A ↓ceramide

Sphk Sphk

Patk 6msa

Penicillic acid Aspergillus Penicillium Coffee, Cereals Synergism with Ochratoxin

Keywords: Moniliformin Fusarium Cereals Cardiotoxicity DNA damage No Mycophenolic acid Penicillium Byssochlamys Blue cheeses Immunosuppressive Ochratoxins Aspergillus Penicillium Coffee, cocoa, spices, dried fruits, grapes Nephrotoxicity, Carcinogenicity (group 2B) Yes Patulin Aspergillus Trichothecenes Fusarium Cereals Haematotoxicity, Immunosuppressive Beauvericin Fusarium Cereals, Fruits Cytotoxic, ionophoric, Antibiotic and insecticidal activity Cytotoxic, ionophoric, Antibiotic and insecticidal activity No Ergot Alkaloids Claviceps Rye, Wheat Neurotoxicity nuts, peanuts, cereals, dried fruits Inhibition

La partie qui est introduite par la suite présente la problématique des mycotoxines en portant une attention particulière aux mycotoxines majeures, de part leur toxicité, leur occurrence et leur réglementation. La description détaillée des voies de biosynthèse, des modes d'action, et des effets toxiques met en évidence la diversité et l'extrême complexité de cette thématique de recherche. Néanmoins, elle met aussi en exergue le manque de connaissances sur certains aspects qui poussent à poursuivre les études.

Liste des abréviations

Contexte

Les moisissures sont des champignons filamenteux capables de coloniser de nombreux substrats dès que la présence d'éléments nutritifs et un taux d'humidité sont suffisants. Elles appartiennent au règne fongique, un des groupes majeurs du domaine des eucaryotes. Le nombre d'espèces de moisissures décrites jusqu'à présent s'élève à 99 000, et par extrapolation, les estimations les plus optimistes sur le nombre total d'espèces sur la planète considèrent qu'il y en aurait entre 3 et 5 millions. Parmi cette grande diversité d'espèces, certaines ont été utilisées depuis des siècles par l'Homme pour leurs propriétés médicinales ou pour l'élaboration d'aliments comme les fromages. Cependant, d'autres espèces sont responsables de pathologies humaines, animales et végétales, ainsi que de la dégradation des produits alimentaires. Les genres Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Candida et Stachybotrys sont les plus pathogènes pour l'homme et peuvent déclencher des mycoses ou allergies pouvant devenir graves chez des patients immunodéprimés.

Les moisissures sont capables de produire une très grande variété de métabolites secondaires qui leur confèrent, en général, un avantage sélectif dans leur environnement. Ces métabolites sont dits secondaires car ils ne sont pas nécessaires au développement de la moisissure contrairement aux métabolites primaires tels que les acides nucléiques, les protéines ou les acides gras. De plus, contrairement aux métabolites primaires qui sont codés par seul un gène, la biosynthèse des métabolites secondaires est orchestrée par une cascade de réactions enzymatiques catalysées par des enzymes codées par des gènes regroupés en clusters. Certains de ces métabolites ont des propriétés bénéfiques pour l'homme telle que la pénicilline, mais d'autres peuvent avoir des conséquences néfastes pour la santé des vertébrés et sont connus sous le nom de mycotoxines. C'est le cas de l'aflatoxine qui est l'un des plus puissants agents cancérigènes naturels. Il existe une très grande diversité d'effets toxiques des mycotoxines qui découle directement de l'importante variété chimique de ces métabolites secondaires. Les genres Aspergillus, Penicillium et Fusarium sont les plus importants producteurs de ces toxines. Cependant, il a été observé que toutes les souches d'une même espèce ne produisent pas les mêmes mycotoxines et que certaines de ces souches ne sont pas toxinogènes. Les mycotoxines sont produites dans les champs ou pendant le stockage, lorsque les conditions sont favorables au développement fongique. Elles peuvent donc facilement contaminer les matières agricoles et perdurer bien plus que les moisissures au cours de la chaîne de production alimentaire du fait de leur grande stabilité. Les mycotoxines représentent donc un risque économique pour les agriculteurs puisqu'elles sont responsables d'importantes baisses de rendement, mais aussi des risques sanitaires pour les consommateurs. Ceci a fortement encouragé les pouvoirs publics à réglementer la présence et la concentration de certaines de ces toxines. Cependant, il y a encore un manque de connaissances important quant à la biosynthèse, la détection et la toxicité de ces mycotoxines qui empêche une bonne évaluation et prédiction des risques de contamination. C'est donc une thématique qui requière encore des efforts de recherche et c'est dans ce contexte que s'insèrent les travaux de cette thèse. Table 1:

List of figures

List of tables

I. INTRODUCTION

The fungal kingdom plays an important role in natural ecosystems, as fungi are essential decomposers of dead organic matter, thus restoring carbon, nitrogen, phosphorous and mineral levels in the biosphere. In addition to that, filamentous fungi constitute one of the most important sources of secondary metabolites. Many of these secondary metabolites present industrially interesting properties that have been beneficial for humans in the fields of medicine, food industry, cosmetics, energy and construction. However, other metabolites, known as mycotoxins, have been shown to have deleterious effects resulting in human, animal and phyto-pathologies. For instance, aflatoxin B1, one of the most potent carcinogenic and genotoxic natural substances is of fungal origin (Bennett and Klich 2003). The most important fungal genera that produce mycotoxins are Aspergillus, Penicillium and Fusarium. Aspergillus species are probably the most representative of spoilage fungi given their capacity to grow under a large array of environmental conditions. In fact, there are very few food commodities and raw materials in which Aspergillus cannot develop (Pitt and Hocking 2009). Penicillium species are also ubiquitous saprophytes that are encountered mainly as soil fungi and only accidentally in food/feed commodities, although some species are specifically used in the food production industry such as P. roqueforti (Pitt and Hocking 2009). Contrarily to Aspergillus and Penicillium species, Fusarium species are plant pathogens that are widely distributed in soils and particularly in cultivated soils. Since development of Fusarium species requires high humidity levels, these species are most frequently encountered on the fields pre-harvest or at early stages of storage (Leslie and Summerell 2006).

So far, over 1000 fungal secondary metabolites have been identified, among which, around 30 have proven toxicity and are considered as mycotoxins and only 6 are legally regulated (aflatoxins, zearalenone, deoxynivalenol, fumonisins, ochratoxin A and patulin). A list of the major mycotoxins, classified based on their biosynthetic origin is given in table 1. As it can be seen, there is a large variety of metabolites with very different toxicities. However, in most cases, there is not enough data to assess the exposure risks, which difficults the establishment of official regulations. For instance, toxicity of the so-called emerging mycotoxins, such as beauvericin, enniatins and moniliformin was acknowledged quite recently compared to other mycotoxins. Therefore, there is still not enough data for a proper assessment of the risks related to exposure to these mycotoxins, and no regulations have been established yet [START_REF] Jestoi | Emerging Fusarium-mycotoxins fusaproliferin, beauvericin, enniatins, and moniliformin: a review[END_REF]. Mycotoxin-producing fungal species may develop all around the world in solid or liquid substrates as long as they are in presence of sufficient nutriments and humidity (a w > 0.6). Therefore, food and feed commodities are particularly affected. A worldwide survey performed in 2012 analyzed the presence of five of the main mycotoxins in 4,023 samples of food/feed commodities such as cereals, soybean and straw originating from North and South America, Europe, Africa, Middle East, Asia and Oceania (Fig. 1) (Biomin 2012). The results of this study show a worldwide occurrence of these mycotoxins but a heterogeneous distribution, mainly due to regional endemism of some species. Annual meteorological variations may also affect fungal development and mycotoxins distribution around the world.

Mycotoxins are produced during fungal development on the fields or during storage and therefore, in some cases, they can reach human and animal alimentary chains. Human exposure can also occur by ingestion of contaminated animal products. In addition to ingestion, which is the most common route of exposure, mycotoxins may also enter the organism through dermal, respiratory and parenteral routes [START_REF] Omar | Immunotoxicological risk of mycotoxins for domestic animals[END_REF]. Although cases of severe acute toxicity have already been reported for aflatoxin B1, and T-2 toxin, most of the concern related to mycotoxins exposure is due to chronic exposure. In any case, toxicity is dependent on the route, level and duration of exposure; on the age, health status, sex, genetics and dietary status of the exposed individuals and also on the possible interactions with other toxins [START_REF] Omar | Immunotoxicological risk of mycotoxins for domestic animals[END_REF]. At a molecular level, mycotoxins can affect the DNA template, the RNA polymerase thus hindering transcription, the ribosomes and polysomes thus hindering translation or different metabolic reactions. At a cellular level, these interactions may induce mutagenicity, carcinogenicity or teratogenicity (Fig. 2). All of this may disrupt the function of the different organs of the exposed individuals thus leading to hepatotoxicity, nephrotoxicity, neurotoxicity, immunotoxicity and so forth (Fig. 2) [START_REF] Kiessling | Biochemical mehcanisms of action of mycotoxins[END_REF][START_REF] Omar | Immunotoxicological risk of mycotoxins for domestic animals[END_REF]. The variety of t oxic ef fects induced by m ycotoxins is directly r elated to t he large diversity of t hese metabolites in terms of c hemical s tructures. H owever, i n sp ite of this diversity, bi osynthesis of mycotoxins derives from simple building blocks, all of which are initially metabolized from glucose:

(1) ac etyl-CoA uni ts for p olyketides and terpenes and ( 2) ar omatic amino ac ids for non -ribosomal peptides (Fig. 3). Contrarily to bacterial toxins or fungal toxins from higher fungi, which are usually ribosomal pep tides, b iosynthesis of m ycotoxins require successive metabolic reactions t hat a re orchestrated by a cascade of enz ymes enc oded by di fferent g enes that ar e generally g athered in clusters [START_REF] Keller | Metabolic pathway gene clusters in filamentous fungi[END_REF] . The structural di versity of m ycotoxins results from t he variety of sub-units and the large array of p rocessing r eactions ( cyclization, aromatization, alkylation, glycosylation, hydroxylation and epoxidation) involved in their biosynthesis [START_REF] Boettger | Molecular Diversity Sculpted by Fungal PKS-NRPS Hybrids[END_REF]. A dditional diversity i s further obtained by combination of biosynthetic pathways such as the fusion of polyketide and non-ribosomal peptide biosynthetic pathways. Although quite spread among microorganisms, this marriage remains enigmatic for the scientific community, especially concerning the bi osynthetic programming and ac tivity of the hybrid polyketide synthases (PKS) and the hybrid non-ribosomal pep tide synthases (NRPS) [START_REF] Boettger | Molecular Diversity Sculpted by Fungal PKS-NRPS Hybrids[END_REF] . My cotoxins can t hus be classified into four main categories: (1) polyketides, (2) terpenes, (3) non-ribosomal peptides and ( 4) hybrids (Fig. 3).

Fig. 3: Overview of the different biosynthetic pathways involved in mycotoxin production. Mycotoxins can be classified into four main categories (polyketides, terpenes, non-ribosomal peptides and hybrids) that derive from simple building blocks, all of which are initially metabolized from glucose: acetyl-CoA units for polyketides and terpenes and aromatic amino acids for non-ribosomal peptides. PK-NRP hybrids are obtained by the fusion of the polyketide and the non-ribosomal peptide biosynthetic pathways by the activity of hybrid polyketide synthases and hybrid non-ribosomal peptide synthases.

This chapter gives a detailed overview of some of the most representative mycotoxins of each of these categories. Special attention was paid to the mycotoxins that are regulated (aflatoxins, fumonisins, ochratoxins, patulin, zearalenone and trichothecenes). Gliotoxin and ergot alkaloids were chosen for their relevance in terms of occurrence and toxicity.

II. POLYKETIDES MYCOTOXINS

This group of secondary metabolites is characterized by the consecutive polymerization of ketide groups (CH 2 -CO) n , deriving from the metabolization of acetate. It is a large and very diverse group of metabolites that includes polyphenols, polyenes and macrolides. Given the central role of acetylcoenzyme A (acetyl-CoA) in polyketides biosynthesis, a relationship can be drawn with the biosynthesis of fatty acids. As a matter of fact, these primary metabolites were initially also classified as polyketides [START_REF] Bentley | Constructing Polyketides: From Collie to Combinatorial Biosynthesis[END_REF]. However, two main differences exist between polyketides and fatty acids. Firstly, some of the polyketides synthases (PKS) involved in the biosynthesis of secondary metabolites require a different carboxylic acid than acetyl-CoA, which is not the case for the PKS involved in fatty acids biosynthesis, also known as fatty acid synthases (FAS). Secondly, unlike fatty acids, the oxidation state of polyketides is very variable. According to Nicholson et al., polyketides can be classified into three groups: non-reduced (like norsolorinic acid, an aflatoxin precursor), partially reduced (like 6-methylsalicylic acid, a patulin precursor) and highly reduced (like fumonisins) [START_REF] Nicholson | Design and utility of oligonucleotide gene probes for fungal polyketide synthases[END_REF]. This classification further correlates with the structure and biosynthetic origin of each metabolite. Fungal polyketides can have a wide variety of biological activities, which is not surprising given the large chemical and structural diversity of these metabolites. Some of these activities present industrial interests such as the well-known immunosuppressant properties of mycophenolic acid, which is produced by fungi belonging to the genera Penicillium. This metabolite has been widely used to prevent rejection in organ transplantation [START_REF] Lipsky | Mycophenolate mofetil[END_REF] and also as a potent inhibitor of viral RNA synthesis in vitro [START_REF] Gong | Mycophenolic acid, an immunosuppressive agent, inhibits HBV replication in vitro[END_REF].

Another industrially interesting polyketide is lovastatin, which is mainly produced by Aspergillus terreus, and is used in the pharmaceutical industry as a cholesterol lowering drug [START_REF] Seenivasan | Microbial production and biomedical applications of lovastatin[END_REF]. However, many polyketides can also induce a large panel of toxic effects such as carcinogenic effects (aflatoxin, fumonisin B), hepatotoxicity (aflatoxin), nephrotoxicity (ochratoxin A), genotoxicity (patulin) and oestrogenic disruption (zearalenone). Interestingly, the impact of polyketides on public health is such that out of the 6 groups of mycotoxins that are regulated by the European Union, only the group of the trichothecenes does not belong to the polyketide family (European Commission 2006). More details will be given concerning the effects of these mycotoxins in this section.

II.1. Aflatoxins

This family of mycotoxins was one of the first to be discovered, over 40 years ago, as the cause of the Turkey X disease which triggered acute hepatotoxicity and death in poultry in Great Britain [START_REF] Nesbitt | Aspergillus flavus and turkey X disease. Toxic metabolites of Aspergillus flavus[END_REF]). Since then, aflatoxins have been shown to have immunosuppressive, mutagenic, teratogenic and hepatocarcinogenic effects in both humans and experimental animals [START_REF] Mathison | The toxicology of aflatoxins: Human health, veterinary, and agricultural significance[END_REF]. They are now considered as the most carcinogenic and genotoxic substances of natural origin (Bennett andKlich 2003, CAST 2003). Contamination by aflatoxins generally comes before harvest in corn, peanuts, cotton seeds and tree nuts but also during improper storage of food commodities, generating important economical losses (CAST 2003). At a global level, contamination by aflatoxins affects over 5 billion people in the world through food and polluted air, most generally in warm and humid places, such as Asia, Africa and Central America, where it is associated with liver/lung cancer, HIV/AIDS, malaria, growth stunting, children malnutrition and increased risk of adverse birth [START_REF] Gong | Determinants of aflatoxin exposure in young children from Benin and Togo, West Africa: the critical role of weaning[END_REF][START_REF] Jiang | Aflatoxin-Related Immune Dysfunction in Health and in Human Immunodeficiency Virus Disease[END_REF][START_REF] Liu | Global burden of aflatoxin-induced hepatocellular carcinoma: a risk assessment[END_REF][START_REF] Shuaib | Reproductive health effects of aflatoxins: A review of the literature[END_REF][START_REF] Khlangwiset | Aflatoxins and growth impairment: A review[END_REF][START_REF] Rodrigues | A Three-Year Survey on the Worldwide Occurrence of Mycotoxins in Feedstuffs and Feed[END_REF].

Aflatoxins are mainly produced by 13 Aspergillus species, among which A. flavus, A. ochraceoroseus and A. pse udotamarii produce t ype B af latoxins and A. paras iticus, A. bom bycis a nd A. nom ius produce both type B and G aflatoxins. A. flavus and A. parasiticus are the two main producing species [START_REF] Varga | Two new aflatoxin producing species, and an overview of Aspergillus section Flavi[END_REF]. N ew Aspergillus species have been i dentified as producers of af latoxins: A. novoparasiticus, A. arac hidicola, A. m inisclerotigenes, A. ps eudocaelatus a nd A. p seudonomius (Pildain e t a l. 2008(Pildain e t a l. , V arga et al. 2011(Pildain e t a l. , G oncalves et a l. 201 2, A djovi et al. 2014)). I n addi tion to Aspergillus species, aflatoxins or aflatoxin-related metabolites such as sterigmatocystin have also been isolated from culture extracts of Fusarium kyusbuene [START_REF] Schmidt-Heydt | A strain of Fusarium kyushuense is able to produce aflatoxin B1 and G 1[END_REF], Podospora anserin [START_REF] Slot | Horizontal Transfer of a Large and Highly Toxic Secondary Metabolic Gene Cluster between Fungi[END_REF] and Dothistroma septosporum and D. pini [START_REF] Bradshaw | A polyketide synthase gene required for biosynthesis of the aflatoxin-like toxin, dothistromin[END_REF].

The aflatoxins family enc ompasses 16 st ructurally r elated furanocoumarins (Bhatnagar et a l. 2003) , AFB1, AFB2, AFG1 and AFG2 being the four most abundant and naturally occurring [START_REF] Huffman | Recent advancements in the biosynthetic mechanisms for polyketide-derived mycotoxins[END_REF]. AFB1 and AFB2 are characterized by a cyclopentane E-ring whereas AFG1 and AFG2 contain a xanthone ring i nstead [START_REF] Huffman | Recent advancements in the biosynthetic mechanisms for polyketide-derived mycotoxins[END_REF] , Z eng et a l. 201 1). These differences result i n B lue fluorescence under l ong wave UV light for AFB1 and AFB2 and Green fluorescence for AFG1 and AFG2. AFB2 and AFG2 differ from AFB1 and AFG1 in that their bisfuranyl ring is saturated (Fig. 4).

In addition, AFM1 and AFM2 are the major metabolites of AFB1 and AFB2, respectively and they are produced in the liver of exposed animals by hydroxylation of the parent compounds [START_REF] Gallagher | Role of Human Microsomal and Human Complementary DNA-expressed Cytochromes P4501A2 and P4503A4 in the Bioactivation of Aflatoxin B1[END_REF]). AFM1 and AFM2 represent an important threat for public health because they are excreted in milk, linked to casein proteins, and they persist in dairy products and human breast milk [START_REF] Galvano | Maternal dietary habits and mycotoxin occurrence in human mature milk[END_REF][START_REF] Keskin | Detection of aflatoxin M1 in human breast milk and raw cow's milk in Istanbul, Turkey[END_REF], Motawee and Mc Mahon 2009[START_REF] Prandini | On the occurrence of aflatoxin M1 in milk and dairy products[END_REF]). R ecently, se veral studies hav e reported the presence of AFM1 in d airy products and, in so me cases, above t he maximum l imit ( 50 ng /kg) es tablished by t he European r egulation 1881 /2006 (Boudra et a l. 2007[START_REF] Delialioglu | Investigation of aflatoxin M1 levels in raw and market milks in Mersin Province, Turkey[END_REF][START_REF] Fallah | Assessment of aflatoxin M1 contamination in pasteurized and UHT milk marketed in central part of Iran[END_REF]. Biosynthesis of a flatoxins i s pr obably one of t he most st udied b iosynthetic pat hways of f ungal secondary metabolites, starting with the cloning of the gene nor-1 in A. parasiticus in the early 90's [START_REF] Chang | Cloning of a gene associated with aflatoxin B1 biosynthesis in Aspergillus parasiticus[END_REF]). The complete aflatoxin biosynthetic pathway gene cluster is 70 kb long and contains 25 genes (Trail et al. 1995a, Trail et al. 1995b[START_REF] Huffman | Recent advancements in the biosynthetic mechanisms for polyketide-derived mycotoxins[END_REF]. This biosynthetic pathway starts with the formation of hexanoate from acetate by the action of two fatty acid synthases (FASs). Hexanoate is then cyclisized by the action of a PKS into norsolorinic acid anthrone, which is the first stable intermediate. There are other stable intermediates such as averantin, versicolorin A and B and sterigmatocystin. The production of versicolorins A and B is a branching point, which determines whether AFB1 and AFG1 or AFB2 and AFG2 are synthesized. Versicolorin A is synthesized by desaturation of versicolorin B and therefore it is the precursor of the desaturated AFB1 and AFG1 whereas versicolorin B is the precursor of the saturated AFB2 and AFG2. Sterigmatocystin is the intermediate product in the versicolorin A pathway and it corresponds to dihydrosterigmatocystin in the versicolorin B pathway [START_REF] Bhatnagar | Molecular genetic analysis and regulation of aflatoxin biosynthesis[END_REF], Yu et al. 2004a, Yu et al. 2004b[START_REF] Huffman | Recent advancements in the biosynthetic mechanisms for polyketide-derived mycotoxins[END_REF][START_REF] Roze | Aflatoxin Biosynthesis: Current Frontiers[END_REF]. Notably, the last steps of the biosynthesis of aflatoxin take place in vesicules which play a key role in sterigmatocystin transformation and aflatoxin storage and export [START_REF] Chanda | A key role for vesicles in fungal secondary metabolism[END_REF]. Interestingly, over 20 species, such as A. nidulans and A. versicolor, produce sterigmatocystin as a final product instead of aflatoxin. The enzymatic pathway involved in the biosynthesis of sterigmatocystin in A. nidulans is the same than in the biosynthesis of aflatoxin by A. parasiticus or A. flavus [START_REF] Keller | Analysis of a mycotoxin gene cluster in Aspergillus nidulans[END_REF][START_REF] Brown | Twenty-five coregulated transcripts define a sterigmatocystin gene cluster in Aspergillus nidulans[END_REF][START_REF] Keller | Metabolic pathway gene clusters in filamentous fungi[END_REF]. The main differences lie on different gene distribution in the genetic clusters and also, the presence of several additional genes in the aflatoxin cluster of A. parasiticus and A. flavus [START_REF] Keller | Analysis of a mycotoxin gene cluster in Aspergillus nidulans[END_REF][START_REF] Brown | Twenty-five coregulated transcripts define a sterigmatocystin gene cluster in Aspergillus nidulans[END_REF], Yu et al. 2004a). That is why A. nidulans has been widely used as a model to study fungal genetics and more precisely the biosynthetic pathway of sterigmatocystin. It has also been used to study the regulation of secondary metabolism in fungi and that is how the velvet protein VeA, which plays a central role in the regulation of primary and secondary metabolism in ascomycetes and basidiomycetes was first described (Kafer 1965, Bayram andBraus 2012).

Toxicity of aflatoxins is mostly related to the genotoxic and hepatocarcigenic AFB1, which has been classified in the group 1 (i.e. sufficient evidence of carcinogenicity in humans) in the evaluation of carcinogenic risks to humans by the International Agency for Research on Cancer (IARC) of the World Health Organization (WHO) [START_REF] Iarc | Some traditional herbal medicines, some mycotoxins, naphthalene and styrene[END_REF]. Toxicity of AFB1 follows its biotransformation mainly by cytochromes p450 in the liver (Fig. 5A) [START_REF] Gallagher | Role of Human Microsomal and Human Complementary DNA-expressed Cytochromes P4501A2 and P4503A4 in the Bioactivation of Aflatoxin B1[END_REF]. The most reactive metabolite of AFB1 is the epoxydated exo-AFB-8,9-epoxide form, also known as AFBO [START_REF] Gross-Steinmeyer | Dietary modulation of the biotransformation and genotoxicity of aflatoxin B1[END_REF][START_REF] Hamid | Aflatoxin B1-induced hepatocellular carcinoma in developing countries: Geographical distribution, mechanism of action and prevention[END_REF], Kim et al. 2013[START_REF] Roze | Aflatoxin Biosynthesis: Current Frontiers[END_REF]. This metabolite binds to proteins like albumin, which may result in hepatotoxicity [START_REF] Sabbioni | Isolation and characterization of the major serum albumin adduct formed by aflatoxin B1 in vivo in rats[END_REF]. It is also able to form DNA adducts which are responsible for hepatocarcinogenicity, and in humans, this is related to up to 50% of hepatocarcinomas (Bennett et al. 1981, Gross-Steinmeyer and[START_REF] Gross-Steinmeyer | Dietary modulation of the biotransformation and genotoxicity of aflatoxin B1[END_REF]. Most generally, DNA adducts formed by AFBO lead to DNA base damage and oxidative damage, which may result in a mutation of p53 Tumor Suppressor Gene. Consequently, there is an inhibition of apoptosis and p53 transcription as well as a stimulation of hepatocyte growth, which all together may ultimately lead to cancer (Fig. 5A). There are two main pathways of AFBO detoxification that are more or less effective depending on the species (Fig. 5B). In mice, AFBO is conjugated to glutathione by a glutathione-S-transferase (GST), and the resulting AFB-mercapturic acid is easily excreted through urine [START_REF] Nayak | Synthesis and characterization of mercapturic acid (N-acetyl-L-cysteine)-aflatoxin B1 adduct and its quantitation in rat urine by an enzyme immunoassay[END_REF]). However, this is not very effective in humans where AFBO is rather hydrolyzed by human microsomal epoxide hydrolases (mEH) [START_REF] Slone | Human variability in hepatic glutathione S-transferase-mediated conjugation of aflatoxin B1-epoxide and other substrates[END_REF]. This results in the production of a dihydrodiol of AFB that can contribute indirectly to hepatotoxicity by forming protein adducts [START_REF] Eaton | Interindividual differences in response to chemoprotection against aflatoxin-induced hepatocarcinogenesis: implications for human biotransformation enzyme polymorphisms[END_REF]. It is the subsequent reduction of the dihydrodiol into a dialdehyde by aflatoxine-aldehyde reductases that finally detoxifies AFBO [START_REF] Ellis | An ethoxyquin-inducible aldehyde reductase from rat liver that metabolizes aflatoxin B1 defines a subfamily of aldo-keto reductases[END_REF][START_REF] Kelly | Expression of Human Microsomal Epoxide Hydrolase in Saccharomyces cerevisiae Reveals a Functional Role in Aflatoxin B1 Detoxification[END_REF].

There are other metabolites of AFB1 that come from demethylation (AFP1), hydroxylation (AFQ1 and AFM1) and reduction (aflatoxicol) reactions, but contrarily to AFBO, these metabolites have a significantly lower toxicity compared to their parent compound [START_REF] Slone | Human variability in hepatic glutathione S-transferase-mediated conjugation of aflatoxin B1-epoxide and other substrates[END_REF][START_REF] Eaton | Interindividual differences in response to chemoprotection against aflatoxin-induced hepatocarcinogenesis: implications for human biotransformation enzyme polymorphisms[END_REF][START_REF] Gross-Steinmeyer | Dietary modulation of the biotransformation and genotoxicity of aflatoxin B1[END_REF][START_REF] Hamid | Aflatoxin B1-induced hepatocellular carcinoma in developing countries: Geographical distribution, mechanism of action and prevention[END_REF], Kim et al. 2013) (Fig. 5A). However, AFM1 is also of great concern because of its presence in milk, and although it is less toxic than AFB1, it has been classified by IARC in the group 2B (i.e. possibly carcinogenic to humans) [START_REF] Hsieh | Comparative hepatocarcinogenicity of aflatoxins B1 and M1 in the rat[END_REF][START_REF] Iarc | Some traditional herbal medicines, some mycotoxins, naphthalene and styrene[END_REF]. In addition to carcinogenic and genotoxic effects, AFB1 has also been reported to be immunotoxic. In vitro and in vivo studies have shown that it can reduce the number of circulating lymphocytes [START_REF] Hinton | Immunotoxicity of aflatoxin B1 in rats: effects on lymphocytes and the inflammatory response in a chronic intermittent dosing study[END_REF], inhibit blastogenesis by lymphocytes [START_REF] Meissonnier | Immunotoxicity of aflatoxin B1: impairment of the cell-mediated response to vaccine antigen and modulation of cytokine expression[END_REF][START_REF] Wada | Effects of mycotoxins on mitogen-stimulated proliferation of bovine peripheral blood mononuclear cells[END_REF], alter the activity of natural killer cells and cytokine signalling [START_REF] Methenitou | Immunomodulative effects of aflatoxins and selenium on human natural killer cells[END_REF], affect macrophage functions [START_REF] Meissonnier | Immunotoxicity of aflatoxin B1: impairment of the cell-mediated response to vaccine antigen and modulation of cytokine expression[END_REF][START_REF] Bianco | Modulation of macrophage activity by aflatoxins B1 and B2 and their metabolites aflatoxins M1 and M2[END_REF][START_REF] Bruneau | Aflatoxins B(1), B(2) and G(1) modulate cytokine secretion and cell surface marker expression in J774A.1 murine macrophages[END_REF], and also impact on haematopoietic progenitors [START_REF] Roda | Comparative in vitro and ex-vivo myelotoxicity of aflatoxins B1 and M1 on haematopoietic progenitors (BFU-E, CFU-E, and CFU-GM): species-related susceptibility[END_REF]. Susceptibility to aflatoxins is very variable interspecies and interindividually mainly due to great differences in AFB1 biotransformation (Gross-Steinmeyer and [START_REF] Gross-Steinmeyer | Dietary modulation of the biotransformation and genotoxicity of aflatoxin B1[END_REF][START_REF] Hamid | Aflatoxin B1-induced hepatocellular carcinoma in developing countries: Geographical distribution, mechanism of action and prevention[END_REF], Kim et al. 2013[START_REF] Roze | Aflatoxin Biosynthesis: Current Frontiers[END_REF]. For instance, the LD50 (Lethal Dose 50) for ducklings is 0.3 mg/kg.bw whereas it is 9 mg/kg.bw for mice [START_REF] Patterson | Metabolism of aflatoxin in susceptible and resistant animal species[END_REF]. The order of decreasing toxicity has been described as follows: AFB1> AFM1> AFG1> AFB2> AFG2.

Fig. 5: Biotransformation and modes of action of AFB1: a potent hepatotoxic and carcinogenic. Bioactivation of AFB1 takes place in the liver under the action of cytochromes P450 and results in the formation of the epoxydated exo-AFB-8,9epoxide (AFBO), which is the most reactive metabolite of AFB1, but also other metabolites that come from demethylation (AFP1), hydroxylation (AFQ1 and AFM1) and reduction (aflatoxicol) of AFB1, but contrarily to AFBO, these metabolites have a significantly lower toxicity compared to their parent compounds (A). Detoxification AFBO can be performed by conjugation to glutathione or by hydrolysis (B). Dihydrodiol can contribute indirectly to hepatotoxicity by forming protein adducts unless it is reduced into a dialdehyde by aflatoxin-aldehyde reductases.

II.2. Fumonisins

They constitute a large family of mycotoxins mainly produced by Fusarium verticilloides, F. proliferatum and other Fusarium species [START_REF] Gelderblom | Fumonisins-novel mycotoxins with cancer-promoting activity produced by Fusarium moniliforme[END_REF][START_REF] Marasas | Fumonisins: history, world-wide occurrence and impact[END_REF]. These fungal species are important pathogens of corn responsible for "Fusarium kernel rot" or "pink ear rot" [START_REF] Bullerman | Occurrence of Fusarium and fumonisins on food grains and in foods[END_REF][START_REF] Marasas | Fumonisins disrupt sphingolipid metabolism, folate transport, and neural tube development in embryo culture and in vivo: a potential risk factor for human neural tube defects among populations consuming fumonisin-contaminated maize[END_REF]). Fumonisins have also been isolated from cultures of Alternaria alternata and Aspergillus niger [START_REF] Chen | Production of the Mycotoxin Fumonisin B(1) by Alternaria alternata f. sp. lycopersici[END_REF], Frisvad et al. 2007[START_REF] Mansson | Isolation and NMR characterization of fumonisin B2 and a new fumonisin B6 from Aspergillus niger[END_REF][START_REF] Mogensen | Production of Fumonisin B2 and B4 by Aspergillus niger on grapes and raisins[END_REF]. Contamination can occur at different stages like crop growth, harvesting or storage, depending on temperature and humidity. However, development of Fusarium species mainly occurs prior harvest or in the early periods of storage when humidity levels are still high (a W > 0.9) [START_REF] Dutton | The African Fusarium/maize disease[END_REF]. Human exposure to fumonisins is of greater importance in South American, Asian and African

EXCRETION

B. AFBO

countries due to weather and storage conditions and also due to higher consumption levels of maizebased products [START_REF] Dutton | The African Fusarium/maize disease[END_REF].

The fumonisins family encompasses 28 structurally related metabolites that can be classified into 4 series: A, B, C and P [START_REF] Rheeder | Production of fumonisin analogs by Fusarium species[END_REF]. All of them share a long carbon chain backbone with an amine, but have different hydroxyl, methyl and tricarboxylic acid side chains (Fig. 6). A series have an acetylated terminal amine group in C2 position whereas B and C series have free amino groups and P series have a 3-hydroxypiridinium moiety at this position. C series differ from the rest in that their acyl chain is condensated with glycine instead of an alanine residue so they have a C19 backbone chain instead of C20 [START_REF] Huffman | Recent advancements in the biosynthetic mechanisms for polyketide-derived mycotoxins[END_REF]. One particular feature of fumonisins structure is the presence of two tricarballylic esters on C14 and C15, which is rare in natural products. Type B fumonisins are the most abundant in naturally contaminated commodities. Esterification of the backbone structure gives FB4 and further oxidation gives FB2, FB3 and FB1 [START_REF] Huffman | Recent advancements in the biosynthetic mechanisms for polyketide-derived mycotoxins[END_REF]). Among type B fumonisins, fumonisin B1 (FB1) represents 70% of total fumonisins content and FB2 generally accounts for up to 25%. Concerning the other series, only C fumonisins have been detected in corn samples but at much lower concentrations [START_REF] Thiel | Survey of fumonisin production by Fusarium species[END_REF].

Fig. 6: Chemical structures of the main fumonisins. The fumonisins family encompasses 28 structurally related metabolites that can be classified into 4 series: A, B, C and P. All of them share a long carbon chain backbone with an amine, but have different hydroxyl, methyl and tricarboxylic acid side chains (R1 and R2). A series have an acetylated terminal amine group in C2 position whereas B and C series have free amino groups and P series have a 3-hydroxypiridinium moiety at this position. C series differ from the rest in that their acyl chain is condensated with glycine instead of an alanine residue so they have a C19 backbone chain instead of C20. Reproduced with modifications from [START_REF] Lazzaro | Fumonisins B, A and C profile and masking in Fusarium verticillioides strains on fumonisin-inducing and maize-based media[END_REF].

The biosynthesis of fumonisins has essentially been studied in the genome of Fusarium species [START_REF] Proctor | A polyketide synthase gene required for biosynthesis of fumonisin mycotoxins in Gibberella fujikuroi mating population A[END_REF][START_REF] Proctor | Co-expression of 15 contiguous genes delineates a fumonisin biosynthetic gene cluster in Gibberella moniliformis[END_REF][START_REF] Proctor | A fumonisin biosynthetic gene cluster in Fusarium oxysporum strain O-1890 and the genetic basis for B versus C fumonisin production[END_REF]). The gene cluster of this biosynthetic pathway is concentrated in a 75 kb DNA region. Fumonisins biosynthetic pathway starts with the formation of a linear C18 backbone polyketide with two methyl groups and a terminal carbonyl, followed by condensation with alanine to form the C20 chain. Over 15 genes have been identified so far in the fumonisins biosynthetic cluster. However, the function of many of them remains poorly known [START_REF] Brown | Comparative analysis of 87,000 expressed sequence tags from the fumonisin-producing fungus Fusarium verticillioides[END_REF]. The first gene that was characterized was FUM1 which assembles the 18 carbon backbone chain from a molecule of acetyl-CoA and two molecules of S-adenosyl methionine [START_REF] Huffman | Recent advancements in the biosynthetic mechanisms for polyketide-derived mycotoxins[END_REF]. FUM8, which encodes for an homologous of class II α-aminotransferases, is the next gene in the cluster and it is responsible for the condensation of the backbone chain [START_REF] Huffman | Recent advancements in the biosynthetic mechanisms for polyketide-derived mycotoxins[END_REF]). In addition, FUM21, which encodes for a Zn(II)-2Cys6 DNA-binding transcription factor, is a specific pathway regulator [START_REF] Brown | The Fusarium verticillioides FUM gene cluster encodes a Zn(II)2Cys6 protein that affects FUM gene expression and fumonisin production[END_REF]. It positively regulates the expression of FUM genes and is thus necessary for fumonisins production.

Absorption of fumonisins and particularly of FB1 after oral ingestion is very low and remains under 4% [START_REF] Martinez-Larranaga | Toxicokinetics and oral bioavailability of fumonisin B1[END_REF]). However, it is rapidly distributed in all organs and tissues and more particularly in the liver and kidneys, which are the main target organs of this mycotoxin [START_REF] Voss | A preliminary investigation on renal and hepatic toxicity in rats fed purified fumonisin B1[END_REF], Rotter et al. 1996b). Elimination occurs through feces, biliary and urinary secretions as the parent compound or after microbial deesterification, which results in partial or total hydrolization of FB1 into HFB1 (Shephard et al. 1994a, Shephard et al. 1994b, Shephard et al. 1994c[START_REF] Martinez-Larranaga | Toxicokinetics and oral bioavailability of fumonisin B1[END_REF]. There is no proof of FB1 biotransformation due to P450 cytochromes activities [START_REF] Merrill | Sphingomyelin hydrolysis and regulation of the expression of the gene for cytochrome P450[END_REF]). However, this mycotoxin is able to inhibit CYP2C11 and CYP1A2 activity by suppression of proteinase K [START_REF] Spotti | Effect of fumonisin B(1) on rat hepatic P450 system[END_REF].

Toxicity of fumonisins was first reported for FB1 in farm animals in the late 80's with leukoencephalomalacia in horses [START_REF] Marasas | Leukoencephalomalacia in a horse induced by fumonisin B1 isolated from Fusarium moniliforme[END_REF][START_REF] Kellerman | Leukoencephalomalacia in two horses induced by oral dosing of fumonisin B1[END_REF]) and pulmonary oedemas in pigs [START_REF] Harrison | Pulmonary edema and hydrothorax in swine produced by fumonisin B1, a toxic metabolite of Fusarium moniliforme[END_REF]), these two species being the most sensitive to FB1. Later, laboratory studies showed hepatotoxic, nephrotoxic, carcinogenic, immunotoxic, developmental and reprotoxic effects [START_REF] Riley | Dietary fumonisin B1 induces disruption of sphingolipid metabolism in Sprague-Dawley rats: a new mechanism of nephrotoxicity[END_REF][START_REF] Voss | Subchronic toxicity of fumonisin B1 to male and female rats[END_REF][START_REF] Gelderblom | Fumonisin-induced hepatocarcinogenesis: mechanisms related to cancer initiation and promotion[END_REF][START_REF] Marasas | Fumonisins disrupt sphingolipid metabolism, folate transport, and neural tube development in embryo culture and in vivo: a potential risk factor for human neural tube defects among populations consuming fumonisin-contaminated maize[END_REF], Bracarense et al. 2012). In addition, embryotoxicity and embryolethality caused by fumonisins is strongly suspected in poultry [START_REF] Javed | Embryopathic and embryocidal effects of purified fumonisin B1 or Fusarium proliferatum culture material extract on chicken embryos[END_REF][START_REF] Rauber | Individual and combined effects of Salmonella typhimurium lipopolysaccharide and fumonisin B1 in broiler chickens[END_REF]. In humans, there is evidence supporting a role of exposure to FB1 in neural tube defects [START_REF] Marasas | Fumonisins disrupt sphingolipid metabolism, folate transport, and neural tube development in embryo culture and in vivo: a potential risk factor for human neural tube defects among populations consuming fumonisin-contaminated maize[END_REF]) and in liver and oesophagus cancer [START_REF] Sun | Fumonisin B1 contamination of home-grown corn in high-risk areas for esophageal and liver cancer in China[END_REF][START_REF] Alizadeh | Fumonisin B1 contamination of cereals and risk of esophageal cancer in a high risk area in northeastern Iran[END_REF]). FB1 has thus been classified in the group 2B by IARC as "possible carcinogenic to humans" [START_REF] Iarc | Some traditional herbal medicines, some mycotoxins, naphthalene and styrene[END_REF].

Although FB1 increases micronucleus frequency and DNA strand breaks in vitro and in vivo, it is not considered as a genotoxic carcinogen since it lacks reactivity to DNA [START_REF] Müller | Fumonisin B1 and the kidney: Modes of action for renal tumor formation by fumonisin B1 in rodents[END_REF]. Carcinogenicity of FB1 is rather explained by the induction of oxidative stress, which is related to the increase of reactive oxygen species (ROS) and the impairment of antioxidant defense mechanisms (Fig. 7A) [START_REF] Jecfa | Safety evaluation of certain mycotoxins in food[END_REF][START_REF] Müller | Fumonisin B1 and the kidney: Modes of action for renal tumor formation by fumonisin B1 in rodents[END_REF]. These result in lipid peroxidation and oxidative DNA damage. However the mechanisms behind the induction of oxidative stress by FB1 are still unknown. In order to counterbalance the apoptotic effects of Sa and So, cells induce the phosphorylation of these sphingoid bases by Sphk1 into sphinganine 1-phosphate and sphingosine 1-phosphate, which are both antiapoptotic. In addition, FB1 also increases the production of 1-deoxy-sphinganine, which is also a potent pro-apoptotic.

* Pro-apoptotic metabolites ** Anti-apoptotic metabolites Another possible mode of action for FB1 carcinogenicity is related to the induction of apoptosis, which has been shown in vitro and in vivo (Fig. 7A) [START_REF] Müller | Fumonisin B1 and the kidney: Modes of action for renal tumor formation by fumonisin B1 in rodents[END_REF]. Induction of apoptosis triggers the activation of defense mechanisms such as cell proliferation, possibly leading to tumorigenesis. Again, the mechanisms by which FB1 induces apoptosis are not fully understood. Some studies provided evidence that apoptosis induction by FB1 is directly related to the increase of TNF-α, which initiates apoptosis through cell surface-mediated mechanisms, such as the caspase-3 pathway [START_REF] Jones | Analysis of fumonisin B1-induced apoptosis[END_REF][START_REF] Sharma | Decreased fumonisin hepatotoxicity in mice with a targeted deletion of tumor necrosis factor receptor 1[END_REF][START_REF] Bhandari | Fumonisin B(1)-induced alterations in cytokine expression and apoptosis signaling genes in mouse liver and kidney after an acute exposure[END_REF].

Apoptosis could also be induced by the increase of pro-apoptotic sphingoid bases and the loss of complex sphingolipids, which regulate cell adhesion. FB1 is indeed a well-known sphingolipid disruptor since it inhibits ceramide synthases [START_REF] Soriano | Mechanism of action of sphingolipids and their metabolites in the toxicity of fumonisin B1[END_REF]) due to similarities with sphinganine (Sa) and sphingosine (So), two ceramide precursors (Fig. 7B) [START_REF] Soriano | Mechanism of action of sphingolipids and their metabolites in the toxicity of fumonisin B1[END_REF]. This results in a dose-dependent increase of Sa, and a lower increase of So, before toxicity symptoms appear [START_REF] Riley | Alteration of tissue and serum sphinganine to sphingosine ratio: an early biomarker of exposure to fumonisin-containing feeds in pigs[END_REF]. Thus the Sa/So ratio is commonly used as a biomarker of fumonisin exposure. In order to counterbalance the apoptotic effects of Sa and So, cells induce the phosphorylation of these sphingoid bases by Sphk1 into sphinganine 1-phosphate and sphingosine 1-phosphate, which are both antiapoptotic [START_REF] Müller | Fumonisin B1 and the kidney: Modes of action for renal tumor formation by fumonisin B1 in rodents[END_REF]. In addition, it has been shown that FB1 also increases the production of 1-deoxy-sphinganine in vivo, which is also a potent pro-apoptotic that cannot be phosphorylated like Sa and So to reduce its toxicity due to the lack of the hydroxyl group [START_REF] Zitomer | Ceramide synthase inhibition by fumonisin B1 causes accumulation of 1-deoxysphinganine: a novel category of bioactive 1-deoxysphingoid bases and 1-deoxydihydroceramides biosynthesized by mammalian cell lines and animals[END_REF]. Other studies have shown that when FB1 or HFB1 bind to ceramide synthase, they are transformed into their N-acetyl derivatives, which are more toxic than the parent compounds [START_REF] Harrer | Identification of N-acyl-fumonisin B1 as new cytotoxic metabolites of fumonisin mycotoxins[END_REF].

