Camille Cohier

Lucie Chevillard

Patricia Risède

Olivier Roussel
email: olivier.roussel@gendarmerie.interieur.gouv.fr

Bruno Mégarbane
email: bruno-megarbane@wanadoo.fr

Sophie Salle

Anne Fontova

Respiratory effects of buprenorphine/naloxone alone and in combination with diazepam in naive and tolerant rats

Keywords: Buprenorphine Naloxone Diazepam Respiratory depression Whole-body plethysmography BUP, buprenorphine, NLX, naloxone, BZD, benzodiazepine, DZP, diazepam, GABA, gamma-aminobutyric acid, FLZ, flumazenil, f, respiratory frequency, VE, minute volume, VT, tidal volume, TE, expiratory time, TI, inspiratory time, TTOT, respiratory cycle duration, ip, intraperitoneal, iv, intravenous, sc, subcutaneous

Article 1 -Respiratory effects of buprenorphine/naloxone alone or in association with diazepam

Aux anciens étudiants de l'équipe pharmacologie cérébrale (EA 4475)

Et oui, je suis la petite dernière du groupe. Un grand merci à Gemma, Eleni, les deux Maries, Mohamad, Haymen, Tiphaine, Magalie, Cindy, Marine, Claire pour votre soutien continuel à tous les niveaux et les moments de joie partagée depuis de longues années. Soyez assurés de ma profonde amitié.

A « mes morues » qui se reconnaitront facilement

Vous m'avez toujours écoutée dans les moments de doute, m'avez toujours aidée à retrouver motivation, sourire et joie de vivre. Merci pour tout. Sans vous, cette thèse aurait été différente. Soyez assurées de ma profonde amitié.

I. INTRODUCTION

Les intoxications par opioïdes représentent aux Etats-Unis depuis les années 2000, la première cause de décès toxique par psychotropes [START_REF] Jones | Pharmaceutical overdose deaths, United States[END_REF]. La circonstance principale de ces overdoses fatales est le mésusage des analgésiques opioïdes, à la suite d'une automédication avec développement d'une addiction, le tout facilité par la multiplication des prescriptions de ces produits rendue possible par une réglementation plus souple et la mise à disposition de nombreuses spécialités pharmaceutiques avec des formulations variées [START_REF] Jones | Sources of prescription opioid pain relievers by frequency of past-year nonmedical use United States, 2008-2011[END_REF]. Prenant à bras le corps ce problème majeur de santé publique, les autorités sanitaires américaines ont poussé l'industrie pharmaceutique à renforcer la sécurité des produits mis sur le marché afin de réduire le mésusage. Ainsi, les campagnes de sensibilisation du grand public aux risques de l'utilisation des opioïdes et la modification en 2010 de la formulation de l'Oxycontin ® (chlorhydrate d'oxycodone), médicament dont l'usage abusif est fortement marqué aux Etats-Unis, pour des comprimés non-écrasables et difficilement injectables par voie veineuse se sont rapidement accompagnées du plafonnement du nombre de décès par overdose aux opioïdes mais aussi, malheureusement, d'une hausse significative et inattendue du nombre de décès par overdose à l'héroïne [START_REF] Dart | Trends in opioid analgesic abuse and mortality in the United States[END_REF].

Ces données épidémiologiques ont mis en lumière, le risque de dérive de patients dépendants et abuseurs d'analgésiques légaux vers la consommation d'héroïne, l'un des stupéfiants les plus dangereux qui existe [START_REF] Compton | Relationship between nonmedical prescription-opioid use and heroin use[END_REF].

La toxicomanie aux opioïdes est une préoccupation mondiale puisqu'elle concernait en 2014 environ 17,4 millions de personnes (UNODC, 2016). Selon le rapport des centres Antipoison américains de 2014 [START_REF] Mowry | Annual Report of the American Association of Poison Control Centers' National Poison Data System (NPDS): 32nd Annual Report[END_REF], les opioïdes étaient responsables de 220/1173 décès toxiques déclarés (7,89%) avec une certaine stabilisation après l'augmentation importante des dix dernières années.

Aujourd'hui, deux produits de substitution ont une autorisation de mise sur le marché (AMM) en France dans cette indication : la méthadone (Méthadone AP-HP ® ; sirop ou gélule), utilisée dès le début des années 1970 et, à partir de 1995, la buprénorphine haut-dosage (BUP ; Subutex ® et médicaments génériques depuis 2006 ; comprimés sublinguaux (SL)). À ce jour, environ 110 500 patients reçoivent un traitement quotidien par BUP contre 59 500 par méthadone (OFDT, 2015). Cette spécificité française s'explique par des facilités de prescription de la BUP en comparaison à la méthadone : prescription possible par tout médecin et dispensation en officine de ville [START_REF] Gatignol | Opiate replacement therapy in France[END_REF]. Les autorités sanitaires françaises avaient préféré une prescription plus large de la BUP en raison de ses propriétés pharmacologiques. Par ailleurs, selon l'ANSM, 140 décès sur les 310 recensés liés à la prise de médicaments ou de substances étaient liés à la prise de méthadone (soit 45 % des décès) et 47 (15%) à la BUP.

I.1. Propriétés pharmacologiques générales des opioïdes

I.1.1. Les différents opioïdes

Il existe trois types d'opioïdes : (1) les opioïdes endogènes (principalement enképhalines et endorphines), jouant un rôle dans le contrôle de la douleur ; (2) les opioïdes exogènes naturels extraits du Papaver somniferum comme la morphine ou les deltorphines, peptides extraits de peau de grenouille d'Amérique du sud ; (3) les opioïdes exogènes synthétiques comprenant les molécules dérivées de la morphine telles que l'héroïne appelés opiacés et les autres molécules de structure totalement différente de celle de la morphine comme la méthadone et la BUP.

I.1.2. Les récepteurs aux opioïdes

Les récepteurs aux opioïdes (RO) ont été caractérisés par l'utilisation de certains agonistes et antagonistes spécifiques dans des études in vitro et in vivo [START_REF] Shook | Differential roles of opioid receptors in respiration, respiratory disease, and opiate-induced respiratory depression[END_REF].

Il existe trois sous-types de RO, mu (µ), delta (δ) et kappa (ĸ), appartenant à la famille des protéines G hétérodimériques de type Gi/Go [START_REF] Bailey | Opioids: cellular mechanisms of tolerance and physical dependence[END_REF] et possédant des sites de phosphorylation intra-cytoplasmique permettant de moduler leur activité et leur degré de désensibilisation.

I.1.3. Localisation des récepteurs aux opioïdes

Même si les RO sont largement répartis au niveau du système nerveux central (SNC), ils n'y sont pas distribués de manière homogène. Ils sont situés plus particulièrement au niveau des sites de contrôle de la douleur comprenant :

-la moelle épinière : au niveau de la corne dorsale, ainsi que dans le noyau spinal du nerf trijumeau et du nerf glossopharyngien ;

-l'encéphale : au niveau de la substance grise périaqueducale, de certains noyaux du raphé du tronc cérébral, ainsi que de certains noyaux du thalamus et du système limbique comprenant l'hippocampe, l'amygdale et l'hypothalamus ayant un rôle dans la composante émotionnelle de la douleur.

Les RO se situent également au niveau de structures cérébrales impliquées dans le contrôle des fonctions secondaires activées par les opioïdes :

-les noyaux des faisceaux solitaires des afférences viscérales des nerfs vagues et glossopharyngiens expliquant certains effets attribués aux opioïdes comme la dépression, la toux, l'hypotension orthostatique (systolique) ; -l'area postrema, expliquant l'apparition de nausées et vomissements ;

-l'infundibulum hypothalamique expliquant les propriétés antidiurétiques ;

-le striatum et la substance noire, expliquant la diminution progressive de l'activité motrice et la rigidité musculaire.

I. 1.4. Effets pharmacologiques des opioïdes L'activation de la protéine G par liaison de l'opioïde sur son récepteur entraine l'inhibition de l'adénylate cyclase [START_REF] Herz | Opioids I[END_REF]. Il en résulte l'ouverture des canaux K + ainsi que l'inhibition des canaux Ca 2+ voltage-dépendants [START_REF] Duggan | Electrophysiology of opioids[END_REF], entrainant par conséquent la diminution de l'excitabilité neuronale et l'effet pharmacologique observé.

Parmi les RO-µ, les RO-µ1, ayant une haute affinité pour la morphine (KD < 1 nmol/L), semblent être responsable des effets analgésiques et les RO-µ2, de plus faible affinité (KD > 10 nmol/L) des effets dépresseurs respiratoires. Parmi les RO-δ, les RO-δ1 auxquels se fixe la D-Pen(2),D-Pen (5)]-enkephaline (DPDPE), sont responsables des effets analgésiques spinaux et les RO-δ2, auxquels se fixe la deltorphine, sont impliqués dans les effets analgésiques supra-spinaux. Enfin, les RO-ĸ sont divisés en 3 sous-types ; RO-ĸ1 responsable de l'analgésie spinale, RO-ĸ2 et RO-ĸ3 de l'analgésie supra-spinale.

Les opioïdes ont la capacité d'interagir avec les RO-µ, ĸ et/ou δ mais avec des affinités et des propriétés pharmacodynamiques (PD) différentes (Tableau 1). Sont alors distingués les agonistes faibles comme le tramadol, les agonistes partiels comme la BUP et les antagonistes purs comme la naloxone (NLX). semi-synthétique dérivé de la thébaïne, de formule brute C29H41NO4 et de masse molaire 467,65 g/mol. Peu soluble dans l'eau, cette poudre cristalline blanche possède un coefficient de partage octanol/eau (LogP) de 3,55. Le pKa de la BUP est égal à 8,31 [START_REF] Avdeef | Octanol-, chloroform-, and propylene glycol dipelargonat-water partitioning of morphine-6glucuronide and other related opiates[END_REF].

I.2.2. Propriétés pharmacologiques de la buprénorphine

La BUP possède une puissance analgésique 25 à 50 fois plus importante que la morphine [START_REF] Reisine | Opioid analgesics and antagonists[END_REF]1996). Elle agit comme un agoniste au niveau des RO-µ et comme un antagoniste des RO-κ avec une très grande affinité (mille fois plus que la morphine pour le RO-µ) [START_REF] Huang | Comparison of pharmacological activities of buprenorphine and norbuprenorphine: norbuprenorphine is a potent opioid agonist[END_REF][START_REF] Villiger | Binding of buprenorphine to opiate receptors. Regulation by guanyl nucleotides and metal ions[END_REF][START_REF] Villiger | Buprenorphine : characteristics of binding sites in the rat central nervous system[END_REF][START_REF] Wood | Multiple opiate receptors: support for unique mu, delta and kappa sites[END_REF]. Elle se fixe aussi sur les RO-κ2 mais avec une affinité moindre. Sur ce récepteur, elle exercerait une faible activité antagoniste [START_REF] Huang | Comparison of pharmacological activities of buprenorphine and norbuprenorphine: norbuprenorphine is a potent opioid agonist[END_REF]. La BUP se dissocie lentement de ces RO-µ et κ avec des constantes de dissociation de 6,0 x 10 -12 et 4,0 x 10 -12 M, respectivement [START_REF] Huang | Comparison of pharmacological activities of buprenorphine and norbuprenorphine: norbuprenorphine is a potent opioid agonist[END_REF]. La courbe de dissociation de la BUP est en forme de U inversé, suggérant un modèle à deux récepteurs, appelé auto-inhibition non compétitive [START_REF] Sadée | Buprenorphine: differential interaction with opiate receptor subtypes in vivo[END_REF] et nécessitant l'augmentation de la dose optimale pour obtenir les mêmes effets.

La liaison de la BUP aux RO-µ est lentement réversible, réduisant de façon prolongée le besoin des toxicomanes en héroïne, et par conséquent entraînant une capacité plus faible à engendrer une pharmacodépendance, en comparaison avec les autres opioïdes [START_REF] Pickworth | Subjective and physiologic effects of intravenous buprenorphine in humans[END_REF][START_REF] Walsh | Acute administration of buprenorphine in humans: partial agonist and blockade effects[END_REF].

Aux fortes doses, la BUP diffère de la méthadone, agoniste complet des RO-µ, par son « effet plafond » lié à ses propriétés d'antagoniste partiel [START_REF] Walsh | Acute administration of buprenorphine in humans: partial agonist and blockade effects[END_REF][START_REF] Walsh | Clinical pharmacology of buprenorphine: ceiling effects at high doses[END_REF]. Cette

caractéristique pharmacologique (Tableau 2) lui confère une grande marge de sécurité d'emploi dans le traitement de substitution de la toxicomanie à l'héroïne, en limitant les effets dépresseurs neurologiques et respiratoires en cas de survenue d'un surdosage.

Tableau 2 -Propriétés pharmacologiques comparative de la méthadone et de la BUP I.2.3. Pharmacocinétique de la buprénorphine La BUP possède une biodisponibilité réduite par voie orale en raison d'un métabolisme présystémique important [START_REF] Bullingham | Buprenorphine kinetics[END_REF][START_REF] Walsh | Clinical pharmacology of buprenorphine: ceiling effects at high doses[END_REF]. Administrée par voie sublinguale (SL), la voie préconisée, sa biodisponibilité est de 75 %. La BUP est fortement fixée aux protéines plasmatiques (96%), à l'albumine, aux γ-globulines, et glycoprotéines αacide, avec un pourcentage de liaison de 65,6%, 41,5%, et 84,9%, respectivement (Nanovskaya et al., 2009). Les concentrations plasmatiques de BUP décroissent de manière bi-exponentielle après administration SL de 4 mg de BUP [START_REF] Kuhlman | Human pharmacokinetics of intravenous, sublingual, and buccal buprenorphine[END_REF]. Chez l'homme, les paramètres pharmacocinétique (PK) sont les suivants (Elkader et Sproule, 2005): demi-vie variable (entre 3h et 44h selon les études), volume de distribution de 48 L/kg, et clairance de 100 mL/Kg/min. Chez l'homme, après injection intraveineuse (IV), la courbe d'élimination de la BUP est bi-ou tri-exponentielle [START_REF] Pickworth | Subjective and physiologic effects of intravenous buprenorphine in humans[END_REF][START_REF] Walsh | Acute administration of buprenorphine in humans: partial agonist and blockade effects[END_REF][START_REF] Walsh | Clinical pharmacology of buprenorphine: ceiling effects at high doses[END_REF][START_REF] Gopal | Characterization of the pharmacokinetics of buprenorphine and norbuprenorphine in rats after intravenous bolus administration of buprenorphine[END_REF][START_REF] Yassen | Pharmacokinetic-Pharmacodynamic Modeling of the Effectiveness and Safety of Buprenorphine and Fentanyl in Rats[END_REF].

Deux minutes après son administration, moins de 5% de la dose administrée est présente dans la circulation systémique, traduisant une diffusion tissulaire rapide. Après la phase de décroissance initiale rapide, la phase d'élimination, longue de 20 à 25 h, se fait à hauteur de 70% dans les selles, 30% dans les urines. La BUP est métabolisée, au niveau hépatique, par le cytochrome (CYP) P450 3A4, en formant par N-désalkylation, la N-désalkyl-BUP ou norbuprénorphine (NBUP). La BUP et la NBUP subissent ensuite une glucuro-conjugaison durant la phase II du métabolisme, formant la BUP-3-glucuronide et la NBUP-3-glucuronide [START_REF] Brewster | Biliary excretion, metabolism and enterohepatic circulation of buprenorphine. Xenobiotica Fate Foreign Compd[END_REF][START_REF] Cone | The metabolism and excretion of buprenorphine in humans[END_REF][START_REF] Pontani | Disposition in the rat of buprenorphine administered parenterally and as a subcutaneous implant[END_REF] (Figure 2). Chez l'homme la BUP est majoritairement métabolisée en NBUP (environ 65%) par le cytochrome CYP 3A4 [START_REF] Kobayashi | Human buprenorphine N-dealkylation is catalyzed by cytochrome P450 3A4[END_REF]. D'autres CYP (3A5, 3A7 et 2C8) peuvent également intervenir [START_REF] Moody | A liquid chromatographic-electrospray ionization-tandem mass spectrometric method for determination of buprenorphine, its metabolite, norbuprenorphine, and a coformulant, naloxone, that is suitable for in vivo and in vitro metabolism studies[END_REF][START_REF] Picard | In vitro metabolism study of buprenorphine: evidence for new metabolic pathways[END_REF] mais leur participation est moindre. La cinétique d'élimination de la BUP étant supérieure à celle de la formation de la NBUP, d'autres voies métaboliques ont pu être mises en évidence [START_REF] Chang | Glucuronidation of buprenorphine and norbuprenorphine by human liver microsomes and UDP-glucuronosyltransferases[END_REF]) (Figure 3). D'autres métabolites ont pu être identifiés in vitro à l'aide de microsomes humains par isoformes du CYP 3A et non du CYP2C [START_REF] Picard | In vitro metabolism study of buprenorphine: evidence for new metabolic pathways[END_REF]. volontaires entraîne une diminution modérée de la fréquence respiratoire, avec un plafonnement aux doses élevées [START_REF] Dahan | Buprenorphine induces ceiling in respiratory depression but not in analgesia[END_REF][START_REF] Walsh | The clinical pharmacology of buprenorphine: extrapolating from the laboratory to the clinic[END_REF]. Ces propriétés suggèrent donc un potentiel de sécurité d'utilisation à fortes doses ou en cas de surdosage accidentel ou volontaire.

Chez le rongeur, plusieurs études ont confirmé ces effets plafonds (Figure 4) (Cowan et al., 1977;[START_REF] Walsh | Acute administration of buprenorphine in humans: partial agonist and blockade effects[END_REF][START_REF] Walsh | Clinical pharmacology of buprenorphine: ceiling effects at high doses[END_REF][START_REF] Walsh | The clinical pharmacology of buprenorphine: extrapolating from the laboratory to the clinic[END_REF]Yassen et al., 2007). le rat. On observe un effet plafonné de la PaCO2 appelé dans la littérature « ceiling effect » (Cowan et al, 1977) Ainsi chez le rat, les études ont démontré l'absence d'effets respiratoires délétères de la BUP seule à forte dose, l'administration intrapéritonéale (IP) de 160 mg/kg de BUP, soit 80% de sa dose létale 50 (DL50 : 200 mg/kg ; IP) provoquant, en comparaison au solvant, une simple réduction de la PaO2 sans modifications significatives de la PaCO2 ou du pH artériel (Chevillard et al., 2009). Cette hypoxémie n'était d'ailleurs pas retrouvée dans d'autres travaux, aux doses de 30 mg/kg IP (Hreiche et al., 2006) ou de 3, 30 et 90 mg/kg IV (Gueye et al., 2002). En revanche, Pirnay et al (2008) ont montré qu'une administration IV de BUP 30 mg/kg entraînait une augmentation significative de la PaCO2 et une diminution significative du pH, mais sans réelle pertinence clinique. En pléthysmographie, la BUP injectée à 30 mg/kg et 160 mg/kg en IP chez le rat entraînait un allongement isolé du temps inspiratoire (TI) (Figure 5), sans altération du volume minute (VM) (Chevillard et al., 2009).

I.3. Décès attribuables à la prise de buprénorphine

Malgré ces propriétés pharmacologiques expliquant l'absence attendue d'effets respiratoires délétères en surdosage, plusieurs centaines de cas de décès asphyxiques impliquant la BUP ont été décrits dans la littérature notamment en France et en Suède (Ferrant et al., 2011;Häkkinen et al., 2012;Kintz, 2001). Ces décès étaient le plus souvent associés à un mésusage de la BUP (voie nasale ou injection IV de comprimés pilés) et/ou à une consommation concomitante de sédatifs, au premier rang desquels figurent les benzodiazépines (BZD) et l'éthanol. Néanmoins, le nombre de décès imputés à la BUP restait malgré tout au moins trois fois inférieur à celui attribué à la méthadone [START_REF] Auriacombe | Deaths attributable to methadone vs buprenorphine in France[END_REF] et le risque de décès par overdose au moins quatre fois inférieur chez les usagers de BUP à celui des usagers de méthadone [START_REF] Bell | Comparing overdose mortality associated with methadone and buprenorphine treatment[END_REF]. De plus, l'implication directe de la BUP dans les cas de décès publiés restait difficilement analysable. Une étude rétrospective [START_REF] Pirnay | A critical review of the causes of death among post-mortem toxicological investigations: analysis of 34 buprenorphine-associated and 35 methadone-associated deaths[END_REF]) menée à l'Institut Médico-légale de Paris retrouvait 34 décès attribués à la BUP, dont seulement quatre lui étaient clairement attribuables. L'analyse toxicologique confirmait que la BUP était toujours associée à d'autres substances, les BZD représentant la classe la plus souvent retrouvée et le diazépam (DZP), la molécule la plus fréquemment isolée (Figure 6).

Figure 6 -Nombre de substances retrouvées avec la BUP après l'analyse toxicologique de 34 échantillons sanguins provenant de 34 patients dont le décès avait été imputé directement à la BUP [START_REF] Pirnay | A critical review of the causes of death among post-mortem toxicological investigations: analysis of 34 buprenorphine-associated and 35 methadone-associated deaths[END_REF] Cette étude montrait toutefois la complexité des observations souvent mal étayées et confirmait la présence quasi-constante de BZD dans les cas mortels (Ferrant et al., 2011;Häkkinen et al., 2012).

I.4. La norbuprénorphine : le métabolite majeur et toxique de la buprénorphine

Les études de PK humaines ont démontré que de faibles concentrations de NBUP sont retrouvées après administration de BUP mais que les concentrations maximales et les demivies d'élimination varient selon la voie d'administration et les sujets (Kuhlamn et al., 1996).

Une fois produite, la NBUP est alors transformée en NBUP-3-glucuronide, plus hydrophile pour permettre son élimination urinaire. Dans les cas de morts asphyxiques par overdose de BUP, des concentrations élevées sanguines ou tissulaires de NBUP ont été rapportées par certains auteurs, suggérant un rôle important pour ce métabolite dans la survenue du décès [START_REF] Tracqui | Buprenorphine-related deaths among drug addicts in France: a report on 20 fatalities[END_REF]Kintz, 2001). Cependant, le mécanisme d'action de la NBUP reste mal connu. Des études expérimentales chez le rat montrent que de fortes concentrations de NBUP plasmatiques sont détectées immédiatement après l'administration de BUP [START_REF] Gopal | Characterization of the pharmacokinetics of buprenorphine and norbuprenorphine in rats after intravenous bolus administration of buprenorphine[END_REF] contrairement à d'autres études (Ohtani et al., 1995). De plus, une dépression respiratoire indiscutable et dose-dépendante est observée après l'administration de 3-9 mg/kg de NBUP chez le rat (Ohtani et al., 1997 ;Mégarbane et al., 2006). Il existe donc une forte suspicion pour l'implication de la NBUP dans la survenue des décès imputés à la prise de BUP. Pour expliquer l'absence d'effets respiratoires délétères de la NBUP produite à partir de la BUP, il a été démontré que la BUP prévient et réverse les effets délétères respiratoires de la NBUP (Mégarbane et al., 2006). L'implication du RO-µ et dans une moindre mesure celui du RO-δ dans ce rôle protecteur et l'implication de la NBUP dans l'apparition de la dépression respiratoire sont à ce jour encore mal connus.

I.5. Les benzodiazépines

Aux États-Unis comme en Europe, les BZD sont les agents pharmacologiques les plus prescrits avec plus de 112 millions de prescriptions en 2007 [START_REF] Cascade | Use of benzodiazepines in the treatment of anxiety[END_REF]. Un français sur cinq (20%) consomme au moins une BZD ou une molécule apparentée [START_REF] Ansm | Etat des lieux de la consommation des benzodiazépines en France[END_REF]. Les BZD interagissent avec le SNC avec des propriétés anxiolytiques, hypnotiques, myorelaxantes et anti-convulsivantes [START_REF] Griffin | Benzodiazepine Pharmacology and Central Nervous System-Mediated Effects[END_REF] en fonction de leur structure moléculaire.

En France, vingt-deux BZD et apparentées sont actuellement mises sur le marché. Elles sont prescrites dans le traitement de l'anxiété, des épilepsies, lors d'un sevrage alcoolique ou lors du traitement de substitution aux opiacés, dans les troubles du sommeil. Les BZD font partie des molécules dépresseurs du SNC et agissent en tant qu'agonistes du récepteur de l'acide γaminobutyrique (GABA) [START_REF] Kelly | Role of the histidine residue at position 105 in the human α5 containing GABAA receptor on the affinity and efficacy of benzodiazepine site ligands[END_REF]. transmembranaire formée de cinq sous-unités, dont deux sous unités α, une sous unité β, γ et δ (Figure 7). Il existe plusieurs types de récepteurs GABA-A, différents entre eux par certaines de leurs sous-unités [START_REF] Griffin | Benzodiazepine Pharmacology and Central Nervous System-Mediated Effects[END_REF]. On distingue actuellement six sous-types de sous-unités α, trois sous-types de sous-unités β, trois sous-types de sous-unités γ et un sous-type de sousunités δ. Ceci entraîne non seulement une grande hétérogénéité de structure mais aussi une hétérogénéité pharmacologique, dont les conséquences sont encore mal connues.

Le site de liaison des BZD se trouve à l'intersection des sous-unités α et γ au niveau d'un site spécifique comprenant un résidu histidine et possédant une haute affinité pour les BZD [START_REF] Kelly | Role of the histidine residue at position 105 in the human α5 containing GABAA receptor on the affinity and efficacy of benzodiazepine site ligands[END_REF]. Les récepteurs GABA-A sont retrouvés majoritairement dans le cortex cérébral, les noyaux situés au niveau de l'hypothalamus et ceux de la couche granulaire du cervelet et se situent majoritairement au niveau post-synaptique [START_REF] Crestani | Molecular Targets for the Myorelaxant Action of Diazepam[END_REF]. [START_REF] Griffin | Benzodiazepine Pharmacology and Central Nervous System-Mediated Effects[END_REF].

Le DZP interagit de manière identique et équilibrée sur ses récepteurs du SNC [START_REF] Crestani | Molecular Targets for the Myorelaxant Action of Diazepam[END_REF]. Les effets anxiolytiques s'observent à faibles doses, lorsque le DZP se lie au récepteur possédant la sous-unité α2 au niveau du système limbique. A plus fortes doses, le DZP procure une myorelaxation en plus de son activité anxiolytique principalement dû aux récepteurs possédant la sous-unité α2 au niveau de la moelle épinière et dans une moindre mesure aux interactions avec la sous-unité α3. L'effet sédatif provient plutôt d'un effet sur les récepteurs possédant la sous unité α1.

I.6. Effets respiratoires de la combinaison de benzodiazépines et de buprénorphine

Quelques travaux ont étudié chez l'homme l'effet sur la fonction respiratoire d'une coprescription d'une BZD et d'un opioïde. Lintzeris et al [START_REF] Lintzeris | Interactions on mixing diazepam with methadone or buprenorphine in maintenance patients[END_REF] IV) sur les gaz du sang artériel chez le rat (Gueye et al., 2002) La dose de midazolam utilisée était cependant très élevée et deux autres études n'ont pas montré de résultats significatifs (par rapport au groupe BUP) avec des doses de BZD plus faibles [START_REF] Middleton | The pharmacodynamic and pharmacokinetic profile of intranasal crushed buprenorphine and buprenorphine/naloxone tablets in opioid abusers[END_REF][START_REF] Pirnay | A critical review of the causes of death among post-mortem toxicological investigations: analysis of 34 buprenorphine-associated and 35 methadone-associated deaths[END_REF]. L'une d'elle (Pirnay et al., 2008) s'intéressait à l'administration de différentes BZD (nordiazépam, clonazépam, bromazépam et oxazépam) à doses pharmacologiques équipotentes et soulignait la différence des effets respiratoires en fonction de la BZD impliquée.

Le mécanisme de l'interaction BUP/BZD reste encore mal connu, même si les données de la littérature plaident en faveur d'une interaction pharmacodynamique (PD) (Mégarbane et al., 2006). Ces arguments « théoriques » sont résumés dans le Tableau 4.

Cette interaction pourrait avoir lieu au niveau des RO ou GABA-ergiques notamment les GABA-B (co-exprimés au niveau des neurones commandant la respiration) ou résulter de la sommation des effets centraux et périphériques de la BUP et du DZP. En effet, les opioïdes diminuent la réponse ventilatoire à l'hypoxie, l'hypercapnie ou à l'augmentation des résistances des voies aériennes [START_REF] Berkenbosch | Influences of morphine on the ventilatory response to isocapnic hypoxia[END_REF]Bruce et al., 2009;[START_REF] Walsh | Clinical pharmacology of buprenorphine: ceiling effects at high doses[END_REF]. De leur côté, les BZD agissent sur la commande des muscles oropharyngés entraînant une obstruction des voies aériennes supérieures secondaire à leur relaxation [START_REF] Gowing | Buprenorphine for the management of opioid withdrawal[END_REF]. La conjonction de ces deux effets pourrait ainsi être à l'origine des effets respiratoires observés. Mais cette interaction délétère BUP/BZD reste encore non totalement élucidée à ce jour. [START_REF] Jones | Food-induced lowering of blood ethanol profiles and increased rate of elimination immediately after a meal[END_REF][START_REF] Goullé | Éthanol : pharmacocinétique, métabolisme et méthodes analytiques[END_REF]. La distribution de l'éthanol est rapide (8 min) [START_REF] Jones | Distribution of ethanol an water between plasma and whole blood ; inter and intra individual variations after administration of ethanol by intravenous infusion[END_REF] L'acétaldéhyde est dans ensuite oxydé en acétate par l'aldéhyde déshydrogénase (ALDH).

L'éthanol subit un effet de « premier passage », c'est-à-dire qu'il subit un métabolisme initial digestif avant d'atteindre la circulation sanguine mais celui-ci est moins important que le métabolisme hépatique. Une partie de l'éthanol ingéré est éliminée sous forme inchangée dans l'air expiré, les urines et la sueur. L'élimination de l'éthanol suit une cinétique de type Michaélienne (Wilkinson., 1977) et la clairance rénale est estimée à 0,06 L/h pour un homme de 70 kg. Concernant ses effets respiratoires, l'éthanol serait à faible dose stimulant et à forte dose dépresseur de la ventilation de repos chez l'homme [START_REF] Hitchcock | Alteration in respiration caused by alcohol[END_REF][START_REF] Johnstone | Acute respiratory effects of ethanol in man[END_REF][START_REF] Witt | Respiratory Effects of Ethyl Alcohol Intoxication[END_REF] et chez les mammifères [START_REF] Brackett | Doseand time-dependent cardiovascular responses induced by ethanol[END_REF][START_REF] Pagala | Effect of ethanol on function of the rat heart and skeletal muscles[END_REF]. Les effets respiratoires de l'éthanol sur l'animal adulte évalués par pléthysmographie ont été rapportés dans une seule étude dans la littérature. Roussel et al. ont montré que seule la dose 3g/kg administrée par voie IP tend à augmenter la fréquence respiratoire de l'animal de 10 à 60 min après administration, sans aucune modification des autres paramètres alors que pour une dose de 4,5 g/kg, cette tendance n'apparaît qu'une heure après administration (Roussel et al., 2014). En ce qui concerne les gaz du sang artériels, seul le pH artériel des animaux traités par 3g/kg et 4,5 g/kg était abaissé significativement. Plusieurs cas de décès par dépression respiratoire ont cependant été attribués à la prise concomitante de BUP et d'éthanol chez l'usager occasionnel ou toxicomane dans le cadre d'une polyconsommation (Ferrant et al., 2011;Häkkinen et al., 2012;Seldén et al., 2012).

Ainsi, dans une de ces séries autopsiques (Hakkinen, et al., 2012), l'éthanol était la substance psychoactive retrouvée dans 58% des décès attribués à la BUP (Tableau (Häkkinen et al., 2012;Seldén et al., 2012).

Le mécanisme de l'interaction opioïdes/éthanol reste mal connu, mais plusieurs arguments plaident en faveur d'une interaction de type PD (Dopico et Lovinger, 2009 ;[START_REF] Hickman | Does alcohol increase the risk of overdose death: the need for a translational approach[END_REF][START_REF] Hoffman | Ethanol and the NMDA receptor[END_REF]. Elle se situerait au niveau des RO-µ. En effet, l'éthanol est capable de moduler la libération d'opioïdes endogènes (Jarjour et al., 2009;[START_REF] Marinelli | A microdialysis profile of dynorphin A(1-8) release in the rat nucleus accumbens following alcohol administration[END_REF]Méndez et al., 2010;[START_REF] Xiao | Effects of ethanol on midbrain neurons: role of opioid receptors[END_REF] d'où un possible sommation des effets de la BUP et de ceux des opioïdes endogènes sur les RO-µ. L'éthanol a également été décrit comme modulateur de la voie GABA-ergique, via le récepteur GABA-A (Kumar et al., 2009;[START_REF] Ming | Competing presynaptic and postsynaptic effects of ethanol on cerebellar purkinje neurons[END_REF][START_REF] Sanna | Brain Steroidogenesis Mediates Ethanol Modulation of GABAA Receptor Activity in Rat Hippocampus[END_REF]. Ainsi, l'éthanol, comme les BZD, provoquerait une augmentation de la libération de GABA dans la fente synaptique et potentialiserait l'activité des récepteurs GABA-A post synaptiques.

À l'inverse des récepteurs GABA-ergiques, l'activité des récepteurs excitateurs glutamatergiques (Glu) est inhibée par l'éthanol, et notamment les récepteurs acide N-méthyl-D-aspartique (NMDA). L'éthanol à fortes doses (50 mM) induit une inhibition des récepteur NMDA, étudiée sur tranches d'hippocampe de rats adultes (Dopico et Lovinger, 2009). Cette inhibition se fait par une interaction au niveau des domaines transmembranaires des sous unités Glu-N1 et Glu-N2 [START_REF] Wills | Ethanol effects on N-methyl-D-aspartate receptors in the bed nucleus of the stria terminalis[END_REF]. Le blocage des courants excitateurs par l'éthanol ainsi que la potentialisation de la neurotransmission GABA-ergique inhibitrice seraient également responsables des effets sédatifs de l'éthanol et par conséquent de la potentialisation des effets respiratoires de la BUP (Figure 11). L'interaction entre la BUP et l'éthanol pourrait aussi résulter de la sommation des effets centraux et périphériques de chacune des molécules. En effet, les opioïdes diminuent la réponse ventilatoire à l'hypoxie, l'hypercapnie ou à l'augmentation des résistances des voies aériennes [START_REF] Berkenbosch | Influences of morphine on the ventilatory response to isocapnic hypoxia[END_REF]Bruce et al., 2009;[START_REF] Walsh | Clinical pharmacology of buprenorphine: ceiling effects at high doses[END_REF]. De son côté, l'éthanol agit également sur la commande des muscles oropharyngés entraînant une obstruction des voies aériennes supérieures secondaire à leur relaxation [START_REF] Gowing | Buprenorphine for the management of opioid withdrawal[END_REF].

La conjonction de ces deux effets serait à l'origine des effets respiratoires délétères observés.

Une interaction de nature PK entre opioïdes et éthanol peut également être suggérée. Le métabolisme de l'éthanol en acétaldéhyde par l'ADH provoque une déplétion du ratio de nicotinamide adénine dinucléotide (NAD)/NADH. (Cederbaum, 2012). Ce cofacteur NAD (sous sa forme oxydé NAD + ) est nécessaire à la formation d'acide glucuronique pour la phase II du métabolisme (glucurono-conjuguaison) [START_REF] Hjelle | Hepatic UDP-glucuronic acid regulation during acetaminophen biotransformation in rats[END_REF]. La phase de glucuronoconjuguaison de la BUP et de la NBUP étant limitée en présence d'éthanol, la voie de production de BUP en NBUP (métabolite toxique et majeur de la BUP) pourrait être alors favorisée, expliquant les effets respiratoires délétères observés. Néanmoins, ceci n'est qu'une hypothèse, même si la contribution de la NBUP est fortement suggérée dans l'induction des effets délétères respiratoires observés après la prise de BUP dans les études in vivo (Alhaddad et al., 2012;Mégarbane et al., 2006;Ohtani et al., 1997) et qu'un rôle additionnel de la NBUP-3-glucuronide peut également être suspecté, son administration chez la souris ayant été montré comme à l'origine d'effets respiratoires potentiellement délétères avec la réduction du volume courant (VT) (Brown et al., 2011).

Par ailleurs, dans une étude autopsique chez des patients décédés à la suite d'une overdose à l'héroïne en présence d'éthanol (Polettini et al., 1999), il a été démontré que les concentrations de morphine- [START_REF] Middleton | The pharmacodynamic and pharmacokinetic profile of intranasal crushed buprenorphine and buprenorphine/naloxone tablets in opioid abusers[END_REF]Robinson et al., 1993;Simojoki et al., 2008). La NLX est faiblement absorbée par voie SL et possède une demi-vie courte (20 min) en comparaison à la BUP (environ 5 h) [START_REF] Chiang | Pharmacokinetics of the combination tablet of buprenorphine and naloxone[END_REF]. Aucun effet clinique lié à la NLX n'est alors attendu après prise SL du mélange BUP/NLX selon les recommandations thérapeutiques. Cependant, au cas où les comprimés venaient à être pilés puis injectés ou « sniffés », la NLX serait rapidement absorbée et antagoniserait les effets de la BUP, provoquant ainsi des symptômes de manque, comme établi dans plusieurs études cliniques chez le toxicomane [START_REF] Alho | Abuse liability of buprenorphinenaloxone tablets in untreated IV drug users[END_REF]Orman et Keating, 2009). Le ratio 4:1 choisi (le plus souvent 8/2 mg ou 2/0,5 mg) s'est révélé optimal au cours des études cliniques, car correspondant à la dose minimale de NLX nécessaire pour provoquer des symptômes de manque lors d'une utilisation IV (Mendelson et Jones, 2003).

I.9.2. Premiers bilans cliniques

Depuis la commercialisation du mélange BUP/NLX, des études observationnelles de plus en plus nombreuses sont venues enrichir les études cliniques initiales. Chez certains patients, le mésusage IV du mélange BUP/NLX était clairement à l'origine de symptômes de sevrage avec une phase critique (pendant le 1 er mois) entraînant une réduction du recours à cette voie de diversion, lorsqu'un suivi régulier et un contrôle des symptômes de sevrage étaient mis en place (Demetrovics et al., 2009;Monte et al., 2009). Cependant, ceci n'a pas été observé chez tous les patients et il existe d'ailleurs une importante variabilité inter-individuelle des effets dissuasifs du mélange (Mendelson et Jones, 2003). Par ailleurs, une étude menée en 1991 par

Robinson et al. montrait qu'un tiers des patients injecteurs de BUP/NLX trouvaient ce mélange moins attractif que la BUP seule (Robinson et al., 1993). En revanche, une étude menée en France montrait, à l'inverse, que parmi 53 patients stabilisés à la BUP et recevant le mélange BUP/NLX, 54% préféraient la nouvelle formulation, en invoquant une dissolution plus rapide des comprimés [START_REF] Daulouède | Preference for buprenorphine/naloxone and buprenorphine among patients receiving buprenorphine maintenance therapy in France: a prospective, multicenter study[END_REF]. Toutefois, dans les pays où le Suboxone ® avait été commercialisé, sa valeur de revente avait chutée, à un niveau deux fois plus faible que celui de la BUP, limitant ainsi les risques liés au trafic [START_REF] Amass | Bringing buprenorphinenaloxone detoxification to community treatment providers: the NIDA Clinical Trials Network field experience[END_REF]. Néanmoins, ce résultat doit être nuancé par une étude suggérant que l'utilisation du mélange pouvait conduire certains patients à consommer d'avantage de BZD, source de toxicité éventuelle en co-ingestion avec la BUP voire à échanger de plus en plus leurs seringues (Bruce et al., 2009).

Plusieurs études cliniques chez le volontaire sain, toxicomane ou en situation d'overdose montrent que la NLX ne réverse pas les effets respiratoires induits par la BUP qui possède une affinité bien supérieure aux RO-µ que la NLX, à moins de recourir à de très fortes doses non utilisables en routine (Demetrovics et al., 2009 ;Mégarbane et al., 2010 ;[START_REF] Van Dorp | Naloxone reversal of buprenorphine-induced respiratory depression[END_REF]. De plus, Häkkinen et al ont montré que dans des cas d'intoxications mortelles liées à la prise de BUP ou BUP/NLX, le mésusage IV de la combinaison de BUP/NLX est plus souvent retrouvé que celui de la BUP seule (Häkkinen et al., 2013). Ces observations soulèvent clairement un doute quant à l'intérêt dissuasif du mélange BUP/NLX et du rôle préventif attendu du syndrome de manque induit par l'injection IV. De plus, de nombreuses questions existent quant à la valeur ajoutée du mélange en termes d'effets respiratoires suite à une surdose ou à une association aux BZD ou à l'éthanol.

I.10. Les opioïdes en tant qu'incapacitant utilisé dans le maintien de l'ordre.

Les opioïdes peuvent également être utilisés à des fins de défense militaire. La prise d'otages de 850 spectateurs du théâtre de Doubrovka de Moscou par une cinquantaine de rebelles tchétchènes le 23 octobre 2002 illustre cette utilisation [START_REF] Rieder | Moscow theatre siege and anaesthetic drugs[END_REF]. Elle se terminera tragiquement trois jours plus tard. Selon le ministre russe de la santé, Iouri Chevtchenko, l'aérosol utilisé par les forces Alpha lors de l'assaut du théâtre russe où étaient détenus plus de 800 otages contenait du carfentanyl et du remifentanyl [START_REF] Coupland | Incapacitating chemical weapons: a year after the Moscow theatre siege[END_REF][START_REF] Riches | Analysis of clothing and urine from Moscow theatre siege casualties reveals carfentanil and remifentanil use[END_REF][START_REF] Wax | Unexpected "gas" casualties in Moscow: a medical toxicology perspective[END_REF]. Le fentanyl est un opioïde de synthèse dont le potentiel analgésique est 80 fois plus élevé que celui de la morphine.

La quasi-totalité des décès (117 otages) [START_REF] Rieder | Moscow theatre siege and anaesthetic drugs[END_REF] [START_REF] Bartlett | Control of breathing in experimental anemia[END_REF][START_REF] Houze | Ventilatory effects of low-dose paraoxon result from central muscarinic effects[END_REF][START_REF] Villa | Toxic doses of paraoxon alter the respiratory pattern without causing respiratory failure in rats[END_REF]. La pléthysmographie permet aussi de mesurer le temps inspiratoire acétique à 0,01% afin d'atteindre un pH 2,7 adéquat aux conditions de chromatographie [START_REF] Ceccato | Sensitive determination of buprenorphine and its N-dealkylated metabolite norbuprenorphine in human plasma by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry[END_REF][START_REF] Hegstad | Rapid quantification of buprenorphine-glucuronide and norbuprenorphine-glucuronide in human urine by LC-MS-MS[END_REF]Polettini et Huestis, 2001) -la limite de détection (LD)

-la limite inférieure de quantification (LQi)

-la limite supérieure de quantification (LQs)

-la justesse -la répétabilité -la précision intermédiaire.

L'effet matrice et le rendement de précipitation sont évalués selon l'approche de Matuszewski et al (2003).

Introduction

Buprenorphine (BUP), a semi-synthetic opioid, is widely used as effective maintenance treatment in heroin addicts. In humans (Yassen et al., 2007) as well as rodents (Chevillard et al., 2009), BUP exhibits ceiling respiratory effects in contrast to other opioids, supporting its safety profile. However, following its marketing, asphyxic fatalities (Häkkinen et al., 2012) and poisonings with typical opioid features and respiratory depression (Mégarbane et al., 2010) were attributed to BUP misuse or concomitant ingestion of benzodiazepines (BZD). Intravenous (iv) BUP misuse among drug

AUC of minute volume (arbiratory units)

Fig. 1. Plethysmography effects in Sprague-Dawley rats of solvent (white), 30 mg/kg buprenorphine/solvent (BUP/solvent, black), and 30 mg/kg buprenorphine/7.5 mg/kg naloxone (BUP/NLX, horizontal lines). Each group consisted of six rats. Values represent mean ± SEM of the areas under the curve (AUC) of each parameter between the time before intravenous administration and 60 min post-injection. Data are expressed as arbitrary units. Comparisons were performed using ANOVA followed by multiple tests with Bonferroni's correction. BUP/solvent or BUP/NLX vs. solvent: *P < 0.05, **P < 0.01; BUP/NLX vs. BUP/solvent: $ P < 0.05, $$ P < 0.01.

addicts is frequent, mainly to modulate opiate withdrawal symptoms arising from either attempted self-detoxification in case of insufficient funds to purchase preferred illicit opioids or inability to find a preferred source of drugs, and rarely to experience pleasure or euphoria (Monte et al., 2009). Additionally, studies suggested deleterious interactions between BUP and BZD, resulting rather from pharmacodynamic than pharmacokinetic mechanisms (Gueye et al., 2002;Lintzeris and Nielsen, 2010). Interestingly, in BUP-poisoned patients, 0.4-0.8 mg naloxone (NLX), an opioid receptor antagonist, did not reverse neuro-respiratory toxicity whereas flumazenil (FLZ), a gamma-aminobutyric acid (GABA)-A receptor antagonist, did (Mégarbane et al., 2010). Since 2006, BUP/NLX combination (ratio 4:1) has been marketed, aimed at dissuading iv self-injection of crushed tablets. While sublingual intake of BUP/NLX avoids NLX effects due to its limited bioavailability, iv or intranasal misuse of BUP/NLX is supposed to result in acute withdrawal in opiate abusers described as "bad experience" (Orman and Keating, 2009;Robinson et al., 1993;Simojoki et al., 2008). Switching from BUP to BUP/NLX was effective and well-tolerated [START_REF] Daulouède | Preference for buprenorphine/naloxone and buprenorphine among patients receiving buprenophine maintenance therapy in France: a prospective, multicenter study[END_REF]Demetrovics et al., 2009;Simojoki et al., 2008;Stimolo et al., 2010). In addition, a possible reduction in BUP/NLX abuse potential was expected, based on studies reporting withdrawal symptoms in drug addicts misusing this combination [START_REF] Amass | A prospective, randomized, multicenter acceptability and safety study of direct buprenorphine/naloxone induction in heroin-dependent individuals[END_REF]Degenhardt et al., 2009;Elkader and Sproule, 2005;Fiellin et al., 2001Fiellin et al., , 2006;;Larance et al., 2011;Orman and Keating, 2009;Simojoki et al., 2008;Smirnov and Kemp, 2012;Vicknasingam et al., 2010), even though such symptoms were not reported in all studies (Comer et al., 2010;Harris et al., 2000;Mendelson and Jones, 2003;Robinson et al., 1993). However, since its marketing, there has been no significant reduction in BUP/NLX misuse in either dependent (Bazazi et al., 2011;Bruce et al., 2009;Larance et al., 2011;Monte et al., 2009;Uosukainen et al., 2013) or non-dependant opioid abusers (Comer and Collins, 2002;[START_REF] Duke | Acute effects of intramuscular and sublingual buprenorphine and buprenorphine/naloxone in non-dependent opioid abusers[END_REF]Strain et al., 2000) and injection-related risk behaviors like syringe sharing (Bruce et al., 2009). Similarly to BUP, fatalities and overdoses with respiratory depression have been attributed to BUP/NLX (Häkkinen et al., 2013;Pedapati and Bateman, 2011). Surprisingly, significant increase in BZD use has also been reported among drug addicts following BUP/NLX marketing (Bruce et al., 2009;Vicknasingam et al., 2010). Concerns regarding interactions between BUP/NLX and BZD have been also raised with reported life-threatening cases of respiratory depression (Martin, 2011;Rich et al., 2011).

To date, no study has assessed BUP/NLX-induced respiratory effects and the resulting interactions with BZD. We designed an experimental study in naive and BUP-tolerant rats to investigate BUP/NLX-induced respiratory effects administered alone or in $$$

AUC of minute volume (arbiratory units)

Fig. 2. Plethysmography effects in Sprague-Dawley rats of 30 mg/kg buprenorphine/solvent + solvent (BUP + solvent, white), 30 mg/kg buprenorphine/7.5 mg/kg naloxone + solvent (BUP/NLX + solvent, black), 30 mg/kg buprenorphine/solvent + 20 mg/kg diazepam (BUP + DZP, horizontal lines), and 30 mg/kg buprenorphine/7.5 mg/kg naloxone + 20 mg/kg diazepam (BUP/NLX + DZP, vertical lines). DZP or its solvent was injected intraperitoneally 30 min before the intravenous administration of BUP/NLX or BUP/solvent. Each group consisted of six rats. Values represent mean ± SEM of the areas under the curve (AUC) of each parameter between the time before intravenous administration and 60 min post-injection. Data are expressed as arbitrary units. Comparisons were performed using ANOVA followed by multiple tests with Bonferroni's correction. BUP/solvent + DZP vs. BUP/solvent + solvent: *P < 0.05; BUP/NLX + solvent vs. BUP/NLX + DZP: $ P < 0.05, $$ P < 0.01. $$$ P < 0.001; BUP + solvent vs. BUP/NLX + solvent: ## P < 0.01, ### P < 0.001.

association with diazepam, the most frequently used BZD in drug addicts (Jones et al., 2012), aiming at characterizing the exact role of NLX and its consequences regarding the interaction between BUP and BZD.

Material and methods

All these experiments were carried out within the ethical guidelines established by the National Institutes of Health and the French Ministry of Agriculture. All our experimental protocols were approved by our animal institutional ethic committee (Paris-Descartes University).

Animals

Male Sprague-Dawley rats, 7 to 8-weeks old (250-300 g) were obtained from Janvier (Genest, France). Animals were housed in well-ventilated cages at 20-22 • C with 55 ± 10% relative humidity and maintained under a 12-h dark/light cycle (light from 8:00 a.m. to 8 p.m.) for at least 1 week before the experiments. Food and water were provided ad libitum.

Chemicals and drugs

BUP hydrochloride was generously provided by Reckitt Benckiser (Evry, France). BUP (30 and 10 mg/kg) was diluted in 4% Tween ® (Sigma, St Quentin, France) for iv administration and in 0.9% NaCl (1 mg/kg) for subcutaneous (sc) injections. NLX (Sigma-Aldrich, France) was diluted in 4% Tween ® (7.5 and 2.5 mg/kg) and mixed with BUP to obtain BUP/NLX solutions at 4:1 ratio in agreement with the marketed BUP/NLX formulation. DZP (Roche, France) was diluted in 4% Tween ® (20 mg/kg) and FLZ (Sigma-Aldrich, France) in 0.9% NaCl (10 mg/kg).

Catheter implantation and whole body plethysmography

Four days before the study, a venous femoral catheter was implanted to allow iv drug administration. The rat was anesthetized with intraperitoneal (ip) 70 mg/kg ketamine (Ketalar ® ) and 10 mg/kg xylazine (Rompum ® ), then placed on a warming blanket with regulating thermostat. The femoral vein was catheterized using 30 cm-silastic tubing with external and internal diameters of 0.94 and 0.51 mm, respectively (Dow Corning Co., Midland, MI). The venous catheter was sc tunneled and fixed at the back of the neck. Heparinized saline was injected into the catheter to prevent thrombosis and catheter obstruction. Simultaneously, a temperature transmitter (DSI, Chatillon, France) was implanted in the peritoneal cavity. The rat was then returned to its individual cage for a minimum 72 h recovery period and complete anesthesia washout.

Ventilatory parameters were recorded in a whole-body plethysmograph by the barometric method. On the day of experimentation, the rat was placed in a rectangular Plexiglas chamber with a 3 l volume connected to a reference chamber of the same size by a high-resistance leak to minimize the effect of pressure changes in the experimental room. The animal chamber was flushed continuously with humidified air at a rate of 5 l/min. During the recording periods, the inlet and outlet tubes were temporarily clamped and pressure changes associated with each breath were recorded using a differential pressure transducer (Validyne MP, 45 ± 3 cmH2O, Northridge, CA), connected to the animal and reference chambers. During each measurement, calibration was performed by 3 injections of 1 ml air into the chamber. Ambient temperature was then noted. The spirogram was recorded and stored on a computer with an acquisition data card (PCI-DAS 1000, Dipsi, Chatillon, France) using respiratory acquisition software (Acquis1 Software, CNRS, Gif-sur-Yvette, France) for analysis off-line. This technique was validated daily with a series of leak tests (leak was signaled when reduction in the signal amplitude exceeded 33% in 5 s). The quantification threshold corresponded to a minimum air volume injection of 30 l. Within the range of tested volumes (0.1-3 ml), measurements were linear. (BUP/solvent + solvent, white), 30 mg/kg buprenorphine/7.5 mg/kg naloxone + solvent (BUP/NLX + solvent, black), 30 mg/kg buprenorphine/solvent + 20 mg/kg diazepam (BUP/solvent + DZP, horizontal lines), and 30 mg/kg buprenorphine/7.5 mg/kg naloxone + 20 mg/kg diazepam (BUP/NLX + DZP, vertical lines). (B) Temperature effects in Sprague-Dawley rats of 10 mg/kg buprenorphine/solvent + solvent (BUP/solvent + solvent, white), 10 mg/kg buprenorphine/2.5 mg/kg naloxone + solvent (BUP/NLX + solvent, black), 10 mg/kg buprenorphine/solvent + 20 mg/kg diazepam (BUP/solvent + DZP, horizontal lines), and 10 mg/kg buprenorphine/2.5 mg/kg naloxone + 20 mg/kg diazepam (BUP/NLX + DZP, vertical lines). Rats were either naïve (A) or rendered BUPtolerant with a subcutaneous 1 mg/kg/day BUP pretreatment during 14 days (3B). DZP or its solvent was injected intraperitoneally 30 min before the intravenous administration of BUP/NLX or BUP/solvent. Each group consisted of six rats. Values represent mean ± SEM of the areas under the curve (AUC) of each parameter between the time before intravenous administration and 60 min postinjection. Data are expressed as arbitrary units. Comparisons were performed using ANOVA followed by multiple tests with Bonferroni's correction. BUP/solvent + DZP vs. BUP/solvent + solvent: ***P < 0.001; BUP/NLX + solvent vs. BUP/NLX + DZP: $$$ P < 0.001; BUP/solvent + solvent vs. BUP/NLX + solvent: ## P < 0.01.

The mean coefficient of intra-day variability (four series of 5 measurements carried out the same day) was 1.32 ± 0.18%. The mean coefficient of inter-day variability (25 measurements carried out on three different days) was 1.69 ± 0.11%. We checked that the mean CO2 measured using an Ohmeda 5250 RGM capnograph (rebreathing test) during clamping periods did not exceed 0.6% of the air contained in the chamber. During the experiment, the first measurement was performed after a 30-60 min period of accommodation, when the rat was quiet but not in deep or rapid eye movement sleep which can be grossly estimated from observing the behavior, response to noise, and pattern of breathing. The rat was then gently removed from the chamber for drug administration, and replaced in the chamber for the remaining measurements. Ventilatory parameters were recorded at 5,10,15,20,25,30,40,[START_REF] Corsenac | Road traffic crashes and prescribed methadone and buprenorphine: A french registry-based case-control study[END_REF]60 and then every 30 min for 2 h, each recording lasting about 60 s. The following parameters were measured: the tidal volume (VT), the inspiratory time (TI), the expiratory time (TE), and the total respiratory time (TTOT). Additional parameters were As a preliminary investigation, we studied the effects of NLX in naive rats. Rats were randomized into two groups (N = 6) to receive either 7.5 mg/kg NLX or its solvent (4% Tween ® ) iv. Subsequently, temperature was measured and ventilation studied using plethysmography.

Then, rats were randomized into three groups (N = 6) to receive 30 mg/kg BUP/7.5 mg/kg NLX, 30 mg/kg BUP/solvent or solvent alone iv. Subsequently, temperature was measured and ventilation studied using plethysmography. The dose of 30 mg/kg BUP was chosen as devoid of respiratory effects in rats except for an increase in TI (Chevillard et al., 2009).

Study 2 -effects of BUP/NLX in combination with DZP in naive rats

Rats were randomized into four groups (N = 6) to receive 30 mg/kg BUP/7.5 mg/kg NLX + 20 mg/kg DZP, 30 mg/kg BUP/solvent + 20 mg/kg DZP, 30 mg/kg BUP/7.5 mg/kg NLX + solvent or 30 mg/kg BUP/solvent + solvent. DZP or its solvent was injected ip 30 min before the iv administration of BUP/NLX or BUP/solvent. Subsequently, temperature was measured and ventilation studied using plethysmography. The dose of 20 mg/kg DZP was chosen as devoid of any significant respiratory effect (McCormick et al., 1984).

Additionally, we investigated the effects of iv 10 mg/kg FLZ on BUP + DZP interaction. Rats were randomized into four groups (N = 6). First, rats received either 30 mg/kg BUP/7.5 mg/kg NLX + 20 mg/kg DZP or 30 mg/kg BUP/solvent + 20 mg/kg DZP, then either 10 mg/kg FLZ or its solvent. DZP was injected ip 30 min before the iv administration of BUP/NLX or BUP/solvent and FLZ injected iv 15 min after. The four studied groups were thus the followings: (BUP/solvent + DZP) + FLZ; (BUP/solvent + DZP) + solvent; (BUP/NLX + DZP) + FLZ and (BUP/NLX + DZP) + solvent. Subsequently, temperature was measured and ventilation studied using plethysmography. The dose of 10 mg/kg FLZ was chosen as preliminarily shown to allow complete reversal of BZD-related effects in rats (data not shown). We had chosen 15 min delay between DZP and BUP/solvent or BUP/NLX administration as corresponding to the time of peak effects of BUP/±NLX + DZP combinations on VE.

Study 3 -effects of BUP/NLX in combination with DZP in BUP-tolerant rats

Previous rat models investigating tolerance to BUP-related antinociception used various protocols including daily sc administration of 0.25 mg/kg BUP per day for 7 days (Glover and Davis, 2008), 0.25 mg/kg BUP per day for 29 days (Grecksch et al., 2006), and 1 mg/kg BUP per day for 9 days (Mendez and Trujillo, 2008). In the absence of consensual dose regimen, we decided to administer the highest dose (1 mg/kg/day BUP) during 14 days to obtain BUP-tolerant rats.

We first assessed the development of dependence and tolerance to BUP in our model in two randomized groups of rats (N = 6) pretreated during 14 days with sc 1 mg/kg/day BUP or its solvent. Dependence to BUP was evaluated using Gellert's withdrawal score (Table 1) (Gellert and Holtzman, 1978). Signs were noted during two 5-min observation periods starting at 1 and 31 min after the iv BUP/NLX or BUP/solvent administration. Tolerance to BUP-related respiratory effects was studied using plethysmography after the iv administration of 10 mg/kg BUP.

Then, BUP-tolerant rats were randomized into 4 groups (N = 6) to receive 10 mg/kg BUP/2.5 mg/kg NLX + 20 mg/kg DZP, 10 mg/kg BUP/solvent + 20 mg/kg DZP, 10 mg/kg BUP/2.5 mg/kg NLX + solvent or 10 mg/kg BUP/solvent + solvent. DZP or its solvent was injected ip 30 min before the iv administration of BUP/NLX or BUP/solvent. Subsequently, temperature was measured and ventilation studied by plethysmography. The dose of 10 mg/kg BUP was chosen since a preliminary study showed that all BUP-tolerant rats receiving 30 mg/kg BUP/±NLX died (data not shown).

Statistical analysis

Results are expressed as mean ± SEM, T0 was the mean of the three baseline measurements. To permit simultaneous analysis of the effect of time and various treatments in the different groups, individual animal areas under the curve (AUC) values for each studied parameter were calculated by the trapezoid method from T0 to 60 min. For each measurement, we compared the baseline values, the values at each sampling time, and the AUCs using a two-way analysis of variance for repeated measurements followed by multiple comparison tests using Bonferroni's correction.

To study the effects of flumazenil, we calculated the AUC for each plethysmography parameter from 15 to 20 min and compared the AUCs between the 2 studied groups using Student t-tests. All tests were performed using Prism version 5.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA), and P-values of less than 0.05 were considered as significant.

Results

Study 1 -effects of BUP/NLX in naive rats

In the initial observation, NLX administration significantly decreased rat temperature (P < 0.05), decreased T I (P < 0.05), and increased f (P < 0.05) in comparison to the solvent.

Based on V E measurement, administration of BUP/NLX as with BUP/solvent did not result in significant respiratory depression (Fig. 1 and Table 2). However, BUP/NLX was responsible for a significant increase in f in comparison to the solvent (P < 0.01) and BUP (P < 0.05) as well as a significant decrease in T E in comparison to the solvent (P < 0.01). Additionally, BUP/solvent was responsible for a significant increase in T I in comparison to the solvent (P < 0.01). Both BUP/NLX and BUP/solvent did not significantly alter V T . Temperature was altered neither by BUP/NLX nor by BUP/solvent administration.

Study 2 -effects of BUP/NLX in combination with DZP in naive rats

Combination of DZP with either BUP/NLX or BUP/solvent did not result in significantly different patterns of plethysmography parameters (Fig. 2 and Table 2). However, when co-administering DZP vs. solvent to rats treated with BUP/NLX, there was a significant increase in T E (P < 0.01), reduction in f (P < 0.01), and consequent reduction in V E (P < 0.001). When co-administering DZP vs. solvent to rats treated with BUP/solvent, there was a significant decrease in V T (P < 0.05) without significant alterations in T E and f and consequently in V E . Co-administration of DZP with either BUP/NLX or BUP/solvent resulted in a significant decrease in temperature in comparison to their respective controls (P < 0.001) (Fig. 3A and Table 2).

FLZ administration reversed alterations in all plethysmography parameters related to the combination of DZP with either BUP/NLX or BUP/solvent (Fig. 4): there was a significant increase in V E (P < 0.01), V T (P < 0.01), and f (P < 0.01 when DZP was combined with BUP/NLX and P < 0.05 when combined with BUP/solvent).

Study 3 -effects of BUP/NLX in combination with DZP in BUP-tolerant rats

Following treatment during 14 days with sc 1 mg/kg BUP, no significant increase in T I was observed on day 15 with 10 mg/kg BUP iv administration, in comparison to rats treated during 14 days with saline (P < 0.05), supporting the onset of tolerance to BUPrelated respiratory effects (Fig. 5A). Accordingly, administration of BUP/NLX in comparison to BUP/solvent alone at day 15 to rats pretreated with sc 1 mg/kg BUP during 14 days resulted in a significant increase in the withdrawal score (P < 0.05) (Fig. 5B).

In BUP-tolerant rats, there were no significant differences in respiratory effects of BUP/NLX vs. BUP/solvent (Fig. 6 and Table 2). Similarly, combination of DZP with either BUP/NLX or BUP/solvent did not result in significantly different respiratory patterns. When co-administering DZP vs. solvent to rats treated with BUP/NLX, there were no significant alterations in respiratory effects; however, when co-administering DZP vs. solvent to rats treated with BUP/solvent, there was a significant increase in T I (P < 0.001) and reduction in f (P < 0.01) resulting in a significant decrease in V E (P < 0.001). Moreover, BUP/NLX in comparison to BUP/solvent was responsible for a significant decrease in rat temperature (P < 0.05) (Fig. 3B and Table 2). Co-administration of DZP to either BUP/solvent-or BUP/NLX-treated rats resulted in a significant decrease in temperature in comparison to their respective controls (P < 0.001).

Discussion

In this experimental study, BUP/NLX combination as BUP alone was devoid of any depressive respiratory effects in naive and BUP-tolerant rats. However, in association with DZP, respiratory depression occurred, significantly more marked in naive rats and significantly more limited in BUP-tolerant rats, when comparing BUP/NLX to BUP.

In naive rats, BUP/NLX did not result in respiratory depression as previously shown with BUP (Chevillard et al., 2009;Gueye et al., 2001;Nielsen and Taylor, 2005), supporting the suggestion that BUP-attributed ceiling response is preserved if co-administered with NLX. However, when combined with DZP, BUP/NLX resulted in a significant and sustained (∼60 min-duration) decrease in V E , suggesting that BUP/NLX is unable to avoid the deleterious respiratory depression, previously attributed to the combination of BUP with BZD. Interestingly, our study is the first one to our knowledge to investigate the respiratory effects resulting from BUP/BZD interaction using plethysmography: all previous studies have used blood gas analysis to describe this deleterious interaction. Plethysmography allows the better understanding of each ventilation component contribution in the final respiratory effect assessed by arterial blood gas study. Drug-induced modifications in T I and T E rather suggest an action on the centers of breathing control, while alterations in V T may result from either a central or a direct peripheral action on inspiratory muscles. Even in the absence of respiratory effects evidenced by blood gas analysis, modifications in the different plethysmography parameters may support compensatory physiological mechanisms to avoid the deleterious consequences of the tested drug.

As previously reported (Chevillard et al., 2009), BUP administration induces a significant increase in T I . In our study, BUP combination with NLX led to a significant increase in f in comparison to BUP, resulting from a more limited increase in T I added to a more marked decrease in T E (although not significant) (Fig. 1 and Table 2). In our model, NLX alone significantly decreased T I and increased f in comparison to the solvent. In the literature, various stimulant effects have been attributed to NLX (Isom and Elshowihy, 1982;Sawynok et al., 1979). Additionally, NLX has been shown to enhance ventilatory response (increase in f and V T ) to hypercapnia (Schlenker et al., 1997) or hypoxia (Olson, 1987). NLX-related increase in the sensitivity of central ventilatory response to carbon dioxide was attributed to the displacement of endogenous endorphins from central opioid receptors. Interestingly, NLX infusion has also been demonstrated to increase oxygen consumption (Malin et al., 1985). However, this enhanced ventilatory response to NLX was disputed in other experimental studies showing no significant effects in rat (Baraban et al., 1993;Belenky and Holaday, 1979;Dai et al., 1983;Malin et al., 1985;Steinbrook et al., 1984). In our study, modifications induced by NLX co-administration to BUPrelated plethysmography effects could additionally be attributed to a certain degree of competition between both molecules at the opioid receptors, although BUP affinity exceeded naloxone's at all opioid-receptor types (inhibitory constant 0.08 nM for BUP vs. 0.93 nM for NLX, regarding mu-opioid receptors) (Emmerson et al., 1994;Raynor et al., 1994). Repeated administration of BUP during 14 days resulted in the development of tolerance to BUP-related respiratory effects as assessed by the reduction in BUP-induced T I increase at day 15.

To our knowledge, tolerance to BUP-related respiratory effects has not previously been assessed. In contrast, tolerance to antinociception has been shown to be more marked with BUP than morphine, due to BUP lower efficacy as a mu-opioid receptor agonist than morphine (Walker and Young, 2001).

Regarding BUP/NLX, we confirmed the occurrence of severe withdrawal symptoms following its administration to rats repeatedly treated with BUP, supporting the potential advantage of this combination in reducing iv BUP misuse in humans. In opioiddependent patients, iv injection of NLX or BUP/NLX was responsible for withdrawal features including systolic hypertension, tachypnea, muscle and stomach pains, mydriasis, yawning, anxiety, restlessness, and craving (Nigam et al., 1994;[START_REF] Preston | Buprenorphine and naloxone alone and in combination in opioid-dependent humans[END_REF]. Interestingly, such symptoms were suggested to explain the observed increase in cannabis and BZD consumption in BUP/NLX misusers (Bruce et al., 2009;Robinson et al., 1993).

As with BUP, respiratory depression resulting from BUP/NLX administration in combination with DZP resulted from a pharmacodynamic interaction involving GABA-A receptors, as demonstrated by its complete reversal when administering FLZ. BZD was mainly responsible for V T reduction that led, along with BUP-related T I increase, to a marked V E decrease (Fig. 2 and Table 2). Following FLZ administration, both DZP-related effects on V T and V E were reversed with or without NLX (Fig. 4). Interestingly, FLZ reversed BUP-related T I increase, suggesting that BUP-DZP interaction is due to an addition of their respective effects resulting from two separate pathways. Investigation of BUP-DZP interaction using plethysmography may suggest a combination of BUP-induced respiratory effects mediated by central targets and possible DZP-induced respiratory effects mediated by peripheral targets. Additionally, our data support that reversal of BUP-BZD-related central nervous system depression using FLZ observed in humans (Mégarbane et al., 2010) is exclusively related to the reversal of BZD effects by the GABA-A antagonist.

Surprisingly, we observed increased respiratory depression in naive rats but reduced respiratory depression in BUP-tolerant rats when combining DZP with BUP/NLX in comparison to BUP. To the best of our knowledge, pharmacokinetic interactions between DZP and NLX as well as any influence of treatment duration or regimen on such possible interactions have never been reported. Significant interactions between NLX and GABA receptors have been reported in several studies, although with contradictory results: both potentiating (Belzung and Agmo, 1997) and inhibiting BZDmediated effects (Svensson et al., 2000). In opioid-tolerant animals, we hypothesized that the occurring endocytosis, desensitization, and conformational modifications in membrane mu-opioid receptors (Williams et al., 2013) may have limited their interactions with GABA receptors including at the transduction level and consequently reduced the direct or indirect NLX effects on GABA receptors. If confirmed, our findings may support an interesting advantage of BUP/NLX in comparison to BUP in drug addicts chronically using BUP, despite its possible worsening effect in naïve individuals, where iv misuse is a less frequent condition. However, the exact molecular mechanisms of NLX effects remain to be investigated.

Our study has significant limitations. It may have been underpowered to show some differences between BUP/NLX and BUP. However, since we used 6 rats in each group for each experiment, we believe that where real differences were not assessed by our study, they would not be clinically pertinent.

Conclusions

In summary, significant differences in respiratory effects between BUP/NLX and BUP alone only exist in combination with DZP. We observed increased respiratory depression in naive rats but reduced respiratory depression in BUP-tolerant rats. The exact BUP/NLX benefits in humans remain to be determined. 4, 7,5, 4, 4, 1,5 and 75 ng/mL pour la BUP, la NBUP, la BUP-glucuronide, la NBUP-glucuronide, la NLX et la NLX glucuronide respectivement. La LQs pour tous les composés est de 4000 ng/mL. La Justesse (85-115,7%), la répétabilité (<14.3%) et la précision intermédiaire (<14.9%) sont en accord avec les recommandations internationales. La méthode a été appliquée avec succès pour quantifier les composés dans un échantillon de sang total de rat 24h après avoir reçu une injection IV de BUP/NLX (30.0/7.5 mg/kg).

Introduction

Buprenorphine (BUP), a semi-synthetic opioid derivate of thebaine, is widely used as an effective maintenance treatment in heroin addicts. Since 2006, a BUP/naloxone (BUP/NLX) combination has been marketed with the aim of preventing intravenous misuse of crushed buprenorphine tablets. In humans [1] as well as rodents [2,3], BUP was shown to exhibit ceiling respiratory effects in contrast to other opioids, supporting its safety profile. However, reports emerged of BUP-associated poisonings with typical opioid features and respiratory depression and even fatalities [4][5][6] while toxicity prevention using the BUP/NLX combination remains a matter of debate [7,8].

BUP is highly bound to blood proteins (96%) and metabolized in the liver by the cytochrome P450 3A4 into the active and toxic metabolite norbuprenorphine (NBUP) [9][10][11]. Both compounds are extensively conjugated by UDP-glucuronyl transferase to form the active metabolites, BUP-3-glucuronide and NBUP-3-glucuronide [12]. The mu-opioid receptor antagonist NLX is also conjugated to form an active metabolite, NLX-3-glucuronide [13].

In autopsy cases where BUP or NBUP had been detected in blood or urine, differences in blood concentrations of BUP and NBUP between BUP-attributed fatalities and cases with other causes of death were not clinically relevant [5,6,8,14], suggesting that BUP overdose cannot explain the patient's death by itself in the majority of cases. Mechanisms of BUPrelated toxicity remain thus still unclear, requiring extensive investigations based on experimental studies which mainly involve rats. Due to the small blood volumes sampled from rats, quantification of BUP and its metabolites in whole blood is requested to facilitate the experimental procedures and limit the number of animals in pharmacokinetic (PK) studies.

Quantification in whole blood in forensic laboratories is challenging due to the complexity and diversity of the components included in such a matrix, additionally requiring a sensitive and specific detection system such as liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). LC-MS/MS is considered as the technique of reference for drug analysis including BUP in forensic toxicology and situations requiring multiple sampling like PK studies [12,[15][16][17][18]. Various techniques were developed using solid-phase [15,17,19] or liquid-liquid extraction [20,21] to measure BUP and NBUP; however, these methods are not cost-and time-saving. Moreover, extraction of glucuronides into a lipophilic organic solvent is difficult due to their highly polar and hydrophilic properties [22]. Interestingly, BUP and NBUP were previously quantified using protein precipitation in plasma [18]; however, this method was not available for the measurement of other BUP metabolites. Additionally, BUP and metabolite concentrations were mainly measured in plasma, whether in humans [15,23] or rats [24,25], while urine, [16,26], breastmilk [19] and whole blood [20,27,28] were rarely used.

To the best of our knowledge, no study has developed a method of measurement of BUP and metabolites in rat whole blood. To facilitate the conduction of experimental investigations on the mechanisms of BUP-related toxicity, we aimed to develop an LC-MS/MS method allowing the simultaneous quantification of BUP, NBUP, NLX and their conjugated metabolites in rat whole blood using an preparation based on protein precipitation. We validated the method according to the international recommendations.

Materials and methods

Chemicals and reagents

BUP Hydrochloride and NLX-3-glucuronide (Lipomed AG, Arlesheim, Switzerland) were dissolved in methanol to obtain 1 and 0.1 g/L solutions, respectively. NBUP, BUP-3glucuronide, NBUP-3-glucuronide, BUP-d4, NBUP-d4 and NLX-d5 (Sigma-Aldrich, St Quentin, France) were dissolved in methanol to obtain 0.1 g/L solutions. NLX hydrochloride dihydrate (LGC, Molsheim, France) was dissolved in methanol to obtain a 0.81 g/L solution as anhydrous free base. Only three stable-isotope-labeled analogues, BUP-d4, NBUP-d3 and NLX-d5, were used as internal standards (IS). BUP-3-glucuronide-d3 and NBUP-3glucuronide-d3 were not available. Ammonium formate was purchased from Sigma-Aldrich (St Quentin, France). Methanol and acetonitrile (Carlo Erbra, Val de Reuil, France) were high performance liquid chromatography (HPLC)-grade. Water (Millipore, Molsheim, France) was deionized using milli-Q ultrapure water system

In the rat study, BUP hydrochloride powder was generously provided by Reckitt Benckiser (Evry, France) and diluted in 4% Tween ® (Sigma-Aldrich, St Quentin, France) for intravenous administration. NLX hydrochloride dihydrate powder (Sigma-Aldrich, France) was diluted in 4% Tween ® and mixed with BUP to obtain BUP/NLX solution at 4:1 ratio in agreement with the marketed Suboxone ® formulation.

2.2-Preparation of standard solutions

Before each experiment, two sets containing stock solutions of BUP, NBUP, BUP-3glucuronide, NBUP-3-glucuronide, NLX and NLX-3-glucuronide were prepared by dilution in methanol at 5000, 500, 50 and 5 ng/mL concentrations. One set was used to prepare calibration standards and the other to prepare the validation samples. IS stock solution (BUP-d4, NBUP-d3, NLX-d5) was diluted in methanol to obtain a working solution of 250 ng/mL. All these stock solutions were stored at -20°C.

2.3-Instrumentation

The LC-MS/MS analysis was performed with the Agilent 1260 infinity HPLC system (Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA) consisting of quaternary pumps, an autosampler and a vacuum degasser. Chromatographic separation was carried out using a Raptor TM biphenyl column (100 mm x 3 mm, 2.7 µm) (Restek, Bellefonte, PA, USA) with the adapted guard column. The HPLC system was coupled to an API 3200 TM triple quadrupole mass spectrometer (Sciex, Framingham, MA, USA) equipped with a turboV TM ion source operating in positive electrospray ionization (ESI + ). Instrument control and data acquisition were performed by Sciex Analyst R 1.6 software. For qualitative results, compound identification is typically performed by retention time matching and calculating the ratio of quantifier and qualifier multiple reaction monitoring (MRM) transition for each compound. For quantitative results, only quantifier MRM transition was used.

2.4-Method development 2.4.1. Sample preparation

The calibration and validation standard samples were freshly prepared each day over 3 days by spiking 50 µL of whole blood with the corresponding working solution (maximum of 12.5% of methanol in the whole blood sample). Eleven concentrations were used for calibration standards (1, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 1,000, 2,500 and 5,000 ng/mL) and eleven concentrations for validation standards in triplicate (0. 75, 1.5, 4, 7.5, 15, 40, 75, 150, 750, 1,500 and 4,000 ng/mL) aiming to cover concentrations observed in in vivo experimental studies (see section 2.6.). Whole blood samples (calibration and validation samples in triplicate) fortified with all compounds were spiked with 10 µL of IS stock solution. Samples were submitted to proteins precipitation by 140 µL of acetonitrile and were centrifuged at 18,213x g (12,700 rpm) for 10 min. Finally, 100 µL of the supernatant was transferred to a vial containing 300 µL of ultrapure water.

LC conditions

The HPLC column was held at 30°C. The mobile phases consisted of a mixed solvent system of aqueous ammonium formate buffer (solvent A) with 0.1% formic acid (pH 2.7; 0.25 mM) and methanol (solvent B). Gradient elution was performed at a constant 800-µL/min flow rate as follows: 1 min equilibration at 5% of B followed by a linear increase during 7 min from 5 to 95% of B and 2 min maintained at 95 % B. Then, the system was placed in the initial mobile phase conditions for 3.5 min to allow column equilibration. The injection volume was set at 80µL in full loop mode. Autosampler was kept at 8°C.

MS/MS conditions

Detection was carried out using scheduled MRM mode. However, surviving precursor ions were monitored to reduce lack of sensitivity of fragmented ions. Collision energies were optimized to monitor the two most abundant transitions per compound and used for identification and determination. Nitrogen was used as desolvation gas. Capillary voltage was set at 5,500 V and source temperature at 500°C. Dwell time was 62.5 ms for each MRM transition.

2.5-Method validation

The described procedure was designed as recommended for any new analytical method used in PK studies [29] and according to the accepted international recommendations [30][31][32]. Data were obtained using the e-noval ® software (Arlenda ® , Liege, Belgium). Calibration standards and validation samples were prepared independently from standard solutions on each validation day. The concentrations of compounds in validation samples were calculated from the area ratio between the compound and its corresponding IS, based on calibration curves prepared daily as described below. BUP-d4 was used as IS for BUP and BUP-3-glucuronide quantification, NBUP-d3 for NBUP and NBUP-3-glucuronide quantification and NLX-d5 for NLX and NLX-3-glucuronide quantification.

Freeze/thaw stability at -20°C

All the whole blood samples were frozen after blood collection and underwent one freeze/thaw cycle. All the studied compounds were reported to be stable over at least 9 months in whole blood or plasma [21,[36][37][38][39]. This delay between blood sampling and LC-MS/MS analysis was respected in our study. Additionally, according to the literature [29], assessment of compound stability in our study was not requested.

Precipitation recovery and matrix effect

As whole blood components are able to disturb quantification of compounds by signal suppression or enhancement, matrix effect was quantitatively evaluated, based on Matuszewski's approach [40]. Samples at low (15 ng/mL) and high (1500 ng/mL) concentrations were analyzed. IS concentrations were set at fixed concentrations (250 ng/mL) for all samples based on our procedure. Three different sample sets were prepared: (1) water samples spiked after precipitation in triplicate; (2) five different rat whole blood samples spiked after protein precipitation and (3) before protein precipitation in duplicate. The matrix effect of each compound was evaluated as the peak area ratio of ( 2) to (1) and was expressed as value above (enhancement) or below (suppression) 100 %. Precipitation recovery was estimated as the peak area ratio of (3) to ( 2) and was expressed as value above or below 100 %. For (1), the mean peak area of each triplicate was used as reference. For the five different whole blood (2 and 3), the mean peak area of each duplicate was determined. Variability between rat whole blood was expressed as percentage of coefficient of variation (% CV).

Variability of ME between five different sources of blank whole blood matrix was expected not to exceed 15% CV, but larger variability was acceptable if stable-isotope-labeled analogues are used as IS that effectively compensate for variability in matrix effect. [41].

Results and discussion

Method development

Sample preparation

We used a simple cost-and time-saving extraction technique based on protein precipitation which additionally allowed optimizing recoveries of glucuronide molecules. Acetonitrile was used for proteins precipitation, as recommended with acetonitrile-to-plasma ratio of 3:1 [42],

showing protein precipitation efficiency of 93.5%. Supernatants were reconstituted with water before injection to reach the initial phase composition of the chromatographic method and thus to improve the peak resolution of the method. IS addition increases the method's selectivity and validation performance despite the use of less purified extracts [41].

LC conditions

A Raptor TM biphenyl column was chosen because of its ability to provide highly retentive, selective and rugged reversed-phase separations of hydrophilic and lipophilic drugs and metabolites such as BUP. Increasing retention of conjugated compounds can reduce ion suppression. Chromatographic conditions were optimized at pH 2.7 according to most published methods of BUP quantification [15,23,26]. Elution was optimized to compensate for the lower selectivity due to monitoring of the precursor ion and for the sample treatment performed by protein precipitation that gave less purified extracts. The molarity of ammonium formate buffer was tested between 0.25 and 5 mM. The best selectivity and retention time stability were obtained at 0.25 mM. Polar methanol mobile phase was used according to Restek recommendations for increasing selectivity of the Raptor TM biphenyl column by pi (π) stacking. In the final chromatographic conditions, analytes were separated in less than 8 min which was faster than many published methods using LC-MS/MS for BUP quantification [12,15,17,43]. The retention time of BUP, NLX and their metabolites are listed in table 1. As recommended [41], isotope-labeled IS were used to improve the robustness of the method. BUP-3-glucuronide-d3, NBUP-3-glucuronide-d3, NLX-3-glucuronide-d5 were not available at the experimental time.

MS/MS conditions

For each studied compound, ionization parameters, cone voltages and collision energies were optimized by infusion of a 100 ng/mL solution into the detector at 10 µL/min flow rate in combination with the mobile phase. The positive mode was chosen. In a first step, fragmented ions with highest signals were chosen for MRM quantification. However, this detection method resulted in a poor sensitivity that was not in accordance with the expected LLOQ. To compensate this lack of sensibility, surviving parent ions with higher signals than their respective fragmented ions were monitored as previously reported for the detection of BUP [23,28,44]. Despite a decrease in selectivity compared to the usual MRM mode which detects fragment ions, monitoring parent ions improved sensitivity. Optimized qualifier and quantifier MRM transitions, cone voltage and collision energies are shown in table 1.

Method validation

Selectivity and carry over

No interference was observed at the retention time of the studied compounds and IS, based on six different blank whole blood (supplementary material). Signal to noise ratio at the LLOQ were 52, 40, 12, 12, 11 and 52 for BUP, NBUP, NLX, BUP-3-glucuronide, NBUP-3glucuronide and NLX-3-glucuronide, respectively. Our results were in accordance with the limit of at least 10, as recommended [30][31][32][33]. No carry over (0.01%) was observed when a mobile phase was analyzed just after the highest calibration standard (5,000 ng/mL) (data not shown).

Trueness, precision and range

LLOQs, ULOQs and LODs are shown in table 1. S/N ratios at the LODs and at the LLOQs were all superior to 3 and 10, respectively for all the compounds (supplementary data) and were in accordance with the international recommendations for validation of analytical methods [30][31][32][33]. MRM ratios at validation samples corresponding to the LODs and LLOQs were all within the 30% tolerance levels compared to the calibration standards (data not shown). Considering low whole blood volumes (50 µl), LLOQs and ULOQs of all the compounds of interest were suitable for BUP PK studies in the rat. Trueness and precision are shown in Table 3. Trueness for all the studied compounds was within 85-115% of the theoretical value (LLOQ 80-120%). Precision was within +/-15% CV (LLOQ 20%) [30][31][32][33].

Regarding the calibration range, the obtained profiles were within the acceptance limits of +/-40% (50% for NLX-glucuronide) proposed for toxicological analysis (data not shown).

Precipitation recovery and matrix effects

In rat whole blood, precipitation recovery and matrix effect were 77-110% and 55-129%, respectively (Table 4). The corresponding IS presented similar results. The ion suppression relative to BUP at low and high concentrations (55% and 57%, respectively) was compensated by the addition of stable-isotope-labeled analogues used as IS during the validation experiment. The ion enhancement relative to NBUP-3-glucuronide at low concentrations (129%) could not be compensated by its stable-isotope-labeled analogues due to lack of availability. Despite ion suppression/enhancement exceeding 25% for BUP, results were considered reproducible (CV <28%) and did not affect the other critical validation parameters and our in vivo experimental results (data not shown).

In vivo experimental application

This experiment was a part of a larger experimental in vivo PK study in rats conducted in our laboratory. Our experimental protocol was approved by our animal institutional ethic committee (Paris-Descartes University; N°15-081). The final objective of the PK study was to investigate the mechanisms of drug-drug interaction in the presence or absence of NLX in fatalities attributed to ethanol/buprenorphine combination. The final experimental study will be published elsewhere. In this experiment, we wished to observe BUP, NLX and metabolites time course during 24h. Seven-weeks-old male Sprague-Dawley rats (N=5) weighing 300 g and purchased from Janvier labs (Genest, France). Twenty-four hours before the drug administration, the rats was anesthetized with intraperitoneal 70 mg/kg ketamine (Ketalar ® ) and 10 mg/kg xylazine (Rompum ® ) and its femoral vein and artery catheterized, as previously reported [4]. BUP/NLX (30.0/7.5 mg/kg) was administered by the intravenous route and blood samples (150 µL) collected during 24h after drug administration by the arterial route.

The samples were homogenized and frozen immediately at -20°C until LC-MS/MS analysis to quantitate simultaneously BUP, NBUP, NLX and their glucuronide metabolites. Before analysis, the samples was spiked with the IS solutions and treated similarly to the calibration and validation samples.

An example of representative chromatograms of a whole blood sample of one rat 24h after drug administration is shown in figure 1.

Conclusions

We developed, fully validated and successfully used a sensitive and accurate LC-MS/MS method of simultaneous quantification of BUP, NLX and their metabolites in rat whole blood with extraction based on protein precipitation. The sample preparation and analytical conditions were optimized to increase sensitivity. This method is now available to investigate 26) 97 ( 33) 55 ( 28) 57 ( 19)

Norbuprenorphine 81 ( 20) 94 ( 16) 116 ( 24) 94 ( 15)

Naloxone 110 ( 14) 109 ( 9) 85 ( 13) 75 ( 2)

Buprenorphine-3-glucuronide 87 ( 17) 100 ( 15) 104 ( 21) 87 ( 7)

Norbuprenorphine-3glucuronide 77 ( 25) 105 ( 9) 129 ( 22) 100 ( 6)

Naloxone-3-glucuronide 81 ( 25) 100 ( 16) 112 ( 11) 114 ( 12)

Buprenorphine-d4 250 90 ( 25) 57 ( 18)

Norbuprenorphine-d3 106 ( 19) 73 ( 22)

Naloxone-d5 101 ( 7) 76 ( 8 ethanol/buprenorphine combination, protection provided by naloxone suggests an additional pharmacodynamic interaction.

Key words: buprenorphine; ethanol; naloxone; respiratory depression; plethysmography; pharmacokinetics Buprenorphine (BUP), a semi-synthetic opioid derivative of thebaine, is widely used as an effective maintenance therapy in heroin addicts (Nielsen et al., 2016). BUP acts as a highaffinity partial agonist at the mu-opioid receptor (MOR) (Cowan et al., 1977). In humans (Yassen et al., 2007) and rodents (Chevillard et al., 2009), BUP was shown to exhibit ceiling respiratory effects in contrast to other opioids supporting its safety profile. However, fatalities due to asphyxia and poisonings with typical opioid features have been attributed to BUP in the context of snorting, intravenous (IV) injection of crushed tablets or concomitant exposure to psychotropic drugs, mainly benzodiazepines and ethanol (Ferrant et al., 2011;Häkkinen et al., 2012;Seldén et al., 2012). BUP/naloxone (NLX) combination (ratio 4:1)

has been marketed to reduce diversion and abuse (Mendelson and Jones, 2003); but its relevance remains debated (Hakkinen et al., 2013;Pedapati et al., 2011). Additionally, the effectiveness of naloxone in reversing BUP-attributed central nervous system (CNS) depressant effects in overdose is still unclear due to the high affinity of BUP for the MOR (Mégarbane et al., 2010).

BUP concentrations in fatalities are usually within the therapeutic range (Kintz, 2001). In autopsy cases where BUP had been detected, no significant differences in blood BUP concentrations and in the percentage of cases with positive ethanol detection were observed between fatalities attributed to BUP and fatalities where BUP was not the cause of death (Hakkinen et al., 2012;Selden et al, 2012). These findings supported the proposition that neither ethanol nor BUP could separately explain the death onset, clearly suggesting drugdrug interactions between the molecules. Intuitively, a pharmacodynamic mechanism of interaction was suggested, ethanol targeting the γ-aminobutyric acid (GABA)-A receptor and BUP targeting the MOR resulting in deleterious CNS consequences. Alternatively, the contribution of norbuprenorphine (NBUP), the major N-desalkyl BUP metabolite with established in vivo sedative and respiratory depressant effects in rodents (Alhaddad et al., 2011;Hreiche et al., 2013;Mégarbane et al., 2005;Ohtani et al., 1997) was suggested.

Additionally, the possible deleterious role of glucuronide derivates including the NBUP-3glucuronide, shown to bind to the opioid receptor subtypes in vitro and to exhibit sedative and respiratory effects in a mice model was examined (Brown et al., 2011).

Therefore, we decided to characterize the deleterious interaction between ethanol and BUP and clarify its mechanism. We designed a rat study aiming (1) to describe the neurorespiratory effects resulting from the co-administration of ethanol and BUP in the presence or absence of NLX; (2) to study the reversal of the observed effects using flumazenil and naloxone, the two antidotes available at the bedside to treat poisoned patients; and (3) to determine the pharmacokinetics (PK) of ethanol, BUP and its active metabolites including NBUP and the glucuronide derivatives.

MATERIALS AND METHODS

The experiments were carried out within the ethical guidelines established by the National

Institutes of Health and the French Ministry of Agriculture. Our protocols were approved by the Paris-Descartes University animal institutional ethics committee (N°15-081).

Animals. We used 7-8week old male Sprague-Dawley rats weighing 250-300g at the time of experiment (Janvier-labs, Genest, France). Animals were housed in well-ventilated cages at 20-22°C with 55±10% relative humidity and maintained under a 12-h dark/light cycle (light from 8:00 a.m. to 8 p.m.) for at least one week before the experiments. Food was provided ad libitum until 12h before rat gavage with ethanol.

Chemicals and Drugs.

For rat experiments, BUP hydrochloride, generously provided by Reckitt Benckiser (Massy, France) was diluted in 4% Tween ® (Sigma-Aldrich, St Quentin, Surgery procedures. For the plethysmography study, a venous femoral catheter was inserted four days before the experiment to allow IV administration of the drugs. For the PK study, both venous and artery femoral catheters were inserted the day before the experiment to allow IV administration of the drugs and arterial blood sampling, respectively. For catheterization, the rat was anesthetized with intraperitoneal 70 mg/kg ketamine (Ketalar ® ) and 10 mg/kg xylazine (Rompum ® ) and placed on a warming blanket with regulating thermostat. The femoral vein and/or artery was catheterized using 30cm silastic tubing with external and internal diameters of 0.94 and 0.51 mm, respectively (Dow Corning Co., Midland, MI) as previously described (Cohier et al., 2014) . The catheter was subcutaneously tunneled and fixed at the back of the neck. Heparinized saline was injected to prevent thrombosis and catheter obstruction. Simultaneously, for the plethysmography study, a temperature transmitter (DSI, Chatillon, France) was implanted in the rat peritoneal cavity. Then, the rat was returned to its individual cage for a minimum 72h recovery period and complete anesthesia washout.

Body temperature and plethysmography parameters measurement. Ventilatory parameters were recorded in a whole-body plethysmograph by the barometric method. On the day of experiment, the rat was placed in a rectangular Plexiglas chamber with a 3l volume connected to a reference chamber of the same size by a high-resistance leak to minimize the effect of pressure changes in the experimental room. The animal chamber was flushed continuously

with humidified air at a rate of 5 l/min. During the recording periods, the inlet and outlet tubes were temporarily clamped and pressure changes associated with each breath were recorded using a differential pressure transducer (Validyne MP, 45 ± 3 cmH2O, Northridge, CA), connected to the animal and reference chambers. During each measurement, calibration was performed by three injections of 1ml air into the chamber. Room temperature was noted.

The spirogram was recorded and stored on a computer with an acquisition data card (PCI-DAS 1000, Dipsi, Chatillon, France) using respiratory acquisition software (Acquis1 Software, CNRS, Gif-sur-Yvette, France) for analysis off-line.

The technique was validated daily with a series of leak tests (leak was considered when reduction in the signal amplitude exceeded 33% in 5s). The quantification threshold corresponded to a minimum air volume injection of 30 µl. Within the range of tested volumes (0.1-3 ml), measurements were linear. The mean coefficient of intra-day variability (four series of five measurements carried out the same day) was 1.32 ± 0.18%. The mean coefficient of inter-day variability (25 measurements carried out on three different days) was 1.69 ± 0.11%. We checked that the mean CO2 measured using an Ohmeda 5250 RGM capnograph (rebreathing test) during clamping periods did not exceed 0.6% of the air contained in the chamber. During the experiment, the first measurement was performed after a 30-60min period of accommodation, when the rat was quiet but not in deep or rapid eye movement sleep, grossly estimated from observing the behavior, response to noise, and pattern of breathing. The rat was then gently removed from the chamber for drug administration, and replaced in the chamber for the remaining measurements. Body temperature and ventilatory parameters were recorded at 5,10,15,20,25,30,40,[START_REF] Corsenac | Road traffic crashes and prescribed methadone and buprenorphine: A french registry-based case-control study[END_REF]60,[START_REF] Goullé | Éthanol : pharmacocinétique, métabolisme et méthodes analytiques[END_REF]120,150,180,210 and 240 min, each recording lasting about 60s. We measured the tidal volume (VT), the inspiratory time (TI) and the expiratory time (TE). Additional parameters were calculated including the respiratory frequency (f), the total respiratory time (TTOT) and the minute ventilation (VE = VT * f). At the end of the experiment, rats were euthanized with lethal intraperitoneal injections of pentobarbital.

Gas chromatography coupled to flame ionization detection (GC-FID).

A chromatographic system including a Thermofinnigan Tace GC ® (Thermo Fisher Scientific, Villebon-sur-Yvette, France) was used to measure whole blood ethanol concentrations. The column used was a Hewlett Packard-Blood Alcohol (7.5 m x0.32 mm x20 µm;Chromoptic,Coutaboeuf,France). After warming at 85°C during 30min, 1 ml of head space of sample was injected and eluted to the GC column. The GC column was initially held at 120°C during 1min, then temperature was increased to reach 165°C at 25°C/min during 1.9min and held 2.2min at 165°C. Temperature of hydrogen/air flame was held at 250°C inside the flame ionization detector. Whole blood ethanol concentrations were quantified by using the peak area ratio between ethanol and the IS as previously described (Roussel et al., 2012). The ratio was then calculated on the basis of calibration curves prepared each day (10-400 mg/l). Controls ( 50and 110 mg/l) were included in each analytical batch.

Liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS 2 ). LC-MS 2 analysis

was performed with Agilent 1260 infinity HPLC system (Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA) consisting of quaternary pumps, an autosampler and a vacuum degasser.

Chromatographic separation was carried out using a Raptor TM biphenyl column [(100mm x 3mm (internal diameter); 2.7µm (particle size)] (Restek, Lisses, France) with the corresponding guard column. The HPLC system was coupled to an API 3200 TM triple quadrupole mass spectrometer (Sciex, Framingham, MA, USA) equipped with a turboV TM ion source operating in positive electrospray ionization. Instrument control and data acquisition were performed using Analyst ® 1.6 software (Sciex, Framingham, MA, USA).

The HPLC column was held at 30°C. The mobile phases consisted of a mixed solvent system of 0.25 mM aqueous ammonium formate with 0.1% formic acid (solvent A) and methanol (solvent B). Gradient elution was performed at a constant 800µl/min flow rate as follows:

1min equilibration followed by a linear decrease during 7min from 95 to 5% of solvent A and 2min maintained at 5% of solvent A. The system was then placed in the initial mobile phase conditions during 3.5min to allow column washing. The injection volume was set at 80µl in full loop mode. Autosampler was kept at 8°C. Detection was achieved using scheduled multiple reactions monitoring mode (MRM). Collision energies were adjusted to optimize surviving parent ions signal. Nitrogen was used as desolvation gas. Capillary voltage was set at 5500 V and source temperature at 500°C. Dwell time was 62.5ms for each MRM transition. MRM transition states, cone voltages and collision energies optimized for each compound are presented as supplementary data. The described procedure was validated according to the internationally accepted recommendations. The limit of detection and the lower and upper limits of quantification for each compound are listed in the supplementary data. Whole blood samples from BUP-treated rats (50µl), blank whole blood samples fortified with analytes for the calibration curve (1-5000 ng/ml) and quality controls (15,150 and 1500 ng/ml) included in each analytical batch were spiked with 10 µl IS solution at 250 ng/ml. Methanol/acetonitrile was added to precipitate proteins and the samples were centrifuged at 18,213x g (12,700 rpm) for 10min. One hundred µl of the supernatant was transferred to vials containing 300µl sterile water and submitted to instrumental analysis.

Each compound was quantified using the peak area ratio between the analyte and its respective IS. The drug concentrations were computed on the basis of calibration curves prepared each day.

Study design

Dose regimen and drug administration -Ethanol (3 g/kg) was administered by gavage in rats fasted for at least 12h to avoid significant variability in gastrointestinal ethanol absorption (Gentry, 2000). The dose of 3 g/kg ethanol was chosen as devoid of significant respiratory effects in rats, as previously published (Roussel et al., 2015) and checked in a preliminary study (data not shown), leading additionally to expected blood peaks in the range of concentrations usually found in BUP-attributed fatalities. BUP and BUP/NLX were administered by IV route to mimic crushed pill injection in drug addicts. The dose of 30 mg/kg BUP was chosen as devoid of respiratory effects in rats except for an increase in TI (Cohier et al., 2014). The 4:1 ratio of BUP/NLX combination (30 mg/kg to 7.5 mg/kg) was in agreement with the marketed Suboxone ® formulation. BUP or BUP/NLX was administered IV 30 min after the gavage at the previously reported ethanol peak time observed after intragastric (IG) administration (Jones et al., 1997;Roine et al., 1991). To study the reversal of neurorespiratory effects related to ethanol/BUP combination, FLZ (10 mg/kg) and NLX (7.5 mg/kg) were injected at peak respiratory depression (i.e. 5 min after BUP administration). The IV dose of 10 mg/kg FLZ was chosen as it allows complete reversal of BZD-related effects in rats (Cohier et al., 2014).

Study 1 -Neurorespiratory effects. Fasted rats were randomized into four groups (N=6/group) to receive 0.9%NaCl + BUP, 0.9%NaCl + BUP/NLX, ethanol + BUP or ethanol + BUP/NLX. Subsequently, sedation, temperature and plethysmography parameters were measured during 240 min.

Study 2 -Reversion of the neurorespiratory effects. Fasted rats received ethanol + BUP and were randomized into 3 groups (N=6/group) to receive 10 mg/kg FLZ, 7.5 mg/kg NLX or 4%

Tween at 5min after BUP administration. Subsequently, sedation, temperature and plethysmography parameters were determined before (5 min) and after antidote administration (10, 15 and 20 min).

Study 3 -PK analysis. Fasted rats were randomized into five groups (N= 6-8/group) to receive ethanol + 4% Tween, 0.9%NaCl + BUP, 0.9%NaCl + BUP/NLX, ethanol + BUP and ethanol + BUP/ NLX. Subsequently, serial arterial blood (130 µl) was sampled from each rat after the IG administration of ethanol or 0.9%NaCl (10, 20 and 30 min) and after the IV administration of BUP, BUP/NLX or 4% Tween (5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 90, 120, 180, 240, 300, and 360 min). Whole blood was collected in heparinized microtubes and immediately frozen at -20°C until analysis. We chose to measure concentrations in whole blood since available data in human fatalities have been measured in this matrix.

PK modeling

Ethanol PK was determined after IG administration of 3g/kg ethanol and analyzed using a non-linear mono-compartmental model with oral delay described by the following differential equation:

where CWB is ethanol concentration in VWB (apparent whole blood volume), ka the absorption rate constant of ethanol after IG administration, D the oral ethanol dose, and VM and KM the Michaelis-Menten constants for nonlinear ethanol elimination. The initial condition of Equation 1was set to 0. BUP PK was determined after IV administration of 30 mg/kg and analyzed using a two-compartmental model that fitted well the following equation: CWB = Ae - αt + Be -βt , where CWB is the whole blood drug concentration at time t, the terms A and B the extrapolated zero intercepts, and α and β the apparent first-order elimination rate constants.

The volume of distribution in the central compartment (Vd), the elimination half-life (t1/2β) and the clearance were calculated as follows: Vd = Dose/(A+B), t1/2β = 0.693/kel, where kel is the overall elimination rate constant, and Cl = Vd*kel. BUP metabolites PK were described by a non-compartmental analysis. The best fitted line for the different models was selected after visual inspection of the predicted vs. observed and residual plots, the analysis of the objective function, the Akaike criteria and the precision of the estimates (mean and CV). PK parameters were determined as follows: Cmax and Tmax were the actual observed values. The area under the concentration-time curve from time zero to 360 min (AUC0-360) was calculated using the trapezoid method and the area under the concentration-time curve from

RESULTS

Study 1 -Neurorespiratory effects

Rats treated with ethanol + BUP (P < .01) and ethanol + BUP/NLX (P < .05) were significantly more sedated in comparison to their respective controls (Figure 1). In contrast, no significant difference in sedation was observed between rats treated with 0.9%NaCl + BUP and 0.9%NaCl + BUP/NLX. Temperature significantly decreased in rats treated with ethanol + BUP and ethanol + BUP/NLX in comparison to their respective controls (P < .001).

In rats treated with ethanol + BUP, temperature decreased at 5, 10, 15, 20, 25 and 30 min (P < .001), 40 and 50 min (P < .01) and 60, 180 and 210 min (P < .05); in rats treated with ethanol + BUP/NLX, temperature decreased at 5,10,15,20,25,30 and 40 min (P < .01) and 40,[START_REF] Corsenac | Road traffic crashes and prescribed methadone and buprenorphine: A french registry-based case-control study[END_REF]60,[START_REF] Goullé | Éthanol : pharmacocinétique, métabolisme et méthodes analytiques[END_REF]120,150,180,210 and 240 min (P < .05).

Co-administration of ethanol with BUP/NLX or BUP alone resulted in significantly different patterns of plethysmography parameters (Figure 1). When co-administering ethanol vs.

0.9%NaCl to BUP-treated rats, TI was significantly increased (AUC: P < .01) at 5 min (P <

.001) and 10 and 15 min (P < .01) and VE reduced (AUC: P < .01) at 5 and 15 min (P < .01).

When co-administering ethanol vs. 0.9%NaCl to BUP/NLX-treated rats, VT was significantly reduced (AUC: P < .001) at 5 min (P < .05) and 10 min (P < .05) but VE not significantly modified when comparing the AUCs. VE was only significantly reduced at 5 min in comparison to the baseline (P < .001). Co-administration of ethanol with BUP in comparison to BUP/NLX resulted in a significant decrease in TI (AUC: P < .05) at 10 and 15 min (P <

.001) and 20 min (P < .01), VT (AUC: P < .05) at 60 min (P < .001) and 90 min (P < .01) and VE (AUC: P < .01) at 15 min (P < .05).

In rats, neither BUP nor BUP/NLX resulted in respiratory depression, as previously shown (Chevillard et al., 2009;Cohier et al., 2014), supporting the well-known BUP-attributed ceiling response and its preservation by NLX. However, in combination with ethanol, BUP resulted in rapid-onset but transient sedation and decrease in VE (duration: ∼20min).

Interestingly, in the presence of NLX, respiratory depression was more limited (duration: ∼5min) while sedation was not modified. Our data suggested that NLX is able to limit the deleterious respiratory effects induced by ethanol/BUP in contrast to ethanol/diazepam combination (Cohier et al., 2014). NLX-induced modifications to BUP-related plethysmography effects can be attributed to a certain degree of competition between these molecules at the MOR, although BUP affinity exceeded naloxone's at all opioid-receptor types (inhibitory constant: 0.08 nM for BUP vs. 0.93 nM for NLX, regarding MORs) (Emmerson et al., 1994;Raynor et al., 1994). The ethanol/BUP combination was able to significantly increase TI, supporting the synergic/additional enhancing ethanol-related effects on the consistently reported BUP-induced TI increase (Chevillard et al., 2009). Interestingly, these effects, related to an action on breathing control centers, were prevented by NLX.

Surprisingly, the ethanol/BUP combination in the presence of NLX significantly decreased VT, an effect attributed to either a central or direct peripheral action on inspiratory muscles.

However, its exact mechanism remains to be determined.

We investigated the PK interactions between ethanol and BUP. BUP did not significantly alter ethanol peak or the time-course of its blood concentration. Additionally, NLX did not lower blood ethanol concentrations, contrasting with previous questionable data (Badawy and Evans, 1981). Interestingly, in the presence of ethanol, BUP Vd was increased and consequently the area under its concentration-time curve decreased without additional alterations induced by NLX. Ethanol is known to damage the bilayer structure of cell membranes (Gurtovenko and Anwar, 2009) and increase cell permeability to low-permeability drugs including opioids in monolayer cell cultures (Volpe et al., 2008). Ethanol induces dose-dependent denaturation in the albumin protein in vitro with changes in the skeleton structure including conversion of intramolecular to intermolecular hydrogen-bonded beta-sheet and alterations in the microenvironment of tryptophan residues (Lin et al., 2004;Liu et al., 2010). Due to direct interactions with specific hydrophobic binding sites (Avdulov et al., 1996), ethanol increases the unbound fraction of various albumin-bound drugs as demonstrated with warfarine (Tatsumi et al., 2007). Therefore, based on a reported ~66%binding rate to albumin (Nanovskaya et al., 2009), we hypothesized that ethanol-induces the displacement of the highly lipophilic BUP molecules from albumin's binding sites, which become readily available to cross the brain-blood barrier and contribute to enhanced CNS effects. The rapid and high tissue diffusion and the elevated lipophilicity of BUP may explain why in BUP-attributed fatalities, blood concentrations probably decrease rapidly to reach the therapeutic range while post-mortem brain, kidney and liver concentrations are much higher and better correlated with toxicity (Kintz, 2001;Gaulier et al., 2000).

We found that ethanol induces significant increase in NBUP and NBUP-3-glucuronide metabolic ratios. Ethanol metabolism increases the reduced-to-oxidized nicotinamide adenine dinucleotide (NADH/NAD) ratio (Cederbaum, 2012), diminishing the liver UDP-glucuronic acid required to produce BUP glucuronide derivates and thus increasing BUP desalkylation to NBUP. Consistently, ethanol was shown to inhibit morphine glucuronidation to morphine-3glucuronide in rat hepatocytes (Bodd et al., 1986). Morphine reduced to morphine-3glucuronide was similarly observed in the presence of ethanol in heroin-related fatalities (Polettini et al., 1999).

In the largest series of 182 BUP-attributed fatalities, blood concentrations of BUP and NBUP were found in the 0.2-100 ng/ml and 0.2-89 ng/ml ranges, respectively resulting in NBUP-to-BUP ratios of 0.056 -10 (Hakkinen et al., 2012). Interestingly, maximum BUP and NBUP concentrations measured 10min after IV injection of 16mg BUP in volunteers were 137.7±18.8 ng/ml and 3.7±0.7 ng/ml, respectively (Huestis et al., 2013). In some fatalities, relatively high plasma and tissue NBUP concentrations were found (Gaulier et al., 2000),

suggesting NBUP contribution to BUP-attributed death whereas in other cases, NBUP concentrations were surprisingly low, suggesting rapid death onset after BUP exposure and before much BUP metabolism to NBUP (Bardy et al., 2015). NBUP is a potent respiratory depressor with ~10 fold greater depressant activity than BUP (Ohtani et al., 1995). Dosedependent ventilatory depression was obtained following NBUP administration in rats (Mégarbane et al., 2006;Ohtani et al., 1997) while sedation and decrease in the tidal volume were observed with NBUP-3-glucuronide in mice (Brown et al., 2011).In rats, BUP was shown to be protective against NBUP-related depressive effects on ventilation (Mégarbane et al., 2006). Plasma NBUP-to-BUP ratios resulting in the onset of such protective effects ranged from 7.83±1.95 to 10.04±3.27. In our study, the whole blood NBUP-to-BUP concentration ratios ranged from 0.09 to 1.24 with no significant differences in relation to the time-course and co-treatments received by rats (i.e. in the presence or not of CNS depression). Although a trend to increased NBUP-to-BUP concentration ratios was observed in the rat blood in the presence of ethanol, brain concentrations of BUP and NBUP may more likely predict the onset of CNS toxicity than their ratio in the peripheral blood, considering that ethanol increases NBUP and NBUP-3-glucuronide production and enhances BUP Vd.

Pharmacodynamic interactions between opioids and ethanol have also been suggested to explain the worsened CNS effects resulting from their combination. Ethanol exerts its CNS effects by non-selectively disordering ligand-gated ion channels such as GABA-A and glutamate receptors (Dopico and Lovinger, 2009). In our study, respiratory depression resulting from the ethanol/BUP combination did not involve the benzodiazepine ligand site of GABA-A receptors, since no reversal using FLZ was obtained. However, GABA-A receptors are known to be important CNS targets of ethanol (Kumar et al., 2009) and may thus be involved by other binding sites. Interestingly, RO15-4513, a GABA-A (α4β3δ) receptor antagonist was shown to reverse ethanol-induced sedation [START_REF] Wallner | Alcohol selectivity of β3-containing GABAA receptors: evidence for a unique extracellular alcohol/imidazobenzodiazepine Ro15-4513 binding site at the α+βsubunit interface in αβ3δ GABAA receptors[END_REF]. The authors proposed a model in which β3and δ-containing GABA receptors present a unique ethanol site at the α4/6+β3-subunit interface. We did not assess the effectiveness of this GABA-A receptor antagonist to reverse ethanol/BUP combination-related respiratory effects.

Rat studies showed that acute intake of ethanol is able to release endogenous opiate peptides in the brain (Jarjour et al., 2009;Méndez et al., 2010). Deleterious CNS effects induced by ethanol/BUP combination may thus result from the combination of the effects of the exogenous opioid (i.e. BUP) and the effects of the endogenous opioids released by ethanol.

Interestingly, although quite questionable, NLX effectiveness to antagonize ethanol-induced narcosis was reported in rats (Badawy and Evans, 1981) and humans (Sørensen and Mattisson, 1978). In our study, NLX did not reverse the respiratory depression attributed to the ethanol/BUP combination even though it was administered at its peak onset. However, when BUP was combined with ethanol in the presence of NLX, significantly reduced respiratory depression was observed. BUP exhibits slow association with the MOR (equilibration time: ~30min) (Boas and Villiger, 1985), allowing NLX to act on the MOR (Canestrelli et al., 2014) and block BUP effects (Shannon et al., 1984;[START_REF] Tzschentke | Behavioral pharmacology of buprenorphine, with a focus on preclinical models of reward and addiction[END_REF]. To date, NLX usefulness and optimal dose regimen to reverse BUP-attributed CNS depression remains a matter for debate.

Finally, ethanol was shown in volunteers to significantly reduce the genioglossal muscle activity (Robinson et al., 1985) and consequently increase the upper airway resistance (Krol et al., 1984). Ethanol was also shown to inhibit neuromuscular transmission in the rat phrenic nerve-diaphragm preparation, via pre-and postjunctional mechanisms (Wali and Hayter, 1988). All these findings suggest that respiratory depression induced by the ethanol/BUP combination may result from BUP-induced alteration in the adapted response of the brainstem ventilation control centers to ethanol-induced upper airway obstruction and diaphragm dysfunction. However, this hypothesis remains to be demonstrated.

Our study has significant limitations. It may have been underpowered to show some differences between the studied groups. However, since we used 6-8 rats/group for each experiment, we believe that where real differences were not assessed, they would not be clinically pertinent. Additionally, we did not investigate respiratory effects by blood gas analysis able to assess the ultimate drug-induced respiratory depression; however, modifications in the plethysmography parameters remain useful to investigate clarify the nature of possible drug-drug interactions and show compensatory physiological mechanisms developed to avoid drug-related deleterious consequences.

CONCLUSION

An ethanol/BUP combination is responsible for neurorespiratory depression in the rat, more limited in the presence of NLX, however not reversed by FLZ or NLX, the two antidotes available at the bedside. In addition to possible pharmacodynamic interactions, ethanol increases NBUP production which may contribute to the deleterious effects of the ethanol/BUP combination. Our study supports the benefit of the NLX/BUP combination in comparison to BUP to limit CNS depression that may result from ethanol/BUP co-exposure. 3. Determination of norbuprenorphine-to-buprenorphine (BUP) concentration ratios in the whole blood in relation to the sampling time following BUP administration in four groups of rats receiving intragastric (IG) 0.9%NaCl + intravenous (IV) 30 mg/kg BUP, IG 0.9%NaCl + IV 30 mg/kg BUP/7.5 mg/kg naloxone (NLX), IG 3 g/kg ethanol + IV 30 mg/kg BUP and IG 3 g/kg ethanol + IV 30 mg/kg BUP/7.5 mg/kg NLX. Each group consisted of 6-8 rats.

Norbuprenorphine-to-buprenorphine concentration ratios in the whole blood pour 100 000) [START_REF] Fernandez | Trends in opioid-related fatal overdoses in Massachusetts, 1990-2003[END_REF]. Par ailleurs, le taux de décès parmi les consommateurs de drogues en Europe était évalué comme sept fois supérieur à celui de la population mondiale [START_REF] Frischer | Mortality and survival among a cohort of drug injectors in Glasgow, 1982-1994[END_REF] et al., 2012;[START_REF] Kintz | A new series of 13 buprenorphine-related deaths[END_REF].

La dépression du SNC est la circonstance principale de décès à la suite de l'usage d'un opioïde. La dépression respiratoire mortelle est possible, même dans un cadre thérapeutique aux doses prescrites [START_REF] Corkery | The effects of methadone and its role in fatalities[END_REF][START_REF] Drummer | Recent trends in narcotic deaths[END_REF][START_REF] Pirnay | A critical review of the causes of death among post-mortem toxicological investigations: analysis of 34 buprenorphine-associated and 35 methadone-associated deaths[END_REF][START_REF] Schumann | Fentanyl epidemic in Chicago, Illinois and surrounding Cook County[END_REF]. Les effets respiratoires apparaissent suite à l'action inhibitrice de l'opioïde sur les neurones contrôlant le rythme de la respiration (le complexe parafacial, le complexe Pré-Bötzinger ainsi que le complexe post-inspiratoire) et exprimant à leur surface des RO.

L'activation de ces récepteurs par les opioïdes induit une hyperpolarisation membranaire des neurones et active les canaux potassium qui, à doses élevées, provoquent l'arrêt de l'activité neuronale pouvant aller jusqu'à l'arrêt total des mouvements respiratoires. Cette dépression peut apparaître à l'occasion d'une surdose en opioïde, lors de la mise en place d'un traitement ou surtout lors de la réintroduction de la substance après une période d'abstinence [START_REF] Druid | Evaluation of the role of abstinence in heroin overdose deaths using segmental hair analysis[END_REF] et al., 2001;Hreiche et al., 2006;Nielsen et Taylor, 2005). Néanmoins, la présence de NLX empêche l'allongement du TI induite par la BUP. Cette modification, déjà établie suite à l'administration de BUP seule chez le rat (Hreiche et al., 2006) doit être considérée comme le marqueur de tout traitement par BUP médié par les RO-μ (Chevillard et al., 2009).

Dans notre modèle, la NLX seule abaisse le TI et augmente la f. Ces effets stimulants sur la respiration ont déjà été rapportés dans la littérature (Isom et Elshowihy, 1982;Sawynok et al., 1979). En outre, il a été démontré que la NLX augmente la réponse ventilatoire (f et VT) à l'hypercapnie (Schlenker et al., 1997) ou à l'hypoxie (Olson, 1987). L'augmentation de la sensibilité de la réponse centrale ventilatoire au dioxyde de carbone a été attribuée au déplacement des endorphines endogènes de leurs RO centraux. De manière intéressante, il a également été démontré qu'une infusion de NLX augmente la consommation d'oxygène (Malin et al., 1985). Mais ces modifications restent discutées, d'autres auteurs n'ayant montré aucun effet respiratoire significatif de la NLX chez le rat (Baraban et al., 1993;Belenky et Holaday, 1979;Dai et al., 1983;Malin et al., 1985;Steinbrook et al., 1984). Dans notre étude, les modifications des effets respiratoires induites par la présence de NLX dans le mélange BUP/NLX peuvent aussi être attribuées à un certain degré de compétition des deux molécules sur leurs récepteurs, bien que l'affinité de la BUP sur le RO-μ soit supérieure à celle de la NLX (constante d'inhibition 0,08 nM pour BUP et 0,93 nM pour NLX) (Emmerson et al., 1994;Raynor et al., 1994).

IV. Celle-ci est liée à une synergie PD entre le DZP et la BUP, comme suggéré préalablement (Gueye et al., 2002;Mégarbane et al., 2010;Pirnay et al., 2008) (Mégarbane et al., 2010).

IV.1.2.2. Effets respiratoires de l'association de diazépam et de buprénorphine chez le rat tolérant Après traitement répété par la BUP, nous avons réussi à induire une dépendance et une tolérance, respectivement démontrées par l'apparition d'un syndrome de sevrage à l'injection IV de BUP/NLX et par la disparition de l'augmentation du TI, marqueur respiratoire de la réponse à une dose unique de BUP (Hreiche et al., 2006;Mégarbane et al., 2010). À ce jour, aucune étude expérimentale n'avait analysé les effets de la BUP ou du mélange BUP/NLX chez le rat devenu tolérant à la BUP. Toutes les études expérimentales conduites sur les effets respiratoires de la BUP et de sa combinaison à une BZD ont été effectués à l'aide d'injections uniques des drogues chez des animaux naïfs [START_REF] Borron | Flunitrazepam variably alters morphine, buprenorphine, and methadone lethality in the rat[END_REF]Chevillard et al., 2009;Gueye et al., 2002Gueye et al., , 2001;;Hreiche et al., 2006;Nielsen et Taylor, 2005;Pirnay et al., 2008).

Dans ce travail, nous avons réussi à étudier les effets de la BUP administrée sous la forme du Chez des animaux tolérants, la désensibilisation et les modifications de conformations des RO-μ (Williams et al., 2013) sembleraient limiter les interactions avec les récepteurs GABA-A incluant le niveau de transduction du signal et par conséquent réduit les effets directs ou indirects de la NLX sur les récepteurs GABA-A (Belzung et Agmo, 1997;Svensson et al., 2000). [START_REF] Ceccato | Sensitive determination of buprenorphine and its N-dealkylated metabolite norbuprenorphine in human plasma by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry[END_REF][START_REF] Gopal | Characterization of the pharmacokinetics of buprenorphine and norbuprenorphine in rats after intravenous bolus administration of buprenorphine[END_REF][START_REF] Pirnay | Liquid chromatographic-electrospray ionization mass spectrometric quantitative analysis of buprenorphine, norbuprenorphine, nordiazepam and oxazepam in rat plasma[END_REF] et plus rarement les métabolites glucurono-conjugués en raison des propriétés hautement hydrophiles de celles-ci (Trontelj, 2012). Les seules études quantifiant les métabolites de phase I et II utilisaient un traitement d'échantillon plutôt long et couteux [START_REF] Ceccato | Sensitive determination of buprenorphine and its N-dealkylated metabolite norbuprenorphine in human plasma by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry[END_REF][START_REF] Concheiro | Simultaneous analysis of buprenorphine, methadone, cocaine, opiates and nicotine metabolites in sweat by liquid chromatography tandem mass spectrometry[END_REF]Polettini et Huestis, 2001;[START_REF] Swortwood | Simultaneous quantification of buprenorphine, naloxone and phase I and II metabolites in plasma and breastmilk by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[END_REF] (Brown et al., 2011;[START_REF] Ceccato | Sensitive determination of buprenorphine and its N-dealkylated metabolite norbuprenorphine in human plasma by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry[END_REF][START_REF] Concheiro | Simultaneous analysis of buprenorphine, methadone, cocaine, opiates and nicotine metabolites in sweat by liquid chromatography tandem mass spectrometry[END_REF][START_REF] Lüthi | Buprenorphine and norbuprenorphine quantification in human plasma by simple protein precipitation and ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[END_REF]. Le sang total était la matrice sanguine la plus appropriée, le plasma n'étant pas adapté à une étude PK de notre envergure et n'est pas toujours disponible lors d'un prélèvement autopsique.

IV

IV.2.1. Optimisation des conditions chromatographiques

La préparation de l'échantillon et les conditions analytiques afin d'accroitre la sensibilité de la méthode ont été optimisés. Les protéines des échantillons sanguins (50 µL) ont été précipitées par acétonitrile selon le ratio 3 : 1 comme précédemment recommandé pour obtenir une précipitation de protéines efficace à hauteur de 93,5 % (Polson et al., 2003). Les échantillons ont ensuite été dilués dans de l'eau ultra-pure afin d'améliorer la résolution des pics chromatographiques. La BUP, la NBUP, la NLX et leurs métabolites glucurono-conjugués présents dans le surnageant sont élués sur une colonne Raptor™ Biphényl dont les capacités séparatives ont été optimisées à l'aide de phases mobile appropriées (tampon de formiate d'ammonium à 0,25 mM et méthanol), acidifiées à l'aide d'acide formique à 0,1 % afin d'obtenir un pH de 2,7, généralement utilisé pour le dosage de la BUP et de ses métabolites [START_REF] Ceccato | Sensitive determination of buprenorphine and its N-dealkylated metabolite norbuprenorphine in human plasma by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry[END_REF][START_REF] Hegstad | Rapid quantification of buprenorphine-glucuronide and norbuprenorphine-glucuronide in human urine by LC-MS-MS[END_REF]Polettini et Huestis, 2001) (Emmerson et al., 1994;Raynor et al., 1994).

La combinaison d'éthanol et de BUP est aussi responsable d'une augmentation significative du TI, confirmant une synergie ou une addition des effets de la BUP sur le TI (Chevillard et al., 2009) Le FLZ a été démontré comme capable de reverser à hautes doses certains effets de l'éthanol chez l'homme [START_REF] Lheureux | Effect of flumazenil in a model of acute alcohol intoxication in rats[END_REF][START_REF] Lheureux | Efficacy of flumazenil in acute alcohol intoxication: double blind placebo-controlled evaluation[END_REF]. Cette réversion n'est pas retrouvée au niveau respiratoire dans notre modèle à la dose administrée (10 mg/kg) et ne confirme pas la nature PD impliquant le site de fixation des BZD des récepteurs GABA-A dans l'interaction entre éthanol et BUP. De manière intéressante, l'antagoniste des récepteurs GABA-A (α4-β3-δ), le RO 15-4513 reverse les effets sédatifs de l'éthanol chez le rat [START_REF] Wallner | Low dose acute alcohol effects on GABAA receptor subtypes[END_REF]. Nous proposons un modèle dans lequel le récepteur GABA-A comprenant les sous unités β3 et δ présenterait un site unique de fixation à l'éthanol à l'interface des sous unité α4/6+β3-. Il serait alors intéressant de tester l'antagoniste RO 15-4513 sur la dépression respiratoire observée par l'éthanol associée à la BUP.

L'éthanol (administré entre 1,2 et 2,5 g/kg ; IG) a également été décrit comme modulateur du système opioïde endogène avec la libération de β-endorphines et d'enképhalines (Jarjour et al., 2009;Méndez et al., 2010). Les effets dépresseurs centraux (sédation et dépression respiratoire) induits par l'association d'éthanol et de BUP pourraient donc être attribués à l'addition des effets des opioïdes endogènes libérés et de l'opioïde exogène (BUP). De manière intéressante, chez le rongeur (Badawy et Evans, 1981) comme chez l'homme [START_REF] Jeffcoate | Prevention of effects of alcohol intoxication by naloxone[END_REF][START_REF] Jefferys | Reversal of ethanol-induced coma with naloxone[END_REF]Sørensen et Mattisson, 1978) 3) la stabilité des substances selon plusieurs conditions de conservation (1, 7 et 14 jours à -20°C, + 4°C et température ambiante) ; et (4) l'impact de la présence de cellules buccales sur la stabilité du THC. Les dosages ont été réalisés par chromatographie en phase gazeuse ou liquide couplée à la spectrométrie de masse. Le kit Certus ® collecte un volume de salive supérieur au kit Quantisal ® mais de manière moins reproductible (0,94 +/-0,18 vs 0,84+/-0,06 mL, respectivement). Le rendement d'extraction est plus élevé avec le kit Quantisal ® , surtout pour le THC (0,94 vs 0,54 ; P<0,001). En terme de stabilité, la température idéale pour la conservation des échantillons est la température réfrigérée à + 4°C sauf pour la méthadone qui semble être « piégée » à l'intérieur du kit de prélèvement. En présence de cellules buccales, les concentrations de THC sont significativement diminuées au 7 ème jour de conservation en comparaison au premier jour dans les deux kits collecteurs de salive (P<0,001 pour le kit Quantisal ® et P<0,01 pour le kit Certus ® ). En conclusion, le kit Quantisal ® est plus fiable que le kit Certus ® même si leur faisabilité reste à déterminer sur le terrain par les forces de l'ordre.

Introduction

Driving after illicit drug use is a growing concern worldwide. Interestingly, the presence of illicit drugs was detected in ~13% of drivers involved in fatal road accidents in France in 2014 (1). Opiates, cannabinoids, amphetamines and cocaine metabolites represent the most frequent illicit drugs screened at the roadside. In France, methadone and buprenorphine (BUP), the two marketed maintenance treatments for heroin addiction are additionally considered as illicit drugs if misused or used in the absence of prescription, due to resulting increased sedation in drivers (2,3).

Since 2004, onsite drug testing has been included in the national procedures for detection of driving after using illicit drugs. Tests can be performed in blood and urine; but recently, oral fluid (OF) has been considered as a promising alternative for detecting recent use of illicit drugs. Sampling is non-invasive, rapid and easy, without the risk of errors during OF collection directly by the police on site (4)(5)(6). Additionally, numerous molecules are present at higher concentrations in OF than in blood and mainly as non-metabolized forms (7). Accordingly, heroin and its main metabolite 6-monoacetyl-morphine (6-MAM) are detected in OF (8)(9)(10), in contrast to © The Author 2016. Published by Oxford University Press. All rights reserved. For Permissions, please email: journals.permissions@oup.com blood where only morphine is often detected due to the rapid elimination half-life of heroin and 6-MAM (3 and 5 min, respectively) (11,12). Recent cannabis consumption can be recognized from ∆9-tetrahydrocannabinol (THC) detection in OF even if nondetectable in urine (13). Similarly, OF allows more sensitive detection of basic drugs and drugs with low plasma protein binding such as amphetamines and cocaine (14).

Sampling methods may influence the drug concentration in OF (5,15). Illicit drug consumers are usually unable to produce sufficient OF amounts with the risk of underestimating OF drug concentrations. Conditions before testing including sample handling, transportation and storage may modify dug stability and consequently its quantification (16). Marketed OF collection devices contain buffers with stabilizing salts, non-ionic surfactants and antibacterial agents, which guarantee the stability of most of the drugs and metabolites if samples are stored in refrigerated conditions (17), but may represent a major limitation regarding sample pre-treatment (18,19). THC is commonly a less stable drug when using OF collection devices and room temperature is not recommended for storage (20)(21)(22). In addition, drug recovery from OF samples may be altered by its adsorption to the collection device (23)(24)(25). Interestingly, THC is known to be more difficult to detect in OF when using collection devices due to its retention on the pad, resulting in possible false negative results (22,26,27).

To allow the French National Gendarmerie to choose the most suitable OF collection device at the roadside to identify drivers who have recently used illicit drugs, we comparatively investigated the performance of two OF collection devices, the Quantisal ® and Certus ® collectors using different bench tests measuring (i) OF volumes collected from volunteers; (ii) drug recovery rates from OF spiked with different illicit drugs; (iii) drug stability in the OF sample after 1, 7 and 14 days of storage at different temperatures; and (iv) impact of mouth cells present in the collected OF on drug stability.

Experimental

OF collection devices

Quantisal ® and Certus ® OF collection devices were purchased from Immunalysis Corporation (Pomona, CA, USA) and Concateno (Oxfordshire, UK), respectively. These two devices allow the collection of OF without salivary stimulation, thus reducing the risk of illicit drug dilution in contrast to other devices (4,28). Quantisal ® and Certus ® collectors include (i) a collection pad made of absorptive cellulose and polyethylene, respectively; (ii) a polypropylene stem attached to the pad; and (iii) a plastic transport tube containing 3 mL preservative buffer (final specimen volume: 4 mL). The stem contains an indicator that turns blue when 1 mL (±10%) OF is collected by capillary action.

To sample OF with Quantisal ® collector, the collection pad is placed under the tongue. When the indicator window turns blue, the pad is removed from the mouth and placed into the transport tube, in contrast with the Certus ® collector where the collection pad is actively swabbed around gums, tongue and inside the cheeks until the indicator turns completely blue, then removed from the mouth and placed into the transport tube.

OF provenance

Negative matrix OF was obtained from healthy volunteers free from psychoactive drugs. OF was collected according to the manufacturer's specifications (Study 1). OF was collected directly (without device) and separated in two pools of which one was spiked with non-deuterated internal standards (Studies 2-4).

Standards and compounds

All reagents were of analytical grade. Sodium hydroxide, ethyl acetate and sodium carbonate were purchased from Sigma Aldrich (Saint Louis, MO, USA). Di-potassium hydrogen phosphate anhydrous and hydrochloric acid were purchased from VWR International (LLC, West Chester, PA, USA). Glacial acetic acid came from Fisher Scientific (Illkirch, France). Dichloromethane, hexane, chloroform, 2-propanol and acetonitrile came from Carlo Erba (Val de Reuil, France). The derivatizing compounds, namely bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane (BSTFA) and heptafluorobutyric acid (HFBA), were purchased from Regis technologies (Morton Grove, IL, USA). Ultrapure type I water was obtained using Millipore gradient A10 system with Q-Gard I and Quantum EX cartridges and filtered on Millipore 0.22 µm Millipack filters (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA).

Deuterated and non-deuterated internal standards

The Cerilliant reference solutions, namely amphetamine, amphetamine-d5; methamphetamine, metamphetamine-d5; methylene-dioxyamphetamine (MDA), MDA-d5; methylene-dioxymethamphetamine (MDMA), MDMA-d5; THC), THC-d3; 11-hydroxy-∆-THC (11-OH THC), 11-OH-THC-d3; nor-9-carboxy-∆9-THC (THC-COOH), THC-COOH-d3; ecgonine-methyl-ester (EME), EME-d3; cocaine, cocaine-d3; benzoylecgonine (BZE), BZE-d3; codeine, codeine-d3; morphine, morphine-d3; 6-MAM, 6-MAM-d3; methadone, methadone-d3; BUP, BUP-d4 were purchased from LGC Standards (Molsheim, France), each at concentrations of 0.1 g/L (nondeuterated molecules) or 1 g/L (deuterated molecules) in methanol. These stock solutions were diluted with methanol to obtain 1 mg/L solutions of non-deuterated substances and 5 mg/L solution of deuterated analogs.

Study design

OF collection (Study 1) One milliliter OF was weighed to determine OF density (N = 10). Collected OF volumes and collection times were checked for each device according to the manufacturer's specifications. Quantisal ® and Certus ® collectors were placed into the mouth and removed when the indicator turned blue. Each device was weighed before and after OF collection (N = 10). The time between pad introduction and removal from the mouth was measured (N = 10).

Recovery (Study 2)

OF pools were centrifuged and supernatants spiked with the nondeuterated compounds to reach concentrations of 454 ng/mL for each substance. One milliliter of this spiked OF was added to the collection device either in the pad (then placed in the buffer) or in the buffer (without pad). Samples were refrigerated (+4°C) during 24 h as previously reported (16,21,22). Each device was tested in triplicate with and without pad. The day following OF spiking, two 0.5 mL aliquots of the buffered spiked OF samples were used to quantify amphetamines (first aliquot) and opiates, cocaine and metabolites (second aliquot). One additional 1 mL aliquot was necessary for quantification of cannabinoids. Ratios of the area under the chromatogram peaks of the non-deuterated/deuterated compound were calculated for each sample. Recovery for each compound was determined as the percentage of the mean ratio obtained in the presence of pad divided by the mean ratio obtained without pad.

Drug stability (Study 3)

Similarly, 1 mL-spiked OF was added in triplicate to each collection device pad and then plunged into buffer as recommended. Samples were then refrigerated (+4°C) for 24 h. Stability of each illicit drug was evaluated after 7 and 14 days of storage at -20°C, +4°C and room temperature as recommended (5,17). Measurements obtained at Day 1 were considered as the controls (100% of stability). Ratios of the area under the chromatogram peaks of the non-deuterated/ deuterated compound were calculated for each sample at Days 7 and 14. Stability for each compound was calculated as the percentage of the mean concentration in the treated samples divided by the mean concentration in the controls.

Effect of mouth cells on THC stability (Study 4) Lipophilic membranes of mouth cells are able to bind THC, thus resulting in underestimated and even false negative THC concentrations in OF (29). Certus ® collector requires mechanical movements to collect OF, thus catching more mouth cells than Quantisal ® collector. We hypothesized that centrifugation of OF pool before spiking can reduce the cell content and thus correct THC concentrations in OF.

To test this hypothesis, THC stability with Quantisal ® and Certus ® collectors was evaluated using centrifuged and non-centrifuged OF pools. In all, 1 mL of centrifuged OF and 1 mL of non-centrifuged OF, both spiked with the studied drugs, were added to Quantisal ® or Certus ® pad (N = 3). Stability of THC was evaluated after 7 and 14 days of storage at +4°C. Areas under the curve of THC/THC-d3 chromatogram peaks were measured and THC stability calculated as previously described.

Analytical methods

The Forensic Toxicology Unit is accredited by the French Accreditation Committee (COFRAC) according to CEN ISO 17025 (scope of accreditation n°8-2527). Cannabinoids were extracted by liquid-liquid extraction as described in the consensus edited by the Société Française de Toxicologie Analytique (30)(31)(32), except for the substitution of methylation by sylilation (BSTFA). After basic extraction with diethylether, amphetamines were derivatized by HFBA. Regarding opiates, cocaine and its metabolites, a three-step liquidfluid extraction was necessary before derivatization (HFBA). All the methods were validated using total error determination with e-noval software (Arlenda, Liège, Belgium). Quantitation limits were 3 µg/L for cannabinoids, 15 µg/L for opiates and cocaine and 30 µg/L for amphetamines; detection limits were 1, 5 and 10 µg/L, respectively. Analysis was performed using the gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS) Shimadzu GC 17 A and QP2010SE (Shimadzu, Champs sur Marne, France) equipped with J&W HP-1MS Ultra Inert capillary 12 m × 0.20 mm × 0.33 µm (Interchim, Montlucon, France). The method parameters were the same as previously reported (33). The carrier gas was helium used at a flow rate of 0.9 mL/min. MS conditions were 280°C for the source temperature and 70 eV ionization energy. GC oven temperature was initially held at 90°C for 4.5 min, then raised to 127.5°C at 37.5°C/min, and held there for 4 min, then 210°C at 13.5°C/min, raised to 250°C at 5°C/min and to 320°C at 12.5°C/min. Detection was carried out using the selected ion monitoring mode. The monitored ions are presented in the Supplementary data. Data analysis was performed using GC-MS solution-Version 1.20 (Shimadzu France, Champs sur Marne, France).

Statistical analysis

All data are presented as the mean with the relative standard deviation expressed as a percentage in brackets. Comparisons were performed using paired t-tests (when comparing two groups, Studies 1 and 2). Stability for each compound (Study 3) was calculated as the percentage of the mean concentration in the treated samples divided by the mean concentration in the controls (Day 1) and its respective 95% confidence interval was determined as recommended (34). Drug stability was assumed if the mean concentration of the treated sample was in 90-110% of its corresponding control and 95% confidence interval within 80-120% of the control mean (34). One-way analyses of variance followed by multiple comparison tests using Bonferroni's correction were performed in Study 4. All tests were performed using Prism version 6.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA), and P-values < 0.05 were considered as significant.

Results

OF collection (Study 1)

OF density was determined at 0.995 kg/L [0.83%]. The actual collected OF volume was 0.84 mL [6.7%] with Quantisal ® collector and 0.94 mL [19.0%] with Certus ® collector. Time to collect OF sample was 3 min [27.9%] with Quantisal ® collector and 1 min [27.6%] with Certus ® collector.

Recovery (Study 2)

Recoveries when using or not using the collector pad are listed in Table I. No significant differences were observed between devices, except for THC (P < 0.005) and 11-OH-THC (P < 0.05), with increased recovery in Quantisal ® compared with Certus ® collector. Ratios of the areas under the chromatogram peaks of the non-deuterated/ deuterated compound were calculated for each studied sample. Recovery efficiency for each compound was determined as the percentage of the mean ratio obtained in the presence of the collection pad divided by the mean ratio obtained without the pad (N = 3). Data are expressed in %, relative standard deviation. *P < 0.05; ***P < 0.001; ND, not determined.

Drug stability (Study 3)

Drug stability is shown in Table II. At all temperature conditions, methadone showed a particular profile of stability, becoming undetectable at Day 7 and re-detectable at Day 14. At room temperature and in both collector devices, concentrations of opiates, cocaine and its metabolites rapidly decreased while concentrations of BZE increased at Day 14. At +4 °C, all drugs were stable over 14 days of storage in both collector devices except for methamphetamine, codeine and buprenorphine, concentrations of which decreased at Day 14. At -20°C, concentrations of amphetamines and opiates decreased over 14 days of storage with both devices.

Effect of mouth cells on THC stability (Study 4)

THC stability with or without OF pool centrifugation at refrigerated temperature in Quantisal ® and Certus ® collectors is shown in Figure 1. Without OF centrifugation (presence of mouth cells), THC concentrations significantly decreased in both Quantisal ® and Certus ® collectors at Day 7 in comparison with Day 1 (P < 0.005 and P < 0.01, respectively) and at Day 14 in comparison with Day 7 (P < 0.005 and P < 0.05, respectively). Moreover, in Certus ® collector, THC concentrations significantly increased at Day 14 in comparison with Day 1 (P < 0.005).

Discussion

We have evaluated two OF collection devices, Quantisal ® and Certus ® collectors, for their suitability for collecting samples and allowing the measurement of various illicit drugs concentrations in OF. We showed that Quantisal ® collector is more reliable than Certus ® collector.

As previously reported (35), results with Quantisal ® collector were more reproducible than with Certus ® collector; however, the collection time was longer. Collection time is an important issue for the acceptability and use of OF collection devices by the police. Therefore, measuring the collection time on site is mandatory before choosing the most adequate OF sample collector. As a consequence of sampling variations, the gravimetric determination of collected OF volumes is required to avoid incorrect estimates (36), especially if sampling volume is difficult, as in stressful situations and in the case of ethanol or anticholinergic drug use. There is no internal standard available to be added to the buffer to correct the dilution factor.

Previous studies reported recoveries comparable to ours (26,35,36). About 50% of OF THC was bound by the Certus ® collector pad whereas non-significant THC loss was observed with Quantisal ® collector. The presence of mouth cells represents another major cause of THC retention by the pad. Due to its long lipophilic chain, THC is highly aggregated by low-density polyethylene contained in the Certus ® collector pad but not by the cellulose contained in the Quantisal ® collector pad. One additional hypothesis to explain recovery differences between the two collectors is related to the amount of mouth cells mechanically caught by the pad, which significantly contributes to enhance the retention of lipophilic compounds by the Certus ® collector. This phenomenon may also explain the absence of reproducibility of methadone detection when using the Certus ® collector.

Regarding sample preservation, the best data appear to be obtained from storage in a refrigerator. Room temperature did not appear to be adequate, increasing the observed loss of the various compounds which was, by contrast, significantly prevented with sample refrigeration, as previously shown (21,36). Methadone was not detected in the Quantisal sample after 1 week for any of the storage conditions. However, it was detected near the control value at 2 weeks, leading to the conclusion that the methadone was trapped in the pad at 7 days but then is released into the OF supernatant. When Table II. Stability of illicit drugs at day 7 and day 14 of storage in two collector devices, quantisal ® and certus ® collectors, in comparison with day 1 at various temperatures including room temperature, +4°C and -20°C (N = 3/day and /device) Recovery on Day 1 is set at 100% (control). ND, not detected; bold data (stable compound) mean that the mean concentration in the treated samples is inside 90-110% of the mean concentration in its corresponding control and its 95% confidence interval inside 80-120% of the mean concentration of its corresponding control.

%

4

Cohier et al. frozen, drugs were stable except for buprenorphine, which was more adequately detected at refrigerated temperature. THC was stable in the Quantisal ® collector during 24 h at room temperature and up to 7 days at refrigerated temperature whereas it was irreproducible in the Certus ® collector, as previously shown (22). In our study, morphine was stable in all conditions of storage as previously reported (37); however, 6-MAM was stable only at refrigerated temperature up to 14 days whereas it was reported elsewhere to be stable only up to 1 week (37). Interestingly, cocaine, 6-MAM and THC were reported as unstable with two other collection devices ( 16) whereas THC and cocaine were described as the less stable illicit drugs, highly influenced by the storage temperature in the Quantisal ® device (21). With Quantisal ® collector, optimal conditions of OF sample storage appeared to be in the refrigeration up to 14 days and freezing for long-term storage (21).

Once OF was spiked, THC detection was improved in the absence of mouth cells as previously reported (29). In contrast to these experimental conditions, since cannabinoids are bound to mouth cell membranes, collecting cells in real life may represent an advantage in detecting recent THC use. The THC expected to be detected in actual human OF samples mainly correspond to THC linked to mouth cell contained in the OF rather than THC diluted in the OF. Otherwise, detection of cannabinoids may be significantly improved by freezing cycles that break cells and release the bounded drug (38).

Conclusion

Based on OF drug recovery and stability, OF collection using Quantisal ® followed by sample refrigeration up to 14 days is the most suitable collection method to allow detection of illicit drugs in OF. Before any definitive decision is taken regarding the collector device to use at the roadside, the French gendarmerie should conduct a feasibility study on site. Neuro-respiratory toxicity of buprenorphine in combination to diazepam or ethanol in the presence or not of naloxone: an experimental rat study of the mechanisms of drug-drug interaction Summary : Buprenorphine may induce respiratory depression in case of misuse or combination to psychotropic drugs despite ceiling effects. Buprenorphine/naloxone combination was marketed to limit buprenorphine misuse; however its usefulness is not established. We studied buprenorphine/naloxone-related neuro-respiratory effects in Sprague-Dawley rats in combination to diazepam or ethanol. We validated a liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay to determine the concentrations of buprenorphine and its metabolites in the rat whole blood. Like buprenorphine alone, buprenorphine/naloxone combination in co-administration with diazepam was responsible for respiratory depression. Reversal of respiratory effects was obtained with flumazenil supporting the pharmacodynamic mechanism of this drug-drug interaction. In tolerant rats, buprenorphine/naloxone combination induced withdrawal features but its combination to diazepam did not result in respiratory depression. Buprenorphine/naloxone combination was responsible for respiratory depression in co-administration with ethanol, however less marked than with buprenorphine alone. Respiratory effects were not reversed by flumazenil or naloxone. Previous exposure to ethanol increased buprenorphine volume of distribution and altered its metabolic ratios, suggesting significant contribution of norbuprenorphine to buprenorphine-related toxicity in the presence of ethanol. This drug-drug interaction was rather pharmacokinetic although a pharmacodynamic part cannot be ruled out. Buprenorphine/naloxone formulation presents theoretical advantages; however its clinical benefits in humans remain to be determined.

Mots-clés : Buprénorphine ; Naloxone ; Diazépam ; Ethanol ; Dépression respiratoire ; Pléthysmographie ; Spectrométrie de masse ; Dépistage salivaire Adresse électronique de l'auteur : camille.cohier@gmail.com

A

  tous mes proches, famille, amis et collègues qui m'ont accompagnée durant ce travail. Enfin, je remercie celles et ceux que j'aurais pu oublier et les prie de m'en excuser. LISTE DES ABREVIATIONS ADH : alcohol deshydrogénase ALDH : aldéhyde deshydrogénase AMM : autorisation de mise sur le marché ANOVA : analyse de variance AUC : aire sous la courbe (Area Under the Curve) BHE : barrière hémato-encéphalique BUP : buprénorphine BZD : benzodiazépine Cl : clairance CL-SM/SM : chromatographie liquide -spectrométrie de masse en tandem Cmax : concentration au pic CPG/DIF : chromatographie phase gazeuse -détection par ionisation de flamme CYP : cytochrome DL50 : dose létale 50% DZP : diazépam EI : étalon interne ESI: ionisation par électro-spray (electrospray ionozation) f : fréquence respiratoire FLZ : flumazénil FDA : Food & Drug Administration GABA : acide gamma-aminobutyrique Glu : glutamate HCO3 -: ion bicarbonate IG : voie intragastrique IP : voie intrapéritonéale IRCGN : Institut de Recherche Criminelle de la Gendarmerie Nationale IV : voie intraveineuse Ka: constante d'absorption KD : constante de dissociation Ki : constante d'inhibition Km : constante de Michaelis-Menten LD : limite de détection LQi : limite de quantification inférieure LQs : limite de quantification supérieure MAM : mono-acétyl-morphine MRM : multiple reaction monitoring m/z : masse/charge NAD : nicotinamide adénine dinucléotide NBUP : norbuprénorphine NMDA : N-methyl-D-aspartate NLX : naloxone NS : non significatif OFDT : Observatoire Français des Drogues et Toxicomanies PaCO2 : pression artérielle partielle en dioxyde de carbone PaO2 : pression artérielle partielle en oxygène PD : pharmacodynamique PK : pharmacocinétique pH : potentiel hydrogène RO : récepteur opioïde SC : voie sous-cutanée SD : écart-type (standard deviation) SL : voie sublinguale SNC : système nerveux central SEM : erreur standard à la moyenne (standard error mean) TE : temps expiratoire THC : δ9-tétrahydrocannabinol TI : temps inspiratoire Tmax : temps requis pour atteindre le Cmax TQ : triple quadripôle TTOT : temps respiratoire total UNODC : United Nations Office of Drugs and Crimes VT : volume courant ou volume de tidal VD : volume de distribution VM : volume minute TABLE DES MATIERES I. INTRODUCTION .............................................................................................................. I.1. Propriétés pharmacologiques générales des opioïdes ..................................................................

Tableau 1 -

 1 Activité des principaux opioïdes exogènes et endogènes sur les trois récepteurs opioïdes I.2. La buprénorphine : un opioïde de synthèse I.2.1. Caractéristiques physico-chimiques de la buprénorphine Découverte au début des années 1970 par J.W. Lewis et A. Cowan, la BUP est un opioïde

Figure 2 -

 2 Figure 2 -Métabolites principaux de phase I et II de la buprénorphine

Figure 3 .

 3 Figure 3. Métabolisme in vitro de la BUP par des microsomes hépatiques humains[START_REF] Chang | Glucuronidation of buprenorphine and norbuprenorphine by human liver microsomes and UDP-glucuronosyltransferases[END_REF]

Figure 4 :

 4 Figure 4 : Evolution de la PaCO2 30 min après l'injection d'une dose croissante de BUP ou de morphine chez

Figure 5 :

 5 Figure5: Effet de la BUP (30 mg/kg ; IP) sur le TI en pléthysmographie chez le rat(Chevillard et al, 2009)

I. 5 . 1 .

 51 Le récepteur GABA Le GABA est un des principaux neurotransmetteurs inhibiteurs du SNC et exerce ses effets par l'intermédiaire de plusieurs récepteurs, dont les mieux caractérisés sont les récepteurs GABA-A et GABA-B. Le récepteur GABA-A est un récepteur ionotrope, associé à un canal chlore, alors que le GABA-B est un récepteur métabotrope, couplé à la protéine G. I.5.1.1. Le récepteur GABA-A Le récepteur GABA-A est un membre de la famille des récepteurs-canaux ioniques. La fixation du GABA sur son site de reconnaissance (domaine extra cellulaire de la sous unité β) provoque l'ouverture d'un canal chlore (Figure 7), qui en laissant passer les ions Cl -, produit une hyperpolarisation de la cellule cible, inhibant les transmissions neuronales. Les BZD interagissent avec le récepteur GABA-A de manière allostérique en induisant un changement de conformation du récepteur et en modulant son activité inhibitrice par l'augmentation de la fréquence d'ouverture des canaux Cl -. Le récepteur GABA-A est une glycoprotéine

Figure 7 -

 7 Figure 7 -Structure moléculaire du récepteur GABA-A[START_REF] Jacob | GABAA receptor trafficking and its role in the dynamic modulation of neuronal inhibition[END_REF]

Figure 8 -

 8 Figure 8 -Structure moléculaire du diazépam (Valium ® )

  ont montré dans une étude contrôlée randomisée en cross-over en double aveugle que l'administration d'une dose orale de 10 ou 20 mg de DZP chez des patients non-dépendants aux BZD et traités par BUP ou méthadone n'entraînait pas de baisse significative de la saturation en oxygène mesurée en oxymétrie de pouls. De même, dans une seconde étude contrôlée randomisée en cross over en double aveugle, chez des patients traités par BUP ou méthadone mais n'ayant pas pris de BZD dans les 15 jours précédents[START_REF] Lintzeris | Pharmacodynamics of diazepam co-administered with methadone or buprenorphine under high dose conditions in opioid dependent patients[END_REF], la co-administration de BUP à dose habituelle ou dose 150% plus élevée, associée ou non au DZP(40 mg) n'entraînait pas d'effets respiratoires significatifs, contrairement à la méthadone. À noter que dans ces deux études, les traitements testés étaient administrés par voie orale. Une étude prospective en réanimation s'est intéressée à la présentation clinique des patients intoxiqués par BUP(Mégarbane et al., 2010) : ceux-ci présentaient un syndrome opioïde avec coma et dépression respiratoire d'amplitude comparable à ceux intoxiqués par méthadone ou héroïne (Tableau 3). Si l'utilisation de NLX (Narcan ® , antagoniste compétitif non spécifique des RO) n'entraînait pas de réversion des effets de la BUP, les troubles cliniques étaient reversés par le flumazenil (FLZ ; Anexate ® , antagoniste des récepteurs GABA-A) en présence d'une coingestion de BZD.

Tableau 3 :

 3 Comparaison des caractéristiques cliniques et paracliniques des intoxications à l'héroïne, la BUP et la Méthadone chez l'homme (Mégarbane et al., 2010) Les études cliniques laissaient donc suspecter une forte interaction entre BUP et BZD, que sont venus confirmer plusieurs travaux expérimentaux, dont plusieurs effectués dans notre laboratoire. Chez le rat, Borron et al (2002) ont étudié l'influence sur la DL50 de la BUP IV d'un prétraitement par flunitrazépam (40 mg/kg ; IP) : celle-ci était réduite de 235 à 38 mg/kg. Nielsen et Taylor (2005) ont montré que l'administration de DZP (20 mg/kg ; IV) avant celle de la BUP administrée en IV causait une perte du plafond des effets respiratoires de la BUP avec la mise en évidence sur les gaz du sang artériel, d'une dépression respiratoire 15 min après injection des drogues. De même, Gueye et al (2002) ont montré que la coadministration de BUP (30 mg/kg ; IP) et de midazolam (160 mg/kg ; IP) induisait une dépression respiratoire rapide et soutenue dans le temps par rapport aux animaux traités par BUP seule (Figure 9).

Figure 9 :

 9 Figure 9 : Effet de la co-administration (cercles noirs) de midazolam (160 mg/kg ; IP) et de BUP (30 mg/kg ;

  au niveau des tissus fortement vascularisées tels que le cerveau, les poumons et le foie. L'éthanol se distribue dans l'eau libre sans liaison aux protéines plasmatiques. Son volume de distribution est donc celui de l'eau libre (soit environ 41 L pour un homme de 70 kg). L'éthanol traverse librement la barrière hématoencéphalique (BHE) ainsi que la barrière placentaire. Le métabolisme de l'éthanol se réalise principalement dans le foie (80%) ou il est oxydé en acétaldéhyde. Plusieurs voies participent à cette première oxydation (Figure 10) : (1) la voie de l'alcool déshydrogénase (ADH), majoritaire, (2) la voie microsomale (via CYP P450 2E1) et (3) la voie de la catalase.

Figure 10 -

 10 Figure 10 -Voies du métabolisme de l'éthanol

Tableau 5 :

 5 Concentrations des différentes substances (opioïdes, BZD et éthanol) retrouvées dans les décès liés à la BUP (selon le ratio BUP/NBUP) versus les décès liés à d'autres causes que la BUP (Häkkinen et al., 2012) I.8. Effets respiratoires de la combinaison d'éthanol et de buprénorphine À ce jour, aucune étude expérimentale ou clinique n'a décrit les effets respiratoires de l'éthanol associé à la BUP chez un sujet naïf.

Figure 11 -

 11 Figure 11 -Schéma récapitulant les neurotransmissions GABA-ergique et glutamatergique lors de la prise aigue d'éthanol (Stragier, 2015). Pour des raisons de simplifications, ne sont représentés ici que les récepteurs GABA-A et NMDA. A gauche, l'éthanol induit une augmentation de libération de GABA au niveau pré-synaptique. De plus, le GABA et l'éthanol se fixent sur les récepteurs GABA post-synaptiques. Ces deux phénomènes aboutissent à une potentialisation de l'inhibition. A droite, l'éthanol inhibe les récepteurs NMDA et induit une diminution d'entrée des ions Ca 2+ conduisant à une inhibition du courant excitateur. L'effet cumulé des deux neurotransmissons provoque une hyper-inhibition du système responsable en partie de l'effet sédatif de la prise aigue d'éthanol.

Tableau 6 :

 6 Equation permettant l'obtention du VT et paramètres calculés en pléthysmographie à partir du TI, du TE et du VT les deux enceintes, sans interférer avec le signal lors de l'enregistrement. La variation de pression entre les deux boîtes est ainsi transformée en un signal électrique qui est visualisé sur l'écran sous forme d'un tracé évoluant entre + 6 000 et -6 000 mV.

Figure 9 :

 9 Figure 9 : Appareil de pléthysmographie corps entier

Figure 13 -

 13 Figure 13 -Validation de la pléthysmographie

Figure 14 -II. 4 .

 144 Figure 14 -Enregistrement d'un tracé sur pléthysmographie

II. 4 . 3 .II. 5 . 3 ( 1 -Article 2 - 1 RespiratoryArticle 1 -

 43531211 ProtocoleLe jour du dosage, 10 µL de solution d'EI sont ajoutés à la prise d'essai de sang artériel de 50 µL. Les protéines du sang total sont précipitées par l'ajout d'acétonitrile (ratio 3 : 1)[START_REF] Polson | Optimization of protein precipitation based upon effectiveness of protein removal and ionization effect in liquid chromatography-tandem mass spectrometry[END_REF]. Après homogénéisation et centrifugation pendant 10 min à 18213 x g, 100 µL de surnageant sont dilués dans 300 µL d'eau ultra pure afin d'atteindre les conditions initiales de chromatographie.Le composé d'intérêt est identifié selon son temps de rétention, ainsi que par le ratio d'aire entre la transition qualitative et la transition quantitative choisies préalablement lors de la phase finale du développement. Pour les dosages, seule la transition quantitative est utilisée.Chaque composé est dosé à partir du ratio de l'aire de son pic chromatographique avec celle de son EI, à l'aide d'une droite d'étalonnage préparée quotidiennement. Lors de la série d'essais, trois solutions sanguines de contrôles sont analysées(15, 150 et 1500 ng/mL). Modélisation des concentrations sanguines de l'éthanol, de la buprénorphine et de ses métabolites. La PK de l'éthanol est déterminée après une administration intragastrique (IG) de 3 g/kg d'éthanol, à l'aide d'un modèle non linéaire mono-comportemental (délai oral) décrit selon l'équation différentielle suivante : où CWB représente les concentrations d'éthanol sanguine ; VWB le volume apparent de sang, ka la constant d'absorption de l'éthanol, D la dose ingérée, VM et KM les constantes de Michaelis-Menten en cas d'élimination non-linéaire. Les conditions initiales de cette équation ont été fixées à 0. La PK de la BUP est déterminée après administration IV de 30 mg/kg de BUP à l'aide d'un modèle à deux compartiments décrit selon l'équation : CWB =Ae -αt + Be -βt ; ou CWB est la concentration de BUP au temps t, les termes A et B les extrapolations aux intersections et α et β les constantes d'élimination de premier ordre apparentes. Le volume de distribution dans le compartiment central (Vd), le temps de demie-vie (t1/2β) et la clairance sont calculés selon les équations suivantes : Vd=Dose/(A+B), t1/2β=0,693/kel, ou kel est la constante d'élimination totale et Cl=Vd*kel. Les PK des métabolites de la BUP sont décrites en analyse non-compartimentale. De manière générale, le modèle idéal (régression) pour les différentes analyses est sélectionné après un contrôle visuel des courbes prédites vs observées et des courbes résiduelles, par l'analyse de la fonction objective et du critère d'information d'Akaike afin d'évaluer la justesse de l'estimation ainsi que la précision des valeurs estimées (moyenne +/-CV). Les paramètres PK sont déterminés comme suivant : le Cmax et Tmax sont les valeurs observées ; les AUC selon le temps de 0 à 360 min (AUC0-360) sont calculées par la méthode des trapèzes et les AUC de 0 à l'infini (AUC0-∞) sont calculées selon l'équation suivante : AUC0-∞ = A/α + B/β (pour la BUP). Les ratios métaboliques sont obtenus par le ratio de la somme des concentrations des métabolites sur la somme des concentrations des métabolites et des molécules parents pour chaque animal.De plus, les ratios des concentrations de NBUP/BUP sont calculés à chaque temps de prélèvement. Les modélisations sont réalisées par le logiciel WinNonlin software v.5.Pharsight Corporation, USA). Respiratory effects of buprenorphine/naloxone alone or in association with diazepam in naïve and tolerant rats Simultaneous quantification of buprenorphine, naloxone and phase I and phase II metabolites in rat whole blood by liquid chromatography-tandem mass spectrometry Article 3 -Neuro-respiratory effects of buprenorphine and ethanol in combination: a mechanistic study of drug-drug interactions in the rat ARTICLE effects of buprenorphine/naloxone alone or in association with diazepam in naïve and tolerant rats Camille Cohier, Lucie Chevillard, Patricia Risède, Olivier Roussel, Bruno Mégarbane Article publié dans Toxicology letters Communications (Posters) lors de congrès scientifiques : -Congrès des jeunes chercheurs en Biologie -Institut Imagine, 8 octobre 2014 ; Respiratory effects of buprenorphine/naloxone alone and in combination with diazepam in naive and tolerant rats. -Journées scientifiques de l'école doctorale « Médicament, Toxicologie, Chimie, Environnement » , Paris 13, 22 et 23 juin 2015 ; Respiratory effects of buprenorphine/naloxone alone and in combination with diazepam in naive and tolerant rats. Respiratory effects of buprenorphine/naloxone alone or in association with diazepam in naïve and tolerant rats Des décès asphyxiques par dépression respiratoire ont été attribués au mésusage IV de la BUP (Subutex ® ) ou bien à son association aux BZD. La nouvelle formulation du médicament (Suboxone ® ) combinaison de BUP et de NLX a été mise sur le marché dans le but de dissuader les toxicomanes dépendants d'injecter les comprimés de BUP en provoquant un sevrage aigu. Toutefois, le bénéfice de cette combinaison reste contesté. Nous avons étudié les effets pléthysmographiques du mélange BUP/NLX en injection IV selon différentes modalités d'administration : seul ou en association au DZP, chez des rats Sprague Dawley naïfs ou dépendants à la suite d'un traitement répété de BUP. Chez les animaux naïfs, la BUP/NLX augmente significativement f (P<0,05) sans modifier le VM en comparaison à la BUP seule. En association au DZP, la BUP/NLX augmente le TE (P<0,01), abaisse la f (P<0,01), le VT (P<0,001) et le VM (P<0,001). Chez le rat tolérant, il n'est pas observé de différences significatives pour les effets respiratoires entre BUP et BUP/NLX. Cependant, en combinaison au DZP, la BUP/NLX n'altère plus les paramètres respiratoires alors que la BUP augmente le TI (P<0,001) et abaisse la f (P<0,01) et le VM (P<0,001). En conclusion, les différences en termes d'effets respiratoires entre BUP/NLX et BUP ne sont significatives qu'en association au DZP, avec une augmentation de la dépression respiratoire chez les rats naïfs et une réduction chez les rats tolérants à la BUP. Le mélange BUP/NLX est source d'avantages en cas de mésusage en comparaison à la BUP seule, mais ses bénéfices restent à établir chez l'homme.

Fig. 3 .

 3 Fig. 3. (A) Temperature effects in Sprague-Dawley rats of 30 mg/kg buprenorphine/solvent + solvent(BUP/solvent + solvent, white), 30 mg/kg buprenorphine/7.5 mg/kg naloxone + solvent (BUP/NLX + solvent, black), 30 mg/kg buprenorphine/solvent + 20 mg/kg diazepam (BUP/solvent + DZP, horizontal lines), and 30 mg/kg buprenorphine/7.5 mg/kg naloxone + 20 mg/kg diazepam (BUP/NLX + DZP, vertical lines). (B) Temperature effects in Sprague-Dawley rats of 10 mg/kg buprenorphine/solvent + solvent (BUP/solvent + solvent, white), 10 mg/kg buprenorphine/2.5 mg/kg naloxone + solvent (BUP/NLX + solvent, black), 10 mg/kg buprenorphine/solvent + 20 mg/kg diazepam (BUP/solvent + DZP, horizontal lines), and 10 mg/kg buprenorphine/2.5 mg/kg naloxone + 20 mg/kg diazepam (BUP/NLX + DZP, vertical lines). Rats were either naïve (A) or rendered BUPtolerant with a subcutaneous 1 mg/kg/day BUP pretreatment during 14 days (3B). DZP or its solvent was injected intraperitoneally 30 min before the intravenous administration of BUP/NLX or BUP/solvent. Each group consisted of six rats. Values represent mean ± SEM of the areas under the curve (AUC) of each parameter between the time before intravenous administration and 60 min postinjection. Data are expressed as arbitrary units. Comparisons were performed using ANOVA followed by multiple tests with Bonferroni's correction. BUP/solvent + DZP vs. BUP/solvent + solvent: ***P < 0.001; BUP/NLX + solvent vs. BUP/NLX + DZP: $$$ P < 0.001; BUP/solvent + solvent vs. BUP/NLX + solvent: ## P < 0.01.

Fig. 4 .

 4 Fig. 4. Plethysmography effects of intravenous 10 mg/kg flumazenil (FLZ) vs. its solvent administered in Sprague-Dawley rats 15 min after treatment with 30 mg/kg buprenorphine/solvent + 20 mg/kg diazepam (BUP, vertical lines and white, respectively) or 30 m/kg buprenorphine/7.5 mg/kg naloxone + 20 mg/kg diazepam (BUP/NLX, horizontal lines and black, respectively). DZP was injected intraperitoneally 30 min before the intravenous administration of BUP/NLX or BUP/solvent. Each group consisted of six rats. Values represent mean ± SEM of the areas under the curve (AUC) of each parameter between 15 and 20 min post-injection (i.e. between the time of FLZ injection and 5 min later). Data are expressed as arbitrary units. Comparisons were performed using t-tests. (BUP/solvent + DZP) + FLZ vs. (BUP/solvent + DZP) + solvent: *P < 0.05, **P < 0.01; (BUP/NLX + DZP) + FLZ vs. (BUP/NLX + DZP) + solvent: $ P < 0.05, $$ P < 0.01.

Fig. 5 .

 5 Fig.5. (A) Effects on inspiratory time in Sprague-Dawley rats of intravenous 10 mg/kg buprenorphine on day 15, after a pre-treatment during 14 days with solvent (white) or 1 mg/kg/day buprenorphine (BUP, black) administered subcutaneously. Each group consisted of six rats. Values represent mean ± SEM of the areas under the curve (AUC) of inspiratory time between the time before intravenous administration and 60 min post-injection. Data are expressed as arbitrary units. Comparisons were performed using t-tests. (B) Withdrawal scores in Sprague-Dawley rats pre-treated with subcutaneous 1 mg/kg/day BUP during 14 days and measured on day 15 at two observation periods(1-6 min and 31-36 min) following the intravenous administration of 10 mg/kg buprenorphine/solvent (BUP, white) or 10 mg/kg buprenorphine/2.5 mg/kg naloxone (BUP/NLX, black). Each group consisted of six rats. Values represent mean ± SEM. Comparisons were performed using ANOVA followed by multiple tests with Bonferroni's correction. *P < 0.05.

Fig. 6 .

 6 Fig.6. Plethysmography effects in Sprague-Dawley rats of 10 mg/kg buprenorphine/solvent + solvent (BUP + solvent, white), 10 mg/kg buprenorphine/2.5 mg/kg naloxone + solvent (BUP/NLX + solvent, black), 10 mg/kg buprenorphine/solvent + 20 mg/kg diazepam (BUP + DZP, horizontal lines), and 10 mg/kg buprenorphine/2.5 mg/kg naloxone + 20 mg/kg diazepam (BUP/NLX + DZP, vertical lines) on day 15 after a pre-treatment during 14 days with 1 mg/kg/day buprenorphine administered subcutaneously. DZP or its solvent was injected intraperitoneally 30 min before the intravenous administration of BUP/NLX or BUP/solvent. Each group consisted of six rats. Values represent mean ± SEM of the areas under the curve (AUC) of each parameter between the time before intravenous administration and 60 min post-injection. Data are expressed as arbitrary units. Comparisons were performed using ANOVA followed by multiple tests with Bonferroni's correction. BUP + DZP vs. BUP + solvent: **P < 0.01; ***P < 0.001.

  buprenorphine, naloxone and phase I and phase II metabolites in rat whole blood by liquid chromatography-tandem mass spectrometry Camille Cohier, Sophie Salle, Anne Fontova, Bruno Mégarbane, Olivier Roussel Article en soumission dans "Journal of Pharmaceutical of Biomedical Analysis" Communications orales lors de congrès scientifiques : -Journées Scientifiques du Centre de Recherche Pharmaceutique de Paris. Faculté de Pharmacie de Paris Descartes, 18 mars 2016 ; Dosage simultané de la buprénorphine, de la norbuprénorphine, de la naloxone et de leurs métabolites glucuronoconjugués dans le sang total par CL-SM /SM -24ème congrès de la Société Francaise de Toxicologie Analytique, Perpignan, 1-2-3 juin 2016 ; Dosage simultané de la buprénorphine, de la norbuprénorphine, de la naloxone et de leurs métabolites glucuronoconjugués dans le sang total par CL-SM/SM Article 2 -Simultaneous quantification of buprenorphine, naloxone and phase I and phase II metabolites in rat whole blood by liquid chromatography-tandem mass spectrometry Le Subutex (BUP) et le Suboxone (BUP/NLX) sont deux traitements de substitution aux opiacés. Depuis leur mise sur le marché et malgré les effets dépresseurs respiratoires plafonnés de la BUP qui leur confèrent une sécurité d'emploi, des overdoses par dépression respiratoire ont été attribuées à leur mésusage. Afin de comprendre le mécanisme toxique imputé à la BUP, des études expérimentales ont été menées in vivo chez le rat. Une méthode de dosage simultané de BUP, NBUP, BUP-glucuronide et NBUP-glucuronide ainsi que la NLX et la NLX-glucuronide a été développée et validée par CL-SM/SM. Après traitement de l'échantillon de 50 µL de sang total par précipitation/dilution, les composés présents dans le surnageant sont élués sur une colonne Raptor biphényl (100 mm x 3,0 mm x 2,7 µm ; Restek, France) avec un gradient d'élution de tampon de formiate d'ammonium et de méthanol. Ils sont ensuite ionisés par ESI + et détectées par acquisition en mode scheduled MRM sur un TQ Api 3200 (Sciex, USA). La validation de la méthode a été menée à l'aide du logiciel e-noval (Arlenda, Belgique). L'effet matrice et le rendement de précipitation a été évalué selon l'approche de Matuszewski et al. La méthode a été validée selon les critères d'acceptation de validation de méthodes bioanalytiques. Les LQi sont

Figure 1 :

 1 Figure 1: chromatograms of a whole blood sample of one rat 24h after drug administration

) Article 3 -

 3 Neurorespiratory effects of buprenorphine and ethanol in combination: a mechanistic study of drug-drug interactions in the rat Des décès asphyxiques par dépression respiratoire ont été attribués à l'usage de BUP associé à l'éthanol chez les toxicomanes substitués par BUP/NLX ou BUP. Le mécanisme exact d'interaction entre l'éthanol et la BUP, ainsi que le rôle de la NBUP, le principal métabolite toxique de la BUP, sont inconnus. Nous avons étudiés en pléthysmographie corps entier les effets sédatifs ainsi que les effets respiratoires de la co-administration d'éthanol (IG ; 3 g/kg) et de BUP (IV ; 30 mg/kg) chez le rat Sprague Dawley. Nous avons également déterminé la PK sanguine de l'éthanol par CPG-DIF, ainsi que la PK de la BUP et de ses métabolites par CL-SM/SM. Nous avons investigué les mécanismes d'interaction entre l'éthanol et la BUP en présence ou non de NLX (7,5 mg/kg). L'association d'éthanol et de BUP ou de BUP/NLX induit une sédation des animaux en comparaison à la BUP seule (P<0,001) et BUP/NLX (P<0,005). La combinaison d'éthanol et de BUP augmente le TI et abaisse le VM en comparaison à la BUP seule (P<0.01) et à l'association d'éthanol et de BUP/NLX (P<0.05 et P<0,01, respectivement). La dépression respiratoire et la sédation induites par l'association d'éthanol et de BUP ne sont pas reversées par l'administration des deux antagonistes FLZ et NLX. En présence d'éthanol, les AUC des concentrations en fonction du temps de la BUP sont diminuées (P<0,05) ; le Vd de la BUP est augmenté (P<0,05) et les ratios métaboliques de NBUP et NBUP-glucuronide sont augmentés (P<.01) en comparaison à la BUP seule. En conclusion, la combinaison d'éthanol et de BUP est responsable d'une sédation et d'une dépression respiratoire chez le rat, prévenue mais non reversée par la NLX. Les interactions entre l'éthanol et la BUP sont principalement de nature PK résultant d'une augmentation de production de NBUP. Même si les effets dépresseurs respiratoires attribués à l'éthanol associé à la BUP ne sont pas reversés par la NLX et le FLZ, la protection apportée par la NLX suggère une interaction supplémentaire de type PD.

FIG. 1 .FIG. 2 .FIG. 4 .

 124 Figures legend:

  mélange BUP/NLX et de sa combinaison à une BZD dans notre modèle de rat devenu tolérant. Le traitement des animaux par DZP (20 mg/kg) + BUP/NLX (10 mg/kg/2,5 mg/kg) n'entraîne pas de dépression respiratoire chez les rats tolérants à la BUP contrairement au traitement par cette même association chez les rats naïfs. Ceci suggère que la toxicité attribuée dans les modèles d'animaux naïfs à la combinaison délétère de DZP + BUP pourrait être moins pertinente dans un modèle d'animal tolérant, cette situation se rapprochant d'ailleurs davantage des toxicomanes dépendants chez qui, malgré une prévalence élevée de coprescriptions ou co-consommations de BZD et BUP, présentent un nombre de cas mineur d'intoxications aiguës. L'observation épidémiologique suggérait bien en effet, la possible existence, chez les toxicomanes dépendants, d'un autre facteur, inconnu à ce jour et autre que la co-ingestion d'une BZD pour expliquer la survenue d'une toxicité respiratoire aiguë.

a

  No statistic test could be performed with methadone in Certus ® collector since only one sample of Certus ® collector detected methadone.

  detected in one Certus ® collector sample, thus no statistics could be performed.

Figure 1 .

 1 Figure 1. Stability of THC in Quantisal ® collector (top) or Certus ® collector (bottom) with (left) or without (right) centrifuged pools at refrigerated temperature (+4°C). Ratios of the area under the chromatogram peaks of the non-deuterated/deuterated compound were determined at Days 7 and 14 as percentages of Day 1 (N = 3/day and /device). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001.

  Seconde BZD mise sur le marché après le chlordiazépoxide, le DZP est encore largement utilisé pour ses propriétés anxiolytiques, sédatives, anticonvulsivantes, et hypnotiques.

	Comme toutes les BZD, il est également myorelaxant et amnésiant. De formule chimique
	C16H13ClN2O et de masse moléculaire 284,74 g/mol (Figure 8), le DZP est une des BZD les
	plus utilisées au monde. Après ingestion orale, son absorption est rapide puisque le temps
	correspondant à la concentration maximale (Tmax) dans le sang est compris entre 1 et 2
	heures (Griffin, 2013). Sa biodisponibilité est comprise entre 80 et 100 % et elle se lie
	fortement aux protéines plasmatiques à hauteur de 98 %. L'élimination est essentiellement

rénale et sa demi-vie d'élimination plasmatique comprise entre 20 et 80 h. Le métabolisme du DZP, comme toutes les BZD, se fait principalement dans le foie et son métabolite principal et actif est le desméthyl-DZP (ou NorDZP), dont la demi-vie est plus longue que celle de la molécule mère (entre 40 et 120 h). Enfin, le desméthyl-DZP subit une hydroxylation pour former un autre métabolite actif, l'oxazépam

interaction Interaction PD au niveau de la commande de la respiration

  Tableau 4 -Différents niveaux d'interaction pharmacodynamique possible lors de la co-administration de BZD et de BUP(Mégarbane et al., 2006)

	I.7.1. Pharmacocinétique de l'éthanol
	L'alcool ou éthanol, petite molécule de formule chimique CH3CH2OH et de masse
	moléculaire faible (46,01 g/mol) présente dans les boissons alcoolisées est absorbée
	Type d'interaction rapidement par simple diffusion au niveau gastrique. La majeure partie (70 à 80%) de Niveau d'Implication des systèmes GABA et opioïdes dans l'activité phasique et/ou
		tonique des neurones respiratoires
	l'absorption se situe au niveau de l'intestin grêle, principalement au niveau du duodénum et
		-Co-expression des récepteurs opioïdes et GABA
	-Certaines BZD sont des agonistes des récepteurs δ et κ à fortes concentrations -Voies communes de transduction (Protéine GI) du GABA-B et des opioïdes du jéjunum. Lorsque le sujet est à jeun, la concentration sanguine maximale est généralement
	différents Sommation d'effets physiologiques atteinte au bout de 30 min	BZD

-Commande des muscles dilatateurs du pharynx, apnée obstructive -Dysfonction diaphragmatique Opioïdes Diminution de la réponse ventilatoire à une charge inspiratoire, à l'hypoxie, à l'hypercapnie I.7. L'éthanol Selon l'OFDT, le nombre d'usagers réguliers d'éthanol (au moins trois consommations d'éthanol dans la semaine) est estimé à 8,7 millions de personnes en France parmi les 11-75 ans (OFDT, 2015). Près de 49% des jeunes adultes déclarent un épisode d'alcoolisation ponctuelle importante au cours du mois. Ce mode de consommation excessif d'éthanol répété et régulier (au moins dix fois au cours du mois) est en hausse entre 2005 et 2014. La France fait partie des pays de forte consommation d'éthanol et son abus représente un problème de santé publique majeur. Chez les jeunes, la tendance est au « binge drinking », consistant à atteindre l'ivresse le plus rapidement possible.

  2 et 1,5 g/L) n'expliquaient pas à elles seules le décès, suggérant une addition voire une synergie des effets toxiques. De même, trois cas de décès asphyxiques liés à la prise de BUP et d'éthanol(Ferrant et al., 2011), présentaient des concentrations sanguines et urinaires

	de BUP (comprises entre 3,8 et 6,2 ng/mL) et des concentrations sanguines d'éthanol
	(comprises entre 1,06 et 1,82 g/L) ne pouvant pas expliquer le décès. Par ailleurs, dans les cas
	de décès liés à la prise de BUP, les concentrations de BUP et d'éthanol n'étaient pas
	différentes de celles retrouvées chez les personnes décédées prenant de la BUP mais dont le
	décès n'était pas imputé à la BUP

5), même si les concentrations sanguines de BUP (comprises entre 1,2 et 1,6 ng/mL) et d'éthanol (comprises entre 1,

. Mise sur le marché du Suboxone ®

	point une nouvelle formulation, le Suboxone ® , combinant BUP et NLX selon un ratio 4 :1. Le
	Suboxone ® a désormais remplacé le Subutex ® dans de nombreux pays d'Europe et aux États-
	Unis en raison d'une possibilité alléguée de toxicité réduite. En France, l'AMM a été donnée
	mais les prescriptions de BUP seule restent prédominantes.
	I.9.1. Intérêts du Suboxone ®
	Le mélange BUP/NLX a été conçu dans le but de dissuader l'utilisation IV de BUP voire
	intranasale, et d'en limiter la toxicité
	3-glucuronide et de morphine-6-glucuronide étaient réduites en
	comparaison à celles mesurées chez des patients décédés sans présence d'éthanol. Tous ces
	arguments indirects suggèrent la présence possible d'une interaction de type PK entre
	l'éthanol et la BUP.
	I.9Pour faire face aux risques de mésusage IV de BUP observés chez les toxicomanes, à
	l'origine des intoxications graves ou fatales rapportées, l'industrie pharmaceutique a mis au

I.11. Problématique et objectifs du travail de thèse

	NLX aurait été efficace, ce qui semble avoir été le cas pour certains otages (Jolobe, 2010). La Pour se faire, nous avons souhaité mettre au point une méthode de dosage simultanée de la II. MATERIELS ET METHODES II.1.2.2. Substances étudiées -L'eau ultra-pure est produite par une centrale Milli-Q gradient A10 équipée d'une dans une chambre close. L'augmentation de pression due au réchauffement et à la saturation
	cour européenne des droits de l'homme a lourdement condamné la Russie pour n'avoir pas BUP, NBUP, NLX et leurs métabolites de phase II dans le sang total artériel de rat. cartouche Quantum EX ; l'eau produite a une résistivité de 18,2 Mohms/cm (Millipore, en vapeur d'eau intra-thoracique de l'air inspiré est proportionnelle au volume courant (VT)
	suffisamment préparé son intervention. II.1. Matériel -La BUP (Reckitt Benckiser, France) est dissoute dans une solution aqueuse de tween à France). (équation, Tableau 6) et inversement pour l'air expiré
	Aucune étude expérimentale n'avait évalué les effets respiratoires du mélange BUP/NLX seul Ainsi, nous pensons que notre modèle murin devrait apporter des éléments de réponse aux
	ou en association aux BZD ou à l'éthanol en comparaison avec la BUP seule. Nos objectifs questions suivantes : II.1.1 Animaux 4% (Sigma-Aldrich, France) afin d'obtenir une concentration finale de 30 mg/mL. -Le chlorure de sodium en poudre utilisé est de qualité pour analyses (VWR International,
	-	Le DZP (Roche, France) est dissout dans une solution aqueuse de tween à 4% afin France).
	étaient donc:
	-Quels sont les effets respiratoires de la combinaison de BUP et de DZP ainsi que de BUP Les animaux utilisés sont des rats mâles Sprague-Dawley (Janvier, France) âgés de 7 à 9 d'obtenir une concentration finale de 20 mg/mL. -La gamme d'étalonnage est constituée par un « Cerilliant multi-component alcohol
	1)-Etudier chez le rat Sprague-Dawley les effets respiratoires de la BUP et du mélange et d'éthanol administrés à fortes doses ? semaines, pesant 250 à 350 g au moment de l'expérimentation, maintenus dans des conditions -La NLX (Sigma-Aldrich, France) est dissoute dans une solution aqueuse de tween à 4% calibration kit » et les contrôles internes par les « Medidrug ethanol VB-plus 0,5 g/L » et
	BUP/NLX associés au DZP, la BZD la plus souvent retrouvée dans les études autopsiques, -Quelle est la nature de l'interaction entre la BUP et le DZP et entre la BUP et l'éthanol à constantes de température (20-21°C) et soumis à un cycle de lumière/obscurité (12h/12h). Les afin d'obtenir une concentration finale de 7,5 mg/mL pour respecter le ratio 4 :1 utilisé « Medidrug ethanol VB-plus 1,1 g/L » (LGC standards, France).
	selon plusieurs conditions d'administration se rapprochant le plus possible de son usage chez fortes doses ? animaux disposent de nourriture et d'eau ad libitum jusqu'à la vieille de l'expérimentation. À dans la formulation du Suboxone ® . -L'hydrochlorure de BUP et la NLX-3-glucuronide (Lipomed, Suisse) sont dissouts dans
	l'homme : (1) administration IV à un animal naïf mimant l'utilisation festive chez un -Quel est le rôle de la NBUP dans la dépression respiratoire liée aux combinaisons, la fin d'expérimentation, les animaux sont euthanasiés par une surdose IP ou IV de -La solution d'éthanol absolu (Riedel-delhaen, Allemagne) est diluée dans une solution de le méthanol pour obtenir des concentrations de 1 et 0,1 g/L, respectivement.
	consommateur occasionnel non-dépendant ; et (2) administration IV en combinaison au DZP, notamment avec l'éthanol ? pentobarbital sodique. NaCl 0,9% afin d'obtenir une concentration finale de 300 g/L. -La NBUP, BUP-3-glucuronide, NBUP-glucuronide, BUP-d4, NBUP-d4 et la NLX-d5
	mimant une poly-consommation festive chez un consommateur occasionnel non-dépendant. -Quels sont les éventuels bénéfices en termes d'effets neuro-respiratoires de la combinaison -Le FLZ (Sigma-Aldrich, France) est dissout dans une solution aqueuse de tween à 4% (Sigma-Aldrich, France) sont dissoutes dans le méthanol pour atteindre les
	Nous avons souhaité confirmer le mécanisme PD de l'interaction BUP/BZD et étudier le rôle BUP/NLX en comparaison à la BUP seule en conditions de surdosage, d'association au II.1.2. Les réactifs et solvants afin d'obtenir une concentration finale de 10 mg/mL. concentrations de 0,1 g/L.
	de la voie GABA-ergique en reversant les effets observés par le FLZ, antagoniste compétitif DZP ou à l'éthanol et d'administration après développement d'une tolérance ? La dilution du tween 4% est obtenue à partir d'une solution de tween 20%. La dilution utilisée est le -L'hydrochlorure de NLX (LGC, France) est dissout dans le méthanol pour obtenir une
	des récepteurs GABA-A ayant été rapporté chez l'homme comme capable de reverser, Par ailleurs, une étude comparative des kits de prélèvement (Quantisal ® vs Certus ® ) de II.1.2.1. Anesthésiques et médicaments meilleur compromis testé pour obtenir une dissolution complète et une viscosité proche du NaCl. concentration de 0,81 g/L.
	contrairement à la NLX, les effets neuro-respiratoires induits par une overdose à la BUP Les solutions destinées à être administrées sont conservées au froid positif (+ 4°C) pendant -Le formiate d'ammonium (Sigma-Aldrich, France) ainsi que le méthanol et l'acétonitrile
	matrice salivaire dans la recherche de produits illicites dont les opioïdes dans le cadre de la
	(Mégarbane et al. 2006). sécurité routière, a été menée dans le but d'évaluer leur fiabilité en laboratoire en termes de -La kétamine (Kétamine®) est utilisée en solution injectable à 50 mg/mL (Parke-Davis, 24h sauf pour l'éthanol qui a été conservé à température ambiante selon les recommandations (Carlo Erbra, France) sont de qualité pour analyse chromatographie liquide (CL).
	2)-Etudier chez le rat Sprague-Dawley les effets respiratoires de la BUP et du mélange volume réellement collecté, de rendement d'extraction lors de la collecte, de stabilité selon le France). en vigueur.
	II.2. Pléthysmographie corps entier
	BUP/NLX en association à l'éthanol en administration IV mimant une poly-consommation mode de conservation pour les différentes molécules dépistées et de mode de collecte -La xylazine (Rompun®) est utilisée en solution injectable à 2% (Bayer, France).
	aurait été causée par l'utilisation festive chez un consommateur occasionnel non-dépendant. Nous avons souhaité confirmer le salivaire. Ce travail, correspondant à un article publié dans le « Journal of Analytical -Le pentobarbital sodique (Thiopental®) est utilisé en solution injectable à 50 mg/mL II.1.2.3 Réactifs de dosage
	mécanisme PD de l'interaction BUP/éthanol, en reversant les effets observés par Toxicology » en septembre 2016 et présenté en annexe, permettait d'associer dans cette thèse (Sanofi, France). de cet aérosol afin de neutraliser les preneurs d'otages. Il était primordial que le produit agisse II.2.1. Principe
	rapidement et les concentrations utilisées ont peut-être été surévaluées afin que l'aérosol soit -Le tert-butanol (Sigma Aldrich, France) est dissout dans de l'eau ultra pure à 200 mg/L et
	l'administration de FLZ et de NLX. Nous avons aussi souhaité étudier les interactions PK une approche scientifique plus fondamentale et une recherche appliquée plus proche du
	efficace le plus promptement possible. L'identification plus rapide du toxidrome présenté par utilisé comme EI pour le dosage de l'éthanol sanguin. La pléthysmographie corps entier est une technique non-invasive permettant la mesure des
	entre BUP et éthanol et évaluer le rôle de la NBUP dans l'apparition de la dépression terrain. Ces travaux ont initié l'étude comparative de kits collecteurs de salive organisée par la
	les victimes et/ou la connaissance de la nature du produit utilisé aurait sans doute permis de volumes et des temps ventilatoires à partir des variations de pressions secondaires aux
	respiratoire observée. Mission interministérielle de lutte contre les drogues et les conduites addictives (MILDECA)
	sauver quelques vies, en administrant rapidement l'antidote adéquat. Un traitement à base de variations de température et de saturation en eau de l'air inspiré et expiré de l'animal placé
	et mise en oeuvre par les forces de l'ordre.

  . Le système CL est couplé à un spectromètre de masse en tandem API 3200 TM (triple quadrupole) (Sciex, France) équipé d'une source turboV TM . Les composés sont élués selon leurs propriétés physicochimiques et leur affinité entre la phase mobile et les particules poreuses de la colonne. En phase inverse, les molécules les plus polaires (glucurono-conjuguées), sont moins retenues que leur molécule parent, plus apolaires. En sortie de colonne, les composés élués selon leur temps de rétention sont désolvatés puis ionisés en mode électro-spray positif (ESI

		Transitions MRM	Energie (eV)	Temps de rétention
	Composés	m/z		Cone	Collision	min
	BUP	468,2	396,3	91,0	47,0	7,4
	BUP	468,2	468,2	91,0	21,0	7,4
	BUP-GLUC	645,1	469,4	106,0	55,0	6,6
	BUP-GLUC	645,1	645,4	106,0	25,0	6,6
	BUP-d4	472,2	400,2	91,0	47,0	7,4
	NorBUP	414,2	414,4	91,0	17,0	6,8
	NorBUP	414,2	83,2	91,0	65,0	6,8
	NorBUP-GLUC	590,0	590,4	101,0	23,0	5,9
	NorBUP-GLUC	590,0	414,4	101,0	41,0	5,9
	NorBUP-d3	417,2	165,0	91,0	95,0	6,8
	NLX	328,2	328,3	51,0	15,0	5,1
	NLX	328,2	310,2	51,0	23,0	5,1
	NLX-GLUC	504,2	504,3	101,0	23,0	4,4
	NLX-GLUC	504,2	414,4	101,0	41,0	4,4
	NLX-d5	333,2	315,1	51,0	23,0	5,1

+ ) dans la source du spectromètre de masse. Les ions chargés positivement, sont guidés vers un premier Quadripôle (Q1 ; sélection de l'ion précurseur), fractionnés dans une cellule de collision (Q2) puis les ions fragments sont triés dans le troisième quadripôle (Q3) selon leur rapport masse/charge (m/z) puis détectés dans la fenêtre de temps imposée grâce au mode schedulled Multiple Ion Monitoring (MRM) optimisés préalablement (Tableau 7). L'équipement est piloté et les enregistrements retraités par l'intermédiaire du logiciel Sciex Analyst R 1.6. Tableau 7 -Optimisation des paramètres du spectromètre de masse II.4.2. Validation de la méthode La méthode a été validée selon les recommandations en vigueur de la Food and Drug Administration (FDA) à l'aide du logiciel e-noval (Arlenda ® , Liège) qui a permis d'obtenir les données suivantes pour chaque molécule étudiée :

Table 1

 1 Precipitated withdrawal signs and weighting factors (signs noted simply as present or absent).

		Weighting factor
	Graded signs
	Weight loss in 180 min (each >1% above the weight	1
	lost by control rats)
	Number of escape attempts
	2-4	1
	5-9	2
	10 or more	3
	Number of abdominal constrictions
	(each one)	2
	Number of wet shakes
	1-2	2
	3 or more	4
	Checked signs
	Diarrhea	2
	Facial fasciculation/teeth chatter	2
	Swallowing movements	2
	Profuse salivation	7
	Chromodacryorrhea	5
	Ptosis	2
	Abnormal posture	3
	Erection/ejaculation	3
	Irritability	3

  : the respiratory frequency (f), and the minute ventilation (VE = VT × f). At the end of experiment, rats were euthanized with lethal ip injections of pentobarbital.

	2.4. Study design
	2.4.1. Study 1 -effects of BUP/NLX in naive rats

(FLZ)

vs. its solvent administered in Sprague-Dawley rats 15 min after treatment with 30 mg/kg buprenorphine/solvent + 20 mg/kg diazepam (BUP, vertical lines and white, respectively) or 30 m/kg buprenorphine/7.5 mg/kg naloxone + 20 mg/kg diazepam (BUP/NLX, horizontal lines and black, respectively). DZP was injected intraperitoneally 30 min before the intravenous administration of BUP/NLX or BUP/solvent. Each group consisted of six rats. Values represent mean ± SEM of the areas under the curve (AUC) of each parameter between 15 and 20 min post-injection (i.e. between the time of FLZ injection and 5 min later). Data are expressed as arbitrary units. Comparisons were performed using t-tests. (BUP/solvent + DZP) + FLZ vs. (BUP/solvent + DZP) + solvent: *P < 0.05, **P < 0.01; (BUP/NLX + DZP) + FLZ vs. (BUP/NLX + DZP) + solvent: $ P < 0.05, $$ P < 0.01. calculated

Table 2

 2 Effects of buprenorphine (BUP) and BUP/naloxone (NLX) alone or in combination with diazepam (DZP) on the temperature and plethysmography parameters of naïve and tolerant Sprague-Dawley rats. Effects in each study group were evaluated in comparison to its corresponding comparator, as indicated in column 2. Significant effects are indicated by ↑ or ↓ for P < 0.05; ↓↓ for P < 0.01; ↓↓↓ for P < 0.001.

		Comparator	Inspiratory time	Expiratory time	Tidal volume	Minute volume	Temperature
	Naive rats
	BUP	Solvent	↑	NS	NS	NS	NS
	BUP/NLX	BUP	NS	↓	NS	NS	NS
	BUP + DZP	BUP	NS	NS	↓ a	NS	↓↓↓ a
	BUP/NLX + DZP	BUP/NLX	NS	↑ a	↓↓ a	↓↓↓ a	↓↓↓ a
	BUP/NLX + DZP	BUP + DZP	NS	NS	NS	NS	NS
	BUP-tolerant rats
	BUP/NLX	BUP	NS	NS	NS	NS	↓↓↓
	BUP + DZP	BUP	↑↑↑	NS	NS	↓↓↓	↓↓
	BUP/NLX + DZP	BUP/NLX	NS	NS	NS	NS	↓↓↓
	BUP/NLX + DZP	BUP + DZP	NS	NS	NS	NS	NS
	a Completely reversed by IV 10 mg/kg flumazenil.
	NS, not significant.

Table 1

 1 Multiple Reaction Monitoring (MRM) transitions, cone voltage, collision energy and retention time of the different studied compounds and internal standards. The italic data represents the qualifier transition.

		MRM	Cone	Collision	Retention
		transitions	voltage	Energy	time
	Compounds	(m/z)	(eV)	(eV)	(min)
	Buprenorphine	468.2-396.3	91	47	7.4
	Buprenorphine	468.2-468.2	91	21	7.4
	Buprenorphine-d4	472.2-400.2	91	47	7.4
	Norbuprenorphine	414.2-414.4	91	17	6.8
	Norbuprenorphine	414.2-83.2	91	65	6.8
	Norbuprenorphine-d3	417.2-165.0	91	95	6.8
	Buprenorphine-3-glucuronide	645.1-469.4	106	55	6.6
	Buprenorphine-3-glucuronide	645.1-645.4	106	25	6.6
	Norbuprenorphine-3-glucuronide	590.0-590.4	101	23	5.9
	Norbuprenorphine-3-glucuronide	590.0-414.4	101	41	5.9
	Naloxone	328.2-328.3	51	15	5.1
	Naloxone	328.2-310.2	51	23	5.1
	Naloxone-d5	333.2-315.1	51	23	5.1
	Naloxone-3-glucuronide	504.2-504.3	101	23	4.4
	Naloxone-3-glucuronide	504.2-414.4	101	41	4.4

Table 2

 2 Limit of detection (LOD), lower and upper limit of quantification (LLOQ and ULOQ) for each studied compound.

	LOD	LLOQ	ULOQ

Table 3

 3 Precision and trueness at each validation level (n=9)

		Concentration Trueness Precision
	Compounds
		(ng/mL)	(%)
				Repeatability Intermediate
					precision
				(%)	(%)
	Buprenorphine	4.0	85.0	5.1	15.1
		7.5	87.7	10.3	11.3
		15.0	95.8	3.6	4.1
		40.0	96.6	4.2	5.9
		75.0	91.6	3.5	4.3
		150.0	96.2	3.9	7.7
		750.0	96.3	1.5	8.9
		1500.0	95.6	1.7	6.5
		4000.0	95.0	4.2	5.5
	Norbuprenorphine	7.5	98.9	7.7	8.1
		15.0	108.7	4.9	7.0
		40.0	106.0	5.5	7.5
		75.0	104.7	2.9	7.6
		150.0	107.1	6.1	6.8
		750.0	97.1	4.5	4.8
		1500.0	91.6	3.7	3.7
		4000.0	98.2	9.8	9.8
	Buprenorphine-3-glucuronide	4.0	94.5	14.3	14.3
		7.5	92.1	9.6	9.6
		15.0	96.7	4.2	6.0
		40.0	91.7	5.9	5.9
		75.0	93.4	6.9	8.2
		150.0	97.0	9.8	13.7
		750.0	95.8	7.6	10.5
		1500.0	99.4	2.7	2.9
		4000.0	99.1	2.8	2.8
	Norbuprenorphine-3-glucuronide 4.0	97.3	9.9	14.2
		7.5	98.8	6.4	7.8
		15.0	101.5	6.2	14.3

Table 4

 4 Precipitation recovery (PR) and matrix effects (ME) expressed as value above or below 100% (CV%) at low and high concentrations for each studied compound in rat whole blood and at fixed concentration for the three internal standards.

		Concentration	PR % (CV%) n=5	ME % (CV%) n=5
		(ng/mL)
		Low High	Low	High	Low	High
	Buprenorphine	15	1500	108 (

TABLE 1 .

 1 Pharmacokinetic parameters of ethanol in the whole blood after intragastric administration of 3 g/kg ethanol (N=17 rats). Parameters were determined using a non-linear mono-compartmental model with oral delay

	Parameters (unit)	Mean	CV (%)
	Cmax (mg/dl)	199.0	28.3
	Tmax (min)	50.0	86.0
	ka (/min)	0.07	2.4
	KM (mg/dl)	28.0	21.5
	VM (mg/min)	0.4	9.1
	Cl (dl/min)	0.014	42.3
	Vd (l/kg)	1.31	3.4
	AUC0-360 min (mg/dl.min)	48,810	33.9
	AUC0-∞ (mg/dl.min)	49,450	42.8
	Cmax and Tmax, observed maximal concentration and peak time; ka, absorption rate constant; KM and VM,
	Michaelis-Menten constants; Cl, clearance; Vd, volume of distribution in the central compartment; AUC0-360 min,
	area under the concentration-time curve from time zero to 360 min; AUC0-∞, area under the concentration-time
	curve from time zero to infinity

TABLE 2 .

 2 Pharmacokinetic parameters of buprenorphine (BUP), norbuprenorphine (NBUP), BUP-3-glucuronide and NBUP-3-glucuronide in four groups of rats receiving intragastric (IG) 0.9%NaCl + intravenous (IV) 30 mg/kg BUP, IG 0.9%NaCl + IV 30 mg/kg BUP/7.5 mg/kg naloxone (NLX), IG 3 g/kg ethanol + IV 30 mg/kg BUP or IG 3 g/kg ethanol + IV 30 mg/kg BUP/7.5 mg/kg NLX. Each group consisted of 6-8 rats. Parameters were determined using a two-compartmental model. Comparisons were performed using one-way ANOVA followed by Dunn's post-tests. *P < .05, **P < .01 for ethanol + BUP vs. 0.9%NaCl + BUP

	Parameters (units)	0.9%NaCl + BUP	0.9%NaCl + BUP/NLX	Ethanol + BUP	Ethanol + BUP/NLX
	BUP	Mean	CV (%)	Mean	CV (%)	Mean	CV (%)	Mean	CV (%)
	Cmax (µmol/l)	4.3	101.2	3.4	73.4	2.1	100.6	2.8	103.2
	Tmax (min)	10.8	67.9	10.0	83.7	8.8	46.7	10.6	55.1
	k12 (/min)	0.07	47.9	0.03	35.0	0.02	37.3	0.05	35.5
	k21 (/min)	0.09	26.0	0.02	27.0	0.02	29.9	0.05	29.1
	kel (/min)	0.02	15.7	0.01	18.3	0.01	13.2	0.002	14.8
	Vd (l/kg)	10.6	13.9	17.9	17.4	28.8*	13.5	17.4	10.7
	Cl (l/kg.min)	0.2	5.8	0.2	5.8	0.4	4.1	0.3	9.0
	T1/2β (min)	43.5	15.6	51.7	5.8	47.3	14.1	39.6	14.8
	AUC0-360 (µmol/l.min)	483.0	79.7	234.4	47.7	96.5*	62.5	184.4	84.5
	AUC0-∞ (µmol/l.min)	380.0	5.8	288.8	19.5	159.3*	4.1	210.1	9.0
	BUP-3-glucuronide	Mean	CV (%)	Mean	CV (%)	Mean	CV (%)	Mean	CV (%)
	Cmax (µmol/l)	2.6	82.9	2.4	40.7	5.5	41.9	3.5	38.4
	Tmax (min)	8.3	49.0	9.3	48.4	7.9	72.2	6.3	37.0

  . L'héroïne est l'opioïde illicite qui soulève la plus grande méfiance en raison de sa disponibilité sur le marché noir et en raison des risques qui y sont associés, qu'ils soient liés à la substance elle-même ou bien à son type d'utilisation. L'usage de la méthadone expose également au risque d'overdoses en raison de ses effets puissants et de sa lente d'élimination. Depuis 2003, la BUP (générique du Subutex ® ) a été commercialisée aux Etats-Unis comme alternative à la méthadone.

	En France, 170 000 personnes ont reçu un traitement de substitution à l'héroïne en 2012 et la
	BUP haut dosage est toujours largement majoritaire (65% de bénéficiaires contre 35% pour la
	méthadone) (UNODC, 2016). Cependant, la BUP est encore souvent détournée de son usage
	thérapeutique par un nombre important d'utilisateurs qui la revendent sur le marché noir. Par
	ailleurs, même si la BUP semble plus sûre que la méthadone, son utilisation a été associée à
	un risque élevé de toxicité en cas de mésusage, lorsqu'elle est associée à d'autres
	psychotropes comme les BZD ou l'éthanol ou lorsqu'elle est injectée par voie IV (Häkkinen

. Analyse des effets respiratoires de l'association de diazépam et de buprénorphine

  ou après le développement d'une tolérance, qui pourrait être différente entre les effets respiratoires et les effets analgésiques recherchés (Mohammad et al., 2012).Afin de mieux comprendre le mécanisme de toxicité de la BUP associée aux BZD ou à l'éthanol, ainsi que le rôle de la NLX, nous avons mené plusieurs travaux expérimentaux chez le rat Sprague-Dawley.

	IV.1Dans le premier travail, nous avons étudié les effets respiratoires du mélange BUP/NLX
	administré au rat selon différentes modalités mimant les différentes situations cliniques
	rencontrées au cours du mésusage de la BUP : usager occasionnel festif, association à une
	BZD (DZP) et à l'éthanol ou toxicomane dépendant et tolérant.
	IV.1.1. Effets respiratoires de la combinaison buprénorphine/naloxone seule
	Ainsi, l'injection IV du mélange BUP/NLX comme d'ailleurs celle de la BUP seule
	n'entraîne pas de dépression respiratoire chez le rat, comme précédemment rapporté (Gueye

  1.2. Association du diazépam et de la buprénorphine IV.1.2.1. Effets respiratoires chez le rat naïf et étude pharmacodynamique par réversion La combinaison de DZP avec la BUP seule ou en combinaison avec la NLX est clairement responsable d'une dépression respiratoire objectivée par une réduction significative du VM.

  et semble impliquer les récepteurs GABA-A puisque les effets sont reversés par le FLZ, l'antagoniste GABA-ergique de référence utilisé comme antidote chez l'homme. Le DZP réduit le VT et en l'absence de compensation sur le TE de l'augmentation du TI induite par la BUP, une dépression respiratoire s'installe avec la combinaison DZP + BUP. De plus, la NLX du mélange BUP/NLX ne prévient pas la survenue de cette dépression respiratoire dans notre modèle. Il nous est apparu intéressant de noter que le FLZ modifie le TI de façon significative pour les rats recevant DZP + BUP et DZP + BUP/NLX dans notre travail. La réversion d'un effet attribuable dans la littérature aux opioïdes et non aux BZD (Chevillard et al., 2009) laisse présager de la possibilité d'interaction entre le système opioïde μ et GABA lors de la combinaison DZP + BUP, tant au niveau des récepteurs que de la transduction intracellulaire du signal, sur les cellules du centre pontique ou médullaire haut du contrôle de la ventilation co-exprimant les deux systèmes

. Mise au point d'une méthode de dosage de la buprénorphine et de ses métabolites en LC-MS/MS

  .1.2.3. Mortalité suraiguë de la buprénorphine chez le rat tolérant Il est surprenant de noter que tous les animaux traités de façon répétée par BUP sont décédés à l'injection d'une dose IV de BUP 30 mg/kg (décès : 6/6), alors que la mortalité semblait significativement plus réduite après injection de BUP/NLX (30 mg/kg/7,5 mg/kg) (décès : 2/6) et de DZP 20 mg/kg + BUP/NLX (30 mg/kg/7,5 mg/kg) (décès : 0/6). Le décès chez ces animaux rendus dépendants et tolérants était rapide (5 min après l'injection IV) dans un tableau de convulsions et d'agitation avec respiration agonique. Le mécanisme exact de ces décès n'a pas pu être précisé : il a cependant déjà été rapporté dans certaines études expérimentales, avec d'ailleurs un effet préventif lors du prétraitement par une BZD[START_REF] Borron | Flunitrazepam variably alters morphine, buprenorphine, and methadone lethality in the rat[END_REF]. Des études ultérieures sur un plus grand effectif d'animaux avec une exploration des paramètres métaboliques, gazométriques et neurologiques (électro-encéphalographie) pourraient donc être utiles pour mieux comprendre le mécanisme de cette toxicité suraiguë, d'ailleurs retrouvée par les études autopsiques chez certains toxicomanes à la suite d'injection de comprimés pilés de BUP sans association à une BZD(Kintz, 2001). Le mélange BUP/NLX pourrait ainsi être préventif de ce type de décès, contrairement à son absence d'effets sur l'interaction délétère BZD + BUP chez l'animal naïf.

