Je souhaiterais tout d'abord remercier mon directeur de thèse, Monsieur Vincent Phalip, pour la confiance qu'il m'a accordée tout au long de ce projet. Je souhaite également le remercier pour sa disponibilité et pour tout le temps qu'il a mis à ma disposition pour diriger ce travail. Je suis vraiment très reconnaissante pour tout cela et je souhaiterais souligner le fait que j'ai vraiment apprécié son engagement et son respect sans faille des délais serrés de relecture des documents que je lui ai adressés. Je pense être ressortie bien plus grande et forte de cette thèse par le fait d'avoir appris à être pluridisciplinaire et « multitâches », merci de m'avoir accompagnée dans ce parcours pas si facile.

Je souhaiterais également remercier Monsieur Eric Pollet et Monsieur Luc Avérous, pour toute l'aide qu'ils ont pu m'apporter lors de cette thèse en particulier en ce qui concerne la dernière partie de ce travail de recherche.

Je souhaiterais remercier Madame Anne Forster, avec qui j'ai eu la joie de partager la première partie de mon doctorat. Ton aide m'a été précieuse dans de nombreux domaines.

Merci d'avoir partagé tes connaissances avec moi et de m'avoir formée sur de nombreux concepts de microbiologie que je ne connaissais pas. Merci également à Olivier et Cédric qui ont aussi grandement participés à mon apprentissage durant les tous premiers mois. J'ai une pensée toute particulière pour les anciens et les actuels doctorants du laboratoire de l'ICPEES avec qui j'ai eu l'occasion de partager mes joies et mes déceptions.

Et je remercie aussi toutes les personnes du laboratoire qui m'ont aidée à un moment ou à un autre, qui m'ont aussi soutenue, et celles qui ont partagé mon bureau, les pauses clopes et les pauses colonnes aussi… Un merci tout particulier aux deux super chouettes nanas qui ont partagées ma dernière année de thèse. Amparo, je n'aurais pas assez de papier pour te dire à quel point ma thèse aurait été différente si tu n'étais pas arrivée, je n'aurais pas pu rêver mieux. Je pourrais citer pleins d'anecdotes ou de mots comme YumYum, déménagement, The strain, review, Jäger Bong, macaron, deltoïde… pour décrire tous les fous-rires ou grandes discussions que nous avons pu avoir mais comme je l'ai dit plus haut pas assez de papier… alors juste merci ! Constance, merci à toi aussi pour ta bonne humeur, ton empathie, ton soutien et toutes les longues discussions (drôle ou pas) que nous avons pu avoir. Les filles, les repas Yum Yum vont presque me manquer, il faudra absolument trouver une nouvelle coutume !!! Merci à mes amis qui m'ont toujours soutenue. Pauline, ma confidente, merci pour ta disponibilité dans les bons comme dans les mauvais moments. On peut dire qu'on en aura écrit des thèses et des mémoires ensembles… si on m'avait dit ça il y a 18 ans je n'y aurais pas cru ! Merci à ma précieuse équipe, Rabah, Antoine, Lara, Pierre, Céline (+1), Jeff, Marine Alex, Julie. Vous êtes une équipe « bluffante » comme dirait certains ! Merci à chacun de vous, vous avez tous quelque part participer à ma thèse, que cela soit en m'écoutant, en m'aidant (à dessiner par exemple), ou même encore en me supportant dans mes moments craquages ! Merci à vous tous pour toutes les belles soirées, vacances, fou-rires que nous avons partagés durant ces dernières années! La machine à écrire est prête pour les nouvelles histoires ! Merci à ma famille et mes proches de m'avoir soutenue. Merci Maman d'avoir toujours cru en moi! Merci Mamie ! Merci Sophie ! Merci Alain ! Merci Babette ! Merci Gilles ! Et merci à tous ceux que je n'ai pas cités mais qui sauront lire entre les lignes.

Enfin, le meilleur pour la fin, merci à l'amour de ma vie, Julien. Merci pour ton soutien sans faille, ton amour et surtout pour arriver, en toutes occasions, à me voler un sourire !

Abréviations

Introduction générale

L'augmentation des gaz à effet de serre, l'amoindrissement et la forte variation du coût des ressources fossiles, l'impact de plus en plus néfaste de notre système de production et de consommation sur l'environnement ainsi que la santé sont aujourd'hui des enjeux économiques et environnementaux au coeur des préoccupations de la société. Les domaines basés sur la valorisation des ressources renouvelables issues du végétal tel que la production de produits biosourcés et la chimie verte sont en voie de devenir une nécessité pour palier la diminution des ressources fossiles que va connaître le XXI ème siècle. Le respect et la valorisation de la nature sont devenus des aspects déterminants pour la réalisation des futurs projets économiques et des projets de développement de produits finis. La chimie verte est un secteur d'ores et déjà considéré comme primordial et déterminant pour l'avenir de la planète.

Les enjeux de la chimie verte sont multiples et ont notamment pour but de réduire l'impact de l'industrie chimique sur l'environnement, développer des technologies plus propres, valoriser les déchets et établir des prévisions de fin de cycle des produits manufacturés. L'un des principaux challenges actuels est donc de s'affranchir de l'utilisation massive du pétrole. Les ressources renouvelables issues du végétal constituent une bonne source de matières premières pour répondre à nos besoins qu'ils soient d'ordre énergétique ou pour la production de produits finis. Permettant d'obtenir le même panel de produits, c'est à dire les carburants et les molécules plateformes (« Building Block »), les raffineries pourraient à moyen terme être totalement remplacées par les bioraffineries utilisant la biomasse comme matière première. Il est important de distinguer deux types de bioraffineries, celles de première génération utilisant des plantes alimentaires comme les graines de céréales ou l'amidon, et celles de deuxième génération utilisant la biomasse lignocellulosique. Présentant la qualité indéniable de respecter l'environnement comparativement aux méthodes issues de la pétrochimie, la première génération présente néanmoins un grand problème éthique dû à l'utilisation de ressources alimentaires. Les recherches actuelles s'orientent donc vers la deuxième génération de bioraffineries. La biomasse lignocellulosique représente l'une des ressources naturelles la plus abondante sur terre et a pour avantage d'avoir un prix de revient extrêmement faible par rapport aux ressources fossiles. On estime à environ 180 milliard de tonnes par an, la production annuelle de la biomasse végétale terrestre or seulement 5% est actuellement utilisée par l'homme. On la retrouve partout autour de nous, de l'herbe aux résidus agricoles Enfin la dernière partie retrace l'ensemble du procédé établi sur la valorisation de la biomasse lignocellulosique pour la production de PLA biosourcé et servira de conclusion générale. [START_REF] Sargantanis | Effect of operating conditions on solid substrate fermentation[END_REF]).

B. Les fermentations

La fermentation en milieu liquide

La fermentation en milieu liquide est actuellement la méthode la plus utilisée pour la production d'acide lactique à partir de différentes sources carbonées comme le lactose, le saccharose, les mélasses [START_REF] Ohashi | Continuous production of lactic acid from molasses by perfusion culture of Lactococcus lactis using a stirred ceramic membrane reactor[END_REF]) mais aussi à partir de l'amidon [START_REF] Ohkouchi | Direct production of l(+)-lactic acid from starch and food wastes using Lactobacillus manihotivorans LMG18011[END_REF]

La fermentation en milieu solide (FMS)

La fermentation en milieu solide est beaucoup moins utilisée pour la production d'acide lactique même si des travaux sont de plus en plus menés. Industriellement, la FMS est utilisée pour la production de biomasse, la production d'enzymes, la production de métabolites secondaires ou encore la production de spores [START_REF] Couto | Application of solid-state fermentation to food industry-a review[END_REF]. En 2000, la FMS a été définie comme étant la croissance de microorganismes sur des substrats solides en absence ou presque d'eau libre [START_REF] Pandey | New developments in solid state fermentation: I-bioprocesses and products[END_REF]. En 1980, Raimbault and Alazard, ont différencié deux types de FMS : la première étant une culture solide sur une

C. Objectif de la thèse

Le projet s'inscrit dans la problématique du développement durable. Il a pour but de produire du poly(acide lactique) à partir de biomasse lignocellulosique en utilisant des procédés les plus respectueux possible de l'environnement. La production industrielle de l'acide lactique utilise déjà un procédé basé sur l'emploi des ressources végétales (amidon). Toutes les démarches entreprises dans ce projet ont pour but de respecter les principes de la chimie verte tels que la valorisation de la biomasse végétale non-alimentaire, l'emploi de méthode entraînant peu/pas de déchets, la production de produits biosourcés et la diminution des coûts énergétiques. Author's information: delbrueckii / son de blé aurait pu avoir. Le PLA obtenu présente les caractéristiques suivantes : Mn : 2200 g/mol, Mw : 10000 g/mol et un indice de polydispersité de 4.55.

