Omar S Ahmed

Charles Tardif

Caroline Rouger

Vessela Atanasova

Florence Richard-Forget

Pierre Waffo-Téguo
email: pierre.waffo-teguo@u-bordeaux.fr

Naturally occurring phenolic compounds as promising antimycotoxin agents: Where are we now?

Keywords: co-produits de la vigne, stilbènes, Fusarium graminearum, mycotoxines, métabolomique, réseau moléculaire grapevine by-products, stilbenes, Fusarium graminearum, mycotoxins, metabolomic, molecular network antimycotoxins, food science, fungal invasion, mycotoxins, natural phenolic compounds, plant extracts grapevine by-products, stilbenes, Fusarium graminearum, mycotoxins, metabolomic, molecular network

Etude de l'activité antifongique et antimycotoxine de co-produits de la filière viticole riches en stilbènes contre Fusarium graminearum par des approches de métabolomique non-ciblée

Cette thèse vise à valoriser les co-produits de la filière viticole pour leur potentiel inhibiteur de la croissance de Fusarium graminearum et de la production des mycotoxines associées. Entre 60 et 80 % des cultures mondiales destinées à l'alimentation humaine sont contaminées par des mycotoxines. En Europe, les céréales sont fortement impactées par les contaminations aux trichothécènes de type B (TCTB), tels que le déoxynivalénol (DON) et le 15-acétyl déoxynivalénol (15ADON) produits par certaines espèces de Fusarium. Les TCTB présents dans les denrées alimentaires sont à la fois toxiques pour l'homme et les animaux. Divers leviers sont utilisés pour contrôler les contaminations par les mycotoxines, dont l'utilisation de fongicides de synthèse. Cependant, la législation européenne et française tend à diminuer leur utilisation pour s'orienter vers des stratégies durables comme l'utilisation d'extraits végétaux. Dans ce travail de thèse, des éco-extraits de co-produits ligneux de la filière viticole (sarments, ceps, racines) issus de cinq cépages ont été criblés pour leur capacité à inhiber le développement fongique de F. graminearum ainsi que la production de 15ADON en culture in vitro. La mise en évidence des métabolites bioactifs a été réalisée par des approches de métabolomique non-ciblée exploitant les données de UHPLC-HRMS n des extraits hydro-éthanoliques. Ces approches s'appuient sur des analyses multivariées et la génération d'un réseau moléculaire basé sur la bioactivité. Les extraits issus des parties basses de la vigne, riches en stilbènes oligomérisés, se sont avérés être les plus actifs. Un extrait de racine de cépage Tannat aux propriétés antifongique et antimycotoxine intéressantes a été choisi pour être fractionné par chromatographie de partage centrifuge (CPC). Les fractions obtenues ont été testées in vitro et des approches de métabolomique non-ciblée ont été appliquées afin d'annoter de manière plus fine les déterminants moléculaires associés aux activités antifongique et antimycotoxine. Les composés majoritaires des fractions bioactives ont en outre été isolés par HPLC-UV préparative et leur identification confirmée par RMN. Ces travaux ont montré l'intérêt d'exploiter les co-produits de la filière viticole dans la recherche de moyens de lutte contre les champignons toxinogènes. L'utilisation d'outils statistiques divers et de déréplication ont par ailleurs permis de déterminer les composés ou familles chimiques possiblement responsables des activités observées.

Index des figures

Indes des tableaux

Tableau : Référencement des articles publiés qui utilisent le script pour le calcul de score de bioactivité publié par [START_REF] Nothias | Bioactivity-Based Molecular Networking for the Discovery of Drug Leads in Natural Product Bioassay-Guided Fractionation[END_REF]

Introduction générale

Les champignons phytopathogènes sont responsables des contaminations des céréales. Ils impactent les filières agricoles et causent des baisses de rendements, détériorent les récoltes et entraînent ainsi des pertes économiques importantes [START_REF] Xia | Impact of the improvements in Fusarium head blight and agronomic management on economics of winter wheat[END_REF]. Certains de ces champignons sont producteurs de métabolites secondaires dangereux pour l'homme et les animaux qui les ingèrent, les mycotoxines. Dans le monde, entre 60 et 80 % des cultures destinées à l'alimentation humaine sont contaminées par des mycotoxines (Eskola et al., 2020). En Europe, la fusariose de l'épi (Fusarium Head Blight) est causée majoritairement par Fusarium graminearum suivi d'autres espèces fusariennes comme F. culmorum, F. avenaceum, F. poae et F. tricinctum. F. graminearum est producteur de mycotoxines de la famille des trichothécènes de type B (TCTB), tels que le déoxynivalénol (DON) et le 15-acétyl déoxynivalénol (15ADON), mais aussi de zéaralénone.

Les TCTB présents dans les céréales à la suite d'une contamination par F. graminearum peuvent se retrouver dans les denrées alimentaires du fait de leur stabilité chimique et thermique. Si ces molécules sont consommées de manière régulière, elles peuvent présenter une toxicité aigüe chez l'homme et causer des symptômes comme des vomissements [START_REF] Mishra | Global occurrence of deoxynivalenol in food commodities and exposure risk assessment in humans in the last decade: a survey[END_REF]. Des réglementations à l'échelle européenne ont été fixées par l'Autorité Européenne de Sécurité Alimentaire (AESA/EFSA) pour contrôler les teneurs en DON et limiter leur seuil entre 500 et 1750 µg/kg selon les denrées alimentaires (European Commission, 2007). Pour contrôler durablement ces contaminations par des champignons mycotoxinogènes du genre Fusarium, il est nécessaire de gérer cet agent phytopathogène au champ. Pour cela, la combinaison de différentes approches est nécessaire pour lutter contre ces champignons, comme l'utilisation de variétés de céréales résistantes, l'aménagement des pratiques culturales comme la rotation des cultures et l'enfouissement des résidus de cultures, ainsi que l'emploi de traitements fongicides adaptés (Shah et al., 2018).

L'utilisation répétée des fongicides de synthèse lors des dernières décennies n'a pas été anodine sur les systèmes biologiques, notamment leur impact sur les organismes non-cibles [START_REF] Ankit | Impacts of Synthetic Pesticides on Soil Health and Non-targeted Flora and Fauna[END_REF], et a entraîné le développement de résistances fongiques [START_REF] Brent | Fungicide Resistance in Plant Management: How can it be managed? In Fungicide resistance action committee[END_REF]. La Directive européenne 2009/128/CE et le plan Ecophyto II+ au niveau national visent une réduction de l'utilisation de ces fongicides de synthèse d'au moins 50 % d'ici 2025. Le développement de stratégies innovantes basées sur des produits d'origine naturelle pour un contrôle durable des cultures infectées par ces champignons toxinogènes et leur contamination par des mycotoxines, peut permettre de répondre à cet objectif.

Des travaux de recherche ont été engagés sur les substances d'origine naturelle, notamment sur les composés phénoliques. Ce sont des métabolites spécialisés du règne végétal, dont certains d'entre eux sont produits par les plantes en réponse à une attaque d'agents pathogènes [START_REF] Bilska | Changes in Phenylpropanoid and Trichothecene Production by Fusarium culmorum and F . graminearum Sensu Stricto via Exposure to Flavonoids[END_REF]Stuper-Szablewska et al., 2019). Ces propriétés de défenses chez les plantes ont orienté la recherche de molécules actives que ce soit pour contrer la croissance de champignons mycotoxinogènes, ou dans une moindre mesure la production de mycotoxines. Ainsi, les acides phénoliques [START_REF] Boonmee | Efficiency of hydroxycinnamic phenolic acids to inhibit the production of ochratoxin a by aspergillus westerdijkiae and penicillium verrucosum[END_REF]Gauthier et al., 2016) et les flavonoïdes [START_REF] Bilska | Changes in Phenylpropanoid and Trichothecene Production by Fusarium culmorum and F . graminearum Sensu Stricto via Exposure to Flavonoids[END_REF]Salas et al., 2016b) ont été étudiés pour leurs activités antifongiques et antimycotoxines vis-àvis de certaines espèces de Fusarium, d'Aspergillus et de Penicillium. Mais d'autres familles moins étudiées, comme celle des stilbènes, pourraient s'avérer être intéressantes dans la recherche de nouveaux composés bioactifs.

La vigne (Vitis vinifera L.) est une plante riche en composés phénoliques, notamment en stilbènes [START_REF] Pawlus | Stilbenoid profiles of canes from Vitis and Muscadinia species[END_REF]. La viticulture est très développée dans la région bordelaise et engendre de grandes quantités de co-produits divers comme le marc de raisin, les sarments et les pieds de vigne qui sont peu valorisés à ce jour. Ceci a amené l'axe Molécules d'Intérêt Biologique (MIB) de l'UMR OEnologie et l'UR Mycologie et Sécurité des Aliments (MycSA) à collaborer pour mener des travaux sur l'activité d'extraits de sarments de vignes de cépage Merlot et Sauvignon blanc contre la croissance de F. graminearum et la production des mycotoxines associées. Des premiers résultats concluants ont abouti au projet ANR StilDeTox (ANR-19-CE21-0007, 2019 -2024) qui a pour objectif d'étudier et d'exploiter les activités biologiques d'extraits de co-produits ligneux de vigne riches en stilbènes, afin de mettre au point des solutions d'origine végétale pour contrer la croissance de F. graminearum et d'A. carbonarius et la production de leurs mycotoxines associées, les TCTB et l'ochratoxine A.

Ce projet a été divisé en trois tâches. La première (1) porte sur la production d'un panel d'écoextrait de co-produits de la vigne riches en stilbènes, leur caractérisation chimique et l'étude de leur activité biologique contre les deux agents phytopathogènes mentionnés au préalable. Puis, (2) une sélection d'extraits les plus efficaces sera réalisée par une approche de fractionnement bioguidé pour identifier les molécules actives et tenter d'élucider les mécanismes d'action inhérents à l'activité antifongique et antimycotoxine. Enfin, (3) si les résultats le permettent, le développement d'une méthode de production industrielle et la formulation d'extraits actifs contre les couples agent pathogène et mycotoxine de F. graminearum/TCTB et d'A. carbonarius/OTA sera effectué.

Afin d'y parvenir, différents acteurs académiques et un partenaire industriel constituent les membres de ce projet ANR : l'UR INRAE MycSA, l'axe MIB de l'UMR OEnologie, l'UMR SAVE (Santé et Agroécologie du Vignoble) ainsi que l'entreprise BioLaffort. Ces travaux de thèse s'articulent sur les deux premières tâches de ce projet ANR et ont été effectués entre l'axe MIB, le laboratoire d'accueil, et l'UR MycSA, le laboratoire partenaire.

Ce travail de thèse s'intègre pleinement dans ce projet ANR StilDeTox et plus particulièrement dans les tâches (1) et (2). L'objectif est d'évaluer les activités antifongique et antimycotoxine d'éco-extraits de co-produits de la vigne riches en stilbènes vis-à-vis de F. graminearum en culture in vitro, ainsi que d'annoter les métabolites responsables de l'activité des extraits par des approches de métabolomique non-ciblée dont l'utilisation de réseaux moléculaires.

Dans ce manuscrit, nous allons tout d'abord développer le contexte bibliographique notamment au sujet de l'utilisation des composés phénoliques pour contrôler la production des mycotoxines (illustré par une revue dans Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety). Nous aborderons ensuite l'utilisation des réseaux moléculaires pour découvrir de nouveaux produits naturels bioactifs. Puis, les travaux expérimentaux sont présentés en trois chapitres. Le Chapitre I se focalise sur l'obtention d'éco-extraits de co-produits de la vigne, leur caractérisation et leur criblage vis-à-vis des activités ciblées contre F. graminearum. Le Chapitre II expose l'approche de métabolomique non-ciblée par UHPLC-MS n via les analyses multivariées et la génération de réseaux moléculaires basés sur les scores de bioactivité afin de discriminer les métabolites antifongiques issus des éco-extraits de co-produits. Enfin, le Chapitre III se concentre sur un seul extrait à forte activité antifongique et antimycotoxine, par une approche de fractionnement bioguidé assisté par des analyses métabolomiques non-ciblées en vue de la caractérisation des métabolites antifongique et antimycotoxine. Une discussion générale des résultats obtenus et les perspectives de ces travaux de thèse concluent ce manuscrit de thèse.

Etat de l'art 1 Les composés phénoliques pour lutter contre les champignons mycotoxinogènes

Revue sur les propriétés antimycotoxines des composés phénoliques

Dans l'introduction générale, nous avons évoqué l'intérêt de développer des alternatives naturelles aux fongicides d'origine synthétique. Parmi elles, les composés phénoliques dérivés de la voie des phénylpropanoïdes constituent une classe chimique peu explorée. Afin de répertorier les connaissances publiées sur le sujet, nous avons rédigé une revue portant sur les composés phénoliques végétaux et leur capacité à inhiber la production de mycotoxines et la croissance des champignons mycotoxinogènes. Cette revue, intitulée Naturally occurring phenolic compounds as promising antimycotoxin agents: Where are we now? a été publiée en 2022 dans Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety.

Cette revue est divisée en plusieurs parties. Dans la partie 1. Introduction nous avons exposé la problématique des contaminations des denrées alimentaires par des mycotoxines et fixé le champ d'étude de cette revue. Ainsi, la revue traite des mycotoxines dont les seuils dans les denrées alimentaires sont réglementés à l'échelle européenne et américaine par l'EFSA et la Food and Drug Administration (FDA), ainsi que de celles ayant des recommandations par ces mêmes organisations. Parmi elles, nous retrouvons sept mycotoxines ou familles de mycotoxines dont les trichothécènes (TCTB) de type A et de type B, les aflatoxines, les fumonisines, la zéaralénone, la patuline et l'ochratoxine A ; leurs structures chimiques sont représentées dans la Table S1 du Supporting information de la revue (pages encadrées en noir à la suite de la revue).

Dans la partie 2. Main infected crops and mycotoxin regulations, nous avons présenté les denrées alimentaires sensibles à la contamination par des mycotoxines. La distribution des mycotoxines et des champignons producteurs varie à l'échelle mondiale selon les plantes cultivées, mais aussi en fonction du climat des régions. Dans le contexte actuel de dérèglement climatique, la distribution des mycotoxines à l'échelle mondiale pourrait varier. Nous traitons de ce sujet au sein d'une sous-partie en Supporting information intitulé Geographical distribution and occurrence of mycotoxins in the last four years and the effect of climate.

Nous discutons de la distribution géographique des mycotoxines détectées dans des denrées alimentaires qui ont fait l'objet de travaux de recherche entre 2017 et 2021. Ces travaux sont synthétisés par une carte de la distribution mondiale des mycotoxines détectées en fonction des zones climatiques (Figure S1). Les données détaillées de ces articles sont compilées dans la Table S2.

La partie 3. Strategies to fight against toxigenic fungi and mycotoxin production est le coeur de cette revue. Nous présentons tout d'abord les deux stratégies de lutte existantes pour diminuer la contamination des aliments par des mycotoxines. Cela peut se faire par le contrôle au champ des champignons producteurs de mycotoxines au moyen de stratégies de pré-récoltes, ou par la décontamination des denrées alimentaires infectées par des mycotoxines via des approches post-récoltes. Nous nous sommes focalisé sur les recherches qui portent sur l'utilisation de produits d'origine naturelle (sous-partie 3.1. Plant-based extracts and their botanicals), notamment ceux riches en composés phénoliques. Dans la sous-partie 3.2. Plant phenolic compounds with reported antimycotoxin activity, nous avons défini la nature des composés phénoliques retrouvés chez les plantes, notamment par leur origine biosynthétique (Figure S2, Supporting information) et leur structure (Table S3, Supporting information). Les travaux parus entre 2010 et 2021 qui portent sur les extraits riches en composés phénoliques étudiés pour leur activité antimycotoxine sont présentés dans la sous-partie 3.3. Natural plant extracts rich in phenolic compounds have a promising antimycotoxin activity. Nous avons compilé les travaux sur les composés phénoliques testés seuls contre divers champignons mycotoxinogènes, et répertorié leur activité au sein d'un tableau dans la sous-partie 3.4. Pure phenolic compounds with potential antimycotoxin activity. Dans cette sous-partie, sont répertoriés majoritairement des travaux sur les flavonoïdes (flavanones, flavones, flavonols et flavan-3-ols), les acides phénoliques et leurs dérivés. Les stilbènes et les lignanes sont deux familles qui pour le moment sont les moins étudiées pour leur activité antimycotoxine.

Afin d'identifier les mécanismes d'action de ces composés phénoliques antimycotoxines et le lien possible avec leurs groupements fonctionnels, nous nous sommes intéressés aux modes d'action de ces composés dans la partie 4. Mechanisms of action involved in the inhibition of mycotoxins production by phenolic compounds. Nous y retrouvons notamment l'interaction avec les membranes des champignons, les régulations du stress oxydant et de l'expression des gènes de la biosynthèse des mycotoxines.

Dans les deux dernières parties de cette revue, nous nous sommes intéressés aux facteurs qui pourraient limiter l'utilisation de ces composés phénoliques comme fongicides. Tout d'abord, dans la partie 5. Safety profile of phenolic extracts, nous avons traité de l'innocuité de ces métabolites sur la santé humaine, afin de montrer que ces composés sont connus et ne présentent pas de danger s'ils sont ingérés par l'homme. Enfin, dans la partie 6. Strategies to overcome stability and solubility barriers of phenolic compounds, nous avons discuté des stratégies de formulation d'extraits riches en composés phénoliques afin de faciliter leur solubilité et d'augmenter leur stabilité. En partie 7., une conclusion vient clore la revue, ouvrant vers des questions de recherche comme celle des mécanismes d'action précis des composés phénoliques INTRODUCTION Legend has it that the apple that fell on Newton's head allowed him to invent the laws explaining universal gravity [START_REF] Fara | Myth 6. That the apple fell and Newton invented the law of gravity, thus removing god from the cosmos[END_REF]. Gravity is not the focus of this paper: it is the apple, because in specific conditions of moisture and temperature, mold will grow in it. Molds are fungi that belong to the fungi kingdom with more than 100,000 species identified until now. Few of these species produce toxic metabolites, which are called "mycotoxins." Mycotoxins are toxic specialized metabolites produced naturally by certain filamentous fungi such as molds found in contaminated foods and grains under specific conditions [START_REF] Conte | Mycotoxins in feed and food and the role of ozone in their detoxification and degradation: An update[END_REF]. The term "mycotoxin" originated from the Greek word "mycos" or "mykes," for fungus, and the Latin word "toxicum," for poison [START_REF] El Cafsi | Effects of ochratoxin A on membrane phospholipids of the intestine of broiler chickens, practical consequences[END_REF][START_REF] Iqbal | Mycotoxins in food and food products: Current status[END_REF]. Their discovery was related to their deleterious health effects on domestic animals, leading to questions about their potential effects on human health. It is believed that mycotoxins started to infect human food when mankind began cultivating crops and storing them, perhaps 10,000 years ago (Pitt & F I G U R E 1 Chemical structures of main common mycotoxins and their major fungal species producers found in food and feed commodities. Other structures are shown in Table S1 David Miller, 2017). Mycotoxins colonize different crops in the field before harvest (i.e., field fungi) or during harvesting, handling, storage (i.e., storage fungi), and processing due to a lack of well-established infrastructure, regulations, and standards controlling their presence [START_REF] Gonçalves | Pre-and postharvest strategies to minimize mycotoxin contamination in the rice food chain[END_REF]. Many factors contribute to mycotoxin development including insect infestation, delayed harvesting time, drying methods, inadequate storage conditions, temperature, water activity (a w ), nutrients, and certain biotic conditions (e.g., microbiotic interactions) [START_REF] Mannaa | Influence of temperature and water activity on deleterious fungi and mycotoxin production during grain storage[END_REF][START_REF] Manu | Moisture content, insect pests and mycotoxin levels of maize on farms in Tamale environs in the northern region of Ghana[END_REF]. Other factors could explain their geographical distribution and cooccurrence such as climate and climate changes, which promote a distinct fungal growth and influence mycotoxin production considerably (Eskola et al., 2020;[START_REF] Gruber-Dorninger | Global mycotoxin occurrence in feed: A Ten-Year survey[END_REF]. Approximately 400 types of mycotoxins have been reported until now [START_REF] Molina | Mycotoxins at the start of the food chain in Costa Rica: Analysis of six fusarium toxins and ochratoxin a between 2013 and 2017 in animal feed and aflatoxin M1 in dairy products[END_REF]. Strict regulatory limits or recommendations have been established by various authorities (e.g., Food and Drug Administration [FDA] [START_REF] Cai | Advancing the FDA/Office of Regulatory Affairs Mycotoxin Program: New analytical method approaches to addressing needs and challenges[END_REF] and the European Food Safety Authority [EFSA] [START_REF] Eskola | Overview of the activities of the European Food Safety Authority on mycotoxins in food and feed[END_REF]) to control the presence of certain mycotoxins, especially those produced by the Aspergillus, Fusarium, Penicillium, and Byssochlamys genera. The six major classes of mycotoxins are reported in Figure 1, together with the main fungal species that produce them: aflatoxins (AFs; in green), trichothecenes (type A in gold and type B in red), fumonisins (FUMs; in orange), zearalenone (ZEN; in violet), ochratoxin A (OTA; in blue), and patulin (PAT; in light blue). Their molecular structures vary widely as also shown in Figure 1.

Acute and/or chronic exposure to mycotoxins may lead to death [START_REF] Omotayo | Prevalence of mycotoxins and their consequences on human health[END_REF]. Mycotoxins also have an impact on the economy. Recent research published in 2019 [START_REF] Gruber-Dorninger | Global mycotoxin occurrence in feed: A Ten-Year survey[END_REF] showed that 88% of 74,821 samples of feed and feed raw materials (e.g., maize, wheat, and soybean) collected from 100 countries from 2008 to 2017 were contaminated with one or more mycotoxins. The fact that mycotoxins are chemically stable and temperature resistant means that they can readily withstand food manufacturing processes, making their elimination challenging [START_REF] Kabak | The fate of mycotoxins during thermal food processing[END_REF]. The Food and Agriculture Organization (FAO) estimated that nearly 25% of global crops are contaminated by mycotoxins per year, with annual losses of around 1 billion metric tons of food and food products. However, this figure seems to be highly underestimated, as according to an update by Eskola et al. (2020), 60%-80% of agricultural commodities contain mycotoxins above detectable levels. Moreover, emerging mycotoxins such as beauvericin, enniatins (ENNs), moniliformin, and alternariol have received little attention until now, yet potential risk of health hazards associated with these mycotoxins cannot be ruled out [START_REF] Gruber-Dorninger | Emerging mycotoxins: Beyond traditionally determined food contaminants[END_REF]. This explains why mycotoxins have attracted worldwide attention and why approximately more than 20,000 scientific papers have been published on topics related to mycotoxins since 1960.

Several approaches have been developed to control contamination by mycotoxins and may be categorized into preharvest and postharvest strategies [START_REF] Conte | Mycotoxins in feed and food and the role of ozone in their detoxification and degradation: An update[END_REF]. Preharvest control is based on preventing mycotoxin production in the field by the application of good agricultural practices (GAPs) that include the use of proper cropping systems, tolerant cultivars, fungicides, and/or biocontrol solutions. Alternatively, postharvest management is based on identifying key control points during harvesting, drying, and storage that are critical in developing effective prevention and detoxification strategies (Agriopoulou et al., 2020;[START_REF] Gonçalves | Pre-and postharvest strategies to minimize mycotoxin contamination in the rice food chain[END_REF]. Other strategies that can partially eliminate mycotoxins from contaminated commodities include adsorption, biodegradation, ozone degradation, and the use of cold atmospheric pressure plasma (Afsah-Hejri et al., 2020;[START_REF] Hojnik | Mycotoxin decontamination of food: Cold atmospheric pressure plasma versus "classic" decontamination[END_REF].

New strategies are also emerging. One of these advances includes the promising use of nanomaterials to inhibit mycotoxin production and adsorption as well as to detoxify mycotoxin [START_REF] Horky | Nanoparticles as a solution for eliminating the risk of mycotoxins[END_REF]. Nanomaterials could also be very useful to improve the analytical performances of mycotoxin detection methods [START_REF] Mahmoudpour | Nanomaterials and new biorecognition molecules based surface plasmon resonance biosensors for mycotoxin detection[END_REF]. Other strategies concern the use of plant-based products to control mycotoxigenic fungi growth and mycotoxin production. These products based on naturally derived ecofriendly bioagents are not merely safer to use compared to synthetic fungicides but also provide a way to fight the emergence of fungicide resistance in toxigenic fungi (da Cruz [START_REF] Da Cruz Cabral | Application of plant derived compounds to control fungal spoilage and mycotoxin production in foods[END_REF]. In addition, consumers' preferences tend toward foods with lower levels of preservatives and foods that exhibit more fresh-like characteristics. Many crude plant extracts and essential oils have proven to have antimicrobial activity for plant protection (Bouarab Chibane et al., 2019;[START_REF] Loi | Plant bioactive compounds in pre-and postharvest management for aflatoxins reduction[END_REF]. Their mechanisms to protect plants against fungi are not yet fully understood but could be related to the acquisition of natural defense systems by the host plant, and/or by direct action against pathogens through inhibition of fungal development and/or mycotoxin production [START_REF] Loi | Plant bioactive compounds in pre-and postharvest management for aflatoxins reduction[END_REF].

As the main focus of this review, phenolic compounds, which have been widely investigated due to their promising antimycotoxin activity (Atanasova-Penichon et al., 2016;[START_REF] Ferruz | Inhibition of Fusarium growth and mycotoxin production in culture medium and in maize kernels by natural phenolic acids[END_REF]Schöneberg et al., 2018), are discussed in detail as one of these bioagents. The use of naturally occurring phenolic compounds to counteract mycotoxin production and their promising potential in agriculture are summarized and discussed. The potential mechanisms by which these metabolites can mitigate mycotoxin contamination are presented. Their limitations are also addressed, including their health risks to humans and their methods of application.

MAIN INFECTED CROPS AND MYCOTOXIN REGULATIONS

As previously mentioned, mycotoxins are specialized metabolites produced naturally by fungi and are toxic to both humans and animals [START_REF] Cimbalo | Toxicity of mycotoxins in vivo on vertebrate organisms: A review[END_REF]. They have a broad geographical distribution and numerous mycotoxin-producing fungal species have been identified globally until now. Mycotoxin contamination is the result of the interaction between the toxigenic microorganism, the substrate's susceptibility to infection (i.e., food or feed stuffs), and the environment (Patriarca & Fernández Pinto, 2017). The latter is more related to the fact that climate and climate changes have a significant impact on the geographical distribution of toxigenic fungi, their development, and consequently, mycotoxin production (discussed in Figure S1 and Table S2). According to the Rapid Alert System for Food and Feed (RASFF), mycotoxins became one of the "top 10" hazards reported in food products, mainly cereals and nuts [START_REF] Gámiz-Gracia | Application of LC-MS/MS in the mycotoxins studies[END_REF]. The most common species found to infect food and feed belong to the genera Aspergillus, Penicillium, Fusarium, and Alternaria (Patriarca & Fernández Pinto, 2017) (see Figure 1). The frequency of contamination with Fusarium and Alternaria is higher in freshly harvested samples than with Aspergillus and Penicillium, which are more frequently observed in stored samples [START_REF] Jedidi | Mycoflora isolation and molecular characterization of Aspergillus and Fusarium species in Tunisian cereals[END_REF]. Production of mycotoxin is fungal strain dependent: some do not produce mycotoxins, whereas others produce several. Moreover, the occurrence of a single mycotoxin as well as their cooccurrence are common. Mycotoxins can be found in all types of food and feed stuffs (processed or unprocessed) including cereals [START_REF] Lattanzio | Determination of T-2 and HT-2 toxins in oats and oat-based breakfast cereals by liquidchromatography tandem mass spectrometry[END_REF], meats (Sun et al., 2019), aquatic foods (Ingenbleek et al., 2019), dairy products (Radonić et al., 2017), vegetables (Sun et al., 2019), fruits (Chiotta et al., 2020), juices/alcohol beverages (Oteiza et al., 2017), and even in the public drinking water system (Mhlongo et al., 2020). Table S2 summarizes data published between 2017 and 2021 describing mycotoxin occurrence in different food/feed commodities, their concentration levels, and sample origin. Recommended maximum levels (MLs) of major mycotoxins have been set globally in addition to regulations to ensure good agricultural and manufacturing practices. Numerous national, regional, and international authorities have established limits and regulations for MLs of mycotoxins, including the World Health Organization (WHO), the FAO, the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, and the EFSA [START_REF] Eskola | Overview of the activities of the European Food Safety Authority on mycotoxins in food and feed[END_REF](Eskola et al., , 2020)). Strict regulations have been set for food intended for human use, especially food for infants [START_REF] Hardy | Guidance on the risk assessment of substances present in food intended for infants below 16 weeks of age[END_REF]. Other Asian countries have established their own limits such as the Chinese legal limit for feeds (Xu et al., 2021).

STRATEGIES TO FIGHT AGAINST TOXIGENIC FUNGI AND MYCOTOXIN PRODUCTION

Many strategies have been studied to prevent, reduce, or eradicate mycotoxins. They can be classified into two categories: prevention and detoxification strategies. All preharvest strategies aim to avoid the growth of mycotoxinproducing fungi. GAPs are an example and comprise specific procedures and defined conditions (e.g., storage conditions) that must be implemented in agriculture to produce safe and quality food for consumers. Use of registered fungicides to control fungal infection is a common aspect in GAPs. They are effective in the fight against these pathogens but questions remain regarding their safety and residue levels in the final products. The routine use of fungicides in recent decades has led to agronomic and health issues. These include the development of fungal resistance [START_REF] Brent | Fungicide Resistance in Plant Management: How can it be managed? In Fungicide resistance action committee[END_REF][START_REF] Hahn | The rising threat of fungicide resistance in plant pathogenic fungi: Botrytis as a case study[END_REF], unwanted side effects on other organisms [START_REF] Ankit | Impacts of Synthetic Pesticides on Soil Health and Non-targeted Flora and Fauna[END_REF], and the impact on human health (Bjørling-Poulsen et al., 2008;[START_REF] Efsa) | The 2017 European Union report on pesticide residues in food[END_REF]. To reduce the risks associated with fungicides in human health and the environment, the European Union directive 2009/128/EC recommended developing alternative strategies to reduce the dependency on pesticides (European Commission, 2009). New sustainable approaches based on natural products, such as plant-based substances, need to be developed. Other preharvest management techniques that could replace synthetic fungicides concern the use of antagonistic microorganisms (e.g., bacteria, yeast, and fungi) to control mycotoxigenic fungi [START_REF] Mauro | Biological control products for aflatoxin prevention in Italy: Commercial field evaluation of atoxigenic Aspergillus flavus active ingredients[END_REF]. The mechanism behind this technique is not yet fully understood but was mostly related to the biocompetition between these microorganisms and toxic fungal strains for nutrients, substrates, and space. Yeasts, for example, were shown to be effective in the biocontrol of Aspergillus flavus by producing antifungal volatile organic compounds [START_REF] Jaibangyang | Biological control of aflatoxin-producing Aspergillus flavus by volatile organic compound-producing antagonistic yeasts[END_REF]. Also, many bacteria were found to have potential antifungal and antimycotoxigenic activities. Bacillus subtilis and Bacillus amyloliquefaciens were evaluated for the biocontrol of Aspergillus parasiticus growth and AFs production on pistachio kernels. Both bacterial strains showed effective antifungal and antimycotoxigenic activities [START_REF] Siahmoshteh | Efficacy of Bacillus subtilis and Bacillus amyloliquefaciens in the control of Aspergillus parasiticus growth and aflatoxins production on pistachio[END_REF]. Moreover, nontoxigenic strains of A. flavus were used for the biocontrol of AFs in cereal crops. However, their safety, their ability to produce other mycotoxins, and their impact on the environment are still unclear [START_REF] Kagot | Biocontrol of Aspergillus and Fusarium mycotoxins in Africa: Benefits and limitations[END_REF][START_REF] Khan | Biocontrol of aflatoxins using non-aflatoxigenic Aspergillus flavus: A literature review[END_REF].

Other agronomic techniques are based on soil cultivation (i.e., tillage) (Ayofemi Olalekan Adeyeye, 2020). Tillage involves manipulating the soil profile mechanically for the purpose of crop production. The process affects the soil microenvironment, the distribution of nutrients, and soil conditions. Tillage was found to decrease crop residues, principally straw, which is considered a major source of Fusarium inoculum responsible for Fusarium Head Blight (FHB) in cereals [START_REF] Hofgaard | Inoculum potential of Fusarium spp. relates to tillage and straw management in Norwegian fields of spring oats[END_REF]. However, long-term tillage practices were found to negatively affect soil productivity due to loss of soil structure, organic matter, and soil erosion. On the other hand, no-tillage (equally called zero tillage) is an agricultural practice in which seeds are directly deposited into soil to avoid soil erosion or disrupting the soil structure. However, a positive correlation was established recently between relative fungal abundance and long-term no-tillage practice in China [START_REF] Wang | Long-term no-tillage and different residue amounts alter soil microbial community composition and increase the risk of maize root rot in northeast China[END_REF]. The latter could be responsible for plant residues left in the soil that play a crucial role in fungal infection to adjacent and future crops (Shah et al., 2018). Other GAPs such as crop rotation, crop residue management, good sowing and harvest date, insect management, or the use of resistant cultivars are employed to control mycotoxin contamination in the field (Ayofemi Olalekan Adeyeye, 2020).

As previously mentioned, once accumulated in crops, mycotoxins are difficult to eliminate and implementing an efficient postharvest detoxification/decontamination procedure is sometimes unavoidable. In conducive environmental conditions, the growth of toxigenic fungi cannot be abrogated even if all preharvest measures are taken. The current postharvest strategies were recently described by [START_REF] Wan | Occurrence and preventive strategies to control mycotoxins in cereal-based food[END_REF] and [START_REF] Liu | A review of postharvest approaches to reduce fungal and mycotoxin contamination of foods[END_REF]. Briefly, detoxification/decontamination postharvest strategies are based on deactivating, destroying, or removing mycotoxins [START_REF] Varga | Chemical, physical and biological approaches to prevent ochratoxin induced toxicoses in humans and animals[END_REF]. They are classified into physical, chemical, and biological methods [START_REF] Liu | A review of postharvest approaches to reduce fungal and mycotoxin contamination of foods[END_REF]. Physical methods (e.g., radiation treatment) and chemical methods (e.g., ammoniation) were found to be effective in deactivating mycotoxins. However, concerns were raised about their effects on food product sustainability, nutrition value, and high costs associated with their use. Biological approaches are based on the use of microorganisms (i.e., bacteria and yeast) as mycotoxin binders, deactivators, and detoxifiers [START_REF] Shanakhat | Current methods for mycotoxins analysis and innovative strategies for their reduction in cereals: An overview[END_REF]. However, most of these microbes need regulatory approval before being used in food products. A recent review published by [START_REF] Leslie | Key global actions for mycotoxin management in wheat and other small grains[END_REF] mentioned major pre-and postharvest strategies recently used to control mycotoxin contamination in wheat and other small grains [START_REF] Leslie | Key global actions for mycotoxin management in wheat and other small grains[END_REF].

Plant-based extracts and their botanicals

Medicinal plants and traditional medicine have been used throughout history to cure and prevent many diseases. Several therapeutic agents were discovered from plants or their derivatives and are still in use today [START_REF] Veiga | Impact of plant extracts upon human health: A review[END_REF]. The WHO estimated that about 80% of the world population in year 2000 was dependent on traditional medicines for the treatment of diseases [START_REF] Wangkheirakpam | Traditional and folk medicine as a target for drug discovery[END_REF]. In addition, many specialized plant metabolites are able to restrain a wide variety of pathogens, insects, and pests as well as to minimize the effects of stress conditions [START_REF] Makhuvele | The use of plant extracts and their phytochemicals for control of toxigenic fungi and mycotoxins[END_REF]. The latter includes herbivores, insects, pathogens, and severe environmental conditions. Recent reports showed that plant extracts and their botanicals contain many eco-friendly compounds with promising antifungal activities and capacities to mitigate mycotoxicosis [START_REF] Dikhoba | Antifungal and anti-mycotoxigenic activity of selected South African medicinal plants species[END_REF]. These compounds were found to be easily biodegradable without any harmful effect on the environment. Montibus et al. (2021) recently screened subcritical extracts of 16 wood/forest and vine by-products for their antifungal and antimycotoxin activities on Fusarium graminearum species. Major compounds such as lignans, phenolic acids, and flavonoids found in pine sawdust extract were potentially responsible for this protective effect. On the other hand, essential oils were reported to have a biofungicide effect and to decrease mycotoxin production [START_REF] Mirza Alizadeh | Recent advances on the efficacy of essential oils on mycotoxin secretion and their mode of action[END_REF]. For instance, essential oils from garlic were found to be effective against A. parasiticus, Fusarium verticillioides, and F. graminearum (Bocate et al., 2021). The concentration of garlic essential oils to inhibit mycotoxin production was four times less than the concentration needed to inhibit fungal growth.

Plant phenolic compounds with reported antimycotoxin activity

Phenolic compounds are a large class of specialized plant metabolites formed via the shikimic acidphenylpropanoid and/or polyketide pathways [START_REF] Vogt | Phenylpropanoid biosynthesis[END_REF]. They play a crucial role in plant developmental processes such as cell division, hormonal regulation, and alleviation of oxidative stress and signaling agents [START_REF] Sharma | Response of phenylpropanoid pathway and the role of polyphenols in plants under abiotic stress[END_REF]. Their importance is not limited to plants but also extends to beneficial effects for both human and animal health. Their presence in food is valuable due to their antioxidant activity, which may be responsible for their effects as potential anticancer agents and cardiovascular protectors and for the prevention of obesity (Bonferoni et al., 2017;[START_REF] Oak | Potential mechanisms underlying cardiovascular protection by polyphenols: Role of the endothelium[END_REF][START_REF] Wang | Novel insights of dietary polyphenols and obesity[END_REF] As shown in Figure 2, plant phenolic compounds with reported antimycotoxin activity are classified by their chemical structure into flavonoids and nonflavonoid ones. Flavonoids are groups of specialized metabolites derived from phenylalanine and acetate metabolism pathways (see Figure S2). They are responsible for several functions in plants. They are produced in response to environmental stress such as pathogenic infection, nutrient deficiency, and exposure to high light [START_REF] Kumar | Role of phenolic compounds in plant-defensive mechanisms[END_REF]. They are also reported to have several health benefits in human (Ballard & Maróstica, 2019;[START_REF] Mathesius | Flavonoid functions in plants and their interactions with other organisms[END_REF]. Several studies have mentioned the potential use of flavonoids as anti-inflammatory, anti-aging, antiproliferative, and antioxidant agents. In addition, their potential to treat and/or to prevent many diseases such as cancer, heart diseases, and diabetes has been illustrated (Bhattacharya et al., 2010).

Four subgroups of flavonoids have been reported to have antimycotoxin activities: Flavonols, Flavan-3-ols, Flavones, and Flavanones (see Figure 2). The general structure of flavonoids is based on the C6-C3-C6 skeleton with two benzene rings (rings A and B) linked by a heterocycle pyrone ring (ring C) (see Figure 2). Variations in oxidation patterns of the heterocycle ring lead to the interclassification of flavonoids, whereas structural modifications in the two benzene rings (e.g., hydroxylation, methoxylation, or glycosylation) lead to intradiversity within the same subgroup (Ahn-Jarvis et al., 2019;[START_REF] Kondratyuk | Natural product polyphenols of relevance to human health[END_REF][START_REF] Oliveira | Flavanols: Catechins and proanthocyanidins[END_REF].

On the other hand, nonflavonoids with a reported capacity to inhibit mycotoxin production are classified into hydroxy cinnamic acid derivatives, hydroxy benzoic acid derivatives, stilbenoids, and lignans (see Figure 2). Both hydroxybenzoic acid and hydroxycinnamic acid derivatives have one benzene ring and at least one hydroxyl group attached with basic structures of (C6-C1) and (C6-C3) skeletons, respectively. Unlike flavonoids, hydroxycinnamic acid derivatives are synthesized from the phenylalanine/tyrosine metabolic pathway [START_REF] Marchiosi | Biosynthesis and metabolic actions of simple phenolic acids in plants[END_REF]. After several steps, the latter pathway may lead to the biosynthesis of lignan precursors [START_REF] Vogt | Phenylpropanoid biosynthesis[END_REF]. Stilbenes are biosynthesized through the shikimic acid-phenylpropanoid pathway that ends in the formation of resveratrol. Oligomerization, glycosylation, methoxylation, or hydroxylation of resveratrol accounts for the diversity of stilbenes formed (Rivière et al., 2012).

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F I G U R E 2 Chemical structures of plant phenolic compounds reported in literature between 2010 and 2021 as having potential antimycotoxin activity (data listed in Table 2). Glu, glucose; Neo, neohesperidoside; Rut, rutinose

Natural plant extracts rich in phenolic compounds have a promising antimycotoxin activity

Natural plant extracts are increasingly promising to control fungal contamination in food and feed commodities (Gabaston et al., 2017;[START_REF] Maddox | Antibacterial activity of phenolic compounds against the phytopathogen Xylella fastidiosa[END_REF][START_REF] Sanhueza | Synergistic interactions between phenolic compounds identified in grape pomace extract with antibiotics of different classes against Staphylococcus aureus and Escherichia coli[END_REF]. Recently, in vitro activities of plant extracts were reviewed for their ability to inhibit fungal development [START_REF] Furlong | Use of natural resources from Southern Brazil as a strategy to mitigate fungal contamination[END_REF][START_REF] Loi | Plant bioactive compounds in pre-and postharvest management for aflatoxins reduction[END_REF][START_REF] Ramirez-Mares | Plant-derived natural products from the American continent for the control of phytopathogenic fungi: A review[END_REF][START_REF] Redondo-Blanco | Plant phytochemicals in food preservation: Antifungal bioactivity: A review[END_REF]. However, these reports were limited to the screening of antifungal activity and only briefly addressed the potential antimycotoxin effect. Fungal growth and mycotoxin production are not affected in the same way by phenolic compounds contained in plant extracts. Reduction of mycotoxin production was found to require lower concentrations [START_REF] Atanasova-Pénichon | Bioguided Isolation, Characterization, and Biotransformation by Fusarium verticillioides of Maize Kernel Compounds That Inhibit Fumonisin Production[END_REF]Ferruz, Atanasova-Pénichon, et al., 2016;[START_REF] Schöneberg | Can plant phenolic compounds reduce Fusarium growth and mycotoxin production in cereals? Food Additives and Contaminants -Part A Chemistry[END_REF]. [START_REF] Boutigny | Ferulic acid, an efficient inhibitor of type B trichothecene biosynthesis and Tri gene expression in Fusarium liquid cultures[END_REF] mentioned the inhibitory effect of ferulic acid on trichothecene biosynthesis and fungal growth. Lower concentration of ferulic acid ranging from 0.1 to 1 mM was found to inhibit greatly trichothecene production without affecting fugal growth. The same was observed in a study done by Ferruz, Atanasova-Pénichon, et al. (2016) where only 0.5 mM of ferulic acid was needed to inhibit T-2 toxin production. The same concentration, on the contrary, caused an increase in fungal growth (Fer-ruz, Atanasova-Pénichon, et al., 2016). On the other hand, [START_REF] Safari | The potential of plant-based bioactive compounds on inhibition of aflatoxin B1 biosynthesis and downregulation of aflR, aflM and aflP genes[END_REF] reported that the anti-aflatoxigenic mechanisms of certain plant extracts were related to their effect on gene expression responsible for aflatoxin B1 (AFB1) biosynthesis. El Khoury et al. (2017) demonstrated the use of essential oils and total phenolic compounds extracted from some plants and herbs such as cumin and chamomile in OTA production by Aspergillus carbonarius.

