A S M Tripathi
email: atul.tripathi@univ-littoral.fr

K Kondratenko

B Duponchel

N Hurduc

I Carlescu

Y Boussoualem

A Daoudi

Orientation in large-area semiconducting 2-amino-anthracene thin films fabricated by dynamic floating film transfer method

Keywords: Organic semiconductor, Molecular orientation, Floating film transfer method, Polarized absorption, Liquid crystal

In organic electronics, fabrication of stable, soluble, and uniform thin films of large surface area is highly important for a wide range of organic device applications.

However, these objectives are difficult to achieve when using organic liquid crystalline molecules. This work focuses on a molecular organic material synthesized in our lab which was used to fabricate large-area thin films by applying the recently developed ribbon-shaped floating film transfer method (FTM). After establishing the most optimal casting parameters, organic molecule thin films of large surface area (up to 15 cm in length and 2 cm in width) were obtained. Subsequent polarized optical microscopy and atomic force microscopy investigations confirmed that film morphology and texture was uniform. Further, UV spectroscopy measurements using a polarizer were performed to study the π-π conjugation, indicating that the films exhibited optical anisotropy, as a Dichroic Ratio (DR) of 3.8 was obtained, with a 10 nm redshift in parallel FTM relative to the spin-coating method.

Introduction

Due to the widespread application of organic field-effect transistors (OFETs) in integrated circuits, active matrix and flexible displays, as well as sensors, organic semiconductors are gradually replacing conventional inorganic semiconductor materials [1,[START_REF] Forrest | The path to ubiquitous and low-cost organic electronic appliances on plastic[END_REF]. OFETs exhibit many advantages over conventional Si-based thin-film transistors, including facile modification at the molecular level, low fabrication cost, ease of fabrication, and flexibility [START_REF] Tseng | High-mobility field-effect transistors fabricated with macroscopic aligned semiconducting polymers[END_REF][START_REF] Yan | A high-mobility electron-transporting polymer for printed transistors[END_REF]. Consequently, ample body of research has been dedicated to improving the charge carrier mobility and stability of organic materials, as well as optimizing specific device performance characteristics [START_REF] Yuan | Ultra-high mobility transparent organic thin film transistors grown by an off-centre spin-coating method[END_REF][START_REF] Qiu | H2O effect on the stability of organic thin-film field-effect transistors[END_REF].

Currently, many types of organic semiconducting molecules are incorporated into the active semiconductor layer in the OFET channel by a simple solution processing method with many advantages over polymers [7][START_REF] Liu | Controlled deposition of crystalline organic semiconductors for field-effect-transistor applications[END_REF][START_REF] Sheraw | Functionalized pentacene active layer organic thin-film transistors[END_REF], as a well-defined structure of high purity can be attained by the sublimation method. In particular, pentacene has been shown to exhibit excellent mobility (> 1cm 2 /Vs), as well as good solubility in some common solvents [START_REF] Anthony | A road map to stable, soluble, easily crystallized pentacene derivatives[END_REF][START_REF] Dickey | Improving organic thin-film transistor performance through solvent-vapor annealing of solution-processable triethylsilylethynyl anthradithiophene[END_REF]. Similarly, anthradithiophene, tetracene, and dithiotetrathiafulvalene have been reported to possess superior transistor characteristics [START_REF] Payne | Robust, soluble pentacene ethers[END_REF][START_REF] Mas-Torrent | High Mobility of Dithiophene-Tetrathiafulvalene Single-Crystal Organic Field Effect Transistors[END_REF]. According to the available findings, oxidative stability of anthracene-based semiconductors is higher than that of those based on pentacene [START_REF] Meng | High-performance, stable organic thin-film field-effect transistors based on bis-5′-alkylthiophen-2′-yl-2,6-anthracene semiconductors[END_REF]. Specifically, Ito and colleagues established that, in linear acenes, increasing the number of benzene molecules decreases oxidative stability due to the increase in the highest occupied molecular orbital energy level [START_REF] Ito | Oligo(2,6anthrylene)s: Acene-Oligomer Approach for Organic Field-Effect Transistors[END_REF]. Moreover, Park et al. demonstrated that triisopropylsilylethynyl anthracene derivative exhibited high solubility and moderate performance when incorporated into OFETs by solution processing method [START_REF] Park | Soluble and easily crystallized anthracene derivatives: precursors of solution-processable semiconducting molecules[END_REF]. As strong π-π overlap is important for enhancing the transfer integral and charge hopping (and thus charge transport), these aspects in anthracenebased liquid crystalline molecules possessing semiconducting properties were investigated by Mery et al. [START_REF] Méry | Liquid crystals containing a 2,6-disubstituted anthracene core -Mesomorphism, charge transport and photochemical properties[END_REF] focusing on 2, 6 substituted derivatives, and Chen et al. who explored 2-substituted derivatives based on anthracene [START_REF] Chen | Thermal and Optical Modulation of the Carrier Mobility in OTFTs Based on an Azo-anthracene Liquid Crystal Organic Semiconductor[END_REF]. Recently, our group design an (E)-N-(anthracen-2-yl)-1-(4-(decyloxy)-phenyl) methanimine (10-OPIA) molecule exhibiting mesogenic properties [START_REF] Kondratenko | Novel organic semiconductor based on 2-amino-anthracene : synthesis , charge transporting and photo-conductive properties[END_REF], as shown in Figure 1. These molecules can be easily prepared from available substances and possess excellent solubility in various organic solvents. As indicated in our original work, 10-OPIA exhibits interesting photoconductive properties [START_REF] Kondratenko | Novel organic semiconductor based on 2-amino-anthracene : synthesis , charge transporting and photo-conductive properties[END_REF], making it a good candidate for a wide range of photosensitive devices. As a part of our investigation, these materials were utilized to fabricate thin solid films which were successfully transferred to appropriate substrates.

As controlling the thin film morphology is also important for high-performance organic device applications, several methods can be used to fabricate thin films by solutionprocessed methods, such as mechanical rubbing [START_REF] Brinkmann | Orienting semiconducting pi-conjugated polymers[END_REF], friction transfer method [START_REF] Nagamatsu | Backbone arrangement in "friction-transferred" regioregular poly(3alkylthiophene)s[END_REF], solution sharing [START_REF] Higashi | Anisotropic properties of aligned π-conjugated polymer films fabricated by capillary action and their post-annealing effects[END_REF], capillary action [START_REF] Giri | Effect of solution shearing method on packing and disorder of organic semiconductor polymers[END_REF], doctor blading [START_REF] Pierre | Allprinted flexible organic transistors enabled by surface tension-guided blade coating[END_REF], and dip coating [START_REF] Wang | Microstructure evolution and device performance in solution-processed polymeric field-effect transistors: The key role of the first monolayer[END_REF]. However, all these approaches suffer from some notable drawbacks, including high material wastage, high cost, need for advanced instruments, insufficient film uniformity, and potential damage to the material structure during the multilayer casting process. Most importantly, the shear force used in these methods typically results in face-on orientation, which is unsuitable for planar devices like OFETs. In contrast, thin film deposition by slow solvent evaporation thermodynamically favors edge-on orientation making it suitable for planar devices [START_REF] Chang | Enhanced Mobility of poly(3-hexylthiophene) transistors by spincoating from high-boiling-point solvents[END_REF][START_REF] Yang | Solubility-driven thin film structures of regioregular poly(3-hexyl thiophene) using volatile solvents[END_REF]. These benefits are achieved by the recently developed dynamic floating film transfer method (FTM) [START_REF] Morita | Enhancement of transport characteristics in poly(3-hexylthiophene) films deposited with floating film transfer method[END_REF][START_REF] Dauendorffer | Optical and transport anisotropy in poly(9,9???-dioctyl-fluorene-alt-bithiophene) films prepared by floating film transfer method[END_REF], which necessitated designing a custom-made assisting slider, allowing the film to spread in a single direction [START_REF] Tripathi | Casting Control of Floating-films into Ribbon-shape Structure by modified Dynamic FTM[END_REF]. The slider not only overcomes the drawbacks of the conventional FTM, but it also assists in the formation of large-area rectangular thin films, due to which this process is denoted as ribbon-shaped FTM [START_REF] Tripathi | Anisotropic charge transport in highly oriented films of semiconducting polymer prepared by ribbon-shaped floating film[END_REF]. Thus far, this method has been applied to several conjugated polymers of different structures [START_REF] Tripathi | Facile fabrication of large area oriented conjugated polymer films by ribbon-shaped FTM and its implication on anisotropic charge transport[END_REF][START_REF] Tripathi | Implication of Molecular Weight on Optical and Charge Transport Anisotropy in PQT-C12 Films Fabricated by Dynamic FTM[END_REF][START_REF] Tripathi | Molecular orientation and anisotropic charge transport in the large area thin films of regioregular Poly(3-alkylthiophenes) fabricated by ribbon-shaped FTM[END_REF] with the goal of employing them in photovoltaic applications, light-emitting devices, or in high charge transport. The newly developed FTM can easily be applied to these polymers to obtain oriented thin films of at least 20 cm length and 2 cm width.