Concerning the toxicity of other fumonisins, FC1 and FC2, which are structurally equivalent to FB1 and FB2 are highly phytotoxic, and FC3 and FC4, which are structurally similar to FB3 and FB4 have moderate phytotoxicity [START_REF] Abbas | Phytotoxicity and cytotoxicity of the fumonisin C and P series of mycotoxins from Fusarium spp. fungi[END_REF].

II.3. Ochratoxins

Ochratoxins (OTs) belong to a large family of mycotoxins that encompasses more than 20 different metabolites among which ochratoxin A (OTA) is the most naturally occurring and most toxic.

Ochratoxins are produced by Aspergillus species and mainly by A. ochraceus and A. westerdijkiae, which are usually found on coffee, cocoa, spices and dried fruits in tropical regions of the globe. Other OT-producing Aspergillus species are A. alliaceus, which has been detected on figs and nuts, and A. carbonarius, which is responsible for the decay of grapes and the presence of OTs in wine. Many Penicillium species also produce OTs like P. verrucosum that develops on cereals during storage in temperate regions of the world and P. nordicum, which is found on cheese and fermented meat [START_REF] Reddy | Ochratoxins -Food Contaminants: Impact on Human Health[END_REF]. As most mycotoxins, OTs are not degraded during most food-processing steps such as fermentation and cooking and they are thus frequently encountered in food and feed [START_REF] Huffman | Recent advancements in the biosynthetic mechanisms for polyketide-derived mycotoxins[END_REF]. Cereals, wine, beer and pork meat are, in this order of importance, the main sources of human exposure to OTs [START_REF] Huffman | Recent advancements in the biosynthetic mechanisms for polyketide-derived mycotoxins[END_REF]). In addition, another important feature of OTs is that they readily bind to proteins and therefore, they have also been detected in maternal milk, with the consequent exposure of infant babies [START_REF] Pfohl-Leszkowicz | Ochratoxin A: An overview on toxicity and carcinogenicity in animals and humans[END_REF]. Ochratoxins are usually co-detected with other mycotoxins such as citrinin, aristolochic acid and fumonisins, with a resulting synergistic combination and an increased risk of genotoxicity. Nevertheless, very few studies have addressed the effects of co-exposure to these mycotoxins, and more data is needed [START_REF] Reddy | Ochratoxins -Food Contaminants: Impact on Human Health[END_REF].

Ochratoxins are hybrid molecules composed of a pentaketide dihydroisocoumarin moiety linked to the amino acid phenylalanine by an amide bond at C7. There is a chlorine atom on one of the hydroisocoumarin rings that strongly contributes to toxicity. That is why OTB which is the dechlorinated form of OTA is at least 10 times less toxic than OTA [START_REF] Huffman | Recent advancements in the biosynthetic mechanisms for polyketide-derived mycotoxins[END_REF]. Other important metabolites are: OTα and OTβ, in which there is a cleavage of the amide bond of OTA or OTB, respectively; OTC, which is the ethyl ester form of OTA and the hydroxylated OTA. OTA and OTB also exist in open lactone form [START_REF] O'callaghan | Functional characterization of the polyketide synthase gene required for ochratoxin A biosynthesis in Penicillium verrucosum[END_REF].

Compared to other mycotoxins, little is known about the biosynthesis of OTs. Most of the studies have used Penicillium species and thus, a putative genetic cluster for OTA production has been identified in P. nordicum (Karolewiez andGeisen 2005, Geisen et al. 2006). Given the chemical structure of OTA, three crucial steps for its biosynthesis have been defined: (1) the biosynthesis of the polyketide isocoumarin group, which is attributed to a PKS, (2) the ligation to phenylalanine, which is conducted by a NRPS and (3) the chlorination step, which is performed by a halogenase. Accordingly, sequences coding for a PKS (otapksPN), for a NRPS (otanpsPN) and for an enzyme homologous to a chlorinating enzyme (otachlPN) have been identified in the OTA genetic cluster in P. nordicum. In addition, other sequences have also been identified in the cluster coding for transporter proteins involved in OTA export (otatraPN) [START_REF] Gallo | New Insight into the Ochratoxin A Biosynthetic Pathway through Deletion of a Nonribosomal Peptide Synthetase Gene in Aspergillus carbonarius[END_REF]. Homologous PKS genes have been identified in the genomes of A. carbonarius, A. niger, A. ochraceus, A. westerdijkae and P. nordicum and homologous NRPS genes have been identified in A. carbonarius [START_REF] Gallo | Phylogenetic Study of Polyketide Synthases and Nonribosomal Peptide Synthetases Involved in the Biosynthesis of Mycotoxins[END_REF].

Little is known on the order of the different steps leading to OTA production. The first biosynthetic pathway was proposed by Huff and Hamilton in 1979 [START_REF] Huffman | Recent advancements in the biosynthetic mechanisms for polyketide-derived mycotoxins[END_REF]) (Fig. 8A). They suggested that condensation of 1 acetyl-CoA and 4 malonyl-CoA by a PKS resulted in the formation of mellein which was oxidized into OTβ before chlorination into OTα. Then, ligation with phenylalanine would take places by the action of a NRPS, and would lead to the synthesis of OTC, which would finally be transformed into OTA by the action of an esterase. In 2001, Harris and Mantle suggested that chlorination took place in the final steps rather than before ligation to phenylalanine (Harris andMantle 2001). Finally, in 2012, Gallo et al. observed, in A. carbonarius, that when the NRPS gene in OTA cluster (ACOTAnrps) was disrupted, the mutant did not produce OTA, as expected, but neither did it produce OTC, OTB nor OTα [START_REF] Gallo | New Insight into the Ochratoxin A Biosynthetic Pathway through Deletion of a Nonribosomal Peptide Synthetase Gene in Aspergillus carbonarius[END_REF]. Only OTβ and phenylalanine were detected. They also observed that the mutant kept the ability to produce OTα after addition of exogenous OTA. Given these results, they proposed a new version of OTA biosynthesis in which OTβ is ligated to phenylalanine by the NRPS leading to OTB production (Fig. 8B). OTB is then chlorinated to give OTA which can be further metabolized to form OTα as well as other metabolites. This last step can be performed by the fungi itself or other microorganisms such as rumen microbiota [START_REF] Gallo | New Insight into the Ochratoxin A Biosynthetic Pathway through Deletion of a Nonribosomal Peptide Synthetase Gene in Aspergillus carbonarius[END_REF]. Historically, exposure to ochratoxins has been associated with Balkan Endemic Nephropathy (BEN), a human fatal disease affecting southeastern European countries and characterized by disruption of renal function [START_REF] Castegnaro | Balkan endemic nephropathy: role of ochratoxins A through biomarkers[END_REF]. This pathology has also been related to exposure to aristolochic acid, which is generally found together with OTA in food samples and has similar effects. Kidneys are actually the main target organs of OTs and OTA has been shown to be nephrotoxic to all singlestomach animals tested including mammals and birds but not to adult ruminants (Pfohl-Leszkowicz and Manderville 2007). Porcine nephropathies are the most severe conditions induced by OTA, causing atrophy of the proximal tubules, interstitial cortical fibrosis and sclerotized glomeruli and, in terms of renal function, impairment of tubular function by reduction of maximal tubular excretion of para-aminohippurate for insulin clearance and an increase in glucose excretion [START_REF] Reddy | Ochratoxins -Food Contaminants: Impact on Human Health[END_REF]. OTA also causes lesions in the gastro-intestinal tract, the spleen, brain, liver, kidney, heart and lymphoid tissues in hamsters, rats, mice and chickens (Pfohl-Leszkowicz and Manderville 2007). Embryotoxicity, teratogenicity and immunosuppression have also been reported after exposure to OTA but only at higher doses than those causing nephropathies (> 200-4000 µg/kg feed) (Pfohl-Leszkowicz and Manderville 2007, [START_REF] Reddy | Ochratoxins -Food Contaminants: Impact on Human Health[END_REF]Bhoola 2010, Vettorazzi et al. 2013). Finally, OTA has also been described as a carcinogene and it has been classified in the group 2B by IARC as "Possibly carcinogenic to humans" (IARC 1993). Nephrocarcinogenicity is the most relevant carcinogenic effect of OTA and it has been proven in rats and mice so far, with rats being more sensitive than mice and males being more sensitive than females [START_REF] Reddy | Ochratoxins -Food Contaminants: Impact on Human Health[END_REF]. However, the mode of action by which OTA induces carcinogenicity is not well understood yet. Most studies support an indirect DNA non-reactive genotoxic mechanism involving different epigenetic factors such as oxidative stress, compensatory cell proliferation and disruption of cell signalling and cell division. Additional direct mechanisms like DNA adduct formation are also possibly involved and may influence epigenetic factors [START_REF] Vettorazzi | A review on ochratoxin A transcriptomic studies[END_REF]. Sex and species differences are not well understood neither. Excretion of OTA takes place by binding to carrier proteins that transport the mycotoxin through blood circulation to the liver where it is excreted in the bile or to the kidneys for urinary excretion [START_REF] Reddy | Ochratoxins -Food Contaminants: Impact on Human Health[END_REF].

II.4. Patulin

This mycotoxin was isolated in 1943 from Penicillium griseofulvum, P. expansum and later from Aspergillus clavatus [START_REF] Puel | Biosynthesis and Toxicological Effects of Patulin[END_REF]. At that time, there was a general effort to find new active metabolites with the massive use of penicillins during World War II. Patulin was firstly identified as a new antibiotic against Gram+ and Gram-bacteria; a British company sold it under the name "Tercinin". However, its use stopped a few years later due to strong neurotoxic effects to humans and animals.

Patulin is produced by several genera of filamentous fungi among which the most important are Penicillium (13 species such as (McKinley and Carlton 1991). Other fruits such as cherries, apricots and peaches are subject to contamination by P. expansum and are thus susceptible of containing patulin. This mycotoxin is degraded during fermentation processes and therefore it is not found in alcoholic cider [START_REF] Puel | Biosynthesis and Toxicological Effects of Patulin[END_REF].

Patulin is an unsaturated heterocyclic lactone whose biosynthesis started being studied in the 1950s. It was actually the first polyketide biosynthesis to be analyzed [START_REF] Puel | Biosynthesis and Toxicological Effects of Patulin[END_REF]). The genetic cluster involved in patulin biosynthesis consists of 15 genes clustered in a 40 kb DNA region [START_REF] Artigot | Molecular cloning and functional characterization of two CYP619 cytochrome P450s involved in biosynthesis of patulin in Aspergillus clavatus[END_REF]. However only 4 of these genes have been fully characterized so far [START_REF] Puel | Biosynthesis and Toxicological Effects of Patulin[END_REF]. PatK, which encodes for 6-methylsalicylic acid synthase (6MSAS), the first enzyme in the biosynthetic pathway, PatI and PatH, which encode for two cytochromes (CYP619C2 and CYP619C3, respectively) and lastly, PatN, which encodes for an isoepoxydon dehydrogenase (IDH) involved in the final steps of patulin biosynthesis [START_REF] Puel | Biosynthesis and Toxicological Effects of Patulin[END_REF]. The function of some of the other genes has not been established experimentally, but it can be attributed based on their sequence. For instance, PatM, PatC and PatA encode for different transporters (ABC transporter, MFS transporter and acetate transporter, respectively) and PatG is involved in the decarboxylation of 6-methylsalicylic acid (6MSA) into m-cresol [START_REF] Puel | Biosynthesis and Toxicological Effects of Patulin[END_REF]. Biosynthesis of patulin consists of 10 steps, which start with the formation of 6MSA with a molecule of acetyl-CoA and 3 molecules of malonyl-CoA by 6MSAS (Fig. 9). Decarboxylation of 6MSA results in the production of m-cresol. The methyl group of mcresol is then hydroxylated and oxidized into an aldehyde group to form gentisaldehyde [START_REF] Puel | Biosynthesis and Toxicological Effects of Patulin[END_REF]. The conversion of this metabolite into the two ring structure of patulin occurs by successive formation of four post-aromatic precursors: isoepoxydon, phyllostine, neopatuline and ascladiol. However it is still not clear whether the substrate of these reactions is gentisaldehyde or gentisyl alcohol, as shown in Fig. 9. Patulin is poorly absorbed after oral administration, less than 3% is taken up by the gastric tissues and less than 20% reaches the systemic circulation. Excretion mainly takes place during the first 24 h by urine and feces. Most of the absorbed patulin is conjugated with glutathione intracellularly, which causes glutathione depletion in the cells [START_REF] Rychlik | Absorption of the mycotoxin patulin from the rat stomach[END_REF]).

Symptoms of acute toxicity encompass agitation, convulsions, dyspnea, pulmonary congestion, edema and ulceration, hyperemia and distention of the intestinal tract. Rodents seem to be the most sensitive species whereas poultry seem less affected by patulin exposure [START_REF] Puel | Biosynthesis and Toxicological Effects of Patulin[END_REF]. Sub-acute toxicity has been mainly studied in rats, and it results in weight loss, gastric and intestinal changes, neurotoxicity and alterations of renal functions at higher doses. Additionally, inhibition of several enzymes (ATPases) has also been observed in the brain and in the intestine with consequences particularly on lipid metabolism. Other studies confirmed these results in mice, hamsters and chickens [START_REF] Puel | Biosynthesis and Toxicological Effects of Patulin[END_REF]. There are only few and old studies concerning chronic exposures to patulin. The results of these studies concluded that the intestinal tract and the renal functions are essentially affected by chronic exposure to this mycotoxin [START_REF] Puel | Biosynthesis and Toxicological Effects of Patulin[END_REF]. Concerning reproductive and developmental effects, in rats, 2 mg/kg b.w. of patulin induced abortion of all embryos and in mice, the same dose provoked death of all new borns with brain, lung and cutaneous hemorrhages. Embryotoxicity and teratogenicity have also been proven in eggs [START_REF] Puel | Biosynthesis and Toxicological Effects of Patulin[END_REF]. Finally, patulin is also related to a diversity of immunomodulatory effects. It is responsible for the inhibition of macrophage function (inhibition of protein synthesis and alteration of membrane functions), and also for the reduction of IL-10, IFN-γ and IL-4 production in human macrophages, blood mononuclear cells and Tcells [START_REF] Puel | Biosynthesis and Toxicological Effects of Patulin[END_REF].Data on genotoxicity, mutagenicity and carcinogenicity are not very consistent between different studies. That is probably why IARC classified patulin in the group 3 as "not classifiable as to its carcinogenicity to humans" (IARC 1998). However, the JEFCA considers this mycotoxin as a genotoxic [START_REF] Jefca | Evaluation of certain food additives and contaminants[END_REF].

The general mechanism of toxicity of patulin lies in its ability to bind to different side chains of cysteine, lysine and hystidine as well as to α-amino acid groups of proteins, which might result in biological inactivation of several enzymes. In addition, cytotoxicity and DNA-damaging are caused by covalent bonding with sulfurydryl groups (thiols) such as the cysteine-containing tripeptide gluthatione (GSH) [START_REF] Fliege | Electrophilic Properties of Patulin. Adduct Structures and Reaction Pathways with 4-Bromothiophenol and Other Model Nucleophiles[END_REF]. DNA damages induced by patulin cause micronuclei and formation of chromosomal aberrations (clastogenic effects) [START_REF] Puel | Biosynthesis and Toxicological Effects of Patulin[END_REF].

II.5. Zearalenones

These are a group of mycotoxins produced by several Fusarium species such as F. graminearum, F. culmorum, F. crookwellense, F. equiseti, F. cerealis and F. semitectum. In fact, they are produced by most of toxigenic Fusarium species and therefore, they are usually detected in combination with other fusariotoxines like trichothecenes and fumonisins [START_REF] Scoop | Collection of occurrence data of Fusarium toxins in food and assessment of dietary intake by the population of EU member states[END_REF], Zinedine et al. 2007). As they are produced by Fusarium species, zearalenones are mostly encountered in temperate and warm countries on cereal crops, especially on corn but also on wheat, oats and soybean. Production of these mycotoxins mainly takes place in the field but also during improper cereal storage. Human exposure to zearalenones is essentially caused by consumption of contaminated raw maize, and to a lesser extent corn and wheat-derived products as well as beer [START_REF] Scoop | Collection of occurrence data of Fusarium toxins in food and assessment of dietary intake by the population of EU member states[END_REF]. Absorption, metabolization and excretion of zearalenones are generally fast and therefore, human exposure through meat and other animal products such as milk is of little significance. However, the main concern related to exposure to zearalenones is due to the fact that they are one of the most potent families of non-steroidal naturally occurring oestrogens (Zinedine et al. 2007).

In terms of chemical structure, zearalenones have a resorcinol (m-benzenediol) moiety fused to a 14member macrocyclic lactone [START_REF] Huffman | Recent advancements in the biosynthetic mechanisms for polyketide-derived mycotoxins[END_REF]). There are six major members of this family: Zearalenone (ZEN), α-zearalenol (α-ZEL), β-zearalenol (β-ZEL), α-zearalanol (α-ZAL), β-zearalanol (β-ZAL), zearalanone (ZAN). Until very recently, different abbreviations were used to refer to each metabolite. For the purpose of clarity, in this chapter, abbreviations will be used as described by Metzler [START_REF] Metzler | Zearalenone and its metabolites as endocrine disrupting chemicals[END_REF]. As depicted in figure 10, α-ZEL, β-ZEL, α-ZAL and β-ZAL contain an hydroxyl group instead of a keto group at C-6 compared to ZEN and ZAN. Also, ZAN, α-ZAL and β-ZAL have a saturated bond between C-1 and C-2 contrarily to ZEN, α-ZEL and β-ZEL. Compared to other polyketide mycotoxins, biosynthesis of zearalenones has received far less attention. Generally, m ost cl usters associated with po lyketide biosynthesis contain a single PKS and several other genes encoding transformation enzymes or regulatory genes [START_REF] Gaffoor | Characterization of two polyketide synthase genes involved in zearalenone biosynthesis in Gibberella zeae[END_REF]). However, two PKS have been identified in the biosynthetic pathway of zearalenones. PKS13, which encodes for the p rotein ZEA1p, is a n on-reduced r esorcylic ac id macrolactone m egasynthase a nd PKS4, which encodes for ZEA2p, is, on the contrary, a highly reduced polyketide synthase [START_REF] Huffman | Recent advancements in the biosynthetic mechanisms for polyketide-derived mycotoxins[END_REF]. ZEA2p is the starter enzyme in the biosynthesis of zearalenones. It is responsible for the formation of the highly reduced hexatide chain with a single acetyl-CoA and 8 malonyl-CoA molecules [START_REF] Gaffoor | Characterization of two polyketide synthase genes involved in zearalenone biosynthesis in Gibberella zeae[END_REF]) (Fig. 10). During biosynthesis, the polyketide chain can be partially reduced forming an alkene, which will further lead to ZEN or, the keto groups can be fully reduced forming an alkane, leading t o Z AN pr oduction (Gaffoor and Trail 200 6). Then ZEA1p i s in ch arge of t he iterative elongation of the chain by t he addition o f unr educed k etones and is also in charge of t he aromatic cyclization (Gaffoor andTrail 2006, Huffman et al. 2010) (Fig. 10). In addition to PKS13 and PKS4, ZEB1 and ZEB2 ha ve also bee n des cribed in t he biosynthetic pathway of z earalenones. Z EB1 i s a In mammals putative isoamyl alcohol oxidase that oxydates α-ZEL and β-ZEL into ZEN, and α-ZAL and β-ZAL into ZAN [START_REF] Huffman | Recent advancements in the biosynthetic mechanisms for polyketide-derived mycotoxins[END_REF]) (Fig. 10). ZEB2 is a leucine zipper domain-containing regulator that controls the expression of the other genes of the cluster [START_REF] Huffman | Recent advancements in the biosynthetic mechanisms for polyketide-derived mycotoxins[END_REF].

Interestingly, ZEN can be metabolized back to α-ZEL and β-ZEL and ZAN back to α-ZAL and β-ZAL in mammalian cells [START_REF] Metzler | Zearalenone and its metabolites as endocrine disrupting chemicals[END_REF]. Actually, ZEN can undergo both phase I and phase II metabolization in fungal, plant and mammalian cells. Phase I metabolism includes reduction of the keto groups and hydroxylation of aliphatic or aromatic groups. It has been shown recently that fungi produce a large variety of phase I metabolites such as 13-formyl ZEN, 5,6-dehydroxy ZEN, 5-hydroxy ZEN and 10-hydroxy ZEN (Metzler et al. 2010). Mammalian cells with 3α-and 3β-hydroxysteroid dehydrogenases (HSDs) activities are able to reduce ZEN back to α-ZEL and β-ZEL (in rats, ruminants, swine, turkeys, hens and probably humans too) and ZAN back to α-ZAL and β-ZAL (in cattle, sheeps, horses, goats and deers) [START_REF] Minervini | Zearalenone and Reproductive Function in Farm Animals[END_REF]Dell'Aquila 2008, Metzler et al. 2010) (Fig. 10). HSDs are involved in the synthesis of steroid hormones like E2. Liver is the major organ where this metabolization takes place but it also occurs in other organs with HSDs activity such as the kidneys, the testis, the prostate, the hypothalamus, the ovaries and the intestine. Additionally, hydroxylation of the aromatic group by human CYP1A2 forms 13-and 15-hydroxyl ZEN, two highly unstable catechols, which are further oxidized into quinone-type electrophiles that can cause DNA-adducts [START_REF] Metzler | Zearalenone and its metabolites as endocrine disrupting chemicals[END_REF]. Phase II metabolism consists on the conjugation of ZEN with glucuronides or sulfates. The resulting metabolites are readily excreted mainly in urines but also in blood and bile. From the bile, glucuronides-metabolites can be reabsorbed back in the intestine and hydrolyzed again [START_REF] Metzler | Zearalenone and its metabolites as endocrine disrupting chemicals[END_REF]. In mammalian cells, conjugation is performed by uridine diphosphate glucuronyl transferases (UDPGT) and forms monoglucuronides of ZEN [START_REF] Metzler | Zearalenone and its metabolites as endocrine disrupting chemicals[END_REF]. There is little evidence concerning conjugation of ZEN with sulfates but it has been soundly postulated [START_REF] Metzler | Zearalenone and its metabolites as endocrine disrupting chemicals[END_REF]. In plants, conjugation occurs with polar molecules present in the host cells. The resulting metabolites are often difficult to detect because their polarity and solubility is different from the parent compound for which the detection method was designed. Therefore, many of the metabolites produced in plants are considered as masked mycotoxins.

Zearalenone was first detected after appearance of hyperestrogenism symptoms in swine fed moldy maize. These symptoms include prolonged estrus, anestrus, changes in libido, infertility, increased incidence of pseudo pregnancy, increased udder or mammary gland development, and abnormal lactation [START_REF] Metzler | Zearalenone and its metabolites as endocrine disrupting chemicals[END_REF]. It is also related to the following secondary complications stillbirths, abortions, mastitis, vulvovaginitis and rectal or vaginal prolapses [START_REF] Metzler | Zearalenone and its metabolites as endocrine disrupting chemicals[END_REF]. Endocrine disruption related to zearalenone is attributed to both genomic and non-genomic effects. First, zearalenone competes effectively with endogenous steroid estrogens like 17β-estradiol (E2) for the specific binding sites of estrogen receptors (ER), with no preference between the two isomers ER-α and ER-β [START_REF] Metzler | Zearalenone and its metabolites as endocrine disrupting chemicals[END_REF]) (Fig. 11). ER receptors are found in many different organs such as the uterus, the mammary glands, the bones, the liver and the brain, where zearalenone can therefore have an impact. Relative binding affinities of the main metabolites are as follows: α-ZAL> α-ZEL> β-ZAL> ZEN> β-ZEL. The α-isomers are about 10 fold more active than the rest because of the position of the hydroxyl group. Differences in production of α or β isomers explain differences in sensitivity between species. For instance, pigs produce more α-ZEL whereas chickens produce more β-ZEL. Given its high affinity for the ER, α-ZAL has been used in cattle industry in the USA as a growth promoter under the name RalGro®, it is nevertheless forbidden in Europe [START_REF] Metzler | Zearalenone and its metabolites as endocrine disrupting chemicals[END_REF]. Nongenomic endocrine disruption is caused by the ability of ZEN to disrupt the biosynthesis of steroid hormones by binding to HSDs and more particularly by inhibiting 3α-reduction of steroidal hormones (Fig. 11). This results in an accumulation of some active molecules that can induce reproductive and developmental toxicity in both females and males [START_REF] Minervini | Zearalenone and Reproductive Function in Farm Animals[END_REF]. Disruption of the reproductive tract of laboratory and domestic animals is highly dependent on the reproductive status [START_REF] Minervini | Zearalenone and Reproductive Function in Farm Animals[END_REF]. In female mice this impairment has been related to fibrosis in uterus cystic ducts, in mammary glands and myelofibrosis [START_REF] Minervini | Zearalenone and Reproductive Function in Farm Animals[END_REF]. In male pigs, zearalenone induces a decrease in serum testosterone, weight of testes and spermatogenesis and also feminization and suppression of libido [START_REF] Minervini | Zearalenone and Reproductive Function in Farm Animals[END_REF]. In male rats, it has been shown that it causes inflammation of the prostate gland, testicular atrophy and cysts or cystic ducts in mammary glands [START_REF] Minervini | Zearalenone and Reproductive Function in Farm Animals[END_REF]. Developmental toxicity is mostly due to the fact that ZEN and its metabolites are able to cross the placental barrier and reach the fetus with the resulting exposure in early stages of life [START_REF] Metzler | Zearalenone and its metabolites as endocrine disrupting chemicals[END_REF]) (Fig. 11). As a consequence, there is a reduction of embryonic survival probably caused by alterations of the uterus due to a decrease of the secretion of lutheinizing hormone (LH) and progesterone and to morphological impairments of uterine tissues. No teratogenic effects have been reported for zearalenones [START_REF] Jefca | Evaluation of certain food additives and contaminants[END_REF].

Fig. 11: Mechanisms of toxicity of zearalenone (ZEN).

Zearalenone is mainly known for its hyperoestrogenic effects. This endocrine disruption is attributed to both genomic and non-genomic effects. Genomic effects are due to its similarities with 17β-estradiol (E2) and thus its high affinity for estrogen receptors (ER), with no preference between the two isomers ER-α and ER-β. Relative binding affinities of the main metabolites are as follows: α-ZAL> α-ZEL> β-ZAL> ZEN> β-ZEL. Nongenomic endocrine disruption is caused by the ability of ZEN to disrupt the biosynthesis of steroid hormones by binding to hydroxysteroid dehydrogenases (HSDs) and more particularly by inhibiting 3α-reduction of steroidal hormones. Developmental toxicity is mostly due to the fact that ZEN and its metabolites are able to cross the placental barrier and reach the fetus. Zearalenone is also related to carcinogenesis. Hydroxylation of ZEN by human CYP1A2 forms 13-and 15hydroxyl ZEN, two highly unstable catechols, which are further oxidized into quinone-type electrophiles that can cause DNA-adducts; there is also evidence of DNA fragmentation and micronuclei production.

In addition to these effects, exposure to zearalenone is also associated with stimulation of breast cancer cells in humans [START_REF] Ahamed | Signal transduction through the Ras/Erk pathway is essential for the mycoestrogen zearalenone-induced cell-cycle progression in MCF-7 cells[END_REF], pituitary tumors and hepato-adenomas in mice and rats (Zinedine et al. 2007). Also, symptoms of zearalenone poisoning due to scabby grains are generally similar to deoxynivalenol poisoning (described in the next section) that is nausea, vomiting and diarrhea. Zearalenone has also been shown to have immunosuppressive effects in pigs in vivo (Marin et al. 2013, Pistol et al. 2013). However zearalenone has a low acute toxicity LD50 value in the g/kg b.w. after oral administration in all animal species tested; pigs and sheep being the most sensitive [START_REF] Metzler | Zearalenone and its metabolites as endocrine disrupting chemicals[END_REF].

Nevertheless, the mechanisms behind these pathologies are still not well understood. Some studies have shown that oxidation of catechols can induce DNA-adduct formation, and there is also evidence of DNA fragmentation and micronuclei production (Zinedine et al. 2007[START_REF] Metzler | Zearalenone and its metabolites as endocrine disrupting chemicals[END_REF]) (Fig. 11). Based on current knowledge, zearalenone and its metabolites have been classified in the group 3 by IARC as: "not classifiable as to their carcinogenicity in humans" (IARC 1997).

III. TERPENE MYCOTOXINS

Terpenes are compounds that are derived from the combination of isopentenyl diphosphate (IPP) and dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) by the action of prenyl transferases, also known as isoprenyl diphosphate synthases. Geranyl diphosphate (GPP) is the result of one molecule of IPP and one molecule of DMAPP, addition of a supplementary IPP forms farnesyl diphosphate (FPP), which is an important precursor of fungal secondary metabolites. Terpenes are not only produced by fungi but they are also important secondary metabolites for bacteria and plants. In the latter, they play a role of pollinator attractors, chemical and physical barrier against herbivores and ovopositing insects [START_REF] Chen | The family of terpene synthases in plants: a mid-size family of genes for specialized metabolism that is highly diversified throughout the kingdom[END_REF]). In addition, terpenes are of great interest in the pharmaceutical industry (taxol, used in treatments against lung, breast and ovary cancers), in the agroalimentary industry (menthol, used as a flavouring agent), in the cosmetics industry (santalols, used as fragances) and as biofuel precursors (farnesene) [START_REF] Chen | The family of terpene synthases in plants: a mid-size family of genes for specialized metabolism that is highly diversified throughout the kingdom[END_REF]). Based on their structure, terpenes can be classified as monoterpenes, which are rare in fungi with the exception of chlorinated monoterpenes that have been isolated from mangrove endophytic fungus Tryblidiopycnis sp.; sesterpenes as neomangicols, which are produced by both plants and fungi; triterpenes, which are more frequently produced by plants and rarely reported from microorganisms; tetraterpenes or carotenoids which protect from intense sun radiation (reactive oxygen species and free radicals) [START_REF] Ebel | Terpenes from Marine-Derived Fungi[END_REF]; and sesquiterpenes that encompass the family of trichothecenes that will be further described in this section.

III.1. Generalities on trichothecenes

Trichothecenes are the most representative and best studied of terpene mycotoxins. They form a large family of over 150 secondary metabolites produced worldwide by fungi of different and taxonomically unrelated genera such as Trichothecium, Fusarium, Stachybotrys, Myrothecium and Trychoderma (Rocha et al. 2005). The first trichothecene to be described was trichothecin, an antifungal isolated from Trichothecium roseum cultures [START_REF] Freeman | Trichothecin; an antifungal metabolic product of Trichothecium roseum Link[END_REF]. However, Fusarium species are the most occurring of trichothecenes-producing fungi. These species are important plant pathogens that particularly contaminate cereals such as wheat, barley, oats and maize and are responsible for several phytopathologies, such as Fusarium Head Blight disease and stalk and cob rot, which causes important crop losses worldwide. Fusarium species can be classified in order of decreasing virulence, as follows: F. graminearum, F. culmorum, F. sporotrichoides, F. langsethiae and F. poae.

Trichothecenes are readily encountered in food and feed since they are heat stable, and thus resistant to food processing and autoclaving (Eriksen and Pettersson 2004). After ingestion, they are not degraded in the stomach since they are also stable at neutral and acidic pH (Eriksen and Pettersson 2004). Once in the intestine, trichothecenes are rapidly absorbed in the upper parts 30 min after ingestion and they are also rapidly excreted through feces and urine 24 h after ingestion. Therefore, there is little risk for carry-over of the toxins from animals to human through food consumption [START_REF] Eriksen | Fusarium Toxins in Cereals: A Risk Assessment[END_REF]. Toxicity of trichothecenes has been reported for humans as well as for all animals species tested [START_REF] Desjardins | Trichothecene biosynthesis in Fusarium species: chemistry, genetics, and significance[END_REF]. The first alerts concerning human susceptibility to trichothecenes arose during the Second World War in the Soviet Union with outbreaks of alimentary toxic aleukia after consumption of grains infected with F. sporotrichoides (Desjardins et al. 1993, Bennett andKlich 2003). F. sporotrichoides is a T-2 producing species and these outbreaks were thus associated with this mycotoxin, although there is still not enough evidence to prove it. T-2 toxin is also suspected of having been used as a biochemical weapon in Southeast Asia in the 1980s [START_REF] Maddox | Natural history of yellow rain[END_REF].

All trichothecenes are sesquiterpenes, which share a common structural backbone made of a tricyclic nucleus, called trichothecene, and usually, a double bond at C-9, 10 and an epoxide at C-12, 13. The latest is considered to be very important for toxicity [START_REF] Desjardins | Trichothecene biosynthesis in Fusarium species: chemistry, genetics, and significance[END_REF]. Based on differences in the position and number of hydroxylations and also the number and complexity of esterifications, trichothecenes can be classified into 4 groups [START_REF] Ueno | Biological and chemical detection of trichothecene mycotoxins of Fusarium species[END_REF]:

Type A: contrarily to the other trichothecenes, these trichothecenes lack a ketide group at C-8 position. The most representative mycotoxins of this group are T-2 toxin, its hydrolyzed derivate, HT-2 and diacetoxyscirpenol (DAS).

Type B: These trichothecenes have a ketide group at C-8 position. Deoxynivalenol (DON), nivalenol (NIV) and their acetylated derivatives (3-acetyldeoxynivalenol, 15acetyldeoxynivalenol and 4-acetylnivalenol or fusarenon X) are the most occurring and bestcharacterized mycotoxins of this group.

Type C: In addition to the ketide group, these trichothecenes have an epoxyde group at C-7,8 position. Crotocin is an example of type C trichothecenes. There is not much data on this type of trichothecenes, which will not be further addressed in this section.

Type D: These trichothecenes contain a macrocyclic ring between C-4 and C-15. Verrucarins and satratoxins are well-known type D trichothecenes.

Types A and B are the most occurring and they are generally produced by Fusarium species, whereas types C and D are generally produced by Mycothecium, Trichotecium and Stachybotrys. Among Fusarium species, F. sporotrichoides, F. poae and F. langsethiae are type A trichothecenes-producing species whereas F. graminearum and F. culmorum are rather type B trichothecenes-producing species.

Trichothecenes biosynthesis

Biosynthesis of trichothecenes has been widely studied since the 1980's, and initially on F. sporotrichoides and F. sambucinum. Fifteen genes have been identified as Tri genes that encode for the so-called TRI enzymes. Contrarily to most genes involved in the biosynthesis of mycotoxins, Tri genes are not gathered in a cluster but they are located in three different loci on different chromosomes [START_REF] Kimura | Molecular and genetic studies of Fusarium trichothecene biosynthesis: Pathways, genes, and evolution[END_REF], Merhej et al. 2011). There is a 12-gene core Tri cluster, but also a Tri1, Tri6 locus and the single Tri101 locus. Overall, structures and functions of Tri genes are well conserved among species. However, there exist some differences, such as gene inactivation, which explain why some species produce one or another trichothecene [START_REF] Kimura | Molecular and genetic studies of Fusarium trichothecene biosynthesis: Pathways, genes, and evolution[END_REF]). Related to that, the biosynthetic pathway of T-2 and fusarenon X are the most used as models to study trichothecene biosynthesis and evolution of Tri genes since the production of other trichothecenes, such as deoxynivalenol or nivalenol, seem to have arisen from the inactivation of some Tri genes involved in the biosynthesis of T-2 or fusarenon X [START_REF] Kimura | Molecular and genetic studies of Fusarium trichothecene biosynthesis: Pathways, genes, and evolution[END_REF]). The first step in the biosynthetic pathway is common to all trichothecenes and consists of cyclization of farnesyl pyrophosphate (FPP) into trichodiene under the action of an enzyme encoded by Tri5 (Fig. 12). Then, 9 reactions orchestrated by TRI4, TRI101, TRI11 and TRI3 result in the production of calonectrin. From that point, the biosynthetic pathways of T-2 and NIV divert from that of DON. In T-2 and NIV biosynthetic pathways, calonectrin is tranformed by an acetyl transferase encoded by Tri7 and then by a CYP450 encoded by Tri13 into 3,4,15-triacetoxyscirpenol. This is followed by the action of species-specific genes FsTri1, FsTri16 and FsTri8 in the genome of F. sporotrichoides in order to produce T-2; and FgTri1, and FgTri8 in the genome of F. graminearum to produce nivalenol. Interestingly, FgTRI1 is able to perform a double hydroxylation on 3,4,15-triacetoxyscirpenol on the contrary of FsTRI1 [START_REF] Mccormick | Tri1 in Fusarium graminearum encodes a P450 oxygenase[END_REF].

FgTRI1 is also able to hydroxylate calonectrin directly to produce 3,15-acetyldeoxynivalenol, which is then tranformed into 3-acetyldeoxynivalenol (3-aDON) or 15-acetyldeoxynivalenol (15-aDON) by the action of FgTRI8. Finally, these are then deacetylated into DON. Notably, FgTRI7 and FgTRI13 are not operative in DON-producing species [START_REF] Brown | Functional demarcation of the Fusarium core trichothecene gene cluster[END_REF]). Production of 3-aDON or 15-aDON by FgTRI8 is strain specific and depends on DNA sequence polymorphisms of FgTri8. This polymorphism determines different chemotypes of type B-producing Fusarium species. FgTri8 DNA sequence in 3-aDON chemotype is particularly different from the sequence in 15-aDON and NIV chemotypes (only 78% homologies) whereas 15-aDON and NIV chemotypes have a sequence homology of 85% [START_REF] Alexander | The genetic basis for 3-ADON and 15-ADON trichothecene chemotypes in Fusarium[END_REF]. acetyldeoxynivalenol, which is then tranformed into 3-acetyldeoxynivalenol (3-aDON) or 15-acetyldeoxynivalenol (15-aDON) by the action of FgTRI8. These are then deacetylated into DON. Biosynthesis of macrocyclic trichothecenes (type D) diverts from that of the other trichothecenes after trichotriol production. However, this biosynthetic pathway is less well known than that of types A and B. After trichotriol, different steps result in the synthesis of roridin E, which is the first macrocyclic metabolite. Verrucarins and satratoxins derive from roridin E.

Reproduced with modifications from [START_REF] Nielsen | Mould growth on building materials: Secondary metabolites, mycotoxins and biomarkers[END_REF][START_REF] Alexander | The genetic basis for 3-ADON and 15-ADON trichothecene chemotypes in Fusarium[END_REF].

Biosynthesis of macrocyclic trichothecenes (type D) diverts from that of the other trichothecenes after trichotriol production [START_REF] Nielsen | Mould growth on building materials: Secondary metabolites, mycotoxins and biomarkers[END_REF]) (Fig. 12). However, this biosynthetic pathway is less well known than that of types A and B, and more particularly there is little knowledge on the Tri genes involved in it. After trichotriol, different steps result in the synthesis of roridin E, which is the first macrocyclic metabolite [START_REF] Nielsen | Mould growth on building materials: Secondary metabolites, mycotoxins and biomarkers[END_REF]. Verrucarins and satratoxins derive from roridin E.

Other Tri genes play a role in the regulation of trichothecenes biosynthesis regulation. For example, TRI6, which is a Cys2His2 zinc finger transcription factor, is a central pathway specific regulator in both type A-and type B-producing Fusarium species (Merhej et al. 2011). TRI10 is also a pathway specific regulator which is upstream TRI6 but which plays a more important role in F. sporotrichoides than in F. graminearum. On the contrary, Tri14 another regulator, reduces pathogenicity only in F. graminearum but not in F. sporotrichoides.

Toxicity and mode of action

Trichothecenes are primarily phytotoxins responsible for wilting, chlorosis and necrosis, which result in growth retardation, inhibition of seedling and inhibition of plant regeneration. It has been shown that production of trichothecenes favors fungal development on the plant, but it is not essential for the appearance of disease symptoms [START_REF] Boenisch | Fusarium graminearum forms mycotoxin producing infection structures on wheat[END_REF]. Trichothecenes have also been shown to be toxic to humans and to all tested animals. The mechanism of such toxicity lies on multiple inhibitory effects on the primary metabolism of eukaryotic cells and mainly on the synthesis of proteins (Rocha et al. 2005). Trichothecenes are also responsible for the inhibition of DNA and RNA synthesis as wells as inhibition of mitochondrial activity and modulation of mitogen-activated protein kinases (MAPK) [START_REF] Pestka | Cellular and molecular mechanisms for immune modulation by deoxynivalenol and other trichothecenes: unraveling a paradox[END_REF]). Inhibition of protein synthesis is due to binding to the active site of a peptidyl transferase on the 60S ribosomal subunit. This results in what is known as ribotoxic stress response, which triggers most of the other inhibitory effects caused by trichothecenes. These effects at the molecular level generate alterations at the cellular level such as cell proliferation, cytokine production and modulation of the immune system, increased susceptibility to infectious diseases, growth retardation and reproductive disorders [START_REF] Omar | Immunotoxicological risk of mycotoxins for domestic animals[END_REF], Rocha et al. 2005). The effects induced by trichothecenes are highly dependent on the dose and frequency of exposure. As an example, they can be immune-stimulatory at low doses and short exposure times by activating inflammatory genes; but, at high dose exposure, they can also trigger immunosuppression by inducing apoptosis of leukocytes [START_REF] Pestka | Cellular and molecular mechanisms for immune modulation by deoxynivalenol and other trichothecenes: unraveling a paradox[END_REF]). As already mentioned, toxicity of trichothecenes comes from the presence of an epoxy group; therefore de-epoxydation appears as an efficient detoxifying mechanism (Eriksen and Pettersson 2004). Differences in the ability to de-epoxydate trichothecenes explain the differences in susceptibility to trichothecenes. That is why the pig is one of the most sensitive animal species [START_REF] Omar | Immunotoxicological risk of mycotoxins for domestic animals[END_REF]).

In the last years, there is an increasing number of studies showing the co-occurrence of trichothecenes in corn, wheat and barley [START_REF] Scoop | Collection of occurrence data of Fusarium toxins in food and assessment of dietary intake by the population of EU member states[END_REF]. That is why there is also an increasing number of studies that pay attention to the effects of multicontaminations, and more particularly of the most frequent DON and NIV co-occurrence [START_REF] Alassane-Kpembi | New insights into mycotoxin mixtures: The toxicity of low doses of Type B trichothecenes on intestinal epithelial cells is synergistic[END_REF].

A more detailed description of type A, B and D trichothecenes is given below.

III.2. Type A Trichothecenes

T-2 toxin

T-2 toxin is considered to be the most toxic of the trichothecenes family produced by Fusarium species, although it is not the most occurring (Rocha et al. 2005[START_REF] Li | T-2 toxin, a trichothecene mycotoxin: review of toxicity, metabolism, and analytical methods[END_REF]. It is produced mainly species of the section Sporotrichiella, such as F. sporotrichoides, F. poae and F. langsethiae, which are mainly found in cold climate regions or during wet storage conditions.

As other trichothecenes, T-2 can induce a large variety of effects in humans and animals resulting from inhibition of protein synthesis, such as weight loss, emesis, disruption of hematological parameters, immunosuppression, damages in the liver and stomach and ultimately death (Rocha et al. 2005[START_REF] Li | T-2 toxin, a trichothecene mycotoxin: review of toxicity, metabolism, and analytical methods[END_REF]). This mycotoxin is also related to embryo and fetal toxicity in pigs (Rocha et al. 2005).

Over 20 metabolites of T-2 have been identified so far [START_REF] Wu | Metabolic pathways of trichothecenes[END_REF]). Among these, HT-2 is a major metabolite of T-2, which is produced by F. sporotrichoides, F. poae and F. langsethiae but also by metabolization in mammalians cells, particularly in humans and rabbits. It is produced mainly in the liver and in the gut by hydrolysis of T-2 by a non-specific carboxyesterase. HT-2 is further metabolized into 3-hydroxy HT-2 and 4-hydroxy HT-2 by the action of a CYP450 in the liver. Toxicity of these hydroxylated metabolites has been shown to be greater than T-2 and HT-2. 3hydroxy HT-2 is then excreted free in urine or as its glucuronide form [START_REF] Wu | Metabolic pathways of trichothecenes[END_REF]. HT-2 can also be hydrolyzed into T-2 tetraol, which is less toxic than T-2 and HT-2 and is easily excreted in the urines. As for the other trichothecenes, de-epoxydation is a major detoxification mechanism for T-2.

De-epoxy T-2 is especially produced in rodents, ruminants and swine [START_REF] Wu | Metabolic pathways of trichothecenes[END_REF]). Although T-2 metabolites are well known, knowledge on the toxicity of these compounds is still limited and would deserve more attention [START_REF] Li | T-2 toxin, a trichothecene mycotoxin: review of toxicity, metabolism, and analytical methods[END_REF].

