Alex Westbrook

Etienne Routhier

Julien Mozziconacci

Romain Koszul

Jean-Baptiste Boulé

Nucleosome positioning in yeast: from prediction to synthetic design

à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.

Introduction

Conclusion

We show that a nucleosome model trained on yeast chromatin can accurately predict nucleosome tracks of bacterial chromosomes inside the yeast nucleus, even when there are notable differences in GC content.

With a computational approach based on deep learning prediction, we designed and validated regular nucleosome arrays with tailored nucleosomal repeat length in yeast, much larger than the natural one. Our next step is to integrate modelling of polymerase and cohesin binding into our designs, to get better control over the yeast chromatin. Contact: Alex Westbrook alex.westbrook@mnhn.fr Julien Mozziconacci julien.mozziconacci@mnhn.fr

Nucleosomes

  are the primary elements of DNA folding within eukaryotic cells, essential for both chromosome structure and gene regulation. Nucleosomal tracks are derived experimentally from MNase sequencing. Using deep neural networks, these tracks can be predicted from the DNA sequence alone in yeast. Objectives • How well does a yeast model generalize on exogenous sequences ? • How can this model help in designing new sequences ? Exogenous sequences Yeast strains with a bacterial chromosome Sample of the predicted and experimental tracks on each sequence, and correlation plots over whole chromosome Integration of repeated synthetic sequences in yeast, with nucleosomal repeat length of 167bp (naturally occurring in yeast), 197bp and 237bp (highest known in eukaryotes) Comparison to the 601 sequence, designed in vitro to position nucleosomes preferentially Pretrained model


Angela Osorio
email: angela.z.osorio@gmail.com

Laurent Schmitt
email: laurent.schmitt@unistra.fr

Professeur

Améliorer la gestion des espaces naturels par la participation. Une analyse du guide français pour l'élaboration des plans de gestion

Keywords: espaces naturels protégés (ENPs), plans de gestion, guide méthodologique, France, participation protected natural areas, management plans, methodological guide, France, participation

La protection de l'environnement est aujourd'hui un enjeu majeur à toutes les échelles. En France comme dans de nombreux pays dans le monde, l'une des stratégies clés dans ce domaine est la protection d'espaces naturels faisant l'objet de mesures de gestion et/ou de restauration. De nombreux acteurs scientifiques et institutionnels se positionnent pour proposer des cadres afin de rationaliser ces mesures de gestion/restauration, mais ces démarches ne font que très rarement l'objet d'analyses scientifiques critiques. Un guide méthodologique a ainsi été récemment développé pour guider de manière cohérente tous les acteurs concernés par l'élaboration des plans de gestion d'Espaces naturels protégés (ENPs) français. Nous proposons ici la première évaluation scientifique de ce guide. Celle-ci s'appuie sur l'application d'un cadre évaluatif constitué de trois critères : les fondements scientifiques, l'opérationnalité, et la légitimité. L'application de ces critères nous permet de mettre en évidence certaines faiblesses du guide, qui sont susceptibles d'influencer négativement la qualité des activités des gestionnaires qui l'utilisent. Nous montrons des pistes d'amélioration par le déploiement de démarches participatives, que le guide mentionne rapidement alors qu'il devrait leur accorder une plus grande importance, en explicitant les modalités de mise en oeuvre et les précautions à prendre pour les déployer.

T1 Introduction

En France, les Espaces naturels protégés (ENPs) sont apparus dans la seconde moitié du 19 e siècle avec la création, en 1861, du site artistique en forêt de Fontainebleau. Depuis, on observe une tendance croissante à la création et à l'extension d'ENPs, qui représentent aujourd'hui près du 33 % du territoire national et des espaces maritimes (MTECT, 2022). La volonté d'améliorer les actions de gestion/restauration mises en oeuvre dans les ENPs s'est accompagnée, ces dernières années, d'une complexification du travail effectué par les gestionnaires des ENPs et autres acteurs activement engagés dans de tels projets [START_REF] Atauri-Mezquida | A Framework for Designing Ecological Monitoring Programs for Protected Areas: A Case Study of the Galachos del Ebro Nature Reserve (Spain)[END_REF]. Cette complexification a conduit à la démultiplication de guides censés informer ou accompagner les gestionnaires et leurs partenaires dans la définition, la mise en oeuvre ou l'évaluation de stratégies de gestion/restauration des ENPs. Ces guides jouent aujourd'hui un rôle clé dans la définition des stratégies et des actions de gestion/restauration à appliquer au sein des ENPs [START_REF] Álvarez Fernández | The management performance of marine protected areas in the North-east Atlantic Ocean[END_REF](Álvarez Fernández et al., , 2020b)). Parmi ces guides, les cahiers techniques pour l'élaboration des plans de gestion, mis depuis 1991 à disposition des gestionnaires des ENPs français par l'Atelier technique des espaces naturels (ATEN) (aujourd'hui partie intégrante de l'Office français de la biodiversité), jouent un rôle prééminent sur la scène française. En dépit du rôle central qu'ils jouent dans la mise en oeuvre pratique des politiques de conservation, ces guides n'ont quasiment fait l'objet d'aucune analyse scientifique. [START_REF] Ernoul | Trends in management plans and guides: 25 years of experience from Southern France[END_REF] et [START_REF] Paix | Analyse comparative de la méthodologie des réserves naturelles de France et de la méthodologie des open standards pour la réalisation du plan de gestion d'une réserve naturelle[END_REF] ont analysé une ancienne version du guide de référence français [START_REF] Rnf | Guide méthodologique des plans de gestion de réserves naturelles, Collectif[END_REF], et ont montré que celui-ci négligeait certains concepts cruciaux pour la gestion des ENPs, comme l'identification des acteurs locaux, l'apprentissage continu et l'adaptation. Le « Guide d'élaboration de plans de gestion des espaces naturels » (AFB, 2017) utilisé actuellement par les gestionnaires1 (qui sera appelé « le Guide » dans la suite de cet article), a fait l'objet d'encore moins d'analyses scientifiques. À notre connaissance, seule [START_REF] Arpin | The rise of planning in nature conservation and the practitioners' approach to conflicts. The inspiring case of the Northern French Alps nature reserves[END_REF] en a analysé certains aspects, mais en se concentrant uniquement sur les conflits. L'objet du présent article est de combler cette lacune, en proposant une évaluation scientifique du Guide, et en formulant des recommandations pour son amélioration. Cette démarche d'analyse scientifique d'outils utilisés sur le terrain par les acteurs de la gestion de l'environnement en France a été affinée méthodologiquement et appliquée empiriquement en de nombreuses occasions ces dernières années [START_REF] Jeanmougin | Mismatch between Habitat Science and Habitat Directive: Lessons from the French (Counter) Example: Evaluating the European habitat policy[END_REF][START_REF] Meinard | What is a legitimate conservation policy[END_REF]GERECO, 2018 ;[START_REF] Choulak | A meta-decision-analysis approach to structure operational and legitimate environmental policies -With an application to wetland prioritization[END_REF][START_REF] Jarić | Procrustean beds and empty boxes: On the magic of creating environmental data[END_REF]Meinard et Tsoukias 2019 ;[START_REF] Meinard | On justifying the norms underlying decision support[END_REF][START_REF] Osorio | Gestion et restauration écologique des espaces naturels protégés de la bande rhénane : construction d'une méthodologie participative[END_REF]. Notre analyse, qui s'inscrit, par son ambition et sa méthodologie, dans le prolongement de ces contributions, se déploiera en trois temps. Parce qu'une évaluation s'opère nécessairement sur la base d'un cadre évaluatif de critères, nous commencerons par présenter le cadre évaluatif choisi et les raisons de ce choix. Nous appliquerons ensuite ce cadre évaluatif au Guide. Cette évaluation sera alors utilisée, dans une démarche constructive, pour formuler des recommandations pour l'amélioration du Guide ou d'outils destinés à jouer un rôle similaire au sien. Enfin, nous conclurons sur la portée et les limites de cette étude.

T1 Présentation et justification du choix des critères retenus pour évaluer le Guide

Pour réaliser une évaluation scientifique du Guide, dans le prolongement des études précitées, nous proposons d'utiliser le cadre « analytique politique » (policy analytics), qui a été introduit par [START_REF] Tsoukias | Policy analytics: An agenda for research and practice[END_REF][START_REF] De Marchi | From evidence-based policy making to Policy Analytics[END_REF], puis affiné par plusieurs contributions dans son application aux politiques de conservation [START_REF] Jeanmougin | Mismatch between Habitat Science and Habitat Directive: Lessons from the French (Counter) Example: Evaluating the European habitat policy[END_REF][START_REF] Meinard | What is a legitimate conservation policy[END_REF][START_REF] Meinard | L'« argument économique » dans l'aide à la décision en politique environnementale et son évanescence : réflexions à partir du cas des « boues rouges de Gardanne[END_REF]. Ce cadre a été introduit pour dépasser les approches quantitatives (evidence based), qui consistent à évaluer les politiques publiques et à prescrire des réformes uniquement sur la base de mesures -quantitatives-des résultats de ces politiques. Ces approches, initialement introduites dans le domaine des décisions médicales, ont été généralisées aux autres politiques publiques [START_REF] De Marchi | From evidence-based policy making to Policy Analytics[END_REF]. Cependant, cette généralisation des approches quantitatives à par est discutable, car celles-ci ne sont en toute rigueur applicables qu'à des politiques qui poursuivent des objectifs très circonscrits et dont l'atteinte est quantifiable sans équivoque. Or cette condition est rarement réalisée dans le domaine des politiques publiques, car celles-ci ciblent souvent simultanément plusieurs objectifs, dont la réalisation se mesure par des batteries d'indicateurs qui donnent rarement une image univoque des résultats, en particulier car différents indicateurs reflètent les points de vue divergents que peuvent avoir différents acteurs, porteurs de différentes valeurs [START_REF] Tsoukias | Policy analytics: An agenda for research and practice[END_REF][START_REF] De Marchi | From evidence-based policy making to Policy Analytics[END_REF]. Pour dépasser les limites des approches quantitatives, les auteurs précédemment cités ont proposé un cadre multicritère, « analytique politique », dont une version plus spécifiquement adaptée aux politiques de conservation a été proposée par [START_REF] Jeanmougin | Mismatch between Habitat Science and Habitat Directive: Lessons from the French (Counter) Example: Evaluating the European habitat policy[END_REF]. Le cadre « analytique politique » se compose de 4 critères : (C1) la plus-value démontrable, (C2) les bases scientifiques, (C3) l'opérationnalité et (C4) la légitimité. Ces critères sont définis comme suit :