As the casting conditions depend on the nature of the polymer, the resulting FTMbased films are more suitable for planar devices like OFET, as the edge-on orientation promotes charge transfer from the source to the drain electrode. Moreover, Pandey and colleagues have shown that this method is suitable for oriented composite films comprising of 2D materials dispersed within the polymer matrix, which enhances the charge carrier mobility [START_REF] Pandey | Optoelectrical anisotropy in graphene oxide supported polythiophene thin films fabricated by floating film transfer[END_REF]. Recently, FTM was shown to lead to better device performance compared to other deposition techniques when used in sensing applications [START_REF] Sahu | Air-stable vapor phase sensing of ammonia in sub-threshold regime of poly(2,5-bis(3-tetradecylthiophen-2yl)thieno(3,2-b)thiophene) based polymer thin-film transistor[END_REF][START_REF] Bhargava | High-sensitivity organic phototransistors prepared by floating film transfer method[END_REF]. Despite these advances, further research into the FTM application to organic molecules is needed to further improve the thin film morphology for OFET applications.

In the present study, we focused on controlling the thin film morphology of an organic material (10-OPIA) obtained by applying the recently developed ribbon-shaped dynamic FTM process combined with the spin-coating method. Our findings revealed that a uniform 10-OPIA thin film can be successfully obtained on a liquid substrate even in large-scale production with minimal material wastage and resource utilization, as uniform transfer on the substrate can be achieved by stamping. Thus, 10-OPIA as well as other molecular liquid crystalline organic materials fabricated by ribbon-shaped FTM can be used in semiconductor manufacturing.

Experimental Methods:

In the present study, the 10-OPIA semiconducting properties were investigated, as organic molecules having photoreactive properties are highly beneficial in a wide range of applications. As previously demonstrated by Kondratenko et al., in these molecules, the phenyl moiety is derived from to the anthracene by imine linkage, and is further enhanced by simple nucleophilic addition between 2-aminoanthracene and para-benzaldehyde derivatives [START_REF] Kondratenko | Novel organic semiconductor based on 2-amino-anthracene : synthesis , charge transporting and photo-conductive properties[END_REF]. The alkyl spacer can be precisely controlled by adopting an appropriate alkyl halide precursor. Figure 1 shows the chemical structure of 10-OPIA. For thin film fabrication, an organic molecule solution was prepared in dehydrated chloroform (purchased from Sigma Aldrich) followed by stirring on a hotplate for 60 minutes at 50 o C. Next, 15 µl of the molecule solution was poured in the center of the assisting slider placed at one edge of a rectangular tray and partially filled with liquid substrate. As a result of stirring, the molecule solution spreads in a single direction and forms a solid floating film on the liquid substrate. For the most optimal casting results, the conditions were optimized by adopting a suitable binary mixture of viscous liquid substrates, in this case ethylene glycol (EG) and glycerol (GL), adjusting the casting temperature (of both molecule solution and the viscous liquid substrate) to 30-60 o C, and varying the concentration of molecules in the chloroform solvent in the 0.5-4% w/w range. In the present study, the optimized casting conditions involved mixing EG and GL at a 3:1 ratio to form a viscous liquid substrate, applying 3% w/w molecule concentration, and setting the casting temperature to 40 o C. The resulting FTMprepared oriented films were transferred on a pre-cleaned glass substrate by stamping.

For comparison, films were also prepared by spin coating, for which 1% w/w molecule solution was prepared in chloroform solvent and was spun for 60 s at 1000 rpm, after which isotropic films were deposited by spinning the solution at 1000 rpm.

Results and Discussion:

Thermophysical and mesogenic properties

The phase behavior of 10-OPIA molecules was investigated via calorimetric analysis conducted using DSC. The results obtained during both heating and cooling cycles are shown in Figure 2. As can be seen from the DSC thermograms, 10-OPIA exhibits mesomorphic properties since it displays at least four phase transitions, which are reversible, as they are observed in the heating as well as cooling cycle.

To gain further insight into these phase transitions, we commenced with heating, which led to the first transition and the emergence of two splitting peaks at 139 o C resulting from melting from the crystalline phase to a first smetic mesophase, denoted as Sm1. Further, at 145 o C, a second phase transition occurs with relatively small enthalpy changes that show a slight reduction in order and suggest a second smetic mesophase, labeled Sm2. The next phase transition occurred at 152 o C with two similar peaks, but more significant enthalpy changes. The high energy changes observed at this transition indicate a consequential order loss from Sm2 to a nematic (N) phase. At the last stage of heating, at 160 o C, complete melting occurs from the N phase to a completely disordered isotropic liquid phase (Iso).

Large-area thin film preparation via ribbon-shaped FTM

As thin film deposition technique is essential for high charge carrier transport, Kondratenko et al. [START_REF] Kondratenko | Novel organic semiconductor based on 2-amino-anthracene : synthesis , charge transporting and photo-conductive properties[END_REF] adopted the drop-casting method for this purpose and demonstrated that the resulting 10-OPIA thin films can be employed in OFET and phototransistor devices. However, the film thickness was excessive (up to 220 nm) and non-uniform, and is thus unsuitable for high-performance applications. To overcome these issues, the recently developed ribbon-shaped FTM was utilized in this work [START_REF] Tripathi | Casting Control of Floating-films into Ribbon-shape Structure by modified Dynamic FTM[END_REF].

The film orientation, thickness, and dimensions were carefully controlled by modifying the casting parameters, including the solution concentration of organic material, casting temperature (both liquid substrate and solution), liquid substrate viscosity, etc. [START_REF] Tripathi | Casting Control of Floating-films into Ribbon-shape Structure by modified Dynamic FTM[END_REF][START_REF] Pandey | Controlling Factors for Orientation of Conjugated Polymer Films in Dynamic Floating-Film Transfer Method[END_REF]. The FTM was applied to several semiconducting polymers by using the conventional and newly developed ribbon-shaped method for comparison [START_REF] Tripathi | Facile fabrication of large area oriented conjugated polymer films by ribbon-shaped FTM and its implication on anisotropic charge transport[END_REF][START_REF] Pandey | Influence of backbone structure on orientation of conjugated polymers in the dynamic casting of thin floating-films[END_REF].

Among the various semiconducting polymers, poly(didodecyl-quaterthiophene) showed the highest dichroic ratio (DR) >20. On the other hand, poly[2,5-bis(3tetradecylthiophen-2-yl)thieno [3,2-b]thiophene] exhibited the highest charge transport anisotropy (having mobility > 1 cm 2 /Vs) [START_REF] Tripathi | Anisotropic charge transport in highly oriented films of semiconducting polymer prepared by ribbon-shaped floating film[END_REF][START_REF] Pandey | Rapid Formation and Macroscopic Self-Assembly of Liquid-Crystalline, High-Mobility, Semiconducting Thienothiophene[END_REF], confirming that this method is superior to other commonly applied strategies. To further test its utility, several conducting polymers and hybrid materials were fabricated via this method while controlling the casting parameters, as the optimal conditions are highly dependent on the material structure and characteristics [START_REF] Sahu | Air-stable vapor phase sensing of ammonia in sub-threshold regime of poly(2,5-bis(3-tetradecylthiophen-2yl)thieno(3,2-b)thiophene) based polymer thin-film transistor[END_REF]. However, this method has never been applied on highly conductive organic molecules due to their high solubility and film fragility stemming from the highly crystalline nature of the material. Consequently, in this study, liquid crystalline molecules (10-OPIA) were employed for large-area thin film fabrication on a liquid substrate by ribbon-shaped FTM, while adopting casting conditions different from those needed to obtain conjugated polymers (CPs). As has been previously shown, thin films can easily form on various CPs. In this work, we utilized 1% w/w polymer concentration on EG:GL (at a 3:1 ratio) liquid substrate and a casting temperature in the 40-60 o C range, and achieved an oriented film of 20 cm length and 2 cm width. Further optical as well as electrical characterizations confirmed that the obtained film exhibited optical and electrical anisotropy [START_REF] Tripathi | Facile fabrication of large area oriented conjugated polymer films by ribbon-shaped FTM and its implication on anisotropic charge transport[END_REF]. On the other hand, under similar casting conditions, no film formation is observed when using organic molecules, as after being dropped into the assisting slider, the molecule solution is broken into small parts and is unevenly spread across the entire surface area due to the crystalline nature of the molecules. As these issues are not resolved by increasing the concentration from 1% to 2% w/w, these findings confirm that, to ensure that ribbon-shaped thin films are obtained, it is necessary to achieve an appropriate balance between the viscous force and solution spreading, as well as adopt the optimal casting temperature and molecule solution concentration. Figure 4(a) and Figure 4(b) show a simple schematic of the ribbon-shaped film fabrication method and real casting of 10-OPIA film, respectively. Further details of this method are provided in our previous manuscripts based on CPs [START_REF] Tripathi | Casting Control of Floating-films into Ribbon-shape Structure by modified Dynamic FTM[END_REF][START_REF] Tripathi | Anisotropic charge transport in highly oriented films of semiconducting polymer prepared by ribbon-shaped floating film[END_REF]. It is worth noting that this method is very similar to the Langmuir-Blodgett method, but it does not require application of an external force and an expensive setup. The FTM film employed in this study was obtained via a natural self-assembly process, whereby the films were oriented perpendicular to the solution spreading direction. During the spreading, solid films are formed on the liquid substrate due to the volatile nature of the solvent. Therefore, solid film orientation was caused by solvent evaporation and the opposite viscous force provided by the liquid substrate (such orientation is easily observed using a polarizer sheet). As indicated in Figure 4(a), films of much greater dimensions (up to 15 cm × 2 cm) can be obtained using this method, similar to a conjugated polymer. To verify their composition by optoelectronic characterization, the oriented solid films were transferred on the desired substrate by stamping. Figure 4(b) shows an optical micrograph of a solid film transferred on soda-lime glass, confirming that it uniformly covers the entire glass surface.