Research published between 2010 and 2021 on the biocontrol of mycotoxin production by plant extracts with relative phenolic compounds content is summarized in Table 1. Plant materials were classified into cereals [START_REF] Heidtmann-Bemvenuti | Effect of natural compounds on Fusarium graminearum complex[END_REF], fruit by-products [START_REF] Rajha | Comparison of aqueous extraction efficiency and biological activities of polyphenols from pomegranate peels assisted by infrared, ultrasound, pulsed electric fields and high-voltage electrical discharges[END_REF], microalgae (Scaglioni, Scarpino, et al., 2019), and other materials (e.g., aloe vera gel) [START_REF] Dammak | in vitro antifungal and anti-ochratoxigenic activities of Aloe vera gel against Aspergillus carbonarius isolated from grapes[END_REF].

Several extraction methods have been used to extract phenolic compounds from plants, varying from conventional techniques (e.g., maceration) [START_REF] Dammak | in vitro antifungal and anti-ochratoxigenic activities of Aloe vera gel against Aspergillus carbonarius isolated from grapes[END_REF] to more advanced techniques such as subcritical water extraction (Montibus et al., 2021). The activity of these extracts to counteract mycotoxin production was determined by in vitro culture of mycotoxigenic fungi in liquid or solid medias [START_REF] Boonmee | Efficiency of hydroxycinnamic phenolic acids to inhibit the production of ochratoxin a by aspergillus westerdijkiae and penicillium verrucosum[END_REF][START_REF] Christ-Ribeiro | Cytotoxicity, antifungal and anti mycotoxins effects of phenolic compounds from fermented rice bran and Spirulina sp[END_REF]. The effect on fungal growth is evaluated by measuring fungal radial growth or weighing fungal biomass after drying [START_REF] Atanasova-Pénichon | Bioguided Isolation, Characterization, and Biotransformation by Fusarium verticillioides of Maize Kernel Compounds That Inhibit Fumonisin Production[END_REF][START_REF] Nobili | Buckwheat hull extracts inhibit aspergillus flavus growth and AFB1 biosynthesis[END_REF]. The activity of plant extracts is

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either expressed as a percentage of fungal growth inhibited (Montibus et al., 2021), minimum inhibitory concentration [START_REF] Heidtmann-Bemvenuti | Effect of natural compounds on Fusarium graminearum complex[END_REF], or minimum fungicidal concentration (Abdel-Razek et al., 2017) (see Table 1). Mycotoxins are also extracted from culture media by using a solvent if the mycotoxin is soluble (e.g., water with deoxynivalenol [DON]) [START_REF] Boutigny | Ferulic acid, an efficient inhibitor of type B trichothecene biosynthesis and Tri gene expression in Fusarium liquid cultures[END_REF]. Mycotoxins are then easily quantified by using an analytical approach such as HPLC coupled to a UV detector. Differences between treated and untreated culture media make it possible to estimate the percentage of mycotoxin yield inhibition. As shown in Table 1, many reports were published on plant extracts rich in phenolic compounds. For example, microalgae or cereals extract was found to be rich in phenolic acids (e.g., gallic, caffeic, and chlorogenic acids). Results showed that these natural acids have an inhibitory activity against the production of many mycotoxins such as fumonisin B1 (FB1), OTA, and type B trichothecenes (TCTB) [START_REF] Christ-Ribeiro | Cytotoxicity, antifungal and anti mycotoxins effects of phenolic compounds from fermented rice bran and Spirulina sp[END_REF]Pagnussatt et al., 2014;[START_REF] Scaglioni | Application of fungicides and microalgal phenolic extracts for the direct control of fumonisin contamination in maize[END_REF][START_REF] Scaglioni | Nannochloropsis sp. and Spirulina sp. as a source of antifungal compounds to mitigate contamination by Fusarium graminearum species complex[END_REF]. Moreover, the reuse of agro-industrial by-products is a valuable source of phenolic compounds. Buckwheat hull extract was found to be rich in flavonoids (e.g., hyperoside, vitexin, and rutin). Low concentrations of buckwheat hull extracts (0.1 μg/ml) effectively inhibited AFB1 production up to 93% [START_REF] Nobili | Buckwheat hull extracts inhibit aspergillus flavus growth and AFB1 biosynthesis[END_REF]. Another example is the use of maritime pine sawdust extract that efficiently reduced DON production by F. graminearum. This activity was attributed to the phenolic compounds in pine sawdust extract (e.g., lignans, flavonoids, and phenolic acids) (Montibus et al., 2021). Olive mill waste water after membrane filtration significantly reduced AFB1 production by A. flavus (ranging from 88% to 100%) (Bavaro et al., 2016). Other studies investigated antimycotoxin activities of some plant extracts without quantifying the phenolic content, but rather by linking it to their presence via total phenolic content assays (e.g., Folin-Ciocalteu assays) (Table 1). The inhibition of AFB1, nivalenol (NIV), and DON produced by A. flavus and F. graminearum species with bilberry leaves and rice bran extracts was related to phenolic compound contents [START_REF] Heidtmann-Bemvenuti | Effect of natural compounds on Fusarium graminearum complex[END_REF][START_REF] Kollia | Inhibitory effect of Cynara cardunculus L. extract on aflatoxin B1 production by Aspergillus parasiticus in sesame (Sesamum indicum L.)[END_REF].

3.4

Pure phenolic compounds with potential antimycotoxin activity Pure phenolic compounds have been investigated for their effects on mycotoxin production. Table 2 shows 32 scientific publications between 2010 and 2021, describing their capacity to limit the yield of mycotoxins. More than 30 phenolic compounds (e.g., phenolic acids, flavonoids, stil-benes, lignans, etc.) have been studied in vitro for their ability to counteract the production of the main mycotoxins found in food and feed commodities (as shown in Figure 1). Figure 2 encompasses the two major classes of plant phenolic compounds (i.e., flavonoids and nonflavonoids) with reported antimycotoxigenic activity with the structure of an example of every subclass (e.g., caffeic acid from hydrocinnamic acid derivatives). Other examples with their structures are mentioned in Table S3. Some of these phytochemicals are thought to be produced by plants in response to attack by pathogens (Stuper-Szablewska et al., 2019). Chlorogenic acid and its hydrolyzed product, caffeic acid, were found to contribute to the chemical defense arsenal that cereals employ to fight against FHB and TCTB production (Gauthier et al., 2016;[START_REF] Giordano | Changes in the phenolic acid content and antioxidant activity during kernel development of corn (Zea mays L.) and relationship with mycotoxin contamination[END_REF].

Hydroxycinnamic acid derivatives (Table S3) have been widely investigated for their antimycotoxin effect. Almost half of the studies mentioned in Table 2 concern this group of phenolic acids (i.e., hydroxycinnamic acid and hydroxybenzoic acid derivatives). Among them, caffeic acid has been shown to have a strong antimycotoxin effect at low concentration (0.17-1.67 mM) against a range of mycotoxins including TCTB, AFB1, FB1, and OTA [START_REF] Atanasova-Pénichon | Bioguided Isolation, Characterization, and Biotransformation by Fusarium verticillioides of Maize Kernel Compounds That Inhibit Fumonisin Production[END_REF], 2018;Bavaro et al., 2016;Bollina & Kushalappa, 2011;[START_REF] Ferrara | Inhibition of ochratoxin A production in Aspergillus carbonarius by hydroxycinnamic acids from grapes[END_REF]Gauthier et al., 2016;Pagnussatt et al., 2014;Pani et al., 2014). Ferulic acid, a methylated form of caffeic acid (Table S3), could also affect the in vitro production of TCTB, type A trichothecenes (TCTA), OTA, and FUMs [START_REF] Boonmee | Efficiency of hydroxycinnamic phenolic acids to inhibit the production of ochratoxin a by aspergillus westerdijkiae and penicillium verrucosum[END_REF][START_REF] Ferrochio | Evaluation of ability of ferulic acid to control growth and fumonisin production of Fusarium verticillioides and Fusarium proliferatum on maize based media[END_REF]Ferruz, Atanasova-Pénichon, et al., 2016;Oufensou et al., 2020). Other hydroxycinnamic acid derivatives with similar bioactivity are reported in Table 2.

Other forms of phenolic acids, hydroxybenzoic acid derivatives, have been less investigated (Table 2). However, differences in antimycotoxin activities have been noted between hydroxycinnamic and hydroxybenzoic acid derivatives, notably in Fusarium culture (Ponts et al., 2011). Among them, gallic acid (Table S3) has antimycotoxin activities against TCTB, OTA, and AFs production (Gomaa & El Nour, 2014;Pagnussatt et al., 2014;Romero et al., 2010).

Flavonoids have been found to play an important role in the protection of plants against fungal infection and mycotoxin contamination [START_REF] Bilska | Changes in Phenylpropanoid and Trichothecene Production by Fusarium culmorum and F . graminearum Sensu Stricto via Exposure to Flavonoids[END_REF][START_REF] Keriene | The effect of buckwheat groats processing on the content of mycotoxins and phenolic compounds[END_REF]. Several authors have established a link between the flavonoid content in culture media and their effects to mitigate fungal growth and/or mycotoxin accumulation. Almost 17 flavonoids listed in Table 2 have been investigated for their inhibitory effect against the production of mycotoxins, including flavanones (e.g., naringenin), flavonols (e.g., kaempferol), flavones (e.g., 31 luteolin), and flavan-3-ols (e.g., epigallocatechin) [START_REF] Bilska | Changes in Phenylpropanoid and Trichothecene Production by Fusarium culmorum and F . graminearum Sensu Stricto via Exposure to Flavonoids[END_REF][START_REF] Salas | Efficacy of flavanones obtained from citrus residues to prevent patulin contamination[END_REF]Zhou et al., 2015). Earlier work on flavones and several coumarins revealed the potential ability of these compounds to inhibit TCTA production. Their supplementation led to a significant inhibition of T-2 toxin [START_REF] Desjardins | Inhibition of trichothecene toxin biosynthesis by naturally occurring shikimate aromatics[END_REF]. The accumulation of trichodiene (a precursor of T-2 toxin) in the culture medium was observed, suggesting that flavonoids blocked the trichothecene biosynthesis pathway. [START_REF] Salas | Efficacy of flavanones obtained from citrus residues to prevent patulin contamination[END_REF] tested the capacity of 10 flavones to mitigate the production of PAT by Penicillium expansum and Byssochlamys fulva. Among these metabolites represented in Figure 2, aglycone (e.g., naringenin), glycosylated (e.g., prunin), and esterified (e.g., prunin 6″-Ostearoyl ester) forms of flavones were able to inhibit PAT accumulation in the medium almost completely. [START_REF] Bilska | Changes in Phenylpropanoid and Trichothecene Production by Fusarium culmorum and F . graminearum Sensu Stricto via Exposure to Flavonoids[END_REF] found that 1.3 mM of quercetin was sufficient to inhibit both the growth of F. graminearum strains and the production of TCTB mycotoxin. Nonflavonoids such as stilbenes and lignans have also been investigated in recent years but to lesser extent compared to flavonoids. Some of these compounds have strong potential to mitigate mycotoxin production. Monomeric stilbene (e.g., resveratrol; Figure 2) and prenylated monomeric stilbenes (e.g., arachidin-1, arachidin-3, and chiricanine A; Figure 2 and Table S3) affected the production of AFB1 in A. flavus cultures (Sobolev et al., 2018;[START_REF] Wang | Deep sequencing analysis of transcriptomes in Aspergillus flavus in response to resveratrol[END_REF]. In another study, AFs formation was completely suppressed in Aspergillus species growing on peanut seeds producing stilbenoids [START_REF] Sobolev | Inhibition of aflatoxin formation in aspergillus species by peanut (Arachis hypogaea) seed stilbenoids in the course of peanutfungus interaction[END_REF]. Kulik et al. (2014) showed that lignans occurring in wheat grains (e.g., pinoresinol and secoisolariciresinol) reduced trichothecene levels produced by a panel of five F. graminearum strains.

The concentrations of phenolic compounds used generally range from 0.003 to 20 mM, leading to an inhibition of around 23%-100% of the production of mycotoxin. This efficiency is variable according to the phenolic compound itself, the mycotoxin studied, and the producing fungal strain. Higher concentrations of phenolic compounds do not necessarily mean greater inhibition of mycotoxin production. Zhou et al. (2015) observed a more efficient inhibition of AFB1 production with 0.03 mM gallic acid than with a higher concentration of 0.3 mM. They also found that the addition of catechin (flavanol) to the culture medium at a weak concentration (˂0.03 mM) increased AFB1 production by A. flavus strains. In contrast, a higher concentration of catechin (0.35 mM) inhibited the production of AFB1. Furthermore, the capacity of certain fungal strains to be able to metabolize phenolic compounds can also have an impact on their effectiveness against the pathogen and mycotoxin production (Atanasova-Penichon et al., 2016). For instance, some F. graminearum strains biotransformed chlorogenic acid into protocatechuic, caffeic, and hydroxychlorogenic acids. (Gauthier et al., 2016).

MECHANISMS OF ACTION INVOLVED IN THE INHIBITION OF MYCOTOXINS PRODUCTION BY PHENOLIC COMPOUNDS

Plant extracts and their relative phenolic compounds are a valuable source of bioactive natural products in the fight against toxigenic fungi. As mentioned previously, they can affect the production of mycotoxins and/or fungal development. However, the mechanisms involved in these two phenomena are not yet well known. Generally, low doses of phenolic compounds can inhibit mycotoxin production without affecting fungal growth [START_REF] Atanasova-Pénichon | Bioguided Isolation, Characterization, and Biotransformation by Fusarium verticillioides of Maize Kernel Compounds That Inhibit Fumonisin Production[END_REF]Schöneberg et al., 2018), which suggests that the mechanisms involved in the regulation of fungal growth and mycotoxin synthesis could be different [START_REF] Boutigny | Ferulic acid, an efficient inhibitor of type B trichothecene biosynthesis and Tri gene expression in Fusarium liquid cultures[END_REF].

This section describes mechanisms of action thought to be involved in mycotoxin production by phenolic compounds. Several hypotheses have been proposed about how these derivative compounds could affect the production of mycotoxins by fungal strains. They include the following: fungal membrane modifications, reduction in oxidative stress and inhibition of oxidases, as well as downregulation of the expression of key genes involved in mycotoxin production [START_REF] Atanasova-Pénichon | Mycotoxin biosynthesis and central metabolism are two interlinked pathways in Fusarium graminearum, as demonstrated by the extensive metabolic changes induced by caffeic acid exposure[END_REF]Boutigny et al., 2010;[START_REF] Da Cruz Cabral | Application of plant derived compounds to control fungal spoilage and mycotoxin production in foods[END_REF][START_REF] Loi | Plant bioactive compounds in pre-and postharvest management for aflatoxins reduction[END_REF].

Interaction with the fungal membrane

Phenolic compounds could interact with the fungal membrane, which could in turn affect the fungal development and the production of mycotoxins. They could disrupt the permeability of the fungal membrane by interacting with lipid bilayers, resulting in altered homeostasis through leakage of intracellular constituents [START_REF] Sung | Antifungal action of chlorogenic acid against pathogenic fungi, mediated by membrane disruption[END_REF]. Once phenolic compounds have crossed the fungal membrane, they could interact with key enzymes of fungal development and mycotoxin biosynthesis (Atanasova-Penichon et al., 2016).

Thanks to the presence of a methoxy group in their structure, the lipophilicity of some phenolic compounds facilitates their ability to cross the membrane. Methylated phenolic compounds seem to be more efficient in inhibiting fungal development and/or mycotoxin production. For instance, pterostilbene, a dimethylated stilbene, inhibits Leptosphaeria maculans growth, whereas its unmethylated form, resveratrol, is ineffective [START_REF] Koh | Pterostilbene is a potential candidate for control of blackleg in canola[END_REF]. Membranes seem to be affected differently depending on the nature of the phenolic compounds. As shown by [START_REF] Phan | Structure-dependent interactions of polyphenols with a biomimetic membrane system[END_REF], flavonoids induce a rigidification and an aggregation of the membrane, whereas stilbenes induce a fluctuation and an increase in membrane fluidity.

Moreover, several studies have linked the lipophilic character of these compounds to their ability to inhibit the production of mycotoxins. Notably, the inhibition of mycotoxin production by ferulic acid (a methylated phenolic acid; Figure 2), such as TCTB by Fusarium culmorum (Pani et al., 2014), OTA by Penicillium verrucosum [START_REF] Boonmee | Efficiency of hydroxycinnamic phenolic acids to inhibit the production of ochratoxin a by aspergillus westerdijkiae and penicillium verrucosum[END_REF], and ENNs by Fusarium avenicum [START_REF] Gautier | Investigating the efficiency of hydroxycinnamic acids to inhibit the production of enniatins by Fusarium avenaceum and modulate the expression of enniatins biosynthetic genes[END_REF]. Dambolena et al. (2011) showed that the molecular properties of phenylpropanoids, such as their lipophilicity and saturated area, could explain their ability to inhibit the production of FUMs by F. verticillioides.

Regulation of oxidative stress

Oxidative stress in fungal species could be responsible for mycotoxin biosynthesis, for example, AFs by A. parasiticus and A. flavus, FUMs by F. verticillioides, OTA by Aspergillus ochraceus, and TCTB by F. graminearum [START_REF] Chitarrini | Buckwheat achenes antioxidant profile modulates Aspergillus flavus growth and aflatoxin production[END_REF][START_REF] Ferrigo | in vitro production of fumonisins by Fusarium verticillioides under oxidative stress induced by H2O2[END_REF]Montibus et al., 2015). Fungal species trigger different enzymatic (catalases and superoxide dismutase) and nonenzymatic mechanisms (glutathione and thioredoxin system) in response to this stress (Montibus et al., 2015). The oxidative state is balanced between reactive oxygen species production and their scavenging by antioxidant molecules [START_REF] Da Silva | Mycotoxins and oxidative stress: Where are we?[END_REF], such as phenolic compounds. The latter are wellknown antioxidant metabolites, notably thanks to the presence of hydroxy groups in their structure (Figure 2) (Fukumoto & Mazza, 2000).

A link has been established between the percentage of inhibition of mycotoxin production (e.g., TCTB, AFs, FUMs), fungal strain, assayed phenolic compounds, their concentration, and their antioxidant/antiradical properties [START_REF] Bilska | Changes in Phenylpropanoid and Trichothecene Production by Fusarium culmorum and F . graminearum Sensu Stricto via Exposure to Flavonoids[END_REF][START_REF] Caceres | Aflatoxin biosynthesis and genetic regulation: A review[END_REF]. [START_REF] Bilska | Changes in Phenylpropanoid and Trichothecene Production by Fusarium culmorum and F . graminearum Sensu Stricto via Exposure to Flavonoids[END_REF] studied the effect of flavonoids on trichothecene accumulation in an incubation media of F. culmorum and F. graminearum strains. This study revealed the changes in fungal phenylpropanoid pathway and trichothecene production when exposed to flavonoids. Five flavonoids were tested in this study including naringenin, apigenin, luteolin, kaempferol, and quercetin. The selection and the amount used of these flavonoids were based on their contribution to Fusaria resistance in cereals. Quercetin was found to be the most effective in the reduction of trichothecene accumulation. The authors mainly attributed this effect to the high antioxidant and antiradical properties of quercetin compared to the other tested flavonoids [START_REF] Bilska | Changes in Phenylpropanoid and Trichothecene Production by Fusarium culmorum and F . graminearum Sensu Stricto via Exposure to Flavonoids[END_REF]. Moreover, hydroxyl groups of phenolic compounds can form hydrogen bonds with the carboxyl and thiol groups of enzymes responsible for oxidative stress (da Cruz [START_REF] Da Cruz Cabral | Application of plant derived compounds to control fungal spoilage and mycotoxin production in foods[END_REF]. Phenolic compounds can also interact with the gene involved in regulating oxidative stress. For instance, magnolol (a lignan; Table S3) inhibits the production of alternariol by increasing the gene expression of the enzymes involved in oxidative stress (superoxide dismutase and peroxidase) by A. alternata (Wang, Wang, et al., 2020). A similar observation was made on A. carbonarius cultures supplemented with a polyphenol-rich grape skin extract that inhibits OTA production. The extract disrupted the transcription of the superoxide dismutase (sod) and peroxiredoxin (prx) genes involved in the oxidative stress response [START_REF] Crespo-Sempere | Effect of oxidant stressors and phenolic antioxidants on the ochratoxigenic fungus Aspergillus carbonarius[END_REF].

Although some authors consider that there is a relationship between the antioxidant activities of phenolic compounds and the inhibition of mycotoxins, such as trichothecenes (Pani et al., 2014;Ponts et al., 2011) and FUMs (Dambolena et al., 2011), others propose that DON and 15-acetyl-deoxynivalenol accumulate more in culture medium supplemented with phenolic acid derivatives that have high antioxidant activity. Ponts et al. (2011) published a paper on the effect of adding phenolic acids with different levels of antioxidant activity on the accumulation of TCTB toxin. The authors found that phenolic acids with high antioxidant activity (e.g., ferulic acid) enhanced TCTB production, whereas phenolic acids with weak antioxidant activity (e.g., p-hydroxybenzoic acid) inhibited TCTB production. This effect was related to the accumulation of TRI5 transcripts, a gene that plays an important role in TCTB biosynthesis pathway. This gene was found to increase in the presence of a high antioxidant compound (Ponts et al., 2011).

A balance between lipophilicity and antioxidant activity of phenolic compounds seems to be a key factor in inhibiting mycotoxin production (Pani et al., 2014). [START_REF] Ricelli | Role of some food-grade synthesized flavonoids on the control of ochratoxin a in Aspergillus carbonarius[END_REF] showed that negletein, a flavonoid with one methoxy and two hydroxyl groups in the catecholic position, is more efficient in inhibiting OTA production than dimethoxy and nonmethoxy flavonoids. This suggests that both hydroxy and methoxy groups play a role in the reduction of OTA production. From a structural point of view, the presence of a guaiacyl group (i.e., methoxy group on a hydroxylated benzene ring) (refer to Table S3) on phenolic acids and lignans has been shown to be a key feature in inhibiting trichothecenes in vitro (Pani et al., 2014). Furthermore, the presence of this guaiacyl group in the structure of the studied phenolic compounds did not affect fungal growth and was not linked to high antiox-33 idant activity. A link was also established between the antimicrobial activity of phenolic acids and the pH of the fungal medium. For example, the antimycotoxin and the antifungal activities of phenolic acids were found to be modulated by their presence in their undissociated form (i.e., undissociated carboxyl group) (Almajano et al., 2007;[START_REF] Sánchez-Maldonado | Structure-function relationships of the antibacterial activity of phenolic acids and their metabolism by lactic acid bacteria[END_REF]. These activities were favored at low pH (i.e., below or close to pK a values of phenolic acids) (Almajano et al., 2007). [START_REF] Boonmee | Efficiency of hydroxycinnamic phenolic acids to inhibit the production of ochratoxin a by aspergillus westerdijkiae and penicillium verrucosum[END_REF] investigated the inhibitory activity of hydroxycinnamic acids against the production of OTA by Aspergillus westerdijkiae and P. verrucosum [START_REF] Boonmee | Efficiency of hydroxycinnamic phenolic acids to inhibit the production of ochratoxin a by aspergillus westerdijkiae and penicillium verrucosum[END_REF]. The authors kept the pH value of fungal culture lower or close to the pK a values of selected phenolic acids throughout the incubation period. The reason was to keep investigated phenolic acids at the undissociated form. Another study achieved by [START_REF] Gautier | Investigating the efficiency of hydroxycinnamic acids to inhibit the production of enniatins by Fusarium avenaceum and modulate the expression of enniatins biosynthetic genes[END_REF] investigated the inhibitory effect of hydroxycinnamic acids against the production of ENNs by Fusarium avenaceum [START_REF] Gautier | Investigating the efficiency of hydroxycinnamic acids to inhibit the production of enniatins by Fusarium avenaceum and modulate the expression of enniatins biosynthetic genes[END_REF]. The authors tested two pH conditions (pH 3 and pH 6) in a Fusarium-defined medium. At pH 3, ENNs biosynthesis was significantly decreased regardless of the hydroxycinnamic acid. On the other hand, at pH 6, ENNs production was only reduced in media treated with ferulic acid and pcoumaric acid but at lower limits than those obtained at pH 3. The authors attributed this observation to the fact that at pH 6, dissociated forms of hydroxycinnamic acids are mostly predominant.

Regulation of mycotoxin gene expression

The biosynthetic pathways of the main mycotoxins have been identified, including AFs [START_REF] Caceres | Aflatoxin biosynthesis and genetic regulation: A review[END_REF], OTA (Wang et al., 2016), trichothecenes, andFUMs (Alexander et al., 2009). The structural and regulatory genes involved in the biosynthesis of mycotoxins are considered to be key genes, and the expression of their transcripts has been studied to assess the impact of phenolic compounds on these biosynthetic pathways.

The transcriptomic regulation of the key genes of the trichothecene pathway (tri genes) by phenolic compounds has been extensively studied. A downregulation effect was reported for phenolic acids including ferulic [START_REF] Boutigny | Ferulic acid, an efficient inhibitor of type B trichothecene biosynthesis and Tri gene expression in Fusarium liquid cultures[END_REF](Boutigny et al., , 2010;;Ferruz, Atanasova-Pénichon, et al., 2016;Oufensou et al., 2020), p-hydroxybenzoic (Ponts et al., 2011), and sinapic acids (Kulik et al., 2017a). Other compounds such as lignans (magnolol, pinoresinol, and secoisolariciresinol) (Kulik et al., 2014;Oufensou et al., 2020) and flavonoids (apigenin, luteolin, kaempferol, quercetin, and naringenin) [START_REF] Bilska | Changes in Phenylpropanoid and Trichothecene Production by Fusarium culmorum and F . graminearum Sensu Stricto via Exposure to Flavonoids[END_REF] have also been found capable of negatively affecting the expression of tri genes.

To a lesser extent, transcriptomic approaches have also been undertaken to decipher the regulation mechanisms involved in the modulation of other mycotoxin yields by phenolic compounds. For instance, gallic acid, caffeic acid, and resveratrol (Figure 2) impact the expression of AFs biosynthesis key genes of A. flavus [START_REF] Kim | Elucidation of the functional genomics of antioxidantbased inhibition of aflatoxin biosynthesis[END_REF][START_REF] Wang | Deep sequencing analysis of transcriptomes in Aspergillus flavus in response to resveratrol[END_REF][START_REF] Zhao | The antioxidant gallic acid inhibits aflatoxin formation in aspergillus flavus by modulating transcription factors FarB and CreA[END_REF]. The OTA key genes of A. carbonarius are also downregulated by phenolic acids, such as p-coumaric and ferulic acid [START_REF] Ferrara | Inhibition of ochratoxin A production in Aspergillus carbonarius by hydroxycinnamic acids from grapes[END_REF]. Recently, the effect of ferulic and vanillic acids was found to decrease the FUMs key genes expression in F. verticillioides [START_REF] Ferrigo | Effect of naturally occurring compounds on fumonisin production and fum gene expression in Fusarium verticillioides[END_REF].

As shown above, the mechanisms of action allowing the control of the production of mycotoxins are diverse and remain unclear. Regulation can occur at different levels (e.g., structural, transcriptomic) and depends on various factors, such as the structure of phenolic compounds and on the fungi and mycotoxins produced.

SAFETY PROFILE OF PHENOLIC EXTRACTS

The use of plant extracts rich in phenolic compounds to control toxigenic fungi and mycotoxins is becoming more widespread in research. Most polyphenols are naturally present in foods in the form of micronutrients and are consumed on a daily basis by humans (Abbas et al., 2017). Several in vitro (i.e., cell culture) and in vivo (i.e., human and animal models) studies have confirmed the benefits of polyphenols as nutraceuticals in treating many diseases (e.g., cancer and diabetes) (Bahadoran et al., 2013). The most recent review published in 2021 reported evidence on the potential use of polyphenols as promising active substances in protecting against severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) [START_REF] Mehany | Polyphenols as promising biologically active substances for preventing SARS-CoV-2: A review with research evidence and underlying mechanisms[END_REF]. However, safety concerns arise over the long-term use of these compounds as food additives. It is paramount to establish safe margins for using polyphenols as food preservatives by assessing their potential cytotoxicity.

Resveratrol is one of the most studied polyphenols and has numerous effects [START_REF] Huang | Resveratrol: Review on its discovery, anti-leukemia effects and pharmacokinetics[END_REF][START_REF] Sang | The protective effect of resveratrol against cytotoxicity induced by mycotoxin, zearalenone[END_REF]. Many reports have demonstrated the safety of resveratrol in animal models (Borriello et al., 2014). [START_REF] Sawda | Resveratrol for Alzheimer's disease[END_REF] tested the safety of resveratrol for treating patients with Alzheimer's disease. A total of 119 participants were selected and were given a placebo or a pure synthetic resveratrol (0.5 g) orally once a day. The dose was increased progressively until a final dose of 1 g twice every day for nearly 3 months. No differences in terms of safety and tol-erability were observed between the two groups, thus suggesting the lack of toxicity of resveratrol.

The safety and pharmacokinetics of naringenin were also evaluated in healthy adults consuming whole-orange extract from Citrus sinensis. Eighteen adults were selected and were given doses of 150, 300, 600, and 900 mg of naringenin or placebo in capsule form. All doses were found to be safe and well tolerated in humans [START_REF] Rebello | Safety and pharmacokinetics of naringenin: A randomized, controlled, single-ascending-dose clinical trial[END_REF]. Another concerned example was chlorogenic acid that was proven to reduce blood pressure in humans. Patients with mild essential hypertension (n = 28) received 140 mg/day chlorogenic acids from green coffee extract or placebo. No apparent side effects were observed between the two groups, suggesting that chlorogenic acid may be used safely [START_REF] Watanabe | The blood pressure-lowering effect and safety of chlorogenic acid from green coffee bean extract in essen-tial hypertension[END_REF]. Vanillic acid was also assessed for its long-term safety in rat models. A dose of 1000 mg/kg/day of vanillic acid was administered orally for 2 weeks with no adverse effect observed [START_REF] Mirza | Safety assessment of vanillic acid: Subacute oral toxicity studies in Wistar rats[END_REF].

However, the safety of polyphenols is still under question and even database about polyphenol content in food remains incomplete. Human consumes polyphenols from diet (e.g., fruits and vegetables) and also from food supplements [START_REF] Lima | Polyphenols in fruits and vegetables and its effect on human health[END_REF]. The variability of polyphenol content in food is significant and many factors contribute to this variability. These factors include different plant varieties, postharvest treatment, climate, and storage [START_REF] Liu | Variation in contents of phenolic compounds during growth and post-harvest storage of pigeon pea seedlings[END_REF][START_REF] Shafi | Variability in catechin and rutin contents and their antioxidant potential in diverse apple genotypes[END_REF]. [START_REF] Huang | Dietary polyphenol intake in US adults and 10-Year trends: 2007-2016[END_REF] published a study about dietary polyphenol intake among Americans adults in 2013-2016 and 2007-2016 using the National Cancer Institute method. Phenolic acids and flavonoids were the main consumed polyphenols with an average of 1005.6 and 379.1 mg/day, respectively. Most of polyphenol intake was from foods and beverages (99.8%) followed by coffee, beans, and tea. Hydroxycinnamic acids and flavanols were the highest among other polyphenols with an average of 971.5 and 223.2 mg consumed per day, respectively. [START_REF] Williamson | Dietary reference intake (DRI) value for dietary polyphenols: Are we heading in the right direction[END_REF] published the dietary intake of polyphenols based on 5-a-day campaign using data derived from the United States Department of Agriculture (USDA) [START_REF] Williamson | Dietary reference intake (DRI) value for dietary polyphenols: Are we heading in the right direction[END_REF]. Individuals who consumed five fruits or vegetables per day, not including hydroxycinnamic acids and beverages, have an average intake of polyphenols more than 500 mg, which means that the overall intake of polyphenols could reach between 500 and 1000 mg if hydrocinnamic acids or beverages such as coffee were taken into consideration. On other hand, dietary supplements could be another source of polyphenols. [START_REF] Mennen | Risks and safety of polyphenol consumption[END_REF] published a paper mentioning recommendations made by supplement companies concerning polyphenols [START_REF] Mennen | Risks and safety of polyphenol consumption[END_REF]. These recommendations were close to the intake levels of polyphenols derived from the consumption of dietary products and were based on the type of diet pattern (i.e., Western, Asian, European, etc.).

Although the safety profile of many polyphenols has been documented in many researches, some studies have reported opposite effects. Rodents suffering from renal dysfunction treated on a long-term basis with high doses of quercetin had toxic side effects (Andres et al., 2018;[START_REF] Silva | Polyphenols from food and natural products: Neuroprotection and safety[END_REF]. However, [START_REF] Harwood | A critical review of the data related to the safety of quercetin and lack of evidence of in vivo toxicity, including lack of genotoxic/carcinogenic properties[END_REF] concluded that quercetin, at estimated dietary intake levels, does not produce side effects and that there is no clear evidence about its in vivo effects.

The promising potential of these compounds to control mycotoxin production, and thus their possible application in pre-and/or postharvest settings, raises the question of the human safety profile of these compounds. All the abovementioned studies tended to demonstrate the potential safety of phenolic compounds for humans. Nevertheless, their use is still controversial and requires further research in humans, as demonstrated by the lack of legislation governing them and of their approved use so far.

STRATEGIES TO OVERCOME STABILITY AND SOLUBILITY BARRIERS OF PHENOLIC COMPOUNDS

As seen until now, phenolic compounds have many types of activity that are not merely confined to their antimycotoxin action but also concern health benefits for humans. As previously mentioned, polyphenols could be promising candidates to minimize mycotoxin contents in food in addition to health benefits associated with their consumptions. The latter health benefits include their protective antioxidant effects (Arcambal et al., 2020;[START_REF] Yan | Antioxidant mechanism of tea polyphenols and its impact on health benefits[END_REF], cardiovascular pleiotropic effects (Behl et al., 2020), antiinflammatory [START_REF] Magrone | Recent advances on the anti-inflammatory and antioxidant properties of red grape polyphenols: in vitro and in vivo studies[END_REF], and neuroprotective effects [START_REF] Uddin | Neuroprotective role of polyphenols against oxidative stress-mediated neurodegeneration[END_REF]. Nevertheless, the routine use of phenolic compounds faces several constraints ranging from their instability to factors involving their processing and storage (e.g., heat, moisture, and light), their low solubility, and their possible oxidative degradation when dissolved in water [START_REF] Deng | Technological aspects and stability of polyphenols[END_REF]. In addition, several phenolic compounds have an unpleasant bitter astringent taste that limits their use in food and drug formulations.

Several techniques have been developed to overcome these drawbacks. [START_REF] Sun | Improvement of stability of tea polyphenols: A review[END_REF] published a review about the different approaches used to improve the stability of tea polyphenols. One of these approaches is encapsulation, that is, a technology for packaging solid, liquid, or gas molecules in the form of capsules, particles, spheres, or aggregates (micro-or nanoscales) that can release their content at controlled rates under specific conditions [START_REF] Fang | Encapsulation of polyphenols -A review[END_REF][START_REF] Nedovic | An overview of encapsulation technologies for food applications[END_REF]. Encapsulation is 35 a common strategy used frequently in the pharmaceutical and food industries. Concerning phenolic compounds, encapsulation could be a solution (a) to improve the stability of phenolic compounds instead of using their unstable free form, (b) to preserve their activity, and (c) to offset their bitter taste. The micro-and nanoencapsulation of phenolic compounds has been widely documented [START_REF] Cao | Available technologies on improving the stability of polyphenols in food processing[END_REF][START_REF] Fang | Encapsulation of polyphenols -A review[END_REF][START_REF] Kasote | Encapsulation of polyphenols: An effective way to enhance their bioavailability for gut health[END_REF][START_REF] Milinčić | Application of polyphenolloaded nanoparticles in food industry[END_REF][START_REF] Parisi | Polyphenols and their formulations: Different strategies to overcome the drawbacks associated with their poor stability and bioavailability[END_REF][START_REF] Yang | Nanoformulations to enhance the bioavailability and physiological functions of polyphenols[END_REF]. Phenolic compounds are encapsulated in a structured carrier (e.g., nanoparticles [NPs]) or a mixture of polymers (i.e., matrix) to protect them from degradation by heat or light. Various encapsulating technologies are used to obtain particles loaded with phenolic compounds such as spray-drying, freeze-drying, coacervation, liposome, and so forth and have been discussed in detail in different published works [START_REF] Fang | Encapsulation of polyphenols -A review[END_REF][START_REF] Munin | Encapsulation of natural polyphenolic compounds; a review[END_REF]. The most recent examples of encapsulation are found in the following paragraphs. Chitosan is a common example of carrier NPs that is used to enhance the stability and solubility of phenolic compounds in agronomic field. Chitosan is a naturally occurring biocompatible and biodegradable polysaccharide composed of randomly distributed D-glucosamine and N-acetyl-Dglucosamine. Chitosan NPs have many advantages including enhanced stability of compounds and improved compound solubility. [START_REF] Palacio | Study of encapsulation of polyphenols on succinyl-chitosan nanoparticles[END_REF] recently reported the use of succinyl-chitosan NPs to encapsulate phenolic compounds. They explained that succinyl-chitosan NPs made a strong interaction with phenolic compounds and improved both their solubility and encapsulation efficiency [START_REF] Palacio | Study of encapsulation of polyphenols on succinyl-chitosan nanoparticles[END_REF]. Another study proposed the encapsulation of extracted phenolic compounds from red grape and golden apple pomace in chitosan and soy protein (Gaber [START_REF] Gaber Ahmed | Nano-encapsulation of grape and apple pomace phenolic extract in chitosan and soy protein via nanoemulsification[END_REF]. The resulting nanocapsules showed greater antioxidant activity and encapsulation efficiency. O'Toole et al. ( 2012) published a work on the encapsulation of curcumin, a principal phenolic component of turmeric with many health benefits [START_REF] O'toole | Curcumin encapsulation in submicrometer spraydried chitosan/tween 20 particles[END_REF]. The authors arrived to load successfully curcumin into chitosan/Tween 20 spray-dried particles to enhance both solubility and stability of curcumin. Another example is tetrahydrocurcumin, a curcumin derivative with antifungal and inhibitory effects against Fusarium proliferatum and FUMs production [START_REF] Coma | in vitro inhibitory effect of tetrahydrocurcuminoids on Fusarium proliferatum growth and fumonisin B1 biosynthesis[END_REF]. This compound was encapsulated in spray-dried chitosan particles' matrices for biofungicide applications [START_REF] Loron | Polysaccharide matrices for the encapsulation of tetrahydrocurcumin-Potential application as biopesticide against Fusarium graminearum[END_REF]. [START_REF] Muzzalupo | in vitro antifungal activity of olive (Olea europaea) leaf extracts loaded in chitosan nanoparticles[END_REF] investigated the in vitro antifungal activity of olive (Olea europaea) leaf extracts encapsulated in chitosan-tripolyphosphate NPs against F. proliferatum [START_REF] Muzzalupo | in vitro antifungal activity of olive (Olea europaea) leaf extracts loaded in chitosan nanoparticles[END_REF]. The authors showed great inhibition rate suggesting the possible use of these NPs as biofungicides in agriculture. [START_REF] Matei | Silver nanoparticles and polyphenol inclusion compounds composites for phytophthora cinnamomi mycelial growth inhibition[END_REF] tested the fungicide action of nanocomposites based on silver NPs loaded with four polyphenols (silymarin, ferulic acid, gallic acid, and curcumin) against Phytophthora cinnamomi [START_REF] Matei | Silver nanoparticles and polyphenol inclusion compounds composites for phytophthora cinnamomi mycelial growth inhibition[END_REF]. The authors found a significant inhibition of fungal growth and the possible application of these nanocomposites as an alternative to synthetic fungicide to control plant diseases. A recent review was published by [START_REF] Salem | Plants-derived bioactives: Novel utilization as antimicrobial, antioxidant and phytoreducing agents for the biosynthesis of metallic nanoparticles[END_REF] group on the application of bioagents originating from plants for the biosynthesis of NPs active against certain pathogenic microbes. These applications included the use of phenolic and flavonoid compounds loaded on NPs as biofungicide against mold [START_REF] Salem | Plants-derived bioactives: Novel utilization as antimicrobial, antioxidant and phytoreducing agents for the biosynthesis of metallic nanoparticles[END_REF]. Several other recent reports have been published on the same topic (Ba et al., 2020;[START_REF] Cabral | Improving stability of antioxidant compounds from Plinia cauliflora (jabuticaba) fruit peel extract by encapsulation in chitosan microparticles[END_REF][START_REF] Maluin | Chitosan-based agronanochemicals as a sustainable alternative in crop protection[END_REF][START_REF] Talón | Antioxidant edible films based on chitosan and starch containing polyphenols from thyme extracts[END_REF]Wang, Zhang, et al., 2020).