II. "Screening

Toutes les démarches qui ont été entreprises dans ce projet ont pour but de répondre au mieux aux différents principes de la chimie verte comme la valorisation de la biomasse végétale non-alimentaire, l'emploi de méthode entraînant pas ou peu de déchets, la production de produits biosourcés et la diminution des coûts énergétiques.

Les perspectives résident essentiellement dans le changement d'échelle du protocole ici mis en place. Les rendements de purification présentés pourraient sans doute être augmentés en augmentant l'échelle de purification, particulièrement celle effectuée lors de la première étape de manipulation avec la colonne cationique.

Dans la partie suivante se trouve l'article issu de ces recherches, intitulé « From lignocellulosic biomass to biodegradable polymers: production of polylactic acid by Lactobacillus casei and Lactobacillus delbrueckii from wheat bran hydrolysate », rédigé en anglais et soumis dans le journal « Industrial Crops and Products ».

B. Article

From lignocellulosic biomass to biodegradable polymers: Production of polylactic acid by Lactobacillus casei and Lactobacillus delbrueckii from wheat bran hydrolysates.

Flavie Prévot, Eric Pollet, Luc Avérous, Vincent Phalip

Author information: 3). Le lactide produit n'a pas été purifié.

Toutefois, malgré l'absence de purification, les analyses RMN ont montré que le lactide produit était relativement pur. Le lactide produit est ensuite séché sous vide afin de s'assurer du bon contrôle de la qualité et de la longueur des chaines du PLA.

IV. Conclusion générale

Ce projet de thèse avait pour objectif de développer un procédé complet de la

Summary

This thesis is articulated around the lignocellulosic biomass valorization to develop a fully sustainable, green and cheap route of PLA production. During a first study, two pretreatments have been realized on the lignocellulosic biomass in order to release the fermentable sugars. Several fermentations strategies have been considered and a screening of the couples microorganisms / biomasses has been performed in order to select the best strategy and the best couple microorganism / biomass for lactic acid production. The lactic acid bacteria, Lactobacillus casei and Lactobacillus delbrueckii and wheat bran have been selected to produce lactic acid via a liquid state fermentation on the acid hydrolysate obtained thanks to a diluted acid pretreatment on the wheat bran. During a second study, the chosen strategy has been optimized and scaled-up in order to increase the lactic acid concentration. Liquid state fermentations have been made in a bioreactor in order to control parameter needed for the optimal growth and consequently the optimal lactic acid production (pH, pO 2 , agitation, acid lactic production). Then, the lactic acid purification has been performed by ion exchange chromatography. This technic was made in two key steps using a strong cationic column and a weak anionic column successively. Finally, the purified lactic acid was then polymerized by ring opening polymerization (ROP). During all the researches, the green chemistry has been placed in the first plan in one hand by the choice of the topic of the study (biomass valorization) and in a second hand by the choice of each employed method (no solvent; few chemical products; sustainable, cheap and green methods).

Keys words: pretreatment, fermentation, microorganisms, lignocellulosic biomass, lactic acid, purification, polymerization, PLA.

Flavie Prévot

Valorisation de déchets végétaux pour la bioproduction de poly(acide lactique)

  -co-LA]: Poly(ε-caprolactone-co-D,L-lactide) PDA: Potato dextrose agar PDB: Potato dextrose broth PDO: Propylene glycol; 1,2-Propanediol P[FS-co-BS]: Poly(2,5-furandimethylene succinate-co-butylene succinate)

  phase substrat-support (assurant à la fois le support et la source de nutriments nécessaire aux microorganismes) et la deuxième étant une culture solide avec une phase support imprégnée d'un milieu liquide nutritif(Raimbault and Alazard 1980, Chen and[START_REF] Chen | Value-added bioconversion of biomass by solid-state fermentation[END_REF]. La FMS est donc un procédé constitué de trois phases : une phase solide, une phase liquide (absorbée ou complexée par le substrat) et une phase gazeuse piégée dans les particules (ou entre ces dernières). Pour permettre une bonne croissance des microorganismes et une bonne expression de leur métabolisme, la phase solide doit présenter une Activité de l'eau (Aw) optimale[START_REF] Pandey | Solid-state fermentation[END_REF]. La capacité en rétention d'eau des substrats solides peut varier de 12 à 90%, ce qui correspond à une Aw comprise entre 0.65 et 0.98[START_REF] Assamoi | Aspects microbiologiques de la production par fermentation solide des endo-beta-1, 4-xylanases de moisissures: le cas de Penicillium canescens[END_REF]. Les champignons filamenteux FMS, comme Rhizopus oryzae sont des microorganismes très plébiscités en FMS, en raison de leur résistance à une faible Aw et à pression osmotique élevée. La FMS est considérée comme un procédé technologique reproduisant les conditions naturelles de vie des microorganismes, en permettant leur adhésion à la surface d'un support organique[START_REF] Hölker | Solid-state fermentation-are there any biotechnological advantages?[END_REF]. Par conséquent, la FMS est particulièrement adaptée aux organismes pluricellulaires et aux souches sauvages. Ce type de culture est hétérogène et l'inoculation se fait en conidies ou en mycélium. Les cultures peuvent être pures ou au contraire mixtes (synergie possible des métabolismes)[START_REF] Brijwani | Production of a cellulolytic enzyme system in mixed-culture solid-state fermentation of soybean hulls supplemented with wheat bran[END_REF]. Un regard tout particulier doit être apporté au choix du substrat. Deux catégories de support sont distinguées : les supports inertes et les supports organiques. La première catégorie comprend les matériaux synthétiques comme la mousse de polyuréthane et les matériaux dits minéraux comme les granulés d'argile et les perlites. Ces matériaux ne constituent alors que des supports inertes et nécessitent l'apport d'un milieu nutritif (sel minéraux, source de carbone et d'azote). La deuxième catégorie est constituée des matériaux organiques naturelles de type amylacé ou lignocellulosique. Ce sont des sources de polymères insolubles, complexes et hétérogènes tel que le son de blé, les rafles de maïs, la bagasse de canne à sucre, etc. Elles sont considérées comme des matières premières abondantes et par conséquent bon marché. Ces matériaux constituent à la fois le support et le substrat de la FMS[START_REF] Durand | La fermentation en milieu solide[END_REF]. Lors du choix du substrat, plusieurs facteurs rentrent en jeu : la taille des particules, la porosité, sa capacité de rétention d'eau (ou sa capacité à contenir des éléments nutritifs), son coût et sa disponibilité[START_REF] Manpreet | Influence of process parameters on the production of metabolites in solid-state fermentation[END_REF]. De plus, la sélection du substrat doit se faire en affinité avec les microorganismes choisis. En effet, sa composition biochimique dans le cas d'un support organique aura une incidence directe sur les microorganismes et sur le profil enzymatique. Les procédés utilisés en FMS posent de nombreux problèmes dus à un contrôle et une régulation difficile des paramètres environnementaux tels que la température, le pH, l'agitation, etc. L'impossibilité de contrôler certains de ces paramètres à l'aide de capteurs en ligne lors de la fermentation est aujourd'hui un facteur limitant pour l'évolution des procédés de FMS[START_REF] Bellon-Maurel | Sensors and measurements in solid state fermentation: a review[END_REF].Ce problème se retrouve lors d'un changement d'échelle (« scale up ») où les dispositifs sont encore en voie d'optimisation. Le besoin d'ingénierie et de conception de bioréacteurs à l'échelle industrielle pour la FMS est grand[START_REF] Couto | Application of solid-state fermentation to food industry-a review[END_REF]. Cela est principalement dû à une faible standardisation de ce type de système, une hétérogénéité du substrat, à une reproductibilité limitée et à des problèmes pour miniaturiser des bioréacteurs[START_REF] Bellon-Maurel | Sensors and measurements in solid state fermentation: a review[END_REF]. L'extraction du produit fermenté en FMS représente un avantage puisqu'elle nécessite en fonction de l'application aucune extraction ou l'utilisation d'un faible volume de solvant. Néanmoins le produit présente généralement un haut niveau d'impureté.

  Néanmoins, l'utilisation de l'amidon pour cette production entre en compétition avec son usage alimentaire. Ce procédé pose aujourd'hui un problème éthique dans un monde où 868 millions de personnes ont un apport énergétique insuffisant (Food and Agriculture Organization (FAO, 2013)). Par conséquent, le développement d'un procédé utilisant la biomasse lignocellulosique comme matière première permettrait une production plus respectueuse de notre environnement.Dans ce travail, la production d'acide lactique s'effectue en plusieurs étapes clés. Au préalable, la biomasse lignocellulosique doit être prétraitée afin de déstructurer et d'hydrolyser la paroi végétale. Cette étape est nécessaire car elle permet la libération des sucres fermentescibles nécessaires aux microorganismes pour produire l'acide lactique.Ensuite vient la fermentation en elle-même. Elle nécessite la sélection de biomasse, des microorganismes et la mise en place de différentes stratégies de fermentation. L'acide lactique produit est ensuite extrait et purifié. La dernière étape consiste à polymériser cet acide lactique en PLA. Les techniques utilisées dans chaque étape ont été choisies afin de répondre aux critères d'un procédé engagé dans le développement durable. Le schéma ci-dessous illustre les étapes clés du projet de production d'un PLA bio-sourcé (Figure1).