Phase transition in thin films obtained via ribbon-shaped FTM

To elucidate the processes facilitating the phase transition in FTM-prepared thin films, POM observations of the textural changes upon heating associated with phase transitions were performed. The results were compared to those obtained for bulk samples, with the texture of the FTM-coated 10-OPIA thin film shown in Figure 5 as an example. As can be seen from the image, the Sm1 and Sm2 texture is very similar to the crystalline phase. Moreover, the phase transition temperatures derived from the observed textural changes align with those yielded by DSC. In particular, the texture detected at around 158 o C exhibits the characteristics of the nematic phase and to be homogeneous. Texture changes were also observed in the cooling cycle, as shown in Figure 6. The observed texture is much more crystalline than that obtained using the capillary method commonly applied to bulk cells. These large crystalline domains are highly desirable for OFET application because they cross the channel from the source to the drain electrode.

Optical characterization of 10-OPIA samples

As described above, application of the ribbon-shaped FTM leads to large-area uniform thin films of appropriate molecular orientation. To quantitatively analyze the molecular orientation of 10-OPIA samples obtained in this work, films were transferred onto a soda-lime glass substrate by stamping and were subjected to polarized electronic absorption spectral investigations.

For this purpose, their absorbance was measured using the polarizer angle of 00° and 90°, i.e., parallel and perpendicular to the molecular orientation direction. Figure 7(a) shows the normalized polarized and non-polarized electronic absorption spectra of 10-OPIA molecules, revealing obvious differences in the absorption spectra produced by FTM parallel and perpendicular as well as spin-coated thin films. The film absorption was recorded in the 350 to 475 nm range, while λ = 360-470 nm was adopted for parallel and perpendicular measurements, and λ = 375-450 nm for spincoated samples. In this absorption range, the maximum absorbance peak was observed at 418 nm, 409 nm, and 408 nm for parallel, perpendicular, and spin-coated samples, respectively. Although these values are comparable, a 10-nm shift between the peaks of spin-coated and parallel-orientation films is noteworthy.

Polarized electronic absorption spectra of 10-OPIA samples obtained by ribbon-shaped FTM are shown in Figure 7(b). It is evident that, when the incident beam angle relative to the film surface changes from 00 o to 90 o , optical absorption anisotropy occurs due to the molecular orientation having a DR of 3.8. To quantify the optical anisotropy of the polarized absorption spectrum of the corresponding 10-OPIA sample obtained by ribbon-shaped FTM, DR was calculated as DR = A∥/A⊥, i.e., as the ratio of maximum absorbance parallel A∥ at λmax∥ to absorbance in perpendicular, A⊥ at λmax∥. The findings for thin films prepared by the FTM and spin-coating method are reported in Table 1, confirming increased π-orbital delocalization on the molecules [START_REF] Sahu | Air-stable vapor phase sensing of ammonia in sub-threshold regime of poly(2,5-bis(3-tetradecylthiophen-2yl)thieno(3,2-b)thiophene) based polymer thin-film transistor[END_REF]. These results indicate that the films fabricated by this advanced method also have enhanced π-stacking and are thus suitable for use in optoelectronic devices. It is also worth noting that, in FTM-processed films, orientation intensity is small and that λmax is redshifted in 10-OPIA. As reported in our previous work, thin films cast via this process exhibit superior charge transport performance compared to the spin-coated films, even at weak DR [START_REF] Pandey | Enhancement of carrier mobility along with anisotropic transport in non-regiocontrolled poly (3-hexylthiophene) films processed by floating film transfer method[END_REF].

Moreover, the orientation size up to several centimeter-scale can be achieved with only 15-20 μl of solution. Figure 7(c) shows the DR of five samples, ranging from 2.1 to 3.8, with an average of 3.1.

Table 1 : Optical parameters of 10-OPIA thin-film molecules prepared by FTM and those obtained by spin coating derived from their corresponding solid-state electronic absorption spectra. concentration in chlorobenzene solvent [START_REF] Kondratenko | Novel organic semiconductor based on 2-amino-anthracene : synthesis , charge transporting and photo-conductive properties[END_REF]. As OFET performance depends on several factors, including processing conditions, semiconductor insulator/metal interface, and the active semiconductor layer thickness [START_REF] Fan | The effect of thickness on the optoelectronic properties of organic field-effect transistors: Towards molecular crystals at monolayer limit[END_REF][START_REF] Gupta | Understanding the effect of semiconductor thickness on device characteristics in organic thin film transistors by way of two-dimensional simulations[END_REF] and pentacene material thickness affects the molecular crystal packing and grain size [START_REF] Kakudate | Polymorphism in pentacene thin films on Si O2 substrate[END_REF][START_REF] Bouchoms | Morphology identification of the thin film phases of vacuum evaporated pentacene on SIO2 substrates[END_REF], the findings reported in this work indicate that the FTM can be used for OFET applications. It is also worth noting that grain boundaries are caused by variations in morphology caused by greater film thickness, which is undesirable, as charge carriers are trapped, compromising the device performance [START_REF] Verlaak | Microscopic description of elementary growth processes and classification of structural defects in pentacene thin films[END_REF][START_REF] Horowitz | Grain size dependent mobility in polycrystalline organic field-effect transistors[END_REF]. According to the available evidence, OFET mobility decreases when the active layer thickness exceeds 100 nm. These issues can be overcome by FTM [START_REF] Tripathi | Anisotropic charge transport in highly oriented films of semiconducting polymer prepared by ribbon-shaped floating film[END_REF][START_REF] Tripathi | Facile fabrication of large area oriented conjugated polymer films by ribbon-shaped FTM and its implication on anisotropic charge transport[END_REF], as film uniformity and thickness can be precisely controlled, making it suitable for large-scale fabrication of organic electronics devices.

Film Fabrication Conditions

Conclusion:

In this work, an organic semiconducting molecular material with a film morphology controlled by a recently developed ribbon-shaped FTM was synthesized to obtain floating solid films of a large surface area (up to 15 cm × 2 cm). The findings yielded by polarized optical microscopy confirmed their optical homogeneity, as indicated by the DR of 3.8. Moreover, the absorbance spectrum produced by the parallel film exhibited 10-nm redshift compared to the spin-coated sample, indicating better π-π conjugation.

Finally, when the film morphology was evaluated by AFM, a well-aligned structure of films prepared by FTM was confirmed, indicating that this method can be adopted for large-scale applications. Table 1 : Optical parameters of 10-OPIA thin-film molecules prepared by FTM and those obtained by spin coating derived from their corresponding solid-state electronic absorption spectra.