On the other hand, mesoporous silica materials have attracted more attention during the last decade as carrier matrices for drugs to increase their aqueous solubility and, consequently, their oral bioavailability. For example, Brezoiu et al. (2019) reported the encapsulation of polyphenolrich grape pomace extracts in modified mesoporous silica. The encapsulated phenolic compounds were found to have better biological activity and stability compared to free extract. Another alternative to encapsulating phenolic compounds is to use lipid-based nanocarriers (e.g., liposome), which act as a vehicle for the delivery of compounds. [START_REF] Pagnussatt | Assessment of the encapsulation effect of phenolic compounds from Spirulina sp. LEB-18 on their antifusarium activities[END_REF] investigated the inhibitory activity of liposomal systems containing phenolic extract of Spirulina sp. against F. graminearum [START_REF] Pagnussatt | Assessment of the encapsulation effect of phenolic compounds from Spirulina sp. LEB-18 on their antifusarium activities[END_REF]. The authors observed enhanced antifungal activity that was related to higher penetration of phenolic extracts into different plant tissues. A detailed review was published by [START_REF] Pimentel-Moral | Lipid nanocarriers for the loading of polyphenols -A compre-hensive review[END_REF] concerning the loading of polyphenols into lipid nanocarriers. The authors mentioned that lipid-based nanosystems for lipophenols offer many advantages including enhanced aqueous solubility, stability, and improved oral bioavailability. Furthermore, many nanocarrier-based lipids obtained a Generally Recognized as Safe (GRAS) status for oral and topical administration. Several studies have been published on the use of lipid nanocarriers to load natural phenolic compounds with applications extended to different fields (Bhise et al., 2017;[START_REF] Faridi Esfanjani | Improving the bioavailability of phenolic compounds by loading them within lipid-based nanocarriers[END_REF][START_REF] Hosseini Berenji | Resveratrol entrapped food grade lipid nanocarriers as a potential antioxidant in a mayonnaise[END_REF][START_REF] Păvăloiu | Polyphenolic extract from Sambucus ebulus L. leaves free and loaded into lipid vesicles[END_REF][START_REF] Pimentel-Moral | Polyphenols-enriched Hibiscus sabdariffa extract-loaded nanostructured lipid carriers (NLC): Optimization by multi-response surface methodology[END_REF][START_REF] Zhou | Encapsulation of lipophilic polyphenols in plant-based nanoemulsions: Impact of carrier oil on lipid digestion and curcumin, resveratrol and quercetin bioaccessibility[END_REF]. Other nanocarriers include nanomicelles [START_REF] Iurciuc-Tincu | Drug delivery system based on pH-sensitive biocompatible poly(2-vinyl pyridine)b-poly(ethylene oxide) nanomicelles loaded with curcumin and 5fluorouracil[END_REF], zein NPs (Liu, Ma, et al., 2017), protein-polysaccharide complex NPs, chitosan-cyclodextrins [START_REF] Liu | Chitosan/sulfobutylether-β-cyclodextrin nanoparticles as a potential approach for tea polyphenol encapsulation[END_REF], polymeric NPs [START_REF] Felice | Delivery of natural polyphenols by polymeric nanoparticles improves the resistance of endothelial progenitor cells to oxidative stress[END_REF], and gelatin films [START_REF] Liu | Controlledrelease of tea polyphenol from gelatin films incorporated with different ratios of free/nanoencapsulated tea polyphenols into fatty food simulants[END_REF]. All the abovementioned authors discuss possible strategies for overcoming the limitations of using polyphenols in the agronomic field of indus-trial and clinical settings and increasing their activity and stability.

CONCLUSION

Mycotoxins are a health hazard for humans and animals. These specialized metabolites produced by fungal pathogens infecting crops can contaminate human food and animal feed. Mycotoxins are found worldwide, which has led global organizations such as the WHO, the FDA, and the EFSA to set limits for their accepted levels in food and feed.

Mycotoxins can contaminate different types of processed and unprocessed foods. More than half of all cereal commodities were contaminated with at least one mycotoxin above the risk levels in 2020 with high possibility of recurrent occurrence. The same mycotoxin patterns are found in similar climate zones, their distribution being mainly affected by climatic conditions. Furthermore, factors related to climate change such as temperature increase, CO 2 level increase, changes in rainfall levels, and humidity are expected to lead to shifts in mycotoxin patterns.

Conventional strategies employed in pre-and postharvest approaches to control mycotoxins are partly based on the use of synthetic fungicides. There is currently a clear trend to find control solutions based on the use of natural and more sustainable practices. This review has discussed the most recent studies on the potential for using phenolic compounds to minimize contamination with mycotoxins. Notably, several plant or by-product extracts from various origins, as well as phenolic compounds of natural origin such as phenolic acids, flavonoids, stilbenes, and lignans, are capable of efficiently controlling the in vitro production of AFs, FUMs, trichothecenes, ZEN, OTA, and PAT. However, current legislation in the European Union and the United States does not allow the use of plant extracts rich in phenolic compounds as a means of controlling mycotoxins. Despite ongoing research demonstrating the harmlessness of these molecules for humans and the environment, further analysis is needed to prove their safety before their potential use to control mycotoxin production. Other questions may arise about their use, including the sourcing of phenolic-rich plants, their supply and purification, which can be costly, as well as the difficulty of using them in preor postharvest settings. However, current studies aiming to improve their solubility, stability, and potential applications are showing more and more the outstanding promise they hold.

In summary, this review has discussed phenolic compounds used to control the production of mycotoxins and mechanisms of action involved. Their antioxidant properties and lipophilicity seem to play a major role in their activity. Different mechanisms of action seem to be involved in the inhibition of toxin production, such as structural modifications of the fungal membrane, downregulation of the expression of genes involved in mycotoxin production, and inhibition of the enzymatic activity responsible in regulating oxidative stress. However, further studies are needed to determine the precise mechanisms of phenolic compounds, depending on the targeted mycotoxins and mycotoxin-producing fungal species. We began with Newton, and we finish with him or rather his apple. Is it possible to avert the eventual growth of harmful mold on that apple that proliferates due to specific conditions of moisture and temperature? Only future research will provide an answer to that question.

A C K N O W L E D G M E N T

The authors would like to thank Dr. Ray Cooke for proofreading the manuscript.

A U T H O R C O N T R I B U T I O N S

Omar S. Ahmed, Caroline Rouger, and Vessela Atanasova conceptualized the idea of the study. Omar S. Ahmed provided resources, performed visualization, and reviewed and edited the manuscript. Omar S. Ahmed and Charles Tardif wrote the original draft. Vessela Atanasova acquired funding.

C O N F L I C T O F I N T E R E S T

The authors declare no conflict of interest.

O R C I D

Pierre Waffo-Téguo https://orcid.org/0000-0003-1309-5451 Advances in occurrence, importance, and mycotoxin control strategies: Prevention and detoxification in foods. Foods, 9(2), 137. Ahn-Jarvis, J. H., Parihar, A., & Doseff, A. I. (2019). Dietary flavonoids for immunoregulation and cancer: Food design for targeting disease. Antioxidants, 8( 7), 1-30.

R E F E R E N C E S

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Aflatoxins

Fumonisins

Type B trichothecenes

Aflatoxin B2 Aflatoxin M1 Aflatoxin G1 Aflatoxin G2

Fumonisin B2

Fumonisin B3

Type A trichothecenes

Geographical distribution and occurrence of mycotoxins in the last four years and the effect of climate

To elucidate regional mycotoxin occurrence patterns, published reports in the recent four years (2017-2021) were grouped into the world map in Figure S1.A. Eight geographic regions (i.e., South America, Central America, North America, Middle East, North Africa, Sub-Saharan Africa, Africa and Asia) and 36 countries were mentioned in these studies focusing on contamination by mycotoxins. Remarkably, their occurrence is particularly high in many undeveloped and developing countries especially in Africa [START_REF] Juan | Multi-mycotoxin determination in barley and derived products from Tunisia and estimation of their dietary intake[END_REF]Kebede, Liu, Jin, & Xing, 2020). Inappropriate storage and improper facilities may initiate fungal growth and subsequently, lead to mycotoxin production (Kebede et al., 2020).

The issue being worsened by the lack of awareness. Notably, many reports were published on cases of mycotoxins found in many commodities in Serbia, Argentina, Iran, and Mexico.

Difficult economic development and small investment in the area of agricultural production made these countries at high risk for mycotoxin spread. [START_REF] Castañares | Natural occurrence of Alternaria mycotoxins in malting barley grains in the main producing region of Argentina[END_REF]Milicevic et al., 2019;[START_REF] Quevedo-Garza | Aflatoxin M1 occurrence in fluid milk commercialized in Monterrey, Mexico[END_REF].

Variability of mycotoxin content in samples from the same geographical area has been Central Manitoba [START_REF] Tittlemier | Fusarium and Alternaria mycotoxins present in Canadian wheat and durum harvest samples[END_REF].

According to the 2020 BIOMIN Mycotoxin survey that investigated 21,000 finished feed products and raw commodities from 79 countries, all of the surveyed regions were found to be affected by mycotoxins. Nearly 91% of the collected samples were found to have at least one major mycotoxin, and 71% of samples were affected with co-occurrence of different mycotoxins [START_REF] Biomin Holding | World Mycotoxin Survey 2020 -Annual Report[END_REF]. Climate, and consequently climate changes (CC), have a significant impact on the geographical distribution of toxigenic fungi, their development and mycotoxin production. Remarkably, shifts in traditional mycotoxin occurrence patterns cannot merely be due to temperature increase, but also to increased CO2 levels, changes in precipitation patterns and relative humidity (Á. Medina, González-Jartín, & Sainz, 2017). There is a strong relation between mycotoxin production and environmental factors including water activity (aw) and temperature that potentially govern the life cycle of fungi [START_REF] Mannaa | Influence of temperature and water activity on deleterious fungi and mycotoxin production during grain storage[END_REF]. Therefore, meteorological and environmental factors must be keyed into future scenarios to predict mycotoxin infection and distribution areas during the coming decades.

Generally, there are four major climate zones worldwide: the tropics, the subtropics, temperate zones and cold zones, based on temperature and relative humidity as shown in Figure 2.A. AFs tend to be more prevalent in tropical and subtropical zones [START_REF] Abdallah | Risk characterization and quantification of mycotoxins and their producing fungi in sugarcane juice: A neglected problem in a widelyconsumed traditional beverage[END_REF][START_REF] Lasram | Occurrence and exposure assessment of aflatoxin B1 and ochratoxin A in pearl millet (Pennisetum glaucum L.) from Tunisia[END_REF] Magan, Peromingo, & Rodríguez, 2017;Liu et al., 2017;Lv et al., 2019;A. Medina et al., 2017). In addition, the risk of Fusarium Head Blight (FHB) (Haile et al., 2019), which is a major fungal disease affecting wheat production globally, increases with the co-incidence of a wet and warm environment during flowering (Vaughan, Backhouse, & Del Ponte, 2016). Cerón-Bustamante et al. (2018) showed that the regional differences in FHB composition observed in

-------------------------------------------------------- LC-MS

Flavonoids

Cas particulier des stilbènes

Les stilbènes font partie des composés phénoliques recensés dans la revue précédente, pour leur activité antimycotoxine. Toutefois, il y a peu de travaux à ce jour qui font mention de cette bioactivité.

Les stilbènes sont des non-flavonoïdes issus de la voie des phénylpropanoïdes. Le resvératrol est la forme monomérique de base des stilbènes, mais des phénomènes d'isomérisation, d'oligomérisation, de glycosylation, de méthoxylation ou d'hydroxylation de ce composé amènent à une diversité de structures au sein de cette famille (Rivière et al., 2012). Un échantillon de cette diversité structurale est représenté sur la Figure 1. Cette classe de polyphénols est connue pour être retrouvée dans diverses familles botaniques comme les Gnetaceae, les Pinaceae, les Cyperaceae, les Fabaceae, les Dipterocarpaceae et surtout les Vitaceae (Rivière et al., 2012). Vitis vinifera L., appartenant à la famille des Vitaceae, est la principale source alimentaire de stilbènes. Ces derniers sont connus pour être des phytoalexines chez la vigne, c'est-à-dire des substances synthétisées par la plante face à des contraintes biotiques, notamment fongiques [START_REF] Dubrovina | Regulation of stilbene biosynthesis in plants[END_REF] Les stilbènes ont déjà fait l'objet de travaux de recherche pour leurs propriétés biologiques diverses en santé humaine et végétale. Le E-resvératrol et la E-ε-viniférine sont notamment étudiés pour leur activité anti-inflammatoire et face au stress oxydant [START_REF] Beaumont | In the shadow of resveratrol: biological activities of epsilon-viniferin[END_REF], mais aussi pour leur activité anticancéreuse ou encore antidiabétique [START_REF] Tsai | Biological actions and molecular effects of resveratrol, pterostilbene, and 3′-hydroxypterostilbene[END_REF].

En santé végétale, les travaux de [START_REF] Langcake | The production of resveratrol by Vitis vinifera and other members of the Vitaceae as a response to infection or injury[END_REF] dans les années 1970 ont montré pour la première fois que le E-resvératrol issu de la vigne pouvait être une molécule antifongique. Des activités d'inhibition de la croissance mycélienne ont été mesurées sur Botrytis cinerea, le champignon responsable de la pourriture grise de la vigne ; Piricularia oryzae et F. oxysporum, des agents phytopathogènes du riz et des cultures potagères [START_REF] Langcake | The production of resveratrol by Vitis vinifera and other members of the Vitaceae as a response to infection or injury[END_REF]. D'autres études ont pu montrer l'intérêt de ces métabolites et d'extraits de vigne riches en stilbènes contre d'autres microorganismes néfastes pour les cultures. La recherche s'est principalement axée sur les agents pathogènes de la vigne, comme B. cinerea [START_REF] Adrian | Biological activity of resveratrol, a stilbenic compound from grapevines, against Botrytis cinerea, the causal agent for gray mold[END_REF][START_REF] El Khawand | A dimeric stilbene extract produced by oxidative coupling of resveratrol active against <em>Plasmopara viticola</em> and <em>Botrytis cinerea</em> for vine treatments[END_REF][START_REF] Xu | In vitro and in vivo effectiveness of phenolic compounds for the control of postharvest gray mold of table grapes[END_REF], Plasmopara viticola, l'agent responsable du mildiou (Gabaston et al., 2017;[START_REF] Schnee | Vitis vinifera canes, a new source of antifungal compounds against Plasmopara viticola, Erysiphe necator, and Botrytis cinerea[END_REF][START_REF] Taillis | A grapevine by-product extract enriched in oligomerised stilbenes to control downy mildews: focus on its modes of action towards Plasmopara viticola[END_REF] ou encore Diploria seriata, champignon impliqué dans la maladie de l'Esca [START_REF] Lambert | Phenolics and their antifungal role in grapevine wood decay: Focus on the Botryosphaeriaceae family[END_REF]. En plus de leur activité démontrée contre les microorganismes, les extraits enrichis en stilbènes pourraient agir dans la stimulation des défenses des plantes face à des stress biotiques d'origine fongique [START_REF] De Bona | Dual Mode of Action of Grape Cane Extracts against Botrytis cinerea[END_REF].

Ces molécules pourraient avoir un intérêt en santé des plantes, par leur activité à la fois inhibitrice de certains champignons, mais aussi biostimulatrice des défenses de la vigne. Néanmoins, il n'y a ce jour que très peu de travaux sur le contrôle de la production de mycotoxines par ces composés phénoliques. Comme nous l'avons développé dans la revue, les études pour le moment se sont basées sur l'utilisation de monomères de stilbènes comme le Eresvératrol ou l'arachidine-1 pour inhiber la production de mycotoxines produites par le genre Aspergillus, comme l'aflatoxine B1 et l'ochratoxine A (De Rossi et al., 2012;Sobolev et al., 2018;Zhou et al., 2015).

Récemment, des extraits à l'eau sous-critique de sarments et racines de vigne ont été testés sur des cultures in vitro de F. graminearum afin d'étudier l'activité antifongique et contre la production de 15ADON (Montibus et al., 2021). Ces travaux, réalisés en collaboration entre le l'axe MIB de l'UMR OEnologie et l'UR MycSA, ont montré que les extraits de sarments obtenus par une extraction à 125 °C inhibaient significativement la croissance du champignon (> 35 %), mais aussi la production de DON et de 15ADON d'au moins 46 % à 100 mg/L. Les extraits racinaires n'ont pas inhibé la croissance du champignon, les auteurs ont fait le choix de ne pas conserver cet extrait pour les analyses des mycotoxines. Ces résultats sont les premiers à avoir montré l'activité d'extraits de vigne contre la production de mycotoxines.

Dans ces travaux de thèse, nous tenterons d'exploiter le contenu en stilbènes de co-produits viticoles pour rechercher des effets inhibiteurs de la croissance de F. graminearum et de la production de TCTB associée.

L'utilisation des réseaux moléculaires pour la mise en évidence de produits naturels

Les outils biochimiométriques en appui au fractionnement bioguidé

Dans le domaine de la recherche sur les produits naturels, un des objectifs est d'identifier les métabolites responsables de l'activité au sein de mélanges complexes. Afin d'y parvenir, les approches conventionnelles sont basées notamment sur le fractionnement bioguidé, cela repose sur l'alternance entre séparation chromatographique d'un extrait de composition complexe en fractions plus simples et mesure de l'activité biologique pour sélectionner les fractions les plus efficaces (H. K. Kim et al., 2022). Cependant, c'est un processus qui peut s'avérer être lent selon les activités biologiques étudiées et les méthodes de fractionnement utilisées, couteux en solvant et sans aucune certitude d'isoler une molécule bioactive inconnue (H. K. Kim et al., 2022;[START_REF] Li | Drug discovery and natural products: end of era or an endless frontier[END_REF]. Le fractionnement peut également entrainer une baisse de l'activité des sous-fractions et mener à l'isolement de composés moins actifs, c'est notamment le cas si les activités observées sont l'effet de la synergie de plusieurs molécules [START_REF] Inui | Unbiased evaluation of bioactive secondary metabolites in complex matrices[END_REF].

Plus récemment, l'avènement des approches basées sur le profilage métabolique, notamment par des analyses par spectrométrie de RMN (résonnance magnétique nucléaire) ou par spectrométrie de masse (MS), a permis de réaliser des profils chimiques des matrices complexes étudiées. Ces données chimiques sont ensuite complétées avec les activités biologiques par le biais de modèles statistiques afin de corréler l'activité étudiée à un, ou plusieurs, métabolites détectés dans les matrices [START_REF] Wolfender | Innovative omicsbased approaches for prioritisation and targeted isolation of natural productsnew strategies for drug discovery[END_REF]. Ces approches sont définies comme biochimiométriques et utilisent des analyses statistiques comme des degrés de corrélation, des modèles statistiques non supervisés tels que les analyses de cluster hiérarchique (ACH) et les analyses en composantes principales (ACP). Mais aussi des analyses supervisées basés sur la régression linéaire, comme la régression des moindres carrés partiels (PLS) et l'analyse discriminante de ce modèle (PLS-DA) [START_REF] Kellogg | Biochemometrics for Natural Products Research: Comparison of Data Analysis Approaches and Application to Identification of Bioactive Compounds[END_REF][START_REF] Ory | Targeting bioactive compounds in natural extracts -Development of a comprehensive workflow combining chemical and biological data[END_REF].

Ces approches biochimiométriques permettent de mettre en avant les potentiels marqueurs de bioactivité dans les matrices complexes étudiées. Afin d'attribuer une structure chimique à ces marqueurs, des étapes de déréplication sont réalisées. Cela repose sur l'annotation des molécules connues dans un mélange à partir des données spectrales RMN et/ou MS n , sans fractionnement et isolement au préalable [START_REF] Wolfender | Metabolomics in Ecology and Bioactive Natural Products Discovery: Challenges and Prospects for a Comprehensive Study of the Specialised Metabolome[END_REF]. Ces annotations sont faites sur la base du lien entre les signaux des métabolites détectés par MS 1 , MS 2 et/ou RMN et une potentielle structure chimique connue, cela nécessite donc le recensement des spectres de molécules connus au sein des bases de données spectrales.

Il existe des bases de données de molécules qui vont regrouper des molécules naturelles et synthétiques, comme par exemple PubChem ou SciFinder. Plus récemment, des bases de données qui regroupent les produits naturels ont été créés comme celle des projets COCONUT [START_REF] Sorokina | COCONUT online: Collection of Open Natural Products database[END_REF] ou LOTUS [START_REF] Rutz | The LOTUS initiative for open knowledge management in natural products research[END_REF], qui font le lien entre les structures moléculaires et les organismes vivants dans lesquels ces métabolites ont été retrouvés. Ces bases de données permettent de regrouper des informations notamment sur la structure de ces composés et les articles associés où les molécules ont été isolées. Ainsi, des informations sur les spectres MS 1 , MS 2 ou RMN de ces molécules peuvent être obtenues pour réaliser la déréplication des composés. L'ajout de ces données spectrales dans les bases de données permet de faciliter les étapes de déréplication. Pour des molécules connues dont la fragmentation en masse n'a pas encore été répertoriée dans la littérature, il existe aussi des méthodes prédictives de simulation de spectre, qualifiées d'in silico. C'est le cas de l'outil CFM-ID (F. [START_REF] Wang | CFM-ID 4.0: More Accurate ESI-MS/MS Spectral Prediction and Compound Identification[END_REF] qui permet de prédire la fragmentation MS 2 d'une molécule donnée à partir de son code SMILES (Simplified Molecular Input Line Entry System) ou de son identifiant InChI (International Chemical Identifier).

Les réseaux moléculaires pour la déréplication des molécules

Les analyses par LC-MS/MS de matrices complexes permettent d'obtenir des informations sur la composition chimique. Toutefois, ces données brutes riches en informations structurales ne permettent pas une visualisation claire de la complexité chimique des échantillons. L'exploitation de ces données sous forme de réseaux moléculaires permet de faciliter l'observation des données de masse en regroupant les métabolites structurellement proches.

Les réseaux moléculaires sont une approche qui permet d'organiser les données de MS 2 sur la base de leur similarité spectrale, ainsi des molécules avec des spectres proches peuvent correspondre à des molécules structurellement proches [START_REF] Ariyo | Co-occurrence of mycotoxins, aflatoxin biosynthetic precursors, and Aspergillus metabolites in garlic (Allium sativum L) marketed in Zaria, Nigeria. Food Additives and Contaminants: Part B Surveillance[END_REF]. Des schémas de fragmentation communs peuvent se traduire soit par des fragments fils identiques ou alors par des analogies de pertes de neutres. Ainsi, les spectres MS/MS sont comparés un à un et un score cosine est associé à chaque combinaison. Ce score varie de 0 à 1, une valeur nulle signifie une absence de similarité spectrale entre deux ions, et la valeur maximale correspond à la superposition parfaite de deux spectres.

Lors de la représentation sous forme de réseau moléculaire, comme sur l'exemple de la Figure 2, les ions sont représentés par un point appelé node (noeud). Si deux ions ont une valeur de cosine au-dessus du seuil fixé (généralement 0,7), ils pourront être liés entre eux par un edge (lien). Les ions ainsi regroupés forment un cluster, au sein de ce dernier il y a donc plusieurs ions qui partagent des similarités spectrales. Il est connu qu'au sein d'une même famille chimique les composés sont proches au niveau structural, ceci est notamment régi par le fait qu'elle provienne des mêmes voies métaboliques. Ainsi, le regroupement des molécules structuralement proches en cluster, peut permettre d'annoter ces derniers par une famille chimique. Les premiers travaux qui ont permis la mise en place des réseaux moléculaires ont été réalisés par l'équipe du Pr. Dorrestein sur des extraits de différentes colonies bactériennes et des fractions issues d'une collection de cyanobactéries. L'ajout de standards connu au sein des réseaux a permis la déréplication de plusieurs molécules et a été la preuve de concept de cette méthode [START_REF] Yang | Molecular networking as a dereplication strategy[END_REF]. Puis, cette même équipe a développé un serveur en ligne pour la génération de réseau moléculaire, appelé GNPS pour Global Natural Products Social Molecular Networking (M. Wang et al., 2016), ce qui a permis de faciliter l'utilisation de cette approche par un plus large public. Ce serveur est lié à des bases de données spectrales pour permettre la déréplication des molécules en mélange. Les spectres expérimentaux sont comparés aux spectres des bases de données et un cosinus est calculé. Un score élevé de cosinus (par exemple > 0,7) témoigne d'une similarité élevée entre le spectre disponible dans les bases de données et le spectre expérimental, ainsi ce dernier peut être annoté comme correspondant au métabolite connu. De plus, cette plateforme est collaborative, en effet les utilisateurs peuvent y ajouter des spectres de standards de molécules et ainsi contribuer à l'enrichissement de la base de données de molécules. A ce jour, d'autres logiciels ont été développés pour générer des réseaux moléculaires, notamment MetGem [START_REF] Olivon | MetGem Software for the Generation of Molecular Networks Based on the t-SNE Algorithm [Research-article[END_REF] qui utilise la représentation t-SNE. Cette représentation permet de conserver les analogies structurales entre deux clusters, ils seront alors proches entre eux sur ce réseau, contrairement à la représentation en réseau moléculaire proposée par GNPS. Les industriels s'intéressent aussi à cette approche, en effet Thermo Fisher a ajouté à son logiciel commercial, Compound Discoverer, un outil permettant la génération de réseaux moléculaires.

En appui des réseaux moléculaires, d'autres approches de déréplication peuvent être employées. Les travaux publiés par [START_REF] Allard | Integration of Molecular Networking and In-Silico MS/MS Fragmentation for Natural Products Dereplication[END_REF] ont permis la création d'un outil en libre accèsfacilitant la déréplication des molécules par la génération d'une base de données de fragmentation in silico à partir des SMILES des molécules contenues dans le Dictionary of Natural Products par CFM-ID. Ces données ont pu être couplées directement aux réseaux moléculaires générés et ainsi permettre l'annotation de molécules. Le logiciel SIRIUS permet aussi d'attribuer un nom de composé ou une famille chimique à des molécules à partir des données LC-MS/MS [START_REF] Dührkop | SIRIUS 4: a rapid tool for turning tandem mass spectra into metabolite structure information[END_REF]. Pour un ion donné, le logiciel propose des formules moléculaires à partir des données de MS 1 et génère des arbres de fragmentation théoriques à partir des données de MS 2 . Ensuite, les données sont comparées à des fragmentations in silico de molécules présentes sur des bases de données en ligne comme SciFinder n ou PubChem, ou des bases de données personnalisées. Ainsi, le logiciel permet d'annoter les ions selon leur similarité de fragmentation avec les données in silico.

Les réseaux moléculaires basés sur les scores de bioactivité

Dans cette partie, nous allons nous focaliser sur les travaux qui ont couplé les activités biologiques d'extraits d'origine naturels avec les réseaux moléculaires afin d'identifier les métabolites responsables de l'activité ciblée.

L'intégration du fractionnement bioguidé aux réseaux moléculaires pour cibler l'isolement de molécules bioactives inconnues a été faite par [START_REF] Naman | Integrating Molecular Networking and Biological Assays To Target the Isolation of a Cytotoxic Cyclic Octapeptide, Samoamide A, from an American Samoan Marine Cyanobacterium[END_REF]. Des extraits de cyanobactéries du genre Symploca ont été analysés par LC-MS/MS et leurs activités cytotoxiques vis-à-vis de cellules cancéreuses du poumon ont été évaluées. Les réseaux moléculaires ont été générés, ensuite les noeuds et clusters des extraits les plus actifs (> 75 % de cytotoxicité) ont été conservés pour réaliser la déréplication et orienter l'isolement de ces molécules. Ici, les réseaux moléculaires ont permis la visualisation des métabolites contenus dans les extraits les plus actifs. Lors des travaux de Nothias et al. (2018) sur les activités antivirales de fractions d'un extrait d'Euphorbia dendroides vis-à-vis du virus du chikungunya, les réseaux moléculaires générés sur GNPS ont été couplés directement à la bioactivité. En effet, le degré de corrélation de Pearson a été calculé entre l'intensité de chaque ion détecté dans l'ensemble des fractions par les analyses LC-MS/MS et une donnée de bioactivité. Ici, la bioactivité est le ratio entre activité antivirale et cytotoxicité sur des cellules saines, afin d'évaluer le potentiel bioactif des molécules. Ainsi, pour chaque ion un score est attribué et la visualisation sur le réseau de cette bioactivité se fait à partir d'un seuil. Un ion dont la bioactivité est jugée élevée a un degré de corrélation de Pearson r > 0,85 et une p-value de la correction de Bonferroni < 0,03. Cette approche a permis d'annoter des ions inconnus comme des diterpènes phorboïdes et de les isoler pour confirmer leur activité contre le virus du chikungunya. Un notebook Jupyter basé sur du langage R libre d'utilisation a été créé pour calculer les scores de bioactivité et permettre l'import de ces données sur les réseaux moléculaires. Les travaux présentés dans ce manuscrit utiliseront cette approche. Récemment, des travaux utilisant les réseaux moléculaires générés par MetGem ont été couplés à des données de bioactivité. Dans cette étude, une souche de Pénicillium sclerotiorum isolée sur des termites a été utilisée pour réaliser un extrait. Ce dernier a été fractionné, puis testé contre des souches résistances d'agents pathogènes humains, en parallèle les données LC-MS/MS des fractions ont permis la génération de réseaux moléculaires. Une représentation t-SNE du réseau moléculaire a été adoptée, et les noeuds présents dans les fractions les plus efficaces ont été colorés pour ensuite être dérépliqué. Ainsi, huit azaphylones ont pu être isolé [START_REF] Hebra | Dereplication, annotation, and characterization of 74 potential antimicrobial metabolites from penicillium sclerotiorum using t-SNE molecular networks[END_REF].

Depuis la parution de cette méthodologie, elle a été reprise dans 16 articles différents à ce jour qui sont référencés dans le Tableau 1, ci-dessous. La méthode a pu être utilisée pour mettre en évidence et isoler des métabolites efficaces contre des agents pathogènes divers, par exemple bactériens [START_REF] Buedenbender | Bioactive Molecular Networking for Mapping the Antimicrobial Constituents of the Baltic Brown Alga Fucus vesiculosus[END_REF][START_REF] Hall | Investigation of the chemical composition of antibacterial Psidium guajava extract and partitions against foodborne pathogens[END_REF], parasitaires [START_REF] Dos Santos | GC-MS Analysis, Bioactivity-based Molecular Networking and Antiparasitic Potential of the Antarctic Alga Desmarestia antarctica[END_REF][START_REF] Peña-Espinoza | Anthelmintic and metabolomic analyses of chicory (Cichorium intybus) identify an industrial by-product with potent in vitro antinematodal activity[END_REF] ou mixtes bactérie-levure formant un biofilm [START_REF] Hamion | Valorization of Invasive Plant Extracts against the Bispecies Biofilm Staphylococcus aureus-Candida albicans by a Bioguided Molecular Networking Screening[END_REF]. Les matrices utilisées sont également diverses, même si ce sont majoritairement des matrices végétales, des travaux sur des souches de levures [START_REF] Buedenbender | Genomics-and metabolomics-based investigation of the deep-sea sediment-derived yeast, rhodotorula mucilaginosa 50-3-19/20[END_REF], des champignons endophytes de Fucus [START_REF] Fan | Pyrenosetins A-C, New Decalinoylspirotetramic Acid Derivatives Isolated by Bioactivity-Based Molecular Networking from the Seaweed-Derived Fungus Pyrenochaetopsis sp. FVE-001[END_REF] ou des souches de cyanobactéries ont pu être utilisées [START_REF] Bellver | Inhibition of Intestinal Lipid Absorption by Cyanobacterial Strains in Zebrafish Larvae[END_REF]. Ce sont des exemples non exhaustifs de la diversité d'activités et de matrices qui peuvent être utilisées via cette approche. Comme nous avons pu le voir, à ce jour, il n'y a pas eu d'approche de couplage direct de fractionnement bio-guidé par CPC et de réseaux moléculaires basés sur les scores de bioactivité. Nous souhaitons mettre en place cette approche dans ces travaux de thèse à partir des écoextraits de co-produits de vigne.

Chapitre I

Criblage d'extraits de vigne pour leur activité antifongique et antimycotoxine visà-vis de Fusarium graminearum

Chapitre I : Criblage d'extraits de vigne pour leur activité antifongique et antimycotoxine vis-à-vis de Fusarium graminearum 1 Introduction

La viticulture génère des co-produits divers, lors de l'entretien du vignoble qui entraine une production de biomasse ligneuse comme les sarments, les ceps et les racines ; mais aussi au cours du processus de vinification qui aboutit à la co-production de marc de raisin et de rafles.

En France en 2018, la viticulture a produit près de 8,4 millions de tonnes de bois de vigne, dont 1,3 million de tonnes de sarments et 7,1 millions tonnes de ceps et de racines [START_REF] Franceagrimer | L'Observatoire National des Ressources en Biomasse. Évaluation des ressources agricoles et agroalimentaires disponibles en France[END_REF] Une collaboration a été mise en place avec l'UR INRAE MycSA, dont une des thématiques de porte sur la recherche de solutions dans la lutte face aux contaminations fongiques des céréales.

Les travaux récents au sein de cette équipe sur les matrices végétales riches en composés phénoliques ont mis en avant le rôle antifongique et antimycotoxine de ces métabolites sur F. graminearum [START_REF] Atanasova-Pénichon | Bioguided Isolation, Characterization, and Biotransformation by Fusarium verticillioides of Maize Kernel Compounds That Inhibit Fumonisin Production[END_REF]Ferruz et al., 2016;Montibus et al., 2021). C'est dans ce contexte que nous avons choisi de travailler sur les co-produits de la filière viticole riches en composés phénoliques.

Les extraits de bois de vigne ont déjà montré des activités vis-à-vis d'agents pathogènes fongiques de la vigne, de plus ces extraits sont riches en composés phénoliques. Cette matrice végétale semblait donc être un candidat intéressant pour inhiber la croissance fongique et la production de mycotoxines. C'est à partir de ce constat qu'un travail de criblage à partir d'extraits issus de différents cépages et parties de vigne a été mené sur des cultures de F. graminearum afin d'identifier les extraits les plus efficaces sur l'inhibition de la croissance du champignon et la production de ses mycotoxines associées, des TCTB. Le criblage biologique permettra de sélectionner les extraits les plus efficaces pour la suite de l'étude.

Dans ce chapitre, nous allons tout d'abord présenter les méthodes d'éco-extraction utilisées pour l'obtention d'extraits de co-produits de vigne. Ces éco-extraits seront ensuite caractérisés notamment par le dosage de leur contenu en stilbènes. Dans le but d'évaluer les activités antifongique et antimycotoxine des éco-extraits, nous avons mis au point une méthode de criblage qui sera présentée. Enfin, l'étude sur le criblage des deux bioactivités ciblées sera détaillée. Les solvants ont été éliminés des extraits par évaporation sous pression réduite à l'aide d'un évaporateur rotatif, puis l'eau résiduelle a été congelée dans de l'azote liquide avant lyophilisation de l'extrait pendant 24 à 48 h. Une fois les extraits secs obtenus, ils ont été conservés dans des flacons ambrés à température ambiante et à l'abri de la lumière.

Production d'éco-extraits enrichis en stilbènes

Matériels et méthodes

Extractions hydro-éthanoliques

Dans le but d'adopter une démarche de chimie verte utilisant des solvants avec un impact réduit sur la santé, l'environnement et qui soient utilisables en toute sécurité, notre choix s'est porté sur l'utilisation de l'éthanol comme solvant d'extraction (Chemat et al., 2012b;[START_REF] Prat | A survey of solvent selection guides[END_REF].

Ainsi, les 13 co-produits de vigne ont été extraits en utilisant les paramètres d'extraction de l'ASE préalablement décrits (Partie 2.1.2.1) avec un mélange éthanol/eau (85/15, v/v). Une fois les extraits secs obtenus, une partie a été conservé sec dans des flacons ambrés à température ambiante et à l'abri de la lumière. Une autre partie a été utilisé pour réaliser des solutions mères à 25 mg/mL dans de l'éthanol 100 % et sont conservées à -20 °C.

Extractions à l'eau sous-critique

Des extraits aqueux ont également été obtenus au moyen de l'ASE, à une température de 160 °C et une pression de 10 Mpa. Les paramètres d'extraction appliqués ont été les mêmes que ceux décrits pour les extractions hydro-éthanoliques. Le montage de la cellule a été similaire à celui présenté sur la Figure 3, seul le type de filtre a été modifié par un filtre en fibre de verre (ASE Extraction Glass Fiber filters, Dionex Corporation, Sunnyvale, CA), qui est adapté à des températures élevées comme ici. Les extractions à l'eau sous-critique ont été réalisées en duplicat sur une sélection restreinte de co-produits, à savoir les sarments de Tannat, les ceps de Sauvignon blanc, les racines de Merlot, de Sauvignon blanc, de Cabernet sauvignon et de Tannat.

Activités antioxydantes

Le test au 2,2-diphényl 1-picrylhydrazyle (DPPH) a été réalisé sur les 13 éco-extraits dans des plaques 96 puits. Pour cela 50 µL de chaque extrait préalablement solubilisé dans le mélange méthanol/eau (50/50, v/v) à une concentration de 0,25 mg/mL ont été déposés dans les puits suivis de 150 µL de solution méthanolique de DPPH à 200 µM. Un témoin négatif, sans extrait, mais avec le mélange méthanol/eau, ainsi qu'un blanc, sans réactif, mais avec du méthanol, ont été préparés. Une fois le réactif ajouté, les plaques ont été incubées pendant 20 min à 37 °C à l'obscurité, puis l'absorbance à 520 nm a été mesurée au lecteur de plaque (FLUOstat OPTIMA, BMG Labtech, Durham, New-York, USA). Profils stilbéniques des extraits hydro-éthanoliques Afin de connaître les profils en stilbènes des extraits hydro-éthanoliques de co-produits de la vigne obtenus par ASE, 9 stilbènes ont été dosés par HPLC-DAD. Le choix s'est porté sur des stilbènes de différents degrés d'oligomérisation qui sont connus pour être présents dans ces parties de la vigne [START_REF] Gabaston | Wood and roots of major grapevine cultivars and rootstocks: A comparative analysis of stilbenes by UHPLC-DAD-MS/MS and NMR[END_REF][START_REF] Goufo | A Reference List of Phenolic Compounds (Including Stilbenes) in Grapevine (Vitis vinifera L.) Roots, Woods, Canes, Stems, and Leaves[END_REF], parmi eux des monomères (Eresvératrol La Figure 7 montre que l'ensemble des extraits hydro-éthanoliques analysés contiennent des stilbènes. Nous pouvons noter une variation de la concentration en stilbènes selon les extraits, en effet la teneur en stilbènes dosés varie de 34 mg/g d'extrait pour les sarments de Cabernet sauvignon à 272 mg/g pour les ceps de Merlot (Figure 7), ce qui représente respectivement 3,4 % et 27,2 % de la masse de l'extrait. Au sujet des composés dosés, ils représentent entre 0,1 et 1,7% de la masse totale de bois sec. Trois extraits se démarquent parmi les 13, à savoir les extraits de sarments de Merlot, de Cabernet sauvignon et d'Artaban. En effet, ces 3 extraits issus de cépages rouges présentent des quantités en stilbènes inférieures à 100 mg/g. Les éco-extraits hydro-éthanoliques de co-produits de la vigne préalablement obtenus ont été testés sur des cultures fongiques de F. graminearum. Dans cette partie, seront présentés les travaux portant sur le criblage des activités antifongique et antimycotoxine vis-à-vis de cet agent phytopathogène et la mise au point au préalable de cette méthode. Cette étape de criblage a pour objectif de sélectionner les extraits les plus actifs pour la suite des expérimentations. Le milieu de culture Gardiner a été choisi pour l'étude de l'effet des extraits sur la croissance fongique car il permet d'obtenir un développement rapide et homogène de F. graminearum avec l'obtention d'une biomasse conséquente. Pour 1 L de milieu, 30 g de D(+)-saccharose (Acros Organics), 2 g de NaNO3 (Sigma-Aldrich), 1 g de KH2PO4 (Sigma-Aldrich), 0,5 g de MgSO4 (Sigma-Aldrich), 0,5 g/L de KCl (Riedel-de Haën), 0,01 g de FeSO4 (Sigma-Aldrich) et 0,1 mL de solution de nutriment de Vogel sont nécessaires [START_REF] Gardiner | Nutrient profiling reveals potent inducers of trichothecene biosynthesis in Fusarium graminearum[END_REF]. Chaque puits d'une plaque 24 puits a été comblé par 2 mL de ce milieu de culture, puis 10 µL d'extrait hydro-éthanolique ont été déposés pour atteindre des concentrations finales allant de 5 à 125 mg/L et une concentration éthanolique de 0,5 %. La solubilisation des extraits dans l'éthanol permet de faciliter leur solubilité dans le milieu de culture majoritairement aqueux, et le faible pourcentage d'éthanol n'impacte que très faiblement le développement de F. graminearum. Enfin, 20 µL de l'inoculum ont été ajoutés dans les puits pour atteindre une concentration finale de 5.10 3 spores/puits. Pour chaque condition, 6 puits ont été inoculés et 3 puits sont restés sans inoculum, ces derniers servant à connaitre l'absorbance du milieu de culture complémenté par les différents extraits. Les plaques ont été placées en chambre de culture à 25 °C à l'obscurité pendant au moins 6 jours.

Matériels et méthodes

Le milieu de culture MS favorisant la production de TCTB par F. graminearum a été utilisé pour l'étude de l'effet des extraits sur la production de mycotoxines par le champignon. Ce milieu est constitué pour 1 L, de 20 g de D-(+)-glucose (Sigma-Aldrich), 0,5 g de KH2PO4 (Scharlau), 0,6 g de K2HPO4, 017 g de MgSO4 (Sigma-Aldrich), 1 g de (NH4)2SO4 (Sigma-Aldrich) et 0,1 mL de solution de nutriment de Vogel [START_REF] Boutigny | Ferulic acid, an efficient inhibitor of type B trichothecene biosynthesis and Tri gene expression in Fusarium liquid cultures[END_REF]. La préparation des puits est semblable à celle décrite ci-dessus pour le milieu Gardiner. Une fois inoculées, les plaques ont été mises en culture à 25 °C dans l'obscurité pendant au moins 10 jours.

Pour l'ensemble des cultures, des puits complémentés par 0,5 % d'éthanol ont servi de témoins négatifs, alors que des puits contenant du tébuconazole (TEB) à 0,2 µM et 0,5 % d'éthanol ont été utilisés comme témoins positifs. Le TEB a été préparé au préalable dans de l'éthanol. L'acide caféique (AC) à 3 mM a été utilisé comme témoin positif.

Pour les cultures sur plaque 96 puits, un volume plus petit (300 µL) et des temps de cultures plus courts ont été nécessaires (4 à 6 jours). Pour chaque condition en plaque 96 puits, 3 réplicats non-inoculés et 6 réplicats inoculés ont été préparés. Une fois les TCTB dosés dans le milieu, la concentration en mycotoxine a été exprimée en fonction de la biomasse mycélienne en µg de mycotoxine/mg de biomasse sèche. Puis, comme pour la croissance fongique, le pourcentage d'inhibition a été déterminé en comparant chaque échantillon avec le contrôle négatif.

Mise au point des conditions de cultures

Une étape de mise au point a été nécessaire afin de déterminer des conditions de culture de F. graminearum pour le criblage des extraits hydro-alcooliques dans le but de connaitre leur potentiel antifongique et antimycotoxine. Cette étape a notamment permis de choisir la souche de F. graminearum, le milieu de culture ainsi que répondre aux contraintes liées à l'emploi des extraits obtenus par ASE. L'objectif général de cette étape de mise au point était de pouvoir réaliser des analyses robustes et rapides, permettant de déterminer l'activité antifongique et antimycotoxine lors d'une seule expérimentation.

Nous devions faire face à certaines contraintes, notamment la quantité d'extrait disponible. Nous avions à notre disposition entre 180 et 470 mg au moins 180 mg d'extrait qui doivent être utilisés pour les essais biologiques, mais aussi pour les analyses chimiques. Ainsi, nous avons décidé de ne pas réaliser les cultures sur des boîtes de Pétri qui nécessitent au moins 8 mL de milieu de culture. Nous avons donc travaillé sur des microplaques 24 ou 96 puits, qui nécessitent des plus petits volumes. Toutefois, le passage sur microplaque a requis une mise au point, notamment sur le temps de culture et sur la méthode de mesure de la croissance fongique.

