Marco E Mechan-Llontop

John Mullet

Ashley Shade
email: ashley.shade@cnrs.fr

Phyllosphere Exudates Select for Distinct Microbiome Members in Sorghum Epicuticular Wax and Aerial Root Mucilage

Keywords: bioenergy, agriculture microbiome, bacterial isolates, plant-association, diazotroph, irrigation, fertilizer, amplicon sequencing, cultivation

HAL is

Phyllosphere exudates create specialized microhabitats that shape microbial community diversity. We explored the microbiome associated with two sorghum phyllosphere exudates, the epicuticular wax and aerial root mucilage. We assessed the microbiome associated with the wax from sorghum plants over two growth stages, and the root mucilage additionally from nitrogen-fertilized and non-fertilized plants. In parallel, we isolated and characterized hundreds of bacteria from wax and mucilage, and integrated data from cultivation-independent and cultivation-dependent approaches to gain insights into exudate diversity and bacterial phenotypes. We found that Sphingomonadaceae and Rhizobiaceae families were the major taxa in the wax regardless of water availability and plant developmental stage to plants. The cultivation-independent mucilage-associated bacterial microbiome contained Erwiniaceae, Flavobacteriaceae, Rhizobiaceae, Pseudomonadaceae, Sphingomonadaceae, and its structure was strongly influenced by sorghum development but only modestly influenced by fertilization. In contrast, the fungal community structure of mucilage was strongly affected by the year of sampling but not by fertilization or plant developmental stage, suggesting a decoupling of fungal-bacterial dynamics in the mucilage. Our bacterial isolate collection from wax and mucilage had several isolates that matched 100% to detected amplicon sequence variants, and were enriched on media that selected for phenotypes including phosphate solubilization, putative diazotrophy, resistance to desiccation, capability to grow on methanol as a carbon source, and ability to grow in the presence of linalool and β-caryophyllene (terpenes in sorghum wax). This work expands our understanding of the microbiome of

INTRODUCTION

The phyllosphere, which includes the above-ground plant structures, has diverse surface features [START_REF] Ruinen | The phyllosphere[END_REF][START_REF] Vacher | The Phyllosphere: Microbial Jungle at the Plant-Climate Interface[END_REF][START_REF] Doan | Topography-Driven Shape, Spread, and Retention of Leaf Surface Water Impacts Microbial Dispersion and Activity in the Phyllosphere[END_REF]. It is a microbial habitat that is exposed to rapid environmental fluctuations and stressors, including in ultraviolet radiation, temperature, and nutrient and water availability. Thus, the diversity and functions of the phyllosphere microbiome reflects this complex habitat [START_REF] Lindow | Microbiology of the phyllosphere[END_REF][START_REF] Vorholt | Microbial life in the phyllosphere[END_REF][START_REF] Vacher | The Phyllosphere: Microbial Jungle at the Plant-Climate Interface[END_REF]. To adapt to abiotic stresses, plants produce a diversity of exudates on their external surfaces [START_REF] Chai | Root exudates impact plant performance under abiotic stress[END_REF].

The secreted exudates vary in composition and structure, creating specialized phyllosphere microhabitats [START_REF] Galloway | Sticky mucilages and exudates of plants: putative microenvironmental design elements with biotechnological value[END_REF]. Exudates that accumulate in the phyllosphere include epicuticular wax on stems and leaves [START_REF] Kunst | Biosynthesis and secretion of plant cuticular wax[END_REF], sugar-rich mucilage on aerial root structures [START_REF] Bennett | A Model for Nitrogen Fixation in Cereal Crops[END_REF], floral nectaries [START_REF] Rering | Nectar-inhabiting microorganisms influence nectar volatile composition and attractiveness to a generalist pollinator[END_REF], and extrafloral nectaries in stems and leaves [START_REF] Pierce | The ecological and evolutionary importance of nectar-secreting galls[END_REF]).

Because of their potential as locations of microbial engagement with the host, research has been initiated to explore these microbial communities that reside on phyllosphere exudates. maize. These bacteria were capable of biological nitrogen fixation (BNF), synthesizing indole-3-Acetic Acid (IAA), utilizing 1-amino-1-cyclopropanecarboxylic acid (ACC), and solubilizing phosphates. The unique polysaccharide composition of the mucilage may modulate its associated microbiota [START_REF] Van Deynze | Nitrogen fixation in a landrace of maize is supported by a mucilage-associated diazotrophic microbiota[END_REF]Higdon et al. 2020b). The maize mucilage is enriched in a mixture of monosaccharides including fucose (28%), galactose (22%), arabinose (15%), glucuronic acid (11%), xylose (11%), mannose (8%), glucose (1%) and galacturonic acid (1%) [START_REF] Van Deynze | Nitrogen fixation in a landrace of maize is supported by a mucilage-associated diazotrophic microbiota[END_REF][START_REF] Amicucci | Strategy for Structural Elucidation of Polysaccharides: Elucidation of a Maize Mucilage that Harbors Diazotrophic Bacteria[END_REF].

The polysaccharide composition of root mucilage may vary among maize genotypes and with changing environmental conditions [START_REF] Nazari | Mucilage Polysaccharide Composition and Exudation in Maize From Contrasting Climatic Regions[END_REF].

Bioenergy sorghum (Sorghum bicolor L. Moench) is a heat and drought-tolerant annual crop being developed for production of biomass, biofuels and bioproducts [START_REF] Mullet | Energy Sorghum-a genetic model for the design of C4 grass bioenergy crops[END_REF][START_REF] Varoquaux | Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses[END_REF]. Bioenergy sorghum confers 75%-90% greenhouse gas mitigation when used for ethanol production or biopower generation respectively [START_REF] Olson | High biomass yield energy sorghum: developing a genetic model for C4 grass bioenergy crops[END_REF]), but excess nitrogen fertilizer is required to grow it, resulting in the release of nitrous oxide and relatively lower carbon benefit than other biofuel feedstocks that do not have high fertilizer demands [START_REF] Kent | Simulated Biomass Sorghum GHG Reduction Potential is Similar to Maize[END_REF][START_REF] Scully | Carbon intensity of corn ethanol in the United States: state of the science[END_REF]). In the 1980s, it was hypothesized that the mucilage secreted by sorghum aerial roots harbors diazotroph bacteria, as has been more recently shown in the a maize landrace [START_REF] Bennett | A Model for Nitrogen Fixation in Cereal Crops[END_REF], but this has not yet been experimentally confirmed. Although the polysaccharide composition of the sorghum aerial root mucilage is uncharacterized, it is expected that the sorghum mucilage is similar in composition to maize [START_REF] Van Deynze | Nitrogen fixation in a landrace of maize is supported by a mucilage-associated diazotrophic microbiota[END_REF][START_REF] Amicucci | Strategy for Structural Elucidation of Polysaccharides: Elucidation of a Maize Mucilage that Harbors Diazotrophic Bacteria[END_REF]. Taken together, it is expected that understanding microbiome interactions on the sorghum mucilage may provide insights into microbiome-enabled solutions to optimize diazotrophic nitrogen for the host and, in parallel, reduce nitrogen fertilizer needs for bioenergy sorghum.

Like other plants, bioenergy sorghum accumulates high levels of epicuticular wax on stems and leaves over its development, and some functions of the wax are to exclude pathogens and prevent water loss. Sorghum epicuticular wax chemistry and structure have been extensively studied. The accumulation, and composition of sorghum epicuticular wax are affected by several factors, including plant age, genotype, water availability, and environmental stresses [START_REF] Bianchi | Epicuticular waxes of two sorghum varieties[END_REF][START_REF] Avato | Epicuticular waxes of Sorghum and some compositional changes with plant age[END_REF][START_REF] Jordan | Environmental Physiology of Sorghum. II. Epicuticular Wax Load and Cuticular Transpiration1[END_REF][START_REF] Steinmüller | Action of ultraviolet radiation (UV-B) upon cuticular waxes in some crop plants[END_REF][START_REF] Shepherd | Effects of environment on the composition of epicuticular wax from kale and swede[END_REF][START_REF] Jenks | Changes in epicuticular waxes on wildtype and eceriferum mutants in Arabidopsis during development[END_REF][START_REF] Bondada | Effect of water stress on the epicuticular wax composition and ultrastructure of cotton (Gossypium hirsutum L.) leaf, bract, and boll[END_REF][START_REF] Shepherd | The effects of stress on plant cuticular waxes[END_REF][START_REF] Xue | Molecular and Evolutionary Mechanisms of Cuticular Wax for Plant Drought Tolerance[END_REF].

However, the influence of sorghum wax chemistry on bacteria colonization and community structure is unknown.

In the present study, we investigated the microbiome associated with bioenergy sorghum epicuticular wax and aerial root mucilage. Given the functions of these exudates for the host, these communities may be of interest to examine microbiome traits that support host drought tolerance and nutrient uptake. To begin to explore the microbial communities inhabiting these specialized phyllosphere exudates, the microbiome composition and structure of wax and mucilage was analyzed from field conditions that included management treatments expected to influence plant water and nitrogen status. Specifically, we assessed the bacterial microbiome associated with the epicuticular wax from sorghum plants at two different developmental stages that also received different amounts of water, and the bacterial and fungal microbiomes additionally associated with the aerial root mucilage from nitrogen (N)-fertilized and nonfertilized sorghum plants. In addition, we curated a bacterial isolate collection from each phyllosphere exudate. We integrate data from both cultivation-independent anddependent approaches to gain deeper insights into the microbiome diversity and dynamics of sorghum epicuticular wax and aerial root mucilage.

We hypothesized that: 1) wax and mucilage harbor different bacterial microbiomes due to their different exudate chemistries, host functions, and compartments; 2) plant developmental stage and watering status has highest explanatory value for the wax bacterial microbiota due to the known role of wax in supporting plant drought tolerance; 3) fertilization status has highest explanatory value for the mucilage bacterial microbiota due to changes in exogenous nutrient availability that are expected to result in changes in mucilage polysaccharide composition; and 4) that the bacterial and fungal members of the mucilage microbiome exhibit similar dynamics due to expected similar host and environmental drivers.

METHODS

Collection of sorghum stems and recovery of epicuticular wax. We collected samples from the bioenergy sorghum (Sorghum bicolor) hybrid TX08001 grown at the Texas A&M University Research Farm in College Station, Texas (30 o 55'5.55" N, 96 o .43'64.6" W). Sorghum plants were grown in 5 replicate 32 rows by 30 m plots at standard planting density and fertilization [START_REF] Olson | High biomass yield energy sorghum: developing a genetic model for C4 grass bioenergy crops[END_REF]. We sampled replicate plots 1-5 at 60 (08/03/2020) and 90 (09/02/2020) days after plant emergence (DAE).

While sorghum plants at 60 DAE were irrigated to maintain non-limiting water status, plants at 90 DAE were grown without irrigation to induce water-limiting conditions until harvesting. Thus, the developmental age of the plants and their watering status are colinear and their effects cannot be separated in our study. We collected stem sections that were covered in epicuticular wax, using razor blades to destructively sample the fifth and sixth fully elongated stem node-internodes below the growing zone into sterile whirl-pak bags. In total, we collected 50 stem samples during the growing season of 2020. All samples were kept on ice for transport, shipped on dry ice to Michigan State University, and then stored at -80 o C. We used sterile razor blades to carefully remove and collect the epicuticular wax from stems in sterile 1.5 ml Eppendorf tubes. Sorghum plants were grown in 5 replicate 30x40 m plots arrayed in a randomized complete block design. Within each plot, nitrogen fertilizer-free subplots were maintained either in the western or eastern -most 3m of each plot. We sampled replicate plots 1-4 in both the main and nitrogen-fertilizer free subplots at 60 and 90 DAE. We used sterile razor blades to carefully collect between 3 to 5 aerial nodal roots per plant that were covered with visible mucilage into sterile 50 ml Eppendorf tubes. In total, we collected 180 aerial root samples during the growing seasons of 2020 and 2021. All samples were kept on ice for transport, and then stored at -80 o C. In the laboratory, we added 15 ml of sterile distilled water and kept the roots for 5 min at room temperature to fully hydrate the aerial root mucilage. We collected 1 ml of mucilage into sterile 1.5 ml Eppendorf tubes per sample. Mucilage samples were stored at -80 o C until processing.