	IV.2Cette méthode a été mise au point pour étudier les mécanismes d'interaction PK entre
	l'éthanol et la BUP. Pour cette étude, nous avons dosé l'éthanol en CPG-DIF et la BUP ainsi
	que ses métabolites en CL-SM/SM pendant 360 min.
	A notre connaissance, au moment de l'étude, aucune méthode de dosage ne permettait
	l'identification de la BUP, de la NLX et de leurs métabolites de phase I et II dans le sang total
	à partir d'une faible prise d'essai de matrice dense (50 µL de sang total) et par simple
	précipitation/dilution. La plupart des études ne quantifiaient la BUP et la NBUP qu'au niveau
	plasmatique

  . La molarité du tampon de formiate d'ammonium a été testée de 0,25 à 5 nM et la meilleure sélectivité ainsi que la meilleure stabilité des temps de rétention ont été obtenues avec une molarité de 0,25 mM. Le méthanol a été choisi en accord avec les recommandations du fournisseur de la colonne biphényl puisqu'il améliore les interactions et la rétention des molécules. Le gradient d'élution a été également optimisé afin de compenser la faible sélectivité due au suivi de la transition ion parent-ion parent ainsi que le manque de pureté des échantillons traités par simple précipitation/dilution.IV.2.2. Validation de la méthodeLa méthode développée et optimisée, a été validée avec succès selon les critères de validation de méthodes bio-analytiques (FDA). Il n'a pas été observé d'interférence aux temps de rétention des molécules et de leurs EI, le ratio signal/bruit aux LQi étant supérieurs à 10 comme recommandé. La justesse est comprise dans l'intervalle 85-115% de la valeur théorique à chaque niveau de validation testé. La précision est comprise dans les +/-15 % de coefficient de variation à chaque niveau de validation testé (20 % à la LQi).Nous avons donc développé et validé avec succès une méthode de dosage simultané de la BUP, de la NLX et de leurs métabolites de phase I et II dans le sang total de rat après simple précipitation des protéines par CL-SM/SM. Cette méthode est également applicable chez l'homme dans les laboratoires de Toxicologie médico-légale. Cette prévention d'effets délétères peut être attribué, là aussi, à un certain degré de compétition entre la BUP et la NLX au niveau du RO-µ bien que l'affinité de la BUP pour ce récepteur soit nettement plus élevée

	un temps supplémentaire de ré-équilibration de 8,5 minutes, ramenant le temps total d'analyse et de BUP.
	à 15,5 min, finalement plus long que notre analyse de 13,5 minutes.
	De même, après l'injection du plus haut niveau de calibration, il n'a pas été observé de rémanence. Les LD et les LQi, avec un signal/bruit supérieur à 3 et 10, respectivement, étaient inférieures à 10 ng/mL (sauf pour la NLX-glucuronide) et correspondaient aux concentrations attendues lors de notre étude expérimentale. Le mode schedulled MRM, après optimisation des paramètres « masse » a une bonne sensibilité et une bonne spécificité et ce, malgré les paramètres limitants de la méthode (faible volume sanguin et traitement de l'échantillon par précipitation des protéines/dilution). Les ratios MRM aux LD et LQi sont tous compris dans l'intervalle de tolérance de 30 % comparés à ceux calculés par les gammes de calibration. La méthode était juste et précise pour chaque molécule dans l'intervalle de dosage validé selon les recommandations en (environ 45 %) mais celle-ci a été compensée par l'usage de son analogue deutéré comme EI et est sans impact sur les autres paramètres de validation. De même, un effet d'enrichissement ionique est observé pour la NBUP-3-glucuronide (129 %) mais il n'a pas impacté les résultats de validation obtenus. Un traitement de l'échantillon plus long comprenant notamment une extraction sur phase solide (SPE) aurait pu diminuer ces effets matrice (Swortwood et al., 2016) mais les rendements de précipitation sont affectés par cette longue et couteuse préparation d'échantillon. Une méthode similaire a récemment été mise au point par Joshi et al. pour le dosage simultané de la BUP, de la NLX et de leurs métabolites de phase I et II dans le plasma chez le rat (Joshi et al., 2016). Cependant, l'utilisation du plasma nécessite des prélèvements plus volumineux de sang total (plus traumatique pour l'animal), suivis d'un traitement plus long (centrifugation et séparation du plasma), peu compatibles avec des prélèvements répétés à temps rapprochés. L'utilisation du plasma n'était donc pas envisageable dans notre étude. d'interactions hydrophiles) lors de la phase de développement mais elle n'avait pas été retenue, faute de robustesse. La ré-équilibration de la colonne est également trop lente, comme décrit dans leur méthode, ou à leur temps d'analyse de 7 minutes doit être additionné En outre, le temps de préparation de leurs échantillons est particulièrement long, puisqu'il nécessite une congélation à -40°C suivi d'une évaporation à +50°C alors que notre traitement d'échantillons ne concerne qu'une simple précipitation des protéines et une dilution des échantillons. L'avantage de leur méthode de dosage réside dans les LQi obtenues pour la NLX-glucuronide (1 ng/mL), nettement inférieures aux nôtres (75 ng/mL). Cette différence s'explique notamment par les conditions chromatographiques. Dans notre méthode de dosage, le pH utilisé (2,7), ne facilite pas l'ionisation de la molécule au niveau de la source du spectromètre de masse en tandem puisque la NLX-glucuronide se retrouve sous deux formes différentes chez les animaux ayant reçu 7,5 mg/kg de NLX ont toujours excédées 75 mg/mL sur la période étudiée. L'avantage de l'utilisation de plasma et de leur préparation d'échantillon par dilution/précipitation/congélation/évaporation semble diminuer les effets matrices observés, inférieurs aux nôtres. vigueur. Lors de l'évaluation de l'effet matrice, une suppression d'ions a été observée pour la BUP Nous avons aussi testé la colonne HILIC (hydrophilic interaction liquid chromatography : CL Cependant, l'ensemble des contraintes n'est pas compatibles avec notre étude.

(neutre et ionisée positivement). Au pH de 3,5, utilisé par la méthode

de Joshi et al., (2016)

, la molécule se retrouve sous forme neutre (~85%), favorisant les conditions d'ionisation au sein de la source. Cependant, les LQi obtenues lors de la validation de notre méthode répondaient aux exigences de notre étude PK puisque les quantifications de NLX-glucuronide retrouvées

  . Cette augmentation du TI liée notamment à une inhibition des centres de contrôle de la respiration est prévenue par la NLX dans la combinaison de BUP/NLX. De manière surprenante, la combinaison d'éthanol et de BUP/NLX abaisse le VT, alors que cet effet est généralement attribué à une action centrale ou périphérique sur les muscles inspiratoires. Le mécanisme exact de cette interaction reste donc à préciser. Nous avons ainsi montré que le métabolisme de l'éthanol n'est pas modifié par l'administration de BUP en présence ou non de NLX(Badawy et Evans, 1981). Par contre, nous avons trouvé une modification significative du métabolisme de la BUP après administration préalable d'éthanol. Ainsi, en présence d'éthanol, le Vd de la BUP est augmenté et par conséquent, l'AUC correspondante de la BUP est diminuée, sans altération supplémentaire attribuée à la NLX. Nous avons émis plusieurs hypothèses théoriques pouvant expliquer cette interaction de nature PK entre l'éthanol et la BUP :Dans notre étude, la dépression respiratoire induite par l'association d'éthanol et de BUP n'est pas reversée par le FLZ seul, administré au maximum de la dépression respiratoire observée.

IV.3.2. Etude pharmacocinétique sanguine

A la suite de la mise au point du dosage de la BUP et de ses métabolites en CL-SM/SM, nous avons pu étudier la PK de l'éthanol et de la BUP afin d'analyser l'interaction PK entre ces deux molécules après administration de la combinaison d'éthanol et de BUP à l'animal. Dans notre modèle, les concentrations sanguines d'éthanol ne sont pas modifiées après administration IV de BUP ou de BUP/NLX.

stupéfiants dans la salive : comparaison de deux kits de prélèvements

  , la NLX a été rapportée comme capable de reverser les effets de l'éthanol lors d'intoxications sévères.Notre travail a cependant quelques limites : L'étude des gaz du sang artériel pourrait être complémentaire de l'approche en pléthysmographie corps entier de nos études puisqu'elle donne la composante finale de la ventilation. Néanmoins, la description des effets respiratoires à l'aide de la pléthysmographie reste primordiale pour comprendre les mécanismes d'interaction entre les différentes molécules. Il n'a pas été possible à la vue des larges coefficients de variation obtenus lors de l'étude PK de la BUP, de montrer certaines différences entre les groupes testés. Cependant, si des différences avaient été observées, nous aurions considéré qu'elles n'auraient pas été assez pertinentes pour une explication clinique.La conduite après avoir fait usage de stupéfiants est une préoccupation mondiale requérant un dépistage rapide et sensible dans le cadre de la sécurité routière. Il est notable que la méthode de prélèvement de salive peut influencer les concentrations des substances dans l'échantillon et par conséquent, altérer la précision du dosage. Nous avons évalué deux kits collecteurs de salive, le kit Quantisal ® et le kit Certus ® pour leurs capacités à collecter les échantillons de salive et leur capacité à permettre aux laboratoires la confirmation de la conduite après avoir fait usage de stupéfiants. Nous avons étudiés quatre paramètres : (1) le volume de salive réellement collecté par les kits ; (2) le rendement d'extraction des substances incluant les opiacés, le THC, les amphétamines ainsi que la cocaïne et certains de leurs dérivés ou métabolites ; (

	V. VI. VII. ANNEXES LIMITES ET PERSPECTIVES CONCLUSION Article 4 -
	Cette étude est la première à décrire les effets respiratoires de BUP/NLX associée à l'éthanol Annexe 1: article 4 -Illicit drugs in oral fluid: evaluation of two collection devices
	ou à une BZD sur des animaux naïfs ou devenus tolérants à la BUP. Annexe 2 : Synthèse des résultats des effets respiratoires des associations DZP/ BUP et
	Des différences significatives en termes d'effets respiratoires existent entre la BUP et la éthanol/BUP
	BUP/NLX seulement en cas d'association au DZP ou à l'éthanol.
	Lors de l'association au DZP, la dépression respiratoire est accentuée chez des rats naïfs alors
	que celle-ci est réduite chez des rats tolérants à la BUP. L'interaction de nature PD a été
	confirmée par réversion des effets dépresseurs respiratoires à l'aide d'un antagoniste GABA-
	ergique.
	En effet, l'effectif d'animaux utilisé (6 à 8) est généralement suffisant pour montrer des Lors de l'association à l'éthanol, la dépression respiratoire est moindre lorsque la BUP est
	différences significatives ayant une pertinence en clinique. administrée en combinaison à la NLX. La NLX ne reverse pas mais prévient des effets
	dépresseurs respiratoires de l'association d'éthanol et de BUP. Les hypothèses des
	mécanismes exacts de l'interaction entre éthanol et BUP sont multiples, essentiellement de
	nature PK sans pouvoir écarter une nature PD.
	A partir de ce travail, il nous apparaît plusieurs avantages à la nouvelle formulation de
	BUP/NLX commercialisée sous le nom Suboxone ® en comparaison à la formulation BUP
	seule (Subutex ® ).
	Le syndrome de manque observé à la suite de l'administration de BUP/NLX aux animaux
	tolérants à la BUP pourrait suggérer la possibilité d'un effet dissuasif chez le toxicomane
	Dans notre étude, la NLX administrée seule au maximum de la dépression respiratoire induite contre le recours au mésusage IV, fréquemment observé dans les cohortes de patients
	par l'association d'éthanol et de BUP ne réverse aucun paramètre respiratoire. Cependant, substitués à la BUP.
	l'administration combinée de BUP/NLX prévient des effets délétères de cette association Le débat persiste encore sur l'intérêt relatif du Suboxone ® par rapport au Subutex ® parmi les
	addictologues.

puisque la dépression respiratoire est moins soutenue qu'avec l'association d'éthanol et de BUP seule. Plusieurs études ont rapporté une prévention de la NLX sur les effets de la BUP Une étude PK avec prélèvements de cerveaux et dosages de la BUP et de ses métabolites pourrait confirmer la nature PK de l'interaction entre l'éthanol et la BUP. D'autres antagonistes comme le RO 15-4513 peuvent être testés chez l'animal pour tenter de reverser les effets de l'éthanol dans la dépression respiratoire induite par son association à la BUP puisque l'utilisation de FLZ ne semble pas être efficace dans la réversion des effets délétères induits par l'association d'éthanol et de BUP.

Table I .

 I Recovery efficiencies of illicit drugs in relation to the collector device, quantisal ® collector vs. certus ® collector

	Illicit drugs	Quantisal ® collector	Certus ® collector
	Amphetamine	98 (6.1)	78 (12.6)
	Methamphetamine	100 (5.3)	102 (14.5)
	MDA	98 (8.5)	102 (12.6)
	THC	94 (5.5)	54 (6.8)***
	THC-COOH	93 (7.1)	87 (9.1)
	11-OH-THC	91 (12.7)	74 (13.8)*
	EME	97 (14.6)	105 (8.7)
	Cocaine	97 (8.5)	106 (7.2)
	BZE	88 (9.7)	107 (15.5)
	Morphine	98 (8.8)	113 (8.5)
	Codeine	98 (6.8)	118 (9.6)
	6-MAM	98 (5.6)	112 (12.8)
	Methadone	98 (60.1)	28 (ND) a
	Buprenorphine	97 (26.3)	84 (33.1)

1. Association DZP/BUP

	Rats naïfs	Comparateur	TI	TE	VT	VM	T°C
	BUP	BUP/NLX	NS	↓	NS	NS	NS
	DZP + BUP	BUP	NS	NS	↓*	NS	↓*
	DZP + BUP/NLX	BUP/NLX	NS	↑*	↓*	↓*	↓*
	DZP + BUP	DZP + BUP/NLX NS	NS	NS	NS	NS
	Rats tolérants à la BUP	Comparateur	TI	TE	VT	VM	T°C
	BUP	BUP/NLX	NS	NS	NS	NS	↓
	DZP + BUP	BUP	↑	NS	NS	↓	↓
	DZP + BUP/NLX	BUP/NLX	NS	NS	NS	NS	↓
	DZP + BUP	DZP + BUP/NLX NS	NS	NS	NS	↓
	Rats naïfs	Comparateur	TI	TE	VT	VM	T°C
	ETHANOL + BUP	ETHANOL	↑	NS	NS	↓	NS
	ETHANOL + BUP	BUP	↑	NS	NS	↓	↓
	ETHANOL + BUP/NLX	ETHANOL	NS	NS	NS	NS	NS
	ETHANOL + BUP/NLX	BUP/NLX	NS	NS	↓	NS	↓
	ETHANOL + BUP/NLX	ETHANOL + BUP ↑	NS	c	↑	NS
	NS : Non Significatif

* : reversé par l'administration IV de FLZ 10 mg/kg NS : Non Significatif

2. Association éthanol/BUP

Toxicité neuro-respiratoire de la buprénorphine associée au diazépam ou à l'éthanol en présence ou non de naloxone : étude expérimentale chez le rat des mécanismes d'interaction Résumé :

  La buprénorphine peut induire une dépression respiratoire en cas de mésusage ou d'association aux psychotropes et ce malgré des effets plafonnés. L'association buprénorphine/naloxone a été commercialisée pour limiter le mésusage; mais son intérêt reste indéterminé. Nous avons étudié chez le rat Sprague-Dawley les effets neuro-respiratoires de la combinaison buprénorphine/naloxone en présence de diazépam ou d'éthanol. Nous avons préalablement mis au point le dosage sanguin de buprénorphine et de ses métabolites par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem. Comme avec la buprénorphine seule, la combinaison buprénorphine/naloxone est responsable en association au diazépam, d'une dépression respiratoire. Celle-ci est reversée par le flumazénil et donc de mécanisme pharmacodynamique. Chez le rat tolérant, la combinaison buprénorphine/naloxone induit un sevrage et son association au diazépam n'induit plus de dépression respiratoire. La combinaison buprénorphine/naloxone est responsable d'une dépression respiratoire en association à l'éthanol, néanmoins moins marquée qu'avec la buprenorphine seule. Celle-ci n'est pas reversée par le flumazénil ou la naloxone. L'exposition préalable à l'éthanol augmente le volume de distribution de la buprénorphine et en altère les ratios métaboliques, suggérant un rôle de la norbuprénorphine dans la toxicité en interaction avec l'éthanol. L'interaction est pharmacocinétique, sans pouvoir écarter une part pharmacodynamique. La formulation buprénorphine/naloxone est source d'avantages théoriques ; mais ses bénéfices cliniques chez l'homme restent à établir.

Etude de linéarité : Dans l'éventail des volumes testés (50 à 2500 µL), la mesure était linéaire.Un volume de calibration était réalisé quotidiennement avant chaque expérience à l'aide d'une seringue d'un mL. Dix mesures ont été effectuées et la moyenne des variations du signal utilisée lors de l'analyse des tracés.Etude de la reproductibilité (variabilité inter-jour) : Sept séries de dix mesures sur des volumes de 50 à 2500 µL ont été effectuées, sur trois jours différents. Le coefficient de variation moyen était de 0,98 ± 0,01 %. Etude de la répétabilité (variabilité intra-jour) : Quatre séries de cinq mesures ont été effectuées le même jour. Le coefficient de variation moyen était de 0,43 ± 0,15 %. Etude de ré-inhalation du CO2 : L'étude de ré-inhalation a pour but de mesurer, lors des périodes de clampage, la teneur moyenne en CO2 dans la chambre ne doit pas dépasser 0,6% de l'air contenu de la chambre. La période optimale de clampage obtenue était de 60 secondes pour un débit d'air de 8 L/min.Ces paramètres de validation sont résumés dans la figure 13.

Cmax & Tmax, observed maximal concentration and peak time; ka, absorption rate constant; k12 & k21, elimination rate constants from the different compartments; kel, overall elimination rate constant; Vd, volume of distribution in the central compartment; Cl, clearance; T1/2β, half-life elimination; AUC0-360 min, area under the concentration-time curve from time zero to 360 min; AUC0-∞, area under the concentration-time curve from time zero to infinity

Acknowledgment

The authors would like to thank Mrs. Alison Good (Scotland, United Kingdom) for her helpful review of the manuscript.

Acknowledgements

The authors would like to thank the animal house laboratory of Paris-Descartes University and to acknowledge Mrs Alison Good, Scotland, UK, for her helpful review of the manuscript.

ACKNOWLEDGMENTS

This work was supported by the Direction Générale de l'Armement-Mission pour la

Recherche et l'Innovation Scientifique (DGA-MRIS) scholarship. The authors would like to thank the animal house laboratory of Paris-Descartes University and to acknowledge Mrs Alison Good, Scotland, UK, for her helpful review of the manuscript.

Acknowledgments

The authors would like to thank the staff of the IRCGN toxicology unit for technical assistance and to acknowledge Mrs Alison Good, UK, for her helpful review of the manuscript.

Funding

This work was supported by the Direction Générale de l'Armement-Mission pour la Recherche et l'Innovation Scientifique (DGA-MRIS) scholarship. Funding: This work was supported by the Direction Générale de l'Armement (DGA) -Mission pour la Recherche et l'Innovation Scientifique (MRIS) scholarship (Grant number: 201360042).

Funding Camille Cohier was funded by the Direction Générale des Armées.

the mechanisms of BUP-related toxicity in rat studies allowing the conduction of complete PK studies. Assessment of our LC-MS/MS method in human whole blood should be of high interest to forensic medicine.

Conflict of interest statement

The authors declare no conflict of interest.

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ABSTRACT

Buprenorphine and buprenorphine/naloxone combination are maintenance treatments used worldwide.

However, since their marketing, despite ceiling respiratory effects, poisonings and fatalities have been attributed to buprenorphine misuse and overdose. Therefore, to better understand the mechanisms of buprenorphine-related toxicity in vivo, experimental investigations have been conducted in the rat. We developed a liquid chromatographic-tandem mass spectrometric (LC-MS/MS) method for the simultaneous quantification of buprenorphine, naloxone and their metabolites (norbuprenorphine, buprenorphine-3-glucuronide, norbuprenorphine-3-glucuronide and naloxone-3-glucuronide) in rat whole blood. Compounds were isolated from whole blood by protein precipitation and chromatographically separated using gradient elution of aqueous ammonium formate and methanol in a Raptor Biphenyl column (100 mm x 3.0 mm x 2.7 µm). Following electrospray ionization, quantification was carried out in the multiple reaction monitoring mode by the tandem mass spectrometer API 3200 system. The LC-MS/MS method was validated according to the currently accepted criteria for bioanalytical method validation. The method required small sample volumes (50 µl) and was sensitive with limits of quantification of 4.0, 7.5, 4.0, 4.0, 1.5 and 75.0 ng/mL for buprenorphine, norbuprenorphine, buprenorphine-3-glucuronide, norbuprenorphine-3-glucuronide, naloxone and naloxone-3-glucuronide respectively. The upper limit of quantification was 4,000 ng/mL for all the studied compounds. Trueness (85.0-115.7%), repeatability (<14.3%) and intermediate precision (<14.9%) were in accordance with the international recommendations. The procedure was successfully used to quantify these compounds in rat whole blood samples collected from an in vivo pharmacokinetic study and can now be assessed for routine use in forensic laboratories.

Keywords: Buprenorphine; Naloxone; Glucuronide; Whole blood; Protein precipitation; Liquid chromatographic-tandem mass spectrometry

Selectivity and carry over

The method selectivity toward matrix was determined by checking the absence of interfering peaks at compound retention time in blank whole blood from six different batches. Carry-over effects were evaluated by injecting the mobile phase at initial conditions after the highest calibration sample (5,000 ng/mL) and by checking the absence of peak compounds.

Trueness, precision and range

Quantitative determination of trueness and precision (repeatability and intermediate precision)

were assessed by the three validation series, at eleven concentrations of each studied compound ranging from 0.75 to 4,000 ng/mL. Ratios between the mean concentrations obtained from the analytical measurements and the theoretical concentrations were used to calculate trueness. Variances of repeatability (intra-day variances) and intermediate precision (sum of intra-day and inter-days variances) were used to estimate the precision of measurements [34]. Precision at each concentration was expressed as the coefficient of variation (CV%) based on the theoretical value of the concentration [35]. According to recommendations [30][31], trueness was expected to be within 85-115% of the theoretical value (LLOQ 80-120%) and precision within +/-15% except for LLOQ (20%). The LLOQs and the LODs were estimated as the lowest validation standard of the two transition qualifier and quantifier compounds giving rise to signal-to-noise (S/N) ratios of 10 and 3, respectively, as recommended [30][31][32][33]. MRM ratios of samples at the LOD and LLOQ were calculated as the ratio of the quantifier and qualifier transition and a 30% generic tolerance permitted according to the SANCO/12571/2013 guidelines [32] when compared to mean MRM ratios of the three calibration standards.

Conflict of interest statement

None

Supplementary data

Table 1S

Signal to noise ratio (S/N) of each multiple reaction monitoring (MRM) transition at the limit of detection (LOD) and lower limit of quantification (LLOQ). The italic data is the qualifier transition.

MRM

ABSTRACT

Respiratory depression and fatalities have been attributed to ethanol/buprenorphine combination in drug addicts maintained with buprenorphine/naloxone or buprenorphine alone. The exact mechanisms of the ethanol/buprenorphine interaction and the contribution to the toxicity of norbuprenorphine, the main buprenorphine metabolite with respiratory depressant properties are unknown. We investigated the sedative and plethsymographic effects resulting from the co-administration of intragastric ethanol (3g/kg) and intravenous buprenorphine (30mg/kg) in Sprague-Dawley rats. We determined the whole blood pharmacokinetics of ethanol (using gas chromatography coupled to mass spectrometry), buprenorphine and its metabolites (using liquid chromatography coupled to tandem mass Statistical analysis. In the plethysmography study, T0 was the mean of the three baseline measurements. For each plethysmography parameter, we compared baseline values and values at each measurement time using a two-way analysis of variance (ANOVA) for repeated measurements, followed by multiple comparison tests with Bonferroni's correction.

To permit simultaneous analysis of the effect of time and various treatments, individual areas under the curve (AUC) for each parameter were calculated by the trapezoid method from T0 to 20 min and compared using one-way ANOVA followed by multiple comparison tests with Bonferroni's correction. To study reversal of respiratory effects, we compared the value of each plethysmography parameter at 5 min (i.e. before) and 10 min (i.e. after IV FLZ, NLX or solvent administration) using one-way ANOVA followed by Dunn's post-tests. PK parameters were compared using one-way ANOVA followed by Dunn's post-tests. In the plethysmography study, results are expressed as mean ± SEM. In the PK study, concentrations are expressed as mean ± SD and various estimated/calculated parameters as mean ± CV. All tests were performed using Prism version 5.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA). P-values <.05 were considered as significant.

Study 2 -Reversion of the neurorespiratory effects

No reversion of the effects induced by the ethanol/BUP combination on rat sedation and plethysmography parameters was observed at 5, 10 and 15 min after the IV administration of 10 mg/kg FLZ or 7.5 mg/kg NLX (data not shown).

Study 3-PK analysis

Regarding ethanol PK parameters, no significant differences were observed between the three rat groups receiving ethanol, i.e. ethanol + 4% Tween, ethanol + BUP and ethanol + BUP/NLX. Thus, ethanol PK parameters were determined using all concentrations obtained from these rats (Figure 2; Table 1). In the presence of ethanol, BUP concentrations were significantly lower at 5 min (P < .001), 10 and 20 min (P < .01), resulting in decreased AUC0-360 (P < .05) and increased Vd (P < .05) (Figure 3, Table 2). Interestingly, the metabolic ratios of NBUP (P < .01) and NBUP-3-glucuronide (P < .01) were significantly increased in the presence of ethanol. The mean NBUP-to-BUP concentration ratios were in the [0.09-1.24] range and did not significantly vary in relation to the time and treatments received by the rats (Table 3). However, although not significant, there was a trend to increased AUC of NBUPto-BUP concentration ratio in the presence of ethanol (Figure 4). Additionally, NLX did not alter the effects of ethanol on the PK parameters of BUP and its metabolites.

DISCUSSION

Fatalities have been attributed to the concomitant exposure to BUP and ethanol in drug addicts (Ferrant et al., 2011;Häkkinen et al., 2012;Seldén et al., 2012). In our rat model mimicking the reported conditions of human exposure, we showed as previously assessed with benzodiazepines (Cohier et al., 2014), that the ethanol/BUP combination is responsible for enhanced sedation and respiratory depression, however more limited in the presence of NLX. Cette hypothèse métabolique est rendue probable puisque dans une étude sur hépatocytes de rat, l'éthanol inhibait le métabolisme de morphine en morphine-3-glucuronide ou morphine-6glucuronide (Bodd et al., 1986). De manière similaire, chez des patients décédés d'overdose à l'héroïne, des concentrations plus faibles de morphine-3-glucuronide étaient observées en présence d'éthanol (Polettini et al., 1999).

Dans de larges séries de fatalités attribuées à la BUP (Häkkinen et al., 2012), les concentrations sanguines de BUP et NBUP étaient comprises entre 0,2-100 ng/mL et 0,2-89 ng/mL, respectivement, donnant des ratios NBUP/BUP compris entre 0,056-10. De manière intéressante, les concentrations maximales de BUP et NBUP mesurées 10 min après administration IV de 16 mg de BUP chez des volontaires étaient comprises entre 137,7+/-18,8 et 3,7+/-0,7 ng/mL, respectivement (Huestis et al., 2013). Dans certains décès, des concentrations sanguines élevées de NBUP (Gaulier et al., 2000)