Figure 1 :

 1 Figure 1 : Description du projet de thèse

  Dans ce chapitre, la valorisation de la biomasse lignocellulosique a été étudiée en vue de produire de l'acide lactique. Pour cela plusieurs biomasses lignocellulosiques ont été étudiées, plusieurs microorganismes sélectionnées et plusieurs stratégies de fermentation, basées sur différents prétraitements, ont également été mises en place. Le son de blé (Comptoir Agricole de Hochfelden), les rafles de maïs (Comptoir Agricole de Hochfelden) et la bagasse de sucre de canne (Syral) sont les substrats lignocellulosiques qui ont été utilisés durant cette étude. Les microorganismes suivants ont été sélectionnés sur leur capacité à produire de l'acide lactique : Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii et Rhizopus oryzae. L. casei et L. delbruckii sont des bactéries lactiques productrices de L (+) et D (-) acide lactique. Les espèces de Lactobacillus sont considérées comme GRAS (Generally Recognized As Safe). Elles ont été en premier lieu classées en trois genres (Therbacterium, Betabacterium et Streptobacterium) selon des critères de température optimale de croissance et de produit de fermentation des sucres par Orla-Jensen en 1919. Néanmoins en 1986, suite à leurs travaux de taxonomie moléculaire, Kandler et Weiss (1986) ont revu cette classification en trois groupes : Groupe I, Groupe II et Groupe III correspondant respectivement au genres précédemment énoncés. L. casei appartient au Groupe III, qui comprend les espèces à métabolisme hétérofermentaire facultatif. Les hexoses sont fermentés par la voie d'Emden-Meyerhof en acide lactique tandis que les pentoses peuvent l'être également en empruntant la voie hétérofermentaire. L. casei a été sélectionné pour son aptitude à produire majoritairement du L (+) acide lactique. L. delbrueckii appartient au Groupe I, qui comprend les lactobacilles au métabolisme strictement homofermentaire, a été sélectionné pour son aptitude à produire majoritairement du D(-) acide lactique.

  Corresponding author: V. Phalip, E-mail: phalip@unistra.fr, Phone: +33(0, la mise en place d'un procédé complet débutant de la biomasse lignocellulosique et allant jusqu'à l'obtention du poly(acide lactique) a été étudié. Lors du précédent chapitre, il a été mis en évidence que les couples LAB / son de blé présentent les meilleurs résultats pour la production d'acide lactique. Il a également été mis en évidence que la stratégie de fermentation en milieu liquide sur hydrolysat enzymatique (S3) présente les meilleurs résultats pour la conversion d'acide lactique vis à vis de la quantité de son de blé employée tandis que la FML sur hydrolysat acide (S1) semble être plus adaptée pour la conversion du glucose en acide lactique. En se basant sur ces conclusions, S1 a été privilégiée et développée afin d'augmenter la production d'acide lactique. En effet, sa mise en oeuvre en termes de gain de temps et de manipulations est beaucoup plus avantageuse. S3 nécessite deux prétraitements de la biomasse lignocellulosique et la préparation d'un cocktail enzymatique alors que S1 nécessite un seul prétraitement. De plus, le fait que la conversion du glucose en acide lactique soit plus importante avec S1 a également été un argument déterminant pour la sélection de cette stratégie. Lors du « scale-up », deux optimisations ont été effectuées. L'hydrolysat acide a été dilué au quart dans de l'eau ultra-pure afin de limiter la concentration des inhibiteurs de croissance potentiels. Il a également a été supplémenté en glucose (100g/l) afin d'augmenter la concentration finale d'acide lactique au sein du milieu de fermentation. Le fermenteur BIOSTAT®B (B. Braun Biotech International) d'un volume utile de 1.6L a été utilisé. Contrairement aux expériences menées lors du 2ieme chapitre, le passage à l'étape pilote a permis un suivi permanent des paramètres environnementaux au sein du substrat comme le pH, la température, la pO 2. L'optimisation de la stratégie S1 (dilution de l'hydrolysat et ajout de glucose) ainsi que le suivi des précédents paramètres ont permis d'obtenir un rendement de la production d'acide lactique par rapport au glucose d'environ 60% concernant L. casei (majoritairement du L-acide lactique) en quinze jours (avec une concentration en acide lactique de 63.5g/l) et d'environ 33% pour L. delbrueckii (majoritairement du D-acide lactique) en trois semaines (avec une concentration de 35g/l). Les rendements obtenus sont comparables à ceux atteint lors de la fermentation à petite échelle qui étaient de 73% et 52% respectivement pour L. casei et L. delbrueckii. La dilution au quart de l'hydrolysat et l'addition de glucose ont permis d'obtenir des rendements d'acide lactique par rapport à la masse de son de blé utilisée de 0.9g/g pour L. casei et de 0.5g/g pour L. delbrueckii. Comparativement à la fermentation non optimisée sur hydrolysat acide (S1) à petite échelle, où les rendements été de 9mg/g et de 7mg/g pour L. casei et L. delbrueckii, il est évident que l'optimisation a été effectuée avec succès. La deuxième partie du travail a constitué à purifier l'acide lactique contenu dans le milieu de fermentation. Un protocole en plusieurs étapes permettant une purification optimale a été mis en place. Dans un premier temps, le milieu de fermentation subit une ultrafiltration (VIVACELL 100, Sartorius, cut off : 10 kDa) afin de clarifier le milieu. Puis dans un second temps, l'acide lactique contenu dans le milieu de fermentation clarifié est purifié grâce à la chromatographie par échange d'ions (des colonnes cationiques et anioniques sont successivement utilisées). La colonne échangeuse de cations choisie est une colonne acide forte : S-Sépharose Fast-Flow (Pharmacia). Les fractions ayant un pH inférieur au pKa de l'acide lactique (3.8) sont récoltées dans le but de passer dans la colonne échangeuse d'anions basique faible : DEAE-Sepharose Fast-Flow (Pharmacia). Cette colonne permet principalement d'éliminer toute trace de chlorures et de phosphates. Suite à ces étapes de purification, on obtient une solution aqueuse contenant l'acide lactique pur. L'acide lactique est ensuite isolé sous la forme d'une huile jaune clair par évaporation de l'eau grâce au rotavapor. Les rendements de purification obtenus sont 40.7% pour l'acide lactique issu du couple L.casei / son de blé et 34% pour l'acide lactique issu du couple L. delbrueckii / son de blé. Cette étape s'est avérée être l'étape limitante de notre procédé à cette échelle (un grand nombre de répétitions des manipulations a été nécessaire). L'acide lactique obtenu a été dosé afin d'évaluer leur proportion en isomère : l'acide lactique issu de la fermentation L.casei / son de blé possède en moyenne 93.5% L-acide lactique et 6.5% D-acide lactique, tandis que l'acide lactique issu de la fermentation L.delbrueckii / son de blé possède en moyenne 11% Lacide lactique et 89% D-acide lactique. Ces résultats correspondent bien aux résultats attendus et obtenus sur milieu riche MRS (chapitre 2). La polymérisation de l'acide lactique issu de la fermentation avec L. casei a ensuite été réalisée. Cette polymérisation a été menée en trois étapes. La première étape a consisté en une polycondensation en masse sans catalyseur pour obtenir les oligomères (180°C, 25mmHg, 24h). Ensuite une dépolymérisation en masse avec l'octanoate d'étain (0.2 % en masse par rapport aux oligomères) a été réalisée afin d'obtenir le lactide (200°C, 2mmHg). Cette étape a été effectuée à l'aide d'un Kügelrohr. Enfin la dernière étape a consisté en une polymérisation par ouverture de cycle « ring opening polymerisation » (ROP) avec l'octanoate d'étain comme catalyseur (2.5 % en masse par rapport au lactide) (160°C, Patm, 3h). La dernière étape de polymérisation n'a pu être conduite totalement avec l'acide lactique purifié en raison de l'étape limitante que représente la purification. Par conséquent, les dernières étapes de polymérisation de l'acide lactique en PLA ont été effectuées en utilisant des mélanges d'acides lactiques commerciaux mimant le plus fidèlement possible les mélanges biosourcés dans le but d'obtenir les principales caractéristiques du PLA attendu. La quantité d'acide lactique purifié issue du couple L. casei / son de blé a permis de réaliser les deux premières étapes de la polymérisation permettant ainsi de valider la cohérence entre l'acide lactique produit et celui reconstitué avec les produits commerciaux. Le PLA obtenu présente les caractéristiques suivantes : Mn : 6000 g/mol, Mw : 14700 g/mol et un indice de polydispersité de 2.9. Des résultats complémentaires à la publication concernant la polymérisation avec l'acide lactique issu de la fermentation avec L. delbrueckii sont présentés dans une troisième sous-partie. Cette partie a été effectuée avec un mélange racémique commercial d'acide lactique et par conséquent ne mime pas les caractéristiques que le polymère issu du couple L.