L'utilisation d'extraits hydro-éthanoliques (85/15, v/v, éthanol/eau) dans des milieux de culture majoritairement aqueux peut poser des problèmes de solubilisation. Face à cette contrainte, nous pouvons utiliser un faible pourcentage de solvant pour faciliter la solubilisation des extraits, dans la mesure où le solvant n'impacte pas ou peu la croissance du champignon et la production de mycotoxine.

Impact de la concentration de l'extrait sur la croissance de F. graminearum

Une première culture sur plaque 24 puits nous a permis de tester un extrait de sarment Choix de la méthode de suivi de la croissance fongique

Le suivi de la croissance s'est fait par mesure d'absorbance des milieux de culture inoculés, nous avons réalisé des mesures à la fois à 630 et 750 nm, comme cela a déjà pu être fait sur des cultures de champignons filamenteux [START_REF] Frąc | Fast and Accurate Microplate Method (Biolog MT2) for Detection of Fusarium Fungicides Resistance/Sensitivity[END_REF][START_REF] Langvad | A rapid and efficient method for growth measurement of filamentous fungi[END_REF]. Les mesures faites aux deux longueurs d'onde suivent la même tendance pour les conditions de culture avec le champignon seul (Figure 9 Le dosage des mycotoxines dans les milieux de culture n'a pas pu être réalisé, en effet lors de l'arrêt de culture le volume de milieu restant dans les puits était trop faible pour réaliser l'extraction des TCTB. Ce manque de volume peut être dû au faible volume de milieu par puits (300 µL) et à une consommation importante du milieu par le champignon.

En milieu de culture liquide, les souches de F. graminearum de chémotype DON/15ADON, comme celle utilisée ici, produisent plutôt du 15ADON que du DON [START_REF] Pestka | Deoxynivalenol and 15-monoacetyl deoxynivalenol production by Fusarium graminearum R6576 in liquid media[END_REF]. Le dosage des TCTB s'est donc focalisé sur le 15ADON à partir des milieux de culture des microplaques 24 puits, au bout de 7 jours pour le milieu Pour ces deux expérimentations, des conditions de témoins négatifs (Milieu +EtOH) et de contrôles positifs (TEB) seront réalisées.

Evaluation de l'activité antifongique des extraits hydro-éthanoliques

Dans cette partie sont présentés les résultats du criblage des 13 éco-extraits hydro-éthanoliques de co-produits de vigne pour les activités antifongiques. Les propriétés biologiques de chaque extrait ont été exprimées en concentration inhibitrice médiane (CI50) et pourcentage d'inhibition de la croissance fongique afin de juger de leurs activités biologiques et sélectionner les extraits les plus intéressants.

Les résultats présentés sont ceux réalisés à partir des mesures prises à J5. La CI50, exprimée en milligramme d'extrait par litre de milieu de culture dans le Tableau 6, témoigne de la concentration nécessaire d'extrait pour inhiber de 50 % la croissance de F. graminearum après 5 jours de culture. Pour certains extraits, nous n'avons pas déterminé une valeur précise de CI50 mais un intervalle, en raison d'un manque de données biologiques pour déterminer une CI50 précise. Parmi les 13 extraits testés, 10 ont présenté des activités antifongiques à au moins une des concentrations testées. Ce n'est pas le cas pour les extraits issus de sarments de Merlot, Cabernet sauvignon et Artaban qui ont tous induit la croissance du champignon après 5 jours de culture. Les extraits avec les CI50 les plus faibles, donc les plus actifs, sont ceux de racine de Merlot (CI50 = 11 mg/L), de Cabernet sauvignon (CI50 = 34 mg/L) et de Tannat (25 < CI50 < 50 mg/L), ainsi que les ceps de Sauvignon blanc (25 < CI50 < 50 mg/L).

Tableau 6 : Concentration inhibitrice médiane (CI50, en mg/L) de la croissance fongique de F. graminearum par les extraits hydro-éthanoliques de co-produits de la vigne après 5 jours de culture n/a : condition non testée. -: CI50 non applicable car il n'y a pas eu d'inhibition de croissance fongique observée. Nous avons observé une tendance à un gradient d'activité des extraits obtenus à partir des pieds de vigne allant de haut en bas. Ce gradient peut être mis en parallèle avec le gradient d'oligomérisation des stilbènes qui est retrouvé au sein d'un pied de vigne [START_REF] Gabaston | Wood and roots of major grapevine cultivars and rootstocks: A comparative analysis of stilbenes by UHPLC-DAD-MS/MS and NMR[END_REF], où le degré d'oligomérisation des stilbènes augmente en descendant dans la plante. De ce constat, nous avons émis l'hypothèse que l'activité antifongique pouvait être portée par les oligomères de stilbènes présents majoritairement dans les racines de vigne, et ainsi nous donner des pistes pour la mise en évidence de métabolites bioactifs contenus dans les co-produits de la vigne.

Merlot

Evaluation de l'activité antimycotoxine des extraits hydro-éthanoliques

Les résultats précédents sur l'activité antifongique obtenus sur milieu Gardiner nous ont permis d'avoir une idée de la concentration des extraits à tester pour déterminer leur activité antimycotoxine. Pour pouvoir étudier l'effet antimycotoxine des extraits, il est important de choisir une concentration d'extrait qui n'affecte pas la croissance fongique. En effet, les phénomènes qui affectent le développement du champignon et la production de mycotoxine sont induits par des mécanismes différents, eux-mêmes régis par des gènes distincts chez F. graminearum [START_REF] Boutigny | Ferulic acid, an efficient inhibitor of type B trichothecene biosynthesis and Tri gene expression in Fusarium liquid cultures[END_REF]. Ainsi, notre choix s'est porté sur une concentration faible en extrait de 25 mg/L.

La Figure 13 montre l'effet des extraits à 25 mg/L sur la biomasse sèche après 10 jours de culture. Parmi les 13 extraits testés, seulement ceux issus des racines de Tannat et de Merlot impactent négativement la croissance du champignon de manière significative. De plus, 4 extraits de sarments de vigne activent significativement la croissance fongique Ces résultats sont cohérents avec ceux obtenus précédemment lors du criblage des extraits sur milieu Gardiner. Les résultats du dosage de 15ADON mesurés dans le milieu de culture sont représentés sous forme de pourcentage d'inhibition de la production de 15ADON en comparaison avec le contrôle négatif dans le Tableau 8. L'ensemble des extraits ont une activité antimycotoxine significative à 25 mg/L vis-à-vis de la production de 15ADON par F. graminearum. L'inhibition de la production de mycotoxine varie de 55 % pour l'extrait de sarment de Cabernet sauvignon, jusqu'à 98 % pour celui de racine de Tannat. De plus, un cépage semble être plus intéressant que les autres, à savoir le cépage Tannat. En effet, les extraits issus de ce cépage inhibent entre 85 et 98 % la production de mycotoxine.

Tableau 8 : Pourcentage d'inhibition de la production de 15ADON par les extraits éthanoliques de co-produits de la vigne à 25 mg/L après 10 jours de culture *Différence significative en comparaison avec les conditions témoins (Milieu MS + 0,5 % EtOH) à une p-value < 0,05 par le test de Kruskal-Wallis. n/a condition non testée. Contrôle positif, TEB 0,1 µM = 33 % Des travaux menés en 2021 sur des extraits de sarment de vigne obtenus par extraction à l'eau sous-critique ont pu mettre en évidence que des co-produits de la vigne sont efficaces pour inhiber la production de 15ADON et de DON par F. graminearum (Montibus et al., 2021). Néanmoins, les extraits ont été appliqués à une concentration de 100 mg/L pour une inhibition de 46 % de la production de mycotoxine. Les résultats que nous avons obtenus confirment le potentiel de ces extraits de vigne pour contrôler la production de TCTB, mais aussi montrent qu'une concentration de 25 mg/L est suffisante pour impacter de manière significative la production de toxine. D'autres matrices végétales riches en composés phénoliques montrent une forte activité antimycotoxine, mais à des concentrations plus importantes. En effet, il faut respectivement 40 mg/L et 50 mg/L d'extraits méthanoliques de spiruline (Spirulina sp.) et de Nannochloropsis sp. pour inhiber de 100 % et 97 % la production de DON par F. graminearum (Scaglioni et al., 2019). En comparaison avec ces travaux, les extraits hydro-éthanoliques de co-produits sont efficaces à plus faible concentration ; Néanmoins ces résultats sont à prendre avec précaution, car les protocoles utilisés sont différents d'une étude à l'autre et les résultats peuvent être différents selon les souches étudiées (Montibus et al., 2021).

Evaluation des activités antifongique et antimycotoxine des extraits obtenus à l'eau sous-critique

Une autre méthode d'extraction a également été utilisée pour obtenir des éco-extraits riches en stilbènes. Cette méthode d'extraction utilise l'eau comme solvant d'extraction, qui est recommandé pour des méthodes de chimie verte (Chemat et al., 2012b). La combinaison d'une température et d'une pression élevées permet de maintenir l'eau dans un état liquide, tout en modifiant certaines de ses propriétés physico-chimiques, c'est l'état sous-critique de l'eau (Figure 14). Dans cet état, la polarité de l'eau est abaissée, ainsi des molécules moins polaires qui ne seraient pas extractibles dans des conditions d'extraction aqueuse par macération peuvent l'être. Cette méthode a pu être appliquée à l'extraction de différents composés phénoliques, comme les acides phénoliques, des flavonoïdes et des stilbènes [START_REF] Gabaston | Subcritical water extraction of stilbenes from grapevine byproducts: A new green chemistry approach[END_REF][START_REF] Ko | Pilot-scale subcritical water extraction of flavonoids from satsuma mandarin (Citrus unshiu Markovich) peel[END_REF][START_REF] Pinto | Optimizing the extraction of phenolic antioxidants from chestnut shells by subcritical water extraction using response surface methodology[END_REF]. Concernant la croissance fongique, nous avons constaté que l'ensemble des extraits favorisent le développement de la biomasse mycélienne après 10 jours de culture, comme nous pouvons le voir sur la Figure 17. Cette induction de biomasse mycélienne est importante, par exemple la biomasse est doublée en présence d'extrait SWE de racine de Tannat par rapport au contrôle et cela quelle que soit la concentration testée. Cet effet inducteur de la croissance fongique n'avait pas été observé lors du criblage des extraits hydro-éthanoliques. Toutefois, des effets similaires ont pu être observés sur des cultures de F. graminearum complémentées avec des extraits SWE de co-produits ligneux de pin maritime et de vigne (Montibus et al., 2021). Cette augmentation de la biomasse pourrait être liée à la présence dans les extraits de composés favorables au développement mycélien comme des sucres. Comme nous l'avons précisé précédemment, l'extraction à l'eau sous-critique permet d'extraire des hémicelluloses à partir du bois et il a été montré que F. graminearum possède des xylanases et xylosidases nécessaires pour la saccharification des hémicelluloses en sucres simples assimilables par le champignon [START_REF] Carapito | Efficient hydrolysis of hemicellulose by a Fusarium graminearum xylanase blend produced at high levels in Escherichia coli[END_REF].

Merlot

Conclusion

L'objectif de cette première partie était d'obtenir des éco-extraits de co-produits de vigne à partir de différents cépages et parties de vigne, puis d'évaluer l'activité antifongique et antimycotoxine de ces extraits vis-à-vis de F. graminearum et d'identifier les extraits les plus intéressants.

Les extraits hydro-éthanoliques et aqueux à partir de co-produits de la vigne ont été réalisés et testés sur des cultures de F. graminearum. Cette étape de criblage a nécessité une étape de mise au point qui a permis de tester les activités sur microplaque 24 puits.

Les essais réalisés sur des cultures de F. graminearum ont montré que les extraits hydroéthanoliques sont plus intéressants pour inhiber à la fois la croissance du champignon et la production de mycotoxine en comparaison avec les extraits à l'eau sous-critique. Les parties racinaires et les ceps semblent être les parties les plus intéressantes pour inhiber la croissance fongique. L'ensemble des extraits ont montré une activité antimycotoxine supérieure à 55 % lorsqu'ils sont testés à 25 mg/L, et les extraits de sarments et de racines de Tannat sont les plus efficaces avec des inhibitions de la concentration de 15ADON supérieures à 94 %. A notre connaissance, c'est la première fois que des travaux de criblage sur différentes parties de bois de vigne contre ce champignon ont montré des résultats intéressants, et donc cela souligne le potentiel de ces co-produits de la viticulture comme une possible voie de valorisation.

En parallèle, le dosage de 9 stilbènes a permis d'avoir une première idée du contenu stilbénique des extraits. Ces informations mises en parallèles avec les essais biologiques laissent supposer que les oligostilbènes seraient peut-être des marqueurs d'activité antimycotoxine.

La suite des travaux reposera sur l'étude du profil métabolique du panel d'extraits hydroéthanoliques en vue de mettre en évidence les composés responsables de l'activité antifongique ou antimycotoxine sur les cultures de F. graminearum.

Chapitre II

Mise en évidence des métabolites antifongiques par une approche de métabolomique non-ciblée

Chapitre II : Mise en évidence des métabolites antifongiques par une approche de métabolomique non-ciblée 1 Introduction

Dans le premier chapitre, nous avons montré que des extraits hydro-éthanoliques de co-produits de vigne sont efficaces pour inhiber la croissance fongique et la production de 15ADON chez une souche de F. graminearum. Le dosage des 9 stilbènes communs dans la vigne a mis en évidence une diversité de teneurs selon les parties d'un pied de vigne ou bien même des cépages. Les premières observations entre activité biologique et contenu stilbénique tendent à montrer que les extraits les moins riches en ces stilbènes sont aussi les moins efficaces pour inhiber la croissance du champignon. Ainsi, nous pensons que cette famille de composés semble jouer un rôle important pour l'activité biologique des extraits de co-produits de vigne.

Dans ce chapitre, notre objectif est d'identifier quels pourraient être les marqueurs moléculaires des activités antifongique et antimycotoxine. Nous avons fait le choix d'analyser les extraits par UHPLC-HRMS/MS avec des méthodes d'analyses orientées vers la séparation et la détection des composés phénoliques, notamment les stilbènes, et ceci en raison des teneurs importantes en ces composés dans la vigne [START_REF] Goufo | A Reference List of Phenolic Compounds (Including Stilbenes) in Grapevine (Vitis vinifera L.) Roots, Woods, Canes, Stems, and Leaves[END_REF].

Dans le but d'identifier les déterminants métaboliques de bioactivité dans les extraits, nous avons mis en place une analyse métabolomique non-ciblée. Afin d'y parvenir, nous nous appuierons sur les données de spectrométrie de masse pour d'une part, réaliser des analyses statistiques multivariées afin identifier les métabolites discriminants dans les extraits (M. [START_REF] Kim | Metabolomics approach to identify the active substances influencing the antidiabetic activity of Lagerstroemia species[END_REF]. Nous emploierons également une approche basée sur les réseaux moléculaires liés aux scores de bioactivité dans le but de mettre en évidence les métabolites et les familles chimiques corrélés positivement à la bioactivité [START_REF] Nothias | Bioactivity-Based Molecular Networking for the Discovery of Drug Leads in Natural Product Bioassay-Guided Fractionation[END_REF]. Enfin, des outils de déréplication seront utilisés afin d'identifier la nature des métabolites précédemment discriminés.

Matériels et méthodes

Analyse des extraits par UHPLC-UV-HRMS/MS

Préparation des échantillons

Les 13 extraits hydro-éthanoliques de co-produits de vigne ont été analysés par UHPLC-UV-HRMS/MS. Les échantillons ont été préparés à une concentration de 1 mg/mL à partir de 40 µL de solutions mères à 25 mg/mL (cf Partie 2.1.2.2) et de 960 µL d'un mélange acétonitrile Optima LC-MS grade (Thermo Fisher Scientific, Illkirch, France) et d'eau milliQ dans les proportions 50/50 (v/v). Les échantillons ont été filtrés sur filtres PTFE hydrophiles de porosité 0,2 µm (Millex, Merck).

Des molécules pures stilbéniques de la chimiothèque du MIB (fournies par Pr. Pierre Waffo Téguo) ont également été injectées par infusion directe en spectrométrie de masse pour optimiser les paramètres de source dans le but d'obtenir une meilleure réponse à la détection de ces composés. Chacune des 9 molécules préalablement dosées (cf Partie 2.1.4) ont été préparées à une concentration de 50 µg/mL à partir d'une solution mère à 100 µg/mL (méthanol/eau, 50/50 v/v) diluée au demi dans un mélange acétonitrile Optima/eau milliQ 50/50 (v/v). Les préparations de molécules pures ont été filtrées de la même manière que les échantillons. Des mélanges de stilbènes ont été réalisés à partir des solutions à 50 µg/mL, comme décrits dans le Tableau 9.

Tableau 9 : Mélanges de stilbènes injectés par infusion directe en spectrométrie de masse et rapports masse/charge (m/z) des ions pseudo-moléculaires associés La séparation chromatographique a été faite à un débit de 0,4 mL/min en utilisant comme solvant d'élution l'eau milliQ acidifiée à 0,1 % d'acide formique (AF ; Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical) (solvant A) et l'acétonitrile acidifié à 0,1 % AF (solvant B). La séparation chromatographique a été faite selon le gradient de solvants présenté dans le Tableau 10. Ces longueurs d'onde sont propres à l'analyse des composés phénoliques et stilbéniques, l'absence de double liaison entre les deux groupements phénoliques se traduit par une absorbance maximale aux alentours de 280 nm, comme pour l'ampélopsine A ou le pallidol [START_REF] Khan | Pallidol, a resveratrol dimer from Cissus pallida[END_REF][START_REF] Reniero | Identification of two stilbenoids from Vitis roots[END_REF]. Tandis que la présence d'une double liaison en configuration trans induit des λmax de 306 et 320 nm, comme pour le E-resvératrol et la rviniférine (vitisine B) [START_REF] Langcake | The production of resveratrol by Vitis vinifera and other members of the Vitaceae as a response to infection or injury[END_REF][START_REF] Oshima | Novel oligostilbenes from Vitis coignetiae[END_REF]. Les analyses faites à 254 nm permettent de détecter des métabolites connus dans la vigne avec des λmax proches comme des flavonols, des dérivés d'acides hydroxybenzoïques, d'acides hydroxycinnamiques ou encore l'acide ellagique [START_REF] Pereira | HPLC-DAD methodology for the quantification of organic acids, furans and polyphenols by direct injection of wine samples[END_REF][START_REF] Xiang | Health benefits of wine: Don't expect resveratrol too much[END_REF].

Mélange

L'analyse des données de spectrométrie de masse s'est faite en mode balayage (Full scan) pour la MS 1 avec une gamme de masses comprise entre m/z 80 et m/z 1200 en mode d'ionisation négatif. La charge par défaut a été de m/z 1, avec une commande automatique de gain (AGC target) de 1 × 10 6 et une résolution de 70000. Les analyses en tandem ont été réalisées en mode Data Dependant Acquisition (ddMS 2 ) avec une sélection des 5 ions les plus intenses, une résolution de 17500, une fenêtre d'isolement de m/z 1, un seuil d'intensité de 1,6 × 10 5 , un AGC target de 1 × 10 5 et en appliquant une énergie de collision normalisé (NCE) de manière échelonnée à 20, 35 et 50 eV). Les données ont été acquises au format centroïde.

Feature list blank subtraction

Blank raw data files : 2 Minimum # of detection in blanks : 2 Fold change increase : 300 % Deux fichiers ont pu ainsi être générés pour permettre les analyses statistiques multivariées, la génération de réseaux moléculaires et le calcul de score de bioactivité : un fichier au format .csv contenant les informations sur les ions détectés en MS 1 , à savoir le numéro d'identification (ID), le ratio masse sur charge en mode d'ionisation négatif (m/z de l'ion parent), le temps de rétention (tR) ainsi que l'aire sous le pic de l'ion détecté dans chacun des échantillons (UA) ; un second fichier au format .mgf recensant les rapports m/z et l'abondance des ions fils obtenus après fragmentation de chaque ion parent. La construction du chromatogramme est réalisable grâce à l'algorithme ADAP intégré dans le logiciel MZmine [START_REF] Myers | One Step Forward for Reducing False Positive and False Negative Compound Identifications from Mass Spectrometry Metabolomics Data: New Algorithms for Constructing Extracted Ion Chromatograms and Detecting Chromatographic Peaks[END_REF].

Analyses statistiques multivariées

A la liste de masses obtenue lors de l'étape précédente, les données d'activités biologiques présentées dans le chapitre I ont été ajoutées. Pour les activités antifongiques de chacun des extraits, les données ont été incluses sous forme de pourcentage d'inhibition après 5 jours de culture avec 125 mg/L d'extrait (données quantitatives) ou bien sous forme qualitative en précisant si un extrait est actif ou inefficace. Au sujet des activités antimycotoxine, les données sont exprimées en pourcentage d'inhibition. Un extrait est jugé actif quand le pourcentage d'inhibition de l'activité étudié est significativement différent du contrôle, a contrario s'il n'y a pas de différence avec le contrôle ou si l'extrait active une réponse du champignon (pourcentage négatif), l'extrait est jugé inefficace.

La liste de masses obtenue a ensuite été importée sur le logiciel SIMCA (version 16, Sartorius, Göttingen, Allemagne) afin de réaliser dans un premier temps une mise à l'échelle des données en utilisant la méthode de Pareto afin de réduire l'importance accordée aux valeurs fortes tout en préservant la structure des données [START_REF] Di Guida | Non-targeted UHPLC-MS metabolomic data processing methods: a comparative investigation of normalisation, missing value imputation, transformation and scaling[END_REF][START_REF] Van Den Berg | Centering, scaling, and transformations: improving the biological information content of metabolomics data[END_REF]. Ces données mises à l'échelle ont permis la réalisation d'analyses en composantes principales (ACP) afin d'observer la distribution des échantillons analysés. Des groupes d'échantillons ont été constitués en opérant une analyse de cluster hiérarchique (ACH). Des analyses statistiques supervisées ont été réalisées via une analyse discriminante de la régression des moindres carrés partiels (PLS-DA) afin d'identifier les ions qui permettent la discrimination des extraits bioactifs de ceux qui ne le sont pas. Les importances des variables en projections (VIPs) ont été calculées et celles dont la valeur est supérieure à 1,5 ont été conservées afin de mettre en place des analyses supervisées complémentaires. Ainsi, l'analyse discriminante de la régression orthogonale des moindres carrés partiels (OPLS-DA) entre les échantillons bioactifs et inefficaces a été faites sur les VIPs > 1,5. Ceci a permis la génération d'une représentation en S (S-plot) permettant d'observer la distribution des métabolites sur deux axes selon leur degré de corrélation avec une modalité (bioactifs ou inefficaces) et leur covariance. Les métabolites ayant une valeur de corrélation pcorr > |0,7| et de covariance p > |0,05| sont été jugés comme discriminants pour un groupe ou une modalité [START_REF] Wheelock | Trials and tribulations of 'omics data analysis: Assessing quality of SIMCA-based multivariate models using examples from pulmonary medicine[END_REF]. La fiabilité des modèles PLS-DA et OPLS-DA a été évaluée par un test ANOVA de validation croisée (CV-ANOVA) dont la p-value doit être inférieure à 0,05 ; ainsi que par la réalisation d'un tableau des erreurs de classification validé par un test de Fisher (misclassification table) [START_REF] Eriksson | CV-ANOVA for significance testing of PLS and OPLS® models[END_REF].

Génération des réseaux moléculaires basés sur la bioactivité (BBMN)

Génération des réseaux moléculaires par GNPS

Les réseaux moléculaires ont été générés sur la plateforme en ligne GNPS (Wang et al., 2016) avec le processus (en anglais, workflow) de Feature-Based Molecular Networking version 28.2 (FBMN, [START_REF] Nothias | Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment[END_REF].

Sur les réseaux, les liens entre deux ions sont générés sur la base de la similarité de leur spectre de fragmentation en masse en prenant en compte les paramètres précisés dans le Tableau 12, notamment le partage d'au moins 5 fragments ou pertes de masse communes (Minimum Matched Fragment Ions), une différence de masse entre les ions parents inférieure à 500 Da (Maximum shift between precursors), ainsi qu'un score de similarité (minimum pairs cosine) d'au moins 0,7. En parallèle, une annotation automatique des ions a été proposée par comparaison des spectres de fragmentation avec ceux présents dans les bases de données en ligne de GNPS. Les paramètres utilisés pour qu'un ion corresponde à un composé d'une base de données ont été : 6 fragments de MS 2 appariés (Library Search Min matched Peaks), un score seuil de similarité (score threshold) de 0,7 ainsi qu'une différence de masse avec l'analogue inférieure à 100 Da (Maximum Analog Search Mass Difference). Lorsque ces conditions ont été réunies, une proposition de métabolite a alors été soumise pour l'identification de l'ion.

La création des FBMN a généré différents fichiers exportables pour permettre la visualisation des réseaux moléculaires.

Calcul des scores de bioactivité des métabolites

En parallèle de la création des réseaux moléculaires, un score de bioactivité a été calculé pour chacun des ions détectés dans les extraits hydro-éthanoliques. Ce calcul de score a été fait à partir du protocole développé par [START_REF] Nothias | Bioactivity-Based Molecular Networking for the Discovery of Drug Leads in Natural Product Bioassay-Guided Fractionation[END_REF].

Deux scores de bioactivité différents ont été calculés. Dans un premier temps, pour calculer les scores correspondant aux activités antifongiques, les pourcentages d'inhibition de la croissance fongique de F. graminearum après 5 jours de culture sur milieu Gardiner en présence de 125 mg/L d'extraits ont été utilisés (cf Tableau 7, Chapitre I partie 3.3). Dans un second temps, pour exprimer les scores d'activité antimycotoxine, les pourcentages d'inhibition de la production de 15ADON dans les milieux de culture MS après 10 jours de culture ont été utilisés (cf Tableau 8, Chapitre I partie 3.4).

Pour calculer les scores de bioactivité, les pourcentages d'inhibition fongique ou de la production de mycotoxine ont été ajoutés à la liste de masses centrées-réduites obtenue après traitement statistique sur SIMCA (cf. Partie 2.2.3). Cette liste de masses contenant la bioactivité a ensuite été importée sur le notebook Jupyter développé par [START_REF] Nothias | Bioactivity-Based Molecular Networking for the Discovery of Drug Leads in Natural Product Bioassay-Guided Fractionation[END_REF]. Une modification du script a été réalisée afin de supprimer l'étape de normalisation des données d'aire sous le pic de chaque ion (feature) car une étape équivalente a été réalisée au préalable sur SIMCA sur le jeu de données.

Le script consiste en une succession d'étapes afin de mettre en forme les données pour réaliser un test de corrélation de Pearson (r) suivi d'une validation de ce test par une correction de Bonferonni (p-value corrected). Ainsi une matrice de corrélation est réalisée pour chaque ion entre l'aire sous le pic détecté en MS 1 dans chaque extrait et l'activité biologique de ces derniers. La combinaison de ces deux valeurs permet d'attribuer un score de bioactivité à chacun des ions détectés. Les ions dont la valeur de corrélation et de signification statistique sont respectivement supérieure à 0,85 et inférieure à 0,05 sont jugés comme ayant un score de bioactivité statistiquement significatif [START_REF] Nothias | Bioactivity-Based Molecular Networking for the Discovery of Drug Leads in Natural Product Bioassay-Guided Fractionation[END_REF]. Une fois le script exécuté, un fichier de sortie contenant les valeurs des tests statistiques pour chacun des ions est exporté au format csv.

Visualisation des réseaux sur Cytoscape

Les réseaux moléculaires ont été visualisés sur le logiciel Cytoscape (version 3.8.2, [START_REF] Shannon | Cytoscape: A Software Environment for Integrated Models of Biomolecular Interaction Networks[END_REF] grâce à l'import des fichiers graphml générés sur GNPS et le fichier csv généré lors de l'étape précédente.

Déréplication des métabolites bioactifs

Les approches in silico employées

L'approche basée sur les analyses statistiques multivariées et celle sur les scores de bioactivité ont permis de discriminer des métabolites potentiellement bioactifs. Afin de réaliser une identification putative de ces métabolites une stratégie de déréplication a été mise en place. Ainsi, un premier travail de déréplication automatique grâce aux bases de données en ligne de GNPS a été réalisé pendant la génération des réseaux moléculaires (M. Wang et al., 2016). Dans un second temps, les profils UHPC-UV-MS des métabolites d'intérêt ont été comparés avec les standards de stilbènes injectés au préalable. Les données spectrales MS/MS des ions détectés dans les extraits ont été importées vers le logiciel SIRIUS 4.9.15 [START_REF] Dührkop | SIRIUS 4: a rapid tool for turning tandem mass spectra into metabolite structure information[END_REF] afin d'obtenir des propositions structurales à partir du schéma de fragmentation des métabolites et en les comparant avec des fragmentations théoriques de molécules présentes dans les bases de données chimiques en ligne, notamment par l'utilisation de l'outil CSI:Finger ID [START_REF] Dührkop | Searching molecular structure databases with tandem mass spectra using CSI:FingerID[END_REF][START_REF] Hoffmann | High-confidence structural annotation of metabolites absent from spectral libraries[END_REF]. L'outil CANOPUS a été utilisé pour annoter les familles chimiques de molécules si besoin [START_REF] Hoffmann | High-confidence structural annotation of metabolites absent from spectral libraries[END_REF]. Enfin, une vérification manuelle des annotations proposées pour les composés dérépliqués a été faite sur la base de la masse exacte et du spectre de fragmentation en comparant avec la littérature scientifique. Lorsqu'un ion a été annoté comme pouvant appartenir à la famille des stilbénoïdes, nous avons comparé son spectre de fragmentation avec les spectres de fragmentation théoriques de stilbènes de même formule chimique. Pour cela, une base de données structurale interne à l'axe MIB comprenant plus de 900 stilbénoïdes a été complétée par les codes SMILES des molécules. Ces codes ont alors pu être utilisés individuellement pour des molécules candidates pour réaliser la fragmentation in silico sur l'outil en ligne CFM-ID (F. [START_REF] Wang | CFM-ID 4.0: More Accurate ESI-MS/MS Spectral Prediction and Compound Identification[END_REF].

Injection de standards de stilbènes

Afin de faciliter l'identification des métabolites en mélange au sein des extraits, 15 stilbènes, 9 flavan-3-ols et un acide phénolique (Tableau 13) ont été analysés par UHPLC-HRMS/MS avec la même méthode d'analyse que pour les échantillons. Les standards ont été préparés de la même manière que le mélange de standard développé dans la partie 2.1.1.

Discrimination des extraits par groupe d'activité antifongique

Dans le chapitre I, nous avons pu mettre en évidence que parmi les 13 extraits hydroéthanoliques testés, 10 d'entre eux ont présenté une activité antifongique à 125 mg/L. Nous avons noté que les extraits issus des parties souterraines des co-produits de la vigne semblaient être les plus efficaces. Le dosage de 9 stilbènes par HPLC-UV tend à montrer que les extraits les plus riches en stilbènes sont les plus efficaces. Toutefois, des analyses plus fines sont nécessaires pour tenter d'identifier quels sont les composés responsables de cette bioactivité.

Des analyses par UHPLC-HRMS/MS ont été réalisées afin de connaitre la richesse en métabolites des extraits des co-produits viticoles. Dans un second temps, les données de spectrométrie de masse et de bioactivité ont été utilisées pour réaliser des analyses statistiques afin de tenter de faire le lien entre bioactivité et composition chimique des extraits.

Les paramètres du logiciel MZmine ont été optimisés dans le but d'obtenir une bonne détection des ions (détermination du bruit de fond et de la limite de détection), une bonne déconvolution et un bon alignement des pics. Ainsi, à partir des 13 échantillons d'extraits analysés en triplicats, nous avons obtenu une liste de masses comportant 7118 ions. Une fois importées sur le logiciel SIMCA 17 les données d'aires sous le pic des différents ions ont été mises à l'échelle avant de réaliser toute analyse statistique. Nous avons utilisé une mise à l'échelle par la méthode de Pareto plutôt que par celle de l'unit variance (UV), qui nous a permis d'obtenir une distribution gaussienne des données (Figure 19). De plus, cette mise à l'échelle convient aux analyses que nous souhaitons réaliser, en effet elle permet de conserver en partie l'abondance des variables, et donc de limiter l'effet des variables de faible intensité (proche du bruit de fond/de la limite de détection) sur la séparation des modalités (van den [START_REF] Van Den Berg | Centering, scaling, and transformations: improving the biological information content of metabolomics data[END_REF][START_REF] Wheelock | Trials and tribulations of 'omics data analysis: Assessing quality of SIMCA-based multivariate models using examples from pulmonary medicine[END_REF]. En d'autres termes, les ions détectés les plus intenses vont conserver cette intensité après correction et donc peuvent avoir un poids plus fort dans l'analyse en comparaison avec des ions moins intenses. Dans l'objectif de trouver des métabolites bioactifs potentiellement valorisables à une échelle industrielle, il est plus intéressant de se focaliser sur des métabolites abondants. Des ions dont l'intensité détectée en spectrométrie de masse est assez élevée sont potentiellement des métabolites abondants dans l'extrait, donc nous avons privilégié ce type de mise à l'échelle.

Une fois les données mises à l'échelle, des analyses non supervisées par l'ACP et supervisées par l'OPLS-DA ont été réalisées. Tout d'abord, l'ACP a permis de visualiser la distribution de la variance des profils métabolomiques des extraits de co-produits (Figure 20A). Pour chaque condition, nous pouvons observer 3 points qui correspondent aux trois injections. L'ACP nous permet de discerner au moins 2 groupes d'extraits, d'une part les extraits qui ne présentent pas d'activité antifongique à 125 mg/L et d'autre part les extraits antifongiques. Les deux premières composantes principales du modèle expliquent 55 % de la variance entre les deux groupes d'extraits, cette différence entre les deux groupes est significative et est validée par les valeurs de R²X et de Q², qui sont respectivement de 0,296 et 0,240. La distinction de sous-groupes parmi la distribution des extraits peut se faire de manière plus fine grâce à l'observation du dendrogramme de la CAH (Figure 20B). Ainsi, nous pouvons discerner trois groupes parmi les échantillons, avec une scission du groupe des extraits aux propriétés antifongiques en 2 groupes, ceux obtenus à partir des parties racinaires et ceux issus des parties aériennes (ceps et sarments).

Cette distinction correspond également à la différence entre porte-greffe et greffon au sein d'un pied de vigne. En effet, le pied de vigne cultivé en viticulture est constitué d'une partie basale, le porte-greffe, qui apporte la vigueur au pied de vigne par sa résistance à des maladies du bois comme le phylloxera ou de la vigne comme l'oïdium et le mildiou. Ce sont généralement des espèces nord-américaines qui sont utilisées, comme V. riparia, V. lambrusca, V. berlandieri ou V. labrusca [START_REF] Terral | Evolution and history of grapevine (Vitis vinifera) under domestication: new morphometric perspectives to understand seed domestication syndrome and reveal origins of ancient European cultivars[END_REF][START_REF] This | Historical origins and genetic diversity of wine grapes[END_REF]. La partie fructifère du pied est nommé le greffon et correspond au cépage utilisé (exemple : Merlot ou Tannat), ce sont très majoritairement des variétés de V. vinifera [START_REF] Terral | Evolution and history of grapevine (Vitis vinifera) under domestication: new morphometric perspectives to understand seed domestication syndrome and reveal origins of ancient European cultivars[END_REF] Des analyses supervisées ont été réalisées sur les extraits hydro-éthanoliques de co-produits de la vigne notamment par la mise en place de PLS-DA et d'OPLS-DA. La PLS-DA permet d'améliorer la séparation entre des groupes préalablement observés lors de l'ACP [START_REF] Tyagi | Urine metabolomics based prediction model approach for radiation exposure[END_REF][START_REF] Wheelock | Trials and tribulations of 'omics data analysis: Assessing quality of SIMCA-based multivariate models using examples from pulmonary medicine[END_REF] Enfin, l'OPLS-DA permet d'accentuer ces différences entre groupes [START_REF] Trygg | Orthogonal projections to latent structures (O-PLS)[END_REF][START_REF] Van Den Berg | Centering, scaling, and transformations: improving the biological information content of metabolomics data[END_REF] et de générer dans un second temps une représentation en S, qui permet la visualisation des composantes de l'OPLS-DA selon leur variance et leur corrélation pour chacun des groupes [START_REF] Kellogg | Biochemometrics for Natural Products Research: Comparison of Data Analysis Approaches and Application to Identification of Bioactive Compounds[END_REF]. La séparation entre les deux groupes est distincte et le niveau de prédiction du modèle est de Q²=0,99. De la même manière, les valeurs de qualité d'ajustement de la première composante sont plus élevées pour l'axe horizontal, avec respectivement R2Y=0,995 et R2X=0,313. Les deux premières composantes principales expliquent 61 % de la variance entre les deux groupes. La p-value (8,00×10 -28 ) de la CV-ANOVA permettent de vérifier la validité du modèle, tout comme la bonne classification des échantillons qui est de 100 %. Au sein des extraits actifs, nous pouvons à nouveau voir la séparation en deux groupes observés sur l'ACP entre les extraits racinaires et les extraits de ceps et de sarments.

Mise en évidence des métabolites aux propriétés antifongiques

Afin de connaitre les déterminants moléculaires potentiellement responsables des activités antifongiques propres aux extraits de co-produits de la vigne, nous avons utilisé deux approches complémentaires à partir des données de spectrométrie de masse et d'activités biologiques. La première approche utilise les analyses statistiques multivariées et prend en compte les activités biologiques de manière qualitative, alors que la seconde est basée sur des tests statistiques de corrélation qui sont basés sur les données quantitatives d'activité biologique (pourcentage d'inhibition de croissance fongique par exemple). De plus, cette seconde approche est couplée aux réseaux moléculaires, cela permet de visualiser au sein de cette représentation les ions supposés être les plus actifs biologiquement et par extension les familles moléculaires qui peuvent être associées à ce réseau.

Par les analyses statistiques multivariées

Les métabolites discriminants dans les extraits antifongiques A partir de l'analyse supervisée (Figure 22) générée à partir des VIPs, nous avons pu générer une représentation en S qui permet de combiner les variables de covariance et la corrélation des VIPs à partir du modèle OPLS-DA.

Dans un premier temps, nous nous sommes focalisés seulement sur les métabolites les plus discriminants (Figure 23, encadré bleu plein) pouvant déterminer le caractère antifongique des extraits. Ainsi, 12 ions présentant des valeurs de corrélation et covariance supérieures au seuil fixé (pcorr > 0,7 ; p > 0,05) ont été dérépliqués via l'utilisation de différents outils comme le logiciel SIRIUS 4.9, les bases de données en ligne présentes sur GNPS ou de manière manuelle par comparaison avec les spectres de masse présents dans la bibliographie. Ces métabolites sont listés dans le Tableau 14 sous la forme d'un tableau de déréplication. pcorr : valeur de corrélation de la variable ; p : valeur de covariance de la variable ; a: selon les niveaux d'annotation de Viant et al. (2017), métabolite identifié par un standard (1), métabolite putativement annoté à l'aide de bases de données spectrales (2), famille du métabolite putativement caractérisée à l'aide de bases de données spectrales (3), inconnu (4). En rouge, les doublons de métabolites dérépliqués plusieurs fois (adduits, fragment source, problème de déconvolution Nous pouvons noter que les 12 ions les plus discriminants correspondent à au moins 7 métabolites différents qui ont tous été identifiés, à l'aide de standards ou de manière putative, comme faisant partie de la famille des stilbènes. Dans le détail, nous avons pu identifier des stilbènes de plusieurs niveaux d'oligomérisation, dont deux dimères, deux trimères et deux tétramères, dont les structures sont représentées sur la Figure 24. Parmi ces oligomères, nous avons pu identifier à l'aide de standards deux dimères de resvératrol qui sont la cyphostemmine B et l'ampélopsine A, deux trimères à savoir le (+)-E-cis-trans-miyabénol C le (-)-E-cis-cismiyabénol C , ainsi que deux tétramères, l'ampélopsine H et l'isohopépahénol.

Tout d'abord, il est intéressant de noter que le caractère antifongique des extraits est lié à la présence de stilbènes, ce qui conforte notre hypothèse émise dans le premier chapitre sur la teneur en stilbènes plus élevés dans les extraits les plus efficaces. Ces résultats tendent à montrer l'importance des stilbènes comme des marqueurs de l'activité antifongique des extraits.

La cyphostemmine B, à notre connaissance ici détectée pour la première fois dans V. vinifera, a déjà fait l'objet de travaux démontrant l'activité antifongique d'extrait de Cyphostemma crotalarioides contenant 21,8 µg/g de ce métabolite contre Fusarium nivale [START_REF] Bala | Antifungal activity of resveratrol oligomers from Cyphostemma crotalarioides[END_REF]. Ce composé a déjà été identifié chez des Vitaceae, la première fois à partir de Cyphostemma crotalarioides [START_REF] Ducrot | Cyphostemmins A-B, two new antifungal oligostilbenes from Cyphostemma crotalarioides (Vitaceae)[END_REF] mais également chez une autre espèce, Parthenocissus trucuspidata (H. J. [START_REF] Kim | Two new antioxidant stilbene dimers, parthenostilbenins A and B from Parthenocissus tricuspidata[END_REF]. Un isomère structural de ce composé a d'ores et déjà été identifié et dosé dans du bois de vigne, où il peut être retrouvé jusqu'à 0,6 mg/g dans les radicelles de cépage Gravesac [START_REF] Gabaston | Wood and roots of major grapevine cultivars and rootstocks: A comparative analysis of stilbenes by UHPLC-DAD-MS/MS and NMR[END_REF]. Le second dimère identifié, l'ampélopsine A, est souvent retrouvé dans les extraits issus de bois de vigne, et des études ont déjà été menées sur son activité contre des agents phytopathogènes de la plante. C'est notamment le cas dans les travaux de Gabaston et al (2017) ou [START_REF] Schnee | Vitis vinifera canes, a new source of antifungal compounds against Plasmopara viticola, Erysiphe necator, and Botrytis cinerea[END_REF] qui ont étudié le caractère antifongique de divers stilbènes issus d'extraits de sarments contre Plasmopara viticola. L'ampélopsine A a des effets sur la sporulation de champignon, néanmoins parmi les stilbènes testés ce métabolite n'était pas le meilleur candidat en comparaison avec un autre dimère, l'ε-viniférine, des tétramères (hopéaphénol, isophopéaphénol, r2-viniférine et r-viniférine) ou bien le E-trans-cis-miyabénol C. Au sujet de ce dernier, nos analyses montrent qu'une forme énantiomérique de ce trimère, le E-cis-transmiyabénol C, apparait comme étant aussi corrélé aux extraits antifongiques par les analyses statistiques multivariées.