Figure and Table Captions

Figure 1 :

 1 Figure 1: Chemical structure of (E)-N-(anthracen-2-yl)-1-(4-(decyloxy)-phenyl) methanimine (10-OPIA)

For

  all calorimetric investigations conducted as a part of this work, TA Instruments Q1000 Differential Scanning Calorimeter (DSC) was utilized while varying the temperature from -180 o C to 725 o C. In addition, polarized optical microscopy (POM) was conducted using Olympus BX60F5 alongside Linkam LTS 350 hot stage (at temperatures in the -196-350 o C range), and Linkam TMS 93 controller was used for texture characterization and quantification of material changes. UV-Visible spectrophotometer Varian (Agilent) Cary 100 and Perkin Elmer Lambda 2 spectrometers equipped with Thomson polarizer were also employed for capturing the polarized absorption spectrum. Finally, all atomic force microscope (AFM) images presented here were obtained with the help of Veeco (Bruker) Multimode III in tapping mode.

Figure 2 :

 2 Figure 2: DSC thermograms of the heating and cooling 10-OPIA cycles at a rate of 10 o C/min.

Figure 3 :

 3 Figure 3: Texture of a 5 µm-thick 10-OPIA sample captured by POM through crossed analyzer-polarizer: (a) Crystalline (Cr) phase at 120 o C; (b, c) Sm1 and Sm2 mesophase at 140 o C and 148 o C, respectively; and (d) nematic mesophase at 159 o C.

Figure 4 :

 4 Figure 4: Thin film preparation process at optimized conditions involving EG:Gl (at a 3:1 ratio) liquid substrate, 3% w/w concentration, and 40 o C casting temperature. (a) Schematic representation and the actual film casting process comprising the ribbonshaped floating film transfer method. (b) Optical micrograph of a film transferred on a soda-lime glass substrate.

Figure 5 :

 5 Figure 5: Texture of a FTM-processed thin-film 10-OPIA sample obtained at optimized conditions (EG:Gl-3:1 liquid substrate, 3% w/w concentration, and 40 o C casting temperature) captured by POM using a crossed analyzer-polarizer during the heating cycle: (a) Crystalline phase at 120 o C; (b, c) Sm1 and Sm2 mesophase at 140 and 148 o C, respectively; and (d) nematic mesophase at 158 o C.

Figure 6 :

 6 Figure 6: Texture of a FTM-processed thin-film 10-OPIA sample prepared at optimized conditions (EG:Gl-3:1 liquid substrate, 3% w/w concentration, and 40 o C casting temperature) captured by POM using a crossed analyzer-polarizer during the cooling cycle at (a) 120 o C and (b) 145 o C.

Figure 7 :

 7 Figure 7: Optical characterization of a 10-OPIA thin film prepared at optimized conditions (EG:Gl-3:1 liquid substrate, 3% w/w concentration, and 40 o C casting temperature. (a) Normalized polarized and non-polarized electronic absorption spectra of FTM parallel, perpendicular, and spin-coated 10-OPIA thin films. (b) Polarized electronic absorption spectra of FTM-processed 10-OPIA thin films, and (c) DR values of five tested samples.

Figure 8 Figure 8 :

 88 Figure 8 provides AFM images of a spin-coated and an oriented 10-OPIA film prepared

Figure 1 :Figure 2 :

 12 Figure 1: Chemical structure of (E)-N-(anthracen-2-yl)-1-(4-(decyloxy)-phenyl) methanimine (10-OPIA)

Figure 3 :

 3 Figure 3: Texture of a 5 µm-thick 10-OPIA sample captured by POM through crossed analyzer-polarizer: (a) Crystalline (Cr) phase at 120 o C; (b, c) Sm1 and Sm2 mesophase at 140 o C and 148 o C, respectively; and (d) nematic mesophase at 159 o C.

Figure 4 :

 4 Figure 4: Thin film preparation process at optimized conditions involving EG:Gl (at a 3:1 ratio) liquid substrate, 3% w/w concentration, and 40 o C casting temperature. (a) Schematic representation and the actual film casting process comprising the ribbonshaped floating film transfer method. (b) Optical micrograph of a film transferred on a soda-lime glass substrate.

Figure 5 :

 5 Figure 5: Texture of a FTM-processed thin-film 10-OPIA sample obtained at optimized conditions (EG:Gl-3:1 liquid substrate, 3% w/w concentration, and 40 o C casting temperature) captured by POM using a crossed analyzer-polarizer during the heating cycle: (a) Crystalline phase at 120 o C; (b, c) Sm1 and Sm2 mesophase at 140 and 148 o C, respectively; and (d) nematic mesophase at 158 o C.

Figure 6 :

 6 Figure 6: Texture of a FTM-processed thin-film 10-OPIA sample prepared at optimized conditions (EG:Gl-3:1 liquid substrate, 3% w/w concentration, and 40 o C casting temperature) captured by POM using a crossed analyzer-polarizer during the cooling cycle at (a) 120 o C and (b) 145 o C.

Figure 7 :

 7 Figure 7: Optical characterization of a 10-OPIA thin film prepared at optimized conditions (EG:Gl-3:1 liquid substrate, 3% w/w concentration, and 40 o C casting temperature. (a) Normalized polarized and non-polarized electronic absorption spectra of FTM parallel, perpendicular, and spin-coated 10-OPIA thin films. (b) Polarized electronic absorption spectra of FTM-processed 10-OPIA thin films, and (c) DR values of five tested samples.

Figure 8 :

 8 Figure 8: AFM images of a 10-OPIA thin-film sample fabricated by FTM and spincoating method. (a) FTM at optimized conditions (EG:Gl-3:1 liquid substrate, 3% w/w concentration, and 40 o C casting temperature). (b) Spin coating at 1% w/w concentration with 1000 rpm for 60 s.

Acknowledgment

The authors thank ULCO, Region Hauts-de-France, for financial support for this project.

References:


Stéphanie Nguyen
email: stephanie.nguyen-quoc@aphp.fr

Claire Lacan

Damien Roos-Weil

Les CAR-NK allogéniques : une alternative prometteuse aux CAR-T autologues -État de la question, sources de cellules NK, limites et perspectives

Keywords: cellules Natural Killer NK, CAR-NK, immunothérapie, cancer, CAR allogéniques Natural Killer cells, CAR-NK, immunotherapy, cancer, allogeneic CAR Biologie

de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.

Les CAR-NK allogéniques : une alternative prometteuse aux CAR-T autologues -Etat de la question, sources de cellules NK, limites et perspectives

Allogeneic CAR-NK cells: a promising alternative to autologous CAR-T cells -State of the art, sources of NK cells, limits and perspectives

Stéphanie Nguyen 1,2 *, Claire Lacan 1,2 , Damien Roos-Weil 1,3 Affiliations :

1 . Sorbonne Université. Service d'Hématologie clinique ; Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière APHP.6, Pavillon Georges Heuyer. 47-83 Bd de l'Hôpital, 75651 PARIS CEDEX 13. La perte d'expression des molécules CMH de classe I à la surface des cellules tumorales ou infectées par un virus est un mécanisme d'échappement connu à l'immunosurveillance des lymphocytes T, mais rend les cibles plus sensibles à la lyse NK. Le mécanisme d'action des cellules NK est principalement la cytotoxicité : cytotoxicité « naturelle » par la libération de granules perforine/granzyme et expression de facteurs tels que FasL ou de ligand induisant l'apoptose liée au TNF (TRAIL), mais également cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps « ADCC » médiée par le récepteur Fc CD16, déclenchant la dégranulation des cellules NK contre les cellules-cibles recouvertes d'anticorps. Les cellules NK produisent également de nombreuses cytokines telles que l'interféron gamma. Du fait de cette capacité de lyse très rapide car indépendante de l'antigène et sans nécessité de « priming » préalable, un certain nombre de mécanismes de « contention » existent pour limiter les risques d'auto-réactivité. Ces mécanismes sont très efficaces car l'autoréactivité NK est inexistante ou en tout cas extrêmement faible par rapport à l'auto-réactivité des lymphocytes T. Ainsi, l'activité des cellules NK est régulée par une intégration complexe de signaux activateurs et inhibiteurs issus de nombreux récepteurs à la surface des cellules NK qui interagissent avec des ligands à la surface de la cellule cible (figure 1) [START_REF] Sivori | Human NK cells: surface receptors, inhibitory checkpoints, and translational applications[END_REF][START_REF] Pahl | Tricking the balance: NK cells in anti-cancer immunity[END_REF]. Si la balance penche vers les signaux inhibiteurs, la cellule saine ne sera pas détruite (Figure 1a). Si la balance penche vers les signaux activateurs, la cellule « stressée », transformée par un virus ou un processus tumoral, sera détruite (Figure 1b). Les interactions principales les

Effet anti-leucémique des cellules NK allogéniques dans l'allogreffe de CSH haploidentique

Un certain nombre d'hémopathies malignes ne sont pas curables par la chimiothérapie seule quelle que soit la dose de chimio-radiothérapie utilisée. L'allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) reste la seule option curative dans un grand nombre de cancers hématologiques. Le principe de l'allogreffe dans cette situation est de remplacer le système hématopoïétique et le système immunitaire du patient par le système hématopoïétique et le système immunitaire d'un donneur allogénique. La réaction du système immunitaire du donneur vis-à-vis du receveur s'appelle la réaction du greffon. Cette réaction appelée GvL pour Graft versus Leukemia/Lymphoma permet d'éliminer les cellules résiduelles malignes du patient et de contrôler l'hémopathie au long cours. Elle s'accompagne malheureusement d'un effet secondaire indésirable, la maladie du greffon contre l'hôte (GVHDD, Graft versus Host Disease) consistant à une attaque des tissus sains de l'hôte (peau, tube digestif, foie, poumons…) par le système immunitaire du donneur, essentiellement les lymphocytes T alloréactifs. Pour limiter les risques de GVHDD graves, la majorité des allogreffes se fait en situation de HLA-identité entre donneur et receveur. Cependant, l'absence de donneur HLA-identique dans 30 % des indications de greffe a poussé à développer les allogreffes dites alternatives, c'est-à-dire avec une ou plusieurs incompatibilités HLA. Depuis plusieurs années, les greffes haploidentiques familiales, c'est-àdire à partir d'un donneur partageant un haplotype HLA en commun avec le receveur et différant de l'autre (par exemple un père avec son fils, ou un cousin, oncle etc.), sont en constante augmentation, représentant plus de 20 % des allogreffes en France en 2020. Dans cette situation, les cellules NK du donneur haploidentiques peuvent être activées. En effet, certaines molécules du HLA de classe I présentes sur les cellules du donneur et manquantes sur les cellules leucémiques du receveur ne permettent pas à ces dernières d'inhiber les KIR des cellules NK du donneur, ce qui induit l'activation de la cellule NK (Figure 1c). On parle alors d'un effet GVL NK médié par le mismatch KIR/KIR-ligand. De nombreuses publications ont rapporté un effet anti-leucémique majeur d'un tel mismatch, notamment chez les patients allogreffés en haploidentique pour une LAM avancée [START_REF] Ruggeri | Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity in mismatched hematopoietic transplants[END_REF][START_REF] Nguyen | Role of natural killer cells in hematopoietic stem cell transplantation: myth or reality?[END_REF]. Cependant, l'effet anti leucémique des cellules NK alloréactives après greffe est un sujet de discussion et les résultats des études sont parfois contradictoires. Il est probable que les cellules NK, ayant une grande plasticité, « s'adaptent » à leur environnement ou présentent des retards de maturation post-greffe les rendant peu cytotoxiques (6) [START_REF] Nguyen | NK-cell reconstitution after haploidentical hematopoietic stem-cell transplantations: immaturity of NK cells and inhibitory effect of NKG2A override GvL effect[END_REF] . Néanmoins, même si l'effet in vivo des cellules NK reste moins bien élucidé que celui des cellules T, le développement des greffes haploidentiques depuis la fin des années 90 a permis de mettre en lumière cette population particulière et d'exploiter son potentiel de cytotoxicité anti-tumoral majeur [START_REF] André | Anti-NKG2A mAb Is a Checkpoint Inhibitor that Promotes Anti-tumor Immunity by Unleashing Both T and NK Cells[END_REF][START_REF] Cooley | Strategies to activate NK cells to prevent relapse and induce remission following hematopoietic stem cell transplantation[END_REF].

Immunothérapie par CAR-T

L'allogreffe de CSH est la plus ancienne et la plus fréquente des immunothérapies cellulaires anti-leucémiques à ce jour. Cependant, c'est une immunothérapie radicale (où le système immunitaire du receveur est détruit et remplacé par celui du donneur) et non ciblée. Il en découle sa toxicité, notamment les risques de GVHD et d'infections liées au dérèglement immunitaire du patient pendant les mois ou années qui suivent la greffe. Le développement des cellules CAR-T a révolutionné le paysage de l'immunothérapie cellulaire anti-tumorale.

Une cellule CAR-T est une cellule T qui a été génétiquement modifiée pour exprimer un récepteur spécifique de l'antigène cible. Ce récepteur chimérique est composé du fragment variable d'immunoglobuline à chaîne unique (scFv) qui détermine la spécificité antigénique du CAR, d'un domaine transmembranaire et d'un domaine intracellulaire de signalisation de la molécule CD3ζ (CAR-T de première génération) auquel a été associé un domaine de co-stimulation, de type CD28 ou 4-1BB (CAR-T de deuxième génération) ou plusieurs domaines de co-stimulation (troisième génération), ou associé à un transgène supplémentaire tel que des cytokines pour stimuler leur fonction effectrice (quatrième génération). Deux CAR-T de deuxième génération sont commercialisés en France dans le traitement des LAL-B réfractaires ou en rechute de l'enfant et de l'adulte jeune et des lymphomes B à grandes cellules réfractaires ou en rechute : le tisagenlecleucel (Kymriah) et l'axicabtagene ciloleucel (Yescarta). Les résultats des études cliniques évaluant ces traitements ont montré une efficacité remarquable dans ces situations en impasse thérapeutique. On observe des réponses à long terme chez 40 à 60 % des patients dont la médiane de survie est habituellement de six mois avec les chimiothérapies conventionnelles [START_REF] Maude | Chimeric Antigen Receptor T Cells for Sustained Remissions in Leukemia[END_REF][START_REF] Schuster | Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas[END_REF]. Cependant, la thérapie CAR-T pose encore plusieurs problèmes [START_REF] Pfefferle | You Have Got a Fast CAR: Chimeric Antigen Receptor NK Cells in Cancer Therapy[END_REF]. La plupart des cellules CAR-T sont développées à partir de cellules autologues du patient. Cela pose d'une part la question de la qualité des lymphocytes T du patient au moment du prélèvement (la lymphaphérèse) et d'autre part la question de l'hétérogénéité des produits obtenus. En effet, il a été observé des anomalies lymphocytaires T des patients candidats à la thérapie CAR-T, soit liées à l'hémopathie sous-jacente, soit liées aux différents traitements de l'hémopathie (lymphocytes T « épuisés » et/ou Lymphocytes B incapables de présenter l'antigène comme dans la LLC par exemple) [START_REF] Rubio | Suivi immunologique des patients traités par cellules CAR-T pour hémopathie maligne : recommandations du groupe CARTi et de la Société francophone de greffe de moelle et de thérapie cellulaire (SFGM-TC)[END_REF]. Par ailleurs, cela pose plusieurs difficultés logistiques lors du processus de fabrication, long et coûteux. En premier lieu, les lymphocytes T étant des cellules « vivantes » effectrices, il est nécessaire de respecter un certain délai de « wash-out » des traitements médicamenteux avant : (i) de prélever les lymphocytes du patient allant servir de matière aux CAR-T ; (ii) de réinjecter les cellules CAR-T. Il est en effet nécessaire de minimiser l'impact négatif de ces traitements sur la fonctionnalité des cellules prélevées puis injectées. Deuxièmement, une fois prélevés les lymphocytes sont adressés à un CD16 et ne peuvent donc pas médier la cytotoxicité liée à l'anticorps (ADCC). L'intérêt de CAR-NK dérivées d'une lignée cellulaire est la possibilité de générer des cellules « à l'infini » avec un gain en termes de nombre de cellules, de temps et de coût considérable. Malheureusement, du fait de leur nature tumorale, ces CAR-NK dérivées de la lignée NK-G2 doivent être irradiées avant injection. L'irradiation semble conserver leur capacité cytotoxique mais impacte fortement leurs capacités de prolifération in vivo, avec une disparition des cellules in vivo après sept jours, nécessitant des injections multiples. Tang et al ont été les premiers à rapporter l'injection chez l'homme de cellules NK-CAR générées à partir de la lignée NK-92 (clinicaltrials.gov: NCT02944162) (29). Les cellules de la lignée NK-92-MI, qui expriment l'IL-2 humaine, ont été transduites avec une construction lentivirale CAR anti CD33 de troisième génération contenant les molécules costimulatrices CD28 et 4-1BB avec une efficacité de la transduction supérieure à 90 %. Trois patients atteints de LAM en rechute réfractaire recevaient une chimiothérapie de rattrapage suivie de trois injections rapprochées de cellules CD33-CAR NK-92 irradiées au 60Cr (10 Gy) avec des doses comprises entre 3x10 8 et 5x10 9 cellules. Les injections étaient bien supportées cliniquement mais l'effet thérapeutique a été très modeste. Des CAR de quatrième génération ont été conçues à partir de cellules de la lignée NK92 dans une plateforme appelée UniCAR, initialement consacrée aux cellules T. Le système UniCAR se compose de deux éléments : (i) le CAR-NK dirigé contre l'épitope peptidique E5B9, un antigène non exprimé naturellement à la surface des cellules ; et (ii) un composant bispécifique appelé module cible (Target module, TM). Ce composant bispécifique TM est composé de l'épitope E5B9 (reconnu par le CAR) d'un côté et l'antigène tumoral de l'autre (par exemple, l'antigène GD2 dans la Figure 2). Il a une demi-vie très courte, de l'ordre de 30 minutes ce qui permet d'obtenir un effet on/off car dès que le TM est éliminé, l'UniCAR est inactivé. De plus, il permet de cibler un grand panel d'antigènes tumoraux en variant les TM qui peuvent être administrés simultanément ou de façon séquentielle. Les UniCAR sont issues de la lignée NK92 donc sont irradiées, ce qui raccourcit leur durée de vie. Il est possible de faire plusieurs injections d'UniCAR en cas de nonpersistance de ces cellules. De plus, différentes constructions de la molécule bispécifique TM ont été testées (avec un scaffold scFv ou une IgG4, Figure 2). La construction basée sur l'IgG4 permet d'augmenter la durée de vie de la molécule bispécifique, et donc, également la durée de l'interaction avec les CAR-NK [START_REF] Mitwasi | UniCAR »-modified offthe-shelf NK-92 cells for targeting of GD2-expressing tumour cells[END_REF].