III.3. Type B Trichothecenes

Type B trichothecenes are the most common contaminants of cereal grains in temperate regions of the world. A large scale data survey indicates that DON, 15-aDON, NIV, Fusarenon X (FX) and 3-aDON are present in 57%, 20%, 16%, 10% and 8%, respectively of food samples collected in the European Union [START_REF] Scoop | Collection of occurrence data of Fusarium toxins in food and assessment of dietary intake by the population of EU member states[END_REF]. Type B-producing Fusarium species can be classified in different chemotypes according to the set of type B trichothecenes they produce. There are namely 3 chemotypes: (1) NIV/FX, (2) DON/3-aDON and (3) DON/15-aDON.

Nivalenol and Fusarenon X

Nivalenol is mainly produced by Fusarium species of the section Discolor such as F. crookwellense and F. poae and to a lesser extent by F. graminearum and F. culmorum [START_REF] Eriksen | Fusarium Toxins in Cereals: A Risk Assessment[END_REF]. Phytopathogenicity associated to this mycotoxin is low and therefore, apparently healthy cereal grains may contain important levels of nivalenol. Highest concentrations of nivalenol can be found in oats, maize, barley and wheat cereals and by-products (JEFCA 2013).

Nivalenol is responsible for reduction of feed intake, growth retardation, different nephropathies, immunotoxicity and haematotoxicity (Rocha et al. 2005, Wu et al. 2011, JEFCA 2013). In addition, nivalenol is 10 times more toxic to lymphocytes than DON due to the presence of an hydroxyl group at the position C-4, that is absent in the structure of DON [START_REF] Ueno | The toxicology of mycotoxins[END_REF]. In mice, NIV can be transferred to fetus by placenta and to suckling mice through milk [START_REF] Wu | Metabolic pathways of trichothecenes[END_REF].

Fusarenon X (FX), which is produced by acetylation of NIV at C-4 position, is the major metabolite of this mycotoxin in mice, chicken and ducks [START_REF] Wu | Metabolic pathways of trichothecenes[END_REF]). After ingestion, FX is rapidly metabolized back to NIV in liver and kidney, and it can be then excreted in urines [START_REF] Wu | Metabolic pathways of trichothecenes[END_REF]. In ruminants, rats and swine, NIV is de-epoxydated in the rumen or in the lower parts of the gastrointestinal tract and its toxicity is thus drastically decreased (Eriksen and Pettersson 2004).

Deoxynivalenol and its acetylated derivatives

Although it is not one of the most toxic trichothecenes, deoxynivalenol is of great concern in terms of public health because it is one of the most occurring mycotoxins that can be found in cereals [START_REF] Wu | Metabolic pathways of trichothecenes[END_REF]. It is mainly produced by Fusarium species of the section Discolor such as F. graminearum, F. culmorum, F. crookwellense and F. sambucinum. Its acetylated derivatives, 3-aDON and 15-aDON, that are directly formed by fungi, are most generally found together with DON in contaminated samples, although the proportions in which they are present vary depending on the strain chemotype.

In plants, DON is considered as a virulence factor during the infection of wheat spikes, which enables fungal colonization of the wheat rachis after infection of the florets [START_REF] Proctor | Reduced virulence of Gibberella zeae caused by disruption of a trichothecene toxin biosynthetic gene[END_REF][START_REF] Desjardins | Reduced virulence of trichothecene-nonproducing mutants of Gibberella zeae in wheat field tests[END_REF][START_REF] Boenisch | Fusarium graminearum forms mycotoxin producing infection structures on wheat[END_REF]. In humans and animals, DON is also known as vomitoxin due to its emetic effects after acute exposures [START_REF] Vesonder | Isolation of the emetic principle from Fusariuminfected corn[END_REF]). In addition to that, symptoms caused by acute exposure are similar to those observed after ionization: abdominal pain, salivation, diarrhea, vomiting, leucocytosis and gastro-intestinal hemorrhage [START_REF] Pestka | Deoxynivalenol: toxicology and potential effects on humans[END_REF]. Chronic exposure to DON causes feed refusal [START_REF] Maresca | From the gut to the brain: journey and pathophysiological effects of the foodassociated trichothecene mycotoxin deoxynivalenol[END_REF], due to alterations of seritogenic activity of both the peripherous and central nervous system (Fig. 13A) [START_REF] Razafimanjato | The ribotoxin deoxynivalenol affects the viability and functions of glial cells[END_REF]. Other effects related to chronic ingestion of DON are weight loss, growth retardation, intestinal irritation, disruption of immune response and death (Rocha et al. 2005).

Toxicity of DON is caused by the same molecular mechanisms as the other trichothecenes (Rotter et al. 1996a). Immune modulation induced by DON has been extensively studied and it has been shown that inflammation arises from MAPK activation, followed by activation of the prostaglandinendoperoxide synthase 2 (Cox-2) and a consecutive increase of prostaglandins which triggers the production of inflammatory cytokines [START_REF] Moon | Vomitoxin-induced cyclooxygenase-2 gene expression in macrophages mediated by activation of ERK and p38 but not JNK mitogen-activated protein kinases[END_REF]) (Fig. 13A). Recently, DON has been shown to maintain inflammation by favoring the Th-17-related immune response, which could be associated to chronic inflammatory intestinal diseases [START_REF] Maresca | From the gut to the brain: journey and pathophysiological effects of the foodassociated trichothecene mycotoxin deoxynivalenol[END_REF]Fantini 2010, Cano et al. 2013b).

Low doses of this toxin can induce morphological and histological impairments of the intestinal epithelial cells, and also alter the intestinal permeability (Pinton et al. 2012). Toxicity of DON has thus repercussions on the neuro-endocrine system, the intestinal system and the immune system. Based on DON concentrations, the immune system appears to be the most sensitive, followed by the neuroendocrine system and finally by the intestinal system (Fig. 13B).

Detoxification of DON is principally due to de-epoxydation processes that lead to de-epoxy DON, known as DOM-1. DON de-epoxydation is essentially performed by bacteria of the genus Eubacterium, in the gut of ruminants, rodents, poultry and swine [START_REF] Volkl | Microbial detoxification of mycotoxin deoxynivalenol[END_REF], Wu et al. 2011).

Results of the BrdU bioassay, which detects the incorporation of 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) during DNA replication as an indicator of cell proliferation, showed that DOM-1 is 55 times less toxic than DON (Eriksen and Pettersson 2004). De-epoxydation of DON has been estimated to be 95% efficient in ruminants, 80% in poultry but only 5% in swine, which explains the high susceptibility of this species to DON exposure [START_REF] Turner | Determinants of urinary deoxynivalenol and de-epoxy deoxynivalenol in male farmers from Normandy, France[END_REF][START_REF] Yu | Isolation of deoxynivalenol-transforming bacteria from the chicken intestines using the approach of PCR-DGGE guided microbial selection[END_REF].

Fig. 13: Effects of deoxynivalenol (DON).

In humans and animals, DON affects the intestinal system, the immune system and the neuro-endocrine (NE) system. There is an important interplay between these three systems as depicted in the figure (A). For instance, feed refusal induced by this mycotoxin is caused by alterations of the seritogenic activity of both the peripherous and central nervous system. The production of pro-inflammatory cytokines (CK) is also modulated by the presence of DON and this has repercussions on the immune response, the intestine and the NE system. The three systems have different sensitivities to DON (B). The immune system appears to be the most sensitive followed by the NE system and finally by the intestinal system. Reproduced with modifications from [START_REF] Maresca | From the gut to the brain: journey and pathophysiological effects of the foodassociated trichothecene mycotoxin deoxynivalenol[END_REF].

III.4. Type D Trichothecenes

Satratoxins

Stachybotryotoxicosis was first described in the 1930s in Russia, and it became a serious issue during World War II because it decimated the horses of the Russian army [START_REF] Nielsen | Mould growth on building materials: Secondary metabolites, mycotoxins and biomarkers[END_REF]. Satratoxins and macrocyclic trichothecenes stand among the most toxic mycotoxins of the trichothecenes family, being 10 times more cytotoxic than type A trichothecenes [START_REF] Pestka | Inhibition of human lymphocyte transformation by the macrocyclic trichothecenes roridin A and verrucarin A[END_REF]. They are mainly produced by the genus Myrothecium and Stachybotrys and more particularly, by Stachybotrys chartarum [START_REF] Nielsen | Mould growth on building materials: Secondary metabolites, mycotoxins and biomarkers[END_REF][START_REF] Amuzie | Kinetics of satratoxin G tissue distribution and excretion following intranasal exposure in the mouse[END_REF]. They are essentially encountered in mouldy straw in Eastern and Northen Europe and also in damp and moldy buildings, in which they are associated to damp building-related illnesses [START_REF] Nielsen | Mould growth on building materials: Secondary metabolites, mycotoxins and biomarkers[END_REF][START_REF] Amuzie | Kinetics of satratoxin G tissue distribution and excretion following intranasal exposure in the mouse[END_REF].

Stachybotryotoxicosis most typically occurs with inflammation of the stomach, and the mouth as well as necrosis of some tissues. This is followed by a decreasing number of thrombocytes and thus, a decrease in blood clotting and of leukocytes. Less frequently, satratoxins triggers nervous disorders, which result in loss of reflexes, elevated body temperatures, and altered cardiac action [START_REF] Nielsen | Mould growth on building materials: Secondary metabolites, mycotoxins and biomarkers[END_REF]. Additionally, satratoxins are readily transported by spores and they can thus be taken up by the respiratory tract of exposed individuals. It has been shown that they are then distributed throughout the body, although a large part remains in the nasal cavity where they induce inflammation and apoptosis of nasal olfactory sensory neurons and from where they are slowly cleared [START_REF] Amuzie | Kinetics of satratoxin G tissue distribution and excretion following intranasal exposure in the mouse[END_REF].

NEURO-ENDOCRINE (NE) SYSTEM

INTESTINAL SYSTEM IMMUNE SYSTEM DON

Pro-inflammatory CK Pro-inflammatory CK, bacteria translocation

A.

[DON]

1 nM 10 nM 1 µM 100 nM 10 µM 100 µM

Effects on the immune system Effects on the NE system Effects on the intestine

B.

Additionally, recent studies on satratoxin H showed that this mycotoxin induces chromosome breaks in the micronucleus assay [START_REF] Nusuetrong | Apoptotic effects of satratoxin H is mediated through DNA double-stranded break in PC12 cells[END_REF]). Furthermore, it was also observed that it increases the level of phosphorylation of histone H2A, indicating that it causes DNA double-stranded breaks in PC12 cells. It has thus been hypothesized that satratoxin H is genotoxic by DNA double-stranded break [START_REF] Nusuetrong | Apoptotic effects of satratoxin H is mediated through DNA double-stranded break in PC12 cells[END_REF].

IV. NON-RIBOSOMAL PEPTIDE MYCOTOXINS

The production of peptides with a non-ribosomal origin was discovered in the 1960's by analysis of cell extracts in which peptide synthesis had been performed in the presence of RNases and ribosome inhibitors [START_REF] Finking | Biosynthesis of nonribosomal peptides1[END_REF]. Non-ribosomal peptides differ from ribosomal peptides in that they are not involved in the primary metabolism and therefore, there are no proofreading mechanisms involved in their biosynthesis. Also, several hundred substrates, used as building blocks for nonribosomal peptides, have been identified so far whereas only 20 amino acids are known to date for ribosomal peptides biosynthesis. As a result, non-ribosomal peptides present a much larger variety of structures and thus, a broader range of biological activities [START_REF] Finking | Biosynthesis of nonribosomal peptides1[END_REF].

Microorganisms such as gram+ bacteria of the genera Actinomycetes and Bacilli and filamentous fungi are the main producers of this type of peptides. Additionally, enzymes similar to non-ribosomal peptide synthases (NRPS) have also been identified in higher eukaryotes like the amino adipic acid semialdehyde dehydrogenase (U26) in mice [START_REF] Finking | Biosynthesis of nonribosomal peptides1[END_REF]. NRPS are organized in different modules that incorporate different amino acids into the polypeptide chain. Each module is sub-divided into domains that correspond to different enzymatic units. At least three domains are necessary to incorporate one amino acid: (1) the A-domain, which determines the amino acid that will be inserted in the polypeptide chain and activates its amino acid or hydroxyl acid;

(2) the T or PCP domain, which is a thiolation or peptidyl-carrier protein that transports the activated unit between the active sites of the domains and (3) the C-domain, which is a condensation domain that catalyses the formation of the peptide bond (C-N) between the elongated chain and the new amino acid [START_REF] Gallo | Phylogenetic Study of Polyketide Synthases and Nonribosomal Peptide Synthetases Involved in the Biosynthesis of Mycotoxins[END_REF]. Other domains may intervene in the biosynthesis of non-ribosomal peptides by adding different special side-features to the peptidic chain such as fatty acids (in fengicin and surfactin), non proteinogenic amino acids (in cyclosporine A and gramicidin S), carboxy acids (in enterobactin and myxochelin A), heterocyclic rings (in epothilone and bleomycin A2) and modified amino acids (in thaxtornin A and anabaenopeptide 90-A) [START_REF] Finking | Biosynthesis of nonribosomal peptides1[END_REF]. A list of the so-called tailoring domains is shown in table 2. NRPS domains share highly conserved sequences known as core-motifs that can be identified at the protein level and that allow to determine a putative function for unknown NRPS [START_REF] Finking | Biosynthesis of nonribosomal peptides1[END_REF]. In fungi and contrary to bacteria, only one NRPS is generally involved in the biosynthesis of one secondary metabolite and therefore, fungal NRPS contain several catalytic domains and are usually larger enzymes [START_REF] Finking | Biosynthesis of nonribosomal peptides1[END_REF]. This section will introduce the two most important and most studied families of toxic non-ribosomal peptides.

IV.1. Ergot Alkaloids

Ergot alkaloids (EA) constitute a very large family of indole-derived fungal metabolites that were first isolated from sclerotia of Claviceps purpurea. Sclerotia are dark structures corresponding to a resting stage of the fungus that replace rye grains essentially but also other cereals such as wheat. Sclerotia can be directly eaten by grazing animals, harvested with the ripened crop and consequently contaminate food and feed, or they can fall on the ground where they form sexual spores. These spores can remain on the soil but they can also become airborne and infect flowers. Sclerotia development on the flowers results in the formation of asexual spores that can either spread and infect other plants or form new sclerotia [START_REF] Eadie | Convulsive ergotism: epidemics of the serotonin syndrome?[END_REF]. Sclerotia of Claviceps purpurea have been shown to contain many pharmacologically active and inactive substances among which, over 40 different ergot alkaloids.

Other species related to the genera Clavicipitaceae produce ergot alkaloids such as C. paspali and C. fusiformis. Ergot alkaloids have also been isolated from other genera such as Penicillium and Aspergillus species and also from Epichloe and Balansia, that are grass endophytes responsible for severe livestock intoxications [START_REF] Tudzynski | Biotechnology and genetics of ergot alkaloids[END_REF]). Nevertheless, the genus Claviceps has been the most generally studied and used for biotechnological purposes.

The pharmacological interest of ergot alkaloids lies on their structural homologies with different neurotransmitters and their subsequent effect on the central nervous system [START_REF] Tudzynski | Biotechnology and genetics of ergot alkaloids[END_REF]).

Historically, these mycotoxins were associated to St Anthony's fire in the Middle Ages, but they have also been extensively used in obstetrics as anti hemorrhagics during childbirth or abortion [START_REF] Tudzynski | Biotechnology and genetics of ergot alkaloids[END_REF][START_REF] Eadie | Convulsive ergotism: epidemics of the serotonin syndrome?[END_REF]). In the twentieth century, some of these active substances, such as ergotamine, were purified, making their use in medicine safer. Additionally, new synthetic alkaloids have been produced by genetical engineering of their biosynthetic pathway by insertion of new enzymes with different substrate specificities or additional chemical conversions [START_REF] Tudzynski | Biotechnology and genetics of ergot alkaloids[END_REF]).

Ergot alkaloids are 3,4-substituted indol derivatives with a tetracyclic ergoline ring [START_REF] Tudzynski | Biotechnology and genetics of ergot alkaloids[END_REF]. Based on their structure, they can be classified as peptides (ergopeptides and ergopeptames), amides (alkylamides or small peptides) or clavines (clavine alkaloids) and can be synthesized from paspalic acid, L-isolysergic acid or D-lysergic acid [START_REF] Eadie | Convulsive ergotism: epidemics of the serotonin syndrome?[END_REF]. Metabolites deriving from Lisolysergic acid (names ending with -inine) are not biologically active unless dissolved in an aqueous solution in which they isomerize with active derivatives of D-lysergic acid (names ending with -ine) [START_REF] Eadie | Convulsive ergotism: epidemics of the serotonin syndrome?[END_REF]. D-lysergic acid derivatives are simple amino alcohol (like ergotamine) or short peptide chain (like ergometrine) attached to the ergoline nucleus in amide linkage via a carboxy group at C-8 [START_REF] Tudzynski | Biotechnology and genetics of ergot alkaloids[END_REF]). D-lysergic acid derived EA have a wide variety of activities depending on the substituents attached to the carboxy group at C-8 of the ergoline ring. Different substituent will determine the affinity to a different neuro-receptor like the noradrenaline receptor, the dopamine receptor or the serotonin receptor from which will arise a different effect [START_REF] Tudzynski | Biotechnology and genetics of ergot alkaloids[END_REF].

Structural alteration of the ergoline ring or addition of side chains at C-8 can have drastic effects on the affinity to neuro-receptors. For instance, hydrogenation of ergotamine leads to an important increase of its adrenolytic effect [START_REF] Tudzynski | Biotechnology and genetics of ergot alkaloids[END_REF].

Biosynthesis of ergot alkaloids starts with the formation of the ergoline ring, which has been mostly studied in C. purpurea, C. fusiformis and C. paspali (Tudzynski et al. 2001) (Fig 14). The ergoline ring is formed with the condensation of a molecule of L-tryptophan with a molecule of 3.3dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) by the action of the enzyme dimethylallyltryptophane (DMAT) synthase. This constitutes the carboline skeleton of the ergoline system. DMATs activity is positively regulated by tryptophan but is downregulated by phosphate. A cascade of enzymatic reactions following DMAT synthesis leads to the formation of the other two rings. However, apart from DMAT synthase, there is not much information concerning the other enzymes, due to their high instability [START_REF] Tudzynski | Biotechnology and genetics of ergot alkaloids[END_REF]. The next step involves a methyltransferase which methylates the amino nitrogen of DMAT. Then, decarboxylation and closure of the ring C is performed by a chanoclavine-I cyclase. Other enzymes have been described as depicted in Fig. 14A. The formation of the ergoline ring ends after the biosynthesis of paspalic acid. However, some species stop the biosynthesis earlier due to natural mutations or absence of some genes; for instance, C. fusiformis stops after biosynthesis of chanoclavine I [START_REF] Tudzynski | Biotechnology and genetics of ergot alkaloids[END_REF]. The second part of EA biosynthesis consists on the assembly of the ergot peptides and the L-isolysergic acid or D-lysergic acid amids [START_REF] Tudzynski | Biotechnology and genetics of ergot alkaloids[END_REF]). Ergopeptines such as ergotamine, ergoxine and ergotoxine derive from the binding of the D-lysergic acid to a bicyclic cyclol-lactam structure, which is made of three amino acids by D-lysergic peptide synthase (LPS) Fig. 14B. These amino acids differ among ergopeptines. LPS is formed by two subunits: LPS2, which contains the module for D-lysergic acid activation (Lsa) and LPS1, which contains three modules that successively add one of the three amino acids of the bicyclic cyclol-lactam (Alanine, Phenylalanine and Proline, in the case of ergotamine) [START_REF] Tudzynski | Biotechnology and genetics of ergot alkaloids[END_REF]. Based on [START_REF] Tudzynski | Biotechnology and genetics of ergot alkaloids[END_REF].

Different pathologies are associated with the ingestion of ergot alkaloids. The most frequent forms of ergotism are due to repeated exposure to these metabolites. There are two main forms of chronic ergotism that differ geographically and symptomatically. Gangrenous ergotism, which has been more frequent in western regions of the Rhine, is associated with an overdose of ergotamine causing important ischemia in the limbs (leading to the burning sensation described as St Anthony's fire).

Further vasoconstriction triggers dry gangrene with a mummified effect of the affected limbs. These symptoms are caused by the agonistic effect of ergotamine on the serotonin receptor 5-HT1B/ D and 5-HT2, which results in arterial constriction and gangrene [START_REF] Eadie | Convulsive ergotism: epidemics of the serotonin syndrome?[END_REF]. Gangrene is usually related to secondary infections, possibly leading to death [START_REF] Eadie | Convulsive ergotism: epidemics of the serotonin syndrome?[END_REF]. East of the Rhine, the predominant form of ergotism has been convulsive ergotism, which is associated with chronic ingestion of ergoline. This type of ergotism is characterized by involuntary distortion of the trunk and the limbs and also by a delirious, lethargic, manic and hallucinogenic state of the patients. Epileptic episodes related with convulsive ergotism are usually fatal [START_REF] Eadie | Convulsive ergotism: epidemics of the serotonin syndrome?[END_REF]. Although initially suspected as an explanation for the bizarre behavior of the young girls accused of witchcraft in Salem, it seems now unlikely that convulsive ergotism may be the cause of what happened in 1692 [START_REF] Woolf | Witchcraft or mycotoxin? The Salem witch trials[END_REF]. Concerning the effects of EA on the central nervous system, it is still not clear whether or not EA like ergotamine are able to cross the blood brain barrier. Different hypothesis have been suggested for this matter. Vitamin A deficiency would lead to an increase of brain permeability, allowing the entry of EA like ergotamine. Some EA like ergocriptine inhibit P-glycoprotein, which also increases brain permeability [START_REF] Eadie | Convulsive ergotism: epidemics of the serotonin syndrome?[END_REF].

Today, cereals are mechanically cleaned from sclerotia, and this has drastically decreased the human exposure to these mycotoxins [START_REF] Tudzynski | Biotechnology and genetics of ergot alkaloids[END_REF]). Animals such as sheep, cows and goats are however still at risk, principally due to grazing. Animals are subjected to the similar pathologies as humans.

IV.2. Gliotoxin

It belongs to the family of epipolythiodioxopiperazines (ETP), which is a class of fungal toxins characterized by the presence of an internal disulphide bridge across the piperazine ring, responsible for its toxicity (Gardiner and Howlett 2005). Gliotoxin was first described as a metabolite of Gliocladium fimbriatum, from which its name derives. However, production of this mycotoxin is mostly attributed to other fungal genera such as Aspergillus, Penicillium and Trichoderma. In Aspergillus species, such as A. fumigatus, gliotoxin has been shown to act as a potent virulence factor that promotes tissue colonization (Gardiner et al. 2005, Kwon-Chung and[START_REF] Kwon-Chung | What do we know about the role of gliotoxin in the pathobiology of Aspergillus fumigatus?[END_REF]. A. fumigatus is an important human pathogen responsible for invasive aspergillosis that can be fatal in immunocompromised patients. Interestingly, gliotoxin has been more frequently detected in strains isolated in medical facilities than in environmental isolates; it could thus play an important role in infection of hospital patients (Kwon-Chung and Sugui 2009). Apart from its toxinogenic effects, gliotoxin has been shown to protect A. fumigatus strains from peroxy-induced oxidative stress [START_REF] Gallagher | The Aspergillus fumigatus protein GliK protects against oxidative stress and is essential for gliotoxin biosynthesis[END_REF].

Although different studies have addressed gliotoxin biosynthesis, knowledge concerning the enzymes and the intermediary metabolites involved in the pathway is still not complete. In 2005, a putative 12 gene cluster responsible for gliotoxin biosynthesis was identified in A. fumigatus based on its homology with the gene cluster of sirodesmin another ETP produced by Leptosphaeria maculans (Gardiner and Howlett 2005). Disruption of some of the genes included in the cluster of A. fumigatus confirmed that it was indeed responsible for gliotoxin production (Kwon-Chung and Sugui 2009). This gene cluster has also been found in A. terreus (except for one gene, GliN) and A. flavus (Kwon-Chung and Sugui 2009). A biosynthetic pathway has recently been suggested based on the knowledge on the gene cluster and the structure of gliotoxin [START_REF] Scharf | Biosynthesis and function of gliotoxin in Aspergillus fumigatus[END_REF]) (Fig. 15). However, some steps still remain unclear. The first step consists on the formation of diketopiperazine (DKP) by condensation of phenylalanine and serine by the action of the NRPS GliP. This NRPS contains the three basic domains of NRPS, adenylation, condensation and thiolation [START_REF] Scharf | Biosynthesis and function of gliotoxin in Aspergillus fumigatus[END_REF]. Interestingly, deletion of GliP decreases the expression of all the other genes in the cluster but addition of exogenous gliotoxin restores mycotoxin production indicating that gliotoxin is self-regulated (Kwon-Chung and Sugui 2009, [START_REF] Scharf | Biosynthesis and function of gliotoxin in Aspergillus fumigatus[END_REF]. The next step involves hydroxylation of DKP into C-hydroxylated DKP by the P450 cytochrome, GliC. Then, introduction of the sulphur atom takes place. This has remained the most intriguing step in gliotoxin biosynthesis until GliG was fully characterized in 2011 [START_REF] Scharf | A dedicated glutathione S-transferase mediates carbon-sulfur bond formation in gliotoxin biosynthesis[END_REF]. GliG is a gluthatione-S-transferase that mediates the insertion of the sulphur atom from cysteine or sodium sulphate. Then GliT, a pyridine dinucleotide-dependent oxidoreductase, forms the internal disulfide bridge. Oxygen serves as a co-substrate for reduction and reoxydation and flavin adenine dinucleaotide (FAD) serves as a co-factor in the redox reactions [START_REF] Scharf | Biosynthesis and function of gliotoxin in Aspergillus fumigatus[END_REF]).Since GliT is able of keeping gliotoxin in the sulphur-bridge form that does not induce the production of ROS species or protein conjugates, it has a key role in self-resistance to this mycotoxin [START_REF] Scharf | Biosynthesis and function of gliotoxin in Aspergillus fumigatus[END_REF]. Also, the disulfide bridge may also facilitate excretion from fungal cells [START_REF] Scharf | Biosynthesis and function of gliotoxin in Aspergillus fumigatus[END_REF]).

All the enzymes that have been described so far in the gliotoxin cluster in A. fumigatus are gathered in table 3. The mode of action of gliotoxin has been extensively described in animal cell cultures. It is directly related to the presence of the disulphide bridge which triggers: (1) conjugation to proteins with susceptible thiol residues and subsequent inactivation of the protein by catalysis of the internal sulphide bond, and (2) generation of reactive oxygen species (ROS) such as superoxide and hydrogen peroxide via redox cycling between the reduced (dithiol) and the oxidized (disulphide) forms of gliotoxin (Gardiner et al. 2005). All of this results in immunosuppression by inhibition of NF-kB, phagocytosis by macrophages and apoptosis of macrophages and monocytes (Kwon-Chung and Sugui 2009). Apoptosis is triggered by activation of the gene BAK, which is a member of the Bcl-2 family involved in the initiation of apoptosis by induction of ROS production. Consecutively cytochrome c and other mitochondrial apoptosis-inducing factors are released, resulting in caspase induction and apoptosis (Kwon-Chung and Sugui 2009). Apoptosis may turn to necrosis with a concentration of gliotoxin above 10 µM in vitro (Gardiner et al. 2005). Neutrophils are also important targets of gliotoxin although this population of immunologically active cells is resistant to the apoptosis induced by this mycotoxin (Kwon-Chung and Sugui 2009). Additionally, gliotoxin is responsible for mitochondrial damage by inhibiting ATP synthesis, and thus triggering hyperpolarization of the mitochondrial membrane. This affects the electrophoretic mobility of the adenine nucleotide transporter (ATN), an important mediator of apoptosis. By affecting the mitochondrial function, gliotoxin may therefore induce apoptotic cell death (Gardiner et al. 2005). Mitochondrial calcium influx is also disrupted by gliotoxin and this has been shown to cause thymocytes necrosis (Gardiner et al. 2005). In cases of invasive aspergillosis, gliotoxin enhances colonization of the respiratory mucosa by A. fumigatus by damaging the ciliated respiratory epithelium (Gardiner et al. 2005). Finally, gliotoxin inhibits RNA replication by inhibiting the reverse transcriptase and it has thus been used as a therapeutic agent (Gardiner et al. 2005).

Enzyme Comments and proposed function Reference

GliP Two-module non-ribosomal peptide synthetase (dioxopiperazine synthase) involved in synthesis of the dipeptide (Gardiner et al. 2005)

GliT

Thioredoxin reductase (dithiolpiperazine oxidase); formation of disulphide bond (Gardiner et al. 2005) GliC, GliF Cytochrome P450 monooxygenase (Gardiner et al. 2005, Kwon-Chung and Sugui 2009)

GliI

High similarity to amino cyclopropane carboxylate synthases (Gardiner et al. 2005)

GliJ

Dipeptidase domain; unknown function (Gardiner et al. 2005)

GliM

O-Methyl transferase domain; unknown function (Gardiner et al. 2005)

GliN

Methyl transferase domain; unknown function (Gardiner et al. 2005)

GliG

Glutathione S-transferase domain; encodes enzyme that makes/breaks C-S bonds (Gardiner et al. 2005, Scharf et

V. CONCLUSIONS

One of the main conclusions that can be drawn from this chapter is the diversity related to mycotoxins in terms of biosynthesis, chemical structure and toxicity. However, despite great efforts, only a limited number of mycotoxins and fungal secondary metabolites are known today, especially compared to the large variety of species and the knowledge on the richness of their genome.

The biological role of secondary metabolites and mycotoxins for fungi still remains unknown for fungal microbiologists. Most of the scientists agree that secondary metabolites play an important role in the pathogenicity of fungi [START_REF] Calvo | Relationship between secondary metabolism and fungal development[END_REF][START_REF] Fox | Secondary metabolism: regulation and role in fungal biology[END_REF][START_REF] Hof | Mycotoxins: pathogenicity factors or virulence factors?[END_REF]). Related to that, a difference has been suggested between metabolites that act as pathogenicity factors or destructive weapons in hostile environments and metabolites that act as virulence factors, which are produced in order to obtain direct benefits in terms of self defense and host invasion [START_REF] Fox | Secondary metabolism: regulation and role in fungal biology[END_REF]. However, that is not the only function attributed to fungal secondary metabolites as they have also proved to protect against other microorganisms [START_REF] Reverberi | Natural functions of mycotoxins and control of their biosynthesis in fungi[END_REF]. For instance, penicillic acid produced by Penicillium species inhibits quorum-sensing systems of bacteria and also, production of secondary metabolites by A. nidulans protects from fungivores [START_REF] Rohlfs | Secondary chemicals protect mould from fungivory[END_REF]. Secondary metabolites, such as aflatoxins, also help maintain the oxidative state inside fungal cells, preventing harmful effects of endogenous oxidants. In addition, a close relationship has been established between the production of secondary metabolites and fungal development and more precisely, sporulation [START_REF] Calvo | Relationship between secondary metabolism and fungal development[END_REF]. It has been shown that sterigmatocystin and linoleic acid produced by A. nidulans and zearalenone produced by F. graminearum activate sporulation [START_REF] Calvo | Relationship between secondary metabolism and fungal development[END_REF]. Other metabolites, such as melanins produced by A. alternata, act as pigments of sporulation structures increasing their survival by conferring protection against UV light [START_REF] Calvo | Relationship between secondary metabolism and fungal development[END_REF]. Finally, production of secondary metabolites is highly dependent on external signals from the environment like light, temperature and humidity but also signals from the host cells and rival microorganisms. Therefore, a better understanding of the interactions that take place between these signals and production of secondary metabolites, including mycotoxins, would help to understand the function of these compounds and thus to design new techniques to control and limit the production of these toxins.

Concerning known mycotoxins, it is possible to conclude that, apart from some metabolites such as aflatoxins and trichothecenes, which have been extensively studied, there is still a lot of missing information concerning the rest of mycotoxins. Indeed, biosynthetic pathways, modes of action and carcinogenicity would deserve more attention. For instance, regarding ochratoxins, different pathways have been suggested for its biosynthesis so far, but the order of the steps and of the intermediate metabolites are still not clear. Patulin biosynthesis is also not fully understood. A genetic cluster has clearly been identified and a putative function has been attributed to the different genes of the cluster but for most of them, this function has not been confirmed experimentally. More data should also be gathered concerning carcinogenicity of mycotoxins since in most cases, there is not enough evidence to conclude on their carcinogenicity. It is the case for example of fumonisin B1, ochratoxin A, patulin and zearalenone.

Given their toxicological effects and occurrence in food and feed, assessment of the risks generated by mycotoxins for consumers should be taken very seriously. Proper risk assessment requires the effective and precise detection of these toxins. In most cases, only analyses targeting a limited number of known mycotoxins are performed, although great efforts are currently made to maximize the number of detected metabolites [START_REF] Varga | Development and validation of a (semi-)quantitative UHPLC-MS/MS method for the determination of 191 mycotoxins and other fungal metabolites in almonds, hazelnuts, peanuts and pistachios[END_REF]). Untargeted methods to analyze fungal metabolomes could lead to the discovery of new secondary metabolites potentially toxic for humans, animals or plants. A possibility for untargeted methods is to combine high resolution mass spectrometry and double isotopic labeling, as it has been shown recently with the analysis of the metabolome of A. fumigatus, resulting in the identification of new secondary metabolites (Cano et al. 2013a). This kind of studies should be carried out on different fungal species, especially species belonging to the genera Aspergillus, Penicillium and Fusarium, which are the main producers of secondary metabolites.

However, other factors may hinder proper mycotoxin-related risk assessment. For instance, the majority of food and feed products undergo different transformation processes such as fermentation and baking before consumption. In some cases, these techniques degrade mycotoxins thus decreasing toxicity; but in other cases, the situation is worsened due to the metabolization of mycotoxins into more toxic metabolites or due to the release of mycotoxins trapped in the raw materials and that had not been detected in previous analysis. In all cases, the toxicity may be increased by metabolic processes taking place in the humans or animals after ingestion of contaminated commodities. Another important aspect of mycotoxin detection that has just started receiving attention is the issue of masked mycotoxins. After production and secretion in host plants or rival microorganisms, mycotoxins can undergo physicochemical transformations orchestrated by the plant or the microorganisms that modify their structural properties, thus becoming undetectable with conventional techniques. As elegantly reviewed by Berthiller et al., there are two forms of masked mycotoxins: (1) mycotoxins covalently or non-covalently bound to the matrix and that are not extractable unless liberated and (2) conjugated mycotoxins, which can be detected with appropriate methods [START_REF] Berthiller | Masked mycotoxins: A review[END_REF]). Masked mycotoxins have become an important challenge since their presence leads to an underestimation of the real mycotoxin content and of the related risk for the consumer. Metabolization can occur as phase I reactions (hydrolysis or oxidation) in the case of lipophilic compounds or as phase II reactions (conjugation to glucose, malonic acid or glutathione) in the case of hydrophilic compounds. The final aim of these reactions is the detoxification and excretion of these toxic metabolites although, in some cases, the intermediary metabolites might be as toxic as or even more toxic than the parent compound. Trichothecenes are a good example of glucose conjugation resulting in decreased toxicity. DONglucoside (D3G), FX-glucoside, NIV-glucoside and 3-O-glucosides of T-2 and HT-2 have been detected in contaminated cereal samples with relative proportions around 20%. Zearalenone also undergoes conjugation transformations and it has been detected in its glucoside form (Z14G) and in its sulfate form (Z14S). Fumonisins are good examples of mycotoxins covalently bound to the matrix by binding to hydroxyl groups of carbohydrates and to amino groups of amino acids. Despite a lower toxicity of the substances investigated so far, an increased risk for the consumer is not to be excluded due to an increased bioavailability and partial reactivation of masked mycotoxins in mammalian cells.

To date, there is little information available concerning toxicokinetics and toxicodynamics of masked mycotoxins that would allow a proper risk assessment of their presence in food commodities [START_REF] Berthiller | Masked mycotoxins: A review[END_REF]).

In addition, risk characterization should also take into account that: (1) a same fungal species may produce several mycotoxins, (2) a same product may be contaminated by different fungal species and

(3) our diet is composed of a variety of food commodities. Therefore, co-exposure to several mycotoxins is the most frequent scenario. However, there is not much information concerning the toxicity of such interactions as reviewed by Grenier et al. (Grenier and Oswald 2011). Studying toxicity of multi-contaminations is a complex matter in which the natures of the toxins, the concentrations but also the ratios in the food/feed commodities have to be considered. In addition, risk characterization should also consider the different sensibility of each species as well as individual differences, related to the sex, the age and the targeted organ as well as on the dose and frequency of exposure.

Based on the previous considerations, different regulations have been enacted worldwide in order to establish maximal permissible contents of some mycotoxins in food/feed commodities as well as maximal tolerable daily intake (TDI) doses. As a final conclusion, the issue of mycotoxins is complex and it has to be analyzed from several points of view including fungal biology, its environment (physico-chemical and biological), and then the transfer of mycotoxins to food/feed commodities and their possible transformations and interactions before reaching the consumers. Although the articles included in this chapter depict a great progress concerning each of the different aspects related to mycotoxins, a lot of knowledge is still needed.

Fusarium graminearum : phytopathogène et producteur de mycotoxines

Fusarium est un genre de champignons filamenteux ascomycètes, qui appartient à la classe des Sordariomycetes, l'ordre des Hypocreales et la famille des Nectriaceae. Il a été décrit pour la première fois en 1809 par l'allemand Link qui l'a nommé d'après la forme en fuseau, en latin fusus, de ses spores, qui sont d'ailleurs une des caractéristiques principales de ce genre. Plusieurs espèces de Fusarium sont pathogènes pour les plantes, les animaux et l'homme, provoquant des maladies appelées des fusarioses (Leslie and Summerell, 2006). De plus, les espèces de Fusarium comptent parmi les espèces produisant le plus de métabolites secondaires. Certains de ces métabolites sont couramment employés de façon commerciale, comme l'acide gibbérellique qui est utilisé en tant que promoteur de croissance des plantes (Leslie and Summerell, 2006). Néanmoins, les espèces de Fusarium produisent aussi de nombreuses mycotoxines qui sont associées à différentes pathologies chez les plantes, les animaux et les hommes (Desjardins and Proctor, 2007). Fusarium représente donc un genre de moisissures important dans des domaines aussi variés que l'agriculture, l'industrie et la médecine.

Parmi les espèces pathogènes de Fusarium se trouve Fusarium graminearum (F. graminearum) qui contamine essentiellement les céréales comme le blé, le maïs et l'orge dans les régions tempérées du globe. Cette espèce est responsable de pertes économiques importantes à cause de la diminution de la qualité des grains contaminés ainsi que par la toxicité de certaines mycotoxines qu'elle produit et qui sont susceptibles de contaminer les denrées alimentaires. D'un point de vue morphologique, F. graminearum peut être identifié grâce à son mycelium dense et velu, de couleur blanchâtre avec une pigmentation rouge visible au dos des géloses. Cette pigmentation varie en fonction du pH et devient jaune avec le temps et l'acidification du milieu. Les macroconidies, qui sont très caractéristiques de cette espèce, sont fines et de taille moyenne, avec 5 à 6 septa ou compartiments. Elles présentent différentes asymétries, la partie ventrale étant plutôt droite alors que la partie dorsale est incurvée. De même, contrairement à la partie basale, la partie apicale est resserrée, en forme de fuseau.

F. graminearum est homothallique ce qui implique que cette moisissure est capable de se reproduire de façon sexuée par interaction de deux noyaux issus d'une même spore ou bien par interaction avec une autre souche (Fig. I.1). Les organismes hétérothalliques requièrent l'interaction entre deux souches différentes (Leslie and Summerell, 2006). Gibberella zeae est le nom donné à la forme téléomorphe de F. graminearum, qui se reproduit avec des ascospores issues de la reproduction sexuée et qui sont contenues dans les périthèces. F. graminearum est la forme anamorphe, c'est-à-dire, effectuant la reproduction asexuée au moyen de conidies qui sont produites par les sporodochies (Fig. I.1). Pour la reproduction sexuée, il existe des gènes (MAT) qui contrôlent l'identité sexuelle d'une souche en codant pour des facteurs de transcription activant la reproduction sexuée et qui sont généralement regroupés dans un même locus. Chez F. graminearum, il existe deux allèles du gène MAT, MAT-1 et MAT-2 [START_REF] Yun | Molecular Organization of Mating Type Loci in Heterothallic, Homothallic, and Asexual Gibberella/Fusarium Species[END_REF]. Pour que la reproduction sexuée ait lieu, les deux noyaux doivent présenter un allèle MAT différent. Toutefois, l'expression de ces gènes n'est pas nécessaire pour la reproduction asexuée [START_REF] Zheng | The MAT Locus Genes Play Different Roles in Sexual Reproduction and Pathogenesis in Fusarium graminearum[END_REF]. La production de spores sexuées (ascospores) ou végétatives (conidies) dépend de facteurs environnementaux comme le substrat, la lumière, la température et l'humidité. Par exemple, la production d'ascospores est favorisée par la lumière, à des longueurs d'onde proches des UV, ainsi que par une diminution de l'humidité et une augmentation de la température [START_REF] Tschanz | The effect of environment on sexual reproduction of Gibberella zeae[END_REF][START_REF] Trail | Ejection mechanics and trajectory of the ascospores of Gibberella zeae (anamorph Fuarium graminearum)[END_REF]. Cependant, il semblerait que la virulence et la production de mycotoxines soient indépendantes du mode de reproduction [START_REF] Desjardins | Deletion and complementation of the mating type (MAT) locus of the wheat head blight pathogen Gibberella zeae[END_REF]. De même, il a été montré que l'infection des plantes soit aussi bien due aux conidies qu'aux ascospores. Néanmoins, ces dernières sont capables de germer dans des conditions d'humidité plus faibles que l'on retrouve lors de la floraison des plantes et elles sont donc plus souvent considérées comme les agents infectieux primaires [START_REF] Paulitz | Diurnal release of ascospores by Gibberella zeae in inoculated wheat plots[END_REF]Leslie and Summerell, 2006). D'ailleurs, l'expression des gènes MAT est importante pour la colonisation de certaines plantes comme le maïs [START_REF] Zheng | The MAT Locus Genes Play Different Roles in Sexual Reproduction and Pathogenesis in Fusarium graminearum[END_REF]. [START_REF] Ma | Fusarium Pathogenomics[END_REF]). F. graminearum se développe sous forme de mycélium haploïde. Pour sa reproduction, il existe deux formes de spores végétatives : (1) les macroconidies, qui sont produites par des agrégations de conidiophores, connus sous le nom de sporodochies et (2) les chlamydospores, qui sont des formes de résistance que l'on retrouve aussi bien au sein des macroconidies qu'au sein du mycélium. Chez G. zeae, la sporulation des ascospores fertilisées lors de la reproduction sexuée peut découler de la combinaison avec une autre souche (ascospore recombinée) ou alors, de façon homothallique, c'est-à-dire, par interaction de deux noyaux issus d'une même spore (ascospore clonée).

Le cycle biologique de F. graminearum commence par l'infection des épis ou des racines par des spores sexuées ou végétatives, qui ont été conservées dans le sol sur des débris des récoltes précédentes ou des hôtes alternatifs pendant la période de l'hiver (Fig. I.2). L'infection a lieu lorsque les conditions climatiques (température et humidité) deviennent favorables au développement fongique, c'est-à-dire, après l'épiaison, soit la formation complète des épis, et le début de la floraison [START_REF] Sutton | Epidemiology of wheat head blight and maize ear rot caused by Fusarium graminearum[END_REF][START_REF] Caron | Fusarium graminearum sur les résidus de culture des blés et des maïs et en fonction du travail du sol[END_REF]. L'entrée des spores a lieu au niveau d'ouvertures naturelles dans les épis ou alors, par des lésions causées par des insectes ou enfin, par pourriture des racines. Après germination des spores, F. graminearum se développe et se propage premièrement extracellulairement et de façon asymptomatique puis, dans un deuxième temps, intracellulairement, entraînant la nécrose des tissus. La production de certains métabolites secondaires est impliquée dans la colonisation et l'apparition des symptômes. Par exemple, le déoxynivalénol (DON) est un important facteur de virulence qui engendre la nécrose des tissus, facilitant l'avancement du [START_REF] Trail | For blighted waves of grain: Fusarium graminearum in the postgenomics era[END_REF]). mycélium [START_REF] Trail | For blighted waves of grain: Fusarium graminearum in the postgenomics era[END_REF]. L'accumulation de cette mycotoxine est aussi en partie responsable de la perte de qualité des grains chez le blé et le maïs, qui se traduit par des grains de plus petite taille et ridés. De même, la contamination par cette moisissure entraîne aussi la décoloration des épis à cause du développement du mycélium dans la tige, ce qui bloque l'apport de nutriments [START_REF] Miller | Use of a Fusarium graminearum strain transformed with green fluorescent protein to study infection in wheat (Triticum aestivum)[END_REF]. Cette décoloration est d'ailleurs un signe caractéristique du Fusarium Head Bligh ou Fusariose de l'épi, qui est une des maladies les plus fréquentes chez le blé. D'autres phytopathologies sont associées à la présence de F. graminearum (Tableau I.1). Il faut savoir que certaines de ces maladies ne sont pas exclusivement causées par cette moisissure et qu'il y a une vingtaine d'espèces de Fusarium pathogènes pouvant aussi en être responsables, mais F. graminearum prédomine en Europe [START_REF] Arseniuk | Fusarium Head Blight Reactions and Accumulation of Deoxynivalenol (DON) and Some of its Derivatives in Kernels of Wheat, Triticale and Rye[END_REF]Leslie and Summerell, 2006). En plus de la colonisation de la plante, la moisissure produit de nouveau des spores pour assurer sa dispersion sur d'autres plantes et sa survie

Eté

pendant les saisons moins favorables. Chez le blé, la formation de périthèces est associée aux stomates de la plante qui régulent les échanges gazeux avec l'environnement extérieur. Les ascospores sont donc facilement dispersées par l'air, alors que les conidies, qui sont généralement produites à la surface des zones contaminées ou sur les débris au sol, sont plus facilement dispersées par les éclats de gouttes d'eau sur de plus courtes distances [START_REF] Trail | For blighted waves of grain: Fusarium graminearum in the postgenomics era[END_REF]. Après les récoltes, les grains contaminés, pouvant contenir des mycotoxines, entrent dans les chaînes de production alimentaire, entraînant des risques pour les consommateurs. Les débris de récoltes qui restent sur le sol deviennent des centres infectieux potentiels pour les futures sémences.