Figure 3 :

 3 Figure 3 : RMN du lactide issu des oligomères de LA L/D

Figure 4 :

 4 Figure 4 : RMN du PLA issu de LA L/D

  Ce projet a donc mis en évidence la faisabilité d'un procédé de production d'un polymère biosourcé, le PLA, en utilisant la biomasse lignocellulosique. Afin d'optimiser cette valorisation, plusieurs perspectives d'amélioration pourraient être discutées. Les deux premières sont directement liées au procédé de production d'acide lactique et concerne le prétraitement de la biomasse lignocellulosique et la purification de l'acide lactique. En effet un prétraitement plus efficace de la biomasse lignocellulosique pourrait augmenter la quantité de sucres fermentescibles libérée lors de la déstructuration de la paroi végétale et ainsi éviter l'ajout de glucose lors l'optimisation du procédé. Depuis quelques années, l'amélioration des prétraitements de la biomasse lignocellulosique est devenue un sujet de recherches très documenté en raison de la nécessité de son utilisation pour l'élaboration de produits finis durables respectant l'environnement. La purification de l'acide lactique fermenté pourrait également être améliorée en passant à un « scale-up » du procédé afin de réduire le nombre de manipulations. Afin d'augmenter la valorisation de la biomasse lignocellulosique, une dernière perspective peut également être mise en lumière grâce aux différents résultats obtenus lors des chapitres 2 et 3. En effet, la stratégie choisie pour ce projet repose sur l'utilisation de l'hydrolysat obtenu suite au prétraitement à l'acide dilué, laissant la biomasse prétraitée disponible pour une autre utilisation. Il serait donc possible d'envisager, deux productions d'acide lactique simultanées basées sur deux stratégies différentes sur une même quantité de biomasse. Pour cela, la stratégie S3 (FML sur hydrolysat enzymatique) qui présentait de bons résultats lors de l'étude menée dans le chapitre 1 pourrait être optimisée afin de cumuler sa production d'acide lactique avec celle obtenue avec S1 (Figure5).

Figure 5 :

 5 Figure 5 : Association des deux stratégies S1 et S3 en vue d'augmenter les rendements de valorisation de la biomasse lignocellulosique. S1 : FML sur hydrolysat acide ; S3 : FML sur hydrolysat enzymatique.

  et forestiers ainsi qu'aux sous-produits de transformation du bois. La biomasse lignocellulosique est constituée d'un réseau tridimensionnel de polymères : la cellulose, l'hémicellulose et la lignine. La cellulose et l'hémicellulose sont des sources abondantes de sucres fermentescibles (hexoses et pentoses). De nombreux microorganismes utilisent ces sucres comme source d'énergie et en fonction de leur métabolisme permettent la production de produits divers comme l'éthanol, l'acide lactique, l'acide itaconique, l'acide succinique et autres. Le travail de cette thèse consiste à valoriser la biomasse lignocellulosique afin d'obtenir un produit biosourcé, le Poly(acide lactique)(PLA). Pour développer un procédé entier, plusieurs étapes clés ont été étudiées. Dans le but de produire de l'acide lactique avec un bon rendement, plusieurs stratégies de fermentation ont été évaluées en réalisant un criblage de plusieurs microorganismes et de plusieurs biomasses lignocellulosiques. Les

	production d'acide lactique. Afin d'effectuer ce criblage, plusieurs stratégies de fermentation
	et de prétraitement de la biomasse lignocellulosique sont discutées. Après avoir décrit le
	contexte de l'étude et ses perspectives, les recherches sont présentées sous forme d'un article,
	intitulé « Screening of biomass, microorganisms and fermentation processes in biomass,
	valorization through lactic acid production », rédigé en anglais et retranscrit tel que nous
	souhaitons le soumettre.
	La troisième partie du manuscrit est consacrée à l'étude du procédé dans sa globalité partant
	de la biomasse lignocellulosique jusqu'à l'obtention du PLA. Les choix du couple
	microorganisme/biomasse lignocellulosique et de la stratégie de fermentation ont été réalisés
	grâce aux résultats établis dans la partie précédente. Une optimisation du procédé de
	production d'acide lactique a été menée à plus grande échelle. Puis, l'extraction et la
	purification de l'acide lactique biosourcé a été étudié pour aboutir au PLA par polymerisation
	par ouverture de cycle « ring opening polymerization ». Après avoir décrit le contexte de
	l'étude, les recherches sont présentées sous forme d'un article, intitulé « From lignocellulosic
	biomass to biodegradable polymers: Production of polylactic acid by Lactobacillus casei and
	Lactobacillus delbrueckii from wheat bran hydrolysates », rédigé en anglais et soumis dans le
	journal « Industrial Crops and Products », accompagnés de résultats complémentaires.
	molécules chimiques a été mentionnée. Enfin, la production actuelle des biopolymères issus
	de ces quatre acides organiques et de leurs dérivés a été étudiée, en mentionnant la possibilité
	d'une future production issue de la biomasse lignocellulosique. La revue
	intitulée «Bioproduction of organic acids building blocks from lignocellulosic ressources -
	Towards biobased polymers» a été écrite en anglais et insérée telle que nous souhaitons la
	soumettre. Différents types de fermentation sont ensuite décrits en vue de compléter l'état de
	l'art du sujet évoqué dans la revue. Enfin, compte tenu des éléments bibliographiques,
	l'objectif de la thèse est décrit.
	La deuxième partie de ce mémoire est consacrée à l'optimisation des choix de la
	biomasse lignocellulosique et du microorganisme en vue d'obtenir un bon rendement de

autres étapes clés du procédé, l'extraction et la purification de l'acide lactique biosourcé issue du milieu de fermentation, ont également été abordées dans le but de produire le PLA.

Ce manuscrit est divisé en quatre parties. La première partie décrit la recherche bibliographique effectuée sur l'état de l'art du sujet. Ce chapitre a pour objectif de présenter les différents enjeux s'articulant autour de la valorisation de la biomasse lignocellulogique jusqu'à l'obtention de polymères biosourcés. Pour cela, une revue a été écrite. Après une description des prétraitements pouvant être utilisés sur la biomasse lignocellulosique, la notion et l'importance des « building blocks » ont été introduites. Aujourd'hui, l'importance de pouvoir les produire via l'utilisation de biomasse lignocellulosique au lieu de sucres et d'amidon semblent être au coeur des préoccupations. La production de quatre acides organiques « building blocks » d'intérêt particulier a été décrite (fermentation, microorganismes, biomasse lignocellulosique…) et leur potentialité en tant que plateforme de

  et de la cellulose(Abe and Takagi 1991). C'est une fermentation favorable aux organismes unicellulaires tels que les bactéries et les levures. Ce type de fermentation est adapté aux souches mutées ou modifiées génétiquement[START_REF] Stephanopoulos | Challenges in engineering microbes for biofuels production[END_REF]. Les cultures pures sont davantage adaptées, les cultures mixtes présentant de nettement moins bon résultats (contrairement à la FMS). L'inoculation des microorganismes se fait en cellules ou en volume de culture. La culture est homogène en tout point du substrat qui est aussi homogène. Les milieux de culture sont souvent des matières premières coûteuses, solubles ou sous forme de fines particules en suspension. Des prétraitements sont fréquemment employés (particulièrement pour la biomasse lignocellulosique) afin d'atteindre un milieu de culture liquide[START_REF] Sun | Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review[END_REF] Cheng 2002, Talebnia, Karakashev et al. 2010). Au sein du substrat, la quantité d'eau est non limitée et la quantité d'air est limitée contrairement au substrat employé en FMS. Le produit de fermentation qui est dilué au sein du substrat, demande des traitements important en vue de son extraction. En revanche, le produit présente

un taux d'impuretés modéré contrairement à la FMS. Le procédé est relativement aisé en FML contrairement à la FMS. Le contrôle et la régulation des paramètres environnementaux sont aisés et des capteurs en ligne sont disponibles. Ce procédé génère néanmoins un volume important d'effluent à traiter.