plus-value démontrable (C1) : ce critère pose la question de savoir si les outils évalués contribuent de manière démontrable à l'amélioration des pratiques de gestion/restauration ; bases scientifiques (C2) : ce critère examine si la politique de conservation évaluée s'appuie sur des connaissances scientifiques actualisées ; opérationnalité (C3) : ce critère pose la question de savoir si la politique de conservation évaluée est suffisamment précise et concrète pour être applicable sur le terrain sans ambiguïté [START_REF] Jeanmougin | Mismatch between Habitat Science and Habitat Directive: Lessons from the French (Counter) Example: Evaluating the European habitat policy[END_REF][START_REF] Choulak | A meta-decision-analysis approach to structure operational and legitimate environmental policies -With an application to wetland prioritization[END_REF] ; légitimité (C4) : ce critère représente la condition préalable à un large soutien des mesures de conservation ; il est fondamental pour la lecture des conflits environnementaux au sein des ENPs [START_REF] Gauchon | Une composante des conflits environnementaux : la querelle de légitimité[END_REF]. Au cours des conflits liés à la gestion des ENPs, les acteurs sont dans une quête de légitimité qui se déploie dans de multiples dimensions [START_REF] Gauchon | Une composante des conflits environnementaux : la querelle de légitimité[END_REF] et peut avoir différentes sources qui coexistent de manière généralement complexe et changeante [START_REF] Arpin | Seeking legitimacy in European biodiversity conservation policies: The case of French national parks[END_REF]. [START_REF] Meinard | What is a legitimate conservation policy[END_REF] propose une analyse de la légitimité des actions et des politiques de conservation particulièrement pertinente pour notre analyse, car elle a été développée à partir d'études de cas dans le domaine de la gestion d'ENP. Chez [START_REF] Meinard | What is a legitimate conservation policy[END_REF], la légitimité fait référence à la volonté continue, manifestée par les gestionnaires, de justifier leurs actions de conservation. Dans cette approche, la légitimité n'est pas une caractéristique innée des actions institutionnelles, mais le résultat de pratiques de légitimation [START_REF] Sikor | Access and property: A Question of Power and Authority[END_REF], par exemple l'ouverture aux débats et aux négociations.

Ces critères fournissent un cadre d'évaluation des politiques de conservation plus pertinent qu'une analyse quantitative, car chaque critère est étayé par une large littérature. En effet, C1 est une reformulation, plus générale, de l'ambition des approches quantitatives, que les autres critères viennent complémenter. C2 représente l'« impératif scientifique » [START_REF] Granjou | Un "impératif scientifique" pour l'action publique ? Analyse d'une compétition pour l'expertise environnementale[END_REF] qui anime l'exigence de combler le fossé entre connaissance et action dans le domaine de la conservation [START_REF] Roux | Bridging the Science-Management Divide: Moving from Unidirectional Knowledge Transfer to Knowledge Interfacing and Sharing[END_REF][START_REF] Knight | Knowing But Not Doing: Selecting Priority Conservation Areas and the Research-Implementation Gap[END_REF][START_REF] Arlettaz | From Publications to Public Actions: When Conservation Biologists Bridge the Gap between Research and Implementation[END_REF] Pour cette application, nous suivons la structure du Guide, qui présente l'élaboration des plans de gestion comme un travail en trois grandes étapes :

(1) l'état des lieux/diagnostic, qui permet d'identifier les enjeux de la gestion du site ;

(2) la définition des objectifs à long terme (OLT) puis opérationnels (OO), que le plan d'action a vocation à permettre d'atteindre ;

(3) l'évaluation, qui vise à rendre compte, sur la base d'indicateurs, des résultats des actions de gestion mises en oeuvre dans le plan de gestion (PG).

Nous schématisons ces concepts, ainsi que les liens qui les unissent dans la Figure 1 Ainsi, le Guide recommande que le critère de sensibilité soit évalué sur la base des listes rouges de l'UICN2 et d'autres sources auxquelles il est implicitement fait référence, comme les livres rouges3 , ou les listes d'espèces et habitats déterminants ZNIEFF4 . Le Guide présente ces listes comme des sources dont la pertinence et la fiabilité sont incontestables. Ce faisant, le Guide manque de bases scientifiques (C2), car il ignore la vaste littérature montrant que, malgré la qualité des travaux naturalistes et scientifiques sur lesquels ces listes sont basées, et malgré l'utilité des bases de référence communes qu'elles fournissent pour comparer différents sites, nombre d'entre elles comportent des biais d'échantillonnage géographiques et taxonomiques ou reposent sur des données obsolètes [START_REF] Yang | Geographical sampling bias in a large distributional database and its effects on species richness-environment models[END_REF][START_REF] Meyer | Global priorities for an effective information basis of biodiversity distributions[END_REF][START_REF] Mcrae | The Diversity-Weighted Living Planet Index: Controlling for Taxonomic Bias in a Global Biodiversity Indicator[END_REF][START_REF] Jarić | Procrustean beds and empty boxes: On the magic of creating environmental data[END_REF]. De plus, ces listes peuvent même, dans certains cas, être manipulées, comme l'illustrent les cas de retraits de certaines espèces sous pression politique (Braverman, 2016a[START_REF] Braverman | Anticipating Endangerment: The Biopolitics of Threatened Species Lists[END_REF]Endangered Species Coalition, 2017). La prise en compte rigoureuse de ces limites est centrale lorsqu'on utilise de telles listes pour élaborer des actions et des stratégies de gestion robustes et transparentes. Par son manque de bases scientifiques en la matière, le Guide risque ainsi d'encourager une utilisation « aveugle » de ces listes, ignorant les incertitudes et les biais.

En ce qui concerne l'évaluation du rôle fonctionnel, le Guide part du principe que celle-ci doit être réalisée sur le terrain par les gestionnaires ou les experts naturalistes. Ce postulat représente un décalage avec la littérature scientifique (C2). En effet, celle-ci souligne que réaliser de telles analyses sur le terrain présente de nombreuses difficultés pratiques [START_REF] Pe'er | Towards a different attitude to uncertainty[END_REF][START_REF] Jarić | Procrustean beds and empty boxes: On the magic of creating environmental data[END_REF], et que les experts de terrain ne peuvent souvent pas s'appuyer pour cela sur la littérature scientifique [START_REF] Jeanmougin | Mismatch between Habitat Science and Habitat Directive: Lessons from the French (Counter) Example: Evaluating the European habitat policy[END_REF][START_REF] Troudet | Taxonomic bias in biodiversity data and societal preferences[END_REF][START_REF] Sutherland | Building a tool to overcome barriers in research-implementation spaces: The Conservation Evidence database[END_REF].

Le troisième et dernier critère est la représentativité de l'ENP pour le patrimoine naturel de la zone. Le Guide rappelle que ce critère permet de pointer des spécificités locales, sources d'unicité en termes de répartition d'espèces ou d'habitats. Cependant, de nouvelles faiblesses de bases scientifiques (C2) sont ici révélées par l'absence de toute mention des difficultés à évaluer la représentativité de l'ENP en raison du manque de données dans les inventaires [START_REF] Fedorov | Identifying Highly Diverse Areas of Rare Plant Species as a Basis for Assessing Representativeness and Improving the Network of Protected Areas[END_REF], qui expliquent que la littérature scientifique considère l'évaluation de la représentativité comme un défi mondial majeur [START_REF] Hazen | Unnatural Selection: An Analysis of the Ecological Representativeness of Natural World Heritage Sites[END_REF]. Par ailleurs, le Guide ne discute pas des procédures d'évaluation de la représentativité, négligeant ainsi une vaste littérature [START_REF] Mingarro | Environmental representativeness and the role of emitter and recipient areas in the future trajectory of a protected area under climate change[END_REF][START_REF] Fedorov | Identifying Highly Diverse Areas of Rare Plant Species as a Basis for Assessing Representativeness and Improving the Network of Protected Areas[END_REF][START_REF] Milla-Figueras | Evaluating seabed habitat representativeness across a diverse set of marine protected areas on the Mid-Atlantic Ridge[END_REF], pourtant pertinente au plan opérationnel (C3). De plus, le Guide ne mentionne pas la complexité de la notion de « patrimoine naturel », qui peut faire l'objet de divergences, voire de conflits, entre des acteurs ayant des perceptions et des interprétations différentes des valeurs liées à la nature [START_REF] Bénos | Conservation, valorisation, labellisation : La mise en patrimoine des hauts-lieux pyrénéens et les recompositions de l'action territoriale[END_REF][START_REF] De Cacqueray | Le patrimoine, un élement fédérateur pour la gouvernance des espaces protégés ? L'exemple du marais de Brouage (Charente-Maritime)[END_REF][START_REF] Laslaz | Colloques et documents : comptes rendus[END_REF]. Cette absence révèle également des faiblesses dans les bases scientifiques (C2) qui peuvent avoir un impact sur l'opérationnalité (C3) et la légitimité (C4 [START_REF] Barthod | Bilan de dix ans de débats passionnés sur la gouvernance des espaces naturels protégés en France[END_REF][START_REF] Depraz | Géographie des espaces naturels protégés[END_REF][START_REF] Cosson | Dynamiques d'intégration des espaces naturels protégés en France : Une approche comparative entre parcs nationaux et réserves naturelles[END_REF][START_REF] Ronsin | Composer des relations entre "science" et "gestion de la nature" : ethnographie des frontières, casquettes et controverses dans les conseils scientifiques[END_REF]. La prise en compte de ces leviers d'action est primordiale au niveau opérationnel (C3) pour élaborer un plan de gestion pertinent.

T2 Définition des objectifs

Les étapes suivantes de la démarche proposée par le Guide sont consacrées à la définition des objectifs. Le Guide distingue les objectifs à long terme des objectifs opérationnels. Les premiers sont définis comme « l'état ou la fonctionnalité souhaitée par rapport à la situation actuelle de l'enjeu, qui doivent être visés afin de préserver cet enjeu » (AFB, 2017). Une bonne raison de définir les objectifs comme des « états » est que cette approche permet d'évaluer l'atteinte des objectifs. La définition des objectifs à long terme comme des états souhaités peut donc être comprise comme l'expression d'une volonté de pouvoir évaluer les résultats des plans de gestion. Une telle approche est largement encouragée dans la littérature en biologie de la conservation (voire par exemple [START_REF] Ferraro | Money for Nothing? A Call for Empirical Evaluation of Biodiversity Conservation Investments[END_REF], ce qui révèle de solides bases scientifiques en la matière (C2). Une définition des objectifs opérationnels comme états à atteindre sur la période de 3 à 5 ans qui leur est associée serait cohérente avec cette logique, ainsi qu'avec la littérature sur la gestion adaptative, puisque cela permettrait aux gestionnaires d'ajuster les actions de gestion au fur et à mesure du déroulement du plan de gestion [START_REF] Holling | Surprise for Science, Resilience for Ecosystems, and Incentives for People[END_REF][START_REF] Apitz | Adaptive management principles and sediment management[END_REF][START_REF] Bennett | Conservation social science: Understanding and integrating human dimensions to improve conservation[END_REF][START_REF] Sendzimir | Adaptive Management of Riverine Socio-ecological Systems[END_REF]. Cependant, lorsqu'il s'agit des objectifs opérationnels, le Guide prend ses distances vis-à-vis de la littérature scientifique (C2) en abandonnant la logique de la formulation des objectifs comme des états, et en proposant plutôt de les définir sur la base des « facteurs d'influence ». Ces derniers sont définis par le Guide comme les facteurs naturels et anthropiques qui influencent directement ou indirectement l'existence, l'état et l'évolution des enjeux5 . Le Guide ne décrit pas la manière dont l'analyse de ces facteurs doit être effectuée, ce Le traitement de l'étape de définition des objectifs pèche par ailleurs par la superficialité de son traitement des questions relatives à la gestion des conflits [START_REF] Laslaz | Autour de la nouvelle loi sur les Parcs nationaux français : enjeux et conflits[END_REF][START_REF] Gauchon | Une composante des conflits environnementaux : la querelle de légitimité[END_REF][START_REF] Arpin | The rise of planning in nature conservation and the practitioners' approach to conflicts. The inspiring case of the Northern French Alps nature reserves[END_REF][START_REF] Seijo | Conflicting Frames about Ownership and Land Use Drive Wildfire Ignitions in a Protected Conservation Area[END_REF], qui peuvent davantage concerner les actions définies que les objectifs de conservation [START_REF] Cadoret | Les conflits, freins et leviers pour l'ancrage territorial des aires marines protégées : Une analyse comparative internationale[END_REF]. Le Guide promeut une approche des conflits selon laquelle ceux-ci doivent être résolus en élaborant des consensus [START_REF] Arpin | The rise of planning in nature conservation and the practitioners' approach to conflicts. The inspiring case of the Northern French Alps nature reserves[END_REF]. Ce faisant, le Guide ignore les nombreuses contributions scientifiques (C1) qui soulignent que la recherche du consensus peut (1) réduire à néant la possibilité de débattre de positions différentes sans recourir à la violence ; (2) empêcher une analyse approfondie des conflits et (3) cacher l'hégémonie de certains acteurs [START_REF] Mouffe | On the political[END_REF][START_REF] Arpin | The rise of planning in nature conservation and the practitioners' approach to conflicts. The inspiring case of the Northern French Alps nature reserves[END_REF], dirimante au plan de la légitimité (C4).

T2 Suivi et évaluation

L'évaluation a pour but d'analyser les résultats de la gestion des ENPs et d'en tirer des leçons. Ces résultats sont influencés par de nombreux facteurs qui peuvent être à la fois écologiques et humains, ces derniers incluant les ressources budgétaires, le soutien plus ou moins marqué des différentes parties prenantes, les leviers d'action managériaux et les éventuels conflits internes [START_REF] Santos | Assessment of the management in Brazilian Marine Extractive Reserves[END_REF]. Ainsi, même si le gestionnaire déploie de grands efforts pour atteindre certains objectifs, combinés aux efforts des autres parties prenantes, il est possible que les résultats ne soient pas à la hauteur des attentes, en raison de facteurs échappant à son contrôle direct. L'évaluation peut donc donner des résultats trompeurs si elle ne fait pas la distinction entre les résultats de son travail en soi et l'influence de facteurs externes (GERECO, 2018). Malgré l'importance de cette distinction, le Guide la passe sous silence (C2). Le Guide manque également de bases scientifiques (C2) en matière de gestion adaptative. En effet, bien qu'il souligne l'importance de développer des stratégies de gestion adaptatives, il ne considère pas les processus proposés dans la littérature scientifique pour les mener à bien. Par exemple, lors de la présentation des évaluations annuelles et à mi-parcours, il indique que les moyens d'action peuvent être réalignés, mais pas les actions elles-mêmes. Cela va à l'encontre des principes de la gestion adaptative, qui préconisent d'adapter les actions de gestion (et les moyens de les réaliser) tout au long du cycle de gestion [START_REF] Sendzimir | Adaptive Management of Riverine Socio-ecological Systems[END_REF]. En effet, la mise en oeuvre de la gestion adaptative nécessite une flexibilité et une adaptation permanentes des pratiques, ainsi que des collaborations entre experts, scientifiques et gestionnaires, pour communautaire » ; « Réduire les pressions exercées par les activités nautiques dans les zones récifales sensibles ».

permettre un apprentissage mutuel [START_REF] Folke | Adaptive governance of socio-écological systems[END_REF][START_REF] Bormann | Adaptive Management of Forest Ecosystems: Did Some Rubber Hit the Road?[END_REF][START_REF] Ananda | Collaborative approaches to water management and planning: An institutional perspective[END_REF]. Un autre problème relatif aux bases scientifiques (C2) apparaît dans la manière dont le Guide traite des indicateurs. En effet, bien qu'il souligne l'importance des indicateurs dans l'évaluation, il ne fournit pas d'explications sur la manière dont les gestionnaires doivent choisir et construire les indicateurs, alors même que la littérature scientifique souligne largement la complexité de ces tâches [START_REF] Bouyssou | Evaluation and Decision Models. A Critical Perspective[END_REF][START_REF] Hallam | Measuring impacts on species with models and metrics of varying ecological and computational complexity[END_REF]. Cette lacune est particulièrement marquée dans le cas des indicateurs socioéconomiques, puisque les exemples et les explications fournis par le Guide sont exclusivement axés sur les aspects écologiques, sans aucune explication.

T1 Leçons constructives à tirer de l'évaluation du Guide pour améliorer les outils de gestion L'application de notre cadre d'évaluation nous a permis d'identifier des faiblesses concernant les fondements scientifiques (C2), l'opérationnalité (C3) et la légitimité (C4) des préconisations du Guide. Dans cette section, nous montrons que ces faiblesses sont révélatrices du fait que le Guide se limite à une vision qui nous semble relativement superficielle de la participation des porteurs d'enjeux. Pour cela, notre démonstration se déploiera en deux temps. Nous montrerons dans un premier temps que tous les problèmes pointés dans la section précédente peuvent être résolus au moyen de dispositifs participatifs. Cependant, ainsi que nous le montrerons dans un second temps, le Guide ne fournit pas les moyens de s'assurer de la résolution effective de ces problèmes, faute de spécifier des modalités idoines de mise en oeuvre de la participation.

T2 Potentiel des approches participatives pour résoudre les problèmes identifiés

Le principe selon lequel les stratégies de gestion doivent faire l'objet d'une décision partagée par les parties prenantes dans le cadre de processus participatifs est largement accepté tant par les pouvoirs publics (voir par exemple la Stratégie nationale pour les aires protégées 2030, ministère de la Transition écologique, 2021) que par la littérature scientifique [START_REF] Arnstein | A ladder of citizen participation[END_REF][START_REF] Depraz | Géographie des espaces naturels protégés[END_REF][START_REF] Bergandi | De la protection de la nature au développement durable : Genèse d'un oxymore éthique et politique[END_REF][START_REF] García-Montes | Metodologías participativas para la planificación de la sostenibilidad ambiental local[END_REF][START_REF] Osorio | Mise en oeuvre d'un processus de « participation contre-argumentative » dans la gestion et la restauration des milieux fluviaux : retour d'expérience dans une Réserve Naturelle Nationale rhénane[END_REF]. Le déploiement d'une telle démarche participative a le potentiel pour résoudre les différents problèmes révélés par notre évaluation du Guide, en mobilisant les trois grandes étapes structurant le Guide et l'évaluation que nous en avons proposée (Tableau 1).

En effet, pendant l'étape de diagnostic, des approches participatives peuvent permettre d'intégrer différents points de vue sur les valeurs associées à l'ENP et d'apporter des idées innovantes, tout en renforçant la légitimité de la démarche de gestion (AERMC et IRSTEA, 2017 ;[START_REF] García-Montes | Metodologías participativas para la planificación de la sostenibilidad ambiental local[END_REF]. L'inclusion de différentes parties prenantes peut aider les gestionnaires à identifier les lacunes de connaissances et les incertitudes qui peuvent impacter la gestion [START_REF] Hockings | Evaluating management of protected areas: Integrating planning and evaluation[END_REF]The Nature Conservancy, 2007). Lors de la définition des objectifs de gestion, des processus participatifs peuvent permettre aux parties prenantes de construire une vision commune de l'avenir de l'ENP en s'appropriant la stratégie de gestion. Ces parties prenantes peuvent également contribuer à l'analyse des facteurs d'influence, par exemple par le biais d'ateliers de cartographie mentale (AERMC et IRSTEA, 2017) représentant les liens entre les problèmes existants dans le site et les facteurs qui pourraient les aggraver ou contribuer à leur solution.

Enfin, concernant l'évaluation, une démarche participative permettrait de construire des indicateurs avec la contribution des parties prenantes et donc de représenter une pluralité d'intérêts et de valeurs [START_REF] Bouleau | Ce que nous apprend l'histoire des indicateurs environnementaux[END_REF]. Cela favoriserait également l'acquisition des nouvelles connaissances (TNC, 2007) en impliquant, par exemple, le grand public dans la réalisation des inventaires, et cela renforcerait la compréhension [START_REF] Hockings | Évaluation de l'efficacité : Un cadre pour l'évaluation de l'efficacité de la gestion des aires protégées 2ème édition[END_REF] et la légitimité de la gestion de l'ENP.

Tableau 1. Potentiel de la participation pour résoudre les problèmes identifiés dans le Guide. Chaque ligne reprend un des problèmes identifiés dans notre évaluation (colonne 1). Le principe général de résolution de chacun de ces problèmes est formulé dans la colonne 2. L'implication et les discussions avec des chercheurs en écologie et des experts de terrain expérimentés permettraient de pointer les limites du dire d'expert en matière de fonctionnement écologique et d'apporter des connaissances sur ce sujet et l'évaluation des milieux.

Problèmes identifiés

Le Guide ne prend pas en compte les problématiques d'agrégation des critères pour l'estimation de la responsabilité.

Les échanges avec des porteurs de connaissances peuvent permettre d'identifier les problématiques d'agrégation.

Le Guide néglige la complexité des prérogatives, compétences, droits et moyens du gestionnaire et de ses partenaires (« responsabilité » au sens de la responsabilité environnementale). L'organisation d'ateliers participatifs permettrait l'identification collective des acteurs et de leurs responsabilités.

Définition des objectifs

Les méthodes à déployer pour l'identification et l'analyse des facteurs d'influence sont insuffisamment décrites. L'identification et l'analyse des facteurs d'influence peuvent s'appuyer sur une analyse collective, dans le cadre d'étaliers participatifs, des opportunités, des menaces et des pressions sur les enjeux, ainsi que des leviers d'action des parties prenantes. Le Guide ne prend pas suffisamment en compte la gestion adaptative.

L'implication et les discussions avec des porteurs de connaissances d'horizons divers (scientifiques, membres d'associations naturalistes, différents types d'usagers, et cetera), dans le cadre de dispositifs participatifs récurrents, permettraient de faire émerger des idées innovantes et des données actualisées sur le site. Le Guide ne préconise aucune méthode de consultation pour la définition et/ou validation des objectifs.

La définition et la validation collective des objectifs permettraient aux parties prenantes de se les approprier, en les ajustant jusqu'à ce que des formulations recueillant l'assentiment de toutes les parties prenantes soient atteintes. [START_REF] Paletto | Social Network Analysis to Support Stakeholder Analysis in Participatory Forest Planning[END_REF] ; l'inclusion de parties prenantes non gestionnaires dans les approches de gestion peut, dans certaines conditions, conférer un pouvoir de nuisance aux parties prenantes qui n'ont pas de compétences de gestion, ou qui auraient un intérêt à saboter la démarche de gestion ; il existe un risque de manipulation des processus participatifs qui pourrait aboutir à la reproduction ou au renforcement des relations de pouvoir inégales et à l'imposition de certaines formes de savoir [START_REF] Turnhout | The politics of co-production: participation, power, and transformation[END_REF][START_REF] Blondiaux | Le participatif en actes : quel avenir pour l'injonction à la participation ?[END_REF] ; le processus peut également être instrumentalisé par certains acteurs pour étouffer des conflits et faire accepter subrepticement des propositions contestables [START_REF] Hassenforder | Enjeux et pluralité de la participation dans la gestion intégrée des ressources en eau[END_REF] ; sous certaines formes, elle pourrait favoriser l'affaiblissement des groupes organisés via l'individualisation de l'expression [START_REF] Blondiaux | Le participatif en actes : quel avenir pour l'injonction à la participation ?[END_REF] ; et elle peut également rencontrer des difficultés pour constituer et fidéliser les participants, ce qui peut conduire dans certains cas à des processus participatifs sans public [START_REF] Blatrix | La démocratie participative en représentation: Sociétés contemporaines[END_REF] et al., 2013 ;Álvarez Fernández et al., 2020a). Dans les rares occasions où des processus participatifs liés à la gestion/restauration des ENPs sont déployés, les parties prenantes ne sont intégrées ni au début [START_REF] Kovács | Evaluation of participatory planning: Lessons from Hungarian Natura 2000 management planning processes[END_REF] ni au cours du processus (Álvarez Fernández, 2020a).

Suivi

Pour consolider les processus participatifs qui pèchent dans toutes ces situations, un renforcement des guides méthodologiques selon les directions que nous préconisons dans le cas du Guide pourrait jouer un rôle crucial. Afin de cerner précisément la portée de ce travail, il importe également de prendre en compte plusieurs critiques qui pourraient lui être adressées. Le cadre « analytique politique », dont nous sommes partis en en soulignant la pertinence, a été discuté dans la littérature, en particulier du fait du caractère général ou abstrait des critères qui le composent, et diverses tentatives ont été développées pour l'améliorer [START_REF] Meinard | What is Policy Analytics? An Exploration of 5 Years of Environmental Management Applications[END_REF] Cette critique ne nous semble pas fondée, dans la mesure où notre recommandation principale n'est pas de renforcer directement le contenu scientifique du Guide, mais plutôt d'encourager la mise en oeuvre de processus participatifs dont il est attendu que ce soient eux qui opèrent, au cas par cas, les renforcements scientifiques pertinents. Cependant, il reste à voir, à l'épreuve du terrain, si un Guide renforcé selon les lignes de force que nous préconisons resterait accessible et compréhensible pour les acteurs qui en ont l'usage. À un plan conceptuel plus fondamental, l'ancrage de nos recommandations dans une vision positive de la participation peut être discutée sur la base de la vaste littérature pointant les effets pervers des dispositifs participatifs [START_REF] Paletto | Social Network Analysis to Support Stakeholder Analysis in Participatory Forest Planning[END_REF][START_REF] Hassenforder | Enjeux et pluralité de la participation dans la gestion intégrée des ressources en eau[END_REF][START_REF] Turnhout | The politics of co-production: participation, power, and transformation[END_REF][START_REF] Blondiaux | Le participatif en actes : quel avenir pour l'injonction à la participation ?[END_REF]. Dans notre optique, ces effets pervers ne sont pas un trait essentiel de toute démarche participative, mais plutôt des manifestations d'une mauvaise application de méthodes participatives, et les précautions dont nous pointons plus haut la nécessité pour une bonne application des démarches participatives nous semblent suffisantes pour prémunir la survenue de tels effets pervers. Seules des études empiriques, qui dépassent largement les ambitions de cet article, peuvent permettre de valider ou invalider le bienfondé de cette hypothèse.

De vastes chantiers de recherche sont ainsi ouverts par cette première étude, dont les conclusions doivent être comprises au prisme de leurs limites.

T1

  Application des critères d'évaluation aux trois étapes structurant le Guide T2 Définition des enjeuxSelon le Guide, cette première étape de l'élaboration d'un plan de gestion vise à identifier les « responsabilités » du site. Le Guide indique que cette identification doit s'effectuer en analysant la liste des espèces, des habitats ou des objets géologiques présentant une importance environnementale particulière pour le site. Cette analyse est censée se baser sur trois critères : la sensibilité écologique du patrimoine naturel, le rôle fonctionnel du site et la représentativité de l'ENP pour le patrimoine naturel de la zone. Le Guide présente ces critères comme indiscutables, et suppose que les renseigner est une tâche de routine pour laquelle les experts disposent des compétences et de l'accès aux données pertinentes.

T1 Structure de l'évaluation du Guide Dans cette partie, nous appliquons au Guide les critères du cadre évaluatif présenté ci-dessus.

	. C3 est une
	exigence pragmatique dont la justification nous semble difficilement discutable. Enfin, C4 est
	largement reconnu comme un élément crucial de la gestion durable à long terme des ENPs
	(Piwowarczyk et Wróbel, 2016).
	Pour l'évaluation du Guide, parmi les quatre critères C1 à C4 utilisés par Jeanmougin et al.
	(2017), nous nous focaliserons sur les trois derniers, pour une raison pragmatique : évaluer le
	Guide en utilisant le critère C1 demanderait de comparer les résultats obtenus par des actions
	de conservation basées sur le Guide avec des actions de conservation qui ne le sont pas.
	Toutefois, comme le Guide n'a été publié que récemment, les actions de conservation reposant
	sur ses recommandations n'en sont qu'à leurs débuts, et les preuves de sa possible contribution
	n'apparaîtront pas avant plusieurs années. En effet, la plupart des plans de gestion ont une durée
	de 5 ans, voire de 10 ans, et le processus de construction d'un plan de gestion prend souvent au
	moins un an. De plus, l'évaluation des résultats elle-même prend du temps, en particulier quand
	ceux-ci concernent l'état de populations d'espèces-cibles ou d'habitats-cibles : typiquement au
	moins une saison de végétation, soit un an minimum. Par conséquent, au mieux, les premiers
	retours d'expérience sur la plus-value du Guide n'apparaîtront pas avant 2024, voire 2029. Cette
	limitation inévitable de preuves ne doit cependant pas bloquer des initiatives comme la nôtre
	pour évaluer cet outil dans l'intervalle, en vue de suggérer des améliorations.

  ). Au-delà des difficultés et des angles morts liés à l'analyse de la sensibilité, du rôle fonctionnel et de la représentativité, le Guide ignore la manière dont ces différents critères doivent être agrégés pour identifier les responsabilités. Le Guide indique que la représentativité ou le rôle fonctionnel peuvent chacun suffire à constituer un enjeu, mais que la sensibilité seule ne suffit pas. Il suppose donc une méthode d'agrégation non compensatoire entre ces trois critères, dont la pertinence n'est pas étayée et dont les propriétés ne sont ni explorées ni données explicitement. Il néglige la vaste littérature (C2) démontrant que, sur la base des mêmes valeurs pour les différents critères, différentes procédures d'agrégation peuvent produire des résultats profondément différents (voir par exemple les étudesde Schwartz et al., 2017 et de Choulak et al., 2019).Par ailleurs, le sens même que le Guide donne au terme responsabilité révèle un déficit d'opérationnalité (C3). Le concept de responsabilité est généralement défini comme « l'obligation faite à une personne de répondre de ses actes du fait du rôle, des charges qu'elle doit assumer et d'en supporter toutes les conséquences » (CNRTL, 2012). Dans cette définition, la notion de « responsabilité » renvoie ipso facto aux acteurs ou agents « responsables ». Le concept de responsabilité compris dans ce sens habituel est évidemment pertinent pour élaborer des stratégies et des plans d'actions de conservation, et il joue un rôle clé dans de nombreux documents normatifs internationaux, comme la directive européenne 2004/35/CE sur la responsabilité en matière de dommages environnementaux. À rebours de cet usage de la notion de responsabilité, le Guide ne prend pas en compte le rôle des acteurs responsables, et définit la responsabilité en parlant uniquement de « responsabilité du site », qui fait référence à l'importance du site pour la conservation de l'enjeu concerné à différentes échelles. Cette conception inhabituelle de la responsabilité apparaît également dans la manière dont le guide aborde le concept d'enjeu, qu'il définit comme ce qui peut être gagné ou perdu sur le site. Une telle définition néglige le fait que ce qui peut être gagné ou perdu dépend des leviers d'action dont disposent le gestionnaire et les autres acteurs avec lesquels il interagit lors du déploiement de la stratégie de gestion(GERECO, 2018). Ces leviers peuvent correspondre à des marges de manoeuvre spatiales, temporelles ou organisationnelles, telles que les réglementations environnementales et les ressources (humaines, techniques et financières) dont dispose le gestionnaire. En effet, les gestionnaires, les propriétaires fonciers, les organisations, mais aussi les collectivités locales, les institutions européennes, et cetera, disposent de prérogatives, de droits et devoirs et de ressources financières spécifiques, qui peuvent affecter le site de manières différentes, avec des implications majeures sur ce dont le gestionnaire peut raisonnablement être considéré comme responsable

  qui laisse en suspens un certain nombre de questions opérationnelles concernant leur application concrète (C3) : quelles sont les étapes à suivre et quels sont les critères à utiliser ? Comment classer ou hiérarchiser ces critères ? Au-delà de ces angles morts opérationnels, le choix de définir les objectifs opérationnels par des facteurs d'influence plutôt que par des résultats souhaités n'est ni justifié ni expliqué dans le Guide. Par conséquent, le lecteur en est réduit à spéculer sur les raisons qui ont pu motiver ce choix, ce qui entraîne une perte de légitimité (C4). Si l'on s'adonne à cet exercice spéculatif, on peut imaginer qu'une confusion entre facteurs d'influence et leviers d'action disponibles ait été à l'origine de l'idée de définir les objectifs opérationnels sur la base des facteurs d'influence. Promouvoir la définition des objectifs opérationnels sur la base des leviers d'actions disponibles aurait permis de renforcer l'opérationnalité (C3), mais au prix de l'abandon de la possibilité d'évaluer la réalisation des objectifs. Définir les objectifs opérationnels sur la base des facteurs d'influence induit la même perte de possibilité d'évaluation, mais sans gain d'opérationnalité, puisque certains facteurs d'influence majeurs, par exemple le changement climatique, sont hors de portée pour la plupart des gestionnaires.

Comment la participation pourrait les résoudre ?

		Selon le Guide, le diagnostic	L'organisation d'ateliers participatifs pour l'identification
		doit se focaliser exclusivement	collective des entités et thématiques qui comptent pour les
		sur les espèces de faune et flore	acteurs du territoire permettrait d'élargir le diagnostic par la
		et les habitats présentant un	prise en compte d'entités naturelles non patrimoniales et
		statut de patrimonialité.	d'interactions hommes/nature, matérialisées par exemple par
			les paysages ou les usages traditionnels.
		Le Guide ne préconise aucune	L'implication et les discussions avec des porteurs de
		précaution dans l'utilisation des	connaissances d'horizons divers (scientifiques, membres
		listes d'espèces et habitats de	d'associations naturalistes, différents types d'usagers, et
		référence.	cetera) permettraient de pointer les incertitudes affectant ces
			listes et les compléter le cas échéant. Ces discussions
			peuvent permettre également d'identifier et d'échanger
			autour des valeurs liées au site, aux espèces et aux habitats.
	Diagnostic	Le Guide passe sous silence la difficulté, voire l'impossibilité, pour des experts sur le terrain, d'appréhender le
		fonctionnement des
		écosystèmes.

renforcer dans le Guide pour permettre cette résolution participative

  Le Guide contient les rudiments d'un comblement de ses propres lacunes à cet égard, puisque l'idée de participation des acteurs à la démarche de gestion y est mentionnée à plusieurs reprises. Par exemple, lorsque le Guide évoque les facteurs clés d'une gestion réussie, il mentionne l'attachement au territoire, la perception du public, les outils pédagogiques associés et la gouvernance. De même, dans la Fiche 7 (AFB, 2017) « Comment associer les acteurs ? », qui a été construite essentiellement à partir du chapitre « Dialogue pour Natura 2000 »[START_REF] Souheil | Guide méthodologique d'élaboration des Documents d'objectifs Natura 2000[END_REF], le Guide mentionne le « dialogue territorial », la « concertation » et la « communication », qui renvoient tous trois à l'idée d'une implication des parties prenantes, et donc à la participation. Le Guide souligne même que toutes les parties prenantes devraient être impliquées, plus ou moins directement, dans la mise en oeuvre de la stratégie de gestion, et il suggère également que l'élaboration de la stratégie de gestion et sa mise en oeuvre sont des tâches collectives. Cependant, ces références à la participation restent toutes génériques, et ne s'accompagnent à aucun moment de préconisations concrètes, ni sur les modalités de mise en oeuvre des démarches participatives ni sur les précautions à prendre dans son déploiement. Cette mise en oeuvre n'a pourtant rien d'évident. Elle peut être complexe, car elle peut augmenter le temps et le coût du processus de gestion

		Le Guide néglige l'importance	L'implication et les discussions avec des porteurs de
	évaluation	du caractère évaluable des objectifs, ne cadre par le travail de choix des indicateurs et ne prend pas en compte le	connaissances d'horizons divers (scientifiques, membres d'associations naturalistes, différents types d'usagers, et cetera) pourraient : -contribuer à l'établissement d'objectifs évaluables,
	et	caractère adaptatif.	-permettre de construire des indicateurs pertinents,
			-permettre d'apporter des idées innovantes et des
			données actualisées, susceptibles d'être renouvelées
			au cours du cycle de gestion.
	T2 Points à

Portée et limites de l'évaluation et des recommandations formulées

  . Éviter de tels écueils demande que les démarches participatives soient finement définies, à l'appui d'analyses poussées des réseaux d'acteurs et des pouvoirs d'influence qui sont les leurs, et dans le cadre d'évènements participatifs orchestrés par des animateurs compétents, à même de choisir et mettre en oeuvre les méthodes les plus adaptées dans les différentes situations. Une synthèse de la littérature sur les méthodes participatives, leurs détails de mise en oeuvre, leurs forces, leurs faiblesses et leurs conditions d'applications, manque par conséquent dans le Guide. Manque également un ciblage précis des étapes de construction des plans de gestion au niveau desquelles la mise en oeuvre de ces méthodes est nécessaire, et une clarification des besoins auxquels la participation doit venir répondre à différentes étapes. Notre objet dans cet article n'est pas de produire extensivement les compléments nécessaires, mais simplement d'en souligner l'importance. La figure 2 pointe les étapes de l'élaboration des plans de gestion où la participation doit ainsi jouer un rôle clé (en vert).Figure2. Adaptation du schéma d'élaboration d'un plan de gestion (Figure1) pointant les étapes au niveau desquelles la participation doit jouer un rôle-clef (en vert). Cet article présente les résultats d'une évaluation du Cahier Technique N°88 (AFB, 2017), qui guide actuellement les gestionnaires des ENPs en France dans l'élaboration des plans de gestion. Cette évaluation, basée sur trois critères (les fondements scientifiques, l'opérationnalité et la légitimité), met en évidence de nombreuses faiblesses dans ce guide, qui sont susceptibles d'impacter négativement la gestion des ENPs à l'avenir. Nous montrons que ces faiblesses peuvent être résolues par le déploiement de démarches participatives, que le Guide mentionne rapidement, alors qu'il devrait leur accorder une importance majeure, en spécifiant les modalités de leur mise en oeuvre et les précautions à prendre pour les déployer. Par ce travail, nous espérons contribuer à l'amélioration du contenu méthodologique du Guide et apporter un éclairage utile pour les gestionnaires qui l'utilisent, pour les prestataires chargés par les gestionnaires d'établir des plans de gestion, ou encore pour les acteurs du financement de la gestion, comme les services déconcentrés de l'État ou les agences de l'eau, qui pourraient s'appuyer sur nos recommandations afin d'affiner les critères d'attribution des financements pour des démarches de gestion. Au-delà du Guide lui-même et de ses utilisateurs, nos recommandations ont une portée plus vaste. En effet, de nombreux guides du même type produits de par le monde avec une ambition similaire, par exemple en Argentine (Administración de Parques Nacionales, 2010) ou en Espagne (EUROPARC-España, 2008), voire à l'international (University of Cadiff etIUCN, 2003), mentionnent la nécessité de mener des démarches participatives, en négligeant d'en préciser les modalités. Cette négligence explique certainement, au moins en partie, le fait que, dans de nombreux cas, les décisions relatives aux ENPs sont prises sans tenir compte de l'avis des parties prenantes[START_REF] Piwowarczyk | Determinants of legitimate governance of marine Natura 2000 sites in a post-transition European Union country: A case study of Puck Bay, Poland[END_REF], et la gestion quotidienne est basée sur des approches descendantes (top-down) qui négligent leurs contributions potentielles(Marques

	T1

  . Des évaluations s'appuyant sur des versions affinées du cadre « analytique politique » permettraient certainement d'apporter des éclairages complémentaires aux nôtres. De même, d'autres cadres évaluatifs pourraient être mis à contribution. Dans une telle démarche, démultipliant les modalités d'évaluation, il serait en particulier intéressant de travailler, non plus seulement (comme nous l'avons fait) sur le Guide en tant que produit fini, mais également sur son processus d'élaboration, ainsi que sur son processus d'utilisation, dans différents contextes et par différents acteurs. Cette prise en compte des utilisations pratiques du Guide pourrait par ailleurs permettre d'affiner nos recommandations, en assurant que celles-ci ne soient ni trop exigeantes au regard des compétences mobilisables sur le terrain en termes de participation, ni trop lourdes à mettre en oeuvre au regard du temps et des ressources financières et humaines disponibles. Cette vision « par le terrain » est également indispensable afin d'assurer que la mise en oeuvre de nos recommandations n'achoppe pas sur les écueils rappelés plus haut, concernant les possibles manipulations et errances des démarches participatives. Par ailleurs, au niveau opérationnel, le regard scientifique que nous portons sur un document destiné à des acteurs de terrain peut sembler en décalage avec les objectifs et utilisations d'un tel document. On pourrait ainsi craindre que les exigences de scientificité que nous promouvons risquent de se traduire par une inflation de technicité scientifique rendant le Guide inutilisable.

Le Guide s'adresse en particulier aux gestionnaires des statuts d'ENP suivants : Réserve naturelle nationale (RNN), Réserve naturelle régionale (RNR), Réserve naturelles régionales et de Corse (RNC), Parcs naturels marins (PNM), Arrêtés de protection de biotope (APB ou APPB), Espace naturel sensible (ENS), sites des Conservatoires d'espaces naturels (CEN), sites du Conservatoire du littoral (CdL), Réserves nationales de chasse et de faune sauvage (RNCFS), Réserve de chasse et de faune sauvage (RCFS), RCFS de Corse, Réserves biologiques dirigées (RBD), Réserves biologiques intégrales (RBI), Sites sans statut (à vocation de conservation) et Natura

Pour plus d'informations, voir la section « Pourquoi rédiger un plan de gestion ? » du Guide, [en ligne], URL : http://ct88.espaces-naturels.fr/

Pour plus d'informations, voir le site de l'UICN [en ligne], URL : https://www.iucnredlist.org/

Pour plus d'informations, voir le site de l'UICN [en ligne], URL : https://www.iucn.org/resources/publications

Pour plus d'informations, voir les inventaires français des ZNIEFF [en ligne], URL : https://inpn.mnhn.fr/programme/inventaire-znieff/presentation

Le guide propose les exemples d'objectifs suivants : OLT : « Maintenir les potentialités d'accueil du fond de baie pour les oiseaux en hivernage et en halte migratoire » ; OO : « Limiter le piétinement des habitats dunaires d'intérêt

Remerciements

Nous remercions l'équipe de recherche de LIVE, ainsi que A-C. Vaissière, E. Hassenforder, A.Mangos et A. Richard pour leurs précieux commentaires, suggestions et corrections.


Wanqing Zhao

Pengyue Xu

Yixuan Ma

Yiming Song
email: ymsong@nwu.edu.cn

Yihang Wang

Panpan Zhang

Bin Li

Yongmin Zhang

Jianli Li

Shaoping Wu
email: wushaoping@nwu.edu.cn

Old trees bloom new flowers, lysosome targeted near-infrared fluorescent probe for ratiometric sensing of hypobromous acid in vitro and in vivo based on Nile red skeleton

Keywords: Near infrared, Fluorescent probe, HOBr, Lysosome, Bioimaging

Hypobromous acid (HOBr), one of the significant reactive oxygen species (ROS) that acts as an important role in human immune system, however the increasing level of HOBr in human body can cause the disorder of eosinophils (EPO), leading to oxidative stress in organelles, and further causing a series of diseases. In this study, a ratiometric fluorescent probe DMBP based on Nile red skeleton was developed to detect HOBr specifically by the electrophilic substitution with HOBr. DMBP emits near-infrared (NIR) fluorescence at 653 nm, after reacting with HOBr, the emission wavelength of DMBP shifted blue and a new peak appeared at 520 nm, realizing a ratiometric examination of HOBr with a limit of detection of 89.00 nM. Based on its sensitive and specific response to HOBr, DMBP was applied in the visual imaging of HOBr in HepG2 cells and zebrafish. Foremost, probe DMBP has excellent lysosome targeting ability and NIR emission reduced the background interference of biological tissues, providing a potential analytical tool to further investigate the role of HOBr in lysosome.

Introduction

Reactive oxygen species (ROS) are a class of oxygen-containing chemically reactive substances that are indispensable in cell signaling and maintenance of homeostasis in the body [START_REF] Antonucci | Mitochondrial reactive oxygen species in physiology and disease[END_REF][START_REF] Dai | Nanozymes for regulation of reactive oxygen species and disease therapy[END_REF][START_REF] Cheng | Reactive oxygen species and oxidative stress in vascular-related diseases[END_REF]. Hypobromic acid (HOBr) is one of the significant ROS which is generated by hydrogen peroxide and bromine ion catalyzed by eosinophils (EPO) in the human immune system [START_REF] Weiss | Brominating oxidants generated by human eosinophils[END_REF][START_REF] Wang | Role of eosinophil peroxidase in host defense and disease pathology[END_REF][START_REF] Suzuki | Effects of urea on the reactions of nucleosides with hypobromous acid[END_REF]. HOBr possesses strong oxidizing and halogenating capabilities and therefore participates in a host of biological processes in the human defense system, like anti-inflammation, sterilization and resistance to pathogen invasion [START_REF] Mccall | Bromine is an essential trace element for assembly of collagen IV scaffolds in tissue development and architecture[END_REF][START_REF] Suzuki | Reactions of rebamipide with hypobromous acid[END_REF]. However, the overexpression levels of HOBr in the body can lead to EPO disorders, which can result in oxidative stress in cellular organelles and further trigger a variety of physiopathological reactions, such as tissue injury, rheumatoid arthritis, cardiovascular diseases and cancers [START_REF] Yap | Chlorinative stress: An under appreciated mediator of neurodegeneration?[END_REF][START_REF] Gorrini | Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy[END_REF][START_REF] Brown | Hypohalous acids contribute to renal extracellular matrix damage in experimental diabetes[END_REF]. Therefore, the detection of HOBr level in vivo and vitro is crucial in clinical practice. In addition, lysosome is a main organell of ROS production, and participates in the above processes [START_REF] Kurz | Lysosomes and oxidative stress in aging and apoptosis[END_REF][START_REF] Dong | Water-soluble dual lysosome/mitochondriatargeted fluorescent probe for detection of SO 2 in water, food, herb, and live cells[END_REF], hence it is essential to detect the level of HOBr in lysosome to investigate its function in physiological processes [START_REF] Duan | Lysosome-targeted fluorescent probes: design mechanism and biological applications[END_REF]. However, there are relatively few methods to detect HOBr in lysosome, it is still a challenge to develop a novel method to monitor HOBr level in real time.

In recent years, fluorescent probe has rapidly entered the horizons of researchers due to its high sensitivity, good selectivity, real-time monitoring and non-invasive imaging, and has become an indispensable tool for monitoring small molecular substances in vivo and in vitro [START_REF] Guan | An NIR fluorescent/photoacoustic dual-mode probe of NADPH for tumor imaging[END_REF][START_REF] Li | A water-soluble and incubate-free fluorescent environment-sensitive probe for ultrafast visualization of protein thiols within living cells[END_REF][START_REF] Zhang | Kill three birds with one stone: mitochondria-localized tea saponin derived carbon dots with AIE properties for stable detection of HSA and extremely acidic pH[END_REF][START_REF] Feng | Molecular engineering of benzenesulfonyl analogs for visual hydrogen polysulfide fluorescent probes based on Nile red skeleton[END_REF][START_REF] Zhu | A reversible and ratiometric fluorescent probe based on rhodol derivative with an ESIPT unit for monitoring copper ion content and in situ evaluation of related drugs in cells[END_REF][START_REF] Bi | Design and synthesis of photoaffinity-based probes for labeling β-glucuronidase[END_REF]. At present, the specific detection of HOBr based on fluorescent probe still faces great challenge for two reasons: (i) the low level of HOBr in vivo (2.00~100.00 μM). (ii) the oxidation capacity of HOBr is much weaker than HOCl and is seriously susceptible to interference by other ROS [START_REF] Xu | A near-infrared reversible fluorescent probe for peroxynitrite and imaging of redox cycles in living cells[END_REF][START_REF] Wang | A near-infrared reversible and ratiometric fluorescent probe based on Se-BODIPY for the redox cycle mediated by hypobromous acid and hydrogen sulfide in living cells[END_REF].

Therefore, there are relatively few fluorescent probes reported for the detection of HOBr. Han group firstly reported two redox fluorescent probes mCy-TemOH and Cy-TemOH, which can achieve ratiometric and quenching detection of HOBr, respectively, developed a new strategie for the detection of HOBr [START_REF] Yu | Development of reversible fluorescence probes based on redox oxoammonium cation for hypobromous acid detection in living cells[END_REF]. Kim group designed a BODIPY-based J-aggregating probe and utilized its electrophilic bromination to achieve the selective detection of HOBr generated by EPO [START_REF] Kim | Selective monitoring and imaging of eosinophil peroxidase activity with a J-aggregating probe[END_REF], which was a pioneering work for the detection of HOBr by electrophilic substitution strategy.

Overall, there are three detection mechanisms of fluorescent probe reported for HOBr detection [START_REF] Zhang | Advances in organic fluorescent probes for bromide ions, hypobromous acid and related eosinophil peroxidase-A review[END_REF]: (i) oxidation reaction caused by HOBr as a strong oxidant [START_REF] Huo | A novel fluorescent probe for highly selective and sensitive detection of hypobromous acid in arthritis model mice[END_REF], (ii) HOBr-catalyzed coupling cyclization of amino groups with sulfur-methyl group [START_REF] Jia | A highly selective ratiometric fluorescence probe for bioimaging of hypobromous acid in living cells and zebrafish[END_REF],

(iii) electrophilic substitution reaction of HOBr and small molecular compounds [START_REF] Wu | Bromination-induced spirocyclization of rhodamine dyes affording a FRET-based ratiometric fluorescent probe for visualization of hypobromous acid (HOBr) in live cells and zebrafish[END_REF][START_REF] Zhu | In situ observation of lysosomal hypobromous acid fluctuations in the brain of mice with depression phenotypes by two-photon fluorescence imaging[END_REF]. These sensing strategies were applied to design HOBr fluorescent probes based on various fluorophores. In fact, in previous studies, the electrophilic halogenation of HOBr to electron-rich aromatic substrates showed stronger response than ClO - [START_REF] Pattison | Kinetic Analysis of the reactions of hypobromous acid with protein components: implications for cellular damage and use of 3-bromotyrosine as a marker of oxidative stress[END_REF][START_REF] Ximenes | Hypobromous acid, a powerful endogenous electrophile: experimental and theoretical studies[END_REF], and thus highly electrophilic properties of HOBr could be exploited to design its specific fluorescent probe.

Nevertheless, most of the HOBr fluorescent probes built on the aromatic bromination strategy were signal-off type owning to the intramolecular heavy atom impact [START_REF] Zhang | Advances in organic fluorescent probes for bromide ions, hypobromous acid and related eosinophil peroxidase-A review[END_REF] (Fig. 1A), and such probes are unattractive for the detection of HOBr, thus we are committed to finding a fluorophore with excellent properties to solve this problem. Fortunately, in this paper, we found that nile red would not be quenched by HOBr, on the contrary, the bromination could cause a ratiometric change in fluorescence properties of nile red to realize a ratiometric detection of HOBr. This discovery opens up a new idea for researchers to subsequently develop promising HOBr fluorescent probes.

In this work, we developed a NIR fluorescence probe DMBP built on nile red skeleton (Fig. 1B). DMBP has an electron donor N, N-diethyl and receptor carbonyl that form ICT effect, which dominated the intense red fluorescence, and has a specific site for the detection of HOBr through electrophilic substitution reaction, which changed the optical properties of DMBP. Probe DMBP emits strong red fluorescence (653 nm) at prime, then the emission wavelength shifts to 520 nm after the addition of HOBr, achieving a ratiometric fluorescence response to HOBr. Moreover, probe DMBP has excellent selectivity and has been applied for visual imaging of HOBr in cells and zebrafish. Furthermore, DMBP can localize to lysosomes and realize the ratio detection of HOBr in lysosomes.

Experimental Section

Materials and Instruments

All solvents in the experiments were of analytical grade, water was treated by an ultra-water purification system, chemical reagents were purchased from Energy Chemical, and Lyso-Tracker Green was purchased from Beyotime Biotechnology.

Fluorescence spectra were obtained by F-7000 fluorescence spectrophotometer and ultraviolet spectra were acquired from UV-1880 UV-Visible spectrophotometer.

Confocal images were performed with a Leica TCS SP8 laser confocal microscope.

The MS and NMR data were obtained by MicroTOF QII mass spectrometer and 6001541ASP superconducting NMR instrument, respectively. Liquid chromatogram was obtained by LC-2030Plus high performance liquid chromatography system.

Synthesis of DMBP

Detailed synthesis method was described in Supporting Information (Scheme S1), and the structure of DMBP was determined by MS (Fig. S4), 1 H NMR (Fig. S6) and 13 C NMR (Fig. S7).

Spectral measurement

Transferred 11.5 mg DMBP into a 25.00 mL volumetric bottle, and fixed it with DMSO to prepare the reserve solution, then 50.00 μL of DMBP (1.00 mmol/L), ion solutions, 1.00 mL of DMSO and 1.00 mL of PBS solution were added to the colorimetric tube in order, then fixed with deionized water to 5.00 mL. The excitation and emission slit widths of the fluorescence spectra were 5 nm and 10 nm respectively, and the voltage was 700 V. The ion solutions used in the experiments were prepared ready-to-use, and the detailed preparation methods were described in Supporting Information. All optical spectra were scanned at room temperature.

Cell imaging experiment

Cell imaging experiments were performed with HepG2 cells. Firstly, the cytotoxicity of probe DMBP was detected by MTT assay, and then the imaging experiment was carried out. Detailed experimental procedures were described in Supporting Information.

Zebrafish imaging experiment

All zebrafish used in the experiments were in accordance with international ethical guidelines, and the three-day fertilized AB genotype zebrafish was selected as the experimental model. Detailed experimental procedures were described in Supporting Information.

Results and Discussion

Design of probe DMBP

We aimed to construct a ratiometric sensing platform to detect HOBr in lysosome. Redox reaction has been considered as a feasible strategy for detecting ROS, however, it is difficult to be adopted to detect HOBr because HOBr has similar character, weaker oxidation capacity and lower concentration compared to ClO -in vivo [START_REF] Liu | Hypochlorous acid turn-on fluorescent probe based on oxidation of diphenyl selenide[END_REF][START_REF] Manjare | Selective and sensitive superoxide detection with a new diselenide-based molecular probe in living breast cancer cells[END_REF], which may cause non-negligible influence. Literatures reported that electrophilic halogenation of electron-rich aromatic substrates or olefins by HOBr shows stronger reactivity than ClO -. Mainly because Br -is formed as an intermediate in these reactions, compared with Cl -, Br -has lower electronegativity and higher polarizability, making it more receptive to positive charges, and thus HOBr exhibits higher electrophilicity [START_REF] Kim | Selective monitoring and imaging of eosinophil peroxidase activity with a J-aggregating probe[END_REF][START_REF] Hawkins | The role of aromatic amino acid axidation, protein unfolding, and aggregation in the hypobromous acid-induced inactivation of trypsin inhibitor and lysozyme[END_REF]. Therefore, the high electrophilic property of HOBr can be used to design its specific fluorescent probe. As a classical NIR fluorescent dye, nile red has excellent properties such as low background interference, deep tissue penetration and good photostability [START_REF] Peng | Nanobubble labeling and imaging with a solvatochromic fluorophore nile red[END_REF][START_REF] Sun | Derivatizing nile red fluorophores to quantify the heterogeneous polarity upon protein aggregation in the cell[END_REF][START_REF] Sun | Design, synthesis, and evaluation of nile red analogs for myelin imaging as near-infrared fluorescence probe[END_REF], and most importantly, the aromatic ring contained in nile red can react with HOBr through electrophilic substitution, which is an ideal fluorophore for the design of HOBr fluorescent probe. In our design strategy (Fig. 1B), Nile red scaffold is used as the fluorophore, the morpholine ring as the lysosomal localization group [START_REF] Wang | A red-emission fluorescent probe for visual monitoring of lysosomal pH changes during mitophagy and cell apoptosis[END_REF][START_REF] Biswas | Strategic engineering of alkyl spacer length for a pH-tolerant lysosome marker and dual organelle localization[END_REF], and the aromatic ring in molecule can react with HOBr to generate brominated products by electrophilic substitution, which can inhibit the intramolecular charge transfer (ICT) of probe DMBP (the synthesis route was shown in Scheme 1, yield: 27.2%), thus affecting the spectral properties of probe DMBP to produce a ratiometric fluorescence response. Scheme 1. Synthetic route of probe DMBP.

Spectral properties of DMBP

Firstly, the molar absorption coefficient, fluorescence quantum yield and other related spectral properties of probe DMBP were measured in different organic solvents (Table S3). DMBP has NIR emission (653 nm) and high fluorescence quantum yield up to 30.00%, with deep tissue penetration and low background, which demonstrated its broad prospect in biological imaging. Then we examined the absorption and emission spectra of DMBP before and after the reaction with HOBr.

The absorption and emission peaks of DMBP were at 580 nm and 653 nm respectively (Fig. 2A,2B). The absorption peak at 580 nm was decreased significantly after the addition of HOBr, accompanied by an increasing peak at 420 nm (Fig. 2A). Meanwhile, the ratio changes appeared in the fluorescence spectra, the emission peak at 653 nm decreased together with an arising emission peak at 520 nm after the reaction between DMBP and HOBr (Fig. 2B). Selectivity and competition studies were used to demonstrate the specificity of DMBP to HOBr, the above results showed that other biologically relevant analytes, common anions and cations in humans would not cause ratiometric response of DMBP or influence the detection of HOBr (Fig. 2C,1D), indicating that DMBP has excellent selectivity for HOBr and powerful anti-interference ability. The impact of HOBr concentration on the spectral properties of DMBP was next investigated. Fig. 3A showed the variation trend, the increasing concentration of HOBr caused rising fluorescence intensity at 520 nm (green) and reducing at 653 nm (red) of DMBP. The ratio of green to red fluorescence intensity of DMBP was proportional to HOBr (0~56.00 μM), whose correlation index reached 0.9911 and possessed a lower Limit of Detection (LOD) of 89.00 nM (Fig. 3B). The above experimental results indicated that DMBP could response to different concentrations of HOBr selectively and showed a ratiometric variation, rendering DMBP an ideal probe for the sensitive and accurate detection of HOBr. We also explored the effects of time and pH to examine the dynamics and pH tolerance of DMBP and its response to HOBr (Fig. S12). Firstly, the kinetic properties between DMBP and HOBr were investigated (Fig. S12A), after the addition of HOBr, the fluorescence signal ratio (I 520 /I 653 ) of DMBP enhanced 40-fold within 1 min and reached equilibrium within 10 mins. Next, we evaluated the pH tolerance of DMBP and the reaction system, as shown in Fig. S12B, after the addition of 40.0 μM of HOBr, probe DMBP showed stable fluorescence emission of I 520 /I 653 under pH 3~12 that contained physiological conditions. The above results indicated that DMBP is an excellently sensitive and stable fluorescent probe to detect HOBr.

Validation of reaction mechanism

The electron donor N, N-diethyl and acceptor carbonyl groups exist in DMBP forming the ICT effect, and producing intense red fluorescence. According to the changes of fluorescence emission, the adding of HOBr caused significant reduction of intensity at 653 nm and increased at 520 nm, resulting in a blue shift of fluorescence spectra, which may be attributed to the bromine substituent reduced the electron density of the oxygen heterocycle.

It was reported that HOBr could attack the 5-position of coumarin and the 4'(5') position of rhodamine B to generate brominated products, and the 8-position of DMBP had similar substituents in the adjacent position with them [START_REF] Wu | Bromination-induced spirocyclization of rhodamine dyes affording a FRET-based ratiometric fluorescent probe for visualization of hypobromous acid (HOBr) in live cells and zebrafish[END_REF]. Therefore, it was speculated that the electrophilic substitution of HOBr occurred at the 8-position of DMBP (Fig. 4A). After the electrophilic substitution reaction between DMBP and HOBr, the bromine replaced the hydrogen at the 8-position of probe, which effectively inhibited the ICT process, and triggered a blue shift of emission wavelength to produce a ratiometric fluorescence signal. For further confirmation of the mechanism, we subjected the reaction product to mass spectrometry and liquid phase analysis. Probe DMBP was dissolved in methanol at a final concentration of 10.00 μM, then detected with an injection volume of 10.00 µL. The eluent was methanol at a flow rate of 1 mL•min -1 , probe DMBP (10.00 μM) was treated with HOBr (50.00 μM) for 10 min, signals were collected at 420 nm and 580 nm. As shown in Fig. 4B, probe DMBP had a chromatographic peak at 7.9 min after isocratic elution with 85% methanol, and a new peak at 9.8 min appeared after the reaction with HOBr, which demonstrated the generation of new product. To further determine the structure of the new product, we purified and subjected it to mass spectrometry, the measured mass spectral peak was 562.0947 (Fig. S5), which was consistent with the calculated value of DMBP-Br as 562.0954, providing a proof of the generation of DMBP-Br. Subsequently, the synthesized DMBP-Br was subjected to liquid phase analysis, and the peak position was consistent with the reaction product, demonstrating that the probe reacted with HOBr to form DMBP-Br.