Culturing the epicuticular wax and mucilage microbiomes. For bacterial isolation, we pooled the epicuticular wax collected from different plants, as described above, and resuspended 100 mg of wax in 1 ml of sterile distilled water. We also pooled the mucilage collected from different plants, as described above. To capture a diversity of bacteria from the wax and mucilage, we used a variety of cultivation media (Table 1).

First, we used standard culture media with a relatively high concentration of nutrients, including Tryptic Soy Agar (TSA: casein peptone 15 gl -1 , soy peptone 5 gl -1 , sodium chloride 5 gl -1 , agar 15 gl -1 , pH 7.3) and 50TSA (1/2 dilution of TSA). We also used media with relatively lower concentrations of nutrients, including Reasoner's 2A (R2A: yeast extract 0.5 gl -1 , proteose peptone N o 3 0.5 gl -1 , casamino acids 0.5 gl -1 , glucose 0.5 gl -1 , soluble starch 0.5 gl -1 , sodium pyruvate 0.3 gl -1 , K2HPO4 0.3 gl -1 , MgSO4 x 7H2O 0.05 gl -1 , agar 15 gl -1 ), 50R2A (1/2 dilution of R2A), and M9 minimal media (Na2HPO4 12.8 gl -1 , KH2PO4 3.0 gl -1 , NaCl 0.5 gl -1 , NH4Cl 1.0 gl -1 , glucose 20 gl -1 , 1M MgSO4 solution 20 ml, 1M CaCl2 solution 0.1 ml, thiamine 0.5% w/v solution 0.1 ml, agar 15 gl - 1 ). To enrich for bacteria with putative plant beneficial traits, we used selective media types, including Jensen's medium (sucrose 20 gl -1 , K2HPO4 1 gl -1 , MgSO4 0.5 gl -1 , NaCl 0.5 gl -1 , FeSO4 0.1 gl -1 , Na2MoO4 0.005 gl -1 , CaCO3 2 gl -1 , agar 1 gl -1 ) and modified nitrogen-free M9 minimal media with and without 1% (w/v) D-arabinose, galactose or xylose at pH 5, 5.8 or 7 (Na2HPO4 12.8 gl -1 , KH2PO4 3.0 gl -1 , NaCl 0.5 gl -1 , 1M MgSO4 solution 20 ml, 1M CaCl2 solution 0.1 ml, agar 15 gl -1 ) for detection of putative nitrogen fixing bacteria, Pirovskaya's agar (yeast extract 0.5 gl -1 , dextrose 10 gl -1 , Ca3(PO4)2 5 gl - 1 , (NH4)2SO4 0.5 gl -1 , KCl 0.2 gl -1 , MgSO4 0.1 gl -1 , MnSO4 0.0001 gl -1 , FeSO4 0.0001 gl -1 , agar 15 gl -1 ) for detection of phosphate solubilizing bacteria, Gauze's synthetic medium N o 1 (soluble starch 20 gl -1 , KNO3 1 gl -1 , NaCl 0.5 gl -1 , MgSO4 x 7H2O 0.5 gl -1 , K2HPO4 0.5 gl -1 , FeSO4 x 7 H2O 10 mgl -1 , agar 15 gl -1 ) for isolation of Actinobacteria, King's medium B (proteose peptone 20 gl -1 , K2HPO4 1.5 gl -1 , MgSO4 x 7H2O 1.5 gl -1 , glycerol 10 ml) for isolation of fluorescent pseudomonas, and methanol mineral salts medium ((NH4)2SO4 2.0 gl -1 , NH4Cl 2.0 gl -1 , (NH4)2HPO4 2.0 gl -1 , KH2PO4 1.0 gl -1 , K2HPO4 1.0 gl -1 , MgSO4 x 7H2O 0.5 gl -1 , Fe2SO4 x 7H2O 0.01 gl -1 ,CaCl2 x 2H2O 0.01 gl -1 , yeast extract 2.0 gl -1 , agar 20 gl -1 ) for isolation of methanol-utilizing bacteria.

All plates were incubated for up to 14 days. To select for anaerobic bacteria, agar plates were placed in anaerobic jars (Mitsubishi AnaeroPack 7.0L rectangular jar) containing three bags of anaerobic gas generator (Thermo Scientific AnaeroPack Anaerobic Gas generator). To enrich for bacteria resistant to desiccation, one hundred microliters of dilution 10 -1 from the wax and mucilage were inoculated on 20 ml of 50% TSB liquid culture supplemented with different concentrations of 6000 polyethyleneglycol, including -0.49 MPa (210 gl -1 PEG w/v), -0.73 MPa (260 gl -1 PEG w/v) and -1.2 MPa (326 gl -1 PEG w/v). To enrich for bacteria that can grow in the presence of terpenoids, 100 ml of dilution 10 -1 from the wax and mucilage were inoculated on 20 ml of 50% TSB liquid culture supplemented with 1% (v/v) of either linalool or βcaryophyllene. Liquid cultures were incubated at 28 o C for 24 h, and dilutions 10 -1 to 10 -4 were plated in duplicate on R2A agar plates for 24 h. Well isolated individual colonies were picked with a sterile toothpick and transferred to a new R2A plate. To confirm bacterial purity, individual bacterial colonies were transferred three times on new R2A agar plates. Glycerol stock (25% v/v) of pure bacteria isolates were stored at -80 o C.

Metagenomic DNA extraction and amplicon sequencing. Microbial DNA was extracted from 0.5 ml of mucilage and 100 mg of epicuticular wax using a DNeasy PowerSoil kit (Qiagen, Maryland, USA) according to the manufacturer's instructions. To confirm successful DNA extraction, the metagenomic DNA was quantified using a qubit 2.0 fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), and visualized in a 1% agarose gel.

Then, the PCR amplifications and sequencing of the V4 region of the 16S rRNA bacterial or archaeal gene from the epicuticular wax and mucilage samples and the ITS1 region of the fungal rRNA gene from the mucilage samples only were performed. DNA concentrations were normalized to approximately 1 µg/µl between all samples before PCR amplification and sequencing. The V4 hypervariable region of the 16S rRNA gene was amplified using the universal primers 515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′) and 806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) [START_REF] Caporaso | Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample[END_REF] under the following conditions: 95 o C for 3 min, followed by 30 cycles of 95 o C for 45 s, 50 o C for 60 s, and 72 o C for 90 s, with a final extension at 72 o C for 10 min. The metagenomic DNA of each sample was submitted to the Genomics Core of the Research Technology Support Facility at Michigan State University for library preparation and sequencing using the Illumina MiSeq platform v2 Standard flow cell in a 2x250bp paired-end format, using their standard operating protocol.

The ITS1 region was amplified using primers ITS1f (5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′) and ITS2 (5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′) (Smith and Peay 2014) with the addition of index adapters CS1-TS-F: 5' -ACACTGACGACATGGTTCTACA -[TS-For] -3' and CS2-TS-R: 5' -TACGGTAGCAGAGACTTGGTCT -[TS-Rev] -3' as requested by the Genomics Sequencing Core under the following PCR conditions: 94°C for 3 min, followed by 35 cycles of 94°C for 30 s, 52°C for 30 s, and 68°C for 30 s, with a final extension at 68°C for 10 min. The amplification was performed with GoTaq Green Master Mix (Promega). The PCR products were purified with ExoSAP-IT reagent, and Bacterial genomic DNA extraction. Bacteria colonies that were first streaked and isolated for purity were grown on 2 ml of 50% TSB liquid culture at 28°C for 24 h. Bacteria culture was centrifuged at 5,000 rpm for 10 min. Genomic DNA of each isolate was extracted by using the Zymo -Quick DNA Fungal/Bacterial 96 kit following the manufacturer's protocol. Total genomic DNA was quantified using a qubit 2.0 fluorometer and visualized in a 1% agarose gel. The PCR amplification of the full-length 16S rRNA gene with universal primers 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) and 1492R (5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′) [START_REF] Miller | Short-Read Assembly of Full-Length 16S Amplicons Reveals Bacterial Diversity in Subsurface Sediments[END_REF]) was performed by using the Pfu Turbo DNA polymerase (Agilent) under the following conditions: 95 o C for 2 min, followed by 24 cycles of 95 o C for 30 s, 48 o C for 30 s, and 72 o C for 3 min, with a final extension at 72 o C for 10 min. PCR products were purified with ExoSAP-IT reagent and submitted for Sanger sequencing at the Genomics Core of the Research Technology Support Facility at Michigan State University, MI, USA.

Bacterial and fungal amplicon sequencing analysis. Paired-end sequencing data from each sequencing experiment were processed with QIIME2 [START_REF] Bolyen | Reproducible, interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2[END_REF] version 2021.8.0. In brief, sequences were imported using the PairedEndFastqManifestPhred33V2 format. Sequence quality control, denoising, and generation of feature tables containing counts for the Amplicon Sequencing Variants (ASVs) were performed with the q2-dada2 plugin version 2021.8.0 [START_REF] Callahan | DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data[END_REF]. Trimming parameters for the DADA2 plugin were selected with FIGARO version 1.1.2 [START_REF] Weinstein | FIGARO: An efficient and objective tool for optimizing microbiome rRNA gene trimming parameters[END_REF]. ASVs tables and representative sequences from each sequencing experiment were merged with the q2-feature-table plugin. ASV taxonomy (of merged ASVs) was assigned with the q2-feature-classifier plugin using the SILVA version 1.38 database [START_REF] Quast | The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools[END_REF] Permuted analysis of variance (PERMANOVA) and permuted analysis of betadispersion (PERMDISP) were used to assess differences in beta diversity structure across treatments by centroid and dispersion. Differential abundance analysis was performed with the DESeq2 package [START_REF] Love | Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2[END_REF]. Each dataset (bacterial/fungal, wax/mucilage) was subsampled independently to ensure maximum coverage for comparisons over time and across field treatments. The exception was when testing hypothesis 1 (differences in wax and mucilage bacterial microbiome), and in this case both datasets were subsampled to an even 2,500 sequences per sample for comparison.

Full-length 16S rRNA gene Sanger sequencing analysis: Culturing phyllosphere exudate microbiota. To generate a consensus sequence of the full-length 16S rRNA gene from each bacterial isolate, sequences were imported into Geneious version 2021.2.2 (https://www.geneious.com/). High-quality forward and reverse sequences were aligned and trimmed to generate a consensus sequence. Then, the consensus sequence was searched with BLAST for taxonomic classification. CD-HIT version 4.8.1 [START_REF] Li | Cd-hit: a fast program for clustering and comparing large sets of protein or nucleotide sequences[END_REF] was used to remove redundant 16S rRNA sequences. To identify bacterial isolates that match 100% to the identified ASVs from the culture-independent approach, a local BLAST search was performed. In summary, a local BLAST database was created with all non-redundant 16S rRNA sequences from our bacterial collection using the makeblastdb command and the -dbtype nucl option. A BLAST search was carried out to identify related sequences in the representative sequences (ASVs dnasequences.fasta) file generated from the DADA2 denoising step with the blastn command, and the flowing options: "6 qseqid sseqid pident length mismatch gapopen qstart qend sstart send evalue bitscore".

Comparison with publicly available plant-associated bacterial genomes. We retrieved 637 plant-associated (PA) bacterial genomes that were classified as non-root associated from the [START_REF] Levy | Genomic features of bacterial adaptation to plants[END_REF]) study. High-quality bacterial genomes were annotated with Prokka (Seemann 2014) using an in-house python script and annotated 16S rRNA gene copies were identified (available on GituHub, see Data availability statement). For bacteria with multiple 16S rRNA copies, CD-HIT version 4.8.1 [START_REF] Li | Cd-hit: a fast program for clustering and comparing large sets of protein or nucleotide sequences[END_REF] was used to remove redundant sequences (99% similarity) and one 16S rRNA sequence was conserved, totaling 433 unique PA sequences. All 16S rRNA sequences from the PA bacterial genome dataset were concatenated in a single fasta file with the cat command. CD-HIT was used to remove redundant sequences (100 % similarity) from the 16S rRNA concatenated file. All non-redundant 16S rRNA sequences from both the sorghum bacterial collections and the publicly available PA bacteria were merged in a single fasta file. Sequence alignment was performed with MAFFT v7.407 [START_REF] Katoh | MAFFT: a novel method for rapid multiple sequence alignment based on fast Fourier transform[END_REF]. Alignment trimming was performed with trimAl [START_REF] Capella-Gutiérrez | trimAl: a tool for automated alignment trimming in large-scale phylogenetic analyses[END_REF]. A maximum-likelihood (ML)-based phylogenetic tree was built with IQ-TREE 2.2.0-beta version [START_REF] Minh | IQ-TREE 2: New Models and Efficient Methods for Phylogenetic Inference in the Genomic Era[END_REF]. ModelFinder version (-m TEST option) [START_REF] Kalyaanamoorthy | ModelFinder: fast model selection for accurate phylogenetic estimates[END_REF]) was used to select the best model for the phylogenetic tree construction. Branch support was assessed using 1,000 ultrafast boostrap approximations (-bb 1000 option) [START_REF] Hoang | UFBoot2: Improving the Ultrafast Bootstrap Approximation[END_REF]. Phylogenetic diversities were calculated as the total tree length, that represents the expected number of substitutions per site. Phylogenetic tree was edited with iTOLs version 6.5.8 [START_REF] Letunic | Interactive Tree Of Life (iTOL) v5: an online tool for phylogenetic tree display and annotation[END_REF].

Data and code availability. The data analysis workflows for sequence processing and ecological statistics are available on GitHub (https://github.com/ShadeLab/Sorghum_phyllosphere_microbiome_MechanLlontop_202 2.git). Raw sequencing data has been deposited in the Sequence Read Archive NCBI database under BioProject accession number PRJNA844896 (including 16S rRNA and ITS amplicons). Full-length 16S rRNA sequence data has been deposited in the GenBank with accession numbers ON973084-ON973283.

RESULTS

Sequencing summary. In total, we sequenced the bacterial 16S rRNA V4 region from 48 epicuticular wax samples from the 2020 growing season, as well as the bacterial 16S rRNA V4 region from 179 mucilage samples and the fungal ITS region from 173 mucilage samples that were collected across two growing seasons in 2020 and 2021.

We obtained 8,648,839 bacterial sequences from the wax, and 20,606,039 bacterial and 20,181,404 fungal sequences from the mucilage. After quality control, removal of chimeras, and denoising, 7,930,768 quality bacterial reads were obtained from the wax samples, and 19,880,634 bacterial and 12,157,819 fungal sequences were obtained from mucilage (Table 2). For wax, the total number of sequences per sample after the denoising process with DADA2 into Amplicon Sequence Variants (ASVs) ranged from 1,722 to 272,108. After the removal of nonbacterial and unassigned sequences, a total of 2,386,033 sequences remained, with sequencing reads per wax sample ranging from 138 to 206,128. We removed wax samples with fewer than 1000 sequences, and the remaining 42 epicuticular wax samples were rarefied to 1,303 sequences for further analysis (Figure 1A). Given the observed richness (12 to 93 ASVs per sample) by these cultivation-independent methods, Figure 1A shows that the wax bacterial microbiome was covered with the given sequencing effort.

For root mucilage, the number of bacterial sequences per sample after the denoising ranged from 222 to 330,853. After the removal of nonbacterial and unassigned sequences, a total of 12,956,774 sequences remained, with sequencing reads per sample ranging from 110 to 235,069. We removed samples with fewer than 20,000 sequences, and the remaining 158 samples were rarefied to 20,519 sequences for comparative analysis (Figure 1B). Given the observed richness (49 to 555 ASVs per sample) by these cultivation-independent methods, Figure 1B shows that the mucilage bacterial microbiome was covered with the given sequencing effort. The number of fungal sequences per mucilage sample after the denoising ranged from 78 to 119,207.

After the removal of non-fungal and unassigned sequences, a total of 12,297,453 sequences remained, with sequencing reads per sample ranging from 32 to 119,207.

We filtered mucilage samples with fewer than 30,000 ITS sequences, and the remaining 171 samples were rarefied to 33,975 sequences for comparative analysis (Figure 1C).

Similarly, given the observed richness by these cultivation-independent methods (47 to 237 ASVs per sample), Figure 1C shows that the mucilage fungal microbiome was covered with the given sequencing effort.

Hypothesis 1: Wax and mucilage harbor different bacterial microbiomes

Compositional differences in the bacterial microbiomes of the epicuticular wax and mucilage were apparent at the family level of taxonomic resolution (Figure 2A andB)

as well as at the genus level (Supplementary Figure S1A andB). Wax and mucilage bacterial microbiomes had different richness (observed taxa Wilcoxon rank p<0.001, Supplementary Table 1) and different structures (PERMANOVA R-squared= 0.14, p=0.001). Thus, Hypothesis 1 was supported. However, there were no differences detected in the dispersions of wax and mucilage bacterial microbiome structures (PERMDISP F=0.69,p=0.43).

03) (Supplementary Table 1).

There was higher variation in the community structure in the epicuticular wax on plants at 90 DAE compared with plants at 60 DAE (PERMDISP F=17.92, p=0.001). There was a small but significant influence of sorghum developmental stage on the epicuticular wax community structure (PERMANOVA R-squared=0.06, p= 0.003, Figure 3A, Table 3).

The sorghum epicuticular wax microbiome was dominated by the Proteobacteria (84% mean relative abundance) and Bacteroidetes (11%) bacteria phyla. The bacterial Phytobiomes Journal 20 classes Alphaproteobacteria (54%), Gammaproteobacteria (30%), and Bacteroidia (11%) were in highest abundance. Sphingomonadaceae (25%), Rhizobiaceae (21%), and Xanthomonadaceae (7%) were the major bacterial families in sorghum epicuticular wax (Figure 2A). At the genus level, Sphingomonas (28%), Rhizobium (12%), Aureimonas (10%), and Acinetobacter (5%) were the dominant taxa in wax (Supplementary Figure 1). Differential abundance analysis showed that only one ASV (ASV ID #5438e75153393c2dda98fe3d99c26da1) from the Microbacteriacea family was more abundant on the wax of plants at 60 DAE (by 3.08-fold, DeSeq p = 0.01), and that one ASV (ASV ID #8f820a46cfecd19477f4485d1c436764) assigned to Pseudoxanthomonas genera was more abundant on the wax of plants at 90 DAE (by 4.49-fold, DESeq p = 0.01). Taking these results together, Hypothesis 2 was weakly supported with a small, significant difference in wax bacterial microbiome by plant stage and two taxa that were distinguishing between the stages.

Hypothesis 3: Fertilization status has highest explanatory value for the bacterial mucilage microbiota

Altogether, 12,047 bacterial ASVs were identified in aerial root mucilage. There was no difference in richness between mucilage samples collected from sorghum plants at 60 DAE and 90 DAE (observed species Wilcoxon rank p = 0.82, Supplementary Table 1), and also no difference between mucilage samples from nitrogen-fertilized plants as compared with unfertilized plants. (observed species Wilcoxon rank p = 0.15, Supplementary Table 1). There was different beta dispersion in community structure by plant developmental stage (PERMDISP F=19.56, p=0.001) but not by fertilization status (PERMDISP F=1.83,p=0.187). The mucilage bacterial microbiome structure was better explained by developmental stage than fertilization status (PERMANOVA R-squared= 0.14 and 0.03, respectively, both p= 0.001) (Figure 3B).

The aerial root mucilage bacterial microbiome was dominated by the Proteobacteria (61% mean relative abundance) and Bacteroidota (36%) bacteria phyla.

The bacterial class Gammaproteobacteria (40%), Bacteroidia (34%), and Alphaproteobacterial (21%) were the most abundant. Erwiniaceae (23%), Rhizobiaceae (14%), Flavobacteriaceae (12%), Pseudomonadaceae (9%), and Sphingomonadaceae (6%) were the major bacterial families in mucilage (Figure 2B). A differential abundance analysis identified 25 ASVs enriched in the mucilage at 60 DAE and 72 ASVs significantly enriched in plants at 90 DAE (Figure 4, DESeq p = 0.01). Taking these results together, Hypothesis 3 was not supported, and the bacterial microbiome of the mucilage was not highly sensitive in structure or dispersion to fertilization given this study's field conditions, nor were there notable distinguishing taxa by plant fertilization status.

Hypothesis 4: The bacterial and fungal members of the mucilage microbiome exhibit similar dynamics.

Altogether, 5,641 fungal ASVs were identified in aerial root mucilage. There were differences in richness between mucilage samples collected from sorghum plants during the 2020 and 2021 growing seasons (observed species Wilcoxon rank p = 0.008), and also between mucilage samples from nitrogen-fertilized plants compared with unfertilized plants (observed species Wilcoxon rank p < 0.01). However, no difference was observed between mucilage samples from plants at 60 DAE vs. 90 DAE (Supplementary Table 1). The mucilage fungal microbiome structure was strongly influenced by year of collection (PERMANOVA R-squared= 0.51, p < 0.001). Fungal community structure was weakly influenced by developmental stage (PERMANOVA R-squared= 0.02, p < 0.05), but not by fertilization status (PERMANOVA, p > 0.05) (Figure 2C).

The mucilage fungal microbiome was dominated by the Ascomycota (76%) and Basidiomycota (23.7%) phyla. The Dothideomycetes (50%), Sordariomycetes (24%), and Tremellomycetes (14%) fungal classes were the most abundant. Cladosporium (22%), Nectriaceae (17%), Didymellaceae (14%), Bulleribasidiaceae (9 %), Pleosporaceae (8%) were the dominant fungal families in the mucilage. The genera Cladosporium exhibited higher abundance in the 2020 growing season (34%) compared with 2021 (14%). In contrast, we found an enrichment of the genera Epicoccum in 2021 (18%) compared with the 2020 growing season (0.02%) (Supplementary Figure 1).

Taking these results together, Hypothesis 4 was not supported because the bacterial microbiome of mucilage was more sensitive to plant development and consistent across sampling years than the fungal, while the fungal microbiome also exhibited greater variability between years.

Cultivation-dependent bacterial taxonomic and phenotypic diversity of sorghum

phyllosphere wax and mucilage.

Bacterial culture collections from the epicuticular wax and aerial root mucilage were constructed by enriching bacteria with putative plant-beneficial traits (Table 1). In total, 500 bacteria from the wax and 800 bacteria from the mucilage were isolated, and then a subset of 200 isolates from both the wax and mucilage were taxonomically identified by sequencing the full-length 16S rRNA gene (Supplementary Table 2). These isolates were chosen to represent the range of different cultivation conditions employed and, additionally, to maximize distinguishing phenotypes (morphology, color, etc) to avoid redundancy in the collection (Figure 5). The wax bacterial collection was dominated by the Proteobacteria, followed by Actinobacteria, and Bacteroidetes phyla, and the mucilage bacterial collection was dominated by the Proteobacteria, followed by Actinobacteria, Firmicutes, and Bacteroidetes phyla (Supplementary Table 2).

Forty-eight ASVs matched with 100% sequence identity to strains in the isolate collections (Supplementary Table 2). Most of the bacterial families found in the sorghum wax and mucilage had representatives among the isolate collection (Figure 6).

Families such as Beijerincklaceae, Chitinophagaceae, Oxalobacteraceae were not captured by our wax bacterial cultivation efforts. Families observed using cultivationindependent techniques but that were not captured by our mucilage cultivation efforts included Cytophagaceae and Oxalobacteraceae.

To understand potential novelty and redundancy represented by the diversity of our wax and mucilage bacterial collections, we compared the full-length 16S rRNA genes with those extracted from the bacterial genomes of previously described nonroot-associated, plant-associated (PA) bacteria [START_REF] Levy | Genomic features of bacterial adaptation to plants[END_REF], assigned as nonroot-associated. 637 bacterial genomes were retrieved from a publicly available database (see Methods) to provide a reference of context for our 200 sorghum phyllosphere isolates. The final data set contained 527 non-redundant full-length 16S rRNA sequences: 94 new 16S rRNA genes from our sorghum wax and mucilage collections, and 433 rRNA genes from the published plant-associated bacterial genomes (Figure 7).

DISCUSSION

We investigated the microbiota associated with bioenergy sorghum phyllosphere exudates, specifically from epicuticular wax on stems and leaves and from mucilage on aerial roots.

The chemistry of epicuticular wax that covers sorghum stems has been extensively characterized [START_REF] Bianchi | Epicuticular waxes of two sorghum varieties[END_REF][START_REF] Jordan | Environmental Physiology of Sorghum. II. Epicuticular Wax Load and Cuticular Transpiration1[END_REF][START_REF] Jenks | Leaf sheath cuticular waxes on bloomless and sparse-bloom mutants of Sorghum bicolor[END_REF]Farber et al. 2019aFarber et al. , 2019b)), but there is still much to learn about its microbial residents and their colonization dynamics. Thus, we decided to characterize the wax microbiota from stems of field-grown bioenergy sorghum plants at 60 DAE and 90 DAE. We chose these two-time points because they represent different developmental stages, and, in our field conditions, they also had different water availability. During the vegetative stage, sorghum plants at 60 DAE have all leaves developed and fully expanded. At 90 DAE in the upper mid-west, plants have transitioned to the reproductive stage, seed development is in progress and nutrients are being relocated to the kernel. In the southwestern U.S., sorghum plants are in extended vegetative growth stage, with floral initiation expected at 120 DAE. The major lineages we detected in the epicuticular stem wax, including Proteobacteria, Bacteroidetes, and Actinobacteria, agree generally with reports from Arabidopsis thaliana and Sorghum bicolor epicuticular leaf wax [START_REF] Reisberg | Distinct phyllosphere bacterial communities on Arabidopsis wax mutant leaves[END_REF][START_REF] Sun | Microbial communities in crop phyllosphere and root endosphere are more resistant than soil microbiota to fertilization[END_REF]. Furthermore, we also observed changes in the relative abundances of several taxa at 60 DAE compared with plants at 90 DAE, which could be associated with changes in the composition of the epicuticular wax as the plant grows [START_REF] Avato | Epicuticular waxes of Sorghum and some compositional changes with plant age[END_REF][START_REF] Jenks | Changes in epicuticular waxes on wildtype and eceriferum mutants in Arabidopsis during development[END_REF], though more work is needed to characterize changes in the chemical composition of the wax alongside the structural changes in the microbiome to understand their relationship more fully. It has been suggested that microbes in wax may be able to metabolize wax components and use them as a carbon source [START_REF] Ueda | Extracellular esterases of phylloplane yeast Pseudozyma antarctica induce defect on cuticle layer structure and water-holding ability of plant leaves[END_REF]. Our study enriched several bacterial isolates that were able to grow with linalool and beta-caryophyllene, two of the terpenes found in sorghum wax.

To gain further insight into epicuticular wax microbiome assembly and dynamics, next steps could expand this research not only by including samples from different growing seasons, but also by including sorghum genotypes that are mutants in wax production [START_REF] Jenks | Chemically Induced Cuticle Mutation Affecting Epidermal Conductance to Water Vapor and Disease Susceptibility in Sorghum bicolor (L.) Moench[END_REF][START_REF] Jenks | Leaf sheath cuticular waxes on bloomless and sparse-bloom mutants of Sorghum bicolor[END_REF][START_REF] Peters | Mutagenesis, Selection, and Allelic Analysis of Epicuticular Wax Mutants in Sorghum[END_REF][START_REF] Punnuri | The Genes Bm2 and Blmc that Affect Epicuticular Wax Deposition in Sorghum are Allelic[END_REF]).

For decades it has been suggested that the sorghum aerial root mucilage harbors diazotroph bacteria [START_REF] Wani | Cereal nitrogen fixation: Proceedings of the Working Group meeting held at ICRISAY Center[END_REF][START_REF] Bennett | A Model for Nitrogen Fixation in Cereal Crops[END_REF]. We hypothesized that fertilization would strongly influence the phyllosphere mucilage microbiota due to changes in exogenous nutrient availability and changes in mucilage polysaccharide composition. However, our cultivation-independent data (16S rRNA amplicons) suggest that that differences in nitrogen fertilization had no notable influence on the microbiome structure for both bacterial and fungal communities. In contrast, plant developmental stage strongly affected the mucilage bacterial microbiome structure. Similar evidence of microbiome seasonality has been found in other studies of different surfaces of the phyllosphere microbiome [START_REF] Copeland | Seasonal Community Succession of the Phyllosphere Microbiome[END_REF][START_REF] Grady | Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops[END_REF][START_REF] Xiong | Plant developmental stage drives the differentiation in ecological role of the maize microbiome[END_REF][START_REF] Smets | Bacterial Succession and Community Dynamics of the Emerging Leaf Phyllosphere in Spring[END_REF]). We also observed several putative diazotroph bacteria in the sorghum mucilage that were isolated anaerobically and on nitrogen-free media, including Curtobacterium, Pantoea, Pseudomonas, Strenotrophomonas, which were reported as lineages that could colonize the maize mucilage [START_REF] Van Deynze | Nitrogen fixation in a landrace of maize is supported by a mucilage-associated diazotrophic microbiota[END_REF]Higdon et al. 2020bHigdon et al. , 2020a)).

Regarding the fungal microbiome in the mucilage, we found that the year of collection had the highest explanatory value. With two years of field data, there is not enough information to understand if the fungal community is responsive to other covariates (e.g., weather) or more stochastically assembled every year. Fungal community members likely have different responses than bacterial members to changing environmental conditions, including temperature, moisture, solar radiation, and precipitation [START_REF] Jackson | Annual and Seasonal Variation in the Phyllosphere Bacterial Community Associated with Leaves of the Southern Magnolia (Magnolia grandiflora)[END_REF][START_REF] Copeland | Seasonal Community Succession of the Phyllosphere Microbiome[END_REF][START_REF] Wagner | Host genotype and age shape the leaf and root microbiomes of a wild perennial plant[END_REF][START_REF] Gomes | Endophytic and Epiphytic Phyllosphere Fungal Communities Are Shaped by Different Environmental Factors in a Mediterranean Ecosystem[END_REF]. We can deduce that the bacterial and fungal communities did not have strong relationships or co-dependencies based on their structures, and likely have different dominating drivers. However, the possibility of redundant functional relationships between different bacterial and fungal mucilage members cannot be eliminated.

We combined both culture-independent and dependent approaches to improve our understanding of the microbiome diversity in phyllosphere exudates. Due to the chemical composition, plant DNA contamination, and low bacterial biomass associated with the wax and mucilage, a metagenomic sequencing approach would have been challenging to pursue with the sorghum phyllosphere [START_REF] Sharpton | An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data[END_REF][START_REF] Van Deynze | Nitrogen fixation in a landrace of maize is supported by a mucilage-associated diazotrophic microbiota[END_REF]. Sequencing the V4 16S rRNA and the ITS1 regions allowed us to deeply characterize bacterial and fungal communities in sorghum phyllosphere exudates, albeit with limited taxonomic resolution that can be provided by the amplicons (to approximately the genus level [START_REF] Poretsky | Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics[END_REF] as well as limited functional insight [START_REF] Langille | Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences[END_REF][START_REF] Turner | The plant microbiome[END_REF]. Thus, we decided to culture wax and mucilage bacteria by using a variety of isolation media and growing conditions that we expected to enrich for plant-beneficial bacterial phenotypes. In the end, we were able to capture representatives of most of the bacterial families and genera that we observed in our culture-independent approach. These isolates can now be used to test directly for plant beneficial properties and microbe-plant interactions in the laboratory.

In summary, we report a characterization of microbiome structure of energy sorghum phyllosphere exudates, epicuticular wax and aerial root mucilage under multiple field conditions and across two seasons for mucilage. We found that the wax and mucilage harbor distinct bacterial communities, suggesting niche specialization in the sorghum phyllosphere, and captured several key bacterial lineages in a parallel cultivation effort. Additionally, we found that fungal communities and bacterial communities in the mucilage are responsive to different drivers, with bacterial communities most distinctive by developmental stage and fungal communities most distinctive by year of sample collection. Next steps are to use the ecological dynamics from the cultivation-independent sequencing and apparent phenotypes of the bacterial isolates to understand the roles of these exudate microbiome members for plant performance.

  Epicuticular wax samples were stored at -80 o C until processing. Collection of sorghum aerial roots and removal of the mucilage. We collected samples from the bioenergy sorghum cultivar TAM 17651 grown at the Great Lakes Bioenergy Research Center (GLBRC), as part of the Biofuel Cropping System Experiment (BCSE) in Hickory Corners, Michigan (42 o 23'41.6" N, 85 o 22'23.1" W).

  sample sequencing was completed by the Genomics Core of the Research Technology Support Facility at Michigan State University using the Illumina MiSeq platform v2 Standard flow cell in a 2x250bp paired-end format. For quality control purposes, positive and negative controls were included throughout the DNA extraction, PCR amplification, and sequencing processes. A 75 µl aliquot of the ZymoBIOMICS Microbial Community Standard (Zymo Research, Irvine, CA, U.S.A) and 75 µl aliquot of an in-house Community Standard were included as positive controls. Sterile DEPC-treated water was included as negative control.

Hypothesis 2 :

 2 Plant developmental stage/watering status has highest explanatory value for the wax bacterial microbiota Altogether, we identified 534 bacterial ASVs in epicuticular wax. Wax bacterial microbiome samples collected from sorghum plants at 60 DAE and 90 DAE had different richness (observed taxa Wilcoxon rank p= 0.

Figure 1 .

 1 Figure 1. Sequencing effort and alpha diversity for sorghum epicuticular wax and aerial

Figure 2 .

 2 Figure 2. Relative abundances of bacterial families in sorghum epicuticular wax (A) and

Figure 3 .

 3 Figure 3. Principal Coordinates Analysis (PCoA) based on Bray-Curtis dissimilarities for

Figure 4 .

 4 Figure 4. Differential abundance analysis for amplicon sequencing variants (ASVs)

Figure 5 .

 5 Figure 5. Taxonomic diversity of the subset of bacteria cultivated from sorghum

Figure 6 .

 6 Figure 6. Overlap in bacterial diversity found in the sorghum epicuticular wax and aerial

Figure 7 .

 7 Figure 7. Phylogenetic diversity in the sorghum epicuticular wax and aerial root

  and Shade Phyllosphere exudates select for distinct microbiome members in sorghum epicuticular wax and aerial root mucilage Figure6

for wax bacterial microbiomes. A Wilcoxon rank sum test with continuity correction was used to test for differences in alpha diversity across treatments.

	for bacteria and UNITE version 8.3 database
	(Nilsson et al. 2019) for fungi.
	The ASV table, taxonomy table, and sample metadata files were imported into R
	version 4.1.3 for data visualization and statistical analysis. Diversity and statistical
	analyses were performed using the phyloseq (McMurdie and Holmes 2013) and vegan
	(Dixon 2003) packages. Treatments compared were: exudate (wax, mucilage) for
	bacterial microbiomes; fertilization status (fertilized, unfertilized), year of sample
	collection (2020, 2021), and developmental stage (60 DAE, 90 DAE) for mucilage
	bacterial and fungal microbiomes; and developmental stage/water availability (60 DAE,
	90 DAE)

TABLES 895 Table 1 .

 8951 Solid media and their enrichment objectives (target phenotypes) used in this 896 study to culture bacteria from the sorghum wax and mucilage. Dilutions from 10 -1 to 10 -4 897

	898	were plated for each condition, for each exudate.
	899
		Media	Target phenotype	Temperature	Oxygen
				( o C)	condition
		Reasoner's 2A agar (R2A)	General diversity	25,	Aerobic,
					anaerobic
		50% R2A	General diversity	25,	Aerobic,
					anaerobic
		Tryptic Soy Agar (TSA)	General diversity	25,	Aerobic,
					anaerobic
		50% TSA	General diversity	25,	Aerobic,
					anaerobic
		M9 minimal medium	General diversity	25,	Aerobic,
					anaerobic
		King's B medium	Pseudomonas species	25,	Aerobic,
					anaerobic
		Nitrogen-free Jensen's	Nitrogen fixation	25,	Aerobic,
		medium			anaerobic
		M9 minimal medium	Nitrogen fixation	25,	Aerobic,
		nitrogen-free, 1% xylose			anaerobic
		M9 minimal medium	Nitrogen fixation	25,	Aerobic,
		nitrogen-free, 1% galactose			anaerobic
		M9 minimal medium	Nitrogen fixation	25,	Aerobic,
		nitrogen-free, 1% arabinose			anaerobic
		M9 minimal medium	Nitrogen fixation	25,	Aerobic,
		nitrogen-carbon free			anaerobic
		Pirovskaya's agar	Phosphate solubilization	25,	Aerobic,
					anaerobic
		50% Tryptic Soy Broth, 1%	Resistance to/utilization of	28	Aerobic
		linalool*	terpenoids
		50% Tryptic Soy Broth, 1% β-caryophyllene*	terpenoids Resistance to/utilization of	28	Aerobic
		50% Tryptic Soy Broth,	Osmotic tolerance	28	Aerobic
		6000 Polyethylene Glycol*
		Gauze's synthetic medium	Actinobacteria species	25	Aerobic
		N-1

Table 2 .

 2 Sequencing summary of sorghum epicuticular wax and aerial root mucilage microbial communities characterized in this study.

				Mucilage
		Wax	Mucilage	(16S	Mucilage	Mucilage
		(16S rRNA)	(16S rRNA)	rRNA)	(ITS1)	(ITS1)
		2020	2020	2021	2020	2021
	Number of
	samples	48	99	80	92	81
	Raw Read				10,403,18	9,778,22
	Pairs	8,648,839	12,783,054 10,034,885	4	0
						5,957,24
	QC reads	7,930,768	10,809,135 9,071,499 6,200,571	8
	%
	Chloroplast/
	Mitochondria/	70%	24%	48%	0%	0%
	unassigned
	of QC reads

Table 3 .

 3 Permuted multivariate analysis of variance (PERMANOVA) to test for microbiome differences in beta diversity.

	Datase t	Exudate Variable tested	Degree s of freedo m	Pseudo F	R-d square	p-value
	Bacteri a	Mucilage , wax	Exudate	1	35.51	0.14	<0.00 1
		Mucilage Development	1	25.22	0.14	<0.00 1
		Mucilage Fertilization	1	4.26	0.03	<0.00 1
		Mucilage Year	1	3.36	0.02	<0.00 1
		Mucilage	Fertilization*Developme nt	1	1.78	0.01	0.05
		Mucilage Development*Year	1	2.78	0.01 <0.01
		Mucilage Fertilization*Year	1	1.64	0.01	0.06
		Wax	Development	1	2.75	0.06 <0.01
	Fungi	Mucilage Development	1	3.25	0.02 <0.05
		Mucilage Fertilization	1	2.20	0.01	0.07
		Mucilage Year	1	176.38	0.51	<0.00 1
		Mucilage	Fertilization*Developme nt	1	0.57	0.00	0.68
		Mucilage Development*Year	1	5.03	0.01 <0.01
		Mucilage Fertilization*Year	1	4.29	0.01 <0.05

  Mechan Llontop, Mullet and Shade Phyllosphere exudates select for distinct microbiome members in sorghum epicuticular wax and aerial root mucilage Figure3Mechan Llontop, Mullet and Shade Phyllosphere exudates select for distinct microbiome members in sorghum epicuticular wax and aerial root mucilage Figure4Mechan Llontop, Mullet and Shade Phyllosphere exudates select for distinct microbiome members in sorghum epicuticular wax and aerial root mucilage

	Relative Abundance (Family > 3%)	C TAXA	Bacterial Family Burkholderiaceae Caulobacteraceae Chitinophagaceae Comamonadaceae Cytophagaceae Elsteraceae Enterobacteriaceae Erwiniaceae Flavobacteriaceae Hymenobacteraceae Legionellaceae Microbacteriaceae Microscillaceae Moraxellaceae Morganellaceae Oxalobacteraceae Paenibacillaceae Pseudomonadaceae Fungal Family Bionectriaceae Bulleribasidiaceae Ceratobasidiaceae Chrysozymaceae Cladosporiaceae Conioscyphaceae Coniothyriaceae Corticiaceae Cyphellophoraceae Dermateaceae Didymellaceae Didymosphaeriaceae Entolomataceae Filobasidiaceae Glomerellaceae Helotiaceae Hyaloscyphaceae Hydnodontaceae Rhizobiaceae Rhodanobacteraceae Rubritaleaceae Sphingobacteriaceae Sphingomonadaceae Spirosomaceae Weeksellaceae Xanthomonadaceae Yersiniaceae Acetobacteraceae Bacteriovoracaceae Beijerinckiaceae Geodermatophilaceae Kineosporiaceae Myxococcaceae Nocardioidaceae Xanthobacteraceae Hypocreales_fam_Incertae_sedis Leptosphaeriaceae Mrakiaceae Mycosphaerellaceae Nectriaceae Orbiliaceae Pezizaceae Phaeosphaeriaceae Pleosporaceae Rhynchogastremataceae Serendipitaceae Sporidiobolaceae Stachybotryaceae unidentified Trichosphaeriaceae Tremellaceae Abditibacteria Actinobacteria Polyangia Bdellovibrionia Verrucomicrobiae Bacteroidia Gammaproteobacteria Alphaproteobacteria Class Differentially abundant ASVs: 60 vs 90 DAE -8 -4 0 Log2FoldChange 4 Sphingobium Variovorax Flavobacterium Unclassified Rhizobiaceae Unclassified Oxalobacteraceae Acinetobacter Filimonas Novosphingobium Pseudomonas Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium Lacibacterium Pedobacter Bdellovibrio Dyadobacter Taibaiella Chryseobacterium Methylophilus Mucilaginibacter Chiayiivirga Peredibacter Unclassified Comamonadaceae Unclassified Alphaproteobacteria Edaphobaculum Rhodopseudomonas Herbaspirillum Verrucomicrobium Caulobacter Luteolibacter Duganella Brevundimonas Roseomonas Blfdi19 Pseudoxanthomonas Unclassified Chitinophagaceae Sphingomonas Methylobacterium-Methylorubrum Hymenobacter Pantoea Unclassified Rickettsiaceae Quadrisphaera Aureimonas Abditibacterium Adhaeribacter Flavisolibacter Legionella Mucilage microbiome
			Aerial Root Mucilage -Fungal Microbiome

  Mullet and ShadePhyllosphere exudates select for distinct microbiome members in sorghum epicuticular wax and aerial root mucilage Figure7

	Mechan Llontop,
	Tree scale: 1
	SO RG H AS 40 7 26038 80214 02090 26341 66463 03889 2219 2643 59 01110 51 2219 2643 0413 0 AS RG SO H 51 0 2556 9210 03 0001 2 6480 2804 8 0001 0 2609 4601 70 0128 9 2537 2588 42 0014 6 0231 2524 29 0611 7 3639 6447 6 0001 0 0470 89 0411 8 52 2541 3667 0515 1 24 2563 8614 0001 0 39 2576 5640 0053 8 0 2512 3634 0145 3 S 6447 H R S O G A 44 1 264 O S R G H 322 176 8 033 15 A S 58 5 264 322 175 0 000 01 257 977 888 9 051 39 262 273 651 2 050 44 264 322 192 6 029 40 273 262 651 8 051 37 A G O S R H 264 S 42 2 322 191 4 009 31 252 212 516 8 000 41 644 736 356 033 16 264 322 192 4 000 01 461 252 464 5 063 84 A G O S R H S 5 6 5 262 273 658 3 075 79 251 989 975 4 019 29 264 322 192 8 008 13 H A S 6 2 2 R G S O 264 322 179 0 022 49 261 584 059 5 007 77 258 258 187 3 000 12 252 353 362 9 023 94 264 322 192 0 007 41 542 809 5 002 19 806 258 542 258 1 037 38 322 182 3 012 42 182 264 322 2 007 52 371 264 825 258 2588 2 000 01 2542 2585 57 0019 5 4281 2582 83 0000 4 5812 78 0478 3 2585 4281 84 0064 5 2585 4281 87 0013 8 2643 2217 40 0145 5 R G H A S9 09 SO SO RG H AS 11 71 SO RG H AS 44 7	SO RG H AS 83 3 SO RG H AS 95 6 SO RG H AS 85 2 SO RG H AS 86 0 25626 17136 00421 25346 81815 02008 2585 4276 29 0240 7 2510 0650 69 0005 6 2585 4276 35 0024 4 2524 6148 68 0223 3 2596 5835 59 0011 0 2585 4279 79 0139 6 2524 6147 29 0216 2 2537 5618 36 0337 1 2537 5618 40 0239 0 2509 6010 34 0004 0 2643 2218 11 0214 5 SO R G H A S1 20 6 2609 4597 66 0311 3 2585 4281 57 0000 1 2609 4597 60 0154 6 S O R G H A S 88 8 S O R G H A S 12 08 264 322 180 3 017 29 S O R G H A S 98 4 S O R G H A S 10 46 S O R G H A S 11 39 S O R G H A S 87 5 S O R G H A S 87 2 S O R G H A S 12 04 S O R G H A S 20 9 264 322 190 3 000 03 S O R G H A S 8 5 9 S O R G H A S 9 2 3 260 864 216 5 000 03 S O R G H A S 5 9 4 S O R G H A S 6 1 2 S O R G H A S 4 2 1 S O R G H A S 50 2 264 322 191 8 015 42 716 650 057 000 04 S O R G H A S 10 77 S O R G H A S 11 69 264 322 174 5 002 30 322 264 189 4 019 69 S O R G H A S 44 5 255 130 6110 016 64 977 257 892 5 035 25 2576 861 779 026 02 S O R G H A S 50 5 S O R G H A S 93 0 SO R G H A S9 88 2643 2218 93 0243 1 2643 2219 11 0365 5 2218 65 2643 0111 2 2218 2643 97 0350 7 2357 2554 49 0265 7 2219 2643 10 0349 4 6209 2623 36 0014 8 2217 2643 87 0097 7 2218 2643 72 0180
	Proteobacteria
	Firmicutes
	Bacteroidetes
	Actinobacteria
		S O R G H A S 87 S O R G H A S 9 5 78 S O R G H A 96 S 264 322 183 8 026 95 0 S A 12 S O R H G 264 322 182 5 006 73 251 709 304 8 001 97 264 322 178 2 012 62 251 649 302 7 029 98 S O H S 3 61 A G 88 R 322 175 013 93 3 177 014 28 9 007 264 264 322 264 322 6 57 175 264 322 175 8 015 264 322 174 2 008 264 322 176 4 024 53 264 322 174 4 028 75 264 322 176 0 018 29 264 322 181 6 014 43 264 322 175 1 015 42 264 322 176 1 015 89 264 322 178 6 018 13 264 322 176 3 021 26 264 322 176 7 002 59 264 322 175 7 006 45 264 322 179 4 018 66 264 322 9 007 28 174 2643 2218 13 0018 51 2643 2218 33 0000 1 1 2576 8612 81 0340 2630 9683 66 0149 0 8 2517 0930 15 0030 7 SO R G H A S7 39 2643 2219 1 17 0000 2582 5813 6 05 0201 2513 2370 1 87 0161 6412 2847 7 6 0062 2523 8 67 0486 2310 2643 2217 98 0166
		9
		Mucilage
		Wax

TABLE S3 List of bacterial strains isolated from sorghum wax and mucilage. Isolates were taxonomically identified by sequencing the full-length 16S rRNA gene.