(fermentation liquide sur hydrolysat acide) S2 (fermentation solide sur hydrolysat acide) S3 (fermentation liquide sur hydrolysat enzymatique) S4 (saccharification et fermentation solide simultanées)

  par conséquent il produit exclusivement du L(+) acide lactique. Ce microorganisme a été sélectionné parce qu'il est filamenteux et possède donc la capacité de coloniser efficacement les substrats solides. des conditions optimales. S4 correspond à une saccharification et fermentation solide simultanées. Cette fermentation en milieu solide s'effectue sur chaque biomasse prétraitée à l'acide dilué en présence du cocktail enzymatique pour humidifier le substrat. Toutes ces stratégies ont été menées sans aucun ajout de sucres ou de nutriments. En a obtenu les meilleurs résultats sur toutes les biomasses utilisées avec les bactéries lactiques en termes de rendement d'acide lactique par masse de substrat lignocellulosique utilisé. Le meilleur rendement est obtenu avec le couple L. casei / son de blé, il atteint 72mg/g soit presque sept fois plus que le rendement obtenu avec le même couple dans toutes les autres stratégies. Néanmoins S1 a obtenu les meilleurs rendements de conversion de glucose en acide lactique et cela avec toutes les biomasses (sauf dans le cas du couple L. casei / bagasse de canne à sucre qui atteint un rendement légèrement meilleur en S3). Le meilleur rendement est obtenu avec le couple R. oryzae / son de blé (77%), alors qu'avec S3, le rendement est de 6% seulement. Il est suivi de près par les couples L. casei / son de blé et L. Production d'acide lactique en utilisant les différentes stratégies de fermentation Pour la suite de l'étude, la FML sur hydrolysat acide a été privilégiée, pour des raisons qui seront explicitées dans le prochain chapitre. Celui-ci décrit le « scale up » de la stratégie

	Cette étude se concentre sur le criblage des différents couples effet, les milieux de fermentation utilisés (liquide ou solide) proviennent directement des Tableau 2 : choisie. Les paramètres sélectionnés ont été optimisés afin d'atteindre une production d'acide
	microorganisme/biomasse et sur les différentes stratégies de fermentation afin d'identifier le prétraitements réalisés sur la biomasse lignocellulosique et ont été substitués au milieu de lactique plus élevée en vue d'une extraction/purification de l'acide lactique et d'une
	meilleur microorganisme, la meilleure biomasse et la meilleure stratégie. Afin de libérer les fermentation standard. polymérisation pour permettre la synthèse de poly(acide lactique) (PLA) à partir de biomasse
	sucres fermentescibles, la biomasse lignocellulosique brute a été prédigérée. Pour cela deux lignocellulosique.
	prétraitements ont été testés: l'hydrolyse à l'acide dilué et l'hydrolyse enzymatique. Ces Les résultats obtenus grâce aux quatre stratégies mises en place montrent que la
	prétraitements ont permis de développer quatre stratégies de fermentation. Chaque stratégie a été réalisée sur chaque biomasse et avec chaque microorganisme. Dans la partie suivante se trouve l'article issu de ces recherches, intitulée « Screening production d'acide lactique diffère en fonction du substrat lignocellulosique utilisé. Les delbrueckii / son de blé qui atteignent respectivement 73% et 52% avec S1 (comparativement of biomass, microorganisms and fermentation processes in biomass, valorization through biomasses lignocellulosiques ne se comportent pas de la même manière lors de prétraitement à 63% et 21% avec S3). lactic acid production », rédigé en anglais et retranscrit tel que nous souhaitons le soumettre.
	Les bactéries lactiques s'adaptent donc à tous les types de stratégies misent en place L.casei L.delbrueckii L.casei L.delbrueckii L.casei L.delbrueckii L.casei L.delbrueckii
	puisqu'elles produisent dans tous les cas de l'acide lactique. Dans le cas du champignon
	filamenteux, la faible quantité de glucose semble être un facteur limitant à la production
	d'acide lactique. En effet, malgré l'observation de la croissance, le champignon sporule très Rendement (% glc) 73.2 51.8 --62.9 20.9 --
	vite dans chaque stratégie et produit rarement de l'acide lactique. Il n'y a qu'en FML que ce
	Aspergillus tubingensis/ son de blé a été choisi suite à l'analyse des résultats obtenus lors des dernier produit de l'acide lactique et cela uniquement sur les hydrolysats issus du
	dosages des activités enzymatiques des cocktails. Chaque biomasse prétraitée à l'acide dilué a prétraitement du son de blé. L'existence chez ce champignon d'une lactate déshydrogénase, Rendement (mg/g) 9.9 7.0 12.6 14.9 72.3 24.0 11.7 15.6
	subi une hydrolyse enzymatique avec ce cocktail enzymatique. Suite à ce prétraitement, deux potentiellement régulée de manière différentielle par des éléments des hydrolysats, capable de
	Nombre d'étapes	1	1	2	2

R. oryzae est un champignon filamenteux utilisant également la glycolyse dans son intégralité pour la production d'acide lactique. Contrairement aux bactéries lactiques, il possède uniquement le gène l-ldh codant la L-lactate déshydrogénase et Un premier prétraitement, l'hydrolyse à l'acide dilué a été effectuée sur les biomasses brutes. Ce prétraitement permet de fractionner, solubiliser et hydrolyser l'hémicellulose, la cellulose et la lignine. L'hémicellulose est mieux dégradée par ce type de prétraitement. Ce prétraitement a donné lieu à l'élaboration de deux stratégies de production d'acide lactique. La stratégie 1 (S1) correspond à une fermentation en milieu liquide sur l'hydrolysat acide issu de chaque biomasse. S2 correspond à une fermentation en milieu solide sur chaque biomasse prétraitée suite à l'hydrolyse acide et adaptée aux conditions optimales de chaque microorganisme. Un deuxième prétraitement, l'hydrolyse enzymatique a été réalisée sur chaque biomasse prétraitée. Ce prétraitement est préconisé en ajout à l'hydrolyse acide pour une hydrolyse plus complète des polysaccharides de la biomasse, en particulier ceux issus de la dégradation de la cellulose. Dans un premier temps, afin d'effectuer l'hydrolyse enzymatique, une étude rapide a été menée afin d'élaborer un cocktail enzymatique adéquat. Ce dernier a été obtenu suite à une fermentation en milieu solide sur le son de blé non prétraité. Plusieurs microorganismes (Aspergillus tubingensis, Trichoderma sp, Rhizopus oryzae, Fusarium venenatum) ont été testés afin de sélectionner le cocktail le plus performant. Le couple autres stratégies de fermentation ont été réalisées. La stratégie S3 correspond à une fermentation en milieu liquide sur l'hydrolysat enzymatique issu de chaque biomasse devenant le milieu de fermentation après avoir été traité pour permettre la croissance de chaque microorganisme dans visant à digérer la paroi lignocellulosique et par conséquent ne libère pas la même quantité de sucres fermentescibles. En effet, les biomasses étudiées ne possèdent pas la même proportion de chaque polymère constituant le complexe lignocellulosique et donc ne répondent pas de la même manière aux prétraitements. Le son de blé est la biomasse lignocellulosique ayant eu les meilleurs résultats avec toutes les stratégies mises en place et avec tous les microorganismes étudiés. Cela s'explique en partie par sa structure, avec un pourcentage de lignine faible et un pourcentage d'hémicellulose plus élevé que celui de cellulose. Cette biomasse répond bien aux prétraitements mises en place et est celle qui permet d'obtenir le meilleur rendement de conversion du glucose en acide lactique et le meilleur rendement d'acide lactique par rapport à la quantité de biomasse lignocellulosique utilisée.

Les bactéries lactiques présentent les meilleurs résultats dans toutes les stratégies sauf dans le cas de S1 où le champignon filamenteux montre des résultats légèrement supérieurs. fonctionner dans le sens de la consommation de l'acide lactique pour former du pyruvate dans des conditions de déficit en glucose pourrait expliquer ces observations.

S3

Cette étude a été menée dans le but de choisir les microorganismes, la biomasse lignocellulosique et la stratégie de fermentation la plus adaptée à une production d'acide lactique. Suite aux différents résultats obtenus, les bactéries lactiques (L. casei et L. delbrueckii), le son de blé ont été sélectionnés. La FML sur hydrolysat enzymatique (S3) semble être plus adaptée pour la conversion en termes de quantité de son de blé tandis que la FML sur hydrolysat acide (S1) semble plus adaptée pour la conversion du glucose en acide lactique (Tableau 2).

S1

B.