Fluorescence imaging of HOBr in HepG2 cells

Before cell imaging, the toxicity of DMBP to HepG2 cells was assessed by MTT assay firstly (Fig. S10), more than 80% of HepG2 cells survived when the concentration of DMBP reached 12.50 μM, indicating that probe DMBP had lower cytotoxicity and was available for cell imaging.

There are many reactive oxygen species involved in reactions inside lysosomes, so it is interesting to study the reactive oxygen species inside lysosomes. We attached a lysosomal localization motif to the designed probe and determined the localization of DMBP in the lysosome by co-localization imaging experiments. As shown in Fig. 5A, after co-incubation with Lyso-Tracker Green (a commercially available lysosomal green fluorescent probe) and DMBP with HepG2 cells for 3 min, the red fluorescence collected by the probe highly overlapped with the green fluorescence of Lyso-Tracker Green. In addition, the cross-sectional fluorescence intensity distributions of DMBP and Lyso-Tracker Green in the cells were essentially identical (Pearson coefficient was 0.97), indicating that probe DMBP could be localized in lysosomes.

Then the response of DMBP to exogenous HOBr in living cells was investigated.

The green and red channels were set up for simultaneous detection, an obvious fluorescence signal could be observed in the red channel but almost none in the green channel when DMBP was incubated with cells (Fig. 5B). However, after the incubation of HOBr, the fluorescence of the red channel decreased and that of the green channel was significantly enhanced, indicating that DMBP could be used to detect exogenous HOBr. In addition, the fluorescence intensity changes of two channels were positively correlated with the concentration of HOBr, which suggested that DMBP could realize visualization of exogenous HOBr in living cells. Green channel was acquired at 480~600 nm, λ ex =405 nm, red channel was acquired at 610~750 nm, λ ex =552 nm, Scale bar: 25 μm.

Fluorescence imaging of HOBr in zebrafish

Given the relatively promising detection ability of probe DMBP in cells, we further explored its application in zebrafish. Using three-day zebrafish as animal model, we first investigated the fluorescence signal in zebrafish before and after the addition of exogenous HOBr. As shown in Fig. 6A 20.00 μM) and NAC (250.00 μM). Green channel was acquired at 480~600 nm, λ ex =405 nm, red channel was acquired at 610~750 nm, λ ex =552 nm.

Conclusion

In summary, we designed and synthesized a lysosome-targeted NIR fluorescent probe DMBP based on the Nile red skeleton. The experiment result shows that HOBr can react with the probe via electrophilic substitution, resulting in an increasing emission peak at 520 nm, which produced a ratiometric signal change from red to green depending on the change of ICT process. DMBP exhibits high selectivity and sensitivity to HOBr and can rapidly distinguish other ROS. DMBP also has good biocompatibility and cell permeability that had been successfully used for exogenous and endogenous HOBr imaging in HepG2 cells and zebrafish. More importantly, as the first NIR fluorescent probe can simultaneously localize lysosomes and achieve

Fig. 1 .

 1 Fig. 1. Design strategy of probe DMBP.

Fig. 2 .

 2 Fig. 2. (A) UV absorption spectra before and after the reaction of DMBP with HOBr. (B) Fluorescence emission spectra before and after the reaction of DMBP with HOBr. (C) Fluorescence spectra of DMBP (10.00 μM) upon addition of 40.0 µM 19 kinds of ions (0: blank; 1: HOBr; 2: H 2 O 2 ; 3: ClO -; 4: NO; 5: ROO . ; 6: •OH; 7: 1 O 2 ; 8: ONOO -; 9: t-BuOOH; 10: GSH; 11: Cys; 12: Hcy; 13: S 2-; 14: K + ; 15: Ca 2+ ; 16: Mg 2+ ; 17: Fe 2+ ; 18: Br -; 19: NO 2 -). (D) Competitive fluorescence spectra of DMBP (10.0 µM) with HOBr and other biologically relevant species. λ ex = 420 nm. Insets in (B): Pictures of before and after the reaction of DMBP with HOBr under 365 nm excitation. Insets in (C): Pictures of DMBP upon treatment with various ions under 365 nm excitation.

Fig. 3 .

 3 Fig. 3. (A) Fluorescence emission curves of DMBP (10.00 μM) with added HOBr (0~56.00 μM) (pH 7.4,20% DMSO); slit widths: 5/10 nm; operating voltage: 700 V; λ ex = 420 nm. (B) Linear correlation of (A). (C) Fluorescence photos (λ ex =365 nm) of probe DMBP after reacting with HOBr (0 μM, 8.00 μM, 16.00 μM, 24.00 μM, 32.00 μM, 40.00 μM, 48.00 μM, 56.00 μM). Inset in (A): Fluorescence intensity changes at 653 nm and 520 nm. Inset in (B): Fluorescence intensity ratio (I 520 /I 653 ) with added HOBr (0~76.00 μM).

Fig. 4 .

 4 Fig. 4. (A) Prediction of reaction sites between probe DMBP and HOBr. (B) Liquid phase spectra before and after the reaction with HOBr. (C) Reaction mechanism between probe DMBP and HOBr.

  Some abnormal activities in the organism can change the concentration of HOBr in the lysosome, therefore, observing the change of endogenous HOBr is beneficial to determine the role it plays in the lysosome. Fig. 5C shows the fluorescence imaging experiment of DMBP on endogenous HOBr. HepG2 cells treated with DMBP only showed red fluorescence, after the stimulation of NaBr to produce HOBr in cells, the fluorescence at red channel was weakened, while the fluorescence at the green channel was significantly enhanced, and this trend was correlated with the concentration of NaBr. Subsequently, the added reagent NAC (a scavenger of HOBr) decreased the green fluorescence signal significantly, which proved that the change of fluorescence signal at the green channel was caused by the generation of HOBr. In summary, probe DMBP can monitor the fluctuation of exogenous and endogenous HOBr in HepG2 cells in real time and is expected to be used to examine the role of HOBr in lysosomes.

Fig. 5 .

 5 Fig. 5. (A) Co-localization images of Lysosomes. (a) Lyso-Tracker Green (1.00 μM), (b) DMBP (5.00 μM), (c) merged image. Green channel was acquired at 500~600 nm, λ ex =488 nm, red channel was acquired at 610~750 nm, λ ex = 552 nm. (d) Co-localization scatter plot of (a). (e) Cross section intensity of (a). (B) Confocal fluorescence images of HepG2 cells with DMBP (5.00 μM) and exogenous HOBr (0 μM, 5.00 μM, 10.00 μM, 20.00 μM). (C) Confocal fluorescence images of HepG2 cells with DMBP (5.00 μM) and endogenous HOBr. (a-d) control; (e-h) NaBr (20.00 μM); (i-l) NaBr (20.00 μM) and NAC (250.00 μM). (D) Digitization fluorescence intensity of each group of cells in (B). (E) Digitization fluorescence intensity of each group of cells in (C).Green channel was acquired at 480~600 nm, λ ex =405 nm, red channel was acquired at 610~750

  , after incubation of DMBP with zebrafish alone, there was a clear fluorescence signal at red channel but almost not at green channel. Conversely, the zebrafish incubated with DMBP and different concentrations of HOBr showed gradually enhanced fluorescence signal at the green channel and decreased at the red channel. The above results demonstrate that probe DMBP can detect exogenous HOBr in animal models, further indicating its promising application for in vivo imaging. EPO can catalyze a reaction to produce HOBr, making the concentration of HOBr correlate with EPO activity, which is associated with inflammation and tissue damage in vivo; therefore, detection of endogenous HOBr concentration is expected to enable monitoring of EPO activity for early diagnosis of diseases. Based on this information, we imaged endogenous HOBr (induced by NaBr) in zebrafish using probe DMBP. Enhanced green fluorescence and attenuated red fluorescence were observed in zebrafish treated with NaBr. To demonstrate that the change in fluorescence was caused by HOBr, we also made a control experiment using reagent NAC to eliminate the HOBr induced by NaBr, and as shown in the Fig. 6B, the green fluorescence was significantly weakened, demonstrating that the change in fluorescence of the green channel was caused by HOBr. The above experiments manifested that probe DMBP is capable of detecting endogenous HOBr in organisms, and is expected to be used for early diagnosis of diseases.

Fig. 6 .

 6 Fig. 6. (A) Confocal fluorescence images of zebrafish with probe DMBP (5.0 μM) and exogenous HOBr (0 μM, 5.00 μM, 10.00 μM, 20.00 μM). (B) Confocal fluorescence images of DMBP (5.00 μM) and endogenous HOBr in zebrafish. (a-d) control; (e-h) NaBr (20.00 μM);(i-l) NaBr (20.00 μM) and NAC (250.00 μM). Green channel was acquired at 480~600 nm, λ ex =405 nm, red channel was acquired at 610~750 nm, λ ex =552 nm.

Acknowledgements

The authors thank the National Natural Science Foundation of China (No. 21572177), the Key Research and Development Program of Shaanxi Province (No. 2021ZDLSF03-03), Biomedicine Key Laboratory of Shaanxi Province (No. 2018SZS41).

Appendix A. Supplementary data

Supplementary data to this article can be found online at https://xxx

Data availability

Data will be made available on request.

ratiometric detection of HOBr, we believe that probe DMBP is a potential tool for the diagnosis of HOBr-related diseases in lysosomes.

CrediT authorship contribution statement

Declaration of Competing Interest

The authors declare that they have no known competing financial interests or personal relationships that could have appeared to influence the work reported in this paper.