Tableau I.1 : Phytopathologies associées à la contamination par F. graminearum (Leslie and Summerell, 2006).

Nom anglais Traduction Hôte

Fusarium Comme il a précédemment été mentionné, lors de l'infection, les espèces de Fusarium produisent une large gamme de métabolites secondaires dont certains ont été reconnus comme des mycotoxines de part leur toxicité pour les vertébrés (Bennett and Klich, 2003). Parmi les « fusariotoxines » les plus connues, on trouve la famille des trichothécènes de type B, comme le déoxynivalénol et le nivalénol. F. graminearum produit aussi de la zéaralénone, de la fusarine C et de l'aurofusarine (Leslie and Summerell, 2006). Une description détaillée des trichothécènes et de la zéaralénone a été réalisée dans la partie précédente, c'est pourquoi seules la fusarine C et l'aurofusarine seront présentée ici. D'autres mycotoxines comme le buténolide, la culmorine, les fusarielines et la chrysogine sont aussi associées à F. graminearum, cependant, ces métabolites sont assez peu documentés dans la littérature.

⎨ La fusarine C : Cette mycotoxine fait partie de la famille des fusarines qui comprend, entre autres, la fusarine A, la fusarine D, l'épi-fusarine C et la dihydrofusarine C, qui ont toutes en commun la présence d'un cycle 2-pyrrolidone [START_REF] Kleigrewe | New Approach via Gene Knockout and Single-Step Chemical Reaction for the Synthesis of Isotopically Labeled Fusarin C as an Internal Standard for the Analysis of this Fusarium Mycotoxin in Food and Feed Samples[END_REF]. La fusarine C a tout d'abord été isolée de cultures de Fusarium verticillioides (syn. de F. monoliforme) sur maïs. Celui-ci constitue aussi le substrat de prédilection pour la production de fusarine C par F. graminearum [START_REF] Gelderblom | Metabolic activation and deactivation of fusarin C, a mutagen produced by Fusarium moniliforme[END_REF]. Après purification, la fusarine C se présente sous forme d'une huile à coloration jaunâtre sensible à la lumière et à la chaleur et qui se dégrade à des pH basiques. Cette mycotoxine fait partie des métabolites dits hybrides, dont la biosynthèse fait intervenir aussi bien une polykétide synthase (PKS) et une non-ribosomal peptide synthase (NRPS). Dans le cas de la fusarine C, l'enzyme impliquée dans la biosynthèse de ce métabolite est hybride, intégrant à la fois les sites catalytiques caractéristiques des PKS et les sites spécifiques des NRPS. La voie de biosynthèse de cette mycotoxine a été élucidée tout d'abord chez F. moniliforme et F. venenatum [START_REF] Song | Fusarin C Biosynthesis in Fusarium moniliforme and Fusarium venenatum[END_REF] puis, chez F. graminearum (Gaffoor et al., 2005) gènes ont été identifiés dans le cluster de la fusarine C, dont la fusarine synthase (GzFUS1 chez F. graminearum) qui consiste en une fusion entre une PKS et une NRPS. Lors de la biosynthèse, une chaîne heptakétide est tout d'abord formée, et ensuite, une homosérine (acide aminé) est adenylée et attachée à la chaîne. Après condensation, le polykétide devient un amide intermédiaire qui est ensuite réduit par la partie NRPS de GzFUS1 [START_REF] Song | Fusarin C Biosynthesis in Fusarium moniliforme and Fusarium venenatum[END_REF]. Le reste des étapes menant à la formation de la fusarine C ont été récemment élucidées chez F. fujikuroi [START_REF] Niehaus | Genetic Manipulation of the Fusarium fujikuroi Fusarin Gene Cluster Yields Insight into the Complex Regulation and Fusarin Biosynthetic Pathway[END_REF]. Ces étapes consistent en l'oxydation du groupe méthyle pour former un ester de méthyle, puis l'époxydation du cycle et enfin, une dernière étape d'hydroxylation. Il existe peu d'études concernant la toxicité et le mode d'action de la fusarine C. L'exposition par voie orale à cette mycotoxine a été tout d'abord associée à l'apparition de papillomes et de carcinomes de l'oesophage et de l'estomac chez le rat et la souris [START_REF] Iarc | Some naturally occurring substances: Food items and constituents, heterocyclic aromatic amines and mycotoxins[END_REF]. Il a été montré que ces pathologies sont causées par la formation de mutations génétiques par dommages à l'ADN. Néanmoins, selon l'Agence Internationale de Recherche sur le Cancer, il n'existe pas encore de preuves suffisantes concernant la carcinogénicité de la fusarine C qui est classée dans le groupe 2B de cette agence (possible carcinogène pour l'homme) [START_REF] Iarc | Some naturally occurring substances: Food items and constituents, heterocyclic aromatic amines and mycotoxins[END_REF]. Par ailleurs, il a récemment été mis en évidence que la fusarine C stimule les cellules cancéreuses du sein in vitro en activant les récepteurs aux oestrogènes [START_REF] Sondergaard | Fusarin C acts like an estrogenic agonist and stimulates breast cancer cells in vitro[END_REF]. Les résultats de cette étude suggèrent que cette mycotoxine a des propriétés oestrogéniques comparables à celles de la zéaralénone. ⎨ L'aurofusarine : Ce métabolite est un pigment rougeâtre qui a été identifié pour la première fois en 1937 à partir de cultures de Fusarium culmorum [START_REF] Ashley | Studies in the biochemistry of microorganisms LIII. The crystalline colouring matters of Fusarium culmorum (W.G. Smith) Sacc. and related forms[END_REF]. Depuis, il a aussi été détecté chez plusieurs espèces de Fusarium dont F. graminearum. Ce métabolite est largement produit pendant le développement des champignons. Néanmoins, sa fonction n'est pas encore très claire puisque des mutants ne produisant pas d'aurofusarine se développent plus rapidement et sont tout aussi pathogènes sur le blé et le maïs [START_REF] Malz | Identification of a gene cluster responsible for the biosynthesis of aurofusarin in the Fusarium graminearum species complex[END_REF]. L'aurofusarine appartient à la famille des naphthoquinones qui sont des polykétides aromatiques. Ainsi, le cluster de gènes impliqués dans la biosynthèse de ce métabolite contient une PKS (PKS12) et 10 autres gènes « Aur » [START_REF] Malz | Identification of a gene cluster responsible for the biosynthesis of aurofusarin in the Fusarium graminearum species complex[END_REF]. La première étape de la voie de biosynthèse mène à la formation par la PKS12 d'un intermédiaire stable, le YWA1 (Fig. I.4). Ensuite AurZ induit une déshydratation d'YWA1 pour former la nor-rubrofusarine, une naphthopyrone qui est ensuite méthylée par AurJ pour donner la rubrofusarine. Il a récemment été montré que les étapes qui suivent la production de la rubrofusarine sont réalisées à l'extérieur de la cellule [START_REF] Frandsen | Two novel classes of enzymes are required for the biosynthesis of aurofusarin in Fusarium graminearum[END_REF]. D'ailleurs un des gènes du cluster, AurT a été identifié comme étant une pompe spécifique à la rubrofusarine [START_REF] Frandsen | Two novel classes of enzymes are required for the biosynthesis of aurofusarin in Fusarium graminearum[END_REF]. La famille des naphthoquinones est connue pour ses propriétés toxiques qui sont causées par l'inhibition du transport d'électrons, la perturbation de la phosphorylation et la production d'ions superoxydes. Même si le mode d'action de l'aurofusarine n'a pas encore été établi, il est fortement possible qu'il soit similaire à celui des naphthoquinones. Concernant sa toxicité, les volailles sont particulièrement sensibles à l'aurofusarine et plus précisément les oeufs, dont la qualité est amoindrie par la diminution de leur teneur en vitamines A et E et en acides gras [START_REF] Dvorska | Antioxidant systems of the developing quail embryo are compromised by mycotoxin aurofusarin[END_REF]. En 2007, le génome de deux souches de F. graminearum (PH-1 et GZ3639) a été entièrement séquencé (Cuomo et al., 2007). La comparaison des génomes de ces deux souches a mis en évidence des régions hautement polymorphiques contenant notamment des gènes impliqués dans les interactions moisissures-plante et plus précisément l'infection des hôtes. Cette divergence souligne l'adaptation des souches à leur environnement et la spécificité envers leurs hôtes. De plus, suite au séquençage du génome de F. graminearum, d'autres espèces de Fusarium ont été séquencées comme F. solani [START_REF] Coleman | The genome of Nectria haematococca: contribution of supernumerary chromosomes to gene expansion[END_REF], F. oxysporum et F. verticillioides [START_REF] Ma | Comparative genomics reveals mobile pathogenicity chromosomes in Fusarium[END_REF]. L'analyse des génomes a permis d'identifier les gènes impliqués dans le métabolisme secondaire comme les gènes codants pour les PKS et les NRPS (Tableau I.2) (Hansen et al., 2012). Parmi les espèces comparées, et malgré une plus petite taille de son génome, F. graminearum possède le plus grand nombre de gènes codants pour ces deux types d'enzymes (Tableau I.2). Ceci renforce de nouveau l'idée qu'un grand nombre de métabolites secondaires dont certains pourraient s'avérer être toxiques, reste encore à être identifiés chez cette moisissure. En tout, 35 PKS ont pu être identifiées, dont 15 chez F. graminearum, qui est l'espèce présentant le plus grand nombre de PKS spécifiques (Tableau I.2). Parmi ces 15 gènes, seuls 6 ont été caractérisés du point de vue de leur fonction (Tableau I.3). Comme il a été décrit précédemment, GzFUS1 (PKS10) est une enzyme hybride PKS-NRPS impliquée dans la biosynthèse de la fusarine C. Le gène PKS9 code aussi pour une enzyme hybride qui est impliquée dans la biosynthèse des fusarielines néanmoins, cette enzyme a perdu les domaines catalytiques spécifiques des NRPS (Sørensen et al., 2012). En ce qui concerne les NRPS, 30 gènes ont été identifiés, dont 19 chez F. graminearum, qui est encore une fois l'espèce présentant le plus grand nombre de NRPS lui étant spécifiques (Tableau I.2). Seules 3 NRPS ont été caractérisées d'un point de vue de leurs fonctions et toutes trois codent pour des sidérophores (Tableau. I.3). Ces molécules permettent la fixation du fer, nécessaire par exemple à la germination des conidies ou lors de l'infection des plantes (Hansen et al., 2012). Il est intéressant de noter que les 19 gènes codant pour des NRPS chez F. graminearum ont été retrouvés chez F. culmorum et F. pseudograminearum avec l'exception de NRPS18 qui est absent chez F. pseudograminearum [START_REF] Tobiasen | Nonribosomal peptide synthetase (NPS) genes in Fusarium graminearum, F. culmorum and F. pseudograminearium and identification of NPS2 as the producer of ferricrocin[END_REF]. En effet, ces deux espèces sont phylogénétiquement plus proches de F. graminearum que F. verticilloides, F. oxysporym et F. solani.

Tableau I.3 : Fonctions connues des PKS et NRPS chez F. graminearum (d'après (Hansen et al., 2012)).

Gène Fonction

PKS3 (PGL1) Pigment du périthèce PKS4 (ZEA2) Zéaralénone PKS9 (FSL1) Fusarielines PKS10 (FUSS) (PKS-NRPS hybride) Fusarine C PKS12 (AUR1) Aurofusarine Gène Fonction PKS13 (ZEA2) Zéaralénone NRPS1 Malinochrome NRPS2 Ferricrocine NRPS6 Fusarinine
A l'heure actuelle et en Europe, les effets chroniques des mycotoxines, et des fusariotoxines en particulier, sont plus à craindre que d'éventuelles expositions aiguës, grâce aux bonnes conditions de culture ainsi qu'aux différents contrôles subis par les denrées alimentaires. Toutefois, les risques de maladies chroniques associés à l'ingestion de faibles doses à long terme de ces toxines ont poussé les autorités à déterminer des doses journalières tolérables (DJT) ainsi que des concentrations maximales de ces toxines dans les aliments. Les tableaux ci-dessous présentent les valeurs concernant les mycotoxines produites par F. graminearum. Comme pour la majorité des mycotoxines, il n'existe pas de procédés de décontamination des lots de céréales contaminés par ces fusariotoxines. De plus, comme elles sont chimiquement stables, elles ne sont pas détruites lors des processus de transformation des aliments. Ainsi, la contamination dans les champs par F. graminearum et la présence des fusariotoxines peut avoir des lourdes conséquences dans la filière agroalimentaire. Les fusariotoxines posent donc un double problème aussi bien d'un point de vue sanitaire qu'économique. Une des solutions est de limiter le développement du champignon et la production des toxines dans le champ. Ainsi, la majorité des études concernant F. graminearum adresse le processus d'infection pour essayer de mettre en évidence des aspects qui pourraient être utilisés pour mettre au point des techniques de prévention de la contamination. Toutefois, cet objectif n'est pas facilement réalisable du fait de l'abondance des facteurs qui régulent le développement de F. graminearum et la production des métabolites secondaires. Par ailleurs, beaucoup d'efforts sont portés sur le développement de souches de céréales génétiquement résistantes. Cependant, très peu d'études tentent d'apporter des

Objectifs de la thèse

Les mycotoxines sont capables d'engendrer une très grande variété d'effets toxiques, en relation avec leur importante diversité structurelle. Néanmoins, il est clair que seule une infime partie des métabolites secondaires fongiques a été identifiée jusqu'ici, laissant présager la possibilité que certains des métabolites encore inconnus présentent aussi des propriétés toxiques. Ceci est d'autant plus vrai pour les espèces de Fusarium qui comptent parmi les plus productrices en termes de mycotoxines. En Europe et dans les régions tempérées du globe, F. graminearum représente un risque important pour la production céréalière, d'une part, à cause de la perte de qualité des grains contaminés, et d'autre part, à cause des mycotoxines qui sont produites majoritairement dans les champs et auxquelles les consommateurs peuvent être exposées.

En ce qui concerne l'exposition par voie orale, l'intestin est une des cibles privilégiées de ces contaminants alimentaires et notamment du déoxynivalénol (DON), qui est une des mycotoxines les plus occurrentes après contamination par F. graminearum. De plus, les mycotoxines ont pour la plupart la capacité de moduler la réponse immunitaire et ce, même à des faibles doses. Malgré tout, les effets des mycotoxines sur la réponse immunitaire au niveau de l'intestin ont été très peu étudiés.

Dans ce contexte, l'équipe d'immuno-mycotoxicologie, au sein du pôle Toxalim de l'INRA de Toulouse, s'intéresse aussi bien à la détection qu'à la biosynthèse des métabolites secondaires fongiques ainsi qu'aux effets des mycotoxines sur l'intestin et la réponse immunitaire. Les recherches menées au cours de cette thèse ont donc porté une attention particulière à ces domaines de recherche. Aussi, les travaux compris dans ce manuscrit avaient deux objectifs principaux :

1. L'identification des métabolites secondaires produits par F. graminearum.

Pour cela, une méthode analytique combinant la spectrométrie de masse de haute résolution et le marquage des métabolites secondaires avec des isotopes stables a été développée et validée, dans un premier temps, avec le métabolome bien connu d'Aspergillus fumigatus. Cette méthode a ensuite été appliquée à l'analyse du métabolome de F. graminearum.

Etude de la toxicité du métabolome de F. graminearum.

Une attention particulière a tout d'abord été portée à la toxicité du DON pour apporter des connaissances quant aux effets pro-inflammatoires déjà observés après exposition à cette mycotoxine chez le porc. Plus précisément, la modulation des réponses pro-inflammatoires (lymphocytes Th17) et régulatrices (lymphocytes Treg) a été analysée. Ensuite, une étude in vivo sur des porcelets a permis de comparer la toxicité du DON à celle d'un mélange de fusariotoxines. Dans cette étude, les performances animales telles que la consommation alimentaire et la prise de poids ont été mesurées ainsi que des paramètres immunitaires comme l'expression de gènes codants pour des cytokines pro-inflammatoires ou régulatrices.

Travail Expérimental

Travail Expérimental

Caractérisation du métabolome de F. graminearum f

II. Travail Expérimental

Caractérisation du métabolome de F. graminearum

Il a précédemment été mis en évidence que les risques liés à l'exposition aux mycotoxines sont souvent sous-estimés à cause de différents facteurs, dont le fait qu'on ne connaisse qu'un faible pourcentage des métabolites auxquels on est exposé. Ceci s'applique particulièrement aux aliments contaminés par F. graminearum dont on ne connaît qu'une dizaine de métabolites alors que le génome de cette moisissure laisse présager une grande diversité de métabolites encore inconnus. Etant donné que F. graminearum est une des moisissures le plus fréquemment rencontrées en Europe, il apparaît important de mieux caractériser son métabolome et de tenter de déterminer si cette moisissure produit d'autres métabolites, potentiellement toxiques.

Pour cela il a été nécessaire de mettre au point une méthode permettant non seulement la détection, mais aussi l'identification du plus grand nombre de nouveaux métabolites. La spectrométrie de masse de haute résolution et la chromatographie en phase liquide ont été choisies pour leur sensibilité et leur efficacité en termes de séparation, de précision et de résolution. Ces techniques ont été combinées à l'utilisation de métabolites marqués en isotopes stables, ce qui a permis de surpasser les quelques limitations inhérentes aux techniques de chromatographie et de spectrométrie.

La partie qui suit contient tout d'abord une brève introduction des techniques utilisées pour la détection et l'identification de métabolites fongiques. Ensuite, une première étude présente la mise au point et la validation de la méthode sur une espèce modèle (Aspergillus fumigatus) (article 1) puis, une deuxième étude montre l'application de cette méthode sur le métabolome de F. graminearum (article 2).

Détection et identification de métabolites secondaires fongiques

La chromatographie [START_REF] Rouessac | Analyse chimique[END_REF] La chromatographie est une méthode de séparation des différents composés d'un mélange homogène liquide ou gazeux en fonction de leurs propriétés physico-chimiques (Fig. Il existe différents types de techniques de chromatographie en fonction de la nature des phases mobiles et stationnaires. Ainsi, dans la chromatographie en phase liquide, la phase mobile est liquide alors que dans la chromatographie en phase gazeuse, celle-ci est un gaz inerte vis-à-vis de la phase stationnaire et des composés du mélange. De plus, dans chacun des cas, il est également possible d'utiliser une phase stationnaire solide ou liquide.

Le choix de la phase mobile et de la phase stationnaire ainsi que d'autres paramètres tels que la colonne, la température et le débit sont optimisés pour obtenir le meilleur compromis entre résolution (discrimination entre des pics juxtaposés), vitesse de l'analyse (qui inclue aussi le retour aux conditions de départ pour pouvoir lancer l'analyse suivante) et capacité de la colonne (pour éviter sa saturation), en fonction des objectifs de l'analyse.

La chromatographie en phase liquide a connu d'importantes améliorations au début des années 80, avec l'apparition de la chromatographie liquide de haute performance (CLHP ou HPLC en anglais). La technique de séparation a été considérablement optimisée en agissant sur l'interaction entre les différents composés de l'échantillon, la phase mobile et la phase stationnaire. Ainsi, les colonnes ont été miniaturisées et de nouvelles phases stationnaires ont été utilisées. Il en est ressorti des colonnes plus compactes qui requièrent une forte pression à l'entrée pour permettre l'écoulement de la phase mobile. Ces colonnes plus courtes (augmentation de la vitesse d'analyse) et plus étroites (diminution de la consommation de phase mobile) permettent une meilleure séparation et donc une meilleure résolution des pics, ce qui est très avantageux pour la combinaison avec la spectrométrie de masse.

La chromatographie a initialement été développée en tant que technique de séparation; seulement depuis, elle est aussi utilisée comme méthode d'identification en se basant sur les temps de rétention spécifiques de chaque composé et la comparaison avec des standards. Cependant, l'identification avec cette méthode comparative n'est pas d'une très haute précision. A présent, la chromatographie est donc souvent associée à une autre technique de détection comme la spectrométrie de masse, qui va apporter une deuxième information sur chacun des composés séparés et permettre leur identification de façon plus certaine. Parmi les différentes méthodes existantes pour ioniser les composés dans la source du spectromètre, il existe des procédés qui se réalisent sous vide, comme la ionisation par impact électronique et la ionisation chimique positive et, d'autres, qui se réalisent à pression atmosphérique comme l'ionisation par électrospray et l'ionisation chimique à pression atmosphérique. Ces dernières sont compatibles avec la chromatographie en phase liquide, c'est pourquoi elles ont été utilisées dans les études qui seront présentées dans cette partie. ⎨ Trappe à ions (notée LTQ) : elle correspond à un analyseur à basse résolution permettant la fragmentation. Les ions sont piégés entre des électrodes appliquant un champ quadripolaire. La position de piégeage des ions par rapport au centre de la trappe à ions est fonction du rapport m/z. En éjectant les ions de manière progressive, les rapports m/z sont balayés graduellement, permettant d'obtenir un spectre de masse. Cet analyseur peut également fragmenter les ions. Pour cela, un ion père est isolé en éjectant tous les autres ions. La fragmentation a lieu en appliquant une fréquence correspondant à la fréquence de rotation de l'ion dans la trappe. Ce dernier va entrer en résonnance ce qui va augmenter sa vitesse et entraîner sa fragmentation par des collisions de basse énergie avec de l'hélium présent dans la trappe. En éjectant les ions fils de manière progressive de la trappe, leurs rapports m/z sont balayés, générant un spectre MS/MS. Ce processus peut être poursuivi en isolant un ion fils à son tour fragmenté en ions petits-fils, générant un spectre MS 3 , et ainsi de suite pour générer des spectres MS n . Au sein du spectromètre hybride LTQ-Orbitrap, les ions parents ou les ions fragments, peuvent être directement détectés à la sortie de la trappe à ions, de manière sensible, mais en basse résolution. Ils peuvent être aussi accélérés vers l'analyseur orbitrap.

⎨ C-trappe : cet élément permet de focaliser le faisceau d'ions et de les injecter dans l'orbitrap.

Cet élément peut également être « transparent » en laissant passer les ions vers la cellule de collision.

⎨ Cellule de collision (Collision cell) : cette cellule permet de fragmenter un ion parent isolé, mais non fragmenté dans la trappe. La fragmentation des ions est obtenue par collision avec de l'azote. L'énergie de ces collisions est plus forte que dans la trappe en raison de la taille du gaz utilisé, permettant d'obtenir des fragmentations différentes et complémentaires. Les ions fragments générés sont ensuite renvoyés vers la C-trappe pour être injectés et séparés en haute résolution dans l'orbitrap.

⎨ Orbitrap: correspond à un analyseur à haute résolution. Il se compose de deux électrodes concentriques appliquant un champ électrostatique. Les ions oscillent à la fois autour et le long de l'électrode centrale. La fréquence de déplacement le long de l'électrode centrale est fonction du rapport m/z. Une transformée de Fourrier est appliquée pour transformer les fréquences mesurées des ions en rapports m/z. Cet analyseur permet d'atteindre une très haute résolution de séparation des rapports m/z mais requiert un vide très important pour ne pas défocaliser la trajectoire des ions. C'est pouquoi, cet analyseur ne permet pas de fragmenter les ions. Néanmoins, il peut être utilisé pour séparer, à haute résolution, des ions fragments générés en amont dans le spectromètre Ainsi, dans nos études, l'orbitrap a été utilisé pour réaliser les analyses sur l'ensemble des ions parents en haute résolution. Pour les analyses MS 2 et MS 3 , la fragmentation a été réalisée dans la trappe et la détection dans l'orbitrap. La cellule de collision a été utilisée dans des cas particuliers où la fragmentation dans la trappe n'était pas suffisante. [START_REF] Rouessac | Analyse chimique[END_REF] Outre la chromatographie et la spectrométrie de masse, d'autres techniques peuvent être utilisées dans l'étude des métabolites secondaires fongiques.

Autres techniques

⎨ La spectrophotométrie : Cette technique permet d'obtenir le spectre d'absorbance d'une molécule pour une longueur d'onde (λ) donnée ou pour une plage de longueurs d'onde. En général, l'analyse comprend le spectre de l'ultraviolet (190-380 nm) et du visible (380-800 nm) formant un spectre UV-Vis. Un détecteur à barrette de diodes, ou en anglais, photodiode array (PDA) detector ou bien diode array detector (DAD) est normalement utilisé pour mesurer les absorbances pour chaque longueur d'onde. Cette méthode a été très employée en combinaison avec la chromatographie liquide pour caractériser les métabolites secondaires fongiques, dont les mycotoxines (Frisvad andThrane, 1987, 1993). En effet, certains spectres sont caractéristiques d'une molécule ou d'une famille de molécules. Ainsi, la longueur d'onde d'absorbance maximale (λmax), la valeur de longueur d'onde d'absorbance minimale (λmin), les vallées et les épaulements peuvent renseigner sur les groupements chromophores et par conséquent, donner des indices quant à la structure.

⎨ La spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) : la RMN est un outil très utilisé pour l'analyse structurale de composés en solution ou à l'état solide. Elle permet de déterminer la formule développée, la stéréochimie et dans certains cas même, la conformation des composés. Cette technique repose sur l'interaction entre les noyaux des atomes présents dans l'échantillon quand ils sont soumis à un champ magnétique intense et constant. En effet, l'orientation de chaque noyau soumis à un champ magnétique lui est propre et permet donc de l'identifier.

⎨ Immunodétection : ces techniques sont essentiellement utilisées pour le dosage de molécules présentes dans un mélange en se basant sur la spécificité de couplage des anticorps. Les dosages sont majoritairement réalisés par des tests ELISA (de l'anglais Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) qui utilisent un anticorps spécifique à la molécule d'intérêt, couplé à une enzyme capable d'émettre un signal en présence de son substrat. Le signal émis sera alors proportionnel à la concentration du composé étudié. Ces méthodes sont de plus en plus utilisées pour doser les taux de contamination des denrées alimentaires. Néanmoins, elles ne peuvent être appliquées que dans le cas où il existe des standards permettant la production des anticorps spécifiques. De plus, ce genre de méthodes ne peut cibler qu'un nombre limité de métabolites en même temps.

⎨ Utilisation d'isotopes : L'utilisation d'isotopes stables ou radioactifs est majoritairement appliquée au dosage de certains composés par l'ajout d'un composé homologue contenant des isotopes. La concentration du composé marqué sert de standard interne pour déterminer la concentration du composé d'intérêt. L'analyse de la composition isotopique est aussi utilisée pour déterminer l'origine géographique ainsi que pour la datation de substances naturelles.

Dans les études présentées par la suite, les isotopes ont été employés d'une toute autre façon. En effet, il ne s'agit pas de doser les métabolites fongiques mais de les identifier. Comme il est décrit dans la prochaine section, le marquage isotopique a servi à déterminer les formules chimiques de chaque métabolite secondaire.

Nouvelle méthode d'analyse non ciblée de métabolites fongiques (Article 1)

L'étude présentée ici décrit une méthode non ciblée de détection de métabolites secondaires fongiques. Les méthodes non ciblées ont pour avantage des paramètres de détection qui permettent l'identification d'un large panel de molécules. La majorité de ces méthodes utilisent des techniques de spectrométrie de masse de haute résolution, comme décrit précédemment. L'objectif de cette étude était de combiner cette technique avec le marquage isotopique du métabolome fongique pour identifier des nouveaux métabolites secondaires. Le marquage isotopique est très largement employé dans des études de voies de biosynthèse, ainsi que de flux et de métabolisation de molécules mais très peu pour l'identification de nouveaux métabolites. A notre connaissance, c'est donc la première fois que ces deux techniques ont été combinées pour analyser le métabolisme secondaire fongique.

Pour valider cette méthode, nous nous sommes servis de la souche NRRL 35693 d'Aspergillus fumigatus qui a été isolée dans notre laboratoire à partir de grains d'orge. A. fumigatus est l'un des pathogènes fongiques les plus importants pour l'homme. Cette moisissure est omniprésente dans notre environnement, et plusieurs centaines de ses conidies (spores de la reproduction asexuée) sont certainement inhalées chaque jour par chaque individu [START_REF] Eduard | Fungal spores: a critical review of the toxicological and epidemiological evidence as a basis for occupational exposure limit setting[END_REF]. La virulence d'A. fumigatus est associée à plusieurs mycotoxines dont la gliotoxine qui est immunosuppressive et la trypacidine qui induit la nécrose des tissus pulmonaires. Le métabolome secondaire d'A. fumigatus est actuellement un des mieux caractérisés, ce qui justifie qu'il ait été choisi en tant que modèle pour valider la méthode.

La souche NRRL 35693 d'A. fumigatus a donc été mise en culture sur trois substrats de grains de blé (Triticum aestivum) différents préalablement enrichis en isotopes stables de la façon suivante:

(1) des grains de blé naturellement enrichis (99% 12 C), (2) des grains de blé enrichis à 96,8 % en carbone 13 ( 13 C) et (3) des grains enrichis à 53,4% en 13 C et 96,8% en azote 15 ( 15 N). Suite à ces cultures, il a donc été possible d'obtenir trois échantillons où les métabolites étaient soit (1) naturellement enrichis, soit (2) enrichis en 13 C uniquement ou (3) enrichis en 13 C et 15 N. De plus, un contrôle avec du blé naturellement enrichi a aussi été mis en culture dans les mêmes conditions mais en absence de moisissure pour pouvoir s'affranchir de la présence des métabolites du blé. Les échantillons ont ensuite été analysés par HPLC-HRMS, ce qui a permis l'indentification de 21 métabolites secondaires. La formule chimique de ces métabolites a pu être déterminée en utilisant Mass Compare qui est un logiciel développé expressément dans ce but par un membre de l'unité. Ce logiciel se sert des différences entre les masses dans l'échantillon 12 C et l'échantillon 13 C pour déterminer le nombre d'atomes de carbone, et de la différence entre l'échantillon 12 C et l'échantillon 13 C/ 15 N pour déterminer le nombre d'atomes d'azote. Les formules chimiques ont ensuite été comparées dans la base de données AntiBase 2012, qui recense à ce jour plus de 40 000 métabolites de microorganismes.

En plus des métabolites déjà connus d'A. fumigatus, l'utilisation de la méthode décrite cidessus a permis d'identifier un nouveau membre de la famille des fumigaclavines, la fumigaclavine D. La structure de ce métabolite, qui n'avait jamais été décrite auparavant, a pu être déterminée grâce à l'élucidation de sa formule chimique et grâce à l'analyse par MS n des spectres de fragmentations. Les fumigaclavines appartiennent à la famille des alcaloïdes de l'ergot et plus précisément au groupe des clavines alcaloïdes. Ces métabolites présentent de fortes similitudes structurelles avec certains neurotransmetteurs et de ce fait, peuvent induire des effets importants au niveau du système nerveux.

Par ailleurs, l'utilisation de cette méthode a aussi permis d'identifier une dégradation de la tryptoquivaline F par le méthanol, ayant eu lieu post-biosynthèse. Ce genre de transformations est fréquent et très problématique dans les études de métabolomes car l'origine non biologique de ces modifications est difficilement identifiable. Dans le cas présent, il n'y avait pas de doutes à ce sujet grâce au marquage isotopique des carbones intégrés biologiquement dans les métabolites. Ainsi, l'intérêt de la méthode ne repose pas uniquement sur la possibilité de déterminer les formules chimiques des pics détectés par HPLC-HRMS, mais aussi et surtout, sur la possibilité de pouvoir discerner les métabolites d'origine fongique des artefacts survenant lors du traitement des échantillons.

La méthode non ciblée de détection de métabolites secondaires fongiques a par conséquent été validée avec succès lors de cette étude. Il est désormais possible de l'appliquer aux métabolomes d'autres espèces fongiques d'intérêt comme F. graminearum. Ce genre d'études offre la possibilité d'identifier une infinité de nouveaux métabolites fongiques et laisse présager la découverte de nouvelles toxines ou de nouvelles molécules d'intérêt pharmacologique.

Tous les détails au sujet de cette étude, qui a été accepté pour publication dans Analytical Chemistry en juillet 2013, sont présentés à la suite dans le format de publication du journal.

Etude du métabolome de F. graminearum (Article 2)

Dans la partie précédente, une nouvelle méthode de détection de métabolites secondaires fongiques a été présentée. Cette méthode a pour caractéristique principale d'être non-ciblée, c'est à dire que ses paramètres d'extraction et de détection ne sont pas spécifiques à un type ou à une famille de métabolites, permettant ainsi d'élargir le spectre de métabolites identifiés. Dans la partie qui suit, cette méthode a été mise en application pour étudier le métabolome de F. graminearum. Comme il a déjà été décrit, le genre Fusarium est l'un des plus importants producteurs de mycotoxines et F. graminearum est l'un des plus importants phytopathogènes des céréales dans les régions tempérées du globe. La contamination des cultures par cette moisissure génère des pertes importantes dans le secteur agricole de part la diminution de la qualité des grains ainsi que la toxicité des mycotoxines associées à la présence du champignon. Malgré cela, les connaissances du métabolome de F. graminearum sont limitées à une dizaine de métabolites seulement. C'est pourquoi l'objectif principal de cette étude était de mieux caractériser le métabolome de cette moisissure.

Pour atteindre cet objectif, la souche PH-1 a été utilisée en tant que modèle d'étude car son génome a récemment été séquencé, révélant la présence de 15 gènes PKS et 19 gènes NRPS. Seuls 9 de ces gènes ont été caractérisés du point de vue de leur fonction, laissant présager un grand nombre de métabolites encore inconnus. Une meilleure connaissance des métabolites produits par F. graminearum pourrait donc permettre à la fois de mieux comprendre sa pathogénicité mais aussi de mieux estimer les risques encourus par les consommateurs.

De la même façon que dans l'étude précédente, la souche PH-1 a donc tout d'abord été mise en culture sur trois substrats de grains de blé différents: (1) des grains naturellement enrichis en isotopes stables, (2) des grains enrichis à 96,8% en carbone 13 ( 13 C) et (3) des grains enrichis à 53,3% en 13 C et à 96,8% en azote 15 ( 15 N). Suite à un mois de culture, tous les métabolites étaient soit naturellement marqués en isotopes stables, soit marqués au 13 C, soit marqués au 13 C et à 15 N. Une analyse par spectrométrie de masse de haute résolution a permis de déterminer la masse exacte de ces métabolites. Leurs formules chimiques ont ensuite été établies à l'aide du logiciel Mass Compare.

De cette façon, 37 nouveaux métabolites ont pu être caractérisés. L'utilisation d'AntiBase, a permis de déterminer que 19 des métabolites caractérisés avaient des correspondances de formule avec des métabolites déjà décrits alors que le reste correspondaient à des métabolites totalement inconnus. Parmi les métabolites déjà décrits, la présence de fusaristatine A dans le métabolome de F. graminearum a pu être démontrée grâce à l'utilisation d'un standard. C'est la première fois que ce métabolite, qui inhibe la prolifération de cellules pulmonaires cancéreuses, a été isolé du métabolome de F. graminearum. De plus, à partir de la structure de la fusaristatine A, deux nouveaux membres de cette famille, qui n'avaient jamais été décrits auparavant, ont été identifiés. Les résultats obtenus lors de cette étude ont apporté de nouvelles perspectives quant à la toxicité de F. graminearum et sont très encourageants dans la poursuite de l'exploration de son métabolome qui s'est montré très riche.

Tous les détails au sujet de cette étude, qui sera bientôt soumise pour publication, sont présentés à la suite, sous forme d'article.

Isotopic labeling of the metabolome of F. graminearum in vitro and identification of new secondary metabolites by HPLC-HRMS analysis

Patricia M. Cano 1,2 , Emilien L. Jamin 1,2 , Souria Tadrist 1,2 , Pascal Bourdaudhui 1,2 , Michel Péan 3,4,5 , Laurent Debrauwer 1,2 , Isabelle P. Oswald 1,2 , Marcel Delaforge 6 , Olivier Puel

Abstract

Filamentous fungi constitute one of the most important sources of secondary metabolites, which may be beneficial or deleterious for humans, animals and plants. So far, only a limited number of these metabolites have been identified, leaving a large array of possible drugs or mycotoxins undiscovered. Fusarium is one of the most important mycotoxin-producing fungal genera and, F. graminearum is one of the most devastating cereal pathogens in temperate regions of the world. It is known for the production of several mycotoxins such as deoxynivalenol, with important immunosuppressive effects, zearalenone, with important estrogenic properties and fusarin C, strongly suspected of being mutagenic. Contamination by F. graminearum makes contaminated cereal grains unsafe for human and animal consumption. Given the limited knowledge on the metabolome of this important cereal pathogen, the main objective of this study was to draw a better picture of its secondary metabolome. Therefore, a recently validated untargeted method was used to identify new metabolites. More precisely, the strain PH-1 was grown on wheat grains (Triticum aestivum) that were differently enriched with stable isotopes: (1) naturally enriched grains, (2) grains enriched 96.8% with 13 C, (3) grains enriched 53.3% with 13 C and 96.8% with 15 N. Then, high-resolution mass spectrometry allowed the specific detection and highly accurate mass measurement, and the isotopic labeling of the metabolome allowed formula ambiguities to be overcome by reporting the number of carbon and nitrogen atoms. Application of the method to the metabolome of F. graminearum allowed the characterization of 37 new compounds, among which 18 corresponded to totally unknown compounds. The use of AntiBase, one of the most extensive databases on fungal metabolites, and a standard allowed the unambiguous identification of fusaristatin A for the first time in the metabolome of this fungus. This metabolite is an inhibitor of cell proliferation. Based on the structure of fusaristatin A, two other members of the fusaristatins family were also identified. The results obtained in this study bring new perspectives on the toxicity of this fungus, encouraging the exploration of the richness of the metabolome of F. graminearum.

Introduction

Filamentous fungi constitute one of the most important sources of secondary metabolites, many of which present industrially interesting properties that have been beneficial for humans in the fields of medicine and food industry. Other metabolites, known as mycotoxins, have been shown to have deleterious effects resulting in human, animal and phyto-pathologies (CAST 2003). For instance, one of the most potent carcinogenic and genotoxic natural substances is aflatoxin B1, which is produced by fungal species belonging to the genus Aspergillus (Bennett and Klich 2003). So far, over 2000 fungal secondary metabolites have been identified, among which, around 30 are considered as mycotoxins and only 6 are legally regulated (aflatoxins, zearalenone, deoxynivalenol, fumonisins, patulin and ochratoxin A). Given the large variety of fungal species and the knowledge on the richness of their genome, it is readily hypothesized that the largest majority of mycotoxins still remains unknown. In fact, in most cases, only studies targeting known mycotoxins are performed, thus limiting the scope of this field of research, which has however great potential for the discovery of new toxins or drugs. That is why untargeted detection methods are necessary to discover new secondary metabolites potentially beneficial or toxic for humans, animals or plants.

Among filamentous fungi, Fusarium is one of the most important mycotoxin-producing fungal genera. Fusarium species are important plant pathogens, widely distributed in cultivated soils in temperate regions of the world (Leslie and Summerell 2006). Fusarium graminearum (F. graminearum) is one of the most devastating cereal pathogens and it has recently been ranked 4 th in a list of the top 10 fungal plant-pathogens [START_REF] Dean | The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology[END_REF]. It causes head blight or scab disease in wheat and barley, and cob or ear rot disease in maize. All of these are responsible for important economical losses worldwide (Goswami andKistler 2004, Kazan et al. 2011). F. graminearum also produces a wide variety of secondary metabolites among which the most predominant known mycotoxins are deoxynivalenol, zearalenone and fusarin C (Desjardins and Proctor 2007). Deoxynivalenol (DON) is known for its immunosuppressive effects, zearalenone for its important estrogenic properties and fusarin C is strongly suspected of being mutagenic. Therefore, due to the presence of these mycotoxines, F. graminearum makes contaminated cereal grains unsafe for human and animal consumption.

Despite the great toxicity of the mycotoxins it produces, the metabolome of F. graminearum has not been well characterized so far. However, many studies have addressed the pathogenicity of this fungus by analyzing its life cycle and its interactions with host plants by the intermediary of known mycotoxins, especially DON [START_REF] Trail | For blighted waves of grain: Fusarium graminearum in the postgenomics era[END_REF]. The recent sequencing of the genome of this fungus (strain PH-1) has lead to the identification of 15 genes encoding for polyketide synthases (PKS) and 19 genes encoding for non-ribosomal peptide synthases (NRPS), which with terpenes synthases are the most important pathways for the biosynthesis of fungal secondary metabolites (Cuomo et al. 2007, Hansen et al. 2012). However, only 6 PKS genes and 3 NRPS genes have been characterized in terms of their biological function (Gaffoor et al. 2005, Hansen et al. 2012, Sørensen et al. 2012). Gaining more knowledge on the metabolome of F. graminearum would positively affect our understanding of the toxicity of this fungus and, it would also allow a better estimation of the risks for the consumers.

Consequently, the main objective of this study was to draw a better picture of the secondary metabolites produced by F. graminearum. An untargeted detection method combining stable isotopic labeling of the metabolome with carbon 13 ( 13 C) and nitrogen 15 ( 15 N) and high-resolution mass spectrometry was therefore used to characterize the secondary metabolome of the strain PH-1 of F. graminearum. This method was recently developed and validated by analyzing the betterknown secondary metabolome of Aspergillus fumigatus, one of the most important human lifethreatening fungal pathogens (Cano et al. 2013). In this method, high-resolution mass spectrometry allows the specific detection and highly accurate mass measurement of fungal secondary metabolites, and the isotopic labeling allows formula ambiguities to be overcome by reporting the number of carbon and nitrogen atoms. In addition, AntiBase 2012, which is a database gathering over 40,000 metabolites produced by microorganisms [START_REF] Laatsch | Antibase[END_REF], was used for possible identification of the metabolites that had been characterized. One of the main advantages of this analytical method is to discriminate products with a non-biological origin, which is usually a struggling point when characterizing new metabolites. In addition, it also discriminates adducts formed with solvents, which distort the chemical formula of the detected ions.

To the best of our knowledge, it is the first time that such an extensive analysis of the metabolome of F. graminearum has been achieved with the combination of HPLC-HRMS and stable isotopic labeling. As a result, 37 new metabolites have been identified, among which 19 could be annotated with AntiBase, although not yet confirmed with standard metabolites and 18 correspond to totally unknown compounds. Among these, fusaristatin A was identified for the first time in the metabolome of F. graminearum. The identification of this inhibitor of lung cells proliferation brings new perspectives on the toxicity of this fungus, encouraging scientists to continue the study of the metabolome of F. graminearum.

Materials and Methods

Chemicals and Reagents

All solvents and chemicals were purchased from Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Illkirch, France). Solvents were HPLC grade except acetonitrile, which was MS grade. All other chemicals were analytical grade.

In vitro cultures of F. graminearum on 12 C, 13 C and 13 C / 15 N Labeled Wheat Grains

The strain of Fusarium graminearum used in this study (NRRL 31084, designated as PH-1) was provided by the Centraalbureau voor Schimmelcultures (Utrecht, The Netherlands). Seven-days cultures of PH-1 on Potato Dextrose Agar (PDA) (Sigma-Aldrich, St Quentin-Fallavier, France) were used to inoculate three different wheat grains substrates (variety Caphorn of Triticum aestivum): (1) naturally enriched wheat grains (99% 12 C/ 1% 13 C, referred to as 12 C wheat), (2) nearly 100 % 13 C enriched wheat grains (referred to as 13 C wheat) and (3) nearly 50 % 13 C and nearly 100 % 15 N wheat grains (referred to as 13 C / 15 N wheat). Wheat uniform isotopic enrichments were performed in hermetically sealed chambers during a complete growth cycle with labeled CO 2 and labeled nitrate and ammonium salts as previously described. Final isotopic enrichments were measured with a Delta V Advantage isotope ratio mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). They were of 96.8 % ± 0.15 for the 13 C wheat, 53.4% ± 0.3 13 C and 96.8% ± 0.07 15 N for the 13 C/ 15 N wheat. Grain preparation and inoculations were performed as previously described (Cano et al. 2013). Prior to inoculation, wheat grains were washed, soaked in distilled water and autoclaved twice to get rid of any endogenous living microorganisms. Water activity (a w ) of the grains was maintained above 0.98 throughout the experiment. Cultures were allowed to grow 1 month at 25°C in the dark without shaking. In order to discriminate between metabolites produced by F. graminearum and wheat metabolites, 12 C wheat grains were also incubated in the same conditions as the other samples but without fungi.