 S3

ACKNOWLEDGMENTS

This work was supported by the Great Lakes Bioenergy Research Center, U.S. Department of Energy, Office of Science, Office of Biological and Environmental Research under Award Number DE-SC0018409. Support for field research was provided by the Great Lakes Bioenergy Research Center, U.S. Department of Energy, Office of Science, Office of Biological and Environmental Research (Awards DE-SC0018409 and DE-FC02-07ER64494), by the National Science Foundation Long-term Ecological Research Program (DEB 1637653) at the Kellogg Biological Station, and by Michigan State University AgBioResearch. JM acknowledges field support from graduate students at TAMU. AS acknowledges support from Michigan State University AgBioResearch.

The authors declare no conflict of interest.

Supplementary Information

Supplementary Figure S1. Relative abundances of bacterial genera in sorghum epicuticular wax (A) and aerial root mucilage (B) at 60 and 90 days after plant emergence; and relative abundances of fungal families in mucilage (C) from samples collected in 2020 and 2021. Only genera with relative abundances >0.03 are shown. S1. Excel file. Tests for differences in bacterial and fungal alpha diversity (richness, a.k.a. number of observed taxa) between exudates (mucilage, wax) and, within each exudate, between categories of development (60 v. 90 DAE), fertilization (nitrogen-fertilized, unfertilized), and year (2020, 2021) using the Wilcoxon rank sum test with continuity correction. S2. Excel file. Bacterial isolates from wax and mucilage and their taxonomy based on full-length 16S rRNA gene Sanger sequencing. The isolates that shared 100% sequence identity to short-read bacterial ASVs (Amplicon Sequencing Variants) are indicated and mapped to the ASV ID.

Supplementary Table

Supplementary Table


Gadda et le néoréalisme. (accompagné de quelques notes sur les réalismes) (texte d'une communication donnée lors d'un colloque à l'université de Nice en 2000. Une version remaniée et augmentée de ce texte a ensuite été publiée dans l'ouvrage collectif Littérature et cinéma néoréalistes : réalisme, réel et représentation, publié par L'Harmattan en 2004)

C'est par le second segment du titre général du colloque qui nous réunit, « réalisme, réel et représentation », que j'entrerai en matière, en proposant d'abord de définir deux modes théoriques du réalisme. Je situerai ensuite la poétique de Gadda par rapport à chacun de ces deux réalismes, ce qu'illustrera Un'opinione sul neorealismo (titre d'un papier qu'il signe en 1950). Il ne s'agira pas pour moi d'envisager le néoréalisme sous l'angle historique, maisdans l'optique qui était d'ailleurs celle de Gadda -de questionner l'idée de réalisme d'un point de vue conceptuel, d'où faire apparaître, à la fin, quelques complications politiques attachées à toute argumentation se réclamant d'une prise directe avec le réel.

Définitions.

Quels sens peut prendre la notion de réalisme d'une représentation (artistique, ou autre) ? Pour les besoins de cet exposé, mais sans exclure l'éventualité d'une validité opératoire plus large, je propose de distinguer deux types de réalisme, qui peuvent être, on va le voir, non seulement distincts mais opposés l'un à l'autre. D'une part, le « Réalisme iconique » ou « descriptif », ou « formel », qui se propose de représenter le réel, de donner une image fidèle de ce que présente le réel lui-même. Il s'agit, en quelque sorte, de calquer l'image sur le modèle réel. Par métaphore, on pourrait aussi parler de réalisme « photographique ». D'autre part, le « Réalisme syntaxique » ou « logique », ou « structurel », qui entend construire une image selon des règles identiques à celles qui gouvernent le réel, une image dont l'architecture logique serait celle de la réalité même. Il ne s'agit plus de calquer, naïvement, ce que le réel donne à voir, mais de travailler à la manière de la réalité : « ars imitatur naturam… in sua operatione ». Le réalisme ici entend « travailler comme la nature, non exprimer la nature ». La phrase est de Picasso, ce qui montre assez la difficulté qu'il peut y avoir à concilier ces deux réalismes.

De l'impossible réalisme formel.

Je viens de faire allusion à une naïveté du réalisme formel. L'oeuvre de Gadda atteste, d'une manière à certains égards novatrice, de sa pure et simple impossibilité. Si on la poursuit de façon cohérente et honnête, l'ambition du réalisme formel conduit à une manière de chaos, pour les trois raisons, intimement coordonnées entre elles, que voici :

• Première raison : aucun objet réel n'est simple, refermé sur soi-même, aucune chose n'est

une enclave isolée dont on pourrait calquer les contours et la moire. Des connexions multiples relient entre eux les objets réels, qui s'accomplissent peut-être même dans d'autres dimensions, hors celles qui nous sont accessibles : « la considerazione di un oggetto finito costringe la nostra mente a riconoscere l'esistenza di tutto il noto, di tutto il pensabile, ed altro ancora » (Meditazione Milanese,in Scritti vari e postumi,p. 646) écrit par exemple Gadda en 1928, dès l'aube de sa carrière, dans cette Meditazione milanese qui est son laboratoire narratologique. Toute chose pouvant renvoyer à n'importe quelle autre, les liens entre les choses advenant en tous sens, à travers l'espace, le temps, et qui sait quoi, suivre « fidèlement » le réel « contraint » à des digressions sans fin. D'où cette page embrouillée typiquement gaddienne, qui cherche à re-présenter, à re-produire le « mostruoso groviglio della totalità » réelle.

• Deuxième raison : en essayant de calquer le réel, non seulement on embrouille sans retour les figures, mais de surcroît on se leurre. Ce n'est pas le réel que l'on calque, mais seulement l'idée que l'on s'en fait, l'apparence qu'il prend, compte tenu de l'état actuel de la connaissance de l'individu ou de l'époque qui regarde. Apparence provisoire, destinée à se modifier d'une manière qu'on ne saurait prévoir, comme le sous-entend Gadda lorsqu'il envisage par exemple que tombe un jour en désuétude le pilier maître de la pensée occidentale sur le monde : « Nei millenni futuri l'applicazione del principio di causa apparirà una grossolana superstizione » (Meditazione Milanese, SVP, p. 651)

• Troisième raison, qu'on vient d'apercevoir : le réel n'est pas une entité stable et autonome, pourvue une fois pour toutes d'une existence indépendante de nous qui l'observons, y vivons, y agissons. À l'inverse, nous contribuons sans cesse à le modeler, et notamment par la production d'actes de langage. La parole n'est pas seulement la retranscription dans un mode intangible de ce qui est ou fut dans le monde tangible ; elle est aussi pré-diction, pré-disposition, pré-figuration de ce qui sera physiquement, elle oriente et crée les événements réels. Ici, la guerre, appelée vivement pendant des décennies par plusieurs générations d'artistes et d'intellectuels, en Italie et en Europe, et finalement obtenue, doit n'avoir jamais cessé d'être pour Gadda, bien qu'il n'en parle jamais directement sous cet angle, une démonstration à l'échelle mondiale du pouvoir réellement créateur des mots. Pouvoir que les événements qui marquèrent ensuite l'histoire de l'Europe ne firent que confirmer, conduisant Gadda, en 1936, à ébaucher la théorisation d'une implication motrice du dire dans le faire : « un vizio della espressione influisce nei giudizi, e però negli atti di un uomo o d'un collegio di uomini… » ( Meditazione breve circa il dire e il fare (1936), in Saggi Giornali e Favole, t. I, p. 444) C'est ici que prend racine la gaddienne dénonciation de la « monolingua », qui risque toujours d'engendrer le dogme d'une pensée unique, donnant à son tour lieu à une action unidirectionnelle, et à un monde mono-maniaque : « L'errore consiste nel "faraonizzare" l'opinione del momento : e i segni e i mezzi di codesta espressione. » (Processo alla lingua italiana (1942), SGF I, p. 494) La page apparemment chaotique de Gadda naît pour moitié (on va voir bientôt l'autre pan) de cette critique fondamentale du réalisme « formel ». La structure du Pasticciaccio, qu'on peut comparer à celle de ce que la physique actuelle appelle les « systèmes chaotiques », où la connaissance du Tout serait le nécessaire préalable à la connaissance d'une quelconque partie donnée, cette structure narrative est la marque d'un refus, en tout cas d'une impossibilité de soumettre la représentation artistique à l'impératif d'imiter quelque parodie de réel.

L'ambition du réalisme structurel.

Compte tenu de ce qui précède, on s'attendrait à pouvoir désigner en Gadda un parangon de l'antiréalisme. Quant au réalisme « descriptif » ou « formel », c'est tout à fait possible, en effet : ce que montre l'écriture de Gadda, c'est que la représentation artistique ne peut pas être le calque de la réalité, celle-ci restant toujours infiniment trop vaste et enchevêtrée.

Mais quant au réalisme « syntaxique » ou « structurel », on peut dire que Gadda poursuit au contraire un projet parfaitement et consciemment réaliste. En même temps que le rejet du réalisme « formel », c'est l'ambition d'un réalisme « structurel » qui est à la base de sa revigorante critique de la langue figée dans ses conventions : l'ambition non d'une écriture qui suive les règles imposées par l'usage, les normes du beau parler, les modes du moment, etc.en somme les codes du réalisme formel -mais d'une écriture qui épouse la syntaxe du monde lui-même : d'une écriture dont les fondements seraient naturels. C'est ainsi que Gadda, pour se défendre des critiques que son écriture luxuriante lui vaut, invoque l'argument d'une prise immédiate avec le monde tel qu'il va : « il grido-parola "barocco è il G. !" potrebbe commutarsi nel più ragionevole e pacato asserto : "barocco è il mondo, e il G. ne ha percepito e ritratto la baroccagine » (Appendice à La cognizione del dolore, in Romanzi e Racconti, t. I, p. 760) On peut interpréter de même toutes les occasions où Gadda légitime son discours en invoquant quelque « veridica istoria », sa « penna veridica », une « palese verità », rapporte ses démonstrations à un « natural meccanismo », à un « meccanismo di natura »… (Eros e On voit maintenant comment le refus du réalisme « formel » est le pendant exact de l'ambition du réalisme « structurel ». On ne peut proposer, montre Gadda, aucune image réaliste du monde si l'on suit de manière réaliste les lois de représentation dictées par le monde. C'est ainsi que la contradiction entre galimatias et nomenclature est la plus solide constante de l'écriture gaddienne : dans un paradoxe qui n'est donc qu'apparent, le désordre formel pointe toujours l'hypothèse d'une stricte organisation structurelle.

Chez ce maître de la digression, de l'interlude, du fouillis, du désordre baroque, ne cesse pourtant jamais d'agir une opiniâtre tension vers le Maître Plan du Monde. Disciple de Leibniz, auquel il voulut consacrer une « tesi di laurea » jamais menée à terme, Gadda conçoit la raison humaine comme fragment de la Raison totale, et donc les processus de la pensée consciente comme analogues aux Mécanismes universels. C'est ici que l'on peut comprendre certaine fascination de l'ingénieur-écrivain Gadda pour les réalisations techno-scientifiques humaines : elles sont pour lui à la fois comme les preuves que l'homme s'abouche à l'Ordre même des choses, et comme les métonymies, les épiphanies de cet Ordre. C'est dans un texte où il est question de la guerre que l'on en trouve, je crois, un des meilleurs exemples. Il s'agit de Manovre di artiglieria da campagna, esquissé en 1924, achevé et publié en 1928. Ce qui, pour le soldat jeté dans le combat, n'est que chaos infernal, n'est tel qu'à cause de la partialité de sa vision. Un point de vue extérieur, une omniscience diégétique permet au contraire d'entrevoir la Perfection surhumaine, l'invariante Hiérarchie qui règle le carnageune Transcendance dont l'exactitude mathématique des calculs balistiques ou des trajectoires des éclats d'obus est à la fois le paradigme et la preuve ontologique. On pressent, c'est bien le moins, des implications politiquesassez bien admises désormais quant au Futurisme, moins volontiers envisagées si c'est de Gadda qu'il s'agit -dans cette magnification de la guerre… Gadda est donc un écrivain éminemment réaliste, au sens du réalisme « logique », « syntaxique », ou « structurel ». Un écrivain fanatiquement réaliste, même, j'oserai dire « ultraréaliste ». J'entends ici le contraire exact de surréaliste, si le surréalisme consomme la rupture d'avec la logique qui réglemente les processus mentaux de la vie rationnelle consciente, et donc notre idée de la réalité. L'ultraréalisme exaspère au contraire cette logique rationnelle : à peine débouté, comme on a vu, le « principio di causa », voici que Gadda le réintroduit amplifié, par la poétique des « causali », des causes multiples et concomitantes. C'est encore l'ultraréalisme qui dicte les saillies acerbes envers les formes du mysticisme en art, les moqueries condescendantes envers le rêve, la poésie, le mythe… C'est que ce sont autant de créations qui donnent l'image d'un mode de fonctionnement de l'esprit propre à faire douter que la raison raisonnante soit, en effet, un reflet miniature des Lois souveraines de l'univers, et même à faire douter que de telles Lois nous soient d'aucune façon concevables. L'ultraréalisme gaddien, loin de porter la contestation au coeur de tout réalisme possible, tend au-delà des réalismes connus, mais dans la même direction qu'eux.

Tout ce qui précède se résume de manière très claire dans la façon dont Gadda conduit sa critique du néoréalisme : « Nella "poetica" del neorealismo, quale mi si è rivelata da alcuni esempi, direi che ogni fatto, ogni quadro è (cioè riesce ad essere) nudo nocciolo, è (cioè riesce ad essere) grano di un rosario dove tutti i grani sono giustapposti ed eguali di fronte all'urgenza espressiva. Enumerati in serie, infilati in una filza, questi fatti avvicinati così per "asindeton" non vengono coordinati in una consecuzione che valga a più profondamente motivarli, a disporli in una architettura, quella che essi realmente ebbero…Direi che la poetica neorealistica riesce a un racconto astrutturale, granulare. » « Un lettore di Kant non può credere in una realtà obbiettivata, isolata, sospesa nel vuoto ; ma della realtà, o piuttosto del fenomeno, ha il senso come di una parvenza caleidoscopica dietro cui si nasconde un "quid" più vero, più sottilmente operante, come dietro il quadrante dell'orologio si nasconde il suo segreto macchinismo. » (Un'opinione sul neorealismo, SGF I, p. 629-630. Je souligne) La dénonciation n'est pas sans fondement de l'erreur des réalismes, qu'ils soient néoou non, lorsqu'ils croient en une réalité en soi, prennent l'apparence pour l'essence, méconnaissent la complexité mouvante du réel, au profit d'une juxtaposition naïve de faits artificiellement arrêtés, isolés et objectivés. On retrouve les grandes lignes du refus de tout réalisme formel, de tout réalisme qui ignore l'enchevêtrement invisible des connexions infinies, se contente de calquer l'image superficielle d'un réel simpliste. Mais on voit que Gadda, en formulant sa critique, invoque à son tour l'argument réaliste, se réclame de cet autre réalisme que j'ai appelé « structurel » : il présuppose qu'il est une architecture véridique des événements, que le monde est régi par quelque mécanique ou mécanisme invisibles, quelque noumen, d'ailleurs platonicien plutôt que kantien, en tout cas isomorphe aux schémas de notre techno-science, et que l'art peut donc la révéler et la reproduire. La même idéologie sous-tend le jugement porté en 1954 sur Dali, dont la peinture résulterait d'une déformation semblable à celle, supposément opérée par le rêve, des « images réelles » (SGF I, p. 1115), images réelles qu'il faut donc supposer clairement établies et formées d'avance. Or le rêve n'est pas un mode subalterne du fonctionnement de l'esprit, mais une activité autonome de mise en images du monde, dont rien ne dit qu'elle soit au réel dans un rapport moins profond de vérité que la vie consciente.

Comme pour tant d'autres sujets qu'il aborde, Gadda conduit sa critique de l'intérieur de ce qu'il dénonce : de même qu'il reprochait à l'armée italienne d'avoir manqué de militarisme (Il castello di Udine, 1934), de même qu'il fustigeait le fascisme sur des critères en partie communs à l'idéologie fasciste (Eros e Priapo, 1944), de même il condamne un réalisme au nom d'un autre.

Chez Gadda, chez d'autres aussi je pense, les arguments esthétiques et gnoséologiques sont rarement étrangers à une perspective politique. Trois ans avant de publier son opinione sul neorealismo, écrivant à son cousin Piero à propos des « pittorastri, poetastri, scrittorastri » qui, après-guerre, instruisent (partialement, sans doute) le procès du fascisme, Gadda s'insurge, dans ce qu'on doit bien appeler un réflexe de classe : « Essi insultano la "borghesia milanese" attribuendole tutte le colpe di tutti i mali dell'universo e sapendo che io provengo da essa ed ho delle persone a me care e stimabili che appartengono ad essa. » (Lettre du printemps 1947, in Piero GADDA CONTI, Le confessioni di Carlo Emilio Gadda, Milan, Pan editrice, 1974, p. 66) Et quelques années plus tard, commentant la sortie de Rocco e i suoi fratelli, Gadda mêle à nouveau l'irritation teintée de mépris politique à l'argument esthétique, et cela, de son propre aveu, préalablement à la vérification du bien-fondé de l'attaque : « Quanto al film di Visconti non l'ho visto e forse non lo vedrò mai, perché la poveraglia siculocalabro-sardignola ed il vilipendio della borghesia (immagino) del Nord mi hanno francamente stufato (esteticamente) e irritato (moralmente). » (Lettre du 30 octobre 1960, Ibid, p. 112) Pour dépasser l'anecdote et aller plus loin dans cette réflexion, il faut maintenant porter le regard sur la question, à proprement parler fondamentale, que j'ai jusqu'ici tenue à distance, et qui, comme souvent les questions fondamentales, concerne une frontière : celle que le réalisme exige entre des notions comme réel et représentation du réel, vérité et artifice, réalité et idée sur la réalité…

Quelques considérations heuristiques.

Il paraît à première vue parfaitement naturel de séparer, même d'opposer ces motsconcepts : nul doute, se dit-on, qu'une partie des faits et des événements dont l'humain est acteur ou témoin relèvent de ce qui est vraiment (l'histoire, la matière, la certitude, la preuve, le fait, le monde objectif…), tandis qu'une autre ressortit à la sphère de ce qui n'est pas vraiment, ou vraiment pas (l'imagination, le rêve, l'illusion, le mythe, l'idée, l'impression subjective…).

Pourtant, toutes ces notions sont infiniment loin d'aller de soi. Elles ne peuvent s'extraire du cercle tautologique, elles ne peuvent qu'affirmer la frontière entre réel et fictif, entre réalité et rêve qu'elles ont dû pré-supposer, tracer d'abord pour se définir. Ce faisant, elles sanctionnent une distinction historiquement récente et géographiquement locale, qui n'a ni la même force d'évidence, ni le même tracé, ni le même rôle pour toutes les cultures et pour toutes les époques (qu'on songe aux songes dans l'Antiquité). Qu'importe alors que l'on hiérarchise les deux catégories dans un sens ou dans l'autre, que l'on considère avec les scientistes que les figurations les plus apparemment immatérielles « ne sont que littérature », ou que l'on estime que l'art ou le rêve sont « quelque chose de plus » que l'hypothétique réalité brute : dans un cas et dans l'autre, on croit certaine la ligne de partage, du moins certaine la possibilité d'une ligne de partage entre ceci et cela.

Or non seulement cette ligne ne nous est pas connue ; mais rien ne permet de surcroît d'assurer qu'elle est réellement, qu'elle est dans l'ordre des choses. Il est des entités auxquelles on décerne d'emblée un passeport d'entrée dans la réalité, qui n'ont pourtant pas de légitimité autre que celle de créatures qu'on range tout aussi préremptoirement parmi les fantasmes-fantômes de l'esprit. Le fait qu'une grande majorité de personnes n'ait jamais touché de personnages de roman, observé l'effet physique d'un voeu, d'un rêve ou d'un sort, vu de fantômes, ne prouve pas que ces choses ne sont pas réellement. L'exemple pourra faire sourire, mais personne, pourtant, ne songerait à douter de l'existence réelle des atomes ou des étoiles lointaines, alors que nul d'entre nous ne les a réellement jamais vus ni touchés, jamais vus ni touchés comme choses immédiates. C'est sans doute ce à quoi pensait Alain Jouffroy, lorsqu'il écrivait : « Certaines limites sont hallucinatoires. Vous regardez devant vous et vous ne voyez rien ? Regardez le ciel : des années-lumière touchent votre rétine… N'est-ce pas l'utopie en action ? Vous faites trop de cas de toutes ces images ! » (Alain JOUFFROY, Trajectoire, Paris, Gallimard, 1968, p. 94) Ici ou là, on ne voit et touche que des images. Celles que notre imagination et nos sens, bornés en nombre et en acuité, nous permettent de concevoir ; celles aussi que nos croyances et nos connaissances, conditionnées par un espace-temps culturel donné, nous laissent oser élaborer ou entrevoir. Mais on ne saurait sans un risible égo-ethno-centrisme, et une flagrante absence de mémoire (la terre hier encore était plate), inférer que cela n'existe pas, de ce que nous n'en avons paspas encore -eu personnellement ou collectivement l'expérience. S'il faut bannir les figurations « imaginaires » de l'ordre du réel, quel est donc ce réel dont l'esprit humain doit lui-même en si grande partie s'exclure ? Et à l'inverse, une personne ou une civilisation qui, par exemple, croient que les esprits des morts rôdent aux abords du monde des vivants, ne nouent-elles pas avec eux des rapports objectifs et efficients ? Les recherches et pratiques de Tobie Nathan montrent par exemple que les « fantômes » peuvent être « utilisés », auprès d'individus pour qui ils existent, à des fins thérapeutiques très concrètes, par des scientifiques pourtant formés à l'école rationaliste occidentale. Une époque qui voit partout la main de Dieu ou Diable ne trouve-t-elle pas maintes confirmations concrètes de la véracité de sa pensée ? Sous la conviction que la démarcation est nette, sinon pour nous, du moins pour la « nature », entre fiction et réalité, se dissimule la certitude néoscientiste qu'il y a une réalité brute, qu'elle s'organise sur des schémas logiques analogues à ceux que nous pratiquons, et qu'on doit donc pouvoir en avoir une intelligence directe. Si tel était le cas, on devrait obtenir des sciences de la nature, par exemple la physique ou la biologie, des réponses claires sur ce point, et la désignation précise des objets (j'entends objet au sens large : choses et relations entre les choses) immédiats. Mais aucun scientifique sérieux ne se risquera à en dresser la liste : car il n'est, à l'échelle humaine, aucun objet immédiat. La vie, la littérature, la science sont également des lieux de médiation, d'interprétation, d'invention : l'arbre réel n'est pas davantage enfermé dans l'image qui se forme sur la rétine que Caligula dans la pièce de Camus ; notre ami n'est pas plus contenu dans les idées que nous nous faisons de lui que le Soleil dans les équations qui décrivent son mouvement. À chaque fois, le réel est ce qui déborde les formules rassises, le réel est cette impossibilité de se laisser contenir : ce qui exsiste se tient en-dehors de notre saisie. Nous ne sortons jamais du labyrinthe des métaphores sur le Monde, sur la Réalité, second terme éternellement absent de toutes nos figures de style. Les fondements de la pensée « sont l'oeuvre de la libre activité de notre esprit », sont des « décrets [qui] s'imposent à notre science », mais « ils ne s'imposent pas à la nature » : « D'où viennent les principes de la géométrie ? Nous sont-ils imposés par la logique ? Lobatchevski a montré que non en créant les géométries non euclidiennes. L'espace nous est-il révélé par nos sens ? Non encore, car celui que nos sens pourraient nous montrer diffère absolument de celui du géomètre. La géométrie dérive-t-elle de l'expérience ? Une discussion approfondie nous montrera que non. Nous conclurons donc que ces principes ne sont que des conventions. » (Henri POINCARE, La Science et l 'Hypothèse, Paris, Flammarion, 1920) Gadda entrevoit ce vertige qui saisit l'entendement de celui qui découvre que « ignoriamo il soggetto di ogni proposizione possibile » (La cognizione del dolore, RR I, p. 636). C'est Gonzalo qui est chargé d'énoncer ce théorème de l'insondable incompétence de l'homme à tenir aucun discours en prise sur aucune chose réelle. Mais hormis quelques moments de La cognizione del dolore, l'essentiel de l'effort gaddien consiste, au contraire, à tenter d'éreinter l'angoisse de ce vide sous l'accumulation encyclopédique, cyclopéenne, des éruditions, des nomenclatures, des vérités attestées. Dans La cognizione, c'est un raté qui parle, un fou qui finit par tuer, tuer sa mère, et de ce meurtre symbolique et sans doute thérapeutique naîtra un personnage encore bouillant, certes, mais réconcilié, à un degré accru d'optimisme intellectuel, avec la raison, la logique, le savoir officiel : Ingravallo, en quête de l'ordre intrinsèque du monde. Quête sans fin, bien sûr, car cet ordre est trop vaste pour nos capacités ; mais à l'image de la perfection structurelle des pierres précieuses, il est ; il est en soi, et peut se révéler, partiellement, localement, mais parfaite et objectivement à l'homme. Il s'agit encore, comme on voit, de l'ambition d'un réalisme « structurel » absolu.

L'idée selon laquelle la raison humaine touche au socle même des choses, loin d'être propre à Gadda, sous-tend et soutient de longtemps d'immenses secteurs de l'entreprise cognitive occidentale. Ainsi, bien que la pointe la plus avancée de la pensée actuelle, dans divers domaines fondamentaux, ne s'envisage plus elle-même de cette manière, on continue couramment à dire de la science qu'elle « découvre », fait des « découvertes », c'est-à-dire à postuler un « fond des choses » que çà et là nous mettrions à nu.

De quelques complications politiques.

Je dis « nous », et résonne aussitôt, en forme de question, la deuxième proposition du titre d'un remarquable essai de Tzvetan Todorov : « et les autres » ? (cf. Tzvetan TODOROV, Nous et les autres. La réflexion française sur la diversité humaine, Paris, Seuil, 1989). Les autres, nous leur avons plus d'une fois et en plus d'un endroit imposé, comme une et indivisible, une vision du monde qui, parfois, avait surtout pour elle la poudre et la chair à canon. On l'aura compris : je voudrais envisager quelques complications politiques qui, fût-ce par inadvertance, peuvent s'attacher aux revendications réalistes.

On peut avoir quelque réticence à regarder cet aspect. Il est vrai qu'une certaine « monolingua » universitaire nous prépare bien plus sûrement à penser nos activités comme traçant un champ clos et séparé, qu'à entendre la com-plication, la co-implication entre eux du politique et de l'artistique, du politique et du philosophique, du politique et de l'esthétique. Il est vrai aussi que le thème est difficile et risqué : personne n'ignore ce qu'il peut en coûter de transgresser, même au sens simplement étymologique, les frontières instituées. Mais la recherche le commande parfois, mais la pensée n'avance guère dans les voies obligées, dans la crainte des interdits et le respect des sens uniques. Je me limiterai ici à quelques esquisses, sur une question à laquelle ni la difficulté, ni le risque, ni la prétendue « mort des idéologies » cette mode épistémologiquement toujours déjà démodéene devraient nous décourager de réfléchir.

Qu'on l'entende au sens de l'histoire de la littérature ou dans une acception ordinaire, qu'on l'envisage « formel » ou « structurel », le « réalisme » se réclame d'une coïncidence entre réalité et pensée dont Bachelard dit qu'elle est un « véritable monstre épistémologique ». Une pensée qui, pour asseoir ses préférences, les décrète « réalistes », qui tente ainsi de leur et de se donner un sceau de vérité incontestable, parce que directement abouchée au monde réel, directement en phase avec les choses-en-soi, pactise avec ce monstre. Monstre qui n'est pas seulement épistémologique, mais encore politique. Car la ligne de démarcation rêve/réalité que postule pour se fonder tout réalisme, en quelque lieu qu'on la situe, est déjà idéologique, en tant qu'elle partage implicitement le monde en vrai et faux, et ses habitants en sensés et déments, en réalistes et utopistes, en objectifs et idéologues, en primitifs et civilisés, en mythomanes et scientifiques, et variantes innombrables… Le réalisme comporte ainsi toujours le risque du dogmatisme le plus violent : c'est au plus fort de sa période réaliste, quand elle envisageait par un sinistre contresens la structure du cerveau humain comme identique à celle des machines électriques, que la médecine a imaginé de « soigner » des gens par la torture électrique.

Se réclamer sans explications du « réalisme », en art ou dans la vie, prétendre montrer ou savoir les choses telles qu'elles sont ou vont, perdre de vue que toute réalité humaine s'élabore relativement à des conventions largement arbitraires, toujours modifiables, donc à soumettre sans cesse à la critique, y compris quant à l'expérience sensorielle, croire qu'on parle de et depuis le socle ontologique, tout cela relève d'une erreur dont les conséquences peuvent être tragiques. Personne ne peut se targuer de connaître la réalité de référence, les inventions les moins apparemment réalistes (était-il "réaliste" de supposer que la terre est ronde, suspendue dans rien, en rotation sur elle-même ? Est-il "réaliste" de décrire l'univers comme "en expansion" ? Et dans ce cas, qu'est-ce que la pensée "réaliste" place au-delà des confins du cosmos ? Faut-il alors dire qu'il est, outre qu'en expansion, infini ? La notion d'infini est-elle "réaliste" ?) peuvent donner lieu à de très réelles conséquences, et les objets "réels" que nous manipulons n'en sont pas moins des abîmes où l'esprit est saisi, s'il les regarde vraiment, d'un vertige sans remède : le nombre π (dont on ignore la valeur exacte, puisque la série des chiffres qui suivent sa version approximative est infinie, de sorte qu'on ne connaît réellement la surface d'aucun cercle, ni la surface ni le volume d'aucune sphère, d'aucun cylindre, etc.) appartient à ce qu'en arithmétique on appelle, justement, l'ensemble des nombres... « réels ». Dans l'oeuvre de Gadda, sans que j'entende en contester l'importance, on voit souvent agir une erreur de ce genre, une conception où la chose et la règle se pensent consubstantielles : « Aveva [Gonzalo] della legge, un concetto sui generis ; non appreso alla lettura dell'editto, ma consustanziato nell'essere, biologicamente ereditario » (La cognizione del dolore, in RR I, p. 650). Il s'agit ici de la loi au sens juridique, mais le constat d'un chevillement de la règle à l'être a chez Gadda une portée générale. Et parfois, notamment dans les textes écrits entre 1915 et 1944, la menace politique que comporte cette erreur n'est plus tout à fait aussi théorique, aussi exempte de collusions avec des violences historiques qu'on voudrait s'en persuader. Un seul exemple parmi d'autres. Lorsqu'il invoque le « natural meccanismo », c'est pour appuyer l'idée que la femme est un être biologiquement inférieur à l'homme, « femmina-materia » que l'homme-esprit sculpte, et c'est cette malléabilité par les mâles dominants, et par le « mastio dei mastî » Mussolini, qui adit-ilpermis le fascisme.

Je n'y insiste pas davantage, mais je ne conçois pas d'escamoter de la poétique gaddienne le vaste pan de ses présupposés « ultraréalistes » et tous leurs corollaires, ni ne peux séparer son opiniâtre ambition-conviction de poser le discours sur la chose même, dans la vérité même, d'avec l'illusion où il demeura, plus d'une fois, en acquiesçant, tantôt docile tantôt enthousiaste, aux modes et aux raisons de la violence d'État.

[Comme souvent, quand la critique est réticente à voir mêlés littérature et politique, elle court le risque de trahir l'auteur ou le thème qu'elle voulait servir et défendre. Gadda était parfaitement conscient des implications politiques de l'art, et, au moins jusqu'à la fin des années 1930, très fier du rôle qu'il estimait avoir à jouer. En témoigne, dès l'aube de sa carrière, son Giornale… d'écrivain-soldat ; en témoigneront ensuite les pages de célébration militariste, colonialiste et nationaliste du Castello de 1934 ; une recension élogieuse du journal de guerre d'Emilio De Bono en novembre 1935, qui fait le lien explicite avec la guerre en cours cette année-là (« l'uomo che conduce oggi le operazioni militari nell'Africa parla ai nostri animi "assetati di cose vere" il linguaggio delizioso della verità », SGF I, p. 799) ; puis, dans un effort inverse, la tentative (difficile à mener à bien, on voit pourquoi) de pamphlet antifasciste en 1944. Année qui marque peut-être un tournant, mais pas une rupture, puisque le Pasticcaccio affiche encore, et à plus d'un titre, l'intention politique.] Si « la réalité est une fiction partagée du monde », comme le dit joliment mon ami l'écrivain de théâtre Frédéric Thabault, le réalisme peut-il être autre chose qu'un conformisme, dont l'exaltation belliciste, dont l'exultation fasciste ont donné le terrible exemple ? Autre chose qu'une mise en conformité du discours, de la pensée, des représentations, avec les formes et les préceptes que le moment nous dicte, et qu'incapables de nous hisser hors notre propre historicité, nous prenons pour des commandements souverains de la Réalité ? Je ne peux réellement pas répondre. Mais justement parce qu'elle demeure ouverte, la question m'incite, j'entends quant à la recherche et à la pensée, à garder en éveil une méfiance envers les toujours suspects « principes de réalité ».

Christophe Mileschi

Priapo, in Saggi Giornali e Favole, t. II, respectivement p.237, p. 304, p. 351, p. 329 et p. 257)