteur transmembranaire à tyrosine kinase (RTK). Ce récepteur, qui agit en dimère, reçoit un signal venant de l'environnement ou de cellules voisines, sous la forme d'un ligand qui se fixe sur son domaine cette réaction n'a plus lieu chez le mutant. Ce faux-sens touche donc un acide aminé essentiel dans l'activité d'autophosphorylation qui précède le transfert du phosphate sur une protéine substrat. • L'allèle W contient comme W19H une mutation nulle. Des expériences de localisation de la un allèle hypermorphe, où le récepteur serait constitutivement activé. Ce peut être le cas s'il n'y a plus besoin de ligand pour déclencher la phosphorylation. On peut alors faire l'hypothèse que les allèles hypermorphes sont létaux à l'état hétérozygote, dès le stade embryonnaire précoce. Ceci est compatible Base • -Allèle antimorphe ou dominant négatif: le produit fabriqué à partir de l'allèle mutant possède une activité antagoniste de celle du produit sauvage. Comment savoir à quel type d'allèle on a affaire? La réaction du phénotype devant un nombre croissant de copies du gène muté permet de distinguer entre différents types d'allèles: • Pour un allèle amorphe, l'addition de copies supplémentaires du gène muté n'a aucun effet supplémentaire sur le phénotype • Par contre pour un allèle hypomorphe, qui conserve une fraction de la fonction sauvage, on se rapprochera du phénotype sauvage en multipliant le nombre de copies • Pour un allèle hypermorphe, on observera à l'inverse une accentuation du phénotype mutant si le nombre de copie augmente De même la modulation du nombre d'allèles sauvage en présence d'allèles mutants permet de différencier certains allèles dominants antimorphe gain de fonction antagoniste mutant mutant plus faible mutant de descendants W44 faible expression petites taches blanches blanc à 85%, fertilité réduite • L'allèle W41 se comporte à l'état hétérozygote comme l'allèle W42, son phénotype est plus à la fonction sauvage (dominante) (*) cas d'haplo-insuffisance. (**) éventuellement double mutant d'une part à cause de l'absence du produit sauvage (si elle a un phénotype), d'autre part à cause de l'apparition d'une nouvelle fonction et du phénotype qui lui est associé. • autopsie des foetus et évaluation de la cause de la mort • examen des organes chez les mutants viables: examen sanguin, examen des cellules de la peau et dissection des gonades ; On observe ainsi que dans les trois phénotypes c'est le nombre de cellules spécialisées impliquées dans la production des phénotypes qui est affecté: • peu ou pas de mélanocytes chez les mutants. La synthèse des pigments du pelage est donc diminuée, non par manque d'un des enzymes impliqués dans la biosynthèse des mélanines mais par manque des cellules dans lesquelles s'expriment les gènes codant pour les enzymes de biosynthèse des pigments • peu ou pas d'érythrocytes d'où l'anémie • peu ou pas de cellules germinales d'où la stérilité De ces analyses phénotypiques fines ont en conclut que la protéine codée par White-spotting interviendrait dans la prolifération, la différenciation ou la migration des cellules souches de ces différentes lignées cellulaires. L'étape suivante de l'identification par clonage du gène White-spotting a W41 faux-sens 831 V-M petites taches blanches, anémie blanc à 85%, anémie La disponibilité de la nature moléculaire des différents allèles permet maintenant de mieux comprendre comment agissent les mutations: • L'allèle W37 se comporte exactement comme W19H. La mutation faux-sens en position 582 qui change un acide glutamique en lysine est une mutation nulle. La protéine est présente mais totalement inactive. Par dosage de l'activité d'autophosphorylation à partir d'ATP marqué, on montre en effet que L'analyse phénotypique fine de mutants permet aussi d'avoir des informations sur le lieu accentué que chez lparmi tous les allèles du gène Whire-spotting, les généticiens n'en ont isolé aucun qui correspondrait à d'action des gènes.
	-phénotype mutant. De plus, le phénotype d'un allèle antimorphe sera aggravé en présence d'une Allèle amorphe ou nul : correspond à une mutation qui abolit complètement la fonction du phénotype est gradué de la même façon si on compare les hétérozygotes et les homozygotes. extracellulaire. La fixation du ligand entraîne l'activation du récepteur, qui se traduit par la protéine tronquée montrent qu'elle n'est plus présente à la surface des cellules. De fait, la délétion de 78 avec l'observation que des mutations somatiques équivalentes provoquant une surexpression non
	produit du gène ; celui-ci est totalement inactif ou absent. délétion du gène sauvage. • Pour certains homozygotes viables on voit apparaître un troisième phénotype: un défaut de phosphorylation de certains de ses résidus tyrosine qui pourront à leur tour activer une autre protéine aa affecte un des domaines transmembranaires abolissant l'ancrage de la protéine dans la membrane. régulée de la protéine ont un effet dévastateur car entraînant une prolifération cellulaire. Dans un
	La table suivante résume les phénotypes obtenus dans différentes combinaisons alléliques pour fertilité. Les allèles concernés sont toujours récessifs. par phosphorylation. la disponibilité de la séquence a permis de caractériser la nature moléculaire de embryon en cours de développement, l'effet d'une prolifération cellulaire anarchique est bien
	les différents types d'allèles: plusieurs allèles, ce qui est résumé dans la table suivante: évidemment catastrophique.
		211 212 215

Les mutants du gène White-spotting chez la souris permet d'illustrer la variété des allèles de nature différente que l'on peut obtenir pour un seul gène. On connaît en effet de très nombreux allèles affectant ce locus. • A l'état hétérozygote, tous provoquent des taches blanches sur le pelage. Ils sont donc dominants. Certains allèles présentent à l'état hétérozygote un phénotype supplémentaire, une anémie par manque de globules rouges. Ils sont donc aussi dominants pour l'anémie. Par contre, d'autres allèles sont récessifs pour ce phénotype d'anémie. • A l'état homozygote, on voit clairement que les différents allèles ont un effet spécifique et variable. • L'allèle W19H est une délétion du gène White-spotting. Il s'agit donc d'un allèle nul. L'hétérozygote ne produit qu'une dose de protéine sauvage. Il est haplo-insuffisant pour la prolifération des mélanocytes ce qui affecte donc la couleur du pelage. Mais, il est récessif pour l'hématopoïèse et le développement des cellules germinales. Il s'ensuit qu'une dose de protéine est suffisante pour assurer le développement des cellules érythroïdes et germinales mais pas celui des mélanocytes. L'absence totale de produit est létale par anémie à 12 jours de gestation. Le produit du gène White-spotting est donc essentiel à la vie des souris. • L'allèle W42 est intrigant car il montre à l'état hétérozygote un phénotype plus fort (un pelage entièrement blanc et une anémie) que l'allèle nul de référence! Il est donc aussi dominant pour En conclusion, les mutants de White-spotting offre un bel exemple de ce que l'on peut tirer de l'analyse de la complexité des phénotypes et des renseignements qu'on peut en tirer en conjonction avec une analyse moléculaire, biochimique et cytologique. Beaucoup de travail, venant de nombreuses équipes de chercheurs, ont été nécessaires pour faire d'abord l'analyse génétique chez la souris, puis la corrélation avec d'autres mammifères (chat, humain, cheval…). Ces analyses génétiques ont été suivies par des analyses moléculaires et biochimiques, puis avec un raccord avec les études sur le cancer. En effet, certaines tumeurs chez les mammifères comme des sarcomes chez le chat sont dues à une dérégulation du gène White-spotting dans les cellules somatiques. On peut d'ailleurs remarquer que

  Ces méthodes ne sont pas circonscrites à l'analyse du développement de la fructification chez Podospora anserina. En effet, greffes et mosaïques génétiques sont fréquemment utilisées aussi chez les animaux et les plantes pour analyser leur développement.Afin de déterminer les implications des gènes dans les divers processus du vivant, nous avons vu dans les chapitres 3 à 7 que les mutagenèses, qu'elles soient directes ou inverses, fournissent des mutants qui vont pouvoir être analysés à l'aide de techniques multiples, dont nous avons détaillé quelques exemples. Toutefois, si les informations obtenues par les méthodes décrites précédemment sont importantes, elles ne concernent principalement que les gènes pris isolément. Or, dans la physiologie cellulaire, les gènes agissent souvent de concert au sein de voies métaboliques ou de régulation pour effectuer leurs fonctions. De fait, nous avons vu au chapitre 4, que l'analyse de la complémentation, en particulier lorsque il y a des exceptions au principe général, permet de suggérer des interactions entre les produits codés par plusieurs gènes. L'analyse des interactions entre mutations permet effectivement donc d'acquérir des informations supplémentaires par rapport à l'analyse des Le double mutant peut aussi présenter un phénotype plus proche de celui du sauvage, voire le phénotype sauvage : on parle alors d'effet suppresseur.Définition: Une mutation est dite épistatique sur une autre mutation si le double mutant ne présente que le phénotype de cette mutation, alors que celui de l'autre est masqué. La mutation dont le Par extension, on dit qu'un gène est épistatique sur un autre (qui sera alors hypostatique) si les mutations de ce gène sont épistatiques sur celles affectant le gène hypostatique.Des effets d'épistasie vont souvent se produire dans le cas où les mutations affectent des gènes qui participent à une même voie de biosynthèse, une même voie de régulation/signalisation ou un même processus développemental. Nous allons voir que l'interprétation des données d'épistasie n'est pas toujours simple. En effet, prenons comme premier exemple une voie de biosynthèse linaire d'un produit pour lequel un des intermédiaires est toxique ou coloré (figure137). Les mutants dans ce gène seront létaux (ou pigmentés). Les doubles mutants possédant cette mutation létale ou pigmentant et une autre mutation située en amont dans la chaîne de biosynthèse seront viables ou incolore, puisque le produit toxique ou coloré ne sera pas fabriqué. Le gène agissant en amont est donc épistatique sur celui en aval.De même, les doubles mutants possédant cette mutation létale ou pigmentant et une autre mutation située en aval dans la chaîne de biosynthèse seront létaux ou colorés, puisque le produit est fabriqué dans ce type de doubles-mutants. Une fois encore c'est le gène situé en amont qui est épistatique. Le

		L'épistasie
		Chapitre 8 : Les interactions géniques
	mutants isolément.
		La méthodologie générale consiste à construire des doubles mutants (avec des mutations à
	l'état homozygote dans le cas de mutations récessives) et à observer leurs phénotypes. Formellement, il
	existe trois types d'interactions possibles:
	•	les deux mutations ne montrent pas d'interaction et le double mutant présente les phénotypes
	additionnés des deux mutations.
	•	les deux mutations voient leurs effets amplifiés de manière coopérative ou synergique, si bien
	que le double mutant présente un phénotype fortement aggravé par rapport à ce qui est attendu par la
	simple addition des mutations: on parle alors d'effet accentuateur.
		Nous allons voir successivement chacun de ces types d'effets et ce que leur présence indique
	quant à la fonction des gènes.

• les deux mutations ont des effets antagonistes. Le double mutant peut ne présenter par exemple que le phénotype d'une seule des deux mutations: on parle alors d'un effet épistatique. phénotype est masqué est dite hypostatique. Comme pour la dominance/récessivité, il s'agit d'une sorte de relation de domination, mais: • les relations de dominance/récessivité concernent les allèles d'un même gène • l'épistasie/hypostasie concernent des allèles de gènes différents Figure 137: épistasie et voie de biosynthèse ou développement. Dans le cas de voies de biosynthèse et de développement linéaires le phénotype du double mutant sera celui du mutant du gène situé le plus en amont. même raisonnement s'applique dans le cas d'une voie de développement linéaire (figure 137): c'est le gène contrôlant l'étape la plus en amont qui sera épistatique sur les gènes situés plus en aval. Maintenant si on regarde ce qu'il se passe dans une voie de signalisation ou de régulation linéaire comportant des activateurs et des répresseurs (figure 138); on voit que les gènes épistatiques sont ceux qui sont en aval lorsque l'épistasie est testée entre un activateur et un répresseur. Pour voir ceci, raisonnons à partir des mutations perte-de-fonction qui sont les plus fréquentes. • Si la régulation est positive, c'est à dire que le partenaire situé en amont active celui situé en aval, une mutation nulle dans le gène amont entraîne une absence de réponse au signal comme c'est normalement le cas chez le sauvage.

Comment ordonner deux gènes impliqués dans une voie de signalisation?

  L'épistasie est d'un grand intérêt pour ordonner les gènes dans des voies de signalisation ou de régulation pouvant mettre en jeu, en cascade, de nombreux gènes. Pour ceci, il faut évaluer les relations d'épistasie sur les gènes deux par deux. Ceci nécessite de posséder des mutants affectés dans les deux gènes et ayant des phénotypes différents, car bien évidemment si les phénotypes conférés sont identiques, il n'est pas possible de voir si l'un masque l'autre… Il faut dans un premier temps créer un double mutant, par croisement. Si les mutations sont dominantes il suffit que les mutations soient présentes même à l'état hétérozygote dans le même organisme. Si les mutations sont récessives, il faut alors créer un double mutant homozygote pour les deux mutations.On observe ensuite le phénotype du double mutant: la mutation épistatique est celle dont le phénotype l'emporte. Pour interpréter les résultats sans risque de se tromper, il faut prendre quelques précautions: • Il faut que les deux gènes interviennent bien sur la même voie et non sur deux voies parallèles. Dans ce dernier cas on le saura rapidement, car le phénotype du double mutant n'est pas celui de l'un ou de l'autre mais au minimum une addition des deux phénotypes. Cette règle peut s'exprimer aussi de la manière suivante, qui est équivalente :Si c'est le même état du signal qui révèle le phénotype mutant chez les deux simples mutants, la mutation épistatique se trouve dans le gène amont; si c'est un état opposé du signal elle se trouve dans le gène aval. Pour illustrer cette méthode, voici un exemple d'analyse de relation d'épistasie utilisant Saccharomyces cerevisiae. Cette levure sait utiliser le saccharose comme source de carbone car elle possède une invertase qui hydrolyse ce sucre en glucose et fructose. Normalement, en présence de glucose ou de son analogue non métabolisable le 2-deoxyglucose, la synthèse d'invertase est réprimée: une souche sauvage est donc incapable de croître sur du milieu contenant du 2-déoxyglucose et du saccharose. Deux mutants haploïdes de régulation de la voie d'utilisation du saccharose comme source Pour ceci, les diploïdes sauvages construits pour le test de complémentation ont été mis à sporuler. Après méiose et ségrégation, un quart des spores est double mutante. Si les deux locus sont liés l'analyse est un peu plus compliquée car les doubles mutants, qui ne sont obtenus que par crossing-over, sont donc plus rares.

	de carbone ont été isolés:
	• carbone (mais il pousse très bien sur glucose). Chez ce mutant le gène codant l'invertase est sauvage. Le mutant snf1 -ne peut pas pousser sur du milieu avec du saccharose comme seule source de • Le mutant cid1 -pousse en présence de saccharose + 2-déoxyglucose. Dans le cas de la mutation snf1 -on a une expression abolie de l'invertase. Au contraire, dans le mutant cid1-on a un phénotype constitutif. Les deux mutations étant récessives et donc des pertes de fonction, snf1 code un activateur et cid1 pour un répresseur. L'analyse du double mutant snf1 -cid1 -montre qu'il a le même phénotype que le simple mutant snf1-. La mutation snf1-est donc épistatique sur la mutation cid1 Par exemple, la recherche de mutants sensibles aux rayons UV chez Saccharomyces cerevisiae a permis le criblage de 96 mutants indépendants, appelés mutants rad, comportant chacun une seule mutation récessive. Les mutants ont été croisés deux à deux pour tester la complémentation. Ceci a permis de regrouper les allèles dans 30 groupes de complémentation différents qui correspondent donc en première approximation à 30 gènes différents. Ces 30 gènes interviennent-ils tous dans le même processus de réparation, les uns à la suite des autres, ou bien y-a-t-il plusieurs manières de réparer? Pour répondre à cette question, une analyse d'épistasie a été entreprise. Tous les doubles mutants possibles entre les allèles de gènes différents pris deux à deux ont donc été construits; néanmoins pour simplifier, un seul allèle par gène est testé, ce qui représente déjà 30 x 29= 870 double mutants haploïdes a été évaluée: • Si la sensibilité aux UV du double mutant était la même que celle de l'un des deux simples mutants, c'est qu'il y a une relation d'épistasie entre eux, donc qu'ils font partie de la même voie de réparation, dans laquelle ils interviennent séquentiellement. • Si la sensibilité du double mutant est l'addition de celle des deux simples mutants c'est que les deux gènes interviennent dans des processus différents dont les effets sur le phénotype s'additionnent chez le double mutant. mutants! Ensuite, la sensibilité aux UV pour chaque simple mutant haploïde et pour tous les doubles En procédant ainsi systématiquement on est arrivé à classer les 30 gènes dans trois groupes

139: épistasie dans une voie de biosynthèse branchée et complexe. Dans cette voie, deux précurseurs produisent deux pigments (ici un jaune, le pigment 1, et un bleu, le pigment 2) via deux voies linéaires. Les mutants dans les gènes de biosynthèse du pigment 1 sont donc bleus et ceux dans les gènes de biosynthèse du pigment 2 sont jaunes, alors que le sauvage sera vert. Il y a en plus des gènes codant pour des enzymes impliqués dans le dépôt correct des pigments; leurs mutants seront blancs car les pigments ne seront pas correctement déposés. On voit clairement que dès qu'un des gènes impliqués dans le dépôt des pigments est muté, la souche sera blanche, peu importe le(s) pigment(s) fabriqué(s). Ces gènes sont donc épistatiques sur les gènes de fabrication des pigments 1 et 2, bien qu'ils agissent en aval.

On voit donc qu'il est nécessaire de connaître assez précisément la nature des processus biologiques en cause pour pouvoir interpréter correctement les relations d'épistasie. C'est particulièrement vrai si les voies sont branchées ou complexes. Néanmoins, l'obtention de données d'épistasie permet de formuler des hypothèses quant aux relations entre gènes, en particulier dans leur ordre d'intervention dans une voie de biosynthèse, développement et particulièrement de signalisation ou régulation.

• les deux gènes doivent être complètement inactifs chez les deux simples mutants si ceux-ci ont des pertes de fonction. En effet, l'interprétation peut être difficile dans le cas de mutants hypomorphes (voir la section sur les effets accentuateurs).

• Il faut que le signal et les deux gènes étudiés soient les seuls déterminants du phénotype dans l'expérience: tous les autres gènes sont donc supposés fonctionner de façon sauvage chez les simples et doubles mutants.

Si ces critères sont observés, on peut alors en déduire: Si les deux phénotypes observés chez les deux simples mutants sont de même type -tous les deux ont une voie inactive ou tous les deux ont une voie constitutives -alors la mutation épistatique est dans le gène amont. Si les deux phénotypes observés chez les simples mutants sont l'un inactif l'autre constitutif, alors la mutation épistatique se trouve dans le gène aval (voir la figure

138

). -. Les deux phénotypes sont opposés chez les simples mutants, on en conclut que le gène agissant en aval est snf1 et que donc cid1 réprime directement ou indirectement l'activité de snf1. Les groupes d'épistasie Lorsque l'on possède des mutants ayant un phénotype semblable, il est possible de les regrouper en groupes présentant entre eux des relations d'épistasie, indiquant que les gènes pour lesquels ils sont affectés agissent dans une même voie. Les différents groupes formés sont alors appelé groupes d'épistasie. d'épistasie différents, suggérant trois mécanismes indépendants de réparation des lésions UV. L'un d'eux en particulier, appelé groupe RAD3, regroupe des gènes dont les produits sont impliqués dans la réparation par excision de nucléotides après lésions créées par les radiations.

Suppresseur agissant au niveau de l'expression d'un gène

Si une mutation diminue l'expression d'un gène, donc la quantité finale de protéine active synthétisée, on peut imaginer qu'une deuxième mutation qui augmente l'expression compense l'effet de la première. La mutation suppressive peut agir à différents niveaux : • mutations dans la machinerie de transcription qui la rendent plus active, ou dans celle de maturation de l'ARNm qui rendent l'épissage des introns plus efficace. En particulier, des mutations dans des activateurs de transcription impliqués dans l'expression du gène et qui ont par exemple une affinité augmentée pour le promoteur vont se comporter comme des suppresseur extragénique.

• mutations qui augmentent la stabilité de l'ARNm ou de la protéine, en diminuant leur turn-over.

Notez que dans le cas de la stabilité des ARN messager, cela peut laisser l'opportunité à la machinerie de traduction de faire plus d'erreurs (voir section sur les suppresseurs informationnels).

L'accentuation

A l'inverse des suppresseurs, il existe des cas où une deuxième mutation, au lieu de supprimer le phénotype mutant causé par une première mutation, l'aggrave. On parle alors de mutations d'accentuation ( " enhancer " en anglais). Fréquemment le phénotype du double homozygote est tellement aggravé qu'il devient létal : on parle alors de co-létalité.

Comment sélectionner des mutations d'accentuation?

Tout comme on se sert de la suppression, on peut se servir de la propriété d'accentuation d'un phénotype pour cribler de nouveaux mutants affectés dans des gènes interagissant avec un premier allèle mutant. Il est possible de cribler directement sur le phénotype d'accentuation. Chez Saccharomyces cerevisiae un système génétique élégant a été mis au point pour sélectionner des mutations ayant un effet de co-létalité avec une autre mutation (figure 145). En effet, ce système permet de faire un crible visuel positif basé sur les propriétés de coloration rouge d'un mutant du gène ade2.

Comme l'analyse de suppresseur, ce système est fréquemment utilisé pour identifier des gènes impliqués dans le même processus biologique ou pour identifier des voies compensatoires exerçant la même fonction.