Article Screening of biomasses, microorganisms and fermentation processes in biomass valorization through lactic acid production. Flavie Prévot 1 , Anne Forster 2 , Eric Pollet 1 , Luc Avérous 1 , Vincent Phalip 1, 2

1

  Institut de Chimie et Procédés pour l'Energie, l'Environnement et la Santé, Université de Strasbourg, ECPM, 25 rue Becquerel, 67087 Strasbourg Cedex 2, France. Ecole de Supérieur de Biotechnologie de Strasbourg, Université de Strasbourg, ESBS, 300 boulevard Sébastien Brant, 67412 Illkirch Cedex, France.Figure 2 : RMN des oligomères issus de LA L/D Dans un second temps, les oligomères subissent une dépolymérisation en masse avec l'octanoate d'étain comme catalyseur (0.2 % en masse par rapport aux oligomères) pour former le lactide. La manipulation débute avec 10g d'oligomères. La conversion des oligomères est vérifiée par RMN en utilisant la même méthode que décrit précédemment sauf que le groupe méthyl est comparé au groupe carbonyle du lactide (5,4 ppm). La conversion des oligomères est d'environ de 85% (Figure

	Corresponding author: V. Phalip, E-mail: phalip@unistra.fr
	Phone: +33(0)3 68 85 48
	Publication soumise à droit d'auteur

2

  Néanmoins comparativement à S3, S1 présente la meilleure conversion du glucose en acide lactique, soit 73%, 52%, 77% versus 63%, 21%, 6% pour L. casei, L. delbrueckii et R. oryzae respectivement. Suite à cette première étude, une stratégie a été sélectionnée pour un « scale-up », avec les couples LABs / son de blé, afin d'augmenter la quantité d'acide lactique produit et continuer le développement du procédé par la purification et l'extraction de l'acide lactique du milieu de fermentation ainsi que sa polymérisation en PLA. En raison d'un meilleur rendement en conversion des sucres et de sa facilité de mise en oeuvre la stratégie S1 a été choisie. Cette dernière a été optimisée afin d'augmenter le rendement de conversion en acide lactique par rapport à la quantité de biomasse utilisée tout en préservant son rendement de conversion du glucose. Pour cela, l'hydrolysat acide a été dilué au quart avec de l'eau ultrapure et supplémenté en glucose afin d'atteindre la concentration de 100g/L. La fermentation a été menée au sein d'un bioréacteur BIOSTAT®B (B.Braun Biotech International) d'une capacité utile de 1.6L permettant le suivie des paramètres de fermentation en continu.La dernière étape du procédé a consisté à polymériser l'acide lactique purifié. L'acide lactique issu de la fermentation L. casei / son de blé possède en moyenne 93.5% de L-acide lactique et 6.5% de D-acide lactique, tandis que l'acide lactique issu de la fermentation L. delbrueckii / son de blé possède en moyenne 11% de L-acide lactique et 89% de D-acide lactique. La polymérisation de l'acide lactique issus de L. casei / son de blé a été privilégiée pour deux raisons : une quantité d'acide lactique disponible plus importante et une reproduction du mélange d'isomère plus facile à atteindre avec les solutions commerciales d'acide lactique. La polymérisation en masse a été effectuée en trois étapes (oligomères, lactide, PLA) et en utilisant de faible quantité de catalyseur (octanoate d'étain) afin d'atteindre un polymère possédant un haut poids moléculaire tout en minimisant l'utilisation de produit chimique. La quantité d'acide lactique purifié issue du couple L. casei / son de blé a permis de réaliser les deux premières étapes de la polymérisation validant ainsi la cohérence entre l'acide lactique produit et celui reconstitué avec les produits commerciaux. Le PLA obtenu présente les caractéristiques suivantes : Mn : 6000 g/mol, Mw : 14700 g/mol et un indice de polydispersité de 2.9.

	valorisation de la biomasse lignocellulosique jusqu'à l'obtention d'un polymère biosourcé : le
	PLA.
	Dans un premier temps, des biomasses lignocellusiques (le son de blé, les rafles de
	maïs et la bagasse de canne à sucre) ont été choisies et des microorganismes producteurs
	d'acide lactique (Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii et Rhizopus oryzae) ont été
	sélectionnés. Afin d'augmenter l'accessibilité aux sucres fermentescibles de la biomasse
	lignocellulosique, deux prétraitements ont été utilisés : l'hydrolyse à l'acide dilué et
	l'hydrolyse enzymatique. Suite à ce choix de prétraitement, quatre stratégies de fermentation
	ont été mises en place. S1 et S3 correspondent respectivement à des FML sur l'hydrolysat
	acide et l'hydrolysat enzymatique. S2 correspond à une FMS sur la biomasse
	lignocellulosique issue du prétraitement à l'acide dilué. Enfin S4 correspond à une
	fermentation et une saccharification simultanées sur la biomasse lignocellulosique également
	issue du prétraitement à l'acide dilué. La dernière stratégie a été réalisée avec un cocktail
	enzymatique produit grâce au couple Aspergillus tubingensis / son de blé. Ces quatre
	stratégies ont été accomplies à petite échelle sans aucun ajout de sucres ni de nutriments. En
	effet, les différents milieux liquides et solides obtenus suite aux différents prétraitements ont
	été utilisés en substitution des milieux de culture riches généralement employés pour le
	développement et la production d'acide lactique des différents microorganismes. Le pH des
	différents milieux de fermentation a néanmoins été adapté aux conditions optimales de Pour cela deux colonnes échangeuses d'ions ont été choisies. Une colonne échangeuse de
	croissance des microorganismes : 5.5 pour les bactéries lactiques (L. casei et L. delbrueckii) et cations (acide forte) : S-Sépharose Fast-Flow (Pharmacia) et une colonne échangeuse
	6.5 pour le champignon filamenteux (Rhizopus oryzae). Durant cette étude, un criblage d'anions (basique faible) : DEAE-Sepharose Fast-Flow (Pharmacia). Une solution aqueuse
	microorganisme / biomasse lignocellulosique a été réalisé avec chacune des stratégies mise en contenant l'acide lactique pur a été récupérée à la fin de cette purification. L'acide lactique a
	place. Les résultats obtenus ont permis d'identifier le son de blé comme la biomasse ensuite été isolé sous la forme d'une huile jaune clair par évaporation de l'eau grâce au
	lignocellulosique la plus adaptée à la production d'acide lactique. Les bactéries lactiques ont rotavapor. L'acide lactique issu du couple L. casei / son de blé a été obtenu avec un
	également montré de façon générale une plus grande aptitude à la croissance et à la rendement de purification de 40.7% tandis que l'acide lactique issu du couple L. delbrueckii /
	production d'acide lactique. L'examen des données montre que S3 présente les meilleurs son de blé a été obtenu avec un rendement de 34%. Cette étape s'est avérée limitante pour le

résultats en termes de quantité d'acide lactique produit par rapport à la consommation de biomasse lignocellulosique soit 72mg/g de son de blé (environ sept fois plus que toutes les autres stratégies).

L'optimisation a permis d'obtenir des concentrations en acide lactique de 63.5g/l et de 35g/l avec des rendements de conversion du glucose correspondant de 60% et 33% pour L. casei et L. delbrueckii respectivement. L'optimisation de cette étape a été réalisée avec succès. En effet, la production d'acide lactique par rapport à la consommation de son de blé a atteint 0.9g/g et 0.5g/g versus 9mg/g et 7mg/g (S1 à petite échelle avant optimisation) pour L. casei et L. delbrueckii respectivement.

Dans le but de pouvoir polymériser l'acide lactique en PLA, l'extraction et la purification de l'acide lactique contenu dans le milieu de fermentation a été réalisé grâce à une ultrafiltration du milieu suivie par une méthode de chromatographie par échange d'ions. procédé à cette échelle (un grand nombre de répétitions des manipulations a été nécessaire).

Remerciements

 France, 2011France, -2014 (132h) (132h).

 Monitrice de travaux pratiques en thermodynamique, 1 ère année IUT, IUT Louis Pasteur, Schiltigheim, France, 2011 (60h).


Gilles A Francfort

Antoine Gloria

ISOTROPY PROHIBITS THE LOSS OF STRONG ELLIPTICITY THROUGH HOMOGENIZATION IN LINEAR ELASTICITY

Since the seminal contribution of Geymonat, Müller, and Triantafyllidis, it is known that strong ellipticity is not necessarily conserved by homogenization in linear elasticity. This phenomenon is typically related to microscopic buckling of the composite material. The present contribution is concerned with the interplay between isotropy and strong ellipticity in the framework of periodic homogenization in linear elasticity. Mixtures of two isotropic phases may indeed lead to loss of strong ellipticity when arranged in a laminate manner. We show that if a matrix/inclusion type mixture of isotropic phases produces macroscopic isotropy, then strong ellipticity cannot be lost.

Résumé. Nous savons depuis l'article fondateur de Geymonat, Müller et Triantafyllidis qu'en élasticité linéaire l'homogénéisation périodique ne conserve pas nécessairement l'ellipticité forte. Ce phénomène est lié au flambage microscopique des composites. Notre contribution consiste examiner le rôle de l'isotropie dans ce type de pathologie. Le mélange de deux phases isotropes peut en effet conduire à cette perte si l'arrangement est celui d'un laminé. Nous montrons qu'en revanche, si un arrangement de type matrice/inclusion produit un tenseur homogénéisé isotrope, alors la forte ellipticité est conservée.