Metabolite Extraction

Metabolite extraction was performed using 200 mL of chloroform at room temperature on a shaking table IKA Labortechnik HS501 (Janke & Hunkel, Imlab, Lille, France) at 180 rpm for 36 h. Ethyl acetate was used instead of chloroform to extract polar compounds such as deoxynivalenol. Solvents were filtered and then evaporated in two steps: first with rotavapor (Buchi, Switzerland) and then with Zymark Turbovap-LV (McKinley Scientific, Sparta, NJ, USA). Metabolites were dissolved in 400 µL of methanol and then filtered with 0.45 µm Whatman filters (Whatman, GE Healthcare, Kent, UK) before HLPC-MS analysis.

Preparation of metabolite reference compounds

Metabolite reference compounds have been purchased (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). Fusaristatin A was a gift from Shiono, Y. from the Department of Bioresource Engineering, Faculty of Agriculture, Yamagata University, Japan. All standards were dissolved in methanol for qualitative analysis by HPLC-MS as described below. Standard solutions were kept at -20°C.

Untargeted HPLC and mass spectrometry analysis of in vitro cultures

Untargeted analyses were performed using high performance liquid chromatography (HPLC) coupled to an LTQ Orbitrap XL high-resolution mass spectrometer (HRMS) (Thermo Fisher Scientific, Les Ulis, France). Briefly, 10 µL of methanol suspension of culture extracts were injected into a reversed phase (150*2.0 mm) 5 µm Luna C18 column (Phenomenex, Torrance, CA, USA) operated at a flow rate of 0.2 mL/min. A gradient program was performed with 0.1 % formic acid (phase A) and 100 % acetonitrile (phase B) with the following elution gradient: 0 min 20% B, 30 min 50% B, from 35-45 min 90% B, from 50-60 20% B. HRMS acquisitions were achieved with electrospray ionization (ESI) in the positive and negative modes as follows: spray voltage +4.5 kV, capillary temperature 350°C, sheath gas (N 2 ) flow rate 40 au (arbitrary units), auxiliary gas (N 2 ) flow rate 6 au in the positive mode, and spray voltage -3.7 kV, capillary temperature 350°C, sheath gas (N 2 ) flow rate 30 au, auxiliary gas (N 2 ) flow rate 10 au in the negative mode. Full MS spectra were acquired at a resolution of 60000 with a range of mass-to-charge ratio (m/z) set to 50 -800.

For deoxynivalenol detection, a reversed phase (150*2.0 mm) 5 µm polar Synergy column (Phenomenex, Torrance, CA, United States) was used instead of the Luna C18 column for being more efficient to separate polar compounds. A gradient program was performed with 0.1% acetic acid (phase A) and acetonitrile (phase B) as mobile phases. The elution started with an isocratic elution 100% of solvent A for 5 min. Then solvent B was increased linearly to 50% within 5 min. After 6 min at 50%, the gradient was increased again linearly to 90% of B within 4 min. Finally, after 5 min of 90% solvent B, the gradient was decreased to initial conditions in 2 min and remained at this value for the last 10 min. Atmospheric pressure chemical ionization (APCI) operating in the positive mode was used to perform HRMS analyses. Ionization conditions were: 260°C for the vaporizer temperature, 2.5 µA for the corona discharge, 32 au for the sheath gas flow rate, 5 au for the auxiliary gas) and 290°C for the capillary temperature. Mass spectrometric resolution was set to 60,000 for m/z range from 50 to 800.

Results and Discussion

Untargeted Analysis of the metabolome of F. graminearum in vitro

Although it is an important plant pathogen, the metabolome of F. graminearum has not been profusely studied. However, it presents a great interest given its virulence. Therefore, in this study, an untargeted analysis was performed in order to identify new metabolites produced by this fungus. Table 1 summarizes all the metabolites that could be identified in F. graminearum samples, including their retention times (RT), exact m/z values in 12 C wheat substrate as well as in 13 C wheat and 13 C/ 15 N wheat, chemical formulas and adduct forms. Among those are included known metabolites as the mycotoxins deoxynivalenol, zearalenone, fusarin A, fusarin C and aurofusarin.

Formula determination for each metabolite was performed as previously developed and validated on A. fumigatus (Cano et al. 2013). Briefly, after growth on 12 C wheat grains, 13 C wheat grains or 13 C/ 15 N wheat grains, all the produced secondary metabolites produced by F. graminearum were unlabeled ( 12 C cultures), fully labeled ( 13 C cultures), or doubly labeled ( 13 C/ 15 N cultures). Then, after HPLC-HRMS analysis, chromatograms of the most abundant ions in the three substrates ( 12 C, 13 C and 13 C/ 15 N) were extracted from Xcalibur (Thermo Scientific). Wheat metabolites were excluded by HPLC-HRMS analysis of the 12 C wheat sample that was incubated without F. graminearum. Ions corresponding to the same metabolite in the three different substrates were grouped based on same retention time (RT) and similar MS 2 pattern. Mass shifts could be observed among the three m/z ratios corresponding to the same metabolite. The difference between the 12 C m/z and the 13 C m/z indicated the number of atoms of carbon and the shift between the 12 C m/z and the 13 C/ 15 N m/z was used to determine the number of atoms of nitrogen. Mass Compare, an in-house-developed program (Downloadable at http://www.toulouse.inra.fr/axiomm), was able to automatically determine the common chemical formula to the three ions, corresponding to the chemical formula of the metabolite. Finally, all the resulting chemical formulas were searched in AntiBase 2012 [START_REF] Laatsch | Antibase[END_REF]. Additional putative annotation of metabolites was performed by interpretation of MS 2 experiments, and when possible, identity was confirmed by comparison with the HPLC-MS 2 analysis of a standard compound. MS 3 experiments were performed when further information was needed for structural determination.

Identification of new metabolites

Besides the known metabolites, 37 additional chemical formulas could be unambiguously associated to mass peaks detected in our samples (Table 1). The formulas of 19 of these unknown metabolites matched with formulas gathered in AntiBase 2012 (supplementary data). Since this database does not only encompass metabolites produced by filamentous fungi but also bacteria and other microorganisms, putative metabolites were limited to fungal origin and phylogenetic closeness to Fusarium species. Antibase hits were screened in order to search for standard molecules. As a result, fusaristatin A could be identified. Two other metabolites could be related to fusaristatin A and further MS 3 experiments were performed to determine their structure.

Identification of fusaristatin A

Based on HPLC-HRMS results and AntiBase searches, we were able to successfully identify the presence of fusaristatin A in the metabolome of F. graminearum (Fig. 1). This compound displayed a retention time of 40.4 min, and presented a characteristic gaussian isotopic pattern in the 13 C/ 15 N sample with the major ion detected at m/z 681.4861. It was also detected at the same RT but at different m/z ratios in the 12 C sample (m/z 659.4373) and in the 13 C sample (m/z 695.5583). Common elemental composition of the 3 m/z ratios was confirmed by comparison of MS 2 spectra. Additionally, this metabolite was not only ionized as the [M+H] + form but also as the [M+Na] + adduct ion (m/z 681.4188, in the 12 C sample). As previously explained, mass shifts between the 12 C sample (Fig. 1A) and the 13 C sample (Fig. 1B) indicated 36 atoms of carbon and the mass shift between 12 C peaks and 13 C/ 15 N peaks (Fig. 1C) indicated 4 atoms of nitrogen. The chemical formula of the compound was determined using Mass Compare (C 36 H 59 O 7 N 4 ). A search in AntiBase showed that it could correspond to the protonated form of fusaristatin A [C 36 H 58 O 7 N 4 + H] + . The analysis of a standard of fusaristatin A in the same experimental conditions confirmed the nature of this compound (Fig. 1D).

As far as we know, it is the first time that this mycotoxin has clearly been isolated from F. graminearum. Only one previous study reported the presence of this metabolite (Shiono et al. 2007). In that study fusaristatin A was extracted from a fungal species isolated in Germany and identified as a Fusarium species by the Centraalbureau voor Schimmelcultures (The Netherlands). Fusaristatin B (C 37 H 50 O 8 N 3 ), which was also detected in that study, could not be identified in the present article, probably due to strain or media differences. These metabolites showed a growth-inhibitory activity in lung cancer cells (LU 65) with IC 50 values of 23 and 7 µM, respectively. However no further studies have analyzed the toxicity of these metabolites.

In addition to fusaristatin A, two other peaks could be identified as being related to this family of metabolites.

Fusaristatin C

This metabolite was systematically detected at a RT of 40.6 min, when fusaristatin A was present. It will be further referred to as fusaristatin C. In the three substrates ( 12 C, 13 C and 13 C/ 15 N), it appeared with a mass shift of 2 compared to fusaristatin A, which suggested the presence of a saturated double bond (data not shown). Following the same method as before, the exact formula of this metabolite was determined to be [C 36 H 60 O 7 N 4 +H] + . The MS 2 spectrum of this new fusaristatin (Fig. 2B) presented similarities with that of fusaristatin A (Fig. 2A). An MS 3 experiment confirmed identical substructures of the fragment ions 214, 232, 303, 341 and 359 and different substructures for the fragment ions 285, 402, 430, 435, 497, 515 and 626. Based on this, the position of the saturated double bond could be located as depicted in figure 2 (Fig. 2C,D). Given these results, it was possible to elucidate the structure of fusaristatin C (Fig. 2D).

Fusaristatin D

Additionally, another metabolite could be identified at a RT of 40 min with a similar MS 2 fragmentation profile to that of fusaristatin A. It will be further referred to as fusaristatin D. Based on the mass shifts between m/z ratios and using Mass Compare, the chemical formula of fusaristatin D could be determined [C 31 H 54 O 6 N 4 +H] + . Comparison of the MS 2 spectrum of this metabolite (Fig. 3A) with that of fusaristatin A (Fig. 2A), revealed the presence of similar and different fragment ions. The substructure of these fragments was analyzed by MS 3 which confirmed that the ions 214, 232 and 283 were identical in the two molecules, and that 296, 348 and 415 were not. Based on this, it could be deduced that the two molecules differed in the side-chain which had a formula of C 20 H 35 O for fusaristatin A (Fig. 3B) and C 15 H 31 for fusaristatin D (Fig. 3C). However, fragmentation of the sidechain could not be achieved given its low reactivity. Therefore, it was not possible to elucidate the complete structure of fusaristatin D.

Conclusions and perspectives

As a conclusion, the combination of high accuracy mass spectrometry and double isotopic labeling efficiently enabled to study the secondary metabolome of F. graminearum, getting rid of problems coming from interferences of non-biological molecules. Thirty-seven new metabolites could be characterized among which, fusaristatin A, C and D were clearly identified. Fusaristatin A had never been isolated from F. graminearum and fusaristatin C and D had never been described before. There is very limited knowledge on the toxicity of fusaristatin A and none for the two other metabolites. However, given their structural similarities, it is possible to suggest that the toxicity of the fusaristatins C and D is related to that of fusaristatin A that is, inhibition of lung cells proliferation. More knowledge is needed concerning the toxicity of fusaristatins as they may represent a risk after spore inhalation in the field or during grain transformation or after ingestion of contaminated food/feed.

In order to be able to identify other new metabolites, we are now confronted to the limited availability of standards. Also, 18 formulas gave no result in AntiBase, suggesting that they correspond to completely new molecules. The identification of these new secondary metabolites will require further specific and extended structural studies. In addition to that, the results obtained in this study encourage towards diversification of analytical technologies (sample preparation, metabolites separation and MS conditions) to complete the analyses of the metabolites produced on the labeled wheat grains.

Future experiments should also analyze the production of secondary metabolites in planta, in order to characterize the secondary metabolome of F. graminearum, as a plant pathogen and not as a grain saprophyte like in the present study. It has already been shown that, as a result of the interaction with a host plant, the profile of secondary metabolites produced by F. graminearum changes (Kazan et al. 2011). These changes have been explained by the impact of plant metabolites produced during the infection process. It would therefore be very interesting to analyze the presence in planta of the new metabolites identified here in saprophytic conditions. Furthermore, the production of other unknown metabolites, specifically related to pathogenicity, is most likely during infection. The characterization of such metabolites would also be important to continue exploring the richness of the metabolome of F. graminearum.

Supplementary Data

Table 1: Possible annotations for the new metabolites produced by F. graminearum based on AntiBase hits. Chemical formulas obtained after the HPLS-HRMS analysis of F. graminearum cultures extracts were searched in AntiBase 2012 [START_REF] Laatsch | Antibase[END_REF]. The results shown below are restricted to fungal metabolites. In bold are depicted the organisms that are phylogenetically closest to F. graminearum [START_REF] Blackwell | Research Coordination Networks: a phylogeny for kingdom Fungi (Deep Hypha)[END_REF] (1S,2S)-3-Oxo-2(2Zpentenyl)cyclopentane-1octanoic acid Fusarium oxysporum Miersch, O. et al., Phytochem. 50 (1999) Il a été démontré dans le chapitre précédent que le métabolome de Fusarium graminearum est composé d'une très grande diversité de métabolites ayant des structures différentes. Ces métabolites peuvent donc exercer des effets variés sur les organismes hôtes tels que les céréales, mais aussi sur les humains et les animaux ayant ingérés des produits contaminés. Après ingestion, l'intestin est l'un des premiers organes à entrer en contact avec ces métabolites et l'homéostasie de ce milieu complexe est donc susceptible d'être fortement perturbée. Différents acteurs, telles que les cellules épithéliales, les cellules du système immunitaire et le microbiote intestinal, prennent part dans la conservation de cette homéostasie. Ils sont donc particulièrement concernés par l'ingestion de métabolites fongiques.

Plusieurs études ont décrit les effets sur de la barrière intestinale de certaines mycotoxines produites par F. graminearum, comme le DON. Il a par exemple été mis en évidence que cette mycotoxine induit des dommages histologiques ainsi qu'une diminution des protéines des jonctions serrées, augmentant la perméabilité transmembranaire au niveau intestinal (Pinton et al., 2012). Il a aussi été prouvé que le DON perturbe la réponse immunitaire intestinale en augmentant la production de cytokines pro-inflammatoires et la production d'IgA mais en diminuant l'expression des TLRs (Islam et al., 2013).

Par ailleurs, de plus en plus d'études soulignent l'importance d'analyser les effets induits par une exposition combinée de plusieurs mycotoxines, étant donné que cette situation est plus proche de l'exposition réelle. Il a notamment été démontré que différents cocktails de fusariotoxines sont présents dans la majorité des échantillons contaminés par F. graminearum et que la toxicité de ces cocktails et généralement supérieure à celle du DON seul [START_REF] Streit | Multi-Mycotoxin Screening Reveals the Occurrence of 139 Different Secondary Metabolites in Feed and Feed Ingredients[END_REF]. Cependant, ces études ne portent que sur la co-exposition à des mycotoxines déjà connues et, d'après les analyses menées dans la première partie de cette thèse, il est clair maintenant que l'on retrouve d'autres métabolites qui étaient jusque là inconnus dans les échantillons contaminés par cette moisissure.

Les objectifs des études présentées dans cette partie ont été d'une part de mieux comprendre les effets pro-inflammatoires induits par le DON au niveau de la barrière intestinale ; mais aussi d'apporter des connaissances quant aux effets générés par l'ensemble des métabolites produits par F. graminearum. Une première étude a porté sur les effets pro-inflammatoires du DON in vitro et ex vivo chez le porcelet. Une deuxième étude a consisté en l'analyse in vivo des effets du métabolome de F. graminearum sur des paramètres zootechniques et immunitaires chez des porcelets. Enfin, cette partie débute par une rapide introduction des différents acteurs de la barrière intestinale et du système immunitaire intestinal.

Exposition intestinale aux mycotoxines et réponse immunitaire

La barrière intestinale

Après ingestion d'aliments contaminés, l'intestin représente un des premiers sites d'exposition et constitue une barrière de protection importante puisqu'il régule le passage des nutriments et des contaminants vers les différents compartiments de l'organisme. L'intestin est composé de différentes parties : l'oesophage, l'intestin grêle (duodénum, jéjunum, iléon), le gros intestin (caecum et colon) puis le rectum. L'absorption des nutriments et des contaminants a principalement lieu au niveau de l'intestin grêle et plus précisément du jéjunum.

La paroi digestive comprend 4 tuniques successives qui vont à partir de la lumière dans l'ordre présenté ci-dessous (Fig.

II.6):

⎨ La muqueuse : est formée par trois couches successives : la muscularis mucosae (deux couches musculaires), la lamina propria (tissus conjonctif riche en cellules immunitaires) et l'épithélium.

⎨ La sous-muqueuse : tissus conjonctif très irrigué qui permet le glissement de la muqueuse sur la couche musculeuse.

⎨ La musculeuse : constituée de deux couches de fibres musculaires lisses.

⎨ La séreuse : directement connectée au mésentère. Au niveau de la muqueuse intestinale, l'épithélium, qui assure la fonction de barrière et participe à la réponse immunitaire, est composé de différentes populations cellulaires qui s'organisent dans une seule couche monostratifiée. Les entérocytes sont les cellules principales de l'épithélium parmi lesquelles s'insèrent des cellules à mucus ou cellules calciformes, des cellules

Lamina Propria

Epithélium

Muscularis Mucosae

Sousmuqueuse Muqueuse Musculeuse

Séreuse

Lumière intestinale endocrines qui sécrètent entre autres de la sérotonine, des catécholamines et de l'adrénaline, et enfin, des cellules de Paneth qui ont une action exocrine antimicrobienne. L'épithélium intestinal présente deux types de reliefs caractéristiques (Fig.

II.7):

⎨ Les villosités : évaginations en doigts de gant de la muqueuse qui permettent d'augmenter la surface d'absorption au niveau de l'intestin grêle. On retrouve au niveau des villosités des entérocytes essentiellement mais aussi des cellules calciformes.

⎨ Les cryptes de Lieberkühn : On trouve dans ces invaginations des cellules qui servent au renouvellement de l'épithélium comme des cellules souches et des cellules immatures. Ces cellules sont capables de se diviser et de se différencier en migrant le long des villosités pour assurer le renouvellement des cellules épithéliales au sommet des villosités qui meurent d'apoptose et sont éliminées dans la lumière intestinale [START_REF] Booth | Gut instincts: thoughts on intestinal epithelial stem cells[END_REF]. Ce processus prend environ une semaine chez l'homme. De plus, dans les cryptes il y a aussi des entérocytes, des cellules calciformes et des cellules de Paneth. Le passage contrôlé d'eau, d'ions et de nutriments repose sur la polarisation des entérocytes, qui délimitent ainsi l'environnement extérieur des compartiments internes. Au niveau apical, les entérocytes présentent des prolongements cytoplasmiques ou microvillosités qui sont disposées parallèlement les unes des autres et qui contiennent des microfilaments d'actine pour le maintient de leur structure. Ces microvillosités sont reliées aux protéines transmembranaires par des protéines accessoires comme la fimbrine et la villine.

Les cellules de l'épithélium sont connectées entre elles par différentes protéines transmembranaires. Ces protéines permettent de maintenir la structure de l'épithélium ainsi que le contrôle du passage transcellulaire, qui se fait par diffusion directe à travers la membrane ou des protéines de jonctions (Fig. II.8) [START_REF] Groschwitz | Intestinal barrier function: molecular regulation and disease pathogenesis[END_REF]. On retrouve :

Cellule Calciforme

Entérocyte Circulation Lymphatique

Circulation Sanguine

Villosité

Crypte

Cellule Endocrine

Cellule de Paneth Cellule Souche

Cellule en différentiation

⎨ Des Jonctions adhérentes : Ces jonctions se retrouvent sur la partie latérale de la membrane cellulaire. Elles sont formées par l'interaction de protéines transmembranaires, de protéines intracellulaires et du cytosquelette. L'interaction cadherin-caténine forme une des jonctions adhérentes majeures. Ces complexes sont non seulement importants pour la jonction cellulaire mais aussi pour le maintien de la polarité des cellules ainsi que pour la régulation de la migration et la prolifération cellulaire.

⎨ Des desmosomes : Ce sont des structures spécialisées formées des protéines desmogléines et des desmocollines, appartenant à la superfamille des cadherines. Elles possèdent un domaine extracellulaire qui permet l'adhésion entre cellules et un domaine cytoplasmique qui s'associe avec les filaments de kératine du cytosquelette.

⎨ Des jonctions serrées : Elles sont situées près de la surface apicale des cellules et constituent des complexes de maintient mécanique des cellules moins forts que les autres jonctions. Les jonctions serrées sont plutôt impliquées dans la perméabilité sélective de l'espace paracellulaire en permettant le passage de petites molécules comme l'eau et des ions et en empêchant le passage des protéines et des lipides. Il existe quatre familles de protéines transmembranaires qui peuvent former des jonctions serrées : l'occludine, les claudines, les protéines de la famille des junctional adhesion molecules (JAM) et la tricelluline. L'épithélium varie le long de l'intestin et permet de différencier les trois segments. Ainsi, les cryptes sont plus larges au niveau du duodénum alors que les formations lymphoïdes deviennent plus importantes au fur et à mesure que l'on avance dans le tractus intestinal, pour former ce que l'on connaît comme des plaques de Peyer. Ces dernières soulignent l'importance de la barrière intestinale dans la protection immunitaire de l'organisme face aux contaminants alimentaires. Parmi ces contaminants, les mycotoxines peuvent avoir des effets délétères sur la capacité de renouvellement de l'épithélium et la fonction de barrière en augmentant la perméabilité transépithéliale. Les mycotoxines peuvent aussi perturber la mise en place de la réponse immunitaire intestinale [START_REF] Oswald | Immunotoxicity of mycotoxins[END_REF]. Toutefois, l'effet de ces toxines sur le tractus digestif, et notamment sur la réponse immunitaire qui a lieu niveau des muqueuses, est peu documenté. C'est pourquoi les études de toxicité du DON et du mélange de fusariotoxines ont majoritairement porté sur la réponse immunitaire intestinale.

Microvillosité Jonctions Serrées

Desmosome Jonctions Adhérentes

La réponse immunitaire

Le système immunitaire intestinal est l'un des plus importants mais aussi des plus complexes de l'organisme. En effet, l'intestin doit efficacement jongler entre protection de l'organisme au moyen de l'inflammation et tolérance vis-à-vis des bactéries commensales et des antigènes alimentaires non toxiques. La perturbation de l'équilibre entre inflammation et tolérance peut avoir des effets importants sur la santé des individus comme c'est le cas des patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. Il est admis que chez des individus sains, l'environnement immunitaire intestinal a tendance à favoriser la tolérance, et l'inflammation est un symptôme pathologique.

Comme dans le reste de l'organisme, le système immunitaire intestinal est composé tout d'abord du système immunitaire inné. Celui-ci englobe les cellules et les mécanismes orchestrant une défense immédiate de l'organisme qui déclenche l'activation du système immunitaire acquis. Ce dernier génère une réponse spécifique à chaque agent infectieux par l'intermédiaire de populations cellulaires et de mécanismes adaptés pour une réponse plus efficace et de plus longue durée. De plus, l'immunité intestinale est organisée autour de deux axes :

(1) Des sites d'induction qui regroupent des tissus lymphoïdes spécialisés où a lieu la maturation et différentiation des lymphocytes :

⎨ Les plaques de Peyer : se situent dans la sous-muqueuse et contiennent une large collection de follicules à lymphocytes B et des zones d'activation des lymphocytes T. L'épithélium qui se trouve au niveau des plaques de Peyer, et que l'on nomme follicule associated epithelium (FAE), a pour spécificité une plus faible quantité d'enzymes digestives et de mucus mais une plus grande concentration de cellules B et T. Chaque follicule est associé à des cellules M qui sont des entérocytes spécialisés dans la fixation de pathogènes et qui ne présentent pas de microvillosités ni de mucus dans la surface apicale.

⎨ Les ganglions mésentériques : sont les ganglions lymphoïdes les plus importants de l'organisme et les premiers à se former lors du développement du foetus. Ils jouent un rôle essentiel dans le carrefour entre l'immunité mucosale intestinale et l'immunité périphérique en favorisant la circulation des cellules immunitaires.

⎨ Les follicules lymphoïdes isolés (ILF) : à la différence des plaques de Peyer qui sont majoritairement localisées au niveau de l'intestin grêle, les follicules lymphoïdes isolés sont aussi retrouvés au niveau du colon.

(2) Des sites effecteurs où ont lieu les réponses immunitaires par l'action des cellules immunitaires, dont les plus importantes sont : ⎨ Les macrophages : cellules sentinelles appartenant à l'immunité innée, capables de phagocyter des pathogènes extracellulaires. Après la phagocytose, les macrophages peuvent se comporter en tant que cellules présentatrices d'antigène (CPA) et stimuler l'activation des lymphocytes T.

⎨ Les cellules dendritiques (CD): ces cellules agissent à l'interface des systèmes immunitaires innés et acquis puisque ce sont les CPA par excellence. Il existe un grand nombre de souspopulations de cellules dendritiques adaptées aux divers environnements internes de l'organisme.

⎨ Les lymphocytes Th1 : Ce type de lymphocytes appartient à la famille des T helper ou cellules T effectrices. Ce sont des acteurs principaux de l'immunité acquise impliqués dans la réponse cellulaire aux pathogènes intracellulaires en stimulant l'activité des macrophages et des cellules T cytotoxiques.

⎨ Les lymphocytes Th2 : Ces cellules T helper sont spécialisées dans la défense face à des pathogènes extracellulaires en stimulant la mise en place de la réponse humorale, qui repose sur la production d'anticorps spécifiques par les lymphocytes B.

⎨ Les lymphocytes Th17 : Ces cellules T sont d'importantes stimulatrices de la réponse inflammatoire au niveau des muqueuses, comme l'intestin.

⎨ Les lymphocytes T régulateurs (Treg) : Ces cellules sont spécialisées dans le maintien de la tolérance.

Certaines caractéristiques du système immunitaire intestinal lui sont propres, comme le rôle des cellules épithéliales. En effet, comme il a été soulevé dans la partie précédente, ces cellules sont importantes quant à la détection des agents infectieux dans la lumière intestinale au niveau de leur surface apicale. Tout comme les macrophages, les cellules épithéliales peuvent agir en tant que CPA, en présentant les antigènes au niveau de leur surface basale. Ainsi, les cellules épithéliales possèdent les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH II) qui sont reconnues par les cellules T, mais manquent des molécules de co-stimulation pour une activation totale des cellules T. Par conséquent, l'activation par les cellules épithéliales induit généralement la tolérance locale, ou alors, la survie de cellules T préalablement activées. De même, il existe des populations de cellules dendritiques et de lymphocytes T et B qui sont spécifiques à la réponse intestinale. De plus, les populations de lymphocytes possèdent des marqueurs de surface spécifiques (molécules d'adhésion et récepteurs de chemokines) qui leur permettent de revenir à la muqueuse intestinale lors de leur migration dans la circulation sanguine.

Après reconnaissance par les cellules épithéliales, les cellules M ou les macrophages, l'antigène est présenté aux cellules dendritiques. La capture de l'antigène par les CD va induire leur maturation qui s'accompagne de modifications morphologiques et phénotypiques (expression de différents récepteurs et molécules de co-stimulation). Les CD vont ensuite migrer vers les organes lymphoïdes comme les plaques de Peyer où elles vont interagir avec les lymphocytes naïfs. La présentation de l'antigène aux lymphocytes va induire leur activation et leur maturation via les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I et II, des molécules de costimulation et des médiateurs tels que les cytokines. Les lymphocytes vont alors se différencier et devenir spécifiques à l'antigène en question. Ils vont ensuite migrer vers les ganglions mésentériques où ils vont finaliser leur différentiation. Le retour sur le site d'infection se fait ultérieurement par la circulation sanguine (Fig. II.9). A ce moment, chaque population de lymphocytes réalisera une tâche différente : les lymphocytes B produiront des anticorps IgA spécifiques dans la lamina propria, les lymphocytes T helper et les T régulateurs dirigeront la réponse immunitaire en produisant des cytokines et des chemokines au niveau de la lamina propria mais aussi de l'épithélium tout comme les cellules T cytotoxiques qui agiront en produisant des cytotoxines pour détruire l'agent infectieux. [START_REF] Mowat | Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens[END_REF]. La reconnaissance de l'antigène peut avoir lieu au niveau des cellules M dans l'épithélium associé au follicule (a) mais aussi au niveau des cellules épithéliales (réponse locale généralement) (e). Ensuite, les CD vont présenter l'antigène aux lymphocytes naïfs directement dans les plaques de Peyer (b) ou après migration (c), dans les ganglions mésentériques (d). Dans les deux cas, les lymphocytes différenciés rejoignent la circulation systémique (g) avant de regagner les muqueuses intestinales. Il est aussi possible que les antigènes accèdent directement à la circulation sanguine (h) et induisent la différentiation des lymphocytes dans les organes lymphoïdes périphériques (i).

Pour en revenir au fusariotoxines, et plus précisément au DON, étant donné la petite taille des mycotoxines, leurs effets toxiques sur l'immunité intestinale ne proviennent pas de leurs propriétés antigéniques. Malgré cela, les cellules intestinales et les cellules du système immunitaire sont des cibles privilégiées du DON. En fait, celui-ci perturbe la barrière intestinale et la réponse immunitaire en activant différentes voies de signalisation des MAPK et en modifiant l'expression des gènes. Comme il sera montré dans l'étude qui suit, ces perturbations peuvent entraîner la persistance de l'inflammation intestinale avec les risques de maladies chroniques qui y sont rattachées. Ces résultats ont partiellement été retrouvés in vivo, ou par contre, des différences entre l'effet du DON seul et celui d'un mélange de fusariotoxines ont été mises en évidence.

Effets proinflammatoires du DON (Article 3)

Le DON est bien connu en tant que modulateur du système immunitaire. A de fortes doses ingérées de façon aigue, il a été décrit comme un immunosuppresseur par induction de l'apoptose des leucocytes. Au contraire, des faibles doses de cette mycotoxine ingérées de façon chronique sont connues comme immunostimulatrices par induction de cytokines pro-inflammatoires comme l'IL-8 et l'IL-6 [START_REF] Pestka | Mechanisms of deoxynivalenol-induced gene expression and apoptosis[END_REF]. Ces modulations du système immunitaire perturbent l'homéostasie intestinale. Celle-ci repose sur l'interaction de différentes populations cellulaires du système immunitaire inné et acquis entre elles, mais aussi, avec le microbiote intestinal. Une perturbation de la communication intercellulaire peut donc engendrer des disfonctionnements importants de la barrière intestinale comme une plus grande sensibilité à des maladies opportunistes mais aussi, un endommagement des tissus dû à une inflammation chronique. C'est pourquoi l'objectif de cette étude a été d'essayer de mieux comprendre les effets du DON sur les interactions cellulaires entrainant la perturbation de l'homéostasie intestinale et plus précisément, les disfonctionnements pouvant mener à une inflammation chronique.

Pour cela, une approche in vitro avec des cellules épithéliales porcines non transformées (IPEC-1) ainsi qu'une approche ex vivo avec des explants intestinaux de porc ont été utilisées pour analyser les effets du DON sur l'inflammation intestinale et plus particulièrement sur la différentiation des lymphocytes T naïfs. Des analyses transcriptomiques, protéomiques et de cytométrie en flux ont été réalisées lors de cette étude.

Les résultats ont montré que l'inflammation induite par la présence de DON, et qui se traduit par une augmentation de l'expression d'IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β et TNF-α, s'explique par une augmentation de l'expression des gènes impliqués dans la différentiation des lymphocytes Th17 (STAT3, IL-17A, IL-6, IL-1β) au détriment des gènes impliqués dans la différentiation des cellules T régulatrices (FoxP3 et RALDH1). En ce qui concerne les cellules Th17, le DON induit tout particulièrement la production de cytokines par les cellules Th17 pathogéniques (IL-23A, IL-22 et IL-21) et non pas par les Th17 régulatrices (TGF-β et IL-10). Ces résultats concernant l'orientation de la réponse immunitaire intestinale vers une réponse inflammatoire par le DON indiquent que cette mycotoxine pourrait être un facteur déterminant pour le déclenchement de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin.

Cette étude est parue dans PloS ONE en Janvier 2013. Les détails de cette publication sont présentés dans le format du journal.

Effets de la totalité du métabolome de F. graminearum

Le métabolome de F. graminearum a été analysé in vitro dans la première partie de cette thèse en combinant la spectrométrie de masse de haute résolution et le double marquage isotopique. Lors de cette analyse, en plus des mycotoxines connues comme le déoxynivalénol (DON), la zéaralénone et les fusarines, plus d'une trentaine de nouveaux métabolites secondaires a été identifiée. Ces nouveaux métabolites sont donc susceptibles de contaminer les denrées alimentaires humaines et animales. Cependant, leur toxicité est encore inconnue, mis à part pour la fusaristatine A qui inhibe la prolifération des cellules pulmonaires (Shiono et al., 2007). De plus, il a été mis en évidence que des aliments naturellement contaminés par le DON étaient plus toxiques que des aliments artificiellement contaminés [START_REF] Streit | Multi-Mycotoxin Screening Reveals the Occurrence of 139 Different Secondary Metabolites in Feed and Feed Ingredients[END_REF]. Ceci témoigne donc de la présence d'autres métabolites biologiquement actifs qui interagissent avec le DON et augmentent la toxicité du mélange. C'est pourquoi l'objectif de cette étude a été de comparer la toxicité d'un mélange de métabolites produits par F. graminearum avec celle du DON seul.

Pour cela, la souche INRA 159 de F. graminearum a été utilisée pour ensemencer des grains de blé (Triticum aestivum). Cette souche a été choisie car, parmi les mycotoxines connues produites par F. graminearum, elle ne produit essentiellement que du DON. Ceci a permis de comparer la toxicité du DON seul ou en combinaison avec les nouveaux métabolites avec peu d'interférence d'autres mycotoxines connues comme la zéaralénone ou le nivalenol. Une analyse semi-ciblée, c'està-dire avec une recherche ciblée de métabolites mais sans standards, a été réalisée sur un extrait de la culture sur grains. Les résultats ont permis de détecter la présence de 23 des nouveaux métabolites identifiés dans l'étude précédente dont les fusaristatines A, C et D.

Pour comparer la toxicité du mélange à celle du DON, une étude in vivo a été réalisée avec trois groupes de six porcelets gavés pendant 13 jours avec (1) une solution contrôle, (2) une solution contenant 0,3 mg/kg p.c. de DON et (3) une solution contenant l'extrait de culture de F. graminearum avec une concentration en DON de 0,3 mg/kg p.c. Le porc a de nouveau été choisi en tant qu'espèce modèle étant donné sa forte sensibilité au DON et aussi son importante consommation de céréales dans les élevages. La dose de DON et la durée d'exposition ont été choisies de façon à pouvoir observer des effets au niveau des paramètres zootechniques et physiologiques sans entraîner de symptômes cliniques [START_REF] Forsyth | Emetic and refusal activity of deoxynivalenol to swine[END_REF].

Les résultats de cette étude ont montré des effets des traitements sur la consommation alimentaire des animaux et par conséquent sur la prise de poids. Ces effets ont été d'autant plus marqués chez les animaux exposés au mélange de toxines. De même, une augmentation du volume du foie a été mise en évidence après exposition au DON et encore plus après exposition au mélange. Cette augmentation est probablement liée au syndrôme du fatty liver [START_REF] Trail | Evaluation des risques liés à la présence de mycotoxines dans les chaînes alimentaires humaine et animale[END_REF]. D'un point de vue immunitaire, peu d'effets significatifs ont été observés. Cependant, contrairement au DON, le mélange de toxines a significativement diminué l'expression des ARNm codants pour des cytokines pro-inflammatoires comme l'IL-1α et l'IL-17A.

Cette étude a donc mis en évidence que l'exposition à l'ensemble des métabolites produits par F. graminearum dans le blé a des effets plus prononcés ou même contraires aux effets induits par le DON seul. Ces différences s'expliquent sûrement par la présence des nouveaux métabolites interagissant avec le DON. A notre connaissance, c'est la première fois qu'une étude sur la toxicité du métabolome de F. graminearum a été menée. Suite à cette étude, il serait donc intéressant de poursuivre de nouvelles expérimentations sur la toxicité de ces nouveaux métabolites.

Matériel et méthodes

Produits chimiques

Tous les solvants et produits chimiques ont été achetés chez Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Ilkirch, France). Les solvants avaient une qualité suffisante pour analyse par HPLC, à l'exception de l'acétonitrile qui était MS grade. Le deoxynivalenol a été acheté chez Sigma (Sigma Aldrich, Ayshire, Royaume Uni).

Préparation de l'extrait de culture de F. graminearum La souche INRA 159 en provenance de l'unité MYCSA de l'INRA de Bordeaux a été utilisée pour cette étude. Une culture de cette souche sur malt agar (20 g/L malt, 20 g/L agar) a servi pour ensemencer 50 g de grains de blé (Triticum aestivum), préalablement humidifiés avec de l'eau distillée (a w > 0,98) et autoclavés pour éliminer toute trace de microorganismes. La culture a été étuvée à 25°C pendant 4 semaines pour permettre le développement de la moisissure ainsi que la production de métabolites secondaires puis séchée à 90°C pendant 6h. Elle a ensuite été broyée (Waring blender, Stamford, USA) puis tamisée sur un tamis commercial avec une taille de maille de 30 µm. La concentration mycotoxique a été évaluée par le laboratoire LDA 22 (Laboratoire de Développement et d'Analyses, Ploufragan, France). Les résultats sont indiqués dans le tableau cidessous. Analyse des métabolites dans l'extrait de culture de F. graminearum L'extrait de culture de F. graminearum a été analysé par spectrométrie de masse comme décrit précédemment (Cano et al., 2013a). Brièvement, les métabolites secondaires ont été extraits avec 200 ml de chloroforme sur une table d'agitation IKA Labortechnik HS501 (Janke & Hunkel, Imlab, Lille, France) à température ambiante pendant 36 h. L'échantillon a ensuite été filtré, évaporé, repris dans 400 µL de méthanol puis filtré de nouveau avec un filtre Whatman de 0.45 µm (Whatman, GE Healthcare, Kent, UK). Les métabolites présents dans cet extrait ont été analysés par chromatographie liquide de haute performance (HPLC) couplée à un spectromètre de masse hybride de haute résolution LTQ-Orbitrap XL (HRMS) (Thermo Fisher Scientific, Les Ulis, France) avec ionization par electrospray (ESI) en modes positif et négatif. Une colonne reversed phase Luna C18 5 µm (150*2.0 mm) a été utilisée pour la séparation chromatographique (Phenomenex, Torrance, CA, USA). Une solution de 0.1% en acide formique a été utilisée comme phase mobile A et de l'acétonitrile comme phase mobile B. L'élution a été réalisée à un débit de 0,2 ml/min et a commencé par un gradient linéaire allant de 20 à 30% de phase B en 30 min. Ensuite le pourcentage de B a été augmenté à 90% en 5 min et a été maintenu à ce pourcentage pendant 10 min. Le gradient a ensuite été ramené aux valeurs initiales en 5 min et maintenu pendant 10 min. Les conditions d'ESI ont été les suivantes : spray voltage +4,5 kV, température du capillaire 350°C, debit du sheath gas (N 2 ) 40 ua (unités arbitraires), débit du gaz auxiliaire (N 2 ) 6 ua en mode positif et spray voltage -3,7 kV, température du capillaire 350°C, débit du sheath gas (N 2 ) 30 ua, débit du gaz auxiliaire (N 2 ) 10 ua en mode négatif. La résolution d'analyse a été fixée à 60000 pour un spectre de rapport masse/charge (m/z) allant de 50 à 800.

Préparation des solutions de gavage

En conditions d'élevage, l'exposition aux mycotoxines et plus particulièrement aux fusariotoxines se faisant essentiellement par voie orale, le gavage a été choisi comme mode d'exposition pour cette étude. Ce mode d'administration a de plus l'avantage de pouvoir contrôler de manière précise les doses ingérées. Il a été décidé d'exposer les animaux à une concentration de DON de 0,3 mg/kg de poids corporel (p.c.) (soit 0,3 mg/ml, en administrant 1 ml/kg p.c.) pour pouvoir observer des effets marqués au niveau des paramètres zootechniques et physiologiques, sans entraîner des symptômes cliniques [START_REF] Forsyth | Emetic and refusal activity of deoxynivalenol to swine[END_REF]. L'exposition a été réalisée en deux prises pour s'accorder à la prise alimentaire dans les conditions d'élevage et la concentration de DON dans les solutions était donc de 0,15 mg/ml. De plus, pour faciliter la prise des solutions de gavage, du sirop de cassis a été rajouté dans toutes les solutions (25% v/v). Trois solutions différentes ont donc été préparées : (1) une solution contrôle contenant de l'eau et du sirop de cassis, (2) une solution contenant 0,15 mg/ml de DON et (3) une solution « mélange » contenant de la poudre de culture de Fusarium comme décrit ci-dessus, avec un contenu en DON de 0,15 mg/ml.

Plan expérimental de la phase animale et prélèvement des échantillons (Figure II.10)

Toutes les procédures expérimentales ont été menées en accord avec les recommandations européennes en regard de l'utilisation des animaux à des fins de recherche (Directive 86/609/EEC).

Dix-huit porcelets mâles castrés (Pietrain/Duroc/Large-white) et sevrés à 28 jours ont été obtenus auprès d'un élevage local et ont été acclimatés pendant 12 jours avant le début de l'expérimentation. Les animaux ont été vaccinés après sevrage par l'éleveur avec Stellamune®Mycoplasma (Pfizer Animal Health s.a., Louvain-la-Neuve, France) qui est un vaccin courant en élevage contre Mycoplasma hyopneumoniae (Pfizer Animal Health, B-1348 Louvain La Neuve, Belgique). Trois lots de 6 porcelets homogènes au niveau du poids ont été formés dès leur arrivée. Après acclimatation, les animaux ont été gavés pendant 13 jours avec une des trois solutions décrites ci-dessus. Les animaux ont été hébergés en trois groupes séparés correspondants aux trois traitements expérimentaux. Les gavages ont eu lieu tous les jours deux fois par jour, matin et soir afin de s'approcher au mieux de la prise alimentaire dans les conditions d'élevage. Les gavages ont été réalisés à l'aide de seringues munies de tuyaux en PVC. Par ailleurs, pendant toute la durée de l'expérience, les porcelets ont eu libre accès à l'eau et ils ont été nourris ad libitum avec des granulés Beleccla pour porcelets de 1 er âge pendant la période d'acclimatation (Groupe CCPA, 35150 Janze), puis avec des granulés Stimiouti pour porcelets de 2 ème âge (Evialis France, 6006 Vannes CEDEX). Une surveillance hebdomadaire de la consommation d'aliment ainsi qu'une pesée des animaux en jours alternés a été réalisée au cours de l'expérience. Le volume administré de chaque solution a été adapté en fonction du poids des animaux pour respecter la dose d'exposition de 0,3 mg/kg de poids vif. A la fin de l'expérience, les animaux ont été mis à mort par électronarcose et exsanguination. Les poids de la rate et du foie ont été mesurés. De plus, des échantillons de jéjunum ont été directement congelés dans l'azote liquide puis stockés à -80°C avant extraction des ARNs pour analyses transcriptomiques.

Analyses de l'expression des gènes codants pour des cytokines

Les ARNs ont été extraits à partir des échantillons de jéjunum congelés à -80°C. Tout d'abord, les tissus ont été broyés au Fast-Prep-24 (MP Biomedicals, Ilkrich, France) dans des tubes de lyse adaptés (MP Biomedicals) contenant 0,5 ml d'Extract all® (Eurobio, Les Ulis, France). Les extractions ont ensuite été réalisées avec du phénol chloroforme. Les concentrations et qualités des ARNs ont été déterminées au spectromètre Nanodrop ND1000 (Labtech International, Paris, France). Les étapes de transcription inverse et de PCR semi-quantitative en temps réel (qPCR) ont été réalisées comme décrit précédemment [START_REF] Marin | Mycotoxins: Occurrence, toxicology, and exposure assessment[END_REF]. Des ARNs non-inversement transcrits ont été utilisés pour vérifier l'absence d'ADN génomique dans les échantillons. La spécificité des produits PCR a été contrôlée à la fin de la réaction par l'analyse de la courbe de dissociation. Le gène codant pour la peptidylprolyl isomerase A (cyclophiline A) a été utilisé comme gène de ménage pour normaliser les valeurs de fluorescence obtenues lors de la qPCR. Pour déterminer l'expression relative des gènes des différents groupes par rapport au groupe contrôle, la méthode ∆Ct a été utilisée.

Résultats

Analyse des métabolites secondaires présents dans l'extrait de culture de F. graminearum Avant de commencer les analyses concernant les effets d'une exposition à un mélange de métabolites secondaires produits pas F. graminearum dans le blé, il était important d'identifier les métabolites présents dans ce mélange. Pour cela, nous nous sommes basés sur des résultats obtenus précédemment lors de l'analyse par spectrométrie de masse de haute résolution de trois extraits de culture de F. graminearum sur du blé enrichi (1) 100% en 13 C, (2) 50% en 13 C/ 100% en 15 N ou (3) du blé non enrichi (voir article 2). Cette analyse a permis d'établir une liste de métabolites avec leurs masses et leurs formules exactes. Les métabolites compris dans cette liste ont ensuite été recherchés dans l'échantillon utilisé lors de l'expérimentation animale présentée dans cette étude. Le tableau II.2 montre les résultats obtenus lors de cette analyse. Vingt-quatre des nouveaux métabolites ont été identifiés lors de cette analyse dont les fusaristatines A, C et D en plus des fusariotoxines déjà connues comme le déoxynivalénol, les fusarines A et C, et la zéaralénone. ). La deuxième semaine, la consommation du groupe DON a été inférieure à celle du groupe contrôle de 12,7% (6,93 et 7,94 kg, respectivement) alors que celle du groupe exposé au mélange a été inférieure de 21% (6,27 kg) (Fig.

II.11A).

La différence de consommation d'aliment a eu des répercussions sur la prise de poids des animaux de chaque groupe (Fig. II.11B). Effectivement, malgré le fait que les groupes étaient homogènes d'un point de vue du poids au début de la phase expérimentale, on peut observer que les courbes de prise de poids du groupe DON ainsi que du groupe exposé au mélange sont inférieures à celle du groupe contrôle. Au 13 ème jour, la prise de poids moyenne des animaux du groupe DON était 5,6% inférieure à celle des animaux du groupe contrôle (20,13 ± 0,51 kg et 21,3 ± 0,29 kg, respectivement) alors que cette différence était de 18,3% pour les animaux exposés au mélange de toxines (17,4 ± 0,1 kg).

Il est important de préciser que des vomissements ont été observés dans le groupe exposé au mélange à partir du deuxième jour de gavage et dans le groupe exposé au DON une semaine après le début des gavages. Les vomissements sont généralement survenus juste après le gavage. Aucun vomissement n'a été observé dans le groupe contrôle. De plus, lors des abattages, les poids de la rate et du foie ont été mesurés. Pour les analyses, le poids des organes (en g) a été rapporté sur le poids de chaque animal (en kg). Aucune différence significative n'a été observée pour le poids de la rate entre les trois groupes : 2,07 ± 0,13 g/kg pour le groupe contrôle, 2,15 ± 0,08 g/kg pour le groupe DON et 2,39 ± 0,33 g/kg pour le groupe exposé au mélange (données non montrées). En revanche, le poids du foie était significativement plus important dans le groupe DON (32,98 ± 1,09 g/kg) et dans le groupe exposé au mélange (33,86 ± 0,85 g/kg) par rapport au groupe contrôle (29,81 ± 0,19 g/kg) (Fig. II.12). Il n'y avait cependant pas de différences significatives entre le groupe DON et le groupe exposé au mélange.

Effets sur l'expression des ARNs codants pour des cytokines

Suite à l'extraction des ARNs dans le tissu jéjunal, l'expression de différents gènes impliqués dans la réponse immunitaire intestinale a été analysée par RT-qPCR. L'exposition à 0,3 mg/kg p.c. de DON pendant 13 jours a conduit à l'induction de l'expression de cytokines pro-inflammatoires comme le TNF-α qui a été induit de façon significative 4,43 ± 1,01 fois par rapport au groupe contrôle (Fig.

Chemokines CX3CL1 > < < CCL20 > < < Signature Th1/Th2 IL-2 < < < IFN-γ < < < IL12-p40 > < < (*) T-bet > < < IL-4 < = > Signature Th17 IL-17A > < < (*) STAT-3 > < < ROR-γt = > > IL-6 > < > Signature Treg FoxP3 > = < RALDH-1 > > =

Cytokines

Discussion et conclusion

La contamination des denrées alimentaires par les moisissures et les métabolites qu'elles produisent est devenue un défi important pour les agences de sécurité alimentaire à travers le monde. Les fusariotoxines, et plus particulièrement le DON, sont fréquemment rencontrées dans les échantillons de céréales [START_REF] Streit | Current situation of mycotoxin contamination and cooccurrence in animal feed--focus on Europe[END_REF]. Dans le chapitre précédent, il a été mis en évidence qu'en plus des quelques mycotoxines connues produites par F. graminearum, cette moisissure est capable de produire une grande variété de métabolites secondaires qui n'avaient jamais été identifiés auparavant. C'est pourquoi, il est très probable que la co-exposition à ce mélange de métabolites soit fréquente et il est donc important d'en connaître la toxicité.

L'analyse par spectrométrie de masse d'un extrait de culture sur blé, utilisé lors de la phase animale de cette étude, a confirmé la présence de plus d'une vingtaine de ces nouveaux métabolites. Cependant, leur toxicité et surtout leurs interactions avec les fusariotoxines connues n'ont jamais été analysées. Seuls les effets de la fusaristatine A sur la prolifération des cellules pulmonaires ont été décrits jusqu'ici (Shiono et al., 2007). L'objectif de cette étude a donc été de comparer les effets d'une exposition aigüe au DON avec ceux d'une même exposition à un mélange de métabolites produits par F. graminearum dans le blé. Il existe certes de plus en plus d'études concernant le problème des multi-contaminations par différentes mycotoxines, mais la plupart de ces études traite uniquement le problème des aflatoxines en combinaison avec d'autres mycotoxines et peu d'entre elles abordent les co-contaminations par des fusariotoxines (Grenier and Oswald, 2011). Il était donc important de réaliser une étude analysant l'effet d'un mélange représentatif des toxines produites par F. graminearum.

Le gavage avec 0,3 mg DON/kg p.c. a eu des répercussions sur la consommation alimentaire des porcelets. D'autres études ont déjà montré une diminution de la prise alimentaire à des doses similaires, avec cependant une forte variabilité interindividuelle qui a aussi été constaté lors de cette étude [START_REF] Etienne | Biological and physiological effects of deoxynivalenol (DON) in the pig. Mycotoxins in farm animals[END_REF]. De même, une diminution de la prise de poids a aussi été décrite [START_REF] Etienne | Biological and physiological effects of deoxynivalenol (DON) in the pig. Mycotoxins in farm animals[END_REF]. Dans notre étude, la diminution de prise de poids a été moins importante que la diminution de consommation alimentaire. Ceci peut être expliqué car la prise de poids est non seulement affectée par la consommation alimentaire, mais aussi par d'autres facteurs tels que l'efficacité nutritionnelle de l'aliment [START_REF] Trail | Evaluation des risques liés à la présence de mycotoxines dans les chaînes alimentaires humaine et animale[END_REF]. Dans le groupe exposé au mélange de toxines, la diminution de la consommation alimentaire ainsi que celle de la prise de poids ont été plus marquées que dans le groupe exposé au DON, laissant envisager l'interaction de cette mycotoxine avec d'autres métabolites présents dans le mélange.

Quant à l'analyse du poids des organes, une augmentation significative du poids du foie a été mise en évidence dans les deux groupes par rapport au groupe contrôle, alors qu'aucun effet n'a pu être observé au niveau de la rate. Ces résultats sont en accord avec d'autres études qui ont montré une augmentation du poids du foie en présence de DON, probablement lié au syndrome du fatty liver, qui correspond à une accumulation trop importante de lipides [START_REF] Trail | Evaluation des risques liés à la présence de mycotoxines dans les chaînes alimentaires humaine et animale[END_REF].

Les fusariotoxines étant des contaminants alimentaires, l'intestin est donc un des premiers organes à entrer en contact avec ces mycotoxines. Et par conséquent, les cellules du système immunitaire intestinal sont aussi fortement affectées par la présence de ces métabolites. L'homéostasie intestinale repose sur l'interaction coordonnée des différents types cellulaires qui composent le système immunitaire intestinal comme les cellules épithéliales et les lymphocytes par l'intermédiaire de cytokines et de chemokines. Il a déjà été montré que de faibles doses de DON sont capables de perturber l'homéostasie intestinale en induisant la surexpression de gènes impliqués dans la réponse immunitaire et plus particulièrement, dans l'inflammation alors que de fortes doses de DON ont un effet contraire lié principalement à un phénomène d'apoptose des lymphocytes [START_REF] Pestka | Mechanisms of deoxynivalenol-induced gene expression and apoptosis[END_REF]. Dans notre étude, la dose utilisée n'a pas eu d'effets significatifs au niveau de l'expression des cytokines comme il était attendu, à l'exception de l'augmentation significative de TNF-α. Cependant, une tendance générale à augmenter l'expression des gènes a pu être mise en évidence. Inversement, l'exposition au mélange de mycotoxines a diminué l'expression des cytokines par rapport au groupe contrôle. Cette tendance était d'autant plus marquée lorsque le groupe exposé au mélange était statistiquement comparé au groupe DON. Ces résultats soulignent de nouveau l'interaction du DON avec les métabolites présents dans le mélange, aboutissant à des effets différents dans le groupe exposé au DON seul.

Le manque de significativité des résultats peut s'expliquer tout d'abord, par un phénomène d'adaptation à la dose de DON et donc un retour à une situation d'équilibre entre la réponse inflammatoire et anti-inflammatoire. Ceci a déjà été observé dans d'autres études à des doses < 4mg /kg p.c. pendant 2 à 3 semaines et surtout chez des jeunes porcelets [START_REF] Etienne | Biological and physiological effects of deoxynivalenol (DON) in the pig. Mycotoxins in farm animals[END_REF]. De plus, dans la plupart des études, l'exposition au DON est réalisée non pas par gavage mais directement dans l'aliment, ce qui pourrait expliquer les différences constatées. Enfin, des vomissements ont été observés surtout pendant la première semaine de traitement. Le DON est bien connu en tant que vomitoxine, surtout chez des jeunes porcelets (5 à 15 kg) exposés à de fortes doses comme dans notre étude [START_REF] Etienne | Biological and physiological effects of deoxynivalenol (DON) in the pig. Mycotoxins in farm animals[END_REF]. Les vomissements ont donc probablement diminué la dose d'exposition des porcelets, ce qui pourrait aussi expliquer les faibles effets obtenus.

De façon générale et pour conclure, lors de cette étude il a clairement été mis en évidence que l'exposition à l'ensemble des métabolites produits par F. graminearum dans le blé a des effets plus prononcés ou même contraires aux effets induits par le DON seul. Ces résultats sont particulièrement intéressants car c'est la première fois qu'une approche globale de cocontamination, plus proche des conditions d'exposition réelles, a été prise en compte. Toutefois, certains aspects tels que la forme d'administration des toxines, la dose ou la durée de l'expérience devraient être pris en compte lors d'une prochaine expérimentation similaire. Il serait peut être judicieux pour voir des effets plus marqués de réaliser une exposition plus courte pour éviter les phénomènes d'adaptation ou une exposition plus longue à une plus faible dose pour analyser des effets chroniques. Par ailleurs, il serait aussi intéressant de pousser les analyses sur les nouveaux métabolites pour mieux comprendre les interactions avec le DON. Quoi qu'il en soit, cette étude offre de nouvelles perspectives quant à la toxicité des métabolites produits par F. graminearum et mène vers de nouveaux axes de recherche en mycotoxicologie plus globaux.

Discussion & Conclusions

III. Discussion et Conclusions

Dans le cadre de cette thèse, deux objectifs étaient visés. Tout d'abord, il apparaissait important de mieux caractériser le métabolome de F. graminearum, qui est l'une des espèces phytopathogènes les plus importantes en Europe et dans les régions tempérées du monde. En effet, jusqu'à présent seule une dizaine de métabolites secondaires produits par cette moisissure a été identifiée dont seul le DON est soumis à des réglementations. Pour cela, une méthode analytique non ciblée a été développée et validée sur le métabolome mieux connu d'une autre moisissure, A. fumigatus (article 1), avant d'être appliquée à l'étude du métabolome de F. graminearum (article 2). L'autre objectif de cette thèse était d'apporter des connaissances quant à la toxicité des métabolites secondaires produits par F. graminearum. D'une part, en étudiant les effets proinflammatoires du DON au niveau des différentes populations de lymphocytes et notamment les Th17 et les Tregs (article 3) et d'autre part, en comparant les effets induits par le DON et ceux induits par la totalité du métabolome de F. graminearum.

La discussion s'articulera essentiellement autour de ces deux objectifs. Cependant, une attention particulière sera tout d'abord portée sur la problématique des mycotoxines au sens large du terme. Cette mise en contexte permettra de mettre en évidence les obstacles qui peuvent être rencontrés dans ce domaine de recherche. A la fin de la discussion, les résultats obtenus en termes de toxicité seront mis en relation avec l'apparition de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin de façon à donner une vision plus large des enjeux de la problématique du sujet. De plus, il est important de préciser que certains points de discussion ont déjà été abordés lors de la rédaction des articles et ils ne seront pas repris dans cette partie.

Caractérisation du métabolome de F. graminearum f

1. Caractérisation du métabolome de F. graminearum

Infections fongiques et contamination par les mycotoxines

Distribution et occurrence des contaminations

Comme il a été présenté au cours de cette thèse, la présence de mycotoxines dans l'alimentation humaine et animale est une préoccupation qui prend de plus en plus d'ampleur en termes de risques pour la santé publique. La contamination des matières premières par les mycotoxines est directement liée à la présence de moisissures toxinogènes, appartenant principalement aux genres Aspergillus, Penicillium et Fusarium. La distribution mondiale des différentes espèces de ces trois genres dépend fortement de différents facteurs (Fig.

III.1) :

⎨ Conditions météorologiques et environnementales : l'humidité (a W ), la température, l'oxygène et la présence d'autres microorganismes sont des éléments clefs pour le développement des moisissures. Ainsi, chaque espèce a des conditions optimales de développement qui lui sont propres et qui déterminent en grande partie leur distribution géographique (Frisvad et al., 2007). La majorité des Aspergillus et des Penicillium, par exemple, sont capables de se développer à de hautes températures surpassant même les 37°C et à des valeurs d'a W faibles, ce qui explique que ce soit les genres prédominants dans les régions tropicales et sous-tropicales, et qu'ils se développent fréquemment pendant le stockage des matières premières. Les espèces de Fusarium, par contre, sont plus adaptées à de plus faibles températures et à des valeurs d'a W plus élevées, c'est pourquoi elles sont retrouvées dans les régions tempérées du globe, en champs sur la plante ou en début de stockage. Au sein du genre Fusarium, il existe aussi des différences entre les espèces. F. graminearum est généralement associé à un climat plus doux que d'autres espèces comme F. culmorum ou F. sporotrichoïdes, qui résistent à des températures plus froides (Pitt and Hocking, 2009).

⎨ Pratiques agricoles : Différentes techniques d'exploitation des terres sont mises en oeuvre dans le monde. Parmi ces techniques, certaines peuvent s'avérer bénéfiques contre les infections fongiques comme la rotation des cultures et le travail du sol alors que d'autres, comme l'agriculture intensive et l'utilisation de fertilisants riches en azote, peuvent faciliter la colonisation par les moisissures. Les choix réalisés par les agriculteurs impactent donc sur le développement des moisissures et affectent leur distribution mondiale. Ainsi, ces dernières années, l'agriculture biologique, qui se caractérise essentiellement par l'absence d'usage de chimie et biologie de synthèse, a connu un grand essor dans les pays occidentaux. Cette méthode de production agricole présente l'avantage de préserver la biodiversité et l'équilibre environnemental, à l'inverse de l'agriculture industrielle. Cependant, l'absence d'utilisation de fongicides et d'insecticides peut favoriser le développement de moisissures et la contamination par des mycotoxines puisque les dommages ou plaies causées par certains insectes facilitent l'entrée des moisissures dans la plante.

⎨ Conditions de séchage, stockage et transformation des matières premières : Etant donné l'importance de l'humidité pour le développement des moisissures, de mauvaises conditions de séchage et de stockage peuvent augmenter le risque de contamination par des moisissures ainsi que le risque lié à la présence de mycotoxines. Par ailleurs, lors de la préparation des matières premières dans la chaîne de production alimentaire, les mycotoxines peuvent subir des transformations chimiques par la chaleur ou la présence d'autres microorganismes utilisés dans les chaînes de productions. Ces transformations ont généralement pour effet une diminution de la toxicité mais dans certains cas, il se peut que le résultat soit plus toxique que la molécule initiale. Cependant, il y a peu de données à ce sujet pour l'instant. De même, les mycotoxines masquées peuvent aussi se révéler problématiques puisqu'elles ne sont pas détectées lors de l'analyse des matières premières, mais aussi car elles peuvent être libérées de la matrice au cours de la production et par conséquent, devenir bio-accessibles pour les consommateurs.

Tous ces facteurs peuvent donc expliquer qu'il existe une distribution géographique de la contamination des matières premières par des moisissures toxinogènes. Cependant, de nos jours, l'augmentation toujours croissante des échanges commerciaux internationaux favorise le déplacement des denrées alimentaires et l'exposition aux mycotoxines ne répond donc plus à la même distribution que le développement des moisissures. Ceci est probablement le cas des aflatoxines retrouvées dans des aliments en Europe [START_REF] Schatzmayr | Global occurrence of mycotoxins in the food and feed chain: facts and figures[END_REF]. A ceci s'ajoutent des variations météorologiques annuelles qui peuvent aussi influencer le développement des moisissures. Il en est de même pour les conditions de séchage et de stockage des denrées agricoles. Les pratiques agricoles peuvent également favoriser ou limiter la contamination fongique en agissant sur la colonisation de la plante et sur la transmission à d'autres plantes. Le risque lié à la présence des mycotoxines est souvent sous-estimé à cause de différents facteurs : (1) manque de connaissances quant aux métabolites secondaires produits par les moisissures, (2) problèmes de détection des mycotoxines masquées (métabolisées par les plantes), (3) transformations subies par les matières agricoles dans la chaîne de production alimentaire qui peuvent augmenter ou diminuer la toxicité des métabolites secondaires, et (4) manque de connaissances quant à la toxicité de mélanges de différentes mycotoxines. Finalement, des différences de sensibilité inter-espèces et interindividuelles rentrent aussi en jeu dans l'évaluation des risques posés par les mycotoxines.

Contrôle des infections fongiques et de l'exposition aux mycotoxines

En tenant compte des facteurs cités dans le paragraphe précédent, différentes techniques ont été mises au point pour tenter de limiter le développement des moisissures toxinogènes ainsi que l'exposition aux mycotoxines. Dans les champs, il s'agit tout d'abord de réduire la capacité de réplication du phytopathogène dans la plante pour ainsi diminuer les risques de transmission à d'autres hôtes. A ce sujet, les conditions de culture intensives, où de vastes étendues de plantes de même nature sont cultivées à très forte densité, facilitent la transmission d'hôte à hôte du pathogène. Ceci a pour conséquence directe une spécialisation du pathogène ainsi qu'une augmentation de sa virulence [START_REF] Stukenbrock | The origins of plant pathogens in agro-ecosystems[END_REF]. C'est pourquoi de bonnes pratiques agricoles, moins intensives, avec un bon choix de variétés, travail du sol et rotation de cultures, peut limiter la spécialisation et la virulence des phytopathogènes. Cependant, la rotation des cultures peut perdre en efficacité dans le cas où deux types de cultures sensibles à une même moisissure se succèdent. Ceci s'applique par exemple dans le cas où le maïs aurait été la culture initiale. En effet, le maïs est très sensible aux espèces de Fusarium et il est donc fort probable que des résidus de ces moisissures perdurent dans le sol lors de la rotation des cultures, augmentant les risques de contamination pour les cultures suivantes surtout si elles sont aussi sensibles aux Fusarium [START_REF] Schatzmayr | Global occurrence of mycotoxins in the food and feed chain: facts and figures[END_REF].

Pour diminuer la capacité de réplication des moisissures au sein de la plante hôte, d'importantes avancées ont eu lieu dans le domaine de la sélection variétale. Dans le cas de la plupart des céréales, la résistance aux espèces de Fusarium est étroitement liée aux QTL (Quantitative Trait Locus) qui sont des séquences génétiques contrôlant l'aspect quantitatif de traits phénotypiques. Dans l'exemple de la résistance aux Fusarium, ces traits sont généralement en relation à des caractéristiques morphologiques comme la hauteur des plantes [START_REF] Schatzmayr | Global occurrence of mycotoxins in the food and feed chain: facts and figures[END_REF]. D'autres aspects comme la résistance aux insectes ont aussi démontré un impact positif sur la résistance aux moisissures. C'est le cas du maïs transgénique Bt, qui exprime les toxines insecticides produites par Bacillus thuringiensis, comme les delta-endotoxines. La protection contre l'attaque d'insectes empêche donc la formation de plaies et limite l'entrée des moisissures. Le maïs Bt a prouvé son efficacité dans la diminution d'aflatoxines et de fumonisines dans des exploitations agricoles aux Etats Unis [START_REF] Schatzmayr | Global occurrence of mycotoxins in the food and feed chain: facts and figures[END_REF]. Ce genre de méthodes soulève cependant des doutes et des préoccupations quant aux effets sur d'autres organismes non ciblés, le transfert de gènes entre champs transgéniques et champs non transgéniques et le développement de résistances des insectes. Le transfert de gènes associés à la métabolisation et détoxification des mycotoxines pourrait être une bonne alternative au transfert de gènes codants pour des toxines [START_REF] Jouany | Methods for preventing, decontaminating and minimizing the toxicity of mycotoxins in feeds[END_REF].

Le contrôle biologique est aussi une méthode efficace de lutte contre les contaminations fongiques. La compétition avec d'autres microorganismes peut avoir un effet antagoniste sur le développement de moisissures toxinogènes. Dans les cas des espèces de Fusarium, il a été prouvé que Bacillus subtilis inhibe considérablement le développement endophyte du champignon [START_REF] Jouany | Methods for preventing, decontaminating and minimizing the toxicity of mycotoxins in feeds[END_REF]. De même, l'introduction de souches non toxinogènes d'A. flavus dans des champs contaminés par des souches toxinogènes réduit significativement le contenu des plantes en aflatoxines [START_REF] Schatzmayr | Global occurrence of mycotoxins in the food and feed chain: facts and figures[END_REF]. Toutefois, il existe un risque de recombinaison des souches, entraînant la production d'aflatoxine chez les souches initialement non-aflatoxinogènes.

Néanmoins, toutes ces techniques ne sont pas suffisantes lors de contaminations extrêmes, généralement causées par de mauvaises prédictions météorologiques et une mauvaise anticipation des risques d'invasion fongique. Les modèles de prédiction et le monitoring permanent sont donc essentiels pour établir des stratégies préventives adaptées. Une mauvaise gestion des méthodes de prévention peut engendrer des taux élevés de mycotoxines dans la chaîne alimentaire et à ce stade, ces contaminants sont difficiles à éliminer des aliments [START_REF] Jouany | Methods for preventing, decontaminating and minimizing the toxicity of mycotoxins in feeds[END_REF][START_REF] Schatzmayr | Global occurrence of mycotoxins in the food and feed chain: facts and figures[END_REF].

Risques pour les consommateurs

A l'inverse d'autres contaminants alimentaires dont l'origine est liée à l'activité humaine (comme des polluants chimiques ou des additifs alimentaires à des doses toxiques), l'évaluation des risques posés par les contaminants d'origine naturelle (comme les mycotoxines) est plus difficile à réaliser à cause de différents facteurs détaillés ci-dessous (Fig. III.1). Il en résulte souvent une sousestimation de l'exposition réelle et d'insuffisantes mesures de protection des consommateurs.

⎨ Les multi-contaminations : Comme il a souvent été mis en avant au cours de cette thèse, les multi-contaminations sont plus la règle que l'exception en matière d'exposition aux mycotoxines [START_REF] Streit | Multi-Mycotoxin Screening Reveals the Occurrence of 139 Different Secondary Metabolites in Feed and Feed Ingredients[END_REF]. Non seulement parce qu'une même moisissure peut produire différentes mycotoxines mais aussi parce que différentes moisissures peuvent infecter un même produit et que notre alimentation est constituée d'une grande variété de produits pouvant être contaminés. Les effets de ces multi-contaminations sont pour l'instant mal connus et dans la plupart des cas, imprévisibles, ce qui complique l'évaluation des risques.

⎨ Les mycotoxines masquées : Les mycotoxines masquées, qui ne sont pas détectées lors des analyses de qualité des aliments, posent de gros problèmes de sous-estimation de l'exposition aux mycotoxines. En effet, la plante contaminée peut transformer les mycotoxines dans l'objectif de les rendre moins toxiques. Ces transformations sont essentiellement la conjugaison ou la liaison avec la matrice, ce qui rend généralement les mycotoxines indétectables par les techniques conventionnelles d'analyse des matières premières [START_REF] Berthiller | Masked mycotoxins: A review[END_REF].

⎨ Connaissances du métabolome : En se basant sur le nombre d'espèces fongiques recensées ainsi que sur les connaissances du génome de ces espèces, il apparaît évident que seul un faible pourcentage de l'ensemble des métabolites secondaires fongiques a été identifié jusqu'à présent. Ce manque d'informations génère un décalage entre le nombre de métabolites connus et donc étudiés et le nombre de métabolites auquel nous sommes réellement exposés.

⎨ Différences de sensibilité : Il existe de grandes différences de sensibilités inter-espèces mais aussi au sein d'une même espèce, comme des différences dues au sexe, à l'âge et à l'état de santé des individus. De même, dans certaines régions, certaines mycotoxines comme les aflatoxines, interagissent avec des maladies telles que le HIV, la malaria et le retard de croissance chez les enfants.

Ces dernières années, il y a eu une importante prise de conscience quant à l'importance de ces éléments pour une évaluation plus juste des risques posés par l'exposition aux mycotoxines. C'est pourquoi, dans cette thèse, il a été choisi d'aborder un de ces points, la connaissance du métabolome, pour mieux évaluer les risques liés à la contamination par F. graminearum.

Méthode d'analyse non ciblée pour caractériser le métabolome de F. graminearum

La détection de métabolites fongiques :

La détection de métabolites secondaires fongiques représente un défi pour les chercheurs lors de l'identification de nouveaux métabolites et pour les analystes évaluant la qualité des denrées alimentaires. Ceci est dû à l'hétérogénéité des échantillons qui contiennent généralement un large spectre de métabolites de natures très variées. En effet, comme il a déjà été souligné, les métabolites secondaires fongiques appartiennent à des familles chimiques aussi différentes que les cétones, les alcaloïdes, les peptides, les anthraquinones, les acides et les alcools. Il est donc difficile de mettre au point une méthode réellement applicable à l'ensemble des métabolites contenus dans un même échantillon. Les méthodes analytiques doivent alors efficacement combiner sensibilité, notamment lorsque les métabolites se trouvent sous forme de traces dans les échantillons, et spécificité, puisque les analyses sont généralement conduites dans des matrices biologiques complexes. En fonction des objectifs fixés, différentes méthodes mettent plus ou moins l'accent sur la sensibilité et la spécificité en faisant varier les paramètres d'extraction et de détection.

La majorité des méthodes ayant pour objectif l'identification de nouveaux métabolites utilisent des techniques de chromatographie couplées à la spectrométrie de masse. La chromatographie liquide est souvent préférée pour ce type d'analyses car elle peut s'appliquer à l'ensemble des molécules organiques quelle que soit leur taille et leur polarité, à la seule condition que les analytes soient solubles dans la phase mobile. Ceci n'est pas le cas pour la chromatographie en phase gazeuse qui requière la transformation des métabolites en forme gazeuse et s'adresse donc plutôt à des molécules de plus petite taille et de polarité plus réduite. Au niveau de la spectrométrie de masse, différentes possibilités d'ionisation sont aussi possibles dont l'électrospray (ESI), qui est la plus utilisée puisqu'elle s'adresse au plus large spectre de métabolites. Quant aux instruments utilisés pour la mesure des masses des ions, jusqu'à présent, la trappe à ions et le triple quadripôle étaient les plus utilisés. Cependant, la sensibilité de ces instruments pour des analyses non ciblées sur des échantillons complexes est limitée. C'est pourquoi, l'utilisation de nouveaux instruments à haute résolution comme l'orbitrap ou le TOF (Time-of-Flight) est de plus en plus courante dans ce genre d'études. L'orbitrap est plus employé pour sa haute résolution, sa grande précision mais aussi pour la haute sensibilité de détection des analytes par rapport au bruit de fond, ce qui évite la prépurification des échantillons [START_REF] Zachariasova | Novel approaches in analysis of Fusarium mycotoxins in cereals employing ultra performance liquid chromatography coupled with high resolution mass spectrometry[END_REF].

Malgré tout, les techniques d'HPLC-MS sont confrontées à plusieurs difficultés:

⎨ Adduits : La formation d'adduits, tels que [M+Na] + ou [M+NH4] + , est très courante lors de la formation des ions à l'entrée du spectromètre de masse. L'identification de ces adduits en tant que partie non intégrante des métabolites est essentielle pour déterminer la formule chimique exacte de ces molécules.

⎨ Formations de di-/trimères : De la même façon que des atomes de sodium peuvent venir se greffer aux métabolites, il se peut aussi qu'un même métabolite forme des dimères voire des trimères dans des cas plutôt rares. La formation de ces structures peut ainsi compliquer la détermination de la formule du métabolite simple.

⎨ Fragmentation : De part leurs structures chimiques, certains métabolites secondaires perdent facilement des molécules d'eau, HCOOH, CH 3 COOH ou CO 2 . Ces pertes modifient de nouveau la formule et la structure des métabolites, et empêchent leur caractérisation.

⎨ Problèmes d'ionisation : Dû à leurs propriétés chimiques, certains métabolites ionisent mal. A l'inverse du cas mentionné ci-dessus, ces métabolites fragmentent donc difficilement ce qui limite les informations disponibles pour l'élucidation de leur structure. Ceci a pu être observé lors de l'analyse de la fusaristatine D (article 2) dont la chaîne latérale n'a pu être caractérisée.

Ainsi, les modifications subies par les métabolites lors de leur entrée dans le spectromètre de masse doivent être adéquatement identifiées pour permettre la détermination des formules chimiques de ces métabolites. Certains de ces obstacles peuvent être surpassés par l'utilisation d'isotopes stables comme c'est le cas dans la méthode présentée dans cette thèse. Les avantages et les inconvénients de celle-ci sont discutés dans le paragraphe suivant.

Discussion sur la méthode

La méthode qui a été mise au point, validée puis utilisée pour analyser le métabolome de F. graminearum s'appuie sur la spectrométrie de masse de haute résolution qui permet d'obtenir les masses exactes des métabolites ainsi que leurs formules avec une marge d'erreur inférieure à 5 ppm. Cependant, il a récemment été démontré que même en diminuant l'erreur à moins de 1 ppm, des composés avec des masses moléculaires très proches peuvent contenir un nombre d'atomes de carbone très différent [START_REF] Kind | Metabolomic database annotations via query of elemental compositions: Mass accuracy is insufficient even at less than 1 ppm[END_REF]. En effet, il a été estimé qu'avec l'électrospray en mode positif 56,1% des formules peuvent être déterminées sans ambigüités et 36,4% seulement en mode négatif [START_REF] Nielsen | Dereplication of Microbial Natural Products by LC-DAD-TOFMS[END_REF]. Le marquage isotopique a donc été utilisé pour faire face à ces ambigüités de formule.

Une des seules limitations rencontrées avec cette méthode provient directement du fait que certaines molécules ionisent mal, comme il a été montré pour la fusaristatine D (article 2). Cependant, ce problème n'a pas empêché la détermination de la formule chimique de ce métabolite ; il n'a eu des répercussions que sur l'élucidation de la structure. Une autre limitation de la méthode provient de l'identification d'isomères, qui est compliquée en utilisant la spectrométrie de masse comme seule technique d'analyse. L'utilisation de la RMN est une solution possible pour faire face à ce problème, mais cela nécessite la purification préalable d'une quantité suffisante de produit.

En ce qui concerne la formation d'adduits, et plus précisément les adduits inorganiques comme le sodium, leur ajout au métabolite ionisé n'interfère pas dans la détermination des formules chimiques. En effet, ces adduits vont générer un décalage constant des valeurs de m/z dans les trois substrats ce qui ne modifiera pas les décalages induits par les carbones et/ou les azotes marqués qui servent à établir les formules. C'est aussi le cas d'ajouts de molécules organiques comme la dégradation de la tryptoquivaline F par le méthanol et l'insertion d'un groupement méthyle (article 1). L'ajout de ce carbone d'origine non biologique n'a pu être identifié que parce qu'il n'était pas marqué dans l'échantillon 100% 13 C. Cependant deux autres cas de figure peuvent être envisagés où le marquage isotopique ne serait pas suffisant pour identifier la formule des métabolites fongiques. C'est le cas où les métabolites seraient transformés dans les cellules végétales du substrat, ce qui pourrait incorporer des atomes de carbone et/ou d'azote marqués. La discrimination entre le métabolite produit par le champignon et la transformation induite par le blé ne serait alors pas possible. Cependant, ceci a été mis de côté lors de notre étude car les grains de blé n'étant plus sur la plante, il est possible d'admettre qu'ils ne possédaient plus aucune activité métabolique. L'autre possibilité, qui est plus problématique, est la transformation de métabolites du blé par le champignon. Le produit de cette dégradation ne pourrait pas être différencié des métabolites fongiques car il serait marqué comme ces derniers et serait absent de l'échantillon de blé seul. Ce point reste donc une faiblesse de la méthode à résoudre.

Par ailleurs, le fait de travailler avec des métabolites fongiques qui n'ont jamais été décrits auparavant présente d'autres inconvénients. D'une part, il n'est pas possible de purifier les échantillons pour séparer les métabolites de la matrice puisque les méthodes de purification ne peuvent cibler que des molécules connues. Ces méthodes sont pourtant très fréquentes lors de l'utilisation de matrices complexes, comme le blé, pour diminuer le bruit de fond et améliorer la sensibilité et la résolution du signal. De plus, l'absence de standards pour ces nouveaux métabolites ne permet pas de réaliser une analyse quantitative mais seulement qualitative des échantillons. Une analyse semi-quantitative, en exprimant les résultats en pourcentage par rapport à un métabolite connu, est tout de même possible. Toutefois, ceci n'est possible qu'avec un métabolite connu qui soit de la même famille que les métabolites inconnus à quantifier et qu'il ionise de la même façon. Finalement, étant donné la grande variété des nouveaux métabolites, l'analyse du métabolome est difficilement exhaustive. De plus, la production de certains métabolites nécessite un substrat particulier, ou encore, l'interaction avec l'hôte ou la présence d'un autre microorganisme. Par conséquent, la multiplication des conditions de cultures, des techniques d'extraction, de séparation et de détection pourrait permettre d'identifier encore de nouvelles molécules [START_REF] Bergmann | Activation of a silent fungal polyketide biosynthesis pathway through regulatory cross talk with a cryptic nonribosomal peptide synthetase gene cluster[END_REF][START_REF] Brakhage | Fungal secondary metabolites -strategies to activate silent gene clusters[END_REF][START_REF] Nützmann | Bacteria-induced natural product formation in the fungus Aspergillus nidulans requires Saga/Ada-mediated histone acetylation[END_REF].

Perspectives

L'avancée des travaux sur cette partie encourage à poursuivre la caractérisation du métabolome de F. graminearum sur deux aspects principaux. D'une part, il serait très intéressant d'analyser les métabolites secondaires qui sont produits par cette moisissure dans les champs. En effet, dans notre étude, F. graminearum s'est développé en saprophyte sur des grains isolés de la plante et dans des conditions de laboratoire. Cependant, il a été démontré qu'il existe une interaction entre la moisissure et son hôte au niveau de la production de métabolites secondaires (Kazan et al., 2011). Par exemple, il semblerait que la production de DON soit induite par les réponses de stress et de défense de la plante qui se traduisent par la production de certains métabolites comme des polyamines et l'acide coumarique. Il est donc fortement envisageable que lorsque F. graminearum se comporte en tant que phytopathogène dans les champs de blé, son profil de métabolites produits varie par rapport à une situation où il se conduit en saprophyte. Pour cela, il serait possible d'analyser la présence des nouveaux métabolites identifiés dans l'article 2 dans des grains de blé ayant été naturellement contaminés dans les champs. On pourrait donc réaliser une étude semi-ciblée sur ces échantillons (c'est-à-dire, une recherche de métabolites ciblée, mais absence de standards) et comparer la présence in planta des métabolites identifiés in vitro (Fig.

III.2A).

De plus, il est aussi possible que lorsqu'il agit en tant que phytopathogène, F. graminearum produise d'autres nouveaux métabolites qui pourraient agir en tant que facteurs de virulence pour coloniser l'hôte. Il serait donc intéressant de mettre au point une méthode pour pouvoir inoculer les épis de blé lors de la floraison dans les enceintes de marquage isotopique (Fig. III.2B). Le développement du champignon se ferait à l'intérieur des enceintes où F. graminearum se comporterait en tant que pathogène. Les métabolites qu'il produirait alors seraient marqués de la même façon que dans l'expérience in vitro. Les résultats obtenus apporteraient sans doute des nouvelles connaissances quant à la pathogénicité de F. graminearum sur le blé, et offriraient des nouvelles possibilités de lutte contre les infections par cette moisissure. Par ailleurs, l'analyse du métabolome de souches de F. graminearum ayant été mutées pour des gènes tels que Ve1, LaeA et Pac1 pourrait aussi apporter des informations complémentaires pour lutter contre cette moisissure. En effet, ces gènes régulent le métabolisme secondaire en réponse à des facteurs environnementaux comme la lumière dans le cas de Ve1 et LaeA et le pH du milieu pour Pac1 (Merhej et al., 2011b;Bayram and Braus, 2012). Des mutants Ve1 et Pac1 ont d'ailleurs été récemment développés (Merhej et al., 2011a;[START_REF] Merhej | The velvet gene, FgVe1, affects fungal development and positively regulates trichothecene biosynthesis and pathogenicity in Fusarium graminearum[END_REF]. Dans cette thèse, une analyse non ciblée des métabolites produits par F. graminearum sur des grains de blé enrichis en isotopes stables a permis d'établir une liste de 37 nouveaux métabolites produits par cette moisissure qui n'avaient jamais été décrits avant. Il serait maintenant intéressant d'essayer de déterminer si ces nouveaux métabolites sont aussi produits lorsque la moisissure se comporte en tant que phytopathogène, c'est-à-dire, lors de contamination dans les champs (A). De plus, il est aussi envisageable que F. graminearum ne produise pas les mêmes métabolites de façon saprophyte et pathogène. Ainsi, il serait intéressant d'identifier les métabolites produits uniquement en conditions pathogènes. Pour cela, il serait possible de contaminer les épis de blé dans les enceintes utilisées pour le marquage isotopique (B). Ces nouvelles expériences pourraient être réalisées dans le but de mieux caractériser la toxicité du métabolome de F. graminearum.

Analyse non ciblée des métabolites produits in vitro

sur grains de blé marqués F. graminearum, saprophyte

Liste de Nouveaux Métabolites

Analyse semi-ciblée sur grains contaminés in planta F. graminearum, pathogène

?

Analyse non ciblée sur épis marqués F. graminearum, pathogène

Liste de Nouveaux Métabolites

A.

B.

Analyse de la toxicité D'autre part, suite à l'élaboration de la liste de nouveaux métabolites identifiés lors de l'expérience in vitro, il est apparu important de s'intéresser à leur toxicité. Une étude comparant l'effet du DON, qui est une des mycotoxines majeures produites par F. graminearum, avec celui de l'ensemble des métabolites a donc été réalisée. Les résultats obtenus lors de cette étude seront discutés dans la partie suivante. Cependant, une attention plus précise pourrait être portée sur certains des métabolites identifiés, comme par exemple les fusaristatines. En effet, les trois composés de cette famille ont été détectés systématiquement dans le métabolome de F. graminearum, même dans des études préliminaires d'analyse du métabolome de différentes souches sur différents milieux. Ces données suggèrent l'importance de ces métabolites, ce qui pourrait être confirmé dans les études in planta proposées dans le paragraphe précédent. De plus, il existe très peu de données sur la fusaristatine A et aucune sur les fusaristatines C et D. Une étude sur la fusaristatine A a montré que celle-ci pouvait avoir des effets inhibiteurs de la prolifération des cellules pulmonaires cancéreuses (Shiono et al., 2007). Si la toxicité des deux autres composés est similaire à celle de la fusaristatine A, leur présence pourrait supposer un risque important par inhalation de spores et notamment pour les agriculteurs fortement exposés au niveau des champs et du stockage des grains.

Discussion & Conclusions

Toxicité du métabolome de F. graminearum f

2. Toxicité du métabolome de F. graminearum

Discussion du protocole expérimental

Choix du modèle porcin

Le problème des mycotoxines est en premier lieu un problème agricole qui atteint l'homme à travers des matières premières contaminées comme les céréales ou les produits d'origine animale (Tableau III.1). Les animaux de rente sont donc naturellement fortement exposés à ces contaminants alimentaires et, plus particulièrement, le porc est une des espèces les plus sensibles au DON [START_REF] Marin | Mycotoxins: Occurrence, toxicology, and exposure assessment[END_REF]. Cette forte sensibilité s'explique du moins en partie par l'absence de rumen et se traduit par des seuils de teneurs maximales des aliments plus faibles que pour les autres espèces (Tableau III.2). Les porcelets ayant le système immunitaire et le système digestif moins développés sont particulièrement sensibles à cette mycotoxine.

Tableau III.1: Analyse des denrées agricoles de janvier à décembre 2012 et détermination des niveaux de contamination mondiales en DON (enquête réalisée par la société BIOMIN) (Biomin, 2012). Au total, 3920 échantillons ont été traités et évalués quant à la présence de DON. Les produits analysés étaient de natures diverses, comprenant des céréales (blé, maïs, orge et riz) et leurs co-produits (tourteaux de soja, gluten de maïs et drêches sèches de distillerie avec solubles (DDGS)), mais aussi des fourrages (paille et ensilage) et des produits finis. C'est pourquoi lors des phases d'expérimentation, le porc a été choisi comme modèle d'étude. L'élevage porcin est un secteur de l'industrie agro-alimentaire en plein essor qui constitue à lui seul 37% de la production mondiale de viande suivi des viandes de volailles et bovines (année 2008, source FAO). Il représente donc des intérêts économiques importants à l'échelle mondiale, d'où une grande attention est portée aux performances de ces animaux ainsi qu'aux qualités nutritionnelles de leur alimentation. En élevage, la ration des porcins est essentiellement composée de blé et de maïs, qui sont des céréales fortement sujettes aux infections par F. graminearum et le DON est donc facilement retrouvé dans l'alimentation porcine (Tableau III.3).

Tableau III.3 : Calculs de contamination en DON des rations pour les porcins (en mg/kg aliment) (AFSSA, 2009). Outre ces critères, le porc présente aussi un grand intérêt en tant que modèle de recherche étant donné ses similitudes avec l'homme. En effet, il existe de grandes ressemblances au niveau de la taille des organes et des caractéristiques physiologiques du système pulmonaire, cardiovasculaire, reproductif, immunologique et digestif ainsi que des enzymes de transformations hépatiques [START_REF] Miller | The pig as a model for human nutrition[END_REF][START_REF] Rothkotter | The pig as a model of developmental immunology[END_REF][START_REF] Guilloteau | Nutritional programming of gastrointestinal tract development. Is the pig a good model for man?[END_REF][START_REF] Verma | Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies[END_REF]. Plus précisément, en ce qui concerne les systèmes immunitaire et digestif qui ont fait l'objet de cette thèse, il existe plus d'homologies entre le porc et l'homme qu'entre l'homme et le rat ou la souris qui sont pourtant des modèles fréquemment utilisés en recherche [START_REF] Meurens | The pig: a model for human infectious diseases[END_REF]. Au niveau digestif, la structure des villosités épithéliales ainsi que la physiologie et le métabolisme intestinal sont très similaires entre le porc et l'homme [START_REF] Patterson | The Pig as an Experimental Model for Elucidating the Mechanisms Governing Dietary Influence on Mineral Absorption[END_REF]. Il existe de plus d'importantes homologies au niveau des séquences génomiques, ce qui permet de mettre au point et d'utiliser des outils de transcriptomique et de protéomique dérivés de banques de données humaines qui sont plus accessibles et développées.

Enfin, différentes techniques in vitro (modèle cellulaire IPEC-1), ex vivo (explants de jéjunum porcin) et in vivo (anses intestinales) ont été développées par notre équipe d'immunomycotoxicologie qui est donc spécialisée dans l'utilisation du modèle porcin.

Choix du modèle cellulaire

Des expérimentations in vitro ont été menées pour essayer de mieux comprendre le rôle des cellules épithéliales dans la modulation de la réponse immunitaire en présence de DON. En accord avec les autres expérimentations ex vivo et in vivo, ces travaux ont été réalisés sur des cellules épithéliales porcines, et plus précisément, sur les cellules IPEC-1. Ces cellules présentent l'intérêt d'être non transformées et donc plus proches des cellules in vivo. De plus, elles sont bien différenciées et permettent donc la discrimination entre le compartiment apical et le compartiment basolatéral, ce qui a permis à l'équipe de mener des études concluantes sur les effets du DON sur la perméabilité trans-épithéliale. De plus, les résultats sur les IPEC-1 en termes d'expression des gènes impliqués dans la production de cytokines sont en accord avec les profils obtenus ex vivo et in vivo.

Choix des doses, mode et durée d'exposition au DON

Dans la première étude sur l'immunotoxicité du DON (article 3), une dose non cytotoxique de 10 µM a été choisie pour toutes les expérimentations (in vitro, ex vivo et in vivo). Cette dose correspond à une concentration de 3 mg/kg d'aliment soit 3 ppm, en considérant qu'1 kg d'aliment est dilué dans 1 L de contenu intestinal et que la totalité de cette dose est absorbée par l'organisme. Ce choix de concentration de DON est basé sur des études précédentes réalisées au sein de l'équipe et qui ont démontré que ces concentrations n'étaient pas cytotoxiques [START_REF] Kolf-Clauw | Development of a pig jejunal explant culture for studying the gastrointestinal toxicity of the mycotoxin deoxynivalenol: Histopathological analysis[END_REF]Bracarense et al., 2012;Pinton et al., 2012) mais aussi sur des données de contamination naturelle des denrées alimentaires mondiales (Tableau III.1), des données d'exposition des porcins dans les élevages par leur alimentation (Tableau III.3) et les valeurs de teneurs maximales des aliments recommandées par la Commission Européenne (Tableau III.2). En ce qui concerne la voie d'exposition au DON, différents mode d'exposition ont été appliqués dans la première étude. Normalement, in vivo, les cellules épithéliales intestinales sont tout d'abord exposées à cette mycotoxine par voie apicale, mais un retour de la toxine par voie basolatérale n'est pas négligeable dû au passage trans-épithélial et au cycle entéro-hépatique. Ainsi, des études récentes ont mis en évidence des différences au niveau des effets générés par l'exposition au DON du système intestinal par voie apicale ou basolatérale [START_REF] Diesing | Vulnerability of Polarised Intestinal Porcine Epithelial Cells to Mycotoxin Deoxynivalenol Depends on the Route of Application[END_REF]. Les résultats de cette étude montrent que l'exposition basolatérale induit des dommages plus importants en termes d'intégrité de la barrière épithéliale et de fragmentation de l'ADN. Dans notre étude, les IPEC-1 ont été exposées par voie apicale uniquement et les explants par les deux voies de façon simultanée. Le modèle d'anses intestinales d'autre part, est celui qui se rapproche le plus de la situation réelle puisque l'exposition se fait aussi bien par voie apicale que par voie basolatérale, et surtout parce que le maintient de l'irrigation conserve aussi le retour par voie entéro-hépatique. Malgré ces différences, les résultats obtenus restent cohérents entre les trois modèles.

Dans la deuxième étude qui tentait de comparer les effets du DON in vivo avec les effets du mélange de fusariotoxines, les animaux ont été gavés avec 0,3 mg/kg de poids corporel. Cette dose équivaut à une concentration de 6,6 mg/kg d'aliment en considérant que le poids moyen des porcelets était de 15.5 kg et que la consommation alimentaire était de 700 mg par jour. En exposant les animaux à cette forte dose pendant près de deux semaines, des effets marqués étaient attendus au niveau des performances animales et du système immunitaire. Cependant peu de résultats significatifs ont été obtenus lors de cette étude, ce qui pourrait suggérer un phénomène d'adaptation à ces fortes doses. De plus, le gavage, qui a été choisi comme mode d'exposition des porcelets, a aussi pu interférer dans les résultats. Par rapport à l'exposition par alimentation ad libitum avec des régimes contaminés, le gavage présente l'avantage que tous les animaux reçoivent la même dose de mycotoxine. Malgré cela, ces conditions d'intoxication reflètent moins bien celles des élevages et les problèmes de vomissements qui sont survenus dans certain cas suite au gavage ont sûrement augmenté la variabilité intra-groupe. Il est difficile de savoir si les vomissements ont été causés par la dose de DON ingérée ou par la technique de gavage. Cependant, en vu des résultats de profils d'expression des cytokines obtenus, il est possible que les conditions d'exposition au DON dans cette étude ne permettent pas de se placer dans des conditions d'intoxication aigue ni d'intoxication chronique, ce qui pourrait expliquer que des effets marqués n'aient pu être observés. Il serait donc intéressant de refaire cette expérience en administrant des doses plus faibles de DON, pour éviter les vomissements, mais en augmentant la durée d'exposition pour observer les effets causés par une exposition chronique. Une telle exposition serait plus fidèle aux situations d'intoxication dans les élevages et se rapprocherait plus aussi des conditions dans lesquelles l'humain est exposé aux mycotoxines.

Fusariotoxines et les systèmes de défense de l'organisme

Comme il a été décrit dans la première partie de l'introduction, la toxicité de la plupart des mycotoxines, comme le DON, repose sur l'inhibition de la synthèse protéique que ce soit au niveau de la transcription ou de la traduction des séquences nucléiques. C'est pourquoi, les cellules en prolifération ou différentiation, avec un taux de renouvellement protéique élevé, sont les cibles principales de ces contaminants alimentaires. De ce fait, les cellules de la muqueuse intestinale ainsi que les cellules du système immunitaire sont très sensibles à l'exposition aux mycotoxines. Au niveau cellulaire, cette exposition peut générer des perturbations du renouvellement cellulaire, de la perméabilité de l'épithélium intestinal ou de l'activation des cellules immunitaires ainsi qu'affecter la réponse au stress oxydatif. Tout ceci a pour conséquence directe des disfonctionnements de ces deux systèmes de défense de l'organisme et de façon indirecte, peut entraîner un accroissement important de la sensibilité à d'autres contaminants ou à des pathogènes ainsi qu'à des maladies chroniques.

Plus précisément, concernant les mycotoxines produites par F. graminearum, différentes études ont mis en évidence des effets délétères au niveau du système digestif et du système immunitaire, qui peuvent avoir des répercussions importantes au niveau des performances animales dans les filières de production (Tableau III.4). Cependant, comme il a été démontré le long de cette thèse, la production de métabolites secondaires produits par F. graminearum ne se limite pas aux 5 mycotoxines décrites dans le tableau III.4. C'est pourquoi, pour la dernière étude, la toxicité d'un mélange des nouveaux métabolites identifiés dans l'article 2 a été analysée. Comme il a déjà été souligné, les résultats obtenus à ce sujet ne permettent certes pas de conclure quant à la toxicité spécifique de ces métabolites, mais il est clair en tout cas que la toxicité du mélange diffère de celle du DON au niveau immunitaire. Ces résultats encouragent donc à poursuivre l'effort dans l'étude de la toxicité des nouveaux métabolites seuls ainsi que des effets des interactions de tous les métabolites présents dans le mélange. Le reste de la discussion sera essentiellement centré sur le travail sur les effets du DON seul dont les résultats sont plus concluants. Immunosuppression chez les volailles (poules pondeuses) [START_REF] Dvorska | Antioxidant systems of the developing quail embryo are compromised by mycotoxin aurofusarin[END_REF] ↓ Qualité des oeufs [START_REF] Dvorska | Antioxidant systems of the developing quail embryo are compromised by mycotoxin aurofusarin[END_REF] DON ↑ Perméabilité [START_REF] Pinton | The food contaminant deoxynivalenol, decreases intestinal barrier permeability and reduces claudin expression[END_REF] Dommages histologiques et morphologiques des villosités [START_REF] Maresca | The Mycotoxin Deoxynivalenol Affects Nutrient Absorption in Human Intestinal Epithelial Cells[END_REF]Bracarense et al., 2012) ↓ Goblet cells (Bracarense et al., 2012) Immunostimulation par activation des MAPK (faibles doses) [START_REF] Pestka | Deoxynivalenol-induced proinflammatory gene expression: mechanisms and pathological sequelae[END_REF] Immunosuppression par apoptose (fortes doses) [START_REF] Pestka | Mechanisms of deoxynivalenol-induced gene expression and apoptosis[END_REF] ↑ IgA [START_REF] Pestka | Effect of dietary administration of the trichothecene vomitoxin (deoxynivalenol) on IgA and IgG secretion by Peyer's patch and splenic lymphocytes[END_REF]) ↑ Th17 [START_REF] Marin | Mycotoxins: Occurrence, toxicology, and exposure assessment[END_REF] Propriétés émétiques et anorexigènes [START_REF] Forsyth | Emetic and refusal activity of deoxynivalenol to swine[END_REF]Rotter et al., 1996) ↓ Gain de poids [START_REF] Etienne | Biological and physiological effects of deoxynivalenol (DON) in the pig. Mycotoxins in farm animals[END_REF] ↓ Consommation alimentaire [START_REF] Etienne | Biological and physiological effects of deoxynivalenol (DON) in the pig. Mycotoxins in farm animals[END_REF] Fusarine C

Cancer de l'oesophage chez l'homme [START_REF] Gelderblom | Investigations on the carcinogenicity of fusarin C--a mutagenic metabolite of Fusarium moniliforme[END_REF]

Effets sur la barrière intestinale

Comme décrit précédemment, la fonction principale de la barrière intestinale est l'absorption des nutriments. Cependant, elle constitue de même l'organe immunitaire le plus important de l'organisme. Sa fonction immunitaire est organisée autour de trois axes :

⎨ La flore intestinale : une très grande diversité bactérienne colonise les parois du système digestif et constitue la première barrière de défense.

⎨ La muqueuse intestinale : cette muqueuse constitue la surface principale d'échange avec l'environnement extérieur. Elle contrôle de façon sélective le passage des nutriments en empêchant la translocation bactérienne et le passage de toxines et pathogènes. Au niveau de la surface apicale de la muqueuse, les cellules épithéliales intestinales jouent un rôle important dans l'immunité innée.

⎨ Le système immunitaire intestinal : il est essentiel pour le maintien de l'homéostasie intestinale par tolérance des bactéries commensales et pour la défense de l'organisme face aux intrus indésirables. Le GALT (Gut-Associated Lympoid Tissue) rassemble à lui seul plus de 70% des cellules immunitaires de l'organisme.

Malgré son importance majeure, le rôle de la barrière intestinale dans la protection de l'organisme contre les contaminants alimentaires comme les mycotoxines et le DON est peu documenté. C'est pourquoi, il semblait important de mieux connaître les effets immunomodulateurs du DON au niveau de l'intestin pour mieux comprendre les risques plus globaux liés à son ingestion.

Effets sur système immunitaire intestinal

Les cellules du système immunitaire sont particulièrement sensibles à l'exposition au DON de part leur taux de renouvellement élevé ainsi que par les processus de différentiation auxquels elles sont soumises. Parmi les cellules immunitaires, les monocytes, les macrophages, les lymphocytes mais aussi les cellules épithéliales sont des cibles privilégiées du DON.

Les mécanismes par lesquels le DON module le système immunitaire intestinal reposent, comme pour la plupart des mycotoxines, sur l'inhibition de la synthèse des protéines. Paradoxalement, cette toxine est capable d'induire une augmentation de la production de certaines cytokines. Cet effet sur le système immunitaire n'est pourtant pas lié à ses propriétés antigéniques puisque le DON est de trop petite taille pour être reconnu par les récepteurs des cellules immunitaires. La modulation de la réponse immunitaire s'explique plutôt par le stress ribotoxique engendré par la liaison avec la sous-unité 60S du ribosome et plus particulièrement avec l'un de ses constituants, l'ARN 28S. Ceci active différentes voies de signalisation des Mitogen-activated protein kinases (MAPK). Ces enzymes interviennent dans l'embryogénèse, la prolifération et la différentiation cellulaire et l'apoptose par activation de cascades de phosphorylation en réponse à des stimuli extracellulaires. Le DON active deux des principales voies des MAPK : ERK (extracellular-signalregulated) et p38 qui, à leur tour, induisent la production de Cox-2, qui est un agent inflammatoire produisant des prostaglandines. Ces perturbations des voies de signalisation expliquent les effets du DON sur divers processus physiologiques tels que la perméabilité intestinale, l'immunité ou encore l'apoptose [START_REF] Pestka | Mechanisms of deoxynivalenol-induced gene expression and apoptosis[END_REF][START_REF] Pinton | The food contaminant deoxynivalenol, decreases intestinal barrier permeability and reduces claudin expression[END_REF]. Toutefois, il est aussi possible d'envisager qu'en plus de l'effet sur les voies des MAPK, le DON active la réponse immunitaire de façon indirecte par les signaux émis par les cellules épithéliales endommagées par cette toxine au niveau de leur morphologie et des jonctions serrées (Pinton et al., 2012).

De manière générale, les résultats obtenus pendant l'étude sur l'immunotoxicité du DON ont montré une orientation progressive de la réponse immunitaire vers une réponse pro-inflammatoire principalement orchestrée par les lymphocytes Th17 pathogéniques et fortement liée aux Th17 régulateurs qui sont différenciés par la suite.

En mettant ces résultats en perspective, il serait maintenant intéressant d'aborder différents points : ⎨ Détermination de l'origine de certaines des cytokines analysées par marquage intracellulaire (comme l'IL-17 et l'IL-10) pour mieux comprendre les mécanismes qui se mettent en place en présence de DON et qui génèrent les réponses Th17 pathogénique et régulatrice.

Mycotoxines et inflammation chronique de l'intestin : rôle du DON

Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin ou IBD (inflammatory bowel diseases) appartiennent à un groupe de maladies chroniques et récurrentes dont l'étiologie est encore très mal connue mais qui proviennent de l'incapacité de l'organisme à maintenir l'homéostasie intestinale. Ce déséquilibre se traduit par l'inflammation excessive du système digestif en réponse à des composants de la microflore intestinale, principalement dû à des perturbations de la barrière épithéliale et de l'immunité innée et acquise. Récemment, différents facteurs ont été identifiés comme agents augmentant le risque de développement des IBD (Fig. III.3). D'un point de vue clinique, les patients atteints d'IBD présentent de fortes douleurs abdominales et des diarrhées récurrentes, altérant leur qualité de vie non seulement à cause de la douleur mais aussi de la forte fatigue qui en découle. La maladie de Crohn ou CD (Crohn's disease) est caractérisée par l'inflammation de la totalité de tractus digestif de façon discontinue et traversant la paroi intestinale. En revanche, la colite ulcérative ou UC (ulcerative colitis) est associée à l'inflammation continue de la partie terminale du tractus digestif (rectum, colon, caecum) et limitée à la muqueuse intestinale [START_REF] Matricon | Immunopathogenesis of inflammatory bowel disease[END_REF]. Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (IBD, Inflammatory Bowel Diseases) comme la maladie de Crohn (CD, Crohn's Disease) ou la colite ulcérative (UC, Ulcerative Colitis), sont caractérisées par le maintien d'une inflammation intestinale importante, suite à la perturbation de l'homéostasie intestinale. Il semblerait que l'apparition de ces maladies soit le résultat de l'interaction de différents facteurs de type environnemental, génétique et liés au microbiote. Au niveau environnemental, des conditions d'hygiène élevées, où le système immunitaire est faiblement exposé à des agents pathogènes, peut engendrer une mauvaise maturation de celui-ci et des réactions inflammatoires excessives lors d'expositions ultérieures. Le tabac et l'alimentation (effets des aliments sur le microbiote ainsi que dommages causés par les contaminants alimentaires) sont aussi des facteurs augmentant le risque d'apparition des IBD. Parmi les contaminants alimentaires, les mycotoxines ont récemment été identifiées comme possibles facteurs de risque, comme présenté dans la figure III.4. La prédisposition génétique est aussi très importante pour les IBD et explique la prévalence de ces maladies dans certaines familles et aussi, en partie, leur géolocalisation regroupée. Des mutations génétiques peuvent être responsables de la dérégulation de l'expression des gènes impliqués dans la réponse immunitaire. Par ailleurs, suite à l'augmentation de la translocation bactérienne, certaines bactéries pathogènes peuvent persévérer au sein de l'organisme, stimulant la réponse aux infections. De même, une dysbiose des bactéries commensales peut occasionner une diminution des populations dites protectrices et augmenter les populations dites pathogènes, responsables de l'inflammation intestinale.

IBD

Jusqu'à présent, seules les populations de lymphocytes Th1 (pour CD) et Th2 (pour UC) étaient tenues pour responsables du déclenchement des IBD. Cependant, il a récemment été mis en évidence que la population des Th17 joue un rôle majeur dans l'établissement de ces maladies [START_REF] Caprioli | Th17 immune response in IBD: A new pathogenic mechanism[END_REF]. Plus précisément, les cytokines qui sont produites par les Th17 comme l'IL-17, l'IL-21 ou l'IL-22, et l'IL-23 sont impliquées dans le maintien et la prolifération des Th17 et sont des acteurs centraux de l'inflammation intestinale liée aux IBD [START_REF] Caprioli | Th17 immune response in IBD: A new pathogenic mechanism[END_REF]. A ce sujet, il est intéressant de noter que dans l'étude sur l'immunotoxicité du DON (article 3), toutes ces cytokines étaient fortement surexprimées, ce qui suggère une corrélation entre l'exposition au DON et les IBD. De plus, dans cette étude, il a aussi été possible d'observer une augmentation significative de l'IL-6, qui est connue pour augmenter la production d'IgA. Ces immunoglobulines font partie des facteurs immunologiques liés à l'apparition des IBD et même si elles n'ont pas été dosées dans notre étude, il a déjà été démontré que leur concentration augmente en présence de DON [START_REF] Pestka | Effect of dietary administration of the trichothecene vomitoxin (deoxynivalenol) on IgA and IgG secretion by Peyer's patch and splenic lymphocytes[END_REF]. Cette observation conforte donc l'idée que l'exposition au DON puisse être mêlée aux IBD. Cette hypothèse a d'ailleurs déjà était proposée par Maresca et Fantini, qui en rassemblant toutes les données connues sur les effets de certaines mycotoxines sur l'intestin (aflatoxines, alkaloïdes de l'ergot, déoxynivalénol, fumonisines, ochratoxines, toxine T-2 et zéaralénone) se sont aperçus qu'il était en effet possible que ces contaminants alimentaires agissent en tant que facteurs d'induction ou de maintien des IBD (Maresca and Fantini, 2010). D'autres résultats obtenus lors de cette même étude renforcent cette hypothèse (Fig.

III.4).

En effet, il a été montré qu'en plus de leur rôle dans la mise en place de l'inflammation chronique, les cytokines jouent également un rôle dans la perturbation de la perméabilité des barrières épithéliales et hémato-encéphaliques, ce qui pourrait les rendre responsables en partie du déclenchement des IBD [START_REF] Capaldo | Cytokine regulation of tight junctions[END_REF]. Ainsi, le TNF-α, l'IFN-γ et les interleukines IL-1, IL-4 et IL-6 modifient la composition et la structure des protéines de jonction en altérant différentes voies de signalisation et sans induire la mort cellulaire [START_REF] Capaldo | Cytokine regulation of tight junctions[END_REF]. Notre équipe a récemment mis en évidence une diminution de l'expression de ces protéines de jonction et plus particulièrement de la claudine 4 en présence de DON dans des modèles in vitro sur les cellules IPEC-1 (Intestinal Porcine Epithelial Cell line) et Caco-2 (human colon carcinoma cell line), ainsi qu' ex vivo et in vivo sur des segments jéjunaux de porc (Pinton et al., 2012). Ces résultats ont été obtenus non seulement par analyse transcriptomique des gènes, mais aussi par mesure de la résistance électrique transépithéliale (TEER) et de la perméabilité paracellulaire (au passage de dextran et d'E. coli), ainsi que par immunofluorescence et immunoblot avec des anticorps spécifiques de la claudine 4. Au niveau moléculaire, ces phénomènes ont été expliqués par l'activation des MAPKs et plus précisément, de la voie de signalisation ERK1/2 [START_REF] Pinton | The food contaminant deoxynivalenol, decreases intestinal barrier permeability and reduces claudin expression[END_REF]. Cependant, au vu des profils d'expression de cytokines obtenus dans cette thèse lors de l'étude sur l'immunotoxicité du DON, il est possible que les effets de cette mycotoxine sur la perméabilité de la barrière intestinale soient aussi dus à l'augmentation de l'expression des cytokines. En effet, il a été possible d'observer une augmentation de TNF-α, IL-1α et IL-6 in-vitro et ex-vivo. En revanche, ces effets n'ont pas été observés lors de l'exposition au mélange de fusariotoxines, laissant présager des interactions entre les autres toxines et le DON. d'induire la production de cytokines pro-inflammatoires ainsi que de favoriser la réponse Th17 au détriment de la réponse T régulatrice. L'augmentation de la production d'IL-6 est suivie d'une augmentation de la production des IgA, qui jouent un rôle important dans l'immunité des muqueuses. D'autre part, l'activation des MAPKs engendre une diminution de l'expression des protéines de jonction, notamment de la claudine 4, ce qui entraîne une augmentation de la perméabilité de la barrière épithéliale ainsi qu'une augmentation de la translocation bactérienne. La perméabilité trans-épithéliale est, de plus, accrue par l'augmentation des cytokines pro-inflammatoires comme le TNF-α, l'IL-1 et l'IL-6. Par ailleurs, il existe une relation importante entre la présence de bactéries filamenteuses segmentées (SFB) dans la flore intestinale et le maintien des populations des lymphocytes pro-inflammatoires Th17. La mise en place et le maintien de la réponse inflammatoire, qui est suivi d'une augmentation des IgA ainsi que de l'augmentation de la perméabilité trans-épithéliale, qui est à son tour liée à l'augmentation de la translocation bactérienne sont tous des facteurs importants dans le développement de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. De façon indirecte le DON est donc possiblement un agent déterminant dans l'apparition de ces maladies.

Une des conséquences directes de la perturbation de la perméabilité de la barrière intestinale est l'augmentation du passage trans-épithélial de bactéries commensales et non-commensales. Il semblerait que la présence de ces bactéries agisse en tant que précurseur des IBD en activant le système immunitaire (Fig. III.4). Ainsi, deux hypothèses ont été suggérées pour expliquer cette relation cause à effet [START_REF] Matricon | Immunopathogenesis of inflammatory bowel disease[END_REF]:

⎨ Pathogénicité du microbiote : la possibilité que les IBD soient des maladies infectieuses a longtemps été débattue. L'analyse de la muqueuse intestinale de patients sujets aux IBD a révélé la présence de certaines bactéries potentiellement toxinogènes comme Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica and Mycobacterium avium paratuberculosis.

⎨ Dysbiose intestinale : la dysbiose consiste en un déséquilibre de la flore bactérienne intestinale entre les bactéries considérées comme protectrices et celles considérées comme pathogènes. Ce déséquilibre peut fortement perturber le système immunitaire intestinal quant à la tolérance ou non à ces bactéries. Par exemple, chez des individus atteints de CD, les populations de Faecalibacterium prausnitzii, qui sont connues pour leurs propriétés antiinflammatoires, sont pratiquement absentes alors que les E. coli pathogènes (Adherent-Invasive E. coli ou AIEC) sont prédominantes. De plus, il a été établi que la présence de bactéries filamenteuses segmentées ou SFB (segmented filamentous bacteria) dans la muqueuse intestinale favorise la différentiation et la prolifération des Th17. A l'inverse, ces lymphocytes facilitent l'adhérence de ces bactéries à la muqueuse [START_REF] Ivanov | Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria[END_REF]. Cette interaction entre bactéries commensales et cellules proinflammatoires s'ajoute donc à la liste de facteurs pouvant engendrer des IBD (Fig. III.4).

Conclusions

Les recherches bibliographiques et les expériences menées au cours de cette thèse mettent en évidence la richesse du métabolome secondaire des champignons filamenteux. Cette grande diversité de métabolites à structures hétéroclites est le résultat d'une grande variété de voies de biosynthèse. De plus, en tant que contaminants, ces métabolites sont susceptibles d'engendrer une aussi grande variété d'effets délétères chez l'homme, les animaux et les plantes. Ces métabolites toxiques ou mycotoxines sont répartis de façon inégale dans le monde, en fonction de paramètres environnementaux et météorologiques, mais également en fonction de différences des pratiques agricoles. Ceci conduit à une distribution inégale de ces contaminants dans la chaîne alimentaire, qui est cependant partiellement rétablie par les échanges commerciaux internationaux. Malgré cela, des différences de sensibilité interindividuelles conduisent à des effets plus conséquents sur la santé de certaines populations humaines et de certaines espèces animales. A ceci s'ajoutent des pertes économiques importantes dans les secteurs de la production agricole et animale, ce qui rend le problème des mycotoxines de plus en plus préoccupant aussi bien d'un point de vue économique que de santé publique. Cependant, il y a un manque important de connaissances quant à la biosynthèse, la production et la toxicité des mycotoxines, mais aussi, quant à la totalité des métabolites produits par les différentes moisissures susceptibles de contaminer les denrées alimentaires. Par conséquent, les stratégies de lutte contre la présence des mycotoxines et les mesures de protection des consommateurs sont souvent insuffisantes. C'est dans ce contexte là que s'inscrivent les travaux de cette thèse dont l'objectif principal a été de caractériser le métabolome de F. graminearum, un des pathogènes les plus importants des céréales.

Le développement d'instruments de spectrométrie de masse de haute résolution, comme l'orbitrap, s'est montré très utile pour la détection de nouveaux métabolites. Cependant, avec ces méthodes, la détermination de la formule chimique de ces composés n'est pas certaine. C'est pourquoi une méthode d'analyse a été mise au point en combinant la HPLC-HRMS avec des métabolites secondaires marqués avec des isotopes stables du carbone ( 13 C) et de l'azote ( 15 N). L'application de cette méthode non ciblée a permis d'identifier 37 nouveaux métabolites produits par F. graminearum. Ces résultats font part de la richesse encore méconnue du métabolome de cette moisissure et sont très encourageants quant à la poursuite de ce travail aussi bien dans l'exploration du métabolome que dans l'étude de la toxicité des métabolites déjà identifiés. En ce qui concerne la toxicité du métabolome de F. graminearum, il est possible de conclure que le mélange de métabolites génère des effets différents au DON seul d'un point de vue de la performance des animaux et du système immunitaire. Ces résultats suggèrent la présence d'autres métabolites biologiquement actifs et permettent de s'interroger sur les interactions qui ont lieu entre les différents métabolites présents dans ce mélange mais aussi sur la toxicité individuelle de chacun des métabolites. La caractérisation de la toxicité du métabolome de F. graminearum semble d'autant plus importante que d'autres résultats obtenus dans cette thèse ont mis en évidence une possible implication du DON dans les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin par l'intermédiaire des lymphocytes pro-inflammatoires Th17.

En définitive, les travaux réalisés le long de cette thèse offrent de nouvelles perspectives sur le métabolome de F. graminearum et de sa toxicité, et mènent vers de nouveaux défis de recherche. Ceci suggère que certaines des fusariotoxines présentes dans le mélange auraient des répercutions biologiques et donc que leur toxicité reste encore à être élucidée. De plus, l'importance de la caractérisation de la toxicité du métabolome de F. graminearum a été soulignée par les résultats obtenus dans une seconde étude, qui ont révélés une possible implication du DON dans les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin par l'intermédiaire des lymphocytes Th17.

Abstract

F. graminearum is one of the most predominant cereal pathogen in Europe and temperate regions of the world. It belongs to the genera Fusarium, which is one of the most important in terms of the production of secondary metabolites, among which stand several mycotoxins. However, recent advances on the study of its genome suggest that only a small fraction of the secondary metabolites produced by F. graminearum have been identified so far. Therefore, the main objective of this thesis was to characterize the metabolome of this fungus by identifying new metabolites and by analyzing their toxicity. First, an analytical method combining high resolution mass spectrometry and isotopically labeled secondary metabolites was developed. The method was validated with the well known metabolome of Aspergillus fumigatus before it was applied to F. graminearum. As a result, 37 new metabolites were identified such as fusaristatin A, C and D, which were detected for the first time in the metabolome of F. graminearum. Deoxynivalenol (DON) is one of the major mycotoxins produced by this fungus. Therefore, its toxicity was compared to that of a blend of fusariotoxins in vivo in a pig model. The results of this study showed different effects of the blend compared to DON alone on animal performances and immune response. This suggests that some of the fusariotoxins present in the blend could be biologically active and their toxicity should be further investigated. Toxicity of the metabolome of F. graminearum has also been highlighted by the results of a second study which showed a possible implication of DON on the appearance of inflammatory bowel diseases by the action of Th17 lymphocytes.

Mots clés :

Fusarium graminearum, métabolites secondaires, mycotoxines, spectrométrie de masse, isotopes stables, immunotoxicologie, inflammation, porc.

Discipline :

Toxicologie alimentaire et microbiologie

FiguresFIGFIGFIG

  Figures

FIG. 1 :

 1 FIG. 1: WORLDWIDE OCCURRENCE OF THE MAJOR MYCOTOXINS ............................................... FIG. 2: BIOCHEMICAL MECHANISMS OF ACTION OF MYCOTOXINS .............................................. FIG.3: OVERVIEW OF THE DIFFERENT BIOSYNTHETIC PATHWAYS INVOLVED IN MYCOTOXIN PRODUCTION ........................................................................................................................... FIG. 4: CHEMICAL STRUCTURES OF THE FOUR MOST OCCURRING AND NATURALLY PRESENT AFLATOXINS ................................................................................................................................. FIG. 5: BIOTRANSFORMATION AND MODES OF ACTION OF AFB1 ................................................. FIG. 6: CHEMICAL STRUCTURES OF THE MAIN FUMONISINS ......................................................... FIG. 7: MODES OF ACTION OF THE CARCINOGENIC FB1 .................................................................. FIG. 8: DIFFERENT HYPOTHESIS FOR OCHRATOXIN A ..................................................................... FIG. 9: BIOSYNTHESIS OF PATULIN .......................................................................................................... FIG. 10: BIOSYNTHESIS OF ZEARALENONES ......................................................................................... FIG. 11: MECHANISMS OF TOXICITY OF ZEARALENONE .................................................................. FIG: 12: BIOSYNTHESIS OF TRICHOTHECENES .................................................................................... FIG. 13: EFFECTS OF DEOXYNIVALENOL ............................................................................................... FIG. 14: ERGOT ALKALOIDS BIOSYNTHESIS: EXAMPLE OF ERGOTAMINE ................................ FIG. 15: BIOSYNTHESIS OF GLIOTOXIN ...................................................................................................

  Most frequent mycotoxins produced worldwide (non-exhaustive). .......................................... Table 2: Tailoring domains of non-ribosomal peptide synthases. ......................................................... Table 3: Enzymes involved in gliotoxin biosynthesis. ..........................................................................

Fig. 1 :Fig. 2 :

 12 Fig. 1: Worldwide occurrence of the major mycotoxins (Biomin 2012). Occurrence of the 5 major mycotoxins (aflatoxins, zearalenone, de oxynivalenol, f umonisins and oc hratoxin A ) were obt ained by a nalysis of 4, 023 s amples of food/feed commodities such as cereals, soybean and straw, coming from North and South America, Europe, Africa, Middle East, Asia and O ceania. The num ber of s amples a nalyzed for each mycotoxin i n e ach of t he r egions was different depending o n availabilities. Ho wever, for th e p urpose o f c larity, in th is figure, the re sults are e xpressed a s the p ercentage o f positive samples, independently of the total number of analyzed samples.

Fig. 4 :

 4 Fig. 4: Chemical structures of the four most occurring and naturally present aflatoxins: AFB1, AFB2, AFG1 and AFG2. AFB1 and AFB2 are characterized b y a c yclopentane E -ring () and b lue fluorescence u nder lo ng wave UV light whereas AFG1 and AFG2 contain a xanthone ring () instead and display green fluorescence. AFB2 and AFG2 differ from AFB1 and AFG1 in that their bisfuranyl ring () is saturated (). AFM1 and AFM2 are the major metabolites of AFB1 and AFB2, respectively and they are produced in the liver of exposed animals by hydroxylation () of the parent compounds. * Saturation of the Bisfuranyl Ring

Fig. 7 :

 7 Fig.7: Modes of action of the carcinogenic FB1. The mode of action by which FB1 is carcinogenic is not very well understood so far. Different mechanisms are possible: (A) induction of oxidative stress, related to the increase of reactive oxygen species (ROS) and the impairment of antioxidant defense mechanisms which results in lipid peroxidation and oxidative DNA damage and also (A) induction of apoptosis, which triggers the activation of defense mechanisms such as cell proliferation, possibly leading to tumorigenesis. Apoptosis can occur by (A) an increase of TNF-α, which initiates apoptosis through cell surface-mediated mechanisms, such as the caspase-3 pathway or (B) by the increase of pro-apoptotic shingoid bases (sphinganine, Sa and sphingosine, So) and the loss of complex sphingolipids (ceramide), which regulate cell adhesion. In order to counterbalance the apoptotic effects of Sa and So, cells induce the phosphorylation of these sphingoid bases by

Fig. 8 :

 8 Fig. 8: Different hypothesis for ochratoxin A (OTA) biosynthesis. (A) According to Huff and Hamilton, biosynthesis of OTA starts with the condensation of 1 acetyl-CoA and 4 malonyl-CoA by a PKS resulting in the formation of mellein, which is then oxidized into OTβ, before chlorination into OTα. Ligation of Otα with phenylalanine by the action of an NRPS leads to the production of OTC, which is finally transformed into OTA by the action of an esterase. (B) The biosynthetic pathway suggested by Gallo et al. differs from that of Huff and Hamilton after mellein production (divergent pathways are framed). Gallo et al. showed that OTβ is directly ligated to phenylalanine by an NRPS leading to OTB production, which is then chlorinated to form OTA. OTA can be further metabolized to give Otα or other metabolites by the fungi itself or by other microorganisms such as rumen microbiota.

Fig. 9 :

 9 Fig. 9: Biosynthesis of patulin. Biosynthesis of patulin consists of 10 steps, and out of the 15 genes involved in this pathway, only 4 have been fully characterized (PatK, PatI, PatH and PatN). The function of the other genes has been attributed putatively but has not been proved experimentally and thus, they are not represented in this figure. Patulin biosynthesis start with the formation of 6-methylsalicylic acid (6MSA) with a molecule of acetyl-CoA and 3 molecules of malonyl-CoA by the 6-methylsalicylic acid synthase (6MSAS ) which is encoded by the gene PatK. Decarboxylation of 6MSA results in the production of m-cresol. Cytochromes PatI and PatH lead to the formation of toluquinol and mhydroxybenzyl alcohol. Further oxydation of the alcohol group results in the formation of an aldehyde and dehydroxylation produces gentisaldehyde. PatN, which encodes for an isoepoxydon dehydrogenase (IDH) is involved in the final steps of patulin biosynthesis. It is still not clear whether the substrate leading to the final reactions is gentisaldehyde or gentisyl alcohol (dotted arrows). Adapted from (Artigot et al. 2009).

Fig. 10 :

 10 Fig.10: Biosynthesis of zearalenones. This biosynthetic pathway starts with the formation of the highly reduced hexatide chain with a single acetyl-CoA and 8 malonyl-CoA molecules by the action of ZEA2p, which is a highly reduced polyketide synthase encoded by the gene PKS4. Then, the polyketide chain can be partially reduced forming an alkene (), which will further lea d to ZE N or, the k eto groups can b e fully re duced forming a n a lkane ( ), leading to ZAN production. ZEA1p, which is a non-reduced resorcylic acid macrolactone megasynthase encoded by the gene PKS13, is in charge of the iterative elongation of the chain by the addition of unreduced ketones and is also in charge of the aromatic cyclization. Finally, ZEB1 is a p utative iso amyl alcohol oxidase th at oxydates α-ZEL and β-ZEL ( ) in to ZEN (), and α-ZAL and β-ZAL () in to ZAN (). Mammalian cells with 3α-and 3β-hydroxysteroid dehydrogenases (HSDs) are able to reduce ZEN back to α-ZEL and β-ZEL (in rats, ruminants, swine, turkeys, hens and probably humans too) and ZAN back to α-ZAL and β-ZAL (in cattle, sheeps, horses, goats and deers).

Fig: 12 :

 12 Fig: 12: Biosynthesis of Trichothecenes. The first step in the biosynthetic pathway consists on cyclization of farnesyl pyrophosphate (FPP) into trichodiene under the action of an enzyme encoded by Tri5. Then, 9 reactions orchestrated by Tri4, Tri101, Tri11 and Tri3 result in the production of calonectrin. From that point, the biosynthetic pathways of T-2 and NIV divert from that of DON. In T-2 and NIV biosynthetic pathways, calonectrin is tranformed by an acetyl transferase encoded by Tri7 and then by a CYP450 encoded by Tri13 into 3,4,15-triacetoxyscirpenol. This is followed by the action of speciesspecific genes FsTri1, FsTri16 and FsTri8 in F. sporotrichoides in order to produce T-2; and FgTr1, and FgTri8 in F. graminearum to produce nivalenol. FgTRI1 is also able to hydroxylate calonectrin directly to produce 3,15-

Fig. 14 :

 14 Fig. 14: Ergot alkaloids biosynthesis: example of ergotamine. Ergot alkaloids are formed by an ergoline ring assembled to an amid group. (A) The ergoline ring is formed by the condensation of a molecule of L-tryptophan with a molecule of 3.3dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) by the action of the enzyme dimethylallyltryptophane synthase (DMATs). The next step involves a methyltransferase which methylates the amino nitrogen of DMAT. Then, decarboxylation and closure of the ring C is performed by a chanoclavine-I cyclase. (B) Then, in the case of ergotamine, the D-lysergic acid is bound to a bicyclic cyclol-lactam structure (Alanine, Phenylalanine and Proline). The bicyclic cyclol-lactam structure is formed by the two subunits of the D-lysergic peptide synthase (LPS): LPS2 which contains the module for D-lysergic acid activation (Lsa)

Fig. 15 :

 15 Fig. 15: Biosynthesis of gliotoxin. This pathway has been suggested recently by Scharf et al. based on the knowledge on the gene cluster and the structure of gliotoxin[START_REF] Scharf | Biosynthesis and function of gliotoxin in Aspergillus fumigatus[END_REF]. The first step consists on the formation of diketopiperazine (DKP) by condensation of phenylalanine and serine by the action of the NRPS GliP. The next step involves hydroxylation of DKP into C-hydroxylated DKP by GliC. Then, GliG, which is a gluthatione-S-transferase, mediates the insertion of the sulphur atom from cysteine or sodium sulphate. Then GliT, a pyridine dinucleotide-dependent oxidoreductase, forms the internal disulfide bridge. Oxygen serves as a co-substrate for reduction and reoxydation and flavin adenine dinucleaotide (FAD) serves as a co-factor in the redox reactions. Steps marked with a question mark (?) are still unclear.

Fig

  Fig. I.1 : Cycle de reproduction chez F. graminearum (téléomorphe G. zeae) (d'après[START_REF] Ma | Fusarium Pathogenomics[END_REF]). F. graminearum se développe sous forme de mycélium haploïde. Pour sa reproduction, il existe deux formes de spores végétatives : (1) les macroconidies, qui sont produites par des agrégations de conidiophores, connus sous le nom de sporodochies et (2) les chlamydospores, qui sont des formes de résistance que l'on retrouve aussi bien au sein des macroconidies qu'au sein du mycélium. Chez G. zeae, la sporulation des ascospores fertilisées lors de la reproduction sexuée peut découler de la combinaison avec une autre souche (ascospore recombinée) ou alors, de façon homothallique, c'est-à-dire, par interaction de deux noyaux issus d'une même spore (ascospore clonée).

  Fig. I.2 : Cycle biologique de Fusarium graminearum sur céréales (d'après[START_REF] Trail | For blighted waves of grain: Fusarium graminearum in the postgenomics era[END_REF]).

  Conditions défavorables.Survie en mode saprophyte dans les débris, le semis d'automne, hôtes alternatifs et dans le sol, sous forme de chlamydospores ou perithècesHiverRécoltes contaminées: Infections des semences et retour de la moisissure dans le sol ou entrée dans la chaîne alimentaire.Infection primaire après la floraison par ascospores ou conidies au niveau des épis ou des racines Apparition de lésions de nécrosePrintempsColonisation et développement fongique intracellulaire avec apparition de symptômes au niveau des grains (fusariose de l'épi).

  et F. fujikoroi (Diaz-Sanchez et al., 2012) (Fig. I.3). Neuf

Fig

  Fig. I.3 : Biosynthèse de la fusarine C (d'après[START_REF] Song | Fusarin C Biosynthesis in Fusarium moniliforme and Fusarium venenatum[END_REF]).

Fig. I. 4 :

 4 Fig. I.4 : Biosynthèse de l'aurofusarine (d'après[START_REF] Frandsen | Two novel classes of enzymes are required for the biosynthesis of aurofusarin in Fusarium graminearum[END_REF]).

  II.1). Le principe de cette méthode se base sur : ⎨ Une phase stationnaire contenue dans une colonne qui présente une multitude de sites de fixation pour les molécules présentes dans l'échantillon (Fig. II.1c). ⎨ Une phase mobile qui entraîne les molécules à travers la colonne. Les différents composés vont migrer à des vitesses différentes en fonction de leurs affinités relatives pour chacune des phases, et c'est de cette façon qu'a lieu la séparation (Fig. II.1b). Chaque composé est donc caractérisé par son temps de rétention (TR) qui correspond au temps écoulé entre son injection dans la colonne et sa détection à la sortie de celle-ci (Fig. II.1d). Les résultats obtenus lors de l'analyse d'un mélange par chromatographie sont représentés sous forme de chromatogramme, courbe traduisant la variation du signal de détection au cours du temps (Fig.II.1e).Lors de l'analyse, la composition de la phase stationnaire peut être maintenue dans des conditions isocratiques (composition constante) lorsque l'on s'intéresse à un composé ou à une famille de composés ou alors, elle peut être modifiée sous forme de gradient pour des analyses visant un plus large spectre de molécules à caractéristiques physico-chimiques variées.

Fig. II. 1 :

 1 Fig. II.1 : Schéma de l'analyse d'un mélange par chromatographie. Un mélange contenant une variété de composés à détecter, quantifier ou identifier est injecté dans la colonne (a). La phase mobile entraîne les différents composés du mélange à travers la colonne (b) et ceux-ci vont migrer à des vitesses différentes en fonction de leurs affinités pour la phase stationnaire (c). Chaque composé est élué à un temps de rétention qui lui est caractéristique (d). Les résultats de cette analyse sont rassemblés sous forme de chromatogramme où l'axe des abscisses représente le temps, et l'axe des ordonnées correspond au signal de détection (e).

Fig. II. 2 :

 2 Fig. II.2 : Principe de fonctionnement d'un spectromètre de masse. L'échantillon peut être directement injecté dans le spectromètre mais dans le cas de mélanges, des techniques de séparation comme la CLPH sont généralement employées en amont. Après évaporation, les molécules sont ionisées pour pouvoir réagir face aux champs magnétiques à l'intérieur du spectromètre qui vont permettre leur déplacement, leur séparation et leur détection.

⎨

  Ionisation par électrospray (Electrospray ionisation, ESI en anglais) (Fig : II.3): l'ionisation sedéroule en phase liquide dans un capillaire métallique, puis un spray est formé à température ambiante à la sortie du capillaire, porté à un haut potentiel électrique. Le déplacement des gouttelettes chargées du spray est induit d'une part, par la différence de potentiel électrique et de pression entre le capillaire et l'entrée du spectromètre, et d'autre part, par l'énergie cinétique appliquée lors de l'injection. Durant le transfert, le solvant contenu dans les gouttelettes s'évapore petit à petit. La densité de charge des gouttelettes devient peu à peu trop importante et elles finissent par exploser (limite de Rayleigh). Des explosions en série ont alors lieu (chaîne d'explosion coulombienne) et les molécules de l'échantillon sont progressivement libérées sous forme d'ions. L'application d'un gaz (généralement du N 2 ) et l'augmentation de la température du capillaire de transfert peuvent a lieu dans la source, à l'entrée du spectromètre.Il existe différentes sources qui permettent l'ionisation en mode positif et négatif.Les ions sont focalisés et accélérés par des lentilles électroniques, ce qui accroît leur énergie cinétique et permet leur migration jusqu'à l'analyseur.Les ions sont séparés en fonction de leur rapport m/z.Les ions viennet frapper le capteur du détecteur qui émet un signal proportionnel aux rapports m/z. faciliter l'évaporation. Dans le cas de petites molécules organiques, comme les métabolites secondaires fongiques, l'ESI forme des espèces protonées [M+H] + ou déprotonées [M-H] -, selon le mode d'ionisation (positif ou négatif), c'est-à-dire la polarité du potentiel appliquée dans la source. Dans le cas de molécules avec une masse importante, des ions multichargés peuvent aussi se former, ce qui permet leur détection. De plus, des adduits, tels que les adduits sodium [M+Na] + peuvent également se former.

Fig. II. 3 :

 3 Fig. II.3 : Schéma de la source ESI et principe de ionisation par electrospray (Gates, 2004).

Fig. II. 4 :

 4 Fig. II.4 : Schéma de la source APCI et principe de l'ionisation chimique à pression atmosphérique (Gates, 2004).

Fig. II. 5 :

 5 Fig. II.5: Schéma du spectromètre de masse hybride LTQ-Orbitrap® (documentation: Thermo Fisher).

Fig. 1 :

 1 Fig. 1: Fusaristatin A production by F. graminearum: The PH-1 strain of F. graminearum was grown at 25°C during 1 month on: (A) natural wheat grains as well as on grains labeled with stable isotopes: (B) 96.8% 13 C and (C) 53.4% 13 C and 96.8% 15 N. Left-hand panels represent mass spectra obtained after HPLC-HRMS analyses in positive ESI mode at 40.4 min. Right hand panels represent MS 2 spectra of the m/z ratio of interest in each substrate. The mass shift between the 12 C sample (659.4371) and the 13 C sample (695.5571) was used to determine the number of atoms of carbon (36), and the mass shift between the 12 C sample and the 13 C15 N sample (681.4858) was used to determine the number of atoms of nitrogen (4). Then, combination of the three formula lists from the differently enriched substrates with Mass Compare led to the unambiguous determination of the formula (C 36 H 60 O 7 N 4 ). Identification of fusaristatin A was confirmed by comparison with standard (D).

Fig. 2 :

 2 Fig. 2: Structure elucidation of fusaristatin C. The new fusaristatin was detected at 40.6 min at m/z 661.4531 in the 12 C sample. An MS 2 experiment was performed to identify similarities and differences of fragmentation pattern between fusaristatin A (A) and fusaristatin C (B). As a result, and based on the structure of fusaristatin A (C), a structure for the new fusaristatin was postulated (D).

Fig. 3 :

 3 Fig. 3: Structure elucidation of fusaristatin D. Fusaristatin D was detected at 40 min at m/z 579.4080 in the 12 C sample. An MS2 experiment was performed (A) to identify similarities and differences of fragmentation pattern between fusaristatin A and fusaristatin D, further reflected in their structures (B and C, respectively). This comparison showed that the difference between these two metabolites was located on the side-chain. However, given the low reactivity of this chain, it was impossible to characterize the C 15 H 31 structure of fusaristatin D.

Fig. II. 6 :

 6 Fig. II.6 : Schéma des différentes tuniques de la paroi digestive.

Fig. II. 7 :

 7 Fig. II. 7 : Représentation de l'épithélium intestinal.

Fig. II. 8 :

 8 Fig. II.8 : Représentation de deux entérocytes et des protéines de jonctions.

Fig. II. 9 :

 9 Fig. II.9 : Mise en place de la réponse immunitaire intestinale[START_REF] Mowat | Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens[END_REF]. La reconnaissance de l'antigène peut avoir lieu au niveau des cellules M dans l'épithélium associé au follicule (a) mais aussi au niveau des cellules épithéliales (réponse locale généralement) (e). Ensuite, les CD vont présenter l'antigène aux lymphocytes naïfs directement dans les plaques de Peyer (b) ou après migration (c), dans les ganglions mésentériques (d). Dans les deux cas, les lymphocytes différenciés rejoignent la circulation systémique (g) avant de regagner les muqueuses intestinales. Il est aussi possible que les antigènes accèdent directement à la circulation sanguine (h) et induisent la différentiation des lymphocytes dans les organes lymphoïdes périphériques (i).

Fig. II. 10 :

 10 Fig. II.10 : Plan expérimental de l'étude in vivo des effets du métabolome de F. graminearum.

  Analyse de la consommation d'aliment, de la prise de poids et du poids des organesLes données zootechniques ont été observées tout le long de la phase expérimentale de cette étude (Fig. II.11). La consommation d'aliment a été mesurée de façon hebdomadaire pour chaque groupe d'animaux et la valeur obtenue (en kg) a ensuite été rapportée aux nombres d'animaux dans chaque groupe (c'est-à-dire 6). Il est possible d'observer qu'après une semaine de traitement, la consommation d'aliment par animal était la même entre le groupe contrôle et le groupe DON (5,45 kg et 5,5 kg, respectivement) alors que le groupe exposé au mélange de toxines a consommé 5,5% en moins que le groupe contrôle (5,15 kg) (Fig. II.11A

Fig. II. 11 :

 11 Fig. II.11 : Consommation et prise de poids. Dix-huit porcelets mâles castrés ont été gavés pendant 13 jours avec une solution contrôle , une solution à 0,3 mg/kg p.c. de DON et une solution contenant un mélange de fusariotoxines dont 0,3 mg/kg p.c. de DON . La consommation d'aliment (A) est exprimée par kg d'aliment consommés par chaque animal au sein d'un même groupe expérimental pendant une semaine. Le poids des animaux (B) a été mesuré tous les deux jours. Les résultats sont exprimés sans écart type pour la consommation alimentaire, car celle-ci a été mesurée pour l'ensemble des animaux d'un même groupe de traitement. Les résultats de prise de poids sont exprimés en moyenne ± erreur type (SEM) pour 6 animaux.

Fig. II. 12 :

 12 Fig. II.12 : Poids des organes. Dix-huit porcelets mâles castrés ont été gavés pendant 13 jours avec une solution contrôle , une solution à 0,3 mg/kg p.c. de DON et une solution contenant un mélange de fusariotoxines dont 0,3 mg/kg p.c. de DON . Le poids du foie de chaque animal a été mesuré lors de la mise à mort. Il est exprimé en grammes d'organe par kg de poids vif. Les résultats sont exprimés en moyenne ± erreur type (SEM) pour 6 animaux. Le seuil de significativité a été fixé à p< 0,05. Les lettres (a, b) sont utilisées pour indiquer des différences significatives entre les résultats.

  II.13A). De même, mais de façon non significative, l'expression des ARNm codants pour l'IL-1α, une autre cytokine pro-inflammatoire, a été augmentée 1,6 ± 0,3 fois par rapport au contrôle (Fig. II.13B) et l'IL-17A, qui joue un rôle important dans le maintient de la réponse inflammatoire par la population de lymphocytes Th17, a été augmenté 1,46 ± 0,3 fois par rapport au contrôle (Fig. II.13C). Par ailleurs, l'exposition au mélange de fusariotoxines a induit des effets différents à ceux induits par le DON seul. Par rapport aux résultats obtenus pour le groupe DON, l'induction de la réponse pro-inflammatoire a été significativement diminuée 2,96 ±0,5 fois pour le TNF-α, 1,1 ±0,005 fois pour l'IL-1α et 1,01 ±0,1 fois pour l'IL-17A (Fig. II.13A, B et C, respectivement). Par rapport au groupe contrôle, seule l'expression des ARNm codants pour l'IL-1α a été diminuée de façon significative (Fig. II.13B).

Fig

  Fig. II.13 : Modulation de l'expression de cytokines par l'exposition au DON et au mélange de fusariotoxines. L'expression des cytokines a été mesuré par RT-qPCR après extraction des ARNs à partir de tissus du jéjunum de 18 porcelets mâles castrés exposés pendant 13 jours à une solution contrôle (eau+cassis) , une solution à 0,3 mg/kg p.c. de DON et une solution contenant un mélange de fusariotoxines dont 0,3 mg/kg p.c. de DON . Les résultats sont présentés en moyennes ± erreur type (SEM) et le seuil de significativité a été fixé à p< 0,05. Les lettres (a, b) sont utilisées pour indiquer des différences significatives entre les résultats.De même, d'autres analyses sur l'expression de cytokines ont été menées. Ces résultats sont présentés dans le tableau II.3. De façon générale, ces données mettent en avant la différence entre l'effet du traitement avec du DON seul et l'effet du traitement avec le mélange de fusariotoxines. En effet, alors que le DON induit une augmentation des gènes codants pour des marqueurs proinflammatoires comme l'IL-8, l'IL-23 et l'IL-22, le mélange a plus tendance à diminuer l'expression de ces gènes. En revanche, il apparaît qu'aussi bien le DON que le mélange augmentent l'expression du marqueur anti-inflammatoire RALDH-1, enzyme qui transforme la vitamine A en acide rétinoïque et qui favorise la différentiation des lymphocytes Treg. Cependant, ces résultats n'étant pas significatifs, il est difficile de pouvoir en tirer des conclusions.

Fig. III. 1 :

 1 Fig. III.1 :Problématique générale des mycotoxines dans la chaîne alimentaire. Différents facteurs influencent le développement des moisissures dans les matières agricoles. Tout d'abord chaque espèce possède des conditions climatiques (température et humidité) optimales pour son développement, ce qui explique en grande partie leur distribution géographique. A ceci s'ajoutent des variations météorologiques annuelles qui peuvent aussi influencer le développement des moisissures. Il en est de même pour les conditions de séchage et de stockage des denrées agricoles. Les pratiques agricoles peuvent également favoriser ou limiter la contamination fongique en agissant sur la colonisation de la plante et sur la transmission à d'autres plantes. Le risque lié à la présence des mycotoxines est souvent sous-estimé à cause de différents facteurs : (1) manque de connaissances quant aux métabolites secondaires produits par les moisissures, (2) problèmes de détection des mycotoxines masquées (métabolisées par les plantes), (3) transformations subies par les matières agricoles dans la chaîne de production alimentaire qui peuvent augmenter ou diminuer la toxicité des métabolites secondaires, et (4) manque de connaissances quant à la toxicité de mélanges de différentes mycotoxines. Finalement, des différences de sensibilité inter-espèces et interindividuelles rentrent aussi en jeu dans l'évaluation des risques posés par les mycotoxines.

Fig. III. 2 :

 2 Fig. III.2 :Perspectives de travail pour la continuation de la caractérisation du métabolome de F. graminearum. Dans cette thèse, une analyse non ciblée des métabolites produits par F. graminearum sur des grains de blé enrichis en isotopes stables a permis d'établir une liste de 37 nouveaux métabolites produits par cette moisissure qui n'avaient jamais été décrits avant. Il serait maintenant intéressant d'essayer de déterminer si ces nouveaux métabolites sont aussi produits lorsque la moisissure se comporte en tant que phytopathogène, c'est-à-dire, lors de contamination dans les champs (A). De plus, il est aussi envisageable que F. graminearum ne produise pas les mêmes métabolites de façon saprophyte et pathogène. Ainsi, il serait intéressant d'identifier les métabolites produits uniquement en conditions pathogènes. Pour cela, il serait possible de contaminer les épis de blé dans les enceintes utilisées pour le marquage isotopique (B). Ces nouvelles expériences pourraient être réalisées dans le but de mieux caractériser la toxicité du métabolome de F. graminearum.

Tableau III. 4 :

 4 Effets des mycotoxines produites par F. graminearum sur l'intestin et le système immunitaire.

⎨

  Co-culture de différentes populations cellulaires in vitro pour essayer de mieux comprendre les interactions qui ont lieu entre les cellules immunitaires en présence de DON et notamment, entre les cellules épithéliales et les cellules dendritiques d'une part, et d'autre part, entre les cellules dendritiques et les différentes populations de lymphocytes (Th17 et Treg particulièrement).

Fig. III. 3 :

 3 Fig. III.3: Facteurs augmentant le risque de développement des IBD.Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (IBD, Inflammatory Bowel Diseases) comme la maladie de Crohn (CD, Crohn's Disease) ou la colite ulcérative (UC, Ulcerative Colitis), sont caractérisées par le maintien d'une inflammation intestinale importante, suite à la perturbation de l'homéostasie intestinale. Il semblerait que l'apparition de ces maladies soit le résultat de l'interaction de différents facteurs de type environnemental, génétique et liés au microbiote. Au niveau environnemental, des conditions d'hygiène élevées, où le système immunitaire est faiblement exposé à des agents pathogènes, peut engendrer une mauvaise maturation de celui-ci et des réactions inflammatoires excessives lors d'expositions ultérieures. Le tabac et l'alimentation (effets des aliments sur le microbiote ainsi que dommages causés par les contaminants alimentaires) sont aussi des facteurs augmentant le risque d'apparition des IBD. Parmi les contaminants alimentaires, les mycotoxines ont récemment été identifiées comme possibles facteurs de risque, comme présenté dans la figure III.4. La prédisposition génétique est aussi très importante pour les IBD et explique la prévalence de ces maladies dans certaines familles et aussi, en partie, leur géolocalisation regroupée. Des mutations génétiques peuvent être responsables de la dérégulation de l'expression des gènes impliqués dans la réponse immunitaire. Par ailleurs, suite à l'augmentation de la translocation bactérienne, certaines bactéries pathogènes peuvent persévérer au sein de l'organisme, stimulant la réponse aux infections. De même, une dysbiose des bactéries commensales peut occasionner une diminution des populations dites protectrices et augmenter les populations dites pathogènes, responsables de l'inflammation intestinale.

Fig. III. 4 :

 4 Fig. III.4: Possible rôle du déoxynivalénol dans l'apparition des maladies inflammatoires chroniques intestinales.Après ingestion, le DON entre en contact avec les cellules de la barrière intestinale et active différentes voies de signalisation des MAPKs comme ERK ½ et p38. Ceci a pour effet d'une part, d'induire la production de cytokines pro-inflammatoires ainsi que de favoriser la réponse Th17 au détriment de la réponse T régulatrice. L'augmentation de la production d'IL-6 est suivie d'une augmentation de la production des IgA, qui jouent un rôle important dans l'immunité des muqueuses. D'autre part, l'activation des MAPKs engendre une diminution de l'expression des protéines de jonction, notamment de la claudine 4, ce qui entraîne une augmentation de la perméabilité de la barrière épithéliale ainsi qu'une augmentation de la translocation bactérienne. La perméabilité trans-épithéliale est, de plus, accrue par l'augmentation des cytokines pro-inflammatoires comme le TNF-α, l'IL-1 et l'IL-6. Par ailleurs, il existe une relation importante entre la présence de bactéries filamenteuses segmentées (SFB) dans la flore intestinale et le maintien des populations des lymphocytes pro-inflammatoires Th17. La mise en place et le maintien de la réponse inflammatoire, qui est suivi d'une augmentation des IgA ainsi que de l'augmentation de la perméabilité trans-épithéliale, qui est à son tour liée à l'augmentation de la translocation bactérienne sont tous des facteurs importants dans le développement de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. De façon indirecte le DON est donc possiblement un agent déterminant dans l'apparition de ces maladies.

Table 1 : Most frequent mycotoxins produced worldwide (non-exhaustive).

 1

	Biosynthetic pathway	Mycotoxin	Producing fungal genera	Most Frequent Substrate	Most notorious effects	Regulation
	Polyketides	Aflatoxins	Aspergillus	Corn, Peanuts, Tree nuts	Carcinogenicity (group 1*) Hepatotoxicity	Yes
		Citrinin	Aspergillus Penicillium Monascus	Grains, Cheese	Hepatotoxicity, Nephrotoxicity	No
					Hepatotoxicity
		Fumonisins	Fusarium	Cereals (Maize)	Disruption of lipid metabolism
					Carcinogenicity (group 2B)

Table 2 : Tailoring domains of non-ribosomal peptide synthases.

 2

	Tailoring domain		Function
	Epimerization domain E	Transformation of L-amino acid into D-amino acid
	Dual/epimerization domain	E/C Epimerization and condensation

Reductase

R Reduction of final peptide Methylation MT N-methylation of the amide nitrogen Cyclization Cy Formation of heterocyclic rings Oxydation Ox Oxydation of thiazoline ring, formation of aromatic thiazol at the C-terminus of A-domain or downstream of the PCP domain Thioesterase domain TE Release of final peptide through cyclization or hydrolysis

Table 3 : Enzymes involved in gliotoxin biosynthesis.

 3

  These efforts to protect humans and livestock are not only lead by governmental agencies but also by intergovernmental agencies. Risk assessment is usually performed by intergovernmental agencies such as the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JEFCA) and the European Food Safety Authority (EFSA). Then, based on these evaluations, risk management is lead by governmental structures such as the European Commission. For instance, in Europe the Commission regulation 1881/2006 sets maximum levels in food for aflatoxins (B1+ B2+ G1+ G2), aflatoxin M1, DON, fumonisins (B1+ B2), OTA, patulin, T2, H-T2 and zearalenone. Other regulations have been implemented for animal feed such as the directive 2002/32/EC for AFB1 and rye ergots, the recommendation 2006/576/EC for DON, fumonisins (B1+ B2), OTA and zearalenone and the recommendation 2013/165/EU for T-2 and HT-2. Finally, the risks related to mycotoxins are different around the globe depending on the legislations that are applied in each country, the handling and storage conditions of food/feed commodities as well as the combination with other pathological conditions such as malnutrition, malaria and hepatitis[START_REF] Omar | Immunotoxicological risk of mycotoxins for domestic animals[END_REF].

Tableau I.2 : Comparaison des gènes PKS et NRPS chez F. graminearum, F. verticilloides, F. oxysporum et F. solani

  (d'après (Hansen et al., 2012)).

		F. graminearum F. verticilloides	F. oxysporum	F. solani
	Taille génome	36,7 Mb	41,7 Mb	59,9 Mb	54,4 Mb
	Nombre de PKS	15	16	14	13
	PKS spécifiques	9	4	2	7
	Nombre de NRPS	19	16	13	13
	NRPS spécifiques	9	3	0	4

Tableau I.4 : Recommandations de l'Agence Européenne pour la Sécurité Alimentaire (European Food Security Agency, EFSA) concernant les mycotoxines de F. graminearum.

	Mycotoxine	DJT par kg de poids corporel
	Déoxynivalénol	1 µg/kg/jour
	Nivalénol	0,7 µg/kg/jour
	Zéaralénone	0,2-0,5 µg/kg/jour
	Denrée		Mycotoxine	Valeur Maximale (µg/kg)
	Céréales brutes, autres que le blé dur, l'avoine et le maïs	Déoxynivalénol	1250
	Blé dur et avoine bruts		Déoxynivalénol	1750
	Maïs brut		Déoxynivalénol	1750
	Pain		Déoxynivalénol	500
	Pâtes		Déoxynivalénol	750
	Céréales brutes autres que le maïs		Zéaralénone	100
	Maïs brut		Zéaralénone	350

Tableau I.5 : Concentrations maximales autorisées pour les mycotoxines de F. graminearum dans les produits alimentaires dans l'Union Européenne (Règlement de la Commission Européenne 1881/2006, modifié par le règlement 1126/2007).

Table 1 : Metabolic footprinting of F. graminearum.

 1 RT corresponds to the retention time at which the three peaks associated to each molecule are detected. AB hits indicates the number of hits obtained in AntiBase for each molecule, in case there were several different adduct forms for one molecule, hits were grouped.

		Metabolite	Formula a	Ionization mode b	RT c (min)	Ion a	12 C m/z d	13 C m/z d	13 C/ 15 N m/z d	AB hits e
	Known Compounds	Aurofusarin	C30H19O12 C30H18O12Na	ESI + ESI +	32.2 32.2	[M+H]+ [M+Na]+	571.0866 -0.8 ppm 593.0681 -1.5 ppm	601.1877 -0.02 ppm 623.16843 -2.02 ppm	587.1389 -3.3 ppm 609.1202 -4.2 ppm
		Deoxynivalenol	C15H21O6	APCI +	12.7	[M+H]+	297.1332 -0.005 ppm	312.1834 -0.2 ppm	305.1292 -2.8 ppm
		Fusarin A	C23H29O6NNa	ESI +	32.2	[M+Na]+	438.1880 -1.5 ppm	461.2643 -3.4 ppm	451.2246 -3.02 ppm
		Fusarin C	C23H29O7NNa	ESI +	29.2	[M+Na]+	454.1832 -1.02 ppm	477.26086 0.6 ppm	467.2207 -0.5 ppm
		Zearalenone	C18H21O5	ESI -	31.9	[M-H]-	317.1409 2.4 ppm	335.2004 1.8 ppm	327.17363 1.9 ppm
	Newly identified		C36H59O7N4	ESI +	40.4	[M+H]+	659.4372 -0.99 ppm	695.5571 -2.1 ppm	681.4858 -0.7 ppm
	metabolites	Fusaristatin A	C36H58O7N4Na	ESI +	40.4	[M+Na]+	681.4189 -1.2 ppm	717.5384 -3 ppm	703.4662 -3.081 ppm
			C36H57O7N4	ESI -	40.4	[M-H]-	657.4244 1.8 ppm	693.5448 1.1 ppm	680.4753 0.2 ppm
			C36H61O7N4	ESI +	40.6	[M+H]+	661.4531 -0.5 ppm	697.5744 0.2 ppm	683.5009 -1.6 ppm
		Fusaristatin C	C36H60O7N4Na	ESI +	40.6	[M+Na]+	683.4347 -1 ppm	719.5555 -0.9 ppm	705.4822 -2.5 ppm
			C36H59O7N4	ESI -	40.6	[M-H]-	659.4398 1.3 ppm	695.5598 0.1 ppm	682.4909 0.2 ppm
		Fusaristatin D	C31H55O6N4 C31H53O6N4	ESI + ESI -	40 40	[M+H]+ [M-H]-	579.4080 -4.7 ppm 577.3970 -0.2 ppm	610.5126 -4.9 ppm 608.5002 -1.4 ppm	Not Detected 596.4346 -1.5 ppm
	Unknown metabolites		C30H52O8N6Na	ESI +	22.6	[M+Na]+	647.3736 -0.4 ppm	677.4737 -1.2 ppm	668.4039 -4.3 ppm
	ESI +		C18H30O4Na	ESI +	26.4	[M+Na]+	333.2028 -2.5 ppm	351.2635 -1.5 ppm	343.2359 -3.7 ppm
			C18H32O4Na	ESI +	37.6	[M+Na]+	335.2194 0.2 ppm	353.2791 -1.45 ppm	344.2485 -2.9 ppm
			C33H52O7N4Na	ESI +	37.6	[M+Na]+	639.3727 -0.2 ppm	672.4830 -0.9 ppm	661.4195 -2.7 ppm
			C29H52O6N4Na	ESI +	38.5	[M+Na]+	575.3770 -1.5 ppm	604.4740 -2 ppm	594.4134 -4.9 ppm
			C10H15O	ESI +	39.6	[M+H]+	151.1116 -0.7 ppm	161.1450 -2.1 ppm	156.1286 0.9 ppm
			C18H30O3Na	ESI +	39.5	[M+Na]+	317.2087 -0.02 ppm	335.2687 -1.3 ppm	326.2389 0.06 ppm
			C18H29O3Na2	ESI +	39.5	[M+2Na]+	339.1898 -2.5 ppm	357.2497 -3.7 ppm	349.2229 -3.5 ppm
			C18H29O2	ESI +	39.5 [M-H2O+H]+	277.2161 -0.4 ppm	295.27612 -1.4 ppm	287.2491 -2.2 ppm
			C25H37O2	ESI +	40	[M+H]+	369.2788 0.008 ppm	394.3616 -2.7 ppm	381.3172 -4.7 ppm
			C20H38O2N	ESI +	40.9	[M+H]+	324.2889 -2.6 ppm	344.3566 -0.6 ppm	336.3227 -2.8 ppm
			C20H37O2NNa	ESI +	40.9	[M+Na]+	346.2706 -2.9 ppm	366.3371 -4.9 ppm	358.3044 -3.4 ppm
			C38H64O7N4Na	ESI +	41.7	[M+Na]+	711.4660 -1 ppm	749.5926 -2.1 ppm	735.5198 -2.9 ppm
			C38H65O7N4	ESI +	41.7	[M+H]+	689.4834 -1.9 ppm	727.2105 -2.5 ppm	713.5386 -2 ppm
			C28H44O4Na	ESI +	41.7	[M+Na]+	467.3138 1.4 ppm	495.4069 -0.5 ppm	481.3586 -3.1 ppm

a Formula corresponds to the formula of the indicated ion obtained with Mass Compare. b Ionization mode indicates the measurement type the samples were derived from. c e

  .

		Formula	12 C m/z	AB hits	Putative metabolite	Producing Organism	Reference
	ESI +	C 18 H 30 O 4 Na 333.20279 2	Hygrophorone C12, Hygrophorone D12	Hygrophorus pustulatus (Basidiomycete)	Lübken, T. et al., Phytochemistry 65 (2004) 1061-71; Lübken, T. et al., J. Mass Spectrom. 41 (2006) 361-371
					(14RS)-(10E,12E)-14-Hydroxy-9-oxo-10,12-octadecadienoic acid	Pleurocybella porrigens	Amakura, Y. et al., Chem. Pharm. Bull. 54 (2006) 1213-1215
					Filoboletic acid; (9Z,11E)-
		C 18 H 32 O 4 Na 335.21936 4	8,13-dihydroxyoctadeca-9,11-	Filoboletus sp.	Simon, B. et al., Phytochemistry 36 (1994) 815-816
					dienoic acid
					Piliferolide C	Ophiostoma piliferum	Ayer, W.A. et al., Heterocycles 39 (1994) 561-9
						Hygrophorus	Lübken, T. et al., Phytochemistry 65 (2004) 1061-71;
					Hygrophorone A12	persoonii	Lübken, T. et al., J. Mass Spectrom. 41 (2006) 361-
						(Basidiomycete)	371
					6-Hydroxy-4-oxo-11-octadecenoic acid	Hygrophorus discoxanthus (Basidiomycete)	Gilardoni, G. et al., Nat. Prod. Comm. 1 (2006) 1079-1084
		C 18 H 30 O 3 Na 317.20871 6 Conocandin; A-32287	Hormococcus conorum

Banfi, L. et al., J. Org. Chem. 1987, 52, 5452-7

Toxicité du Métabolome de F. graminearum sur la Barrière Intestinale

	2.	Formula Formula Formula	12 C m/z 12 C m/z 12 C m/z	AB hits AB hits AB hits	Putative metabolite Putative metabolite Putative metabolite	Producing Organism Producing Organism Producing Organism	Reference Reference Reference
					Mer-NF-8054-X; 11-Oxo-18,22-cycloergosta-6,8(14)-diene-3beta,5beta,9beta-23S-tetraol 5'-Formyl-2'-hydroxy-4'-methoxy-(E,E)-sorbophenone; Ophiobolin-K 1-(5'-Formyl-2'-hydroxy-4'-methoxy)-2,4-hexadien-1-one Ophiobolin M	Emericella heterothallica, Aspergillus ustus Phaeoacremonium Aspergillus ustus sp. Cochliobolus heterostrophus	Singh, S. B. et al., Tetrahedron 47, 6931-8 1991 Turner II, 110; R. Mizuno et al., Chem. Pharm. Bull. 43 (1995) 9-11; Sakai, K. et al., J. Antibiot. 47 (1994) 591-594; T. Hosoe et al., Chem. Pharm. Bull. 46 (1998) 850-2 Reategui, R. F. et al., J. Nat. Prod. 69 (2006) 113-117 Anke, H. et al., Current Org. Chem. 1 (1997) 361-374
		3a,5beta,8beta,11beta-Diepidioxy-ergost-22E-en-12-one C 21 H 33 O 3 333.24171 4 Tintinnadiol Torachrysone Sorrentanone 6-Epiophiobolin M Dihydropyriculone 6-Epi-3-anhydroophiobolin B Variecolactone; EA-2	Trametes orientalis Mycena tintinnabulum Not specified Cochliobolus heterostrophus Penicillium chrysogenum Pyricularia oryzae Cochliobolus heterostrophus Emericella purpurea, (Basidiomycete) Emericella aurantio-	Chen, H.L. et al. J. Chin. Chem. Soc. (Taipei) 42 (1995) 97-100 Engler, M. et al., Phytochemistry. 49 (1998) 2591-3 Gill/Steglich, 121 (fo 278) Anke, H. et al., Current Org. Chem. 1 (1997) 361-374 Miller, R.F. et al., J. Antibiot. 48 (1995) 520-1 Shen, X.Y. et al., J. Nat. Prod. 62 (1999) 895-897 Nukina, M. Rec. Res. Devel. Agric. Biol. Chem. 2 (1998) 411-417 Takahashi, H. et al., J. Nat. Prod. 62 (1999) 1712-3; Fujimoto, H. et al., Chem. Pharm. Bull. 48 (2000)
					Demethylincisterol A3; O-	Agrocybe chaxingu brunnea	Kawagishi, H. et al., Heterocycles. 69 (2006) 253-1436-41
					Demethyl-17-methylincisterol Verticipyrone 4,4,14a-Trimethyl-3-oxo-5a-pregna-7,9(11)-diene-20(S)-carboxylic acid	(Basidiomycete) Verticillium sp. Cladosporium sp., Verticillium lecanii	258 Ui, H. et al., J. Antibiot. 59 (2006) 785-90 Grove, F.J. at al., J. Chem. Soc. I 1984, 1219-21
						Emericella purpurea,	Takahashi, H. et al., J. Nat. Prod. 62 (1999) 1712-3;
		Neosarcodonin O C 32 H 48 O 5 Na 535.33879 6 Ganoderic acid X Variecolactone; EA-2 4,4,14a-Trimethyl-3-oxo-5a-pregna-7,9(11)-diene-20(S)-2. Toxicité du Sarcodon scabrosus Ganoderma lucidum Emericella aurantio-brunnea Cladosporium sp., Verticillium lecanii carboxylic acid 3-O-Acetyl-16a-hydroxydehydrotrametenolic acid Poria cocos Dehydroeburicoic acid métabolome de F. Kamo, T. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 68 (2004) 1362-5 Toth, J.O. et al., J. Chem. Research (1983) 2722-2787; Fujimoto, H. et al., Chem. Pharm. Bull. 48 (2000) 1436-41 Grove, F.J. at al., J. Chem. Soc. I 1984, 1219-21 Tai, T. et al., Phytochem. 40 (1995) 225-231 Antrodia Yang, S.W. et al., Phytochem. 41 (1996) 1389-1392 cinnamomea Versisponic acid-B Laetiporus versisporus Yoshikawa, K. et al., Chem. Pharm. Bull. 48 (2000) 1418-21 graminearum sur la
		517-23 Shinohara, C. et al., J. Antibiot. 52 (1999) 171-4; Chikanishi, T. et al., J. Antibiot. 52 (1999) 797-802 Kawagishi, H. et al., J. Nat. Prod. 65 (2002) 1712-Kleinwaechter, P. et al., J. Nat. Prod. 64 (2001) 236-9 barrière intestinale 11-Keto-9(E),12(E)-octadecadienoic acid Trichoderma 9-Oxo-10,12-octadecadienoic acid Colossolactone-B Ganoderma colossum (Basidiomycete) Tyromycic acid C Tyromyces fissilis Quang, D. N. et al., J. Nat. Prod. 67 (2004) 148-151 (Basidiomycete) Clitocybe clavipes 1714 Hygrophorone F12 Hygrophorus persoonii (Basidiomycete) Lübken, T. et al., Phytochemistry 65 (2004) 1061-71; Lübken, T. et al., J. Mass Spectrom. 41 (2006) 361-371 C 30 H 45 O 2 437.34157 1 Ganoderal Ganoderma concinna, G. pfeifferi Gonzalez, A.G. et al., J. Nat. Prod. 65 (2002) 417-421 Gill,M., Nat. Prod. Rep. 16 (1999) 301-317; f
		13-Oxo-9(Z),11(E)-octadecadienoic acid C 28 H 40 O 4 Na 463.28185 2 Boligrevilol	Ripartites metrodii, R. tricholoma Suillus tridentinus	Weber, D. et al., Z. Naturf. 61C (2006) 663-669 Muehlbauer A. et al., Tetrahedron Lett. 39 (1998) 5167
	ESI -	C 25 H 37 O 2 369.27881 2 Variecolin; EA-1 2-Acetoxy-3-geranylgeranyl-1,4-dihydroxybenzene Variecolin C 18 H 21 O 6 333.13502 5 8'-Epihydroxy-zearalenone; F-5-4 C 28 H 44 O 4 Na 467.31382 4 Mer-NF-8054-A 8'-Hydroxy-zearalenone; F-5-3	Aspergillus variecolor; Emericella aurantio-brunnea Suillus granulatus Emericella aurantio-Gibberella zeae (fusarium graminearum) brunnea Aspergillus ustus Gibberella zeae (fusarium graminearum)	Hensens, O. et al., J. Org. Chem. (1991), 56, 3399; Hensens, O. et al., J. Org. Chem. 56 (1991) 3399-3403; C. Tringali et al., J. Nat. Prod. 52 (1989) 941-7 Fujimoto, H. et al., Chem. Pharm. Bull. 48 (2000) 1436-41 Fujimoto, H. et al., Tennen Yuki Kagobutsu Toronkai Koen Yoshishu 42 (2000) 481-6 Cole/Cox, 907 Sakai, K. et al., J. Antibiot. 47 (1994) 591-594; Sakamoto, M. et al., Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP (1994) 06 145,194 Cole/Cox, 907; Pohland, A.E. et al., Pure Appl. Chem., 54 (1982) 2219;
					3beta,5a,9a-Trihydroxy-(22E)-ergosta-7,22-diene-6-one 3'-Hydroxyzearalenone	Hericium erinaceum Fusarium roseum	Yaoita, Y. et al., Chem. Pharm. Bull. 50 (2002) 551-3 Turner II, 176
					5a,6a;8a,9a-Diepoxy-(22E,24R)-ergost-22-ene-3beta,7a-diol Dihydroepiheveadride Aigialomycin D	Amanita pantherina, Amanita fungus IFM 52672 virgineoides, Lactarius piperatus, Lyophyllum Aigialus parvus (marine fungus)	Hosoe, T. et al., J. Antibiot. 57 (2004) 573-8; Hosoe, T. et al., Heterocycles 63 (2004) 2581-2589 Yaoita, Y. et al., Chem. Pharm. Bull. 47 (1999) 847-851 Isaka, M. et al., J. Org. Chem. 67 (2002) 1561-6
		C 14 H 13 O 4 245.08254 7	5a,9a-Epidioxy-(22E)-ergosta-7,22-diene-3beta,6beta-diol 2,4,6,8,10,12-Tetradecahexaene-1,14-dioic acid; Corticrocin	Pleurotus eryngii Piloderma croceum (Corticium croceum)	Yaoita, Y. et al., Chem. Pharm. Bull. 50 (2002) 551-3 Gill/Steglich, 181 (fo 400); Rives-Arnau, V., Macromolecules, 18 (1985) 2088;
		C 28 H 42 O 5 Na 481.29269 3 Ergokonin B Tetrahydrocyperaquinone	Trichoderma koningii Not specified	Augustiniak, H. et al., Liebigs Ann. Chem. 4 (1991) 361-6 Thomson II, 165; Thomson III, 89
					Hibiscoquinone B	Not specified	Thomson III, 264

Tableau II.2 : Résultats de l'analyse des métabolites secondaires retrouvés dans l'extrait de culture de F. graminearum.

  La souche INRA 159 a été mise en culture pendant 1 mois sur du blé. La culture a ensuite été broyée et tamisée avant de réaliser l'extraction des métabolites secondaires au chloroforme. L'échantillon a été analysé d'après la méthode décrite précédemment (voir article 2).

		Métabolite	Formule	Forme d'adduit	m/z	12 C
			C 28 H 40 O 4 Na	[M+H]+	463.28185 -0.067 ppm
			C 30 H 45 O	[M+H]+	421.34664 0.350 ppm
			C 28 H 43 O 2	[M+H]+	411.32536 -0.965 ppm
			C 28 H 47 O 7 N 6	[M-H]-	579.35192 1.293 ppm
			C 27 H 45 O 7 N 6	[M-H]-	565.33607 0.971 ppm
			C 25 H 35 O 5	[M-H]-	415.24949 1.186 ppm
			C 18 H 31 O 4	[M-H]-	311.22318 1.276 ppm
			C 34 H 53 O 7 N 4	[M-H]-	629.39273 1.202 ppm
			C 25 H 35 O 4	[M-H]-	399.25467 1.471 ppm
			C 18 H 29 O 3	[M-H]-	293.21255 1.132 ppm
			C 18 H 31 O 3	[M-H]-	295.22827 1.361 ppm
		Métabolite	Formule	Forme d'adduit	m/z 12 C
	Métabolites connus	Fusarine C	C 23 H 29 O 7 NNa	[M+Na]+	454.18316 -1.02 ppm
		Fusarine A	C 23 H 29 O 6 NNa	[M+Na]+	438.18807 -1.46 ppm
		Zéaralénone	C 18 H 21 O 5	[M-H]-	317.14090 2.34 ppm
		Aurofusarine	C 30 H 19 O 12	[M+H]+	571.08663 -0.827 ppm
		Déoxynivalénol	C 15 H 21 O 6	[M+H]+	297,13326 -0,005 ppm
	Nouveaux métabolites identifiés	Fusaristatine A Fusaristatine C	C 36 H 59 O 7 N 4 C 36 H 61 O 7 N 4	[M+H]+ [M+H]+	659.43719 -0.965 ppm 661.45313 -0.524 ppm
		Fusaristatine D	C 31 H 53 O 6 N 4	[M-H]-	577.39697 -0.153 ppm
	Nouveaux métabolites inconnus		C 30 H 52 O 8 N 6 Na C 33 H 52 O 7 N 4 Na	[M+Na]+ [M+Na]+	647.37363 -0.392 ppm 639.37268 -0.221 ppm
			C 29 H 52 O 6 N 4 Na	[M+Na]+	575.37702 -1.541 ppm
			C 25 H 37 O 2	[M+H]+	369.27881 0.008 ppm
			C 20 H 38 O 2 N	[M+H]+	324.28886 -2.609 ppm
			C 28 H 44 O 4 Na	[M+Na]+	467.31382 1.367 ppm
			C 38 H 65 O 7 N 4	[M+H]+	689.48345 -1.924 ppm
			C 30 H 45 O 2	[M+H]+	437.34157 0.372 ppm

Production de mycotoxines Développement de la moisissure Pratiques Agricoles Conditions de séchage et de stockage Conditions Météorologiques Transformations Multi-Contaminations Mycotoxines Masquées Mycotoxines Inconnues

Afrique Amérique du Nord Amérique du Sud Asie Europe Moyen Orient Océanie

	Nombre d'échantillons testés	25	125	145	1797	1580	40	208
	Positifs (%)	68	37	21	67	67	43	45
	Moyenne des positifs (mg/kg) 0,326	2,827	0,379	1,369	0,742	0,121	0,312
	Maximum (mg/kg)	1,253	30,200	4,782	28,005 21,540	0,331	6,715
	Tableau III.2 :

Teneurs maximales (en mg de DON /kg d'aliment) recommandées par la Commission Européenne pour l'alimentation humaine et animale

	Alimentation

(réglementation 1881(réglementation /2006/CE)/CE)

.

Humaine Teneurs maximales (mg/kg) Alimentation Animale Teneurs maximales (mg/kg)

	Blé dur, avoine et maïs brut	1,75	Porcs	0,9
	Autres céréales	1,25	Volailles	5
			Ruminants :
	Céréales destinées à la consommation directe (farines, pâtes)	0,75	→ Adultes	5
			→ Jeunes	2
	Pain et produits de boulangerie	0,5	Bétail laitier, équidés, lapins	5
	Alimentation pour bébés et enfants en bas âge 0,2	Poissons	5

Caractérisation du métabolome de F. graminearum : détection et effets sur la barrière intestinale Cano P.M.

  Sous la direction de : Dr. Isabelle Oswald et Dr. Sylviane Dragacci Résumé F. graminearum est l'une des espèces prédominantes en tant que pathogène des céréales en Europe et dans les régions tempérées du monde. Cette moisissure appartient au genre Fusarium qui est l'un des genres qui produit le plus de métabolites secondaires, dont de nombreuses mycotoxines. Cependant, les connaissances sur son génome laissent présager que F. graminearum produit une très grande variété de métabolites qui sont encore inconnus. C'est pourquoi l'objectif de cette thèse a été de caractériser le métabolome de cette moisissure en identifiant de nouveaux métabolites ainsi qu'en étudiant leur toxicité. Pour cela, une méthode analytique combinant la spectrométrie de masse de haute résolution et le marquage des métabolites secondaires avec des isotopes stables a été développée. Celle-ci à tout d'abord était validée avec le métabolome bien connu d'Aspergillus fumigatus avant d'être appliquée au métabolome de F. graminearum. Cette méthode a permis d'identifier 37 nouveaux métabolites, dont les fusaristatines A, C et D qui on été détectées pour la première fois chez F. graminearum. Le deoxynivalenol (DON) est une mycotoxine majeure produite par F. graminearum, c'est pourquoi sa toxicité a été comparée in vivo sur un modèle porcin à celle d'un mélange de fusariotoxines. Les résultats de cette étude ont montré une toxicité bien différente du mélange par rapport au DON seul, que ce soit par rapport à la performance des animaux ou à leur réponse immunitaire.

Intitulé et adresse du laboratoire:

	Institut National de la Recherche Agronomique -
	INRA, Unité Toxalim -UMR 131
	Laboratoire Immunomycotoxicologie
	180, Chemin de Tournefeuille -B.P. 93173
	31027 Toulouse cedex 9 -France

La spectrométrie de masse[START_REF] Rouessac | Analyse chimique[END_REF] La spectrométrie de masse est une méthode analytique qui a pour but la caractérisation de la matière grâce à la détermination des masses atomiques ou moléculaires des différents composés présents dans un échantillon. De part sa grande polyvalence et sa haute sensibilité, c'est une méthode qui a un champ d'application très vaste. Le principe de fonctionnement d'un spectromètre de masse repose sur la création d'un flux d'ions dévié par un champ électrostatique ou magnétique avant d'atteindre un détecteur. Le déplacement des ions dans le spectromètre est défini de façon précise par des lentilles électroniques, mais la trajectoire de chaque ion est proportionnelle au rapport de sa masse sur sa charge (m/z). L'intensité des ions détectés permet de donner une notion quantitative à l'analyse et la détermination du rapport m/z permet de déduire la masse du composé, ainsi que celles de ses fragments. En effet, un ion peut être fragmenté par collision avec des espèces gazeuses présentes à l'intérieur du spectromètre, ce qui peut apporter des informations quant à sa structure. La figure II.2, décrit de façon simplifiée, les différentes étapes qui ont lieu lors d'une analyse par spectrométrie de masse. A savoir que ces étapes doivent être réalisées dans des conditions de vide pour que les ions puissent se déplacer sans être fragmentés de manière incontrôlée par des molécules résiduelles. Il existe différents types de sources pour ioniser les molécules et différents types d'analyseurs et de détecteurs. Les performances de chacune des combinaisons possibles peuvent être évaluées en fonction de la gamme dynamique en masse (valeur de m/z maximale détectée), la sensibilité (concentration minimale détectée) et la résolution (discrimination de pics de rapports m/z voisins). Ce dernier facteur est déterminant lorsqu'il s'agit d'analyser des échantillons complexes comme ceux qui ont été utilisés pendant cette thèse.

Discussion & Conclusions

Remerciements

Le travail ici présenté a été possible grâce à un partenariat entre l'Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) et l'Agence Nationale de Sécurité Sanitaire des Aliments (ANSES).

Maize Carcinogenicity (group 2B) No * Carcinogenicity groups according to the International Agency for Research on Cancer (IARC)

C 18 H 21 O 317.14018 1 Fusariumin Fusarium sp. Xang et al., 2011(Bioorganic & Medical Chemistry Letters 21, 2011, p 1887-1889) C 25 H 35 O 415.24949 5 Ophiobolin L Helminthosporium marydis E. Li et al., J. Nat. Prod. 58 (1995) 74

S-15183a

Zopfiella inermis Keita, K. et al., J. Antibiot. 54 (2001) Neomangicol C marine Fusarium sp. Renner, M.K. et al., J. Org. Chem. 63 (1998) C 18 H 29 O 293.21255 6 (S,S)-Conocandin; A-32287

Hormococcus conorum

Banfi , L. et al., J. Org. Chem. 1987, 52, 5452-7;Helv.,59,2506Helv.,59, ,1976 11-Keto-9(E),12(E)octadecadienoic acid Trichoderma sp.

Fusarium oxysporum Miersch, O. et al., Phytochem. 50 (1999) 517-23 (1S,2S)-3-Oxo-2(2Zpentenyl)cyclopentane-1octanoic acid Fusarium oxysporum Miersch, O. et al., Phytochem. 50 (1999)

Supporting information

Analyses statistiques

Les données des différents groupes ont été comparées par analyse de la variance (ANOVA) à deux facteurs pour tenir compte des différences individuelles. Préalablement, le test de Fisher a été utilisé pour tester l'homogénéité des variances et le test de student pour comparer les moyennes. Le seuil de significativité a été fixé à une p < 0,05, et p < 0,01 pour évaluer une tendance .

Discussion & Conclusions

Conclusions f