Cellules NK dérivées de sang de cordon

Les cellules de sang de cordon sont une source intéressante de cellules NK car ils existent des centaines de Il est possible que l'adjonction du gène de l'IL-15 dans la construction du CART ait pu contribuer à la persistance prolongée des CAR-NK, même si les mécanismes de maintien de la persistance in vivo des CAR-NK injectées ne sont pas bien compris. Même s'il est difficile de juger de l'efficacité spécifique des CAR-NK à long terme (du fait traitement d'entretien qui a été administré post-injection) ces résultats sont très encourageants.

Cellules NK dérivées de sang périphérique La plupart des essais de thérapie adoptive NK (hors CAR-NK) ont utilisé des cellules provenant de donneurs familiaux haploidentiques ou non familiaux et ont montré une efficacité anti-tumorale dans la LAM de l'adulte et de l'enfant [START_REF] Myers | Exploring the NK cell platform for cancer immunotherapy[END_REF][START_REF] Ciurea | Phase 1 clinical trial using mbIL21 ex vivo-expanded donor-derived NK cells after haploidentical transplantation[END_REF]. Les lymphocytes étaient prélevés par lymphaphérèse puis enrichis en NK après déplétion des lymphocytes T et B (déplétion CD3+ et CD19+ par billes magnétiques), voire même sélectionnées positivement par le CD56+. Ces cellules étaient activées overnight par de l'IL-2 puis réinjectées aux patients. [START_REF] Miller | Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer[END_REF][START_REF] Björklund | Complete Remission with Reduction of High-Risk Clones following Haploidentical NK-Cell Therapy against MDS and AML[END_REF] Les avantages majeurs de ces cellules sont qu'elles sont matures, bien différenciées et en grande majorité CD56dim cytotoxiques. L'inconvénient est qu'il faut prélever des donneurs volontaires adultes sains, ce qui rend la procédure moins aisée qu'avec des unités de sang de cordons congelés. De plus, les cellules NK adultes ayant des capacités de prolifération moindres que les cellules du sang de cordon, il est [START_REF] Bachanova | Initial Clinical Activity of FT596, a First-in-Class, Multi-Antigen Targeted, Off-the-Shelf, iPSC-Derived CD19 CAR NK Cell Therapy in Relapsed/Refractory B-Cell Lymphoma[END_REF]. La patiente a reçu une dose unique de 30x10^6 de cellules FT96 en monothérapie après une chimiothérapie lymphodéplétante. Aucune toxicité liée aux FT96 n'a été notée hormis une neutropénie résolutive. L'évaluation de la réponse tumorale à un mois a montré une réponse partielle selon les critères de Lugano 2014, avec une diminution de plus de 70 % de l'absorption du 18F-fluorodésoxyglucose et une réduction de plus de 50 % de la taille de la tumeur. Une seconde dose de FT596 est envisagée pour cette patiente. Un essai de phase 1 est en cours (clinicaltrials.gov: NCT04245722). Lorsqu'il est utilisé en combinaison avec des anticorps monoclonaux anti-CD20 tels que le Rituximab ou l'Obinutuzumab, le récepteur hnCD16 Fc du FT596 se lie à la portion Fc des anticorps monoclonaux liés aux cellules tumorales, provoquant l'ADCC. L'IL-15RF renforce l'effet cytotoxique et la persistance des cellules NK. Le FT596 agit donc via 3 voies : le CAR anti CD19, l'ADCC via l'anti-CD20 et l'IL-15.

Conclusions

Légendes des figures

2 .

 2 Sorbonne Université, INSERM CNRS 1135 « NK and T cell immunity, Virus and Cancer », Centre d'Immunologie et des Pathologies Infectieuses (CIMI), UPMC UMRS CR7 -Inserm U1135 -CNRS ERL 8255 -Faculté de Médecine Pierre et Marie Curie, Site Pitié-Salpêtrière -91 Boulevard de l'Hôpital -75013 Paris, France.

  3. -INSERM UMRS 1138, Cell Death and Drug Resistance in Lymphoproliferative Disorders Team, Centre de Recherche des Cordeliers, 15 Rue de l'École de Médecine, 75006 Paris, France. l'expression d'une ou plusieurs molécules du complexe majeur d'histo-compatibilité (CMH) de classe I à leur surface, sans immunisation préalable et de manière antigène indépendante, contrairement aux cellules T ou B.

  mieux connues sont : (i) des ligands tels que les molécules du CMH de classe I classiques (HLA-C et HLA-Bw4 essentiellement) ou non classiques (tels que HLA-E) sont exprimés sur la cellule cible et sont reconnus par les récepteurs NK inhibiteurs spécifiques (de type KIR ou CD94/NKG2A), entraînant un signal négatif prédominant et empêchant la lyse autologue via la reconnaissance du soi, (ii) des ligands induits par le stress (tels que MICA/MICB et ULBP) sont exprimés à la surface de la cellule cible transformée et sont reconnus par des récepteurs activateurs NK spécifiques (tels que NKG2D) provoquant un signal activateur et la destruction du « non soi ». Il existe de nombreux autres ligands de récepteurs activateurs (récepteurs NKp44, NKp30, NKp46, NKG2C, KIR activateurs) mais leur nature et leurs fonctions exactes ne sont pas tous connues à ce jour, notamment lorsqu'un même ligand est reconnu à la fois par un récepteur activateur et inhibiteur (par exemple HLA-E, ligand de CD94/NKG2A et de CD94/NKG2C, ou certains allèles HLA-C reconnus par des KIR inhibiteurs et activateurs). Il existe deux populations de cellules NK définies par l'intensité d'expression du CD56 : les cellules NK CD56dim et les NK CD56bright. Les NK CD56dim ont une expression moins intense du CD56 (visualisée en cytométrie en flux [CMF]), elles représentent 90 % des cellules NK du sang circulant, elles sont fortement cytotoxiques et sont CD16+. Les NK CD56bright (expression plus intense du CD56 en CMF) représentent 10 % des cellules NK circulantes mais la majorité des cellules NK dans les ganglions. Elles sont CD16 faible, ont un pouvoir de cytotoxicité plus faible que les CD56dim mais sont fortement prolifératives. Il est admis que le profil phénotypique et fonctionnel d'une cellule NK mature est : CD56dim, CD16high, KIR+, cytotoxique. Celui des cellules NK plus immatures est : CD56bright, CD16low, KIR low, NKG2A+, faiblement cytotoxique mais avec capacité de prolifération. Ces différences de nature et de fonctionnalité sont importantes pour appréhender les obstacles à la manipulation ou à l'utilisation des cellules NK en thérapie cellulaire.

  laboratoire pharmaceutique extérieur au centre d'hématologie clinique avec un délai variable. Ils sont ensuite manipulés génétiquement au cours d'un processus d'environ quatre semaines. Ainsi, entre la décision d'indication et la réinjection des cellules CAR-T au patient, il s'écoule environ deux mois, délai difficile à tenir chez des patients ayant une hémopathie réfractaire non contrôlée. Troisièmement, les cellules CAR-T anti-CD19 injectées ont des toxicités propres, notamment neurologique, inflammatoire (syndrome de relargage cytokinique, CRS) et hématologique (cytopénies parfois prolongées). Quatrièmement, la perte de la cible antigénique après traitement par les cellules CAR-T est une cause de rechute importante, notamment dans les LAL-B CD19. L'efficacité des cellules CAR-T dépendant de la reconnaissance de l'antigène CD19 par le CAR-T, la perte de cet antigène génère une perte de reconnaissance par les cellules CAR-T de leur cible qui ne peut alors plus être détruite. Afin de dépasser certains obstacles liés à la thérapie CAR-T autologue, des cellules CAR-T allogéniques ont été développées mais exposent à un risque accru de rejet d'une part, et de GVHDD de l'autre. Des modifications génétiques supplémentaires telles que la suppression du TCR ou l'introduction d'un gène suicide sont donc nécessaires. Cependant, le risque de rejet des CAR-T allogéniques reste un problème à résoudre.Immunothérapie par les cellules CAR-NKLes cellules NK exerçant leur activité de façon indépendante de l'antigène et du HLA, elles peuvent être obtenues à partir de donneurs allogéniques HLA-incompatibles. Au contraire, l'incompatibilité HLA entre les cellules NK du donneur et les cellules tumorales du receveur pourraient justement favoriser l'alloréactivité anti-tumorale des cellules NK (cf. section « biologie des cellules NK »). De façon intéressante, et contrairement aux lymphocytes T allogéniques, les cellules NK ne provoquent pas de GVHDD. Les raisons de l'absence de GVHDD sont non encore complètement élucidées, bien que peut-être à chercher du côté des ligands des récepteurs activateurs. En effet, il est possible que les tissus sains de l'hôte non stressés (peau, tube digestif…) ne présentent pas à leur surface des ligands induits par le stress, les épargnant de la cytotoxicité NK. Dans certains modèles murins de greffe de moelle CMH incompatibles, les cellules NK du donneur ont même un effet protecteur de la GVHD en détruisant les cellules présentatrices d'antigène du receveur. Cet effet sur le système immunitaire du receveur pourrait également favoriser la prise de greffe et rendre les cellules NK allogéniques moins sensibles au rejet. La possibilité d'avoir à disposition des cellules CAR-NK allogéniques aurait donc évidemment un intérêt majeur en termes de gain de temps et de coûts (12-14). Pour autant malgré ces atouts importants, les cellules CAR-NK présentent un certain nombre de limites, raison pour laquelle leur utilisation en clinique est moins avancée que celle des cellules CAR-T. Leur durée de vie est courte, de l'ordre d'une à deux semaines. Les essais d'injections de cellules NK prélevées chez des donneurs familiaux haploidentiques (tri CD3-CD56+) et activées par l'IL2 réalisés par Miller et al. chez des patients atteints de LAM réfractaire ont montré que la chimiothérapie lymphodéplétante par Fludarabine et Cyclophosphamide était essentielle à l'expansion des cellules NK et que la présence d'IL-15 était un facteur prédictif d'expansion et de réponse clinique (15). L'incorporation de transgènes de cytokines telles que l'interleukine (IL)-2 ou l'IL-15 dans la construction des cellules CAR-NK peut également accroître leur prolifération et leur persistance (13). De plus les cellules NK sont plus difficiles à manipuler génétiquement que les cellules T et leur nombre limité dans le sang circulant nécessite de mettre en place des techniques d'expansion ex vivo afin d'obtenir la dose nécessaire. Enfin, les cellules NK sont sensibles au microenvironnement tumoral (MET). De même que pour l'IL-15, l'incorporation de transgènes codant pour les récepteurs de chimiokines pourrait donc favoriser le trafic des CAR-NK vers les sites tumoraux. Sources des cellules CAR-NK Le profil de tolérance favorable ainsi que le potentiel cytotoxique anti-tumoral des cellules NK en font des candidates privilégiées pour l'immunothérapie cellulaire adoptive allogénique. L'intérêt majeur des cellules CAR-NK allogéniques est leur disponibilité rapide (sans les limites énoncées plus haut liées aux cellules autologues). Il serait ainsi possible de générer plusieurs lots homogènes à partir d'une source de cellules. Plusieurs sources de cellules NK ont été utilisées pour générer des CAR-NK allogéniques. Lignée cellulaire NK-92 NK-92 est une lignée dérivée de cellules lymphomateuses NK humaines, EBV positives, dépendantes de l'IL-2. Elles sont fortement cytotoxiques. Leur phénotype comporte les récepteurs activateurs NKp30, NKp46 et NKG2D. De façon intéressante, leurs seuls récepteurs inhibiteurs de surface se limitent à ILT2, NKG2A (reconnaissant HLA-E) et le récepteur KIR inhibiteur KIR2DL4 à un faible niveau. Elles ont donc très peu de récepteurs inhibiteurs KIR habituels reconnaissant les molécules HLA de classe I, HLA-C ou HLA-Bw4. De ce fait, elles sont peu inhibées par les molécules HLA des patients. En revanche, elles n'expriment pas le

  milliers d'unités de sang placentaire disponibles dans les banques mondiales. Les cellules NK représentent 15 à 30 % des lymphocytes du sang de cordon. Leur phénotype est plus immature que les cellules du sang périphériques d'un adulte, avec notamment un profil CD16 faible (donc une faible capacité d'ADCC), CD56bright (conférant un profil plus prolifératif que cytotoxique), NKG2A+ (récepteur inhibiteur reconnaissant HLA-E), KIR faible (les rendant moins fonctionnelles). Même si les cellules NK contenues dans le sang de cordon sont quantitativement faibles, elles ont une capacité de prolifération élevée et une grande sensibilité à la stimulation cytokinique permettant de les expandre ex vivo. L'équipe du MD Anderson dirigée par Rezvani et al ont récemment publié un essai clinique de phase 1/2 très encourageant testant l'injection de cellules CAR-NK-CD19 issues de sang de cordon chez onze patients porteurs d'hémopathies lymphomateuses B en rechute et/ou réfractaire (lymphome non-hodgkinien ou leucémie lymphoïde chronique (LLC)) (17) (clinicaltrials.gov: NCT03056339). Les cellules NK ont été transduites avec un vecteur rétroviral exprimant des gènes codant pour l'anti-CD19 CAR, l'interleukine-15 et le gène suicide inductible caspase 9 qui induit l'apoptose par liaison spécifique avec une petite molécule dimérisée CID AP20187 (Figure 3). Les cellules ont été administrées en une seule perfusion à l'une des trois doses étudiées par l'essai (1×105, 1×106, ou 1×107 cellules CAR-NK par kilogramme de poids corporel) après une chimiothérapie de lymphodéplétion classique (Fludarabine et Cyclophosphamide). Les incompatibilités HLA entre les cellules NK du cordon et les receveurs étaient multiples. Les auteurs ont essayé initialement de trouver des cordons présentant des typages HLA favorisant l'alloréactivité NK puis n'ont plus tenu compte du typage HLA. De façon remarquable, aucune toxicité post-injection n'a été notée. En particulier, il n'y a pas eu de CRS ou de neurotoxicité et la dose maximale tolérée n'a pas été atteinte. La réponse a été rapide (dans le mois suivant l'injection) et profonde (obtention d'une rémission complète chez sept patients sur onze et retour à la phase chronique LLC pour un lymphome de Richter). Cependant, il faut noter que la moitié des patients ont reçu un traitement d'entretien après l'injection des cellules NK (Lenalidomide, Rituximab, Venetoclax, greffe de cellules souches hématopoïétiques). Les cellules NK ont pu être détectées jusqu'à douze mois post-injection.

  probable qu'il faille un donneur pour un patient. Enfin, il est recommandé de choisir le meilleur donneur ayant une incompatibilité HLA favorisant l'alloréactivité NK, ce qui oblige à trouver un donneur « à façon » pour chaque receveur et ne permet pas d'avoir des donneurs universels facilement accessibles. Pour surmonter ces problèmes, il faudrait développer des techniques d'expansion des cellules NK et probablement améliorer la persistance et l'activation par des constructions incluant les gènes de l'IL-2 ou de l'IL-15. (21). Très récemment, Kararoudi et al. ont utilisé la technique CRISPR/Cas9 pour introduire des CAR dans des cellules NK primaires humaines (28). Ils ont généré des cellules CAR NK ciblant CD33 avec différents domaines transmembranaires et de signalisation (CD4/4-1BB+CD3ζ et NKG2D/2B4+CD3ζ) et les ont développées sur des cellules nourricières CSTX002. Les cellules NK expandues ont conservé une forte expression de CAR (68 % CAR+ en moyenne) et ont présenté une forte activité antileucémique contre les lignées cellulaires de leucémie myéloïde aiguë (LAM) CD33+ et les échantillons de blastes primaires. En utilisant le séquençage ciblé, les auteurs ont démontré la précision de l'insertion du gène CAR dans le génome des cellules NK transfectées, ouvrant des perspectives intéressantes pour générer des CAR NK à partir des cellules NK humaines primaires.Cellules NK dérivées des iPSCLes cellules souches pluripotentes induites (iPSC pour Induced pluripotent stem cells) sont des cellules différenciées qui ont été reprogrammées génétiquement en cellules souches pluripotentes. La reprogrammation d'une cellule différenciée en iPSC consiste à la modifier génétiquement en la faisant exprimer quatre gènes lui conférant les mêmes caractéristiques qu'une cellule souche embryonnaire, sans avoir à utiliser un embryon humain surnuméraire : Klf4, c-Myc, Oct3/4 et Sox2. Ainsi, la cellule différenciée adulte reprogrammée a une capacité de prolifération illimitée et peut se différencier en n'importe quel type cellulaire après adjonction de facteurs de croissance spécifiques, ce qui la rend particulièrement intéressante pour son utilisation dans le domaine de la médecine régénérative, de la thérapie cellulaire ou la modélisation des maladies génétiques. Cette découverte a valu le prix Nobel de médecine 2012 à Shinya Yamanaka chercheur à l'université de Kobé[START_REF] Yamanaka | Pluripotent Stem Cell-Based Cell Therapy-Promise and Challenges[END_REF]. Les sources de cellules différenciées utilisables sont multiples : cellules sanguines, fibroblastes, cellules épithéliales, cellules mésenchymateuses… Du fait de son immortalité, une seule cellule iPSC est nécessaire pour générer un produit cellulaire CAR-NK universel prêt à l'emploi. Les cellules NK générées à partir d'iPSC ont un phénotype immature : CD16 faible, NKG2A high, KIR low, ce qui leur confère une faible cytotoxicité mais une forte capacité de prolifération. Pour améliorer leur cytotoxicité et leur persistance, il est possible de rajouter les gènes codant pour le CD16 et l'IL-15 ou l'IL-2.[START_REF] Li | Human iPSC-Derived Natural Killer Cells Engineered with Chimeric Antigen Receptors Enhance Anti-tumor Activity[END_REF][START_REF] Saetersmoen | Off-the-shelf cell therapy with induced pluripotent stem cell-derived natural killer cells[END_REF]. Le FT596 est le premier produit cellulaire CAR-NK allogénique « prêt à l'emploi », universel, et dérivé des iPSC autorisé pour des essais cliniques aux États-Unis[START_REF] Goodridge | FT596: Translation of First-of-Kind Multi-Antigen Targeted Off-the-Shelf CAR-NK Cell with Engineered Persistence for the Treatment of B Cell Malignancies[END_REF]. Il est composé d'un récepteur d'antigène chimérique (CAR) anti-CD19 optimisé pour les cellules NK, avec un domaine transmembranaire pour le récepteur activateur NKG2D, un domaine de co-stimulation 2B4 et un domaine de signalisation CD3zêta. Ont été rajoutés (i) un récepteur Fc de haute affinité, non clivable, du CD16 (hnCD16), qui a été modifié pour augmenter l'ADCC en empêchant la régulation négative du CD16 et en augmentant la liaison du CD16 aux anticorps ciblant les tumeurs ; et (ii) une protéine de fusion du récepteur IL-15 (IL-15RF) (Figure4). Lorsqu'il est utilisé en combinaison avec des anticorps monoclonaux tel que le Rituximab (anti-CD20), le récepteur hnCD16 Fc du FT596 se lie à la portion Fc des anticorps monoclonaux liés aux cellules tumorales, ce qui entraîne l'activation des cellules NK, la sécrétion de cytokines et une cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) accrue. L'IL-15RF renforce l'effet cytotoxique des cellules NK et des cellules T antitumorales activées. Le FT96 agit donc via trois voies : le CAR anti CD19, l'ADCC via l'anti-CD20 et l'IL-15. Le FT96 agit donc via trois voies : le CAR anti CD19, l'ADCC via l'anti-CD20 et l'IL-15. Une communication au dernier congrès de l'ASH 2020 a rapporté le cas d'une patiente de 76 ans en rechute/réfractaire d'un lymphome B à grandes cellules après huit lignes de traitement, incluant une autogreffe de CSH, une thérapie adoptive de cellules T autologues manipulées, et des cellules NK haploidentiques activées

  Les cellules CAR-NK allogéniques ouvrent des perspectives passionnantes qui pourraient répondre à certains problèmes liés à l'utilisation des cellules CAR-T autologues. L'écueil principal présenté jusque-là par les cellules NK allogéniques était leur faible persistance post-infusion et la nécessité de choisir des donneurs familiaux haploidentiques. Cependant, les constructions récentes associant au CAR de l'interleukine 15 ou un CD16 stable renforçant l'ADCC semblent très prometteuses. La thérapie CAR-NK est encore très peu développée par rapport aux cellules CAR-T : on recense en janvier 2021 seize essais CAR-NK (Tableau 1) versus 745 essais CAR-T sur le site Clinicaltrials. Pourtant, ses nombreux atouts, en particulier la disponibilité immédiate, l'absence de toxicité rapportée et la possibilité de générer plusieurs lots à partir d'une source unique vont probablement faire de la thérapie CAR-NK une voie d'avenir dans la lutte contre le cancer. Abréviations NK, Natural killer ; CMH, complexe majeur d'histo-compatibilité ; TRAIL, tumor-necrosis-factor related apoptosis inducing ligand; HLA, Human Leucocyte Antigen ; GVHDD, graft-versus-host disease ; GvL, Graft versus Leukemia/Lymphoma ; NCRs, natural cytotoxicity receptors ; KIRs, killer cell Ig-like receptors ; ADCC, cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps ; Ig, immunoglobuline; LAL-B, Leucémie aigue lymphoblastique B ; CAR, Chimeric antigen receptor ; CRS, cytokine release syndrome ; TCR, T cell receptor ; scFv, fragment variable à chaîne unique ; iPSCs, cellules souches pluripotentes induites.

Figure 1 .

 1 Figure 1. Cytotoxicité des cellules NK : une balance entre activation et inhibition 1a. En situation autologue non « stressée », l'inhibition NK domine. Il n'y a pas d'auto-réactivité 1b. En situation de « stress », le signal activateur domine le signal inhibiteur. 1c-En situation d'incompatibilité HLA de classe 1 entre NK du donneur et cellules leucémiques du receveur (greffes haploidentiques), les cellules NK du donneur expriment des molécules HLA de classe I (ligand de KIR) qui ne sont pas exprimées sur les cellules leucémiques du receveur, et ne peuvent donc se lier aux KIR inhibiteurs des cellules NK du donneur. Le signal activateur domine.

Figure 2 .

 2 Figure 2. Fonctionnement de l'UniCAR NK-92 contre les cellules tumorales GD2+L'UniCAR-92 est dérivé de la lignée tumorale humaine NK92. Il est constitué (i) d'un anticorps extracellulaire à fragment variable à chaîne unique (scFv) dirigé contre l'épitope peptidique E5B9 qui n'est pas exprimé sur les cellules de l'hôte, (ii) du domaine costimulateur CD28 et (iii) du fragment de signalisation CD3ζ. Les cellules NK-92 modifiées pour exprimer l'UniCAR peuvent être redirigées vers des cellules tumorales exprimant l'antigène cible GD2 via des « Target Module » (TM) ou module cible spécifiques. Ces modules cibles sont constitués d'un anticorps bispécifique qui reconnaît l'antigène GD2 sur la cellule tumorale, et l'épitope E5B9 qui interagit avec la cellule UniCAR NK92.

Figure 3 .

 3 Figure 3. CAR-NK issues du sang de cordon La construction du CAR-NK décrit par l'équipe de Rezvani et al. au MD Anderson comprend un CAR-CD19 classique avec la molécule de co-stimulation CD28, auquel a été rajouté un gène suicide Caspase 9 et le gène de l'IL-15.

Figure 4 .

 4 Figure 4. Mode d'action de la cellule FT596, issue des iPSC La cellule FT596 est composée d'un CAR anti-CD19 optimisé pour les cellules NK, avec un domaine transmembranaire pour le récepteur activateur NKG2D, un domaine de co-stimulation 2B4 et un domaine de signalisation CD3-zêta. Un récepteur Fc de haute affinité, non clivable, du CD16 (hnCD16), a été rajouté pour