Introduction

This contribution is restricted to the two-dimensional case, although most of the results that are being used remain true in any dimension.

In all that follows T stands for the unit 2-torus. Consider a T-periodic heterogeneous linear elastic material characterized by its elasticity tensor field L, a T-periodic symmetric endomorphism on M 2×2 sym , the set of 2 × 2-symmetric matrices. Assume that L is an L ∞ , pointwise very strongly elliptic map, that is that, for some λ > 0, (1.1) M ⋅ L(x)M ≥ λ M 2 for all M ∈ M 2×2 sym , and a.e. x ∈ T. Let D be an open, bounded domain of R d , and u 0 ∈ H 1 (D; R 2 ). Then it is simple to establish, in view of classical homogenization results, that the integral functional

H 1 0 (D) ∋ u ↦ I ε (u) ∶= D ∇(u + u 0 ) ⋅ L( x ε )∇(u + u 0 )dx
Γ-converges for the weak topology of H 1 0 (D) to the homogenized integral functional

H 1 0 (D) ∋ u ↦ I * (u) ∶= D ∇(u + u 0 ) ⋅ L * ∇(u + u 0 )dx,
where L * is a constant elasticity tensor that is very strongly elliptic with constant λ. It is classically given by

(1.2) M ⋅ L * M = min T (M + ∇v) ⋅ L(x)(M + ∇v) dx; v ∈ H 1 (T; R 2 ) .
If instead of pointwise very strong ellipticity, we only assume pointwise strong ellipticity, that is that, for some λ > 0, In an inspirational work [START_REF] Geymonat | Homogenization of nonlinearly elastic materials, microscopic bifurcation and macroscopic loss of rank-one convexity[END_REF], G. Geymonat, S. Müller, and N. Triantafyllidis introduced two measures of coercivity:

M ⋅ L(x)M ≥ λ M 2 for all symmetrized rank one M = a ⊗ b, a, b ∈ R 2 ,
Λ = inf ∫ R d ∇u ⋅ L∇u dx ∫ R d ∇u 2 dx ; u ∈ C ∞ 0 (R 2 , R 2 ) , Λ per = inf ∫ T ∇v ⋅ L∇v dx ∫ T ∇v 2 dx ; v ∈ H 1 (T; R 2 ) .
When Λ > 0, then homogenization occurs as in the classical setting of (1.1), while when Λ < 0, I ε is not bounded from below and there is no homogenization. Their focus was on the case when Λ = 0 and Λ per > 0. There, they showed that there is still homogenization towards I * with associated L * given by (1.2). However, L * may be strongly elliptic (that is, non-degenerate on rank-one matrices) or simply non-negative such matrices, but not strongly elliptic because there exists

a, b ∈ R 2 such that a ⊗ b ⋅ L * a ⊗ b = 0).
The third phenomenon is referred to as loss of strong ellipticity by homogenization. To avoid confusion we will say that a fourth-order tensor L is strongly elliptic if M ⋅ LM ≥ 0 for all rank-one matrices, and that it is strictly strongly elliptic if in addition there exists λ > 0 such that this inequality can be strengthened to

M ⋅ LM ≥ λ M 2 .
There is only one single example [START_REF] Gutiérrez | Laminations in linearized elasticity: the isotropic non-very strongly elliptic case[END_REF] for which one can prove that strong ellipticity is lost by homogenization. The associated composite material has a laminate structure made of two isotropic phases (a strong phase and a weak phase). Loss of strong ellipticity occurs when the strong phase buckles in compression (it is related to the failure of the cell-formula for nonlinear composites, cf. [START_REF] Müller | Homogenization of nonconvex integral functionals and cellular elastic materials[END_REF][START_REF] Geymonat | Homogenization of nonlinearly elastic materials, microscopic bifurcation and macroscopic loss of rank-one convexity[END_REF]). This has been rigorously proved in [START_REF] Briane | Loss of ellipticity through homogenization in linear elasticity[END_REF].

Buckling is by nature a very one-dimensional phenomenon. It is mechanically unlikely that any material could lose strong ellipticity in every rank-one direction. This simple-minded observation suggests that assuming the isotropy of L * may prevent loss of strong ellipticity by homogenization. The aim of the present contribution is precisely to mathematically corroborate the mechanical intuition.

Let us quickly describe our main result. The fact that L * is isotropic allows one to focus on the Lamé coefficients of L * . If they held true, the Hashin-Shtrikman (HS) bounds would prevent loss of strong ellipticity a priori. Whereas the HS bound on the bulk modulus does hold true, we do not know whether even the elementary harmonic lower bound for the Poisson's ratio similarly holds true. The standard proof for very strongly elliptic materials proceeds by duality and cannot be used in our setting of strongly elliptic materials since the energy density is not necessarily pointwise non-negative. Instead, we argue through a comparison argument which does not use duality.

The result

Let λ 1 , µ 1 and λ 2 , µ 2 be the Lamé coefficients of isotropic stiffness tensors L 1 and L 2 . In other words, (L i ) pqrs = λ i δ pq δ rs + µ i (δ pr δ qs + δ ps δ qr ), i, p, q, r, s ∈ {1, 2}.

We assume that

(2.1) 0 < µ 1 = -(λ 2 + µ 2 ) =∶ -K 2 < µ 2 , K 1 ∶= λ 1 + µ 1 > 0.
In particular λ i + 2µ i ≥ 0, i = 1, 2, so that both phases are strictly strongly elliptic but phase 2 is not very strongly elliptic because K 2 < 0.

We then define

L(x) = χ(x)L 1 + (1 -χ(x))L 2
, where χ is the characteristic function the inclusion (phase 1), an open subset of the torus T with Lipschitz boundary; assume further that

(2.2) {χ = 0} ∶= {x ∈ T; χ(x) = 0} is connected in T.
The following result is a generalization of [1, Theorem 2.9, Case 2] because, in contrast with that result, it does not impose any restriction on the geometry of each phase besides representing the worst inclusion/matrix type microstructure, that is that for which the matrix (here phase 2) does not satisfy very strong ellipticity.

Theorem 2.1. Under assumptions (2.1), (2.2), Λ ≥ 0 and Λ per > 0.

As shown in [START_REF] Briane | Loss of ellipticity through homogenization in linear elasticity[END_REF]Proposition 3.4] the laminate configuration (in the periodic setting) results in a loss of ellipticity for L * . The theorem below shows that the isotropy of L * rules out any loss of ellipticity.

Theorem 2.2. Under assumptions (2.1), (2.2) assume further that L * is isotropic with bulk modulus K * and shear modulus µ * . Then K * + µ * > 0, that is, L * is strictly strongly elliptic.

We expect that Theorem 2.2 also holds in the stationary ergodic setting (for which statistical isotropy is a mild requirement that yields isotropy of L * ). The proof we display below fails however to cover this setting due to the use of Korn's theorem on the (compact!) torus. Step 1. Λ ≥ 0. We decompose L as L -L + L where L is the isotropic stiffness tensor with Lamé constants λ, µ defined as follows: µ ∶= µ 1 and λ ∶= inf x {λ(x) + µ(x)}µ 1 = -2µ 1 . On the one hand, so defined, L is clearly strongly elliptic since µ = µ 1 > 0 and λ + 2µ = 0.

On the other hand, µµ ≥ 0, (λ + µ) -(λ + µ) ≥ 0, so that (3.1) L -L is pointwise non-negative as a quadratic form.

This yields L ≥ L pointwise, which implies that Λ ≥ 0 since L is strongly elliptic, so the corresponding Λ is non-negative.

Step 2. Λ per > 0. We argue by contradiction and assume that Λ per = 0. Consider ∇v n a minimizing sequence of periodic fields with ∫ T ∇v n 2 dx = 1 such that

(3.2) lim n→∞ T ∇v n ⋅ L∇v n dx = 0.
We now prove that (i) ∇v n ⇀ 0 weakly in L 2 (T; R 2×2 ), then that (ii) ∇v n is strongly convergent in L 2 (T; R 2×2 ). The combination of (i) and (ii) then yields lim n→∞ ∫ T ∇v n 2 dx = 0, whence the contradiction.

The proof of (i) exploits the structure of the problem. In the spirit of the proof of [1, Theorem 2.9] we add a null Lagrangian 4µ 1 det ∇v n (which satisfies ∫ T det ∇v n dx ≡ 0) to the energy, so that the assumption turns into

(3.3) lim n→∞ T {∇v n ⋅ L∇v n + 4µ 1 det ∇v n } dx = 0.
On the one hand, since ∫ T ∇v n 2 dx = 1, we may assume that (along a subsequence) there exists a periodic field ∇v in L 2 (T; R 2×2 ) such that ∇v n ⇀ ∇v weakly in L 2 (T; R 2×2 ). Since Λ ≥ 0, the map ∇u ↦ ∫ T ∇u ⋅ L∇u dx is weakly lower-semicontinuous, which implies that

T ∇v ⋅ L∇v dx = 0.
As in Step 2 of the proof of [1, Theorem 2.9], we have, pointwise for all u = (u

1 , u 2 ) ∈ H 1 (T, R 2 ), ∇u ⋅ L∇u + 4µ 1 det ∇u = P ( ∂u 1 ∂y 1 , ∂u 2 ∂y 2 ) + R( ∂u 1 ∂y 2 , ∂u 2 ∂y 1 ),
where P and R are quadratic forms that satisfy, for some α > 0,

P (a, b) ≥ α(a + b) 2 χ + α(a -b) 2 (1 -χ), (3.4) R(a, b) ≥ α(a -b) 2 χ + α(a 2 + b 2 )(1 -χ). (3.5)
In particular, since these quadratic forms are non-negative, they vanish almost everywhere at ∇v. On the set {χ = 1}, this yields

∂v 1 ∂y 1 + ∂v 2 ∂y 2 = 0, (3.6) ∂v 1 ∂y 2 - ∂v 2 ∂y 1 = 0, (3.7)
while, on the set {χ = 0},

∂v 1 ∂y 1 = ∂v 2 ∂y 2 , (3.8) ∂v 1 ∂y 2 = ∂v 2 ∂y 1 = 0. (3.9)
From (3.7) and (3.9), we deduce that there exists a potential ψ ∈ H 2 (T, R) such that v = (v 1 , v 2 ) = ∇ψ. We start with proving additional properties on ψ in the matrix, that is on the set {χ = 0}. By assumption, this set is connected, so that from (3.9) we deduce that ψ(y) = ψ 1 (y 1 ) + ψ 2 (y 2 ) for some ψ 1 , ψ 2 ∈ H 2 (T; R) on that set. From (3.8) we then learn that ψ 1 (y 1 ) = ay 2 1 + by 1 + c and that ψ 2 (y 2 ) = ay 2 2 + dy 2 + e for some a, b, c, d, e ∈ R. We continue with the properties of ψ in the inclusion, that is on the set where {χ = 1}. On the one hand, taking the derivative of (3.6) w. r. t. y 1 and of (3.7) w. r. t. y 2 , and using the Schwarz' commutation rule, we obtain that -∆v 1 = 0. On the other hand, the formula for ψ on the set where {χ = 0} completes this equation with the boundary data v 1 (y) = 2ay 1 + b. By uniqueness of the solution of this boundary-value problem, we then conclude that v 1 (y) = 2ay 1 + b on T. Likewise, v 2 (y) = 2ay 2 + d. In turn the condition ∫ T ∇v dx = 0 due to periodicity implies that ∇v ≡ 0 as claimed.

We turn now to the proof of (ii) and shall argue that if (3.2) holds, then (1χ)∇v n converges strongly in L 2 (T; R 2×2 ) to zero. Integrating (3.5) over the unit torus T yields in view of (3. It remains to prove that ∂v 1 n ∂y 1 and ∂v 2 n ∂y 2 converge strongly to zero in L 2 ({χ = 0}; R 2×2 ) as well. By symmetry it is enough to treat the first term ∂v 1 n ∂y 1 . To this aim we follow the beginning of the argument of Step 2 in the proof of [START_REF] Briane | Loss of ellipticity through homogenization in linear elasticity[END_REF]Theorem 2.9]. We get

∂v 1 n ∂y 1 - ∂v 2 n ∂y 2 → 0, in L 2 ({χ = 0}; R 2×2 ).
Consequently, with (3.10),

∂ ∂y 2 ∂v 1 n ∂y 1 = ∂ ∂y 1 ∂v 1 n ∂y 2 → 0 in H -1 ({χ = 0}), ∂ ∂y 1 ∂v 1 n ∂y 1 = ∂ ∂y 1 ∂v 2 n ∂y 2 + r n ( with r n → 0 in H -1 ({χ = 0})) = ∂ ∂y 2 ∂v 2 n ∂y 1 + r n → 0 in H -1 ({χ = 0}).
As in the proof of [1, Theorem 2.9], application of Korn's theorem [START_REF] Nečas | Sur les normes équivalentes dans W k (Ω) et sur la coercivité des formes formellement positives[END_REF] then yields

∂v 1 n ∂y 1 → 0, strongly in L 2 ({χ = 0}; R 2 ).
Likewise ∂v 2 n ∂y 2 converges strongly to zero in L 2 ({χ = 0}; R 2 ), and, in view of (3.10), ∇v n converges strongly to zero in L 2 ({χ = 0}; R 2 ), or, equivalently, (3.11)

T (1 -χ) ∇v n 2 dx → 0.
We are now in a position to conclude. Since det ∇v n is quadratic in ∇v n , (3.11) yields (1χ) det ∇v n → 0 in L 1 (T) while ∫ T det ∇v n dx = 0, so that (3.12)

T χ det ∇v n dx → 0. From (3.4), (3.5), T χ ⎛ ⎝ ∂v 1 n ∂y 1 + ∂v 2 n ∂y 2 2 + ∂v 1 n ∂y 2 - ∂v 2 n ∂y 1 2⎫ ⎪ ⎪ ⎬ ⎪ ⎪ ⎭ dx → 0.
Thus, with (3.12),

T χ ∇v n 2 dx = T χ ⎛ ⎝ ∂v 1 n ∂y 1 + ∂v 2 n ∂y 2 2 + ∂v 1 n ∂y 2 - ∂v 2 n ∂y 1 2⎫ ⎪ ⎪ ⎬ ⎪ ⎪ ⎭ dx -2 T χ det ∇v n dx → 0.
Combined with (3.11), this yields the desired contradiction since ∫ T ∇v n 2 dx = 1.

3.2. Proof of Theorem 2.2. We split the proof into two steps and prove (K * , µ * ) ≥ (-µ 1 , µ 1 ) and (K * , µ * ) ≠ (-µ 1 , µ 1 ) separately.

Step 1. Since Λ ≥ 0 and Λ per > 0, (1.2) defines the homogenized elasticity tensor, so that for all M ∈ M 2×2 there exists

v M ∈ H 1 (T; R 2 ) such that M ⋅ L * M = T (M + ∇v M ) ⋅ L(M + ∇v M ) dx.
Consider L as in Subsection 3.1. Since L is constant and strongly elliptic while ∫ T ∇v M dx = 0, Appealing to (3.1), we conclude that M ⋅ (L * -L)M ≥ 0. The isotropy assumption on L * then permits to conclude that (K * , µ * ) ≥ (-µ 1 , µ 1 ).

T (M + ∇v M ) ⋅ L(M + ∇v M ) dx = M ⋅ LM + T ∇v M ⋅ L∇v M dx ≥ 0 ≥ M ⋅ LM.
Step 2. We argue by contradiction and assume that (K * , µ * ) = (-µ 1 , µ 1 ), so that L * = L. In this case all rank-one matrices a ⊗ a are such that

  and a.e. x ∈ T, the story is different.Date: November 17, 2016.

3 . Proofs 3 . 1 .

 331 Proof of Theorem 2.1.

  strongly in L 2 ({χ = 0}; R 2×2 ).

M

  ⋅ (L * -L)M ≥ T (M + ∇v M ) ⋅ (L -L)(M + ∇v M ) dx.

( 3 .

 3 13) a ⊗ a ⋅ L * a ⊗ a = 0. a + ∇v a⊗a ) ⋅ L(a ⊗ a + ∇v a⊗a ) dx.Adding the null-Lagrangian 4µ 1 det(a ⊗ a + ∇φ a⊗a ) dx and proceeding as in Step 2 of the proof of Theorem 2.1, we conclude that φ a⊗a ≡ cst. Hence the homogenization formula takes the forma ⊗ a ⋅ L * a ⊗ a = a ⊗ a ⋅ T L(x) dx a ⊗ a > 0since the volume fraction of phase 1 is not 0. This contradicts (3.13) and concludes the proof.

Acknowledgements

AG acknowledges financial support from the European Research Council under the European Community's Seventh Framework Programme (FP7/2014-2019 Grant Agreement QUANTHOM 335410).

(G. A. Francfort) L.A.G.A. (UMR CNRS 7539), Université Paris-Nord, Villetaneuse, France E-mail address: gilles.francfort@univ-paris13.fr (A. Gloria) Université Libre de Bruxelles (ULB), Brussels, Belgium and Inria, Lille, France E-mail address: agloria@ulb.ac.be