Les ions correspondants au vaticanol G et au miyabénol B ont été identifiés à l'aide d'outils de déréplication, leur identification reste donc putative, ainsi ces pseudo-identifications peuvent être discutées. Il y a peu d'informations disponibles sur les spectres de fragmentation des oligomères de stilbène dans la littérature, toutefois nous pouvons noter qu'une revue recense une très grande partie des travaux réalisés sur la fragmentation des composés phénoliques dont les stilbènes issus de différentes parties de vigne [START_REF] Goufo | A Reference List of Phenolic Compounds (Including Stilbenes) in Grapevine (Vitis vinifera L.) Roots, Woods, Canes, Stems, and Leaves[END_REF]. Au sujet du vaticanol G, un trimère, cette identification a été apportée grâce à une fragmentation in silico à l'aide du logiciel SIRIUS, qui suggère un score de similarité théorique entre les ions fils de la molécule candidate et le vaticanol G de 65 %. Nous pouvons noter que le vaticanol G a été pour la première fois isolé à partir d'écorce de Vatica rassak (T. [START_REF] Ito | A novel bridged stilbenoid trimer and four highly condensed stilbenoid oligomers in Vatica rassak[END_REF], mais n'a jamais été à ce jour détecté dans la vigne. Une base de données structurale des stilbènes recensés dans la littérature interne au laboratoire, recense près de 50 stilbènes avec une formule chimique similaire au vaticanol G, et donc autant de candidats pour l'identification de l'ion discriminant.

Au sujet du tétramère de ratio m/z 903,2453 (ID = 7421), il a été pseudo-identifié de la même manière, comme étant du miyabénol B avec une similarité théorique de près de 52 %. Toutefois cette molécule n'a pour le moment jamais été identifiée dans le genre Vitis, mais d'autres candidats comme les vitisifurane A et B identifiés dans Vitis vinifera (J. [START_REF] Ito | New oligostilbenes having a benzofuran from Vitis vinifera "Kyohou[END_REF] ou l'amurensine L identifiée dans Vitis amurensis (K. S. [START_REF] Huang | Anti-inflammatory tetramers of resveratrol from the roots of Vitis amurensis and the conformations of the seven-membered ring in some oligostilbenes[END_REF] pourraient être également des identifications potentielles pour cet ion.

Parmi les composés préalablement dosés par HPLC-UV, la vitisine B (ou r-viniférine) se distingue comme étant un métabolite discriminant (pcorr > 0,677 ; p > 0,261) de l'activité antifongique. Ce composé est majoritairement retrouvé dans les racines, comme nous avons pu le montrer lors du dosage. Son abondance est estimée entre 4,5 à 17,1 g/kg de poids sec de racine selon les cépages [START_REF] Gabaston | Wood and roots of major grapevine cultivars and rootstocks: A comparative analysis of stilbenes by UHPLC-DAD-MS/MS and NMR[END_REF] . Il a été démontré que ce tétramère était efficace pour restreindre le développement de champignons pathogènes de la vigne, que ce soit contre Diplodia seriata et Neofusicoccum parvum responsables de certains syndromes de la maladie de l'Esca chez la vigne [START_REF] Lambert | Phenolics and their antifungal role in grapevine wood decay: Focus on the Botryosphaeriaceae family[END_REF]. De même, des extraits racinaires riches en ce composé inhibent la formation de spores chez P. viticola [START_REF] Taillis | A grapevine by-product extract enriched in oligomerised stilbenes to control downy mildews: focus on its modes of action towards Plasmopara viticola[END_REF] et ce composé seul est plus efficace que les autres oligomères testés dans cette étude issus de sarments de vigne pour diminuer la mobilité des spores et la sporulation (Gabaston et al., 2017;[START_REF] Schnee | Vitis vinifera canes, a new source of antifungal compounds against Plasmopara viticola, Erysiphe necator, and Botrytis cinerea[END_REF]. De par son abondance dans les extraits et ses activités avérées vis-à-vis d'autres agents phytopathogènes, ce métabolite est un candidat intéressant pour ses potentielles activités antifongiques.

Les métabolites discriminants dans les extraits inefficaces pcorr : valeur de corrélation de la variable ; p : valeur de covariance de la variable ; a: selon les niveaux d'annotation de Viant et al. (2017), métabolite identifié par un standard (1), métabolite putativement annoté à l'aide de bases de données spectrales (2), famille du métabolite putativement caractérisé à l'aide de bases de données spectrales (3), inconnu (4). En rouge, les doublons de métabolites dérépliqués plusieurs fois (adduits, fragment source, problème de déconvolution)

Parmi ces métabolites, nous retrouvons des composés phénoliques et notamment des flavan-3ols de différent degré d'oligomérisation. Nous retrouvons notamment trois ions qui ont pu être identifiés comme de la catéchine et de l'épicatéchine par injection de standards, un dimère de catéchine, la procyanidine B1 a également été identifié. Deux autres ions n'ont pas pu être identifiés avec certitude, mais sur la base de leurs spectres de MS 1 et de MS 2 , ils pourraient correspondre à un autre dimère catéchique que les procyanidines B1 et B2 (standards injectés, et présentant des temps de rétention différents). Enfin, une forme trimérisée de cette famille a également été dérépliquée, comme pouvant être une procyanidine C. La procyanidine C1 a été injectée, mais ne correspond pas à ce composé au vu de son temps de rétention différent. Ainsi, les extraits inefficaces présentent des dérivés de flavan-3-ols comme étant des marqueurs d'inactivité. D'autres ions ont pu être mis en évidence, notamment des métabolites présentant des groupements osidiques comme l'astilbine, une flavanonone O-glycosylée, et le raffinose, un triholoside. L'ion ID=299 n'a pas pu être dérépliqué via les outils utilisés, mais aux vues de son élution rapide (tR=0,65 min) cela nous laisse penser à un composé très polaire comme un sucre. De plus la formule chimique calculée (C5H10O6) a été soumise sur l'outil SciFinder n dont la majorité des 97 sorties correspondait à des pentoses comme l'acide ribonique, xylonique ou arabinonique. Le spectre de masse théorique de ces 3 pentoses a été calculé sur l'outil CFM-ID et pourrait correspondre à celui de notre ion candidat. Ces métabolites osidiques ou comprenant des groupements osidiques pourraient être potentiellement dégradés par le champignon et utilisés sous forme d'oses simples comme source de carbone assimilable pour le champignon, comme cela a déjà été évoqué pour les extraits à l'eau sous-critique dans le premier chapitre. Néanmoins ces identifications putatives sont à prendre avec précaution, car la méthode séparative et la colonne utilisée ne sont pas adaptées à l'analyse des sucres.

Quatre ions ont été associés à des dérivés d'acide linoléique, comme potentiellement l'acide 9,12,13-trihydroxyoctadeca-10,15-diénoique, donc des molécules cette fois-ci beaucoup plus apolaires.

Les résultats apportés par les analyses statistiques multivariées ont permis de montrer que les différences d'activités entre les extraits de co-produits observées sur le développement de F. graminearum peuvent être expliquées par la nature chimique de ces extraits, et que notamment certains oligomères de stilbènes pourraient avoir un impact important dans l'activité des extraits. De plus, ces approches nous permettent de dire que de manière générale, les stilbènes contenus dans les extraits ont un rôle plus important dans le caractère antifongique en comparaison avec d'autres familles chimiques comme les flavan-3-ols, certains composés glycosylés et des acides gras. Toutefois, pour ces derniers, leur annotation reste putative.

Par les scores de bioactivité

Une seconde approche a été utilisée pour déterminer les métabolites liés à l'activité antifongique. Cette approche, développée par Nothias et al., utilise les réseaux moléculaires ainsi qu'un score de bioactivité pour déterminer quels sont les ions corrélés positivement à une bioactivité [START_REF] Nothias | Bioactivity-Based Molecular Networking for the Discovery of Drug Leads in Natural Product Bioassay-Guided Fractionation[END_REF]. D'un point vu statistique, cette méthodologie diffère de celle se basant sur les analyses multivariées par la nature des données biologiques utilisées. En effet, le test de corrélation de Pearson mis en place permet de générer une matrice de corrélation linéaire entre l'abondance d'un ion présent dans des échantillons et une donnée d'activité biologique quantitative, ici le pourcentage d'inhibition de la croissance du champignon après 5 jours de culture en présence de 125 mg/L d'extrait.

En parallèle, la génération de réseaux moléculaires basés sur les données de MS/MS via la plateforme en ligne GNPS, permet de regrouper en cluster les métabolites partageant des similarités de fragmentation, donc des molécules structurellement proches et potentiellement de la même famille chimique. De plus, les bases de données spectrales présentes sur la plateforme permettent d'identifier des métabolites et d'annoter les clusters [START_REF] Fox Ramos | Natural products targeting strategies involving molecular networking: different manners, one goal[END_REF]. Les scores de bioactivité sont couplés aux réseaux moléculaires afin de visualiser les métabolites corrélés à l'activité antifongique et leur cluster associé.

La Figure 26 représente les clusters contenant des ions dont le score de bioactivité est élevé (r ≥ 0,85 ; p-value corrigée (Bonferroni) < 0,05). Les analyses statistiques ont déterminé 14 ions avec un score supérieur au seuil fixé, puis nous avons réalisé la déréplication de ces composés dans le Tableau 16. Tout d'abord, les bases de données spectrales présentes sur GNPS n'ont pas permis d'annoter ces composés d'intérêt, nous avons donc effectué la déréplication via SIRIUS ou bien de manière manuelle. Ces 14 ions correspondent à au moins 11 composés différents dont 3 qui ont été annotés au niveau moléculaire, 3 selon leur famille chimique et 5 n'ont pas pu être identifiés. Les 6 métabolites annotés correspondent tous à des stilbènes, dont 4 d'entre eux ont été déterminés comme discriminants dans les extraits antifongiques par les approches d'analyse statistiques multivariées. Ces 4 stilbènes sont la cyphostemmine B (un dimère) et l'isohopéaphénol (un tétramère) qui ont été identifiés à l'aide de standards, un tétramère de stilbène, et un trimère identifié putativement comme pouvant être le vaticanol G. Ce composé est représenté par 3 noeuds sur le réseau moléculaire, mais il s'agit potentiellement d'un seul composé. Le noeud sur le cluster 5 correspond à l'ion parent sans adduit, ceux sur le cluster 6 correspondent respectivement à l'ion avec un adduit formiate (ID = 6350) et à un fragment formé en source (ID = 6346). De plus, nous pouvons noter qu'un grand nombre de composés ont pu être annotés comme correspondant à des stilbènes (noeuds entourés en rouge) parmi les clusters contenant des ions avec des scores de bioactivité élevés. Au sujet des noeuds entourés en noir, il s'agit soit de métabolites faisant partie d'une autre famille chimique soit de composés qui n'ont pas pu être annotés comme stilbènes.

Lors de l'analyse supervisée, l'isohopéaphénol a présenté des valeurs de pcorr légèrement en dessous du seuil fixé, à savoir 0,68, mais avec une covariance élevée de 0,204. Il est intéressant de noter que l'un des composés les plus discriminants des extraits antifongiques lors des analyses statistiques était l'ampélopsine A (Figure 24), nous pouvons noter une proximité structurale entre ce composé et l'isohopéaphénol (Figure 24). En effet, ce dernier est un tétramère constitué de deux unités dimèriques de stilbène qui seraient liées au niveau du groupement hydroxyle du cycloheptane. Toutefois, la littérature sur la biosynthèse de ces composés dans la vigne laisse penser à une autre origine. L'isohopéaphénol serait issu d'un couplage oxydatif et d'une isomérisation entre deux unités de E-ε-viniférine catalysés par des peroxydases [START_REF] Takaya | Biogenetic reactions on stilbenetetramers from Vitaceaeous plants[END_REF]. L'isohopéaphénol n'est donc pas issu de la dimérisation de l'ampélopsine A. Celle-ci est, comme de nombreux oligomères de stilbènes, issue de l'E-εviniférine. En effet, il s'agit d'un dimère oxydé de stilbènes qui pourrait être issu de la cyclisation d'intermédiaires de l'E-ε-viniférine résultant en la formation d'un dimère avec un noyau dibenzocycloheptane (Figure 24) [START_REF] Jeandet | Phytostilbenes as agrochemicals: Biosynthesis, bioactivity, metabolic engineering and biotechnology[END_REF]. Le tétramère ne serait pas issu de la dimérisation du dimère, malgré des analogies structurales, mais ces deux métabolites dériveraient d'une unité commune qui est l'E-ε-viniférine.

Les deux autres stilbènes sont des tétramères de m/z [M-H+HCOOH] -965,2452 (ID=7540) et m/z [M-H] -917,2246 (ID=7408) qui n'ont pas pu être identifiés.

Tableau 16 : Tableau de déréplication des métabolites corrélés positivement à l'activité antifongique dans les extraits de co-produits de la vigne vis-à-vis de F. graminearum r : coefficient de corrélation de Pearson; p-value : valeur p-value de la correction de Bonferonni ; a: selon les niveaux d'annotation de Viant et al. (2017), métabolite identifié par un standard (1), métabolite putativement annoté à l'aide de bases de données spectrales (2), famille du métabolite putativement caractérisé à l'aide de bases de données spectrales (3), inconnu (4). En rouge, les doublons de métabolites dérépliqués plusieurs fois (adduits, fragment source, problème de déconvolution) Au sujet des autres métabolites discriminants, 3 d'entre eux sont des noeuds isolés, donc qui ne partagent pas suffisamment de similarité de fragmentation avec d'autres composés, ce qui n'a pas facilité leur déréplication.

ID
Nous pouvons noter que les clusters 3, 4 et 7 contiennent plusieurs noeuds avec des scores de bioactivité élevés (cf diamètre des noeuds). Ces trois clusters sont constitués exclusivement de stilbènes oligomérisés.

Le cluster 3 contient 3 noeuds d'ont les ions respectifs sont corrélés positivement à l'activité antifongique (r ≥ 0,80). Ces ions ont des temps de rétentions différents, mais une un m/z [M-H] -919,2401 identiques qui peuvent être apparié à une molécule de formule chimique C56H40O13. De plus, la fragmentation de ces ions correspondent à des tétramères de stilbènes. Dans la bibliographie faisant référence au genre Vitis, seule l'amurensine K retrouvée chez Vitis amurensis est connue comme présentant la formule chimique C56H40O13 (K. S. [START_REF] Huang | Anti-inflammatory tetramers of resveratrol from the roots of Vitis amurensis and the conformations of the seven-membered ring in some oligostilbenes[END_REF]. Les autres ions présentent des fragments propres aux stilbènes, un m/z [M-H] - 917,2250 correspondant à une formule chimique théorique de C56H38O13, toutefois aucun stilbène recensé dans la bibliographie ne correspond à cette formule chimique.

En plus de l'isohopéaphénol, les clusters 4 et 7 comprennent des ions de tétramères de stilbènes présentant des adduits Cl ou HNO3 notamment de l'ampélopsine H (tR = 10,22 min, m/z [M-HNO3] -941,2569) et de la vitisine A (tR = 10,53 min, m/z [M-HNO3] -941,2570), ces composés ont respectivement une corrélation de 0,72 et 0,66 avec l'activité antifongique. Ces deux clusters, auraient plutôt tendance à regrouper les molécules sous forme d'adduit.

L'utilisation de cette approche tend vers la même conclusion énoncée à la suite des analyses statistiques multivariées sur les extraits antifongiques, à savoir que les stilbènes oligomérisés semblent être les molécules responsables de l'activité antifongique des extraits.

Mise en évidence des métabolites discriminants dans les extraits antimycotoxine

Afin de déterminer les métabolites discriminants issus des extraits aux activités antimycotoxine, la même démarche d'analyses statistiques multivariées basée sur une analyse non-supervisée puis supervisée a été employée. Cette analyse a utilisé les résultats présentés dans le chapitre I sur l'inhibition de la production de 15ADON par F. graminearum dans le milieu de culture en présence de 25 mg/L d'extraits hydro-éthanoliques.

Discrimination des extraits par groupe d'activité antimycotoxine

Contrairement aux activités antifongiques, l'ensemble des extraits a inhibé la production de 15ADON par F. graminearum à la concentration testée de 25 mg/L. Nous avons donc dû générer des groupes d'activité parmi les 13 extraits. Pour cela, des tests bilatéraux de Conover-Iman ont permis de comparer les échantillons entre eux sur la base de leur pourcentage d'inhibition de la production de mycotoxine, et donc de voir leur distribution au sein d'une population (Figure 27). L'analyse non-supervisée permet de voir à nouveau la distribution de la variance des extraits (Figure 28A). Ici, la distribution est la même que sur la Figure 20A, seules les indications sur le groupe d'activité antimycotoxine change. Nous voyons ainsi que la distribution des échantillons sur l'analyse non-supervisée ne permet pas de distinguer les différents groupes. Nous nous sommes donc appuyés sur des analyses supervisées pour forcer la distinction entre ces 3 groupes d'activité (Figure 28B). Nous pouvons discerner les 3 groupes sur la PLS-DA, toutefois la valeur de prédiction du modèle est trop faible pour la première composante pour pouvoir juger d'un bon niveau de prédiction, en effet ici le Q² = 0,39, alors qu'une valeur de Q² > 0,5 est attendue [START_REF] Triba | PLS/OPLS models in metabolomics: The impact of permutation of dataset rows on the K-fold cross-validation quality parameters[END_REF].

Par les analyses statistiques multivariées

Une représentation en S a été générée à partir du modèle OPLS-DA entre les extraits moyennement efficaces et très efficaces pour inhiber la production de mycotoxine. Nous nous sommes intéressés aux métabolites les plus discriminants pour les extraits présentant une forte efficacité d'inhibition (Figure 30, encadré rouge plein). ,1977 585,1561-491,1140-684,0644-3560690-679,1966-479,1137-197, 13,3);93,0330 (9,5);345,0762 (8,1);357,0766 (7,1);423,1218 (7);469,1276 (5,7);317,0808 (5,2) pcorr : valeur de corrélation de la variable ; p : valeur de covariance de la variable ; a: selon les niveaux d'annotation de Viant et al. (2017), métabolite identifié par un standard (1), métabolite putativement annoté à l'aide de bases de données spectrales (2), famille du métabolite putativement caractérisé à l'aide de bases de données spectrales (3), inconnu (4). En rouge, les doublons de métabolites dérépliqués plusieurs fois (adduits, fragment source, problème de déconvolution)

Nous pouvons noter qu'à nouveau ce sont des stilbènes oligomérisés qui ressortent comme étant des métabolites d'intérêt, ici pour discriminer les extraits les plus efficaces. Toutefois, à l'exception de l'ampélopsine A, ce sont d'autres stilbènes que ceux inhibant la croissance du champignon qui semblent être à l'origine de l'activité inhibitrice de la production de 15ADON.

Parmi ces stilbènes potentiellement corrélés à l'activité antimycotoxine, nous retrouvons 4 dimères, 1 trimère et 5 tétramères. Les dimères de stilbènes concernés ont une formule chimique de C28H24O7 (ID 3698 et 4443), alors que de manière générale les dimères retrouvés dans la vigne sont des composés de formule chimique C28H22O6, comme l'ε-viniférine et ses énantiomères ou bien le pallidol, ou C28H22O7 comme l'ampélopsine A. Nous pouvons donc estimer que ces dimères mis en évidence sont peu communs dans la vigne de par leur formule chimique et donc leur structure. Néanmoins, des dimères semblables ont été détectés récemment dans des sarments de cépage Pinot noir [START_REF] Escobar-Avello | Phenolic profile of grape canes: Novel compounds identified by LC-ESI-LTQ-orbitrap-MS[END_REF][START_REF] Saéz | Phenolic Profile of Grape Canes: Novel Compounds Identified by LC-ESI-LTQ-Orbitrap-MS[END_REF] pouvant être associés à du restrystisol (ou rétrisol) A ou B (Figure 31). Un schéma de fragmentation a été proposé pour un composé détecté dans des cultures cellulaires de vigne, pouvant être apparenté à ce composé [START_REF] Mulinacci | Highperformance liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometric investigation of stilbenoids in cell cultures of Vitis vinifera L., cv. Malvasia[END_REF]. Nous retrouvons des fragments similaires comme celui de la perte d'un noyau phénol de m/z 93,0333, duquel découle le fragment m/z 377,1034 ([M-H-C6H6O] -), ainsi que la perte d'un groupement carbonyle sur ce fragment fils (m/z 349,1086, [M-H-C7H6O2] -). Un autre dimère de formule brute C27H24O5 a été identifié putativement comme pouvant être du vitisinol C (ou un isomère, le carasiphénol A), un oligostilbène qui a déjà été isolé à partir de racine de V. thunbergii (Y. L. [START_REF] Huang | Resveratrol derivatives from the roots of Vitis thunbergii[END_REF]. Une étude du schéma de fragmentation de ce composé a été réalisée par ESI-IT-TOF-MS en mode négatif et nous retrouvons 7 fragments ou pertes de masses communes avec ce métabolite (119,0490 ; 265,0873 ; 307,0979 ; 145,0284 ; 161,0598 ; 365,1133 et 267,0663) [START_REF] Zhang | A Fragmentation Study on Four Oligostilbenes by Electrospray Tandem Mass Spectrometry[END_REF].

Parmi ces oligostilbènes, nous retrouvons également 5 tétramères, comme la vitisine A (ou r2viniférine, Figure 31) dont l'identification a pu être confirmée grâce à l'injection d'un standard. Deux autres ions de formule chimique C56H42O12 ont été dérépliqués comme étant des tétramères de stilbènes, sans pour autant avoir été identifiés à l'aide des bases de données ou des standards. Un ion de m/z 904,2488 avec une formule proposée de C56H41O12 n'a pas pu être identifié. Nous pouvons noter que cette formule brute ne correspond à aucun stilbène connu, mais peut correspondre à une formule de tétramère de stilbène déshydrogéné. Cet ion présente des ions fils en MS 2 pouvant s'apparenter à ceux d'un tétramère C56H42O12 avec une perte de masse correspondant à un hydrogène, comme par exemple les fragments de m/z 810,2058, 458,0825 ou 450,0825. De plus, cet ion se retrouve dans un cluster contenant d'autres stilbènes, et ainsi peut potentiellement correspondre à un tétramère de stilbène. Néanmoins, c'est le seul ion de masse paire détecté dans le cluster. L'ion ID=6608, identifié putativement comme l'amurensine K, qui était retrouvé sur un des clusters de stilbènes potentiellement corrélés à l'activité antifongique est ici fortement corrélé au caractère très efficace de l'activité antimycotoxine (pcorr) = 0,839). En outre, des ions correspondant à la vitisine B et à l'isohopéaphénol (Figure 24), deux tétramères, présentent des niveaux de corrélation en dessous du seuil fixé, mais des niveaux de covariance élevés, à savoir 0,588 et 0,589 respectivement. Ceci laisse à penser que ces composés peuvent potentiellement jouer un rôle dans l'inhibition de la production de 15ADON chez F. graminearum.

Des ions de toutes autres natures chimiques avec des corrélations élevées ont également été dérépliqués et pourrait correspondre à des sucres ou des métabolites glycosylés, comme le sorbitol et un potentiel hétéroside d'acide gras. Il est intéressant de noter que si ces métabolites sont corrélés à l'activité antimycotoxine, cela va à contrario de l'observation réalisée sur les métabolites glycosylés qui auraient tendance à induire la croissance fongique.

A nouveau, nous avons remarqué que les stilbènes semblent jouer un rôle important dans les extraits efficaces pour contrer la production de mycotoxine par F. graminearum. Toutefois, ces métabolites semblent différents de ceux qui inhibent la croissance fongique.

Une approche par les réseaux moléculaires basés sur la bioactivité a été entreprise pour mettre en évidence les métabolites corrélés à l'activité antifongique. Toutefois, ces résultats n'ont pas été concluants car aucun ion n'a pu être corrélé à l'activité biologique en question. Nous estimons que ceci pourrait être dû au fait que l'ensemble des extraits sont efficaces au moins à 50 % pour inhiber la production de 15ADON dans le milieu de culture, et donc qu'il n'y a pas de différences suffisamment marquées d'un extrait à l'autre comme nous avons pu le voir dans notre précédente analyse, ou bien dans l'article de Nothias et al. (2018) qui décrit la méthode. Nous avons tout de même tenté de transformer ces données d'activité, notamment en les exprimant d'une autre manière en mettant à l'échelle les données ou bien en exprimant l'inverse de la donnée biologique comme cela a pu être fait par [START_REF] Peña-Espinoza | Anthelmintic and metabolomic analyses of chicory (Cichorium intybus) identify an industrial by-product with potent in vitro antinematodal activity[END_REF], mais sans succès.

Conclusions

Dans ce chapitre, le couplage des données de spectrométrie de masse haute résolution avec les activités antifongiques des extraits de co-produits de la vigne nous ont permis de mettre en évidence que ce sont bien les stilbènes qui jouent un rôle important dans l'activité des extraits hydro-éthanoliques. Les stilbènes oligomérisés semblent jouer un rôle important dans cette activité, notamment des dimères comme l'ampélopsine A et la cyphostemmine B, les trimères comme l'E-cis-trans-miyabénol C et les tétramères de stilbènes comme l'isohopéaphénol et le miyabénol B. A contrario, une autre famille de composés phénoliques bien connus dans le bois de vigne, les flavan-3-ols, ou alors des sucres semblent jouer un rôle inducteur du développement du champignon. Ces résultats tendent à montrer que pour réaliser des extraits antifongiques, il faut choisir les parties racinaires de la vigne, qui sont des parties les plus riches en oligomères de stilbènes, plutôt que les sarments riches en monomères de stilbènes et flavan-3-ols. Ainsi, dans un objectif de valorisation de ces co-produits, il serait intéressant d'optimiser les paramètres d'extraction (choix des solvants, ratio de solvants, enrichissement) pour obtenir des teneurs plus élevées des composés d'intérêt antifongique dans les extraits.

Au sujet des déterminants moléculaires de l'activité antimycotoxine, les analyses multivariées ont montré que c'était à nouveau les stilbènes qui semblaient impacter le plus cette activité. Outre l'ampélopsine A et l'isohopépahénol, ce sont des stilbènes moins communs dans la vigne qui semblaient impacter l'activité antimycotoxine. Parmi eux, des dimères de resvératrol et tétramères de resvératrol oxydés comme potentiellement l'amurensine K. Néanmoins, il a été plus délicat de montrer quels étaient les métabolites corrélés à l'activité antimycotoxine du fait de la forte proximité d'activité entre les différents extraits. Ainsi, nous avons fait le choix de fractionner un extrait à forte activité antimycotoxine afin de tenter d'identifier plus finement quels pouvaient être les métabolites associés à cette bioactivité. Les résultats de ces travaux seront présentés dans le Chapitre III.

A propos des méthodologies utilisées, les deux approches sont complémentaires pour tenter d'identifier des métabolites potentiellement bioactifs dans des extraits complexes mais issus de la même espèce végétale. Les analyses statistiques multivariées ont tendance à discriminer des métabolites dont l'intensité en spectrométrie de masse est significative, alors que ce n'est pas forcément le cas pour ceux mis en évidence par les scores de bioactivité. Mais en contrepartie, les tests de corrélation de Pearson prennent en compte des données biologiques quantitatives qui pourront donc permettre de comparer plus finement les marqueurs entre deux extraits qui sont identifiés comme antifongique, mais qui présentent des niveaux d'activité différents.

L'annotation des ions discriminés par les deux approches statistiques a pu être facilitée par l'injection de standards, mais aussi par l'utilisation des réseaux moléculaires et d'outils de déréplication automatique. Néanmoins, l'annotation a été plus complexe pour les stilbènes car il existe peu de standards commerciaux, de plus les bases de données sont peu fournies en ces familles de composés et les schémas de fragmentation en spectrométrie de masse de ces métabolites sont souvent proches, amenant à des annotations peu concluantes. Ce dernier point a un rôle important dans la réalisation des clusters de réseaux moléculaires, leur similarité de fragmentation tend à générer des macro-clusters lorsque nous appliquons des paramètres « souples » (nombre de liens par noeuds supérieur à 20, taille des clusters supérieure à 500). Cependant, cela ne facilite pas l'identification de ces métabolites. Des optimisations des paramètres de génération de ces réseaux moléculaires pourraient permettre une meilleure visualisation et faciliter l'annotation.

Chapitre III

Etude phytochimique d'un extrait de racine de porte-greffe Gravesac aux propriétés antifongique et antimycotoxine Le choix du système de solvants biphasique est un facteur déterminant de la qualité de la séparation. La polarité des phases influence notamment la distribution des molécules. Le système choisi doit être stable et bien solubiliser l'échantillon. Le système de solvants biphasiques utilisé est adapté du système Arizona [START_REF] Oka | Systematic search for suitable two-phase solvent systems for high-speed counter-current chromatography[END_REF]. Il s'agit d'un système dont la composition est intermédiaire entre les systèmes K et L de la gamme Arizona [START_REF] Biais | Antioxidant and Cytoprotective Activities of Grapevine Stilbenes[END_REF]. Dans ce nouveau système, le méthanol a été remplacé par l'éthanol afin d'obtenir un mélange de solvants moins dangereux pour l'environnement et pour la santé, comme cela a déjà pu être développé dans le passé [START_REF] Faure | Limonene in Arizona liquid systems used in countercurrent chromatography. II Polarity and stationary-phase retention[END_REF] L'extrait Ta_R_AE a été pesé pour obtenir 1 g de poudre, puis a été solubilisé dans 9 mL de phase mobile et 9 mL de phase stationnaire. L'ensemble est filtré sous vide sur un verre fritté n°3. L'échantillon est alors injecté dans le système par l'intermédiaire de la vanne Rhéodyne. L'élution débute à un débit 3 mL/min, puis à 5 mL/min lors de l'apparition du premier pic (20 min). La vitesse de rotation du rotor est de 1000 rpm. L'acquisition commence au moment de l'injection, et la détection UV se fait à 254, 280, 306 et 320 nm. La collecte des fractions est manuelle en se basant sur le chromatogramme. L'extrusion s'effectue après 70 min d'élution avec la phase stationnaire à un débit de 10 mL/min et à une vitesse de rotation du rotor de 500 rpm. La durée totale de la manipulation est de 90 min.

Les 7 fractions (F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7) obtenues ainsi que l'extrusion (F8 = Ext) ont été obtenues. Les solvants ont été évaporés des fractions à l'évaporateur rotatif sous vide, puis les fractions ont été lyophilisées et pesées. Les injections ont été répétées 4 fois dans les mêmes conditions que la première injection. Au total, 5 g d'extrait ont été injectés. La première injection d'un gramme a permis de constituer les fractions pour les analyses sur Fusarium et par UPLC couplée à la spectrométrie de masse, les quatre autres injections ont été conservées pour la purification de molécules. Des solutions de stockage des fractions ont été préparées dans de l'éthanol à une concentration de 10 g/L puis stockées à -20 °C. Une démarche identique à celle développée lors du chapitre 2 sur les extraits de co-produits de vigne a été appliquée sur les fractions de CPC. Les données de spectrométrie de masse ont été prétraitées sur MZmine3.0.21 de la même manière puis ont été exportées sur le logiciel SIMCA pour réaliser les analyses statistiques multivariées puis sur GNPS pour générer les réseaux moléculaires. Les calculs de scores de bioactivité ont utilisé les données de spectrométrie de masse, ainsi que les données de bioactivité des fractions testées à 30 mg/L pour l'inhibition de la biomasse mycélienne et 15 mg/L pour l'inhibition de la production de 15ADON dans le milieu de culture. Les ions discriminants mis en évidence par l'analyse multivariée ou ayant des scores de bioactivité élevés ont été dérépliqués manuellement ou en utilisant les bases de données de GNPS ou le logiciel SIRIUS. Le fractionnement de l'extrait acétate d'éthyle de racine de Tannat par CPC a été opéré en suivant l'acquisition des chromatogrammes UV à 280 et 306 nm (Figure 32). Nous avons récupéré sept fractions différentes à partir des quatre blocs observés sur le chromatogramme, les trois premiers blocs ont chacun été séparés en deux fractions. Le premier et le troisième bloc ont été séparés au niveau de l'apex du pic, alors que le second bloc a été fractionné au niveau de l'épaulement observé (38 min). Le dernier bloc n'a pas été divisé et constitue la fraction 7 (F7). A partir de 75 min de fractionnement, la colonne a été extrudée afin de récupérer les composés retenus dans la phase stationnaire. La première injection de 1,005 g d'extrait acétate d'éthyle de racine de Tannat a permis d'obtenir 8 fractions allant de 19,2 mg pour la F7 à 180,1 mg pour la fraction F2 (Tableau 18). L'ensemble des fractions récupérées représente 76,9 % de la masse de l'extrait injecté avant fractionnement.

Evaluation des fractions pour leur activité inhibitrice du développement fongique et antimycotoxine vis-à-vis de F. graminearum

Répartition par fraction des activités antifongique et antimycotoxine

Lors du criblage réalisé sur les 13 extraits hydro-éthanoliques de co-produits de la vigne développé dans le Chapitre II, nous avons réalisé des cultures sur microplaques. Pour cette expérimentation, nous sommes passés sur boîte de Pétri 8 mL car le nombre moins important de conditions à tester nous le permettait. Nous avons fait le choix de réaliser les cultures sur milieu MS, car sur ce milieu le champignon se développe suffisamment pour voir le potentiel impact de l'extrait sur la croissance du mycélium, de plus ce milieu est favorable à la production de TCTB.

Essais préliminaires sur l'extrait

Lors de premiers travaux sur microplaque 24 puits, nous avons pu tester les extraits hydroéthanoliques dont ceux de racine Nous pouvons observer qu'il y a un effet antifongique de l'extrait et cela dès 10 mg/L. En effet, la biomasse mycélienne est diminuée de 16 % après 10 jours de culture en présence de l'extrait à cette concentration, et plus la quantité d'extrait ajoutée est élevée plus la biomasse diminue. Nous pouvons noter qu'à partir d'une concentration de 40 mg/L, le champignon ne peut même pas se développer dans le milieu de culture. En comparaison avec les résultats obtenus lors du criblage des extraits pour leur activité antifongique sur milieu Gardiner, l'extrait hydroéthanolique de racine de Tannat était inefficace pour inhiber la croissance fongique jusqu'à 10 mg/L. A partir de 25 mg/L, l'inhibition de la croissance fongique était supérieure à 60 % et totale à partir Les dimères de stilbènes semblent également être impliqués dans l'activité antifongique des fractions les plus efficaces. En effet, nous avons identifié de manière putative à l'aide du logiciel SIRIUS un dimère de stilbène, le vitisinol C, ou un isomère le carasiphénol A. Ce métabolite avait déjà été mis en évidence dans les extraits très efficaces pour inhiber la production de 15ADON. Il est donc cohérent de retrouver ce composé à nouveau dans les fractions de l'extrait de racine de Tannat, qui fait partie des extraits efficaces pour inhiber la production de 15ADON. Nous retrouvons également 4 ions, qui une fois dérépliqués par SIRIUS, correspondent à deux autres dimères de stilbènes de formule chimique C28H22O6, notamment l'E-ε-viniférine (identifiée par l'injection d'un standard) et un autre dimère non identifié. Au sujet de la E-εviniférine, le niveau de corrélation est légèrement sous le seuil fixé (pcorr) = 0,666), mais le niveau élevé de covariance (p = 0,218) permet de dire que ce métabolite a une grande influence dans le modèle. Ce dimère de stilbène est abondant dans le bois de vigne et est connu pour être l'élément central pour la biosynthèse de nombreux oligomères de stilbènes [START_REF] Takaya | Biogenetic reactions on stilbenetetramers from Vitaceaeous plants[END_REF]. Dans une démarche de valorisation, il est pertinent de s'intéresser à des métabolites abondants dans les extraits. A titre d'exemple, nous avons dosé 24,6 mg/g d'extrait de ce dimère dans les extraits hydro-éthanoliques de racine de Tannat, soit 11 % des stilbènes dosés dans l'extrait. Ce dimère de stilbène est connu entre autres pour être un métabolite accumulé face à des attaques fongiques du bois de vigne comme l'Esca [START_REF] Amalfitano | Phenols and stilbene polyphenols in the wood of esca-diseased grapevines[END_REF] ou contre P. viticola [START_REF] Alonso-Villaverde | The effectiveness of stilbenes in resistant Vitaceae: Ultrastructural and biochemical events during Plasmopara viticola infection process[END_REF]. Des travaux ont pu montrer que des extraits riches en E-ε-viniférine pouvait permettre de limiter la contamination à P. viticola chez la vigne, ou bien même être efficaces face à des agents pathogènes d'autres plantes, comme le blé avec Fusarium nivale [START_REF] Bala | Antifungal activity of resveratrol oligomers from Cyphostemma crotalarioides[END_REF]. Un ion a été dérépliqué comme pouvant être un dérivé d'acide hydroxybenzoïque de formule chimique C7H6O3. Cette famille de métabolites spécialisés est connue pour être des phytoalexines en réponse à des attaques fongiques ou d'insectes chez les plantes [START_REF] Lattanzio | Role of phenolics in the resistance mechanisms of plants against fungal pathogens and insects[END_REF]. Ces composés sont plus abondants dans les variétés résistantes aux attaques fongiques notamment chez les céréales [START_REF] Chtioui | Bioprospecting Phenols as Inhibitors of Trichothecene-Producing Fusarium: Sustainable Approaches to the Management of Wheat Pathogens[END_REF]. De plus, des essais in vitro sur l'acide p-hydroxybenzoïque montrent des activités intéressantes pour inhiber la croissance d'agents phytopathogènes producteurs de mycotoxine comme ceux du genre Fusarium ou Aspergillus [START_REF] Ahmed | Naturally occurring phenolic compounds as promising antimycotoxin agents: Where are we now?[END_REF][START_REF] Chtioui | Bioprospecting Phenols as Inhibitors of Trichothecene-Producing Fusarium: Sustainable Approaches to the Management of Wheat Pathogens[END_REF].

Par les scores de bioactivités

Comme lors du précédent chapitre, nous nous sommes appuyés sur les réseaux moléculaires basés sur la bioactivité pour tenter de discriminer les déterminants moléculaires corrélés à l'activité antifongique. Nous avons fractionné l'extrait, comme cela a pu être fait dans la preuve de concept par [START_REF] Nothias | Bioactivity-Based Molecular Networking for the Discovery of Drug Leads in Natural Product Bioassay-Guided Fractionation[END_REF] par HPLC préparative, mais ici nous avons utilisé un autre moyen de fractionnement, la CPC. Des travaux récents ont combiné le fractionnement par CPC d'un extrait d'Artemisia annua et la mesure de l'activité antioxydante des fractions aux réseaux moléculaires, mais sans utiliser l'approche statistique par le test de corrélation de Pearson [START_REF] Messaili | Combination of molecular network and centrifugal partition chromatography fractionation for targeting and identifying Artemisia annua L. antioxidant compounds[END_REF].

La méthode utilisant des scores de bioactivité est complémentaire de celle faisant appel aux analyses multivariées, car l'utilisation de données biologiques quantitatives peut permettre de montrer des différences plus fines entre les métabolites constituant les fractions les plus actives.

La Figure 42 représente les clusters comprenant des ions avec des scores de bioactivité élevés obtenus à partir du réseau moléculaire généré avec les données de LC-HRMS/MS de l'extrait de racine de Tannat et des fractions de CPC. Les analyses statistiques ont permis d'attribuer à 33 ions un score de bioactivité élevé. Nous avons fait le choix de focaliser la déréplication sur les ions dont l'intensité dans les fractions les plus actives (F5 et F6) était la plus élevée. Ainsi, une dizaine d'ions avec une intensité comprise entre 10 5 et 3×10 6 mAU ont été dérépliqués (Tableau 20) et les noeuds correspondant à ces ions sont indiqués avec un halo rouge sur le cluster. Les structures des ions putativement identifiés à l'aide de SIRIUS sont présentées sur Figure 43.

Le cluster 1 regroupe 3 ions avec des scores de bioactivité élevés sans pour autant être des molécules de forte intensité dans la fraction F6. Il pourrait correspondre à un cluster de lignanes et néolignanes. Nous retrouvons un ion correspondant à un composé de formule chimique C40H44O13 avec une valeur de corrélation très élevée (r = 0,929), pouvant correspondre à un néolignane. En effet, cet ion a été pseudo-identifié avec les données de MS 2 grâce au logiciel SIRIUS comme pouvant correspondre à quatre néolignanes qui sont l'arctignane D, E, G ou H. Toutefois, ces composés n'ont à notre connaissance jamais été identifiés dans la vigne, mais seulement dans des fruits de bardane, Arctium lappa [START_REF] Umehara | Studies on Differentiation-Inducers from Arctium Fructus[END_REF][START_REF] Umehara | Studies on Differentiation Inducers. VI. Lignan Derivatives from Arctium Fructus. (2)[END_REF]. D'après nos recherches, peu de travaux se sont intéressés aux lignanes de la vigne. Cependant, certains lignanes de type arylnaphtalène ont été isolés de l'espèce V. thunbergii, notamment dans un extrait méthanolique de tiges [START_REF] Niwa | Two Lignan Glycosides from Vitis thunbergii[END_REF][START_REF] Tung | Comparison and Characterization of the Antioxidant Potential of 3 Wild Grapes-Vitis thunbergii,V. flexuosa, andV. kelungeusis[END_REF] et ont pu être supposément dérépliqués dans des baies de vignes sauvages américaines par des analyses métabolomiques non ciblées par UHPLC-Q-TOF-MS [START_REF] Narduzzi | Comparing Wild American Grapes with Vitis vinifera: A Metabolomics Study of Grape Composition[END_REF]. Au sujet des deux autres ions, seule la famille chimique a pu être proposée à l'aide de l'outil CANOPUS du logiciel SIRIUS comme pouvant être des lignanes ou néolignanes. L'activité antifongique et antimycotoxine de certains lignanes ont déjà été étudiés contre F. graminearum ou F. cumorum et la production de TCTB, des composés tels que le pinorésinol, le sécoisolaricirésinol ou le magnolol présentent des activités intéressantes à faible concentration (entre 0,003 et 25 µM, Kulik et al., 2014;Oufensou et al., 2020;Pani et al., 2014). Le cluster 2 est constitué de stilbènes et en particulier d'oligomères. Le noeud avec un halo rouge sur la gauche du cluster a été pseudo-identifié comme un tétramère de stilbène de formule C56H42O12, sans pouvoir être annoté plus précisément. Toutefois ce métabolite a un temps de rétention qui ne correspond à aucun des tétramères de stilbènes mis en évidence précédemment ou des standards analysés par UHPLC-HRMS/MS. Ce noeud est directement lié à un ion identifié comme la vitisine B (r-viniférine, m/z 905,2622 ; tR = 10,93 min), cette dernière a un score de bioactivité élevé, mais en-dessous du seuil fixé (r = 0,737 ; p-value corrigée = 1,18×10 -5 ). Nous pouvons noter que la vitisine B fait partie des tétramères de stilbènes discriminants dans les fractions antifongiques. Sur ce même cluster, un second ion avec un score élevé (r = 0,966) a été dérépliqué et pseudo-identifié comme un pentamère de stilbène de formule chimique C70H50O15 d'après SIRIUS. En comparaison avec les bases de données en ligne SciFinder n et COCONUT, seuls 2 oligostilbènes peuvent correspondre à cette formule chimique, à savoir les amurensines E et F, métabolites précédemment isolés à partir de racine de V. amurensis (K. S. [START_REF] Huang | Four novel oligostilbenes from the roots of Vitis amurensis[END_REF].

Les calculs des scores de bioactivité sur les fractions de CPC ont à nouveau mis évidence des stilbènes comme des métabolites potentiellement corrélés à l'activité antifongique, cependant ce sont des stilbènes différents que ceux préalablement mis en évidence. Parmi eux, nous retrouvons des stilbènes oligomérisés comme des dimères et des trimères. Il se trouve notamment un ion de formule chimique C28H20O7 situé sur le cluster 3, que nous avons pseudoidentifié comme le malibatol A (Figure 43). Ce métabolite a déjà été isolé à partir de cep de vigne coréenne et japonaise [START_REF] Choi | A new glycoside of resveratrol dimer from stem bark of Vitis vinifera[END_REF][START_REF] Yan | A novel oligostilbene named (+)-viniferol A from the stem of Vitis vinifera 'Kyohou[END_REF]. Ce stilbène a une forte similarité structurale avec l'ampélopsine A, métabolite dont nous avons déjà évoqué l'existence dans les extraits antifongiques. En effet, l'ampélopsine A correspond à la réduction du malibatol A au niveau de la double liaison du noyau furanique.

Les trimères de stilbènes sont également représentés au sein des clusters 6 et 10, de plus certains tétramères sont des noeuds isolés. Nous avons identifié 5 ions correspondant à 4 quatre potentiels trimères différents. Un ion de formule chimique C42H30O10 sur le cluster 10 pourrait correspondre à un trimère de resvératrol d'après SIRIUS, et sur la base de la formule chimique associée, SciFinder recense 6 stilbènes différents. Ces composés sont les cotylélophénols A, B, D et E, isolés à partir de tige de Cotylelobium lanceolatum (T. [START_REF] Ito | Two novel trimeric resveratrol derivatives from Cotylelobium lanceolatum[END_REF][START_REF] Ito | Stilbenoids with One Epoxy Group from Cotylelobium lanceolatum[END_REF]) (Figure 43) , ainsi que le grandiphénol C isolés chez Dipterocarpus grandiflorus (T. [START_REF] Ito | Two novel resveratrol trimers from Dipterocarpus grandiflorus[END_REF]. A ce jour, aucun trimère de stilbène avec une formule chimique similaire n'a été isolé dans le genre Vitis.

En conclusion, nous n'avons pas retrouvé les mêmes ions corrélés à l'activité antifongique via les deux approches métabolomiques. Les analyses statistiques multivariées ont fait ressortir les métabolites détectés majoritairement par les analyses UHPLC-HRMS dans les fractions actives, comme la E-ε-viniférine ou la vitisine B (r-viniférine). L'analyse par les scores de bioactivité met quant à elle en évidence des ions fortement corrélés à l'activité biologique des fractions, mais en prenant moins en compte l'abondance de ces composés dans les fractions. Cependant, la représentation sous forme de réseau moléculaire peut faciliter la déréplication des composés, mais aussi orienter vers des métabolites structurellement proches qui pourraient être plus abondants et potentiellement bioactifs.

Mise en évidence des métabolites antimycotoxine par des approches de métabolomique non-ciblée

Lors du second chapitre, nous avions tenté de distinguer les déterminants moléculaires de l'activité antimycotoxine des extraits de co-produits de la vigne. Toutefois, le manque de diversité d'activité au sein des extraits a compliqué le travail de discrimination entre les Les analyses multivariées appliquées afin de discriminer les déterminants moléculaires des fractions antimycotoxine mettent en évidence l'impact de deux métabolites, à savoir la vitisine B et l'E-ε-viniférine. Toutefois, les analyses multivariées effectuées ne font pas de distinction en termes d'activité entre la F4 et les F5 et F6, alors que la première inhibe 92 % de la production de 15ADON et les deux autres n'excèdent pas 67 %. Pour autant, ce sont des composés détectés plus intensément dans les fractions F5 et F6 (Figure 37) que dans F4 (Figure 36), comme la vitisine B, qui ressortent comme étant discriminants. En effet, la vitisine B est détectée à des intensités 13 fois plus intenses dans la F5 (8,8×10 8 ) par rapport à F4 (6,3×10 7 ). De ce fait, nous avons complété les analyses statistiques multivariées par les calculs de bioactivité qui reposent sur le test de corrélation de Pearson, qui eux prennent en compte les variabilités d'activité entre les extraits. pcorr : valeur de corrélation de la variable ; p : valeur de covariance de la variable ; a: selon les niveaux d'annotation de Viant et al. (2017), (1) métabolite identifié par un standard, (2) métabolite putativement annoté à l'aide de bases de données spectrales, (3) famille du métabolite putativement caractérisée à l'aide de bases de données spectrales, (4) inconnu. En rouge, les doublons de métabolites dérépliqués plusieurs fois (adduits, fragment source, problème de déconvolution).

Par les scores de bioactivités

A partir des réseaux moléculaires générés précédemment grâce aux données UHPLC-MS/MS des fractions de CPC d'extrait de racine de Tannat, nous avons importé les scores de bioactivité antimycotoxine pour chacun des ions. Les analyses sur les 13 extraits de co-produits de la vigne n'avaient pas permis de discriminer des métabolites via ces calculs de bioactivité et les analyses multivariées s'étaient portées sur la différence entre les extraits les plus efficaces et les moins efficaces. Comme discuté précédemment, les analyses multivariées réalisées sur les fractions de CPC ne prennent pas en compte les variations d'activités entre deux fractions actives. Ainsi, nous espérons déterminer de manière plus fine les métabolites corrélés positivement à l'activité antimycotoxine à l'aide des scores de bioactivité.

Sur la Figure 47 sont représentés les clusters présentant des noeuds avec les scores de bioactivité les plus élevés. Le seuil a été abaissé pour ces analyses, car le degré de corrélation le plus élevé calculé était de 0,79, ainsi le seuil de bioactivité élevé est fixé à un r ≥ 0,7 et une p-value corrigé > 0,05. De plus, nous avons sélectionné les ions les plus intenses dans la fraction la plus active (F4) pour être dérépliqués, ainsi 10 ions ont été dérépliqués avec des intensités mesurées entre 9×10 4 et 3,5×10 6 mAU. Ces ions correspondent aux noeuds avec un halo rouge sur le réseau moléculaire et les détails sur la déréplication de ces composés sont figurés dans le Tableau 22.

Les structures des métabolites pseudo-identifiés à l'aide de SIRIUS et des bases de données de GNPS sont proposées sur la Figure 48.

Le noeud vert situé sur le cluster 1, de rapport m/z 241,0507, ne fait pas partie des ions les plus intenses dans la F4 (Intensité = 2,5 × 10 4 mAU), mais ce cluster fait partie des plus conséquents du réseau moléculaire généré à partir des données de UHPLC-MS/MS des fractions de CPC. Il est constitué de 85 noeuds, dont certains ont été annotés sur GNPS comme pouvant correspondre à des dérivés d'acides hydroxybenzoïques, comme l'acide gentisique, l'acide gallique et son composé estérifié, le gallate d'éthyle. Ces acides phénoliques n'ont pas été directement corrélés à l'activité antimycotoxine des fractions. Néanmoins, nous pouvons noter que l'acide gallique est connu pour inhiber la production de diverses mycotoxines telles que les trichothécènes de type B dont fait partie le 15ADON, l'ochratoxine A et les aflatoxines (Gomaa & El Nour, 2014;Pagnussatt et al., 2014;Romero et al., 2010). [START_REF] Goufo | A Reference List of Phenolic Compounds (Including Stilbenes) in Grapevine (Vitis vinifera L.) Roots, Woods, Canes, Stems, and Leaves[END_REF]. Certains composés de cette famille, comme la naringénine, ont pu montrer une inhibition quasi-totale à des concentrations inférieures à 3 mM de la production de trichothécènes de type B chez F. graminearum et F. culmorum [START_REF] Bilska | Changes in Phenylpropanoid and Trichothecene Production by Fusarium culmorum and F . graminearum Sensu Stricto via Exposure to Flavonoids[END_REF]. Des dérivés glycosylés comme l'hespéridine et la néohespéridine sont également très efficaces à faible concentration (0,3 mM) pour inhiber totalement la production de DON chez F. graminearum (Salas et al., 2016a). ,1982 ; 451,1199 ; 373,0721 ; 372,0642 ; 371,0565 et 343,0617, déjà retrouvés chez d'autres stilbènes [START_REF] Goufo | A Reference List of Phenolic Compounds (Including Stilbenes) in Grapevine (Vitis vinifera L.) Roots, Woods, Canes, Stems, and Leaves[END_REF]. Nous devons noter que le métabolite identifié putativement comme l'amurensine K dans le précédent chapitre et l'ion parent de ce fragment source (ID = 5505) ne sont pas le même composé car les temps de rétention sont différents (respectivement 9,88 min et 10,47 min).

Le cluster 6 est constitué exclusivement d'ions correspondants à des dimères de resvératrol de de formule chimique C28H22O6, nous pouvons notamment retrouver l'E-ε-viniférine qui était l'un des métabolites avec un niveau élevé de covariance au sein des fractions antimycotoxine. Le score de bioactivité de la molécule est faible car ce composé a un degré de corrélation de 0,30. Les tests de corrélation de Pearson ne viennent donc pas confirmer que cette molécule impacte fortement l'activité antimycotoxine des fractions. Toutefois, au sein de ce cluster, deux ions ont des scores de bioactivité élevé, dont l'ion ID = 3389 qui est celui avec le degré de corrélation le plus élevé de tous les ions détectés (r = 0,79). Ces composés dimériques de resvératrol n'ont pas pu être identifiés à l'aide de standards ni des outils de déréplication. Ces ions ont des temps de rétention différents, à savoir 9,63 min et 9,77 min, et sur le chromatogramme de masse de la fraction F4 nous observons 2 pics, néanmoins les spectres de masse de ces 2 ions sont identiques. Cette dernière information nous laisse suggérer que la déconvolution des pics n'a pas été bonne et que les spectres de MS² ont été fusionnés pour ces deux composés.

Un autre ion (ID = 4652) isolé, de m/z 469,1300 et dont la formule chimique proposée de la molécule est de C28H22O7, pourrait correspondre à un hétérodimère de stilbène. Ce composé a une formule chimique identique à l'ampélopsine A, ainsi qu'un rapport m/z proche (m/z 469,1294), mais présente un temps de rétention différent. En nous référençant à la base de données interne de composés phénoliques, nous trouvons 20 composés avec la même formule chimique. D'après les noms de ces composés, SciFinder référence seulement 3 d'entre eux comme étant déjà retrouvés chez des espèces de Vitis. Parmi eux, se trouve la cis-scirpusine A (Figure 48), un dimère de resvératrol et d'oxyresvératrol, qui peut s'apparenter à de la E-ε-viniférine avec un groupement hydroxyle surnuméraire. Ce métabolite a déjà été retrouvé dans des rafles de raisin de vigne cultivée [START_REF] Kong | Scirpusin A, a hydroxystilbene dimer from Xinjiang wine grape, acts as an effective singlet oxygen quencher and DNA damage protector[END_REF], ou issues de variétés interspécifiques (V. vinifera × V. amurensis × V. labruska et V. vinifera × V. amurensis, [START_REF] Pugajeva | Identification and determination of stilbenes by Q-TOF in grape skins, seeds, juice and stems[END_REF] mais également dans les sarments d'une espèce de vigne américaine, V. rotundifolia [START_REF] Pawlus | Stilbenoid profiles of canes from Vitis and Muscadinia species[END_REF].

Conclusion

Les résultats préliminaires sur l'extrait hydro-éthanolique de racine de Tannat montraient le potentiel de cet extrait pour à la fois pour inhiber la croissance de F. graminearum et la production de TCTB. Le fractionnement par CPC de cet extrait complexe a abouti à l'obtention de huit fractions simplifiées qui ont pu être testées sur des cultures in vitro afin de mesurer l'activité antifongique et antimycotoxine. Les deux activités ont été fractionnées, les fractions F5 et F6 ont permis de concentrer l'activité antifongique, alors que c'est la fraction F4 qui présentait l'activité antimycotoxine la plus élevée.

Les analyses UHPLC-HRMS/MS ont permis d'étudier le contenu chimique des fractions, afin de réaliser une analyse métabolomique non-ciblée dans le but d'identifier les déterminants moléculaires des deux activités étudiées. La première approche appliquée est basée sur les analyses statistiques multivariées. A nouveau, ce sont les stilbènes oligomérisés qui ont fait partie des métabolites discriminants des activités biologiques des fractions de CPC. Les analyses multivariées ont eu tendance à mettre en évidence des composés communs entre les deux activités. C'est notamment le cas de la r-viniférine et de la E-Ɛ-viniférine, et ceci pourrait s'expliquer par la présence de fractions communes dans le groupe des fractions antifongiques et antimycotoxines. Ce sont des stilbènes majoritaires de parties ligneuses de la vigne et le fait que ces composés peuvent être des métabolites potentiellement bioactifs est un avantage dans le but de valoriser les co-produits la filière viticole.

Il était donc pertinent d'utiliser l'approche développée par [START_REF] Nothias | Bioactivity-Based Molecular Networking for the Discovery of Drug Leads in Natural Product Bioassay-Guided Fractionation[END_REF] via les scores de bioactivité pour tenter de discriminer plus finement les métabolites corrélés à ces deux activités. Ainsi, nous avons vu que l'activité antifongique pouvait être corrélée à la présence de néolignanes, qui sont très peu étudiés chez le genre Vitis, mais aussi à des stilbènes de formule chimique peu commune dans la vigne présentant un noyau cycloheptane oxygéné identifiés putativement comme du vitisinol F (C41H34O8), un trimère et du vitisinol C (C27H24O5).

Au sujet, de l'activité antimycotoxine, les scores de bioactivité réalisés sur les extraits n'avaient pas pu donner d'information sur les métabolites corrélés à l'activité. Le fractionnement d'un extrait actif de racine de Tannat a permis de mettre en évidence que ce seraient des stilbènes oligomérisés tels que des dimères et des tétramères déhydrogénés comme les vitisifuranes A ou B qui pourraient être responsables de ces activités.

Ces travaux préliminaires tendent à montrer l'impact fort des stilbènes pour limiter la croissance de F. graminearum et la production de TCTB. Néanmoins, ces composés doivent être testés en culture pour confirmer ces hypothèses. Le travail d'isolement de ces composés par HPLCpréparative est en cours.

Conclusion générale & perspectives

Les travaux menés au cours de cette thèse ont porté sur la valorisation de co-produits de la filière viticole pour contrôler la croissance de F. graminearum et la production de TCTB. Afin d'y parvenir, les activités biologiques d'éco-extraits ont été déterminées in vitro et une approche de métabolomique non-ciblée a été appliquée afin de distinguer les déterminants moléculaires de la bioactivité.

L'étude de propriété antifongique d'éco-extraits de co-produits de vigne

La première partie de ces travaux a porté sur l'éco-extraction de co-produits de la vigne, suivie du criblage de ces extraits pour leur activité antifongique et antimycotoxine in vitro contre F. graminearum. Un panel de treize extraits hydro-éthanoliques obtenu à partir de différentes parties de vigne (sarments, ceps et racines) de cinq cépages différents a été évalué biologiquement. L'activité antifongique de ces extraits a été démontrée pour dix d'entre eux à la concentration de 125 mg/L. Ce sont les extraits des parties basses qui sont apparus les plus efficaces, notamment ceux de racines de Merlot, Tannat, Cabernet sauvignon et de cep de Sauvignon blanc qui inhibent entre 90 et 100 % la croissance de F. graminearum en culture in vitro. La caractérisation de la composition en stilbènes de ces extraits a montré que les parties basses contiennent plus de stilbènes oligomérisés que les parties hautes, ainsi nous observons un gradient d'oligomérisation des stilbènes dans les pieds de vigne (Gabaston et al., 2017). Les stilbènes oligomérisés sembleraient donc plus efficaces pour inhiber la croissance de F. graminearum, comme cela a déjà été montré chez des agents phytopathogènes de la vigne comme Diplodia seriata, Neofusicoccum parvum, Plasmopara viticola (Gabaston et al., 2017;[START_REF] Lambert | Phenolics and their antifungal role in grapevine wood decay: Focus on the Botryosphaeriaceae family[END_REF][START_REF] Schnee | Vitis vinifera canes, a new source of antifungal compounds against Plasmopara viticola, Erysiphe necator, and Botrytis cinerea[END_REF].

L'approche de métabolomique non-ciblée à partir des analyses LC-MS/MS des éco-extraits a conforté notre hypothèse sur le fait que l'activité antifongique serait liée à la présence de stilbènes oligomérisés. Nous avons en effet mis en évidence, à l'aide de standards, la présence plus importante de dimères (ampélopsine A et cyphostemmine B), trimère (E-cis-transmiyabénol C) et tétramère (isohopéaphénol) dans les extraits les plus efficaces. A contrario, la présence de flavan-3-ols comme la catéchine, l'épicatéchine, certaines procyanidines B et C seraient des marqueurs de l'activation de la croissance de F. graminearum dans les extraits de sarments de Merlot, Cabernet sauvignon et d'Artaban. Le fractionnement par CPC de l'extrait racinaire de Tannat a permis de concentrer l'activité antifongique dans les fractions F5 et F6. La déréplication des métabolites corrélés à l'activité antifongique a montré la présence de stilbènes oligomérisés ainsi que de néolignanes dans les fractions les plus actives. L'isolement de ces composés est encore en cours et pourra permettre de vérifier ces hypothèses de structure et de bioactivité.

L'étude de propriété antimycotoxine d'éco-extraits de co-produits de vigne

Au sujet de l'activité antimycotoxine, les treize éco-extraits testés à 25 mg/L ont inhibé la production de 15ADON d'au moins 55 % et jusqu'à 98 % pour l'extrait de racine de Tannat, contre 33 % à 0,1 µM pour le contrôle positif (tébuconazole). Ces résultats montrent pour la première fois l'intérêt des extraits de co-produits de la vigne pour inhiber la production de TCTB. Les analyses métabolomiques non-ciblées réalisées à partir des données de LC-MS/MS des extraits n'ont pas permis de discerner des déterminants moléculaires de l'activité antimycotoxine. Nous estimons que le manque de diversité d'activité entre les extraits pourrait expliquer ce résultat. Le fractionnement par CPC de l'extrait de racine de Tannat a permis de concentrer l'activité antimycotoxine dans la fraction F4. La mise en place d'une approche de métabolomique non-ciblée a alors pu distinguer des oligomères de stilbènes (E-ɛ-viniférine et vitisine B) et des dérivés de flavanones comme des familles de composés potentiellement corrélées à l'activité antimycotoxine des fractions les plus efficaces.

L'annotation des métabolites bioactifs, majoritairement les stilbènes, a pu être faite en partie grâce à des standards isolés au sein de l'axe MIB. L'utilisation des banques de données spectrales présentes sur GNPS n'a pas été très efficace pour annoter les stilbènes. L'approche in silico par le logiciel SIRIUS a permis de faire des propositions structurales en accord avec la bibliographie. Toutefois, ces annotations restent putatives tant que les composés n'ont pas été isolés.

Comprendre les mécanismes d'actions des stilbènes pour inhiber la croissance fongique de F. graminearum et la production de TCTB

Le fractionnement de l'extrait de racine de Tannat a permis de concentrer les activités antifongique et antimycotoxine dans des fractions différentes. Les mécanismes qui régulent la croissance fongique et la synthèse de mycotoxines sont différents chez F. graminearum [START_REF] Boutigny | Ferulic acid, an efficient inhibitor of type B trichothecene biosynthesis and Tri gene expression in Fusarium liquid cultures[END_REF]. L'un des intérêts d'avoir pu concentrer les deux activités dans des fractions différentes est qu'une fois que les molécules seront isolées et caractérisées, elles pourront être testées sur des cultures in vitro afin d'étudier les mécanismes d'action qui régissent ces activités. Afin d'y parvenir, différentes approches sont envisagées, notamment par microscopie, métabolomique et transcriptomique.

Les observations par microscopie électronique pourront permettre d'étudier les modifications que les molécules d'intérêt induisent sur la membrane des champignons. Les effets des molécules actives sur le métabolisme primaire et secondaire du champignon pourront être étudiés à l'aide d'approches métabolomiques par RMN et LC-MS. Pour l'activité antifongique, l'étude des transcrits de F. graminearum pourrait permettre d'identifier la surexpression et la sous-expression de certains gènes en présence de ces métabolites, notamment les gènes qui régissent la biosynthèse des constituants membranaires comme les sphingolipides et les ergostérols [START_REF] Wei | Antifungal activity of cinnamaldehyde against Fusarium sambucinum involves inhibition of ergosterol biosynthesis[END_REF]. Au sujet de l'activité antimycotoxine, l'étude des transcrits pourra notamment aider à comprendre à quel niveau agisse les stilbènes dans l'inhibition des mycotoxines. Ces composés phénoliques pourraient agir à différents niveau, soit directement sur les gènes qui régissent la biosynthèse des TCTB ou sur des voies du métabolisme primaire comme la régulation du stress oxydatif et le cycle de Krebs [START_REF] Atanasova-Pénichon | Mycotoxin biosynthesis and central metabolism are two interlinked pathways in Fusarium graminearum, as demonstrated by the extensive metabolic changes induced by caffeic acid exposure[END_REF], soit lors de leur excrétion par le champignon ou alors en dégradant les mycotoxines.

Les extraits et les métabolites les plus bioactifs devront également être testés sur différentes souches de F. graminearum afin de valider leur activité sur un plus large spectre. L'isolement d'un panel de stilbènes pourrait permettre de les tester contre F. graminearum et d'étudier les effets de synergie de ces composés phénoliques avec d'autres molécules (stilbènes ou autres familles). Les molécules isolées pourront permettre également de réaliser une étude de structure activité comme cela a pu être fait sur des composés phénoliques aromatiques contre la production de fumonisines par F. verticillioides (Dambolena et al., 2011). Ces informations pourraient être utilisées en complément des réseaux moléculaires afin d'identifier des motifs structuraux importants pour l'activité et ensuite cibler l'isolement des composés concernés.

Faciliter la déréplication des stilbènes par les analyses LC-MS/MS et les approches in silico

Au sujet de la déréplication des stilbènes, les réseaux moléculaires ont été utiles pour cibler les clusters de stilbènes, mais les banques de données de GNPS sont pour le moment peu fournies en stilbènes. Il serait donc intéressant de compléter la banque de données spectrales de GNPS par les stilbènes prochainement isolés. De plus, les études déjà existantes [START_REF] Moss | Investigation of monomeric and oligomeric wine stilbenoids in red wines by ultra-high-performance liquid chromatography/electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry[END_REF][START_REF] Zhang | A Fragmentation Study on Four Oligostilbenes by Electrospray Tandem Mass Spectrometry[END_REF] sur les schémas de fragmentation des stilbènes lors des analyses par spectrométrie de masse pourrait être complétées, ainsi cela pourrait faciliter la déréplication de composés inconnus, structurellement proches de stilbènes déjà identifiés. D'autres approches sont envisageables pour améliorer l'annotation de ces composés, notamment l'utilisation de bases de données spectrales in silico. L'axe MIB possède une base de données de plus de 900 stilbénoïdes qui pourraient servir à la déréplication des composés en mélange. Pour cela, l'approche envisagée se base sur les travaux développés par [START_REF] Allard | Integration of Molecular Networking and In-Silico MS/MS Fragmentation for Natural Products Dereplication[END_REF] pour combiner les réseaux moléculaires et l'annotation de molécules à partir de fragmentation in silico de molécules listées dans des bases de données.

L'utilisation du logiciel MetGem pour la génération de réseaux moléculaires utilisant la représentation t-SNE, pourrait faciliter l'observation des clusters contenant des molécules structurellement proches [START_REF] Olivon | MetGem Software for the Generation of Molecular Networks Based on the t-SNE Algorithm [Research-article[END_REF]. Dans ces travaux, les réseaux moléculaires générés par GNPS contiennent un grand nombre de clusters de stilbènes, le regroupement de ces clusters pourrait faciliter leur déréplication et potentiellement identifier des caractéristiques structurales propres à une bioactivité.

Valoriser les éco-extraits de co-produits de la vigne pour le développement d'un produit naturel antifongique

Ces travaux de thèse ont montré l'efficacité d'éco-extraits de co-produits de la vigne pour inhiber la croissance de F. graminearum et la production de 15ADON en culture in vitro. Nous avons fait le choix de distinguer l'activité antifongique et antimycotoxine des extraits ou des fractions, dans un objectif de recherche fondamentale sur la mise en évidence des métabolites responsables de ces deux activités, ainsi que la compréhension des mécanismes d'action de ces métabolites sur le champignon.

L'objectif du projet ANR StilDeTox est de valoriser les co-produits de la vigne à une échelle industrielle pour proposer des solutions de biocontrôle pour des traitements préventifs face à la contamination du blé par F. graminearum. Afin d'y parvenir, différentes étapes sont encore nécessaires, parmi elles le passage des essais in vitro à in planta¸ ainsi que la mise à l'échelle des procédés d'extractions.

Il est envisageable d'améliorer l'extraction des métabolites les plus actifs tout en conservant une approche de chimie verte. L'éthanol utilisé pour réaliser les extractions est considéré comme un solvant vert qui a un impact faible sur l'environnement (Chemat et al., 2012a;[START_REF] Prat | A survey of solvent selection guides[END_REF]. La méthode utilisée pourra être optimisée afin d'améliorer l'activité des extraits à l'aide d'un plan d'expériences [START_REF] Gallego | Simultaneous extraction and purification of fucoxanthin from Tisochrysis lutea microalgae using compressed fluids[END_REF] [START_REF] Rodríguez-Cabo | Comprehensive evaluation of the photo-transformation routes of trans-resveratrol[END_REF]. De plus, l'innocuité de l'extrait riche en stilbènes envers le blé, ses endophytes et les organismes non-cibles devra être vérifiée. Des travaux ont déjà montré que des extraits de bois de vigne n'étaient pas dangereux pour certains nématodes du sol [START_REF] Gabaston | Stilbenes from grapevine root: a promising natural insecticide against Leptinotarsa decemlineata[END_REF]. stilbènes contre Fusarium graminearum par des approches de métabolomique non-ciblée

Cette thèse vise à valoriser les co-produits de la filière viticole pour leur potentiel inhibiteur de la croissance de Fusarium graminearum et de la production des mycotoxines associées. Entre 60 et 80 % des cultures mondiales destinées à l'alimentation humaine sont contaminées par des mycotoxines. En Europe, les céréales sont fortement impactées par les contaminations aux trichothécènes de type B (TCTB), tels que le déoxynivalénol (DON) et le 15-acétyl déoxynivalénol (15ADON) produits par certaines espèces de Fusarium. Les TCTB présents dans les denrées alimentaires sont à la fois toxiques pour l'homme et les animaux. Divers leviers sont utilisés pour contrôler les contaminations par les mycotoxines, dont l'utilisation de fongicides de synthèse. Cependant, la législation européenne et française tend à diminuer leur utilisation pour s'orienter vers des stratégies durables comme l'utilisation d'extraits végétaux. Dans ce travail de thèse, des éco-extraits de co-produits ligneux de la filière viticole (sarments, ceps, racines) issus de cinq cépages ont été criblés pour leur capacité à inhiber le développement fongique de F. graminearum ainsi que la production de 15ADON en culture in vitro. La mise en évidence des métabolites bioactifs a été réalisée par des approches de métabolomique non-ciblée exploitant les données de UHPLC-HRMS n des extraits hydro-éthanoliques. Ces approches s'appuient sur des analyses multivariées et la génération d'un réseau moléculaire basé sur la bioactivité. Les extraits issus des parties basses de la vigne, riches en stilbènes oligomérisés, se sont avérés être les plus actifs. Un extrait de racine de cépage Tannat aux propriétés antifongique et antimycotoxine intéressantes a été choisi pour être fractionné par chromatographie de partage centrifuge (CPC). Les fractions obtenues ont été testées in vitro et des approches de métabolomique non-ciblée ont été appliquées afin d'annoter de manière plus fine les déterminants moléculaires associés aux activités antifongique et antimycotoxine. Les composés majoritaires des fractions bioactives ont en outre été isolés par HPLC-UV préparative et leur identification confirmée par RMN. Ces travaux ont montré l'intérêt d'exploiter les co-produits de la filière viticole dans la recherche de moyens de lutte contre les champignons toxinogènes. L'utilisation d'outils statistiques divers et de déréplication ont par ailleurs permis de déterminer les composés ou familles chimiques possiblement responsables des activités observées.

Mots clés : co-produits de la vigne, stilbènes, Fusarium graminearum, mycotoxines, métabolomique, réseau moléculaire

Study of antifungal and antimycotoxin activities of stilbene-rich grapevine by-products against Fusarium graminearum by untargeted metabolomics approaches

This thesis aims at valorizing grapevine by-products for their potential to inhibit both the growth of Fusarium graminearum and the production of its associated mycotoxins. Between 60 and 80% of the world's food crops are contaminated by mycotoxins. In Europe, cereals are strongly affected by contaminations with type B trichothecenes (TCTB) such as deoxynivalenol (DON) and 15-acetyl deoxynivalenol (15ADON) that are produced by some Fusarium species. TCTBs in foods and feeds are both toxic to humans and animals. Several methods have been applied to control mycotoxin contamination, including the use of synthetic fungicides. However, European and French legislations tend to decrease their use to move towards sustainable alternatives like plant extracts-based solutions. In this thesis, eco-extracts from wood parts of grapevine by-products (canes, trunks, roots) originating from five varieties were screened for their ability to inhibit fungal growth of F. graminearum and 15ADON production in in vitro culture. Identification of bioactive metabolites was performed by untargeted metabolomics approaches using UHPLC-HRMS n data of hydro-ethanolic extracts. These approaches combine multivariate analyses and bioactivity-based molecular networking. Extracts from the lower parts of grapevine, that are rich in oligostilbenes, were found to be the most active. A root extract of Tannat grapevine variety with interesting antifungal and antimycotoxin properties was chosen to be fractionated by centrifugal partition chromatography (CPC). The fractions obtained were tested in vitro and untargeted metabolomics approaches were applied to provide a more detailed description of the molecular determinants associated with antifungal and antimycotoxin activities. The main compounds of the bioactive fractions were isolated by preparative HPLC-UV and their identification was confirmed by NMR. This work showed the interest of exploiting grapevine by-products in order to control infection by toxigenic fungi. The use of various statistical and dereplication tools allowed to determine the compounds or chemical families putatively responsible for the observed activities.

Figure 1 :Figure 2 :Figure 3 :Figure 4 :Figure 5 :Figure 6 :Figure 7 :Figure 8 :Figure 9 :Figure 10 :Figure 11 :Figure 12 :Figure 13 :Figure 14 :Figure 15 :Figure 16 :Figure 17 :Figure 18 :Figure 19 :Figure 20 :Figure 21 :Figure 22 :Figure 23 :Figure 24 :Figure 25 :Figure 26 :Figure 27 :Figure 28 :Figure 29 :Figure 30 :Figure 31 :Figure 32 :Figure 33 :Figure 34 :Figure 35 :Figure 36 :Figure 37 :Figure 38 :Figure 39 :Figure 40 :Figure 41 :Figure 42 :Figure 43 :Figure 44 :Figure 45 :Figure 46 :Figure 47 :Figure 48 :

 123456789101112131415161718192021222324252627282930313233343536373839404142434445464748 Figure 1 : Structures des principaux stilbènes retrouvés chez Vitis vinifera. .......................... 67

Tableau 4 :

 4 .............................................................................. 73 Tableau : Nomenclature et origine des co-produits de la vigne ........................................... 80 Tableau : Gradient d'élution utilisé pour le dosage des stilbènes par HPLC-DAD ............. 83 Propriétés chromatographiques des stilbènes injectés en HPLC-DAD pour le dosage ....................................................................................................................................... 83 Tableau : Gradient d'élution utilisé pour le dosage des TCTB par HPLC-DAD ................. 90 Tableau : Concentration inhibitrice médiane (CI50, en mg/L) de la croissance fongique de F. graminearum par les extraits hydro-éthanoliques de co-produits de la vigne après 5 jours de culture ....................................................................................................................................... 95 Tableau : Pourcentage d'inhibition de la croissance fongique de F. graminearum des extraits éthanoliques de co-produits de la vigne à 125 mg/L après 5 jours de culture ......................... 96 Tableau : Pourcentage d'inhibition de la production de 15ADON par les extraits éthanoliques de co-produits de la vigne à 25 mg/L après 10 jours de culture ............................................... 98 Tableau : Mélanges de stilbènes injectés par infusion directe en spectrométrie de masse et rapports masse/charge (m/z) des ions pseudo-moléculaires associés ..................................... 108 Tableau : Gradient d'élution utilisé pour l'analyse des échantillons par UHPLC-UV-MS/MS ................................................................................................................................................ 108 Tableau : Paramètres de MZmine3 utilisés pour la détection des ions et la création d'une liste de masses ........................................................................................................................ 110 Tableau 12 : Paramètres de génération du Feature-Based Molecular Network (FBMN) sur GNPS ...................................................................................................................................... 112 Tableau : Liste des standards injectés sur UHPLC-HRMS/MS. ..................................... 114 Tableau : Tableau de déréplication des métabolites discriminants des extraits antifongiques vis-à-vis de F. graminearum .................................................................................................. 121 Tableau 15 : Tableau de déréplication des métabolites discriminants des extraits inefficaces vis-à-vis de F. graminearum .................................................................................................. 125 Tableau 16 : Tableau de déréplication des métabolites corrélés positivement à l'activité antifongique dans les extraits de co-produits de la vigne vis-à-vis de F. graminearum ........ 129 Tableau : Tableau de déréplication des métabolites discriminants des extraits très efficace pour inhiber la production de 15ADON chez F. graminearum ............................................. 137

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  observed. For example, deoxynivalenol (DON) concentrations were decreased from eastern to 3on the Prairies of Canada and in Central Alberta compared to South

  Figure S1.B, based on 2020 BIOMIN survey data for corn and cereals (e.g., wheat, barley, oats, rice, sorghum, millet) worldwide, shows doughnut charts of world continents and regions. Surprisingly, 49 to 96% of samples were contaminated with one or more mycotoxins above risk levels with DON, ZEN and FUMs as the major mycotoxins identified.

  FIGURE S1 A. Distribution of mycotoxins according to climate zones worldwide. Mycotoxins mentioned below country names were detected in commodities between 2017 and 2021. B. Doughnut charts show risk level expressed as percentage of samples tested positive for at least one mycotoxin above threshold level set by BIOMIN. Data from BIOMIN Holding GmbH (2020) on 21,000 food and feed samples from 79 countries.

Figure S2 :

 S2 Figure S2:The flavonoids and stilbenes biosynthetic pathway (fromDewick, 2009)

Figure 1 :

 1 Figure 1 : Structures des principaux stilbènes retrouvés chez Vitis vinifera. 1. E-resvératrol, 2. Z-resvératrol, 3. picéide, 4. ptérostilbène, 5. E-ε-viniférine, 6. pallidol, 7. glucoside de E-ε-viniférine, 8. α-viniférine, 9. E-r-viniférine (E-vitisine B). Les groupements fonctionnels en rouge illustrent les différences structurelles par rapport au E-resvératrol.

Figure 2 :

 2 Figure 2 : Représentation schématique de la génération d'un réseau moléculaire basé sur les données de LC-MS/MS, d'après Aron et al., 2020.

Tableau 2 :

 2 été réalisé sur cinq cépages de Vitis vinifera (Merlot, Cabernet sauvignon, Sauvignon blanc et Tannat). Le matériel végétal a été collecté par le Dr. Julien Gabaston lors de sa thèse de doctorat. En plus de ces cépages, des sarments du cépage Artaban ont été collectés en février 2020 (Tableau 2). Il s'agit d'un cépage résistant à l'oïdium et au mildiou sélectionné par l'INRAE et récemment ajouté au Catalogue officiel français (Calonnec et al., 2021; Ministère de l'Agriculture et de l'Alimentation, 2018). Parmi ces cépages, quatre sont rouges, à savoir le Merlot, le Cabernet sauvignon, le Tannat et l'Artaban et un seul est blanc, le Sauvignon blanc.Le matériel végétal a été collecté entre 2017 et 2020 sur des plants de vigne cultivés en France dans la région Nouvelle-Aquitaine pour les cépages rouges et en Centre-Val de Loire pour le cépage blanc. Les pieds de vigne ont été séparés en trois sous-parties, les sarments, les ceps et les racines, puis ont été broyés grossièrement à l'aide d'un broyeur à branches (Bosch, Stuttgart, Allemagne) puis en copeaux d'environ 0,5 cm de long par un broyeur à percussion (Fristch, Universal Cutting Mill Pulverisette 19, Idar-Oberstein, Allemagne). Les copeaux obtenus ont été séchés dans une étuve à 35 °C pendant 2 semaines pour être ensuite stockés dans une pièce sèche à 22 °C à l'abri de la lumière[START_REF] Gabaston | Wood and roots of major grapevine cultivars and rootstocks: A comparative analysis of stilbenes by UHPLC-DAD-MS/MS and NMR[END_REF]. Pour chaque pied, des réserves de 200 à 500 g ont été constituées selon la disponibilité de la matière première et conservées à température ambiante à l'obscurité. Nomenclature et origine des co-produits de la vigne de composés phénoliques nécessite l'utilisation de solvants de polarités intermédiaires, comme l'acétone, le méthanol ou l'éthanol. Notre choix s'est porté sur l'acétone et l'éthanol. Deux mélanges de solvant ont été utilisés pour un test préliminaire sur des poudres de sarments de Merlot, en vue de choisir le mélange le plus optimal pour l'extraction des stilbènes. Il s'agit d'un mélange acétone/eau (60/40, v/v) et d'un autre éthanol/eau (85/15, v/v). Ces proportions de solvants leur confèrent des polarités proches : l'acétone étant moins polaire que l'éthanol, un plus grand pourcentage d'éthanol est nécessaire. Les extraits ont été obtenus à l'aide d'un appareil automatisé d'extraction accélérée par solvants (ASE) (ASE 350, Dionex Corporation, Sunnyvale, CA). Les paramètres d'extractions ont été ceux décrits par Gabaston et al. (2019), soit une température de 60 °C et une pression de 10 Mpa (100 bar) à raison de 2 cycles consécutifs de 5 min chacun. Après chaque cycle, un flux d'azote gazeux a été injecté pendant 100 s dans la cellule pour la purger de l'extrait liquide. Enfin, un rinçage de la cellule d'extraction a été effectué avec le mélange de solvant (60 % du volume de la cellule). L'extrait liquide a été collecté dans des bouteilles en verre de 250 mL. Des cellules d'extraction en acier inox de 34 mL ont été utilisées pour l'extraction, un montage comme présenté sur la Figure 3 a été réalisé. Les cellules sont constituées, de bas en haut, d'un filtre en fibre de cellulose (ASE Extraction filters Cellulose, Dionex Corporation, Sunnyvale, CA), puis environ 1 g de sable de Fontainebleau et enfin 5 g de poudre de sarment de Merlot. Chaque extraction a été réalisée en duplicat.

Figure 3 :

 3 Figure 3 : Schéma du montage de la cellule d'extraction d'ASE

  Dosage de stilbènes par HPLC-UV Pour l'ensemble des extraits hydro-éthanoliques de co-produits de la vigne, neuf stilbènes ont été dosés par HPLC-DAD. La structure et le nom de ces stilbènes sont représentés sur la Figure 4.

Figure 4 :

 4 Figure 4 : Structures des stilbènes dosés dans les extraits hydro-éthanoliques par HPLC-DAD.

  Enfin, chaque extrait a été dilué à 0,05, 0,5 et 1 mg/mL dans un mélange méthanol/eau (50/50, v/v) et filtré sur filtre PTFE hydrophile de 0,2 µm, puis un volume de 10 µL a été injecté en triplicat. La concentration des 9 stilbènes a été déterminée pour chaque extrait et exprimée en µg de composé/mg d'extrait à partir de la concentration dosée dans l'échantillon injecté. Traitement statistique des données Un test de corrélation de Pearson a été utilisé pour étudier la relation entre les activités antioxydantes mesurées et la concentration de chaque stilbène et les stilbènes totaux. Les analyses ont été réalisées à l'aide du logiciel XLSTAT (version 2022.1.2, Addinsoft, Rennes).Caractérisation des extraits hydro-éthanoliquesRendement d'extraction des extraits hydro-éthanoliques Pour chacun des extraits éthanoliques obtenus par ASE, le poids sec a été exprimé en mg ainsi qu'en pourcentage de rendement massique d'extraction et ces valeurs sont résumées dans la Figure5. Nous observons de faibles variations de rendement entre deux réplicats (environ 1 %), à l'exception des extraits de racine de Merlot, où nous avons une différence du simple au double entre les deux réplicats. Des quantités d'extraits allant de 186 mg pour les ceps de Merlot à 473 mg pour les racines du même cépage ont permis d'avoir suffisamment de matière pour réaliser le criblage biologique des extraits ainsi que les analyses chromatographiques.

Figure 5 :

 5 Figure 5 : Quantités d'extraits obtenus par extraction hydro-éthanolique (ASE) à partir de 5 g de chaque co-produit viticole. Les résultats pour chaque réplicat d'extraction sont représentés par une même couleur. En pourcentage sont indiqués les rendements massiques obtenus pour chaque extrait.

  1) et E-picéatannol (2)), des dimères (E-ε-viniférine (3), E-ω-viniférine (4), pallidol (5) et ampélopsine A (6)), des trimères (α-viniférine (7) et E-miyabénol C (8)) et un tétramère (R-viniférine ou E-vitisine B (9)) dont les structures sont représentées sur la Figure 4. A titre d'illustration, les chromatogrammes d'un extrait de ceps de Merlot, riche en stilbènes, et de sarment de Cabernet sauvignon, peu abondant en stilbènes, sont présentés sur la Figure 6.

Figure 6 :

 6 Figure 6 : Chromatogrammes UV (280 nm) des extraits hydro-éthanoliques de ceps de Merlot et de sarment de Cabernet sauvignon à 1 g/L. Les pics numérotés correspondent à ceux des différents stilbènes dosés : 1 : E-Resvératrol, 2 : E -Picéatannol, 3 : E -ε-Viniférine, 4 : E -ω-Viniférine, 5 : Pallidol, 6 : Ampélopsine A, 7 : α-Viniférine, 8 : E-Miyabénol C, 9 : R-Viniférine.

Figure 7 :

 7 Figure 7 : Quantités de stilbènes dosés par HPLC-DAD dans les extraits hydro-éthanoliques ASE de co-produits de bois de vigne. Les couleurs indiquent le degré d'oligomérisation des stilbènes dosés. En vert : monomères (E-resvératrol et Epicéatannol), en jaune : dimères (E-ε-viniférine, E-ω-viniférine, pallidol, ampélopsine A), en vert : trimères (α-viniférine et Emiyabénol C), en bleu : tétramère (r-viniférine). Les valeurs précisées sur les histogrammes représentent les proportions en % des différents monomères et oligomères dosées dans l'extrait.Une plus grande quantité et proportion de tétramère, ici la R-viniférine (vitisine B), est retrouvée dans les racines de vigne. Par exemple, si nous nous intéressons au cépage Tannat, la quantité de stilbènes dosés dans les différentes parties est proche, soit environ 220 mg/g d'extrait. Mais la quantité de tétramère de stilbène a tendance à augmenter en descendant dans le pied de vigne, en effet nous avons dosé dans les sarments, ceps et racine de ce cépage, respectivement 16,4 ; 33,8 et 123,3 mg/g de R-viniférine dans ces extraits. En parallèle, nous pouvons noter une diminution de la quantité de stilbènes moins oligomérisés comme les dimères (principalement la E-ε-viniférine et la E-ω-viniférine). Ce phénomène de gradient d'oligomérisation des stilbènes au sein d'un pied de vigne a été mis en évidence parGabaston et al. (2017) sur des extraits issus de mélanges de cépage ; cela a été confirmé par la suite sur sept cépages dont ceux utilisés dans notre étude[START_REF] Gabaston | Wood and roots of major grapevine cultivars and rootstocks: A comparative analysis of stilbenes by UHPLC-DAD-MS/MS and NMR[END_REF]. La distribution des stilbènes semble également varier selon les cépages, certains d'entre eux présentent une abondance en monomères dans les sarments et ceps, c'est notamment le cas du cépage Merlot qui est riche en ces composés contrairement aux autres cépages. Dans ces deux extraits sont retrouvées les quantités les plus importantes de E-resvératrol, en effet nous retrouvons en

Figure 8 :

 8 Figure 8 : Pourcentage d'inhibition du radical DPPH par les différents extraits hydro-éthanoliques ASE des co-produits de vigne testés à 50 mg/L en comparaison avec le Trolox

  Matériel fongique et préparation de l'inoculumLes expérimentations ont été réalisées sur la souche CBS 185.32 de F. graminearum. La souche a été stockée sur milieu incliné gélosé de Potato Dextrose Agar (PDA, BD Difco) sous huile minérale à 4 °C. Un repiquage est nécessaire sur milieu PDA à 25 °C avant d'initier une expérimentation. Une fois que le champignon s'est suffisamment développé sur milieu solide, l'étape de sporulation a été initiée par inoculation de 4 implants d'environ 0,5 cm² dans 20 mL de milieu liquide de carboxyméthylcellulose (CMC, Sigma-Aldrich) sous agitation à 80 rpm (Infors Multitron Standard) à 25 °C pendant 3-4 jours. Ce milieu est constitué pour 1 L de 15 g de CMC, 1 g d'extrait de levure (Bacto TM Yeast Extract, ThermoFisher), 1 g de NH4NO3 (Sigma-Aldrich), 1 g de KH2PO4 (Sigma-Aldrich) et 0,5 g de MgSO4 + 7 H2O (Sigma-Aldrich)[START_REF] Cappellini | Macroconidium Formation in Submerged Cultures by a Nonsporulating Strain of Gibberella Zeae[END_REF]. Après incubation, le milieu a été filtré sur filtre stérile (Sefar Nitex 100 µm, VWR) et centrifugé 10 min à 4700 rpm, puis le surnageant a été éliminé, les spores contenues dans le culot ont été rincées par 4 mL d'eau stérile avant d'être à nouveau centrifugées. L'eau surnageante a été éliminée et 4 mL de milieu de culture synthétique (MS) ou Gardiner, selon les cultures, ont été ajoutés aux culots de spores. Une fois l'inoculum mis en suspension, les spores ont été dénombrées à l'aide d'une cellule de Malassez, au besoin cette préparation a été diluée avec du milieu de culture pour obtenir une concentration à 2,5.10 5 spores/mL.Conditions de cultures fongiquesLors des premières étapes de mise au point de l'essai, la souche de F. graminearum a été mise en culture soit sur des microplaques de 24 ou de 96 puits (Greiner CELLSTAR) contenant du milieu de culture synthétique (MS) ou Gardiner. Le choix s'est porté sur des milieux de culture liquide permettant une solubilisation plus facile de l'extrait, mais aussi pour permettre l'extraction des TCTB via l'ajout d'un solvant non miscible dans l'eau.

  Suivi de croissance fongique par spectrophotométrieLe suivi de la croissance fongique a pu être réalisé à différents temps de culture par des mesures d'absorbance. Un lecteur de microplaque (TECAN, Infinite M200 Pro, Grödig, Autriche) a permis la lecture des plaques à 2 longueurs d'onde (630 et 750 nm). En comparant les valeurs d'absorbance du témoin négatif (milieu + EtOH) avec celles des échantillons (milieu + extraits ou milieu + TEB), l'inhibition de la croissance fongique induite par les extraits a pu être exprimée en pourcentage en appliquant la formule suivante :𝑃𝑜𝑢𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑎𝑔𝑒 𝑑 ′ 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑓𝑜𝑛𝑔𝑖𝑞𝑢𝑒 = 1 -( 𝐴𝑏𝑠 𝐸𝑐ℎ𝑎𝑛𝑡𝑖𝑙𝑙𝑜𝑛+𝐹𝑔 -𝐴𝑏𝑠 𝐸𝑐ℎ𝑎𝑛𝑡𝑖𝑙𝑙𝑜𝑛 𝐴𝑏𝑠 𝑇é𝑚𝑜𝑖𝑛 𝑛é𝑔𝑎𝑡𝑖𝑓 ) × 100Fg : F. graminearum, Abs : absorbance à 750 nm.Cette méthode de calcul permet une comparaison des données entre des essais réalisés à différents moments. Dosage des TCTB 3.1.4.1 Extraction des TCTB Lors de l'arrêt des cultures, le mycélium et le milieu de culture ont été séparés à l'aide d'une spatule stérile ou par centrifugation. Le mycélium a été stocké à -80 °C avant d'être lyophilisé pour déterminer la biomasse fongique. Un volume de 1 mL de milieu de culture a été prélevé pour réaliser l'extraction des TCTB excrétés par F. graminearum. A ce milieu, 3 mL d'acétate d'éthyle (VWR) ont été rajoutés puis mélangés à l'aide d'un vortex pendant 5 min. Une partie du surnageant (2,5 mL) a été prélevée puis évaporée à sec sous flux d'azote gazeux à 40 °C. Tableau 5 : Gradient d'élution utilisé pour le dosage des TCTB par HPLCles TCTB présents dans les milieux de culture, une gamme d'étalonnage d'un mélange de quatre TCTB a été préparée. Ce mélange commercial (Biopure TM MIX2, Romer) contient 4 mycotoxines fusariennes dont le déoxynivalenol, le nivalenol, le 15-acetyl déoxynivalenol et le 3-acetyl déoxynivalenol. La gamme a été constituée des 5 points suivants : 5, 10, 25, 50, et 100 mg/L.

  de Merlot enrichi en stilbènes (STE) et obtenu au laboratoire lors de manipulations préliminaires, ainsi que suivre la croissance de F. graminearum pendant 7 jours par mesure d'absorbance des milieux de culture à deux longueurs d'ondes (630 et 750 nm). Les mesures de DO ont l'avantage d'être plus rapide et non destructive en comparaison avec des pesées de mycélium quotidiennes. Nous avons donc testé l'extrait mélangé directement dans le milieu de culture Gardiner à 5 concentrations : 50, 125, 250, 500 et 1000 mg/L.

Figure 9 :

 9 Figure 9 : Suivi de croissance par absorbance à 630 nm (ronds) et 750 nm (carrés) de F. graminearum en présence ou non d'acide caféique (AC) ou d'extraits STE à 50 et 125 mg/L sur milieu Gardiner en plaque de 24 puits.Les cultures supplémentées par 50 mg/L d'extrait ont légèrement impacté la croissance du champignon jusqu'à 4 jours (Figure9), tandis qu'en présence de 125 mg/L d'extraits le champignon a été impacté avec une très forte inhibition de sa croissance à 4 jours (environ 89 % d'inhibition). Le témoin positif, l'acide caféique à 3 mM, a inhibé très fortement la croissance du champignon. Au sujet des extraits à 250, 500 et 1000 mg/L, nous avons observé une mauvaise solubilisation des extraits dans le milieu. De plus, après 7 jours de culture, la souche de F. graminearum ne s'est pas développée à ces concentrations (données non présentées). Ces résultats nous ont permis de connaitre la limite de solubilisation de cet extrait en milieu aqueux (aux alentours de 125 mg/L), ainsi que la limite de tolérance du champignon à l'extrait (entre 125 et 250 mg/L).

  ) ou en présence de l'extrait. Les absorbances mesurées à 750 nm sont légèrement moins élevées que celles à 630 nm après 4 jours de culture, ce critère nous a permis de faire notre choix pour la longueur d'onde la plus élevée pour faire le suivi de croissance. En effet, dans le cas d'une culture où le champignon aurait une croissance supérieure, des mesures de croissance à 750 nm donneraient des valeurs moins élevées qu'à 630 nm et empêcheraient une potentielle saturation du détecteur.Choix de la souche de F. graminearum Afin de sélectionner les souches de travail pour le criblage, deux souches ont été inoculées en présence d'extraits STE (Figure10). Les deux souches sont nommées par leur numéro de référencement interne au laboratoire à savoir 164 et 349. Tout d'abord, nous pouvons observer que ces deux souches ont des cinétiques de croissance proches, avec une phase de croissance comprise entre 2 et 4 jours suivis de la phase stationnaire. Afin de regarder les effets de la molécule contrôle et des extraits, les observations sont faites en fin de phase de croissance à 4 jours. Ainsi, au vu de l'absorbance mesurée, les deux souches sont peu impactées par l'extrait à 50 mg/L, ce qui témoigne d'une absence d'effet antifongique. A une concentration plus élevée de 125 mg/L, l'extrait inhibe presque totalement le développement du champignon, tout comme en présence d'acide caféique à 3 mM (environ 60 mg/L). Pour les deux souches, une concentration plus élevée que 125 mg/L d'extrait STE empêche totalement le développement du champignon en milieu liquide.

Figure 10 :

 10 Figure 10 : Suivi de croissance des souches 349 (carrés) et 164 (ronds) de F. graminearum en présence ou non d'acide caféique (AC) ou d'extraits STE à 50 et 125 mg/L sur milieu Gardiner, par mesure de l'absorbance à 750 nm.

Figure 11 :

 11 Figure 11 : Suivi de croissance par absorbance à 750 nm de F. graminearum cultivé sur milieu Gardiner (ronds) ou MS (carrés) en plaques 96 puits Au sujet du milieu de culture utilisé, nous pouvons voir, sur la Figure 11, que les absorbances mesurées sur milieu Gardiner (ronds) sont plus élevées que sur milieu MS (carrés) et cela témoigne d'une croissance plus importante de F. graminearum sur ce milieu. Ainsi, la phase stationnaire est atteinte entre 5-6 jours en milieu Gardiner, alors qu'il faut attendre le jour 10 sur milieu MS. Il y a une phase de croissance rapide pour le milieu Gardiner entre 2,5 et 6 jours, et c'est dans cette période de croissance que nous souhaitons déterminer le potentiel antifongique des extraits. Au sujet de l'impact de l'éthanol sur la croissance du champignon, nous pouvons voir que la courbe du champignon dans le milieu seul (bleu foncé) et en présence d'éthanol (bleu clair) suivent la même tendance, mais avec des absorbances mesurées plus

  Les résultats du dosage du 15ADON dans le milieu MS sont présentés dans la Figure12. Nous pouvons observer que la souche 349 produit du 15ADON dans les conditions témoin (MS), et qu'il y a une diminution de la production de mycotoxine en présence de 0,5 % EtOH, toutefois cette différence n'est pas significative au vu du test statistique utilisé. Nous avons observé une forte variabilité entre les différentes répétitions. Nous pouvons observer que l'extrait STE testé à 5, 10, 50 et 100 mg/L diminue la production de 15ADON en comparaison avec le témoin. Cependant, seuls les essais à 100 mg/L sont significativement différents des conditions témoins. Il est intéressant de noter que nous n'observons pas d'effet dose sur la production de mycotoxine entre 1 et 10 mg/L, mais à partir de 25 mg/L jusqu'à 100 mg/L.

Figure 12 :

 12 Figure 12 : Concentration de 15ADON produit par la souche 349 de F. graminearum (µg/mg de biomasse sèche) sur milieu MS en présence de 0,5 % d'éthanol, d'acide caféique (AC : 3 mM) et d'extrait STE à 5 concentrations (1, 5, 10, 25, 50 et 100 mg/L). *Différence significative en comparaison avec les conditions témoins (Milieu MS + 0,5 % EtOH) à une p-value < 0,05 par le test de Kruskal-Wallis

Figure 13 :

 13 Figure 13 : Masse du mycélium de F. graminearum après 10 jours de culture sur milieu MS en présence des différents extraits hydro-éthanoliques de co-produits de la vigne à 25 mg/L. *Différence significative en comparaison avec les conditions témoins (Milieu MS + 0,5 % EtOH) à une p-value < 0,05 par le test de Kruskal-Wallis

Figure 14 :

 14 Figure 14 : Etat de l'eau selon les conditions de température (°C) et de pression (MPa), d'après Thiruvenkadam et al. (2015) Obtention des extraits à l'eau sous-critique Une sélection restreinte de six co-produits a été utilisée pour réaliser les extractions à l'eau sous-critique (SWE). Notre choix s'est porté sur des matrices dont l'extrait hydro-éthanolique a présenté une activité antifongique et antimycotoxine intéressante, tout en essayant de conserver une diversité dans le panel de matrices (partie de la vigne et cépage). Ainsi, les sarments de Tannat, les ceps de Sauvignon blanc et les racines de Merlot, de Sauvignon blanc, de Cabernet sauvignon et de Tannat ont été utilisés. Les quantités obtenues à partir de 5 g de matière première et les rendements d'extraction massiques sont présentés dans la Figure 15. Des rendements d'extraction nettement supérieurs à ceux obtenus par l'extraction hydroéthanolique ont été obtenus. C'est notamment le cas pour les extraits de cep de Sauvignon blanc, où trois fois plus d'extrait ont pu être obtenus par une extraction à l'eau sous-critique. En effet, l'eau utilisée pour les extractions SWE est un solvant plus polaire que l'éthanol, des composés avec une plus grande affinité pour l'eau plutôt que l'éthanol peuvent être extraits. Cela peut être le cas des hémicelluloses qui sont abondantes dans les parties ligneuses et qui peuvent être facilement extraites par SWE (Andérez Fernández et al., 2018). Au sujet de la composition en stilbènes, Gabaston et al. (2018) ont montré que des extraits obtenus par extraction à l'eau souscritiques de sarments et de racines de cépage Merlot porte-greffe Riparia Gloire de Montpellier sont significativement moins concentrés en stilbènes en comparaison avec un extrait éthanolique (85 % d'éthanol). Les paramètres d'extraction appliqués dans notre étude sont les mêmes que ceux présentés dans les travaux de Gabaston et al. (2018).

Figure 15 :

 15 Figure 15 : Quantité d'extraits obtenus par extraction à l'eau sous-critique (SWE) à partir de 5 g des différents co-produits viticoles sélectionnés. En pourcentage sont indiqués les rendements massiques obtenus pour les différents extraits Evaluation de l'activité antifongique des extraits à l'eau sous-critique Les six extraits ont été testés pour leur activité antifongique et antimycotoxine à des concentrations de 125, 250, 500 et 1000 mg/L. Les pourcentages d'inhibition des extraits à 125 mg/L sont exprimés en fonction d'un contrôle négatif, ici le milieu MS inoculé sans ajout d'éthanol (Figure 16). Les extraits ayant été obtenus par une extraction aqueuse à haute pression et température, nous avons estimé que la solubilité de ces extraits secs pouvait être augmentée, par rapport aux extraits hydroéthanoliques, dans des milieux de culture liquides à température ambiante sans nécessité l'ajout d'éthanol. Une valeur négative d'inhibition correspond à une induction de la croissance fongique.

Figure 16 :

 16 Figure 16 : Pourcentage d'inhibition/d'activation de la biomasse fongique (bleu) et de la production de 15ADON (gris) des extraits à l'eau sous-critique de co-produits de la vigne à 125 mg/L après 10 jours de culture. *Différence significative en comparaison avec les conditions de contrôle (Milieu MS) à une p-value < 0,05 par le test de Kruskal-Wallis. L'activité inhibitrice est calculée en suivant la formule décrite dans la partie matériels et méthodes. Le calcul du pourcentage d'inhibition/activation de la biomasse est réalisé selon la formule suivant : % = [(biomasse condition de contrôlebiomasse condition extrait)/biomasse condition de contrôle] × 100. Pour la production de 15ADON, les valeurs de biomasse ont été remplacées par les concentrations de 15ADON en mg/g de biomasse.

Figure 17 :

 17 Figure 17 : Effet des extraits à l'eau sous-critique (SWE) de co-produits de la vigne à différentes concentrations sur la croissance fongique de F. graminearum après 10 jours de culture. *Différence significative en comparaison avec les conditions de contrôle (Milieu MS) à une p-value < 0,05 par le test de Kruskal-Wallis

Figure 18 :

 18 Figure 18 : Effet des extraits à l'eau sous-critique (SWE) de co-produits de la vigne à différentes concentrations sur la production de 15ADON par F. graminearum après 10 jours de culture.*Différence significative en comparaison avec les conditions de contrôle (Milieu MS) à une p-value < 0,05 par le test de Kruskal-Wallis Bilan sur l'utilisation des extraits à l'eau sous-critiqueLes extractions à l'eau sous-critique des co-produits de la vigne ont permis d'obtenir de meilleurs rendements d'extraction que les extraits hydro-éthanoliques, mais ces extraits se sont avérés être moins actifs une fois testés en solution. L'absence d'activité antifongique mesurée chez les extraits aqueux a motivé notre choix de continuer les expérimentations avec les extraits hydro-éthanoliques. En effet, l'activité antifongique ne doit pas être négligée pour le développement d'un potentiel produit de bio-contrôle.

  méthode d'analyse par UHPLC-UV-MS Les analyses par UHPLC-UV-HRMS/MS ont été réalisées sur un système Vanquish Flex Binary UHPLC (Thermo Fischer Scientific, Brême, Allemagne) équipé d'une pompe binaire, d'un dégazeur, d'un échantillonneur automatique, d'un four à colonne et d'un détecteur UV/Vis VWD Vanquish Flex. Le système de séparation chromatographique est couplé à un spectromètre de masse à haute résolution (HRMS) de type hybride quadrupole-Orbitrap, Q Exactive Plus (Thermo Fischer Scientific), avec une source d'ionisation par électrospray à chaud (HESI-II). L'ensemble des analyses ont été faites sur une colonne en phase inverse Zorbax-SB-C18 (Agilent Technologies) d'un diamètre interne de 2,1 mm et de 100 mm de long, équipée d'une pré-colonne de la même référence d'un diamètre interne de 2,1 mm et de 5 mm de long ; le greffage de la colonne et de la pré-colonne est d'une granulométrie de 1,8 µm.

  Les paramètres d'ionisation de la source HESI-II ont été obtenus à la suite d'une étape d'optimisation de la réponse pour la détection des stilbènes en mélange (Tableau 9) par infusion directe dans la source. L'ajustement des paramètres de la source s'est fait par la visualisation sur le logiciel Tune (version 2.9, Thermo Fisher Scientific) de l'intensité des ions parents. Les paramètres de source modifiés lors de l'optimisation de la réponse ont été le niveau de radio-fréquence du S-lens entre 50 et 100 unités arbitraires (UA) et le débit du gaz de balayage du quadripole (N2) entre 0 et 4 UA, ainsi que dans une moindre mesure le débit du gaz de gaine (N2) testé à 35 et 50 UA et la température du gaz auxiliaire (N2) testé à 320 et 350 °C. Une fois cette étape d'optimisation réalisée, le niveau de S-lens a été fixé à 80 UA, la température du gaz auxiliaire à 350 °C, les débits du gaz de balayage et du gaz de gaine ont été fixés respectivement à 3 et 35 UA. Les paramètres de source HESI-II non modifiés ont été le débit du gaz auxiliaire, la tension électrique de pulvérisation en source et la température du capillaire, qui sont respectivement de 20 UA, -3,5 kV et 370 °C.Application d'une approche de métabolomique non-ciblée pour l'identification des métabolites bioactifsMéthode d'analyse par UHPLC-UV-MS/MS Les analyses par UHPLC-UV-MS/MS ont été réalisées avec la méthode séparative décrite dans le Tableau 10 et avec les paramètres de la source d'ionisation obtenus après l'étape d'optimisation des paramètres de masse. Les 13 extraits hydro-alcooliques préalablement préparés à 1 mg/mL, ainsi qu'un contrôle qualité (QC) constitué d'un mélange de chacun des échantillons dans les mêmes proportions, et un blanc d'analyse formé d'acétonitrile Optima/eau milliQ (50/50, v/v) filtré sur filtre PTFE hydrophile de 0,2 µm, ont été analysés par UHPLC-UV-MS/MS. Chaque échantillon a été injecté trois fois dans une liste d'échantillons randomisés et un QC a été analysé toutes les 5 injections. Prétraitement des données par MZmine Les données brutes Thermo (.raw) obtenues à la suite des analyses par UHPLC-MS/MS ont été importées sur le logiciel MZmine (version 3.0.21, Pluskal et al., 2010) dans le but de détecter les ions et leurs spectres de fragmentation en masse présents dans les échantillons analysés. Pour cela, différentes étapes de prétraitement ont été réalisées et sont détaillées dans le Tableau 11. Tableau 11 : Paramètres de MZmine3 utilisés pour la détection des ions et la création d'une liste de masses Min ratio of peak top/edge: 1,25 Peak duration range (min/mobility) : 0 à 1,5 Min # of data points : 3 Suppression des isotopes à l'aide d'un filtre isotopique du 13C m/z tolerance : 5 ppm Retention time tolerance : 0,05 min Maximum charge : 2 Alignement des pics à l'aide de l'algorithme (Join aligner) m/z tolerance : 5 ppm Weight for m/z : 3 Retention time tolerance : 0,1 min Weight for time : 1 Mobility weight : 1 Feature list rows filter Minimum feature in a row : 2 Minimum features in an isotope pattern : 2 Never remove feature with MS2 : on Gap filling par Peak finder Intensity tolerance : 20 % m/z tolerance : 5 ppm Retention time tolerance : 0,15 min Minimum data points : 1

Figure 19 :

 19 Figure 19 : Distribution des données de spectrométrie des masse des extraits hydro-éthanoliques de co-produits de la vigne, selon la méthode de mise l'échelle UV (A) ou Pareto (B). En abscisse, la valeur d'aire sous le pic des ions détectés après correction, en ordonnée le nombre d'échantillons où cette valeur a été mesurée.

Figure 20 :

 20 Figure 20 : (A) ACP obtenue à partir des données UHPLC-MS des extraits hydro-éthanoliques de co-produits de la vigne. Les extraits antifongiques (bleu) et inefficaces (vert) à 125 mg/L sont représentés sur l'ACP. Les quality control (QC) sont représentés en rouge. En pointillé bleu, le groupe d'échantillons correspondant aux extraits racinaires. (B) Dendrogramme par clustering hiérarchique de ces mêmes extraits.

Figure 21 :

 21 Figure 21 : PLS-DA obtenues à partir des données UHPLC-MS des extraits hydro-éthanoliques de co-produits de la vigne permettant la séparation entre les extraits antifongiques (bleus, A) et les extraits inefficaces (verts, I) Les importances des variables en projection ont été calculées pour ce modèle et seules les variables jugées importantes dans le modèle ont été conservées, ainsi les variables avec une valeur supérieure à 1,5 ont permis de générer l'OPLS-DA présentée sur la Figure 22. Ainsi, nous sommes passés de l'analyse de 7118 variables pour le modèle PLS-DA à 372 pour l'OPLS-DA.

Figure 22 :

 22 Figure 22 : OPLS-DA obtenues à partir des données UHPLC-MS des extraits hydro-éthanoliques de co-produits de la vigne permettant la séparation entre les extraits antifongiques (bleus, A) et les extraits inefficaces (verts, I)

Figure 23 :

 23 Figure 23 : Représentation en S obtenue à partir de l'OPLS-DA permettant la séparation entre les extraits antifongiques et les extraits inefficaces. L'axe horizontal représente la covariance des variables (p) et l'axe vertical correspond à la valeur de corrélation (pcorr). Sur la gauche, sont représentées les variables discriminantes des extraits inefficaces et à droite celles qui expliquent la variance des extraits antifongiques. Les encadrés de couleurs en pointillés et en trait plein correspondent aux valeurs seuils pour les variables discriminantes (p > |0,05|, pcorr > |0,4|) et fortement discriminantes (p > |0,05|, pcorr > |0,7|), respectivement. La couleur des points correspond au m/z des ions d'après le dégradé de couleur sur la droite de la figure.

  Dans un second temps, nous nous sommes intéressés aux métabolites qui sont des marqueurs des extraits inefficaces pour contrôler la croissance de F. graminearum en culture. En effet, identifier ces molécules peut être un axe de recherche dans l'amélioration de l'activité des extraits via d'autres méthodologies d'extraction. Nous avons donc sélectionné les ions présentant des valeurs de corrélation inférieures à -0,7 et de covariance inférieure à -0,05 au sein du S-plot, situé dans l'encadré vert plein dans la Figure 23. La même méthodologie que précédemment a été appliquée pour réaliser la déréplication des 16 ions les plus discriminants. Ainsi, au moins 7 métabolites différents ont été identifiés de manière putative et sont référencés au sein du Tableau 15, et leurs structures potentielles sont représentées sur la Figure 25.

Figure 25 :

 25 Figure 25 : Structures proposées pour les potentiels métabolites discriminants dans les extraits inefficaces vis-à-vis de F. graminearum.* : composé identifié à l'aide d'un standard. a : structure proposée pour illustrer un acide gras C18:1 trihydroxylé.

Figure 26 :

 26 Figure 26 : Feature-based molecular network basé sur les données antifongiques des 13 extraits de co-produits de la vigne. Ce réseau est basé sur les données de HRMS/MS et présente les clusters formés d'ions dont le score de bioactivité est supérieur à la valeur seuil (r ≥ 0,85 ; p-value corrigée (Bonferroni) < 0,05). Les numéros indiqués proche des noeuds correspondent aux ID des ions et les structures sont proposées sur la base de la déréplication.

Figure 27 :

 27 Figure 27 : Pourcentage d'inhibition de la production de 15ADON par mycélium de F. graminearum (mg/g) après 10 jours de culture en présence d'extraits de co-produits de vigne à 25 mg/L. Les mentions ME, E et TE correspondent respectivement à des groupes d'activité antimycotoxine Moyennement efficace, Efficace et Très efficace. Les lettres en minuscule au-dessus des histogrammes correspondent aux groups déterminés par le test bilatéral de Conover-Iman. Ainsi, 3 groupes ont été créés : les extraits moyennement efficaces (ME), efficaces (E) et très efficaces (TE) pour inhiber la production de mycotoxine. Le groupe ME est constitué de 5 extraits à savoir les sarments des cépages Merlot, Sauvignon blanc, Cabernet Sauvignon, Artaban et des ceps de Merlot. Le groupe E, d'efficacité intermédiaire, est constitué d'extraits issus de ceps de Sauvignon blanc, de Cabernet Sauvignon, de Tannat ainsi que de racines de Merlot, de Sauvignon blanc et de Cabernet Sauvignon. Enfin, le groupe TE est constitué d'extraits de sarments et de racine de cépage Tannat. Nous devons préciser que les échantillons du groupe ME et TE ont des activités significativement différentes, alors que les échantillons du groupe intermédiaire (E) ne sont pas différents du groupe TE. Nous souhaitons réaliser des comparaisons entre des extraits qui présentent des activités différentes au niveau statistique, ainsi nous nous focaliseront exclusivement sur les différences entre le groupe ME et TE pour la suite de ce chapitre.

Figure 28 :

 28 Figure 28 : (A) Analyse en composante principale (ACP) des extraits hydro-éthanoliques de co-produits de la vigne. Les extraits présentant une activité antimycotoxine moyennement efficace (ME, verts), efficace (E, bleus) et très efficace (TE, rouges) à 25 mg/L sont représentés sur l'ACP et sont séparés sur la (B) PLS-DA. Les QC sont indiqués en noir sur l'ACP.

Figure 29 :

 29 Figure 29 : OPLS-DA permettant la séparation entre les extraits moyennement efficaces (verts, ME) et les extraits très efficaces (rouges, TE) pour inhiber la production de 15ADON.

Figure 30 :

 30 Figure 30 : Représentation en S obtenue à partir de l'OPLS-DA permettant la séparation entre les extraits moyennement efficaces (ME) et très efficaces (TE) pour inhiber la production de 15ADON. Sur la gauche, les variables discriminantes des extraits ME et à droite celles qui expliquent la variance des TE. Les encadrés de couleurs en pointillés et en trait plein correspondent aux valeurs seuils pour les variables discriminantes (p > |0,05|, pcorr > |0,4|) et fortement discriminantes (p>|0,05|, pcorr>|0,7|), respectivement. La couleur des points correspond au m/z des ions d'après le dégradé de couleur sur la droite de la figure.L'analyse de la représentation en S montre que 18 ions ont des valeurs supérieures au seuil fixé. Leur déréplication a été réalisée via SIRIUS, GNPS et de manière manuelle, et 13 métabolites ont été identifiés ou pseudo-identifiés. Parmi eux, nous retrouvons 10 stilbènes oligomérisés ainsi que 3 autres composés qui sont très polaires et/ou glycosylés (Tableau 17).

Figure 31 :

 31 Figure 31 : Structures proposées pour les potentiels métabolites discriminants dans les extraits très efficaces pour inhiber la production de 15ADON chez de F. graminearum. La vitisine A (r2-viniférine) est le seul composé identifié à l'aide d'un standard.

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  Matériels et méthodesFractionnement par chromatographie de partage centrifuge d'un extrait racinaire de vigneProduction d'extrait de racine à grande échelle Nous avons utilisé les racines de Tannat (porte-greffe Gravesac) qui sont de la même origine que la matière première utilisée lors du criblage pour réaliser l'extraction. Lors du criblage, les extractions (cf Chapitre I partie 2.1.2) ont été faites par ASE dans des cellules pouvant contenir environ 5 g de poudres au maximum. Afin de réaliser une seule extraction, nous avons décidé de réaliser cette extraction par macération. Le même mélange de solvants d'extraction a été utilisé, ici l'éthanol à 85 % (v/v). 500 g de racines finement broyées ont été placées dans un récipient en inox et extrait avec 5 L d'un mélange éthanol/eau (85/15, v/v) par macération sous agitation pendant 2 heures à température du laboratoire. A l'issue de cette période, le macérat est filtré sur laine de verre puis sur papier filtre. L'extraction est réalisée une deuxième fois sur le marc dans les mêmes conditions que précédemment et filtré. Les deux filtrats sont réunis et concentrés à l'aide d'un évaporateur rotatif sous vide (la température ne dépassant pas 40 °C) jusqu'à obtenir un volume de 1,5 L environ. Une suspension aqueuse de couleur brune est obtenue. Une ampoule à décanter de 4 L est remplie avec les 1,5 L de suspension aqueuse et 1,5 L d'acétate d'éthyle. Après agitation manuelle, les deux phases sont séparées par décantation. La phase supérieure (organique) est isolée, et la phase inférieure (aqueuse) est réintroduite dans l'ampoule à décanter. Trois extractions supplémentaires ont été réalisées de la même façon. Les phases organiques sont assemblées puis évaporées sous vide. La fraction organique (acétate d'éthyle) est reprise avec quelques mL d'éthanol, puis complétée avec 50 mL d'eau distillée. Les deux fractions obtenues (organique et aqueuse) sont alors lyophilisées.Le lyophilisat de la phase organique se présente sous forme de poudre brune foncée (Ta_R_AE = 39 g). La phase aqueuse est de 7,5 g (Ta_R_H2O). Une petite fraction de l'extrait organique est utilisée pour réaliser une solution de stockage à 10 g/L dans de l'éthanol et conservée à -20 °C à l'abri de la lumière. Les extraits secs ont été conservés à l'abri de la lumière à température ambiante.Fractionnement par CPC de l'extrait organique de racine de Tannat (Ta_R_AE) L'extrait organique a été fractionné par chromatographie de partage centrifuge (CPC). C'est une technique chromatographique liquide-liquide qui permet de purifier des échantillons par le partage des solutés entre deux phases liquides non miscibles. Dans ces travaux, la phase stationnaire est de nature plutôt apolaire. Cette phase va être maintenue dans la colonne grâce à la force centrifuge induite par sa rotation autour de l'axe. La colonne est composée d'un empilement de disques dans lesquels sont gravées des cellules reliées en cascade par des tubes capillaires. La phase mobile, ici de nature polaire, est pompée à travers la colonne et permet l'élution des molécules.

  Afin d'évaluer les potentielles activités antifongique et antimycotoxine de l'extrait de racine de Tannat ainsi que de ses fractions obtenues par CPC, des expérimentations en milieu liquide sur la souche CBS 185.32 de F. graminearum ont été réalisées. Contrairement aux expérimentations sur le criblage développé dans le Chapitre I, nous avons eu suffisamment de quantité d'extrait pour réaliser les expérimentations en boîte de Pétri d'un diamètre de 55 mm. De plus, l'évaluation de l'activité antifongique et antimycotoxine s'est déroulée lors d'une seule et même expérimentation.Conditions des cultures fongiquesLe matériel fongique et le mode de préparation de l'inoculum ont été identiques aux expérimentations développées dans la partie 3.1.1 du Chapitre I. La concentration finale de l'inoculum de spores de F. graminearum a cependant été modifiée, atteignant 10 6 spores/mL de CMC après comptage en cellule de Malassez.L'ensemble des cultures ont été réalisées sur milieu de culture MS en suivant le protocole décrit par[START_REF] Boutigny | Ferulic acid, an efficient inhibitor of type B trichothecene biosynthesis and Tri gene expression in Fusarium liquid cultures[END_REF]. Une première expérimentation a été faite afin de déterminer une concentration d'extrait de racine de Tannat qui permet d'inhiber la croissance du champignon, ainsi qu'une autre concentration qui n'impacte pas (ou peu) la croissance, mais qui permet d'inhiber la production de 15ADON. L'objectif de cette étape est de fixer deux conditions de culture pour observer de manière indépendante l'activité antifongique et antimycotoxine.Un litre de milieu MS a été réparti dans les boîtes de Pétri pour atteindre un volume de 8 mL. Puis, différentes concentrations de la solution stock d'extrait acétate d'éthyle de racine de Tannat enrichi ont été rajoutées au milieu, afin d'atteindre des concentrations finales de l'extrait de 10, 20, 30, 40 et 50 mg/mL et une concentration finale d'éthanol dans le milieu de culture de 0,5 %. Des conditions de contrôles ont été menées, avec et sans éthanol à 0,5 % d'une part, et avec le témoin positif TEB à 0,1 ; 0,2 et 0,3 µM d'autre part. Le TEB ajouté au milieu de culture a été préparé dans l'éthanol au préalable. Chaque condition a été préparée en 4 réplicats. Les boîtes de Petri ont été complétées avec 100 µL d'inoculum pour atteindre 10 5 spores par boîte de Pétri. Après inoculation, les boîtes de Petri ont été incubées pendant 10 jours à l'obscurité à 25 °C. Une fois les concentrations déterminées pour lesquelles l'extrait est antifongique et antimycoxotine, une seconde expérimentation a été réalisée avec les fractions. Pour cela, les mêmes conditions de mise en cultures ont été appliquées. L'extrait de racine de Tannat et les 8 fractions CPC ont été ajoutés au milieu de culture MS pour atteindre une concentration finale de 15 ou 30 mg/L. Chaque boîte de Pétri a été inoculée et toutes les conditions ont été répétées 4 fois. Mesure de l'activité de l'extrait et des fractions de CPC sur la biomasse mycélienne Après 10 jours d'incubation, les cultures ont été arrêtées et le mycélium a été récupéré à l'aide d'une spatule stérile ou par centrifugation du milieu. Le milieu de culture a été conservé dans un tube Falcon de 15 mL pour le dosage des TCTB et le mycélium a été récupéré dans un autre tube pré-pesé, puis stocké à -80 °C avant lyophilisation. Le mycélium déshydraté a par la suite été pesé. Pour chaque condition, la masse de mycélium pesée a été comparée avec celle des conditions témoins (milieu MS + 0,5 % d'éthanol inoculé avec F. graminearum) afin d'exprimer un pourcentage d'inhibition de la biomasse fongique par l'extrait ou les différentes fractions. Mesure de l'activité de l'extrait et des fractions de CPC sur la production de mycotoxine Les TCTB ont été extraits à partir de 3 mL de milieu préalablement récupéré lors de l'arrêt de culture. A ce milieu de culture, 9 mL d'acétate d'éthyle ont été ajoutés puis mélangés pendant 5 min au Vortex. Jusqu'à 8 mL de phase organique enrichie en TCTB a été récupérée puis évaporée à 40 °C sous flux d'azote gazeux. L'extrait sec a été repris dans 500 µL d'un mélange méthanol/eau (50/50, v/v) avant d'être filtré sur filtre PTFE 0,2 µm. Les échantillons ont été conservés dans des flacons en verre HPLC à 4 °C puis ont été injectés sur un système HPLC-DAD pour le dosage des TCTB. Le matériel et les paramètres utilisés pour le dosage des mycotoxines est le même que celui développé dans la partie 3.1.4.2 du Chapitre I. Analyse métabolomique non-ciblée des fractions CPC d'extrait de racine de Tannat pour la mise en évidence de métabolites bioactifs Analyses par UHPLC-UV-HRMS/MS L'extrait acétate d'éthyle de racine de Tannat, ainsi que les 8 fractions et l'extrusion ont été analysés par UHPLC-UV-HRMS/MS de la même manière que les extraits hydro-éthanoliques de co-produits de la vigne. L'équipement analytique, la colonne UHPLC, la méthode de séparation chromatographique et les paramètres de source en spectrométrie de masse ont été identiques à ceux précisé dans la partie 2.2.1 du Chapitre II. Les échantillons ont été préparés à une concentration de 1 mg/mL à partir de 50 µL de solutions mères à 10 mg/mL et de 450 µL d'un mélange acétonitrile Optima LC-MS grade et d'eau milliQ dans les proportions 50/50 (v/v). Les échantillons ont été filtrés sur filtres PTFE hydrophiles de diamètre 0,2 µm. L'extrait et les 8 fractions de CPC préparés à 1 mg/mL, ainsi que le QC et le blanc d'analyse ont été analysés par UHPLC-HRMS/MS. L'ensemble des échantillons a été injecté 3 fois dans la séquence d'analyse avec randomisation des échantillons, et un QC a été injecté toutes les dix injections. Application d'une approche métabolomique non-ciblée pour l'identification des métabolites bioactifs

Figure 32 :

 32 Figure 32 : Chromatogrammes UV à 280 nm (bleu) et 306 nm (vert) obtenus lors du fractionnement par CPC de l'extrait acétate d'éthyle de racine de Tannat (1 g). Les différentes fractions collectées sont représentées par des barres verticales et les identifiants des différentes fractions sont précisés au-dessus du chromatogramme. F = fraction ; Ext = extrusion.

  de Tannat à 2 concentrations sur milieu MS. Nous avons pu mettre en évidence qu'après 10 jours de culture en présence de 25 mg/L d'extrait le champignon avait une biomasse 18 % moins importante que le contrôle, et qu'à 50 mg/L le champignon ne se développait pas du tout. Ainsi, nous avons estimé qu'il n'était pas nécessaire de tester à une concentration supérieure à 50 mg/L. Toutefois la méthode d'extraction à grande échelle de l'extrait est différente de celle utilisée pour le criblage (macération versus extraction sous pression) et les conditions de culture en boite de Pétri se distinguent également de la culture en plaque multipuits, donc nous pouvons nous attendre à des résultats sensiblement différents. Nous avons donc souhaité réaliser un premier essai à différentes concentrations pour connaitre le pouvoir antifongique et antimycotoxine de l'extrait avant de tester les fractions. Ainsi, les extraits ont été testés à 5 concentrations et après 10 jours l'impact sur la biomasse mycélienne (Figure33) et la production de 15ADON ont été mesurée.

Figure 33 :

 33 Figure 33 : Biomasse de mycélium de F. graminearum après 10 jours de culture sur milieu MS en présence de l'extrait acétate d'éthyle de racine de Tannat à différentes concentrations (10, 20, 30, 40 et 50 mg/L). Les pourcentages au-dessus des barres du diagramme en barres correspondent aux pourcentages d'inhibition de la biomasse en comparaison avec le contrôle (MS EtOH).

  de 50 mg/L. Malgré les changements dans la méthode d'extraction et le protocole de culture, cet extrait de racine de Tannat semble avoir conservé son activité antifongique.Au sujet de l'impact sur la production de 15ADON, nous nous sommes intéressés seulement aux conditions où nous avons pu observer un développement du champignon, à savoir 10, 20 et 30 mg/L. A une concentration d'extrait de 20 mg/L, nous avons pu doser 364,8 ± 74,8 ng de 15ADON/mg de mycélium dans trois des quatre réplicats, ce qui représente une augmentation de 13 % de la production de mycotoxine par rapport au témoin. Toutefois, dans un des réplicats aucune trace de 15ADON n'a été retrouvée. A une concentration plus faible de 10 mg/L, aucune trace de 15ADON n'a été détectée dans les milieux de culture. Ces résultats laissent suggérer que soit l'extrait a une activité antimycotoxine à faible concentration (10 mg/L) et qu'une plus grande quantité d'extrait (20 mg/L) ne va pas empêcher la production de mycotoxine dans le milieu, soit il y a eu des erreurs dans le protocole d'extraction et de dosage des TCTB par HPLC-UV. L'extrait testé à 30 mg/L a inhibé de 100 % la production de 15ADON dans 3 cas sur 4, et dans le seul réplicat où des mycotoxines ont été retrouvé, 335,8 ng de 15ADON/mg de mycélium ont été dosés, ce qui est équivalent à ce qui est retrouvé dans les conditions témoins. Nous avons noté une très forte variation d'activité entre les réplicats et les différentes concentrations testées.Evaluation de l'activité antifongique et antimycotoxine des fractions de CPCCes premiers essais en boite de Pétri nous ont permis de choisir deux concentrations à tester pour l'extrait acétate d'éthyle de racine de Tannat et les fractions CPC. Nous avons sélectionné la concentration de 30 mg/L, car c'est la concentration la plus élevée où nous avons pu observer une inhibition de la croissance du champignon qui ne soit pas totale. Au sujet de l'activité antimycotoxine, il est préférable de tester une concentration où l'extrait n'impacte pas ou impacte peu la croissance fongique, donc plus faible que 30 mg/L. Les résultats préliminaires sur l'activité antimycotoxine de l'extrait sont sujets à une forte variabilité, toutefois nous avons fait le choix de tester l'extrait à une concentration intermédiaire de 15 mg/L En effet, nous souhaitons tester l'extrait et ses fractions à une concentration qui permet une inhibition partielle de la production de mycotoxine, et non pas totale comme à 10 mg/L. L'impact des extraits et fractions sur la biomasse mycélienne de F. graminearum est représenté sur la Figure34. Tout d'abord, nous pouvons noter qu'aux deux concentrations testées l'extrait n'a pas eu d'impact sur la biomasse du champignon après 10 jours de culture. Ce sont donc des résultats différents des premiers essais préalablement présentés. Toutefois, certaines fractions sont actives. Si nous regardons plus en détails l'effet des fractions de CPC à 15 mg/L (Figure34A), nous pouvons observer une diversité d'action selon les fractions. En effet, les fractions 1, 2, 7 et l'extrusion n'affecte pas la biomasse du champignon, alors que les fractions 3 et 4 vont induire une production de biomasse plus importante et a contrario les fractions 5 et 6 vont inhiber la biomasse de 52 % et 62 % respectivement. Le fractionnement par CPC a permis de concentrer les métabolites antifongiques dans les fractions 5 et 6 qui correspondent au troisième bloc observé lors du fractionnement (Figure32).Au sujet des essais à 30 mg/L (Figure34B), nous avons également des diversités d'activités selon les fractions. Les fractions 1, 2, 3, 4 et l'extrusion n'ont pas d'effet significatif sur la production de biomasse après 10 jours de culture. Toutefois, nous distinguons une tendance à la diminution de la biomasse pour la fraction 4, mais cette différence n'est pas significative. Il est intéressant de noter que la fraction 4 induit significativement la production de biomasse à 15 mg/L, alors que cet extrait a une tendance à l'effet inverse une fois la concentration augmentée à 30 mg/L. Ceci suggère un effet dose de certains métabolites présents dans cette fraction. Il en est de même pour la fraction 7 à 30 mg/L qui inhibe 73 % de la biomasse par rapport au contrôle, alors qu'à plus faible concentration cet extrait ne présente pas d'activité particulière. Les fractions 5 et 6 sont à nouveau les fractions les plus efficaces, avec notamment une absence totale de mycélium dans les milieux de culture pour F6 et une inhibition de la biomasse de 97 % pour F5.

Figure 34 :

 34 Figure 34 : Effet de l'extrait acétate d'éthyle de racine de Tannat et des fractions de CPC à 15 mg/L (A) et 30 mg/L (B) sur la biomasse de F. graminearum après 10 jours de culture sur milieu liquide MS. Les lettres en minuscules au-dessus des diagrammes en barres correspondent aux groupes déterminés par le test bilatéral de Conover-Iman.L'extrait de racine de Tannat testé à 15 et 30 mg/L présente une activité antimycotoxine intéressante. En effet, il y a une inhibition de 63 % de la production de 15ADON à la concentration la plus faible, et jusqu'à 91 % pour l'extrait testé à 30 mg/L (Figure35). Nous allons surtout nous focaliser sur les essais à 15 mg/L, car certaines fractions testées à 30 mg/L impactent trop fortement la croissance fongique pour ne pas être dissociées de la production de mycotoxine. D'après la Figure35A, nous pouvons voir que seules les fractions F1 et F2 n'inhibent pas la production de mycotoxine en comparaison avec le témoin. Si nous prenons comme point de comparaison l'extrait de racine, nous pouvons distinguer que ces deux fractions ainsi que l'extrusion inhibent moins la production de mycotoxine que l'extrait. Donc ces fractions ne semblent pas être constituées des métabolites les plus efficaces de l'extrait ou bien dans des concentrations trop faibles pour être efficaces. En revanche, la fraction F4 est celle qui présente le taux de 15ADON le plus faible, avec une inhibition de 92 % par rapport au témoin, soit plus de 4 fois moins de mycotoxine par gramme de mycélium en comparaison avec l'extrait. Le fractionnement a donc permis d'enrichir cette fraction en métabolites aux propriétés antimycotoxine. Nous pouvons noter que les fractions F3, F5, F6 et F7 inhibent la production

Figure 35 :

 35 Figure 35 : Effet de l'extrait acétate d'éthyle de racine de Tannat et des fractions de CPC à 15 mg/L (A) et 30 mg/L (B) sur la production de 15ADON par F. graminearum après 10 jours de culture sur milieu liquide MS. Les lettres en minuscules audessus des histogrammes correspondent aux groupes déterminés par le test bilatéral de Conover-Iman

Figure 36 :

 36 Figure 36 : Chromatogramme de masse annoté (Base peak) de la fraction CPC de racine de Tannat la plus antimycotoxine (F4). Les rapports m/z et la formule brute des ions annotés sur le chromatogramme sont précisés dans le tableau. Les numéros en rouge correspondent à des composés identifiés à l'aide d'un standard. Nous avons réalisé un travail similaire sur la fraction F6. Cette fraction est la plus antifongique parmi celles testées à 30 mg/L. Sur la Figure 37, nous présentons le chromatogramme de masse et les 12 pics qui ont été annotés entre 8 et 12 min. Les standards ont aidé à l'identification de 4 composés au sein de cette fraction, à savoir deux dimères (la E-ε-viniférine et la E-ωviniférine), un trimère (E-cis-trans-miyabénol C) et un tétramère (la vitisine B). Les pics correspondant à la E-ε-viniférine et la vitisine B sont les deux plus intenses dans cette fraction.

Figure 37 :

 37 Figure 37 : Chromatogramme de masse annoté (Base peak) de la fraction CPC de racine de Tannat la plus antifongique (F6). Les rapports m/z et la formule brute des ions annotés sur le chromatogramme sont précisés dans le tableau. Les numéros en rouge correspondent à des composés identifiés à l'aide d'un standard.

Figure 38 :

 38 Figure 38 : Analyse en composantes principales (ACP) de l'extrait acétate d'éthyle de racine de Tannat et des fractions obtenues par CPC. La couleur des échantillons représente leur efficacité à 30 mg/L pour inhiber la biomasse mycélienne de F. graminearum après 10 jours de culture. Sont représentés en vert, les échantillons inactifs, en bleu, les échantillons faiblement actifs et en rouge, les échantillons actifs et en noir les QC.Au niveau des paramètres qui permettent de juger le modèle, nous distinguons que les deux premières composantes permettent d'expliquer 52 % de la variance entre les échantillons avec des valeurs de R2X[1] et R2X[2] de 0,34 et 0,175 respectivement, ainsi qu'un Q² de 0,243. Sur la Figure38, nous pouvons distinguer que les échantillons inactifs pour inhiber la production de biomasse mycélienne sont tous répartis dans le quart inférieur gauche de l'ACP, alors que les fractions actives sont distribuées dans le quart de cercle opposé. Toutefois, les analyses nonsupervisées ne permettent pas de bien distinguer les extraits peu actifs des plus actifs. L'extrait acétate d'éthyle de racine de Tannat (Ta_R_AE) est en position centrale sur l'APC, ceci peut se justifier par le fait d'avoir fractionné l'extrait, en effet la composition de l'ensemble des fractions correspond à celle de l'extrait. Une observation similaire est faite pour l'extrusion qui

Figure 39 :

 39 Figure 39 : OPLS-DA permettant la séparation entre les fractions de CPC de l'extrait acétate d'éthyle de racine de Tannat

Figure 40 :

 40 Figure 40 : Représentation en S obtenue à partir de l'OPLS-DA permettant la séparation entre les fractions de CPC de racine de Tannat inhibant la biomasse fongique et les fractions inefficaces. L'axe horizontal représente la covariance des variables (p) et l'axe vertical correspond à la valeur de corrélation (pcorr). Sur la gauche, sont représentées les variables discriminantes des fractions inactives et à droite celles qui expliquent la variance des extraits actifs. Les encadrés de couleurs correspondent aux valeurs seuils pour les variables discriminantes (p > |0,05|, pcorr > |0,7|). La couleur des points correspond au m/z des ions d'après le dégradé de couleur sur la droite de la figure.

Figure 41 :

 41 Figure 41 : Structure des composés identifiés comme discriminants dans les fractions antifongiques de racine de Tannat via les analyses statistiques multivariées. Les molécules identifiées à l'aide d'un standard sont annotées par un astérisque (*). L'acide p-hydroxybenzoïque est proposé pour illustrer la structure des dérivés d'acide hydroxybenzoïque.

Figure 42 :

 42 Figure 42 : Feature-based molecular network basé sur les données antifongiques de l'extrait de racine de Tannat et des 8 fractions de CPC. Ce réseau est basé sur les données de LC-HRMS/MS et présente les clusters formés d'ions dont le score de bioactivité est supérieur à la valeur seuil (r ≥ 0,85 ; p-value corrigée (Bonferroni) < 0,05).

  marqueurs d'activité et d'inactivité. Le fractionnement par CPC nous a permis d'obtenir un panel d'activité au sein des fractions, comme nous avons pu le décrire dans la partie 3 de ce chapitre. Brièvement, à 15 mg/L la fraction F4 est la plus active, l'extrait et les fractions F3, F5, F6 et F7 le sont également et dans une moindre mesure l'extrusion l'est aussi, alors que les fractions F1 et F2 n'ont pas présenté d'activité. Nous allons nous baser à nouveau sur les analyses UHPLC-HRMS/MS pour tenter de déterminer les marqueurs moléculaires de l'activité antimycotoxine issus de l'extrait de racine de Tannat, en s'appuyant sur les approches métabolomiques et des scores de bioactivité.Par les analyses statistiques multivariéesSur l'ACP (Figure44A), nous pouvons observer la distribution de la variance des échantillons de fractions de CPC et de l'extrait. La distribution des échantillons dans l'espace est la même que sur la précédente ACP (Figure38), seule la couleur des échantillons change selon leur activité antimycotoxine. Ici, les échantillons inactifs sont en bleu, les échantillons faiblement actifs sont en vert et les échantillons actifs en comparaison avec le contrôle sont en rouge. Nous avons ensuite voulu séparer les échantillons en fonction de leur activité, pour cela nous avons effectué une PLS-DA entre les échantillons actifs et inactifs. Nous pouvons voir sur la Figure 44B, que la séparation entre les échantillons actifs et inactifs ne se fait pas au niveau de l'axe vertical, car les échantillons correspondant à l'extrait et la fraction F3 se retrouvent avec les fractions F1 et F2 qui sont inactives. Comme nous avons pu l'observer précédemment, l'extrait a une position centrale sur l'ACP qui est conservée sur la PLS-DA, ceci pourrait s'expliquer par sa composition chimique proche de l'ensemble des fractions. Pour cette raison, l'extrait a été exclu pour la suite des analyses, tout comme la fraction F3.Nous avons donc réitéré le modèle PLS-DA pour comparer la composition chimique des fractions inactives (F1 et F2) avec celle des fractions actives (F4, F5, F6 et F7) dont la distribution de la variance est représentée sur la Figure44C. Il y a une bonne séparation des deux groupes avec les deux premières composantes du modèle, notamment au vu des valeurs de R 2 X(cum) = 0,629 et R 2 Y(cum) = 0,982, ainsi qu'un haut niveau de prédiction du modèle (Q² = 0,971). Le modèle a été vérifié par CV-ANOVA et a obtenu une p-value acceptable de 4,7 × 10 -9 , ainsi que 87,5 % de bonne classification des échantillons. Les VIP ont été calculés et ceux dont la valeur est supérieure au seuil fixé (> 1,5) ont été conservés pour générer le modèle OPLS-DA présenté sur la Figure44D. Le modèle OPLS-DA est obtenu à partir de 320 variables qui ont permis à nouveau une bonne séparation des échantillons actifs et inactifs par les premières composantes du modèle, dont le R 2 X(cum) = 0,661 et le R 2 Y(cum) = 0,959, avec un niveau de prédiction élevé (0,939). Nous avons vérifié le modèle et 87,5 % des échantillons sont bien classés et le test de CV-ANOVA est valide (p-value = 8,8 × 10 -8 ).

Figure 44 :

 44 Figure 44 : (A) ACP de l'extrait acétate d'éthyle de racine de Tannat et des fractions obtenues par CPC. La couleur des échantillons représente leur efficacité à 15 mg/L pour inhiber la production de 15ADON par F. graminearum après 10 jours de culture. Sont représentés en bleu, les échantillons inactifs, en vert, les échantillons faiblement actifs et en rouge, les échantillons actifs. Séparation à l'aide de la PLS-DA des échantillons actifs et inactifs (B) et sans l'extrait ni la F3 (C). L'OPLS-DA (D) a été réalisée sur les échantillons actifs et inactifs les mieux séparés sur la PLS-DA.Le modèle OPLS-DA nous permet d'obtenir une représentation en S des VIPs selon leur covariance et leur corrélation pour les fractions actives ou inactives. Nous nous sommes donc focalisés sur les métabolites les plus discriminants présents dans les fractions actives pour inhiber la production de 15ADON dans le milieu de culture (Figure45, encadrés rouges). Nous pouvons observer, que seulement une variable a des valeurs de covariance et de corrélation supérieures au seuil fixé pour être fortement discriminantes. Nous nous sommes donc également intéressés aux variables avec des valeurs de corrélation moins importantes, entre 0,4 et 0,7, mais dont l'amplitude dans les fractions antimycotoxines est forte, à savoir une valeur de covariance supérieure à 0,1[START_REF] Liu | Profiling the metabolome changes caused by cranberry procyanidins in plasma of female rats using 1H NMR and UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS global metabolomics approaches[END_REF]. Cela correspond à 7 ions qui ont été dérépliqués avec les outils de déréplication précédemment utilisés dans ce travail (Tableau 21) et dont les structures sont proposées sur la Figure46.

Figure 45 :

 45 Figure 45 : Représentation en S obtenue à partir de l'OPLS-DA permettant la séparation entre les fractions antimycotoxine et les fractions inactives. L'axe horizontal représente la covariance des variables (p) et l'axe vertical correspond à la valeur de corrélation (pcorr). Sur la gauche, sont représentées les variables discriminantes des fractions inefficaces et à droite celles qui expliquent la variance des fractions antimycotoxines. Les encadrés rouges en pointillé et en trait plein correspondent aux valeurs seuils pour les variables discriminantes (p > |0,05|, pcorr > |0,4|) et fortement discriminantes (p > |0,05|, pcorr > |0,7|), respectivement. La couleur des points correspond au m/z des ions d'après le dégradé de couleur sur la droite de la figure.L'ion situé dans l'encadré rouge a une masse de m/z 903,2467, correspondant à la formule brute C56H40O12. Plusieurs observations nous laissent penser que ce composé pourrait correspondre à un tétramère de stilbène. Les réseaux moléculaires placent ce composé au sein d'un cluster formé de noeuds pouvant eux-mêmes être attribués à des stilbènes, de formule brute identique à celle de l'amurensine K, à savoir C56H40O13 (m/z 919,2410). De plus, la fragmentation en MS² de ce composé est semblable à d'autres stilbènes, notamment par la perte d'un noyau phénol ([M-H-C6H6O] -; m/z 809,2077), ou par la présence de fragments également retrouvés chez d'autres oligomères comme des trimères (m/z 345,0779 et 451,1214)[START_REF] Moss | Investigation of monomeric and oligomeric wine stilbenoids in red wines by ultra-high-performance liquid chromatography/electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry[END_REF]. La base de données de polyphénols du laboratoire contient 9 tétramères de stilbènes correspondant à la formule brute identifiée. Parmi eux, quatre ont été identifiés dans le genre Vitis, dont notamment l'amurensine L à partir de racine de V. amurensis (K. S. Huang, Lin, & Cheng, 2001) et 2 autres à partir de ceps de V. vinifera à savoir les vitisifuranes A et B (J.[START_REF] Ito | New oligostilbenes having a benzofuran from Vitis vinifera "Kyohou[END_REF]. Ces composés sont peu étudiés et à notre connaissance, aucune étude n'a été publiée sur leur potentielle activité contre des agents fongiques.Nous avons également identifié à l'aide d'un standard un autre tétramère avec une forte covariance dans le modèle, à savoir la vitisine B. Ce métabolite a été annoté pour 3 ions différents, à savoir l'ion parent [M-H] -à m/z 905,2622 et deux autres ions qui seraient des artefacts du prétraitement sur MZmine, à savoir un isotope du carbone (ID = 7236) de cet ion et une copie de cet ion (ID = 7606) induite par une mauvaise déconvolution du composé. Ce tétramère de stilbène était d'ores et déjà apparu comme un potentiel déterminant moléculaire de l'activité antimycotoxine dans les extraits de co-produits de vigne, mais aussi fortement discriminant dans les fractions antifongiques. Il en est de même pour l'E-ε-viniférine qui a été identifiée par un standard dans les fractions les plus actives et dont 3 ions ont été mis en évidence comme discriminants dans cette analyse. Comme pour la vitisine B, nous retrouvons l'ion parent [M-H] -à m/z 453,1352, ainsi que deux artefacts, l'un issu d'une mauvaise déconvolution (ID = 4989) et l'autre étant un adduit formiate de la molécule (ID = 4800, [M-

Figure 46 :

 46 Figure 46 : Structure des composés pseudo-identifiés comme discriminants dans les fractions antimycotoxines de racine de Tannat via les analyses statistiques multivariées.

Figure 47 :

 47 Figure 47 : Feature-based molecular network basé sur l'activité antimycotoxine de l'extrait de racine de Tannat et des 8 fractions de CPC. Ce réseau est basé sur les données de LC-HRMS/MS et présente les clusters formés d'ions dont le score de bioactivité est supérieur à la valeur seuil (r ≥ 0,70 ; p-value corrigée (Bonferroni) < 0,05). Cl. : cluster Le cluster 3 contient deux ions avec des scores de bioactivité élevés, ces deux ions ont un m/z proche à savoir 443,1508 (ID=3896) et 443,1509 (ID=3559) et correspondent à un composé de formule brute théorique C27H24O6. Les bases de données spectrales contenues sur GNPS n'ont pas permis d'identifier ces composés et l'utilisation de SIRIUS n'a pas permis d'annoter ces métabolites, toutefois l'outils CANOPUS compris dans SIRIUS a estimé que ces composés pouvaient correspondre à des dérivées de flavanones. Cette hypothèse est confortée par la présence d'ions annotés sur ce cluster par GNPS comme pouvant être des flavanones aglycones comme la lutéoline, l'apigénine et la naringénine. Cette famille de composés est retrouvée dans la vigne, mais principalement dans les baies et les feuilles sous forme O-glycosylée[START_REF] Goufo | A Reference List of Phenolic Compounds (Including Stilbenes) in Grapevine (Vitis vinifera L.) Roots, Woods, Canes, Stems, and Leaves[END_REF]. Certains composés de cette famille, comme la naringénine, ont pu montrer une inhibition quasi-totale à des concentrations inférieures à 3 mM de la production de trichothécènes de type B chez F. graminearum et F. culmorum[START_REF] Bilska | Changes in Phenylpropanoid and Trichothecene Production by Fusarium culmorum and F . graminearum Sensu Stricto via Exposure to Flavonoids[END_REF]. Des dérivés glycosylés comme l'hespéridine et la néohespéridine sont également très efficaces à faible concentration (0,3 mM) pour inhiber totalement la production de DON chez F. graminearum(Salas et al., 2016a).

  Parmi les ions avec les scores de bioactivité les plus élevés, nous retrouvons 7 ions pouvant être identifiés comme des stilbènes sur les clusters 2, 4, 5 et 6. Une fois dérépliqués à l'aide de SIRIUS ou de leur proximité avec d'autres composés dans des clusters, ces ions correspondent à 4 métabolites différents constitués de deux tétramères et deux dimères. Nous retrouvons à nouveau l'ion de [M-H] -m/z 903,2467, qui correspond à la formule brute C56H40O12 d'une molécule. L'ion a été identifié putativement comme pouvant correspondre aux vitisifurane A (Figure46) ou B (Figure48) (J.[START_REF] Ito | New oligostilbenes having a benzofuran from Vitis vinifera "Kyohou[END_REF]. Ce composé est retrouvé sous 3 formes dans la liste d'ions : déprotoné (ID = 6739) au sein du cluster 5 du réseau moléculaire, avec un adduit formiate (ID = 6768) sous la forme d'un noeud isolé sur le cluster et sous la forme d'un isotope (ID = 6765). Les deux types d'approches statistiques utilisées pour lier l'activité biologique à la composition chimique ont tendance à montrer que ce métabolite pourrait être un déterminant moléculaire fort de l'activité antimycotoxine.

Figure 48 :

 48 Figure 48 : Structure des composés pseudo-identifiés comme corrélés à l'activité antifongique dans les fractions de racine de Tannat via les scores de bioactivité ou faisant partie d'un cluster présentant des ions avec des scores élevée de bioactivité. L'ion [M-C6H6O] -ayant pour ID = 5505 et situé sur le cluster 2 fait partie des ions avec un score élevé de bioactivité. Son m/z est de 825,1982 et la formule brute théorique associée à la molécule est C50H34O12. Le cluster dont fait partie cet ion est un cluster d'oligomères de stilbènes, nous y retrouvons notamment un ion identifié comme l'isohopéaphénol (m/z 905,2624). L'ion d'intérêt (ID = 5505) pourrait correspondre à un fragment source d'un tétramère de resvératrol oxygéné de formule C56H40O13, comme l'amurensine K (m/z 919,2396) préalablement mentionné dans le Chapitre II comme un métabolite discriminant des extraits très efficaces pour inhiber la production de 15ADON. La différence de masse de 94,042 Da pourrait correspondre à la perte d'un groupement phénol (C6H6O) lors de l'ionisation en source (Zhang et al., 2019). D'ailleurs, les chromatogrammes d'ions extraits à m/z 919,2396 (tétramère de resvératrol oxydé) et m/z 825,1982 se superposent, ce qui laisse suggérer que cet ion peut correspondre à un fragment en source. De plus, des fragments de MS² sont partagés entre les deux ions comme les fragments m/z 825,1982 ; 451,1199 ; 373,0721 ; 372,0642 ; 371,0565 et 343,0617, déjà retrouvés chez d'autres stilbènes[START_REF] Goufo | A Reference List of Phenolic Compounds (Including Stilbenes) in Grapevine (Vitis vinifera L.) Roots, Woods, Canes, Stems, and Leaves[END_REF]. Nous devons noter que le métabolite identifié putativement comme l'amurensine K dans le précédent chapitre et l'ion parent de ce fragment source (ID = 5505) ne sont pas le même composé car les temps de rétention sont différents (respectivement 9,88 min et 10,47 min).

Plant extract Raw material Extraction Phenolic content and their concentration Fungal species Mycotoxin produced

  Plant phenolic extracts and their relative phenolic content used to reduce mycotoxin production in vitro(2010)(2011)(2012)(2013)(2014)(2015)(2016)(2017)(2018)(2019)(2020)(2021)

				Reference	Reference	Reference Reference	Nobili et al., Reference 2019 Bavaro et al., 2016 Atanasova-Scaglioni et al., El Khoury et al., Reference Vamvakas et al.,	Pénichon 2018 2017 2020	et al., 2014		Heidtmann-Scaglioni et al., 2018 Kollia et al., 2017 Reference Dammak et al.,	Bemvenuti 2019	et al., 2016			Gomaa & El	Nour, 2014		Pagnussatt et al.,	2014 Yazdani et al.,	Heidtmann-2013	Bemvenuti Rajha et al., 2019 Montibus et al.,	et al., 2016 2021	El Khoury et al.,	Christ-Ribeiro 2017	Abdel-Razek et al., 2019	Sadhasivam et al., 2017	et al., 2019	Scaglioni et al., Montibus et al.,	Mostafa et al., 2018 2021	Christ-Ribeiro 2011	et al., 2019	Crespo-Sempere	(Continues) et al., 2016 Scaglioni et al., 2019 (Continues)	(Continues) (Continues)	(Continues)	(Continues)
			Antifungal	activity Antifungal Antifungal Antifungal activity	FGI: 38% Antifungal activity activity FGI: no significant FGI: no difference significant activity FGI: 29% Increase of the colony Antifungal activity FGI: no significant	difference diameter difference	MIC: FGI: 62% significant difference 0.037 g/kg FGI: no n.m. activity FGI: no Antifungal	significant	difference FGI: no	significant	difference	FGI:	50%-90% e FGI: no	MIC: FGI: 6%-16% c 0.032 g/kg significant difference FGI: no	significant	Significantly difference	FGI: 20% increase of	FGI: no 150 mg/ml growth MFC: fungal	significant	difference FGI: 29% Significantly increase of FGI: 64% Significant increase of	FGI: 40% fungal growth fungal biomass or MFC: no 250 mg/ml significant FGI: no	significant difference	FGI: no difference with control e significant FGI: 34% FGI: no	difference significant	difference
		% of	mycotoxin % of inhibited mycotoxin % of inhibited mycotoxin 93% inhibited 88%-100% d % of mycotoxin inhibited % of mycotoxin inhibited % of mycotoxin inhibited	Significant 96% 99% 100%	inhibition	compared % of	to control 76% 100% mycotoxin inhibited	100% 100% 99%	65%	77%	100%	29% 100% 100%	100%	32% 77%-86% e	92% 69%	100% 74%-94% c 51%-96% e 46%	100% 55% 37%	79%	68% 69% 80% 61%	96% 32% 95% 34%-100% e	100%	55%	47%	69%	22%	97% 69%
		Extract con-Plant extract centration Extract con-used Plant extract centration Extract con-used centration 0.1 μg/ml used 0.05-0.15 ml extract/ml 5 mg/ml of Plant extract Extract con-centration used 0.04 mg/ml Plant extract Extract con-centration used 10 mg/ml Plant extract Extract con-centration used 3 mg/ml Plant extract medium d Extract con-	0.2 mg/ml 2 mg/ml centration used	0.032 g 5 mg/ml		extract/kg 5 mg/ml of medium			70 mg/ml				0.03 mg/ml	0.1 mg/ml	0.032 g	extract/kg 0.28-2.5 mg/ml c of medium μg 12.5 0.1 mg/ml	0.17 mg/ml GAE/ml f	200 ppm	1.25 mg/ml	0.05 mg/ml 0.2 mg/ml	5 mg/ml	0.17 mg/ml	200 ppm	35 ppm	0.05 mg/ml
				Mycotoxin	Mycotoxin Mycotoxin produced	AFB1 Mycotoxin produced produced AFB1 produced Mycotoxin produced	FB1, FB2, FB1 AFB1 AFB1	FB3		OTA AFB2 Mycotoxin produced	NIV DON AFB1	FB1, FB2,	DON FB3 15ADON, 3ADON AFB1 NIV	DON NIV	NIV DON	DON AFB1	NIV	AFB1 DON,		DON OTA OTA NIV 15ADON	NIV	DON AFB1 NIV AFB1, AFB2, AFF1,	DON AFB1 FB1 AFF2 DON, 15ADON	OTA	AFB1,	AFB2,	AFF1,	AFF2	OTA	DON
				Fungal	Fungal Fungal species	A. flavus Fungal species species A. flavus species Fungal species	F. verticillioides F. verticillioides A. flavus A. flavus			A. carbonarius Fungal species	F. gramin-F. gramin-A. parasiticus	earum F. verticillioides earum				F. asiaticum A. flavus			F. meridionale F. gramin-	earum A. flavus	F. gramin-	earum A. flavus F. gramin-	earum	A. carbonarius	P. verrucosum	F. asiaticum	A. flavus	F. meridionale A. flavus	F. verticillioides F. gramin-	A. flavus earum	P. verrucosum	A. flavus	A. carbonarius	F. gramin-	earum
				Phenolic content and their	Phenolic content and their Phenolic content and their concentration	Flavonoids: hyperoside, Phenolic content and their concentration vitexin, isovitexin, concentration Phenolic acids: caffeic (4-23 Phenolic acids: 5-CQA, isoorientin, rutin, quercetin μg/ml d ) and coumaric (3-6 3-CQA, 4-CQA, caffeic, μg/ml d ) acids concentration Phenolic acids: chlorogenic (585.2 μg/g), μg/g), TPC: 7.41 μmol Trolox EQ/g feruloylquinic, p-coumaroylquinic, DW and trihydroxycinnamoylquinic n.m.-TPC a acids Other phenolic compounds: Phenolic acids: 5-CQA tyrosol (58-132 (404 mg/g), 3-CQA, 4-CQA, μg/ml d ), hydroxytyrosol caffeic (12.3 mg/g), (4-23 feruloylquinic, μg/ml d ), verbascoside (0-120 p-coumaroylquinic, and μg/ml d ), isoverbascoside trihydroxycinnamoylquinic (0-15 acids μg/ml d ), comselogoside hydroxybenzoic (24.6 protocatechuic (16.3 μg/g), and gallic (1.7 μg/g) acids Phenolic acids: gallic (728 μg/g) and caffeic Phenolic compounds a Phenolic acids: 3-hydroxycinnamic (1023 μg/g), caffeic (427 μg/g), chlorogenic (300 μg/g), and gallic (62.3 μg/g) acids, Flavonoids: isorhamnetin 3-O-rutinoside (2175 μg/g), luteolin 7-O-glucoside (1.248 μg/g), catechin (946 n.m.-TPC a (0-16 μg/ml d ), and (42 μg/g) acids μg/g), and quercetin (842 Phenolic acids: ellagic caffeoyl-6-secologanoside μg/g) Phenolic content and their concentration Flavonoids, phenolic acids, tannins, and stilbenes a Phenolic acids: caffeic, caffeoylquinic, dicaffeoylquinic, and chlorogenic acids a Phenolic compounds a Flavonoids: chalcone, dihydrochalcone, and rutin Phenolic content and their concentration Flavonoids: pinobanksin (1 mg/g) and pinocembrin (0.4 mg/g) Phenolic acids: vanillic (0.5 mg/g), ferulic (0.4 mg/g), protocatechuic (0.3 mg/g), and caffeic (0.2 mg/g) acids TPC: 21.1 mg/g Phenolic compounds a	Phenolic acids: chlorogenic and gallic acids (3.7%), TFC: 69.7 mg catechol EQ/g μg/g), gallic Phenolic acids: ellagic (37%) TPC: 278.4 mg GAE/g Phenolic acids: chlorogenic (7.4 mg/g) (4.5 and tannins a apigenin-7-glucoside (15.3 Phenolic acids a , flavonoids a , (15.1 mg/g) and (347 TPC: 5-46 mg GAE/g c,f Flavonoids: apigenin (396 283-1148 flavonoids b , and tannins b μg/ml d Phenolic acids: gallic Total polyphenols: (46.6-345 μg/g c ) acids, TPC: 700 (59.5-740.9 μg/g c ) and gallic (0-4 μg/ml d ) μg/g μg/g), caffeic μg/g), protocatechuic μg/g), and chlorogenic μg/g) acids (489.5 (86.6 μg/g), protocatechuic tannins: pedunculagin (126.5 μg/g), gallic Flavonoids b μg/g), ferulic (76.4 (6.4%), punicallin (5.9%), -TPC: 195.8 mg GAE/g μg/g), (68.4 punicalagin (5.6%), gallagic (27 μg/g), syringic (7.6 μg/g), vanillic (3.4 μg/g), hydroxybenzoic acid (5.5%), granatin (5.1%), p-hydroxybenzoic (1.4 μg/g), and ferulic glucogallin (4.8%), and (30.3 μg/g), caffeic TPC (11.2 μg/g), syringic, corilafin (4.5%) (0.3 μg/g) acids TPC: 2.3 mg GAE/g p-Coumaric acid a TPC: 9.6 μg GAE/g n.m. TPC: 95.2 μg GAE/g n.m.-TPC Caffeic and rosmarinic Phenolic compounds: chavibetol, isomethyl eugenol, and hydroxychavicol Lignans: nortrachelogenin (7.3 mg/g) and pinoresinol (2.8 mg/g)	protocatechuic (8.4 μg/g), acids a -TPC	and p-coumaric (2.5 μg/g)	acids
	TA B L E 1 (Continued)	TA B L E 1 (Continued) TA B L E 1 (Continued)	TA B L E 1 (Continued) TA B L E 1 (Continued)			Cereals Raw material Extraction Raw material Extraction Raw material Extraction Other plant Buckwheat Ethanolic Raw material hulls extraction Extraction Olive (Olea europaea-Maize kernels (Fagopyrum Methanolic Coratina (Zea mays) esculentum) extraction cv/Cellina di Ultrafiltrate mill waste water Microalgae Spirulina sp. Methanolic extraction materials Hyssop leaves (Micromeria graeca) Nardò Aqueous extraction Raw material Extraction Bilberry leaves (Vaccinium myrtillus L.) Aqueous extraction TA B L E 1 (Continued)	Neem seeds Methanolic cv) extraction Cardoon heads Methanolic Extraction cv/Koroneiki Aloe vera gel Methanolic Raw material	(Azadirachta extraction Size-indica) exclusion (Cynara cardunculus L.) extraction	Rice bran Methanolic Fruits Betel leaves extract sinensis) lic (Camellia methano-leaves the Green tea fraction of Aqueous extraction (Piper betel Chloroform fraction of	(Oryza extraction Pomegranate Aqueous L.) methano-Subcritical Grape canes	sativa L.) peel (Punica extractions lic water	granatum Cumin Acetonic extract extraction	L.) extraction (Vitis vinifera)	Olive pomace	Methanolic (Olea Isopraponolic	extraction europaea) aqueous	extraction Methanolic Fenugreek Pine sawdust Subcritical	Pomegranate Methanolic Nannochloropsis extraction (Pinus water	Fermented Methanolic fruit shells extraction sp. pinaster) extraction	rice bran extraction (Punica Olive leaves granatum (Oryza (Olea L.) sativa L.) europaea) Isopraponolic aqueous Melissa	extraction	Grape skins Methanolic	(Vitis extraction Mint	vinifera)
																															15 19

TA B L E 1

Abbreviations: 15ADON, 15-acetyl-deoxynivalenol; 3ADON, 3-acetyl-deoxynivalenol; AFB1, aflatoxin B1; AFB2, aflatoxin B2; AFF1, aflatoxin F1; AFF2, aflatoxin F2; CQA, caffeoylquinic acid; DON, deoxynivalenol; EQ, equivalent; FB1, fumonisin B1; FB2, fumonisin B2; FB3, fumonisin B3; FGI, fungal growth inhibition; MFC, minimum fungicidal concentration; MIC, minimum inhibitory concentration; NIV, nivalenol; n.m., not mentioned; OTA, ochratoxin A; TFC, total flavonoid content; TPC, total phenolic content assay. a Refers to another study. b Colorimetric assays. c According to different extraction process. d According to different plant cultivar. e According to different fungal isolate. f Gallic Acid Equivalent.

Antimycotoxin properties Phenolic compound Fungal species Mycotoxins Compound concentration (mM) Mycotoxin inhibition Antifungal activity in vitro system Reference

  Natural phenolic compounds used to reduce mycotoxin production in vitro (2010-2021): Structures shown in Figure2

				Reference Salas et al.,	2016b	Salas et al.,	Bilska et al., 2016a	2018 Pok et al., 2018		Bollina &	Kushalappa, Salas et al., 2012 2011	Salas et al., Schöneberg 2016a et al., 2018 Pok et al., 2018 Salas et al., 2012	Bilska et al.,	2018 Salas et al., 2012		Salas et al.,	2016b Salas et al., 2012		Salas et al., 2012 Salas et al., 2012		Salas et al., 2012	Salas et al., 2012	Salas et al.,	2016b	Salas et al., 2012	Salas et al.,	2016a	Salas et al., 2012 Salas et al., 2012	(Continues)	(Continues)
			in vitro	system Solid MEA		Solid MEA	Solid YES	Sterilized	rice	Liquid PDB	Solid MEA		Solid MEA Sterilized	Sterilized oat Solid MEA rice	Solid YES	Solid MEA		Solid MEA	Solid MEA		Solid MEA Solid MEA		Solid MEA	Solid MEA	Solid MEA		Solid MEA	Solid MEA		Solid MEA Solid MEA
			Antifungal	activity n.m.		n.m.	Significant	inhibition of n.m.	fungal growth a	FGI: 39%	n.m.	n.m. n.m. FGI: no significant	n.m. difference n.m.	Significant n.m.	inhibition of n.m.	fungal growth a	n.m. n.m.	n.m.	n.m.	n.m. n.m.	n.m.	n.m. n.m.	n.m. n.m.	n.m.	n.m.	n.m.	n.m.	n.m.	n.m. n.m.	n.m.	n.m.
			Mycotoxin	inhibition 86%-68%		100%	41%-99% a	100%		100% 100%	99%	97% 99% 59%	100% 99%	10%-99% a 99%	99%		65%-70% 98%	97%	62%-67% 98%	96% 97%	99%	96% 99%	99% 99%	80%-91%	99%	100% 99%	100%	98%	95% 98%	99%	99%
	Antimycotoxin properties	Compound	concentration	Mycotoxins AFB1 (mM) 0.15-0.3		AFB2 0.15-0.3	DON, 3ADON, 1.5-2.9	15ADON, DON 0.15	NIV, FUS-X	DON, 3ADON ZEA 1.58 0.11	PAT 0.25	DON PAT T2, HT2 0.15 0.25 0.33	ZEA PAT 0.3 0.25	DON, 3ADON, PAT 1.5-2.9 0.25	15ADON, PAT 0.25	NIV, FUS-X	AFB1 PAT 0.15-0.3 0.25	PAT 0.25	AFB2 PAT 0.15-0.3 0.25	PAT PAT 0.25 0.25	PAT 0.25	PAT PAT 0.25 0.25	PAT PAT 0.25 0.25	AFB1 0.15-0.3	PAT 0.25	AFB2 PAT 0.15-0.3 0.25	DON 0.3	PAT 0.25	PAT PAT 0.25 0.25	PAT 0.25	PAT 0.25
				Fungal species A. flavus		F. graminearum	F. graminearum				P. expansum	B. fulva	F. langsethiae	P. expansum	F. culmorum B. fulva	P. expansum		A. flavus B. fulva	P. expansum	B. fulva	P. expansum P. expansum	B. fulva	P. expansum B. fulva	B. fulva P. expansum	A. flavus	B. fulva	P. expansum	F. graminearum	B. fulva	P. expansum P. expansum	B. fulva	B. fulva
	TA B L E 2 (Continued) TA B L E 2 (Continued)			Phenolic compound Neohesperidin	Flavonoids	Flavanones	Naringenin								Hesperetin glucoside		Hesperetin glucoside	6″-O-lauroyl ester		Prunin		Prunin 6″-O-butyryl	ester	Naringin	Prunin 6″-O-decanoyl	Hesperidin ester		Prunin 6″-O-lauroyl	ester		Prunin 6″-O-stearoyl	ester
																															23

TA B L E 2

Antimycotoxin properties Phenolic compound Fungal species Mycotoxins Compound concentration (mM) Mycotoxin inhibition Antifungal activity in vitro system Reference Flavones Luteolin

	Bilska et al.,	2018		Bilska et al.,	2018		Ricelli et al.,	2019	Bilska et al.,	2018		Bollina &	Kushalappa,	2011	Bilska et al.,	2018		Zhou et al., 2015	Schöneberg	et al., 2018	Bilska et al.,	2018		Bilska et al.,	2018		Chitarrini et al.,	2014	Schöneberg	et al., 2018	(Continues)
	Solid YES			Solid YES			Liquid CDY		Solid YES			Liquid PDB			Solid YES			Liquid SD	Sterilized	oat	Solid YES			Solid YES			Liquid PDB	Sterilized	oat
	Significant	inhibition of	fungal growth a	Significant	inhibition of	fungal growth a	FGI: no significant	difference	Significant	inhibition of	fungal growth a	FGI: 46%			Significant	difference a		MIC: 2.65 mM	FGI: no significant	difference	Significant	inhibition of	fungal growth a	Significant	inhibition of	fungal growth a	FGI: >50%	FGI: no significant	difference
	50%-97% a			94%-99% a			>60%		95%-99% a			100%			78%-99% a			100%	59%		24%-94% a			86%-99% a			>67%	45%
	1.4-2.8			1.4-2.8			0.018		1.3-2.6			2.95			1.3-2.6			0.33	0.33		1.4-2.8			1.4-2.8			0.33	0.16
	DON, 3ADON,	15ADON,	NIV, FUS-X	DON, 3ADON,	15ADON,	NIV, FUS-X	OTA		DON, 3ADON,	15ADON,	NIV, FUS-X	DON, 3ADON			DON, 3ADON,	15ADON,	NIV, FUS-X	AFB1	T2, HT2		DON, 3ADON,	15ADON,	NIV, FUS-X	DON, 3ADON,	15ADON,	NIV, FUS-X	AFB1	T2, HT2
	F. graminearum			F. culmorum			A. carbonarius		F. graminearum						F. culmorum			A. flavus	F. langsethiae		F. graminearum			F. culmorum			A. flavus	F. langsethiae
	TA B L E 2 (Continued)						Negletein	Flavonols	Quercetin												Kaempferol						Rutin
																											25

Antimycotoxin properties Phenolic compound Fungal species Mycotoxins Compound concentration (mM) Mycotoxin inhibition Antifungal activity in vitro system Reference Flavan-3-ols Epigallocatechin

		Zhou et al., 2015	Zhou et al., 2015			Pagnussatt et al.,	2014	Pagnussatt et al.,	2014	Kulik et al.,	2017b		Kulik et al.,	2017b	Pani et al., 2014			Pani et al., 2014			Boonmee et al.,	2020	Ferrara et al.,	2015	Bollina &	Kushalappa,	2011	(Continues)
		Liquid SD	Liquid SD			Solid PDA		Solid PDA		Solid YES			Solid YES		Vogel's	liquid	medium	Vogel's	liquid	medium	Liquid ME	Liquid MM	Liquid PDB
		MIC: >3.27 mM	MIC: >2.26 mM			FGI: no significant	difference	n.m.		n.m.	n.m.		n.m.	n.m.	FGI: 59%			FGI: no significant	difference		FGI: no significant	difference	FGI: no significant	difference	FGI: 60%
		100%	100%			95%-100% a		100%		53%	95%	88%	15%-48%	52%	97%			84%			50%	87%	100%
		1.31	1.81			0.2		0.2		0.7	0.7	0.7	0.7	0.7	1			1			0.5	5.67	1.15
		AFB1	AFB1			DON		NIV		DON, 3ADON	DON, 15ADON		DON, 3ADON	NIV, 4ANIV	3ADON			3ADON			OTA	OTA	DON, 3ADON
	TA B L E 2 (Continued)	A. flavus	Epicatechin gallate A. flavus	Phenolic acids	Hydroxycinnamic acid derivatives	F. graminearum Trans-cinnamic acid							F. culmorum		F. culmorum 3-Hydroxycinnamic	acid		F. culmorum 4-Hydroxycinnamic	acid		P. verrucosum	A. carbonarius	F. graminearum

Antimycotoxin properties Phenolic compound Fungal species Mycotoxins Compound concentration (mM) Mycotoxin inhibition Antifungal activity in vitro system Reference

		Ferrara et al.,	2015	Bavaro et al.,	2016	Gauthier et al.,	2016		Atanasova-	Penichon	et al., 2018	Bollina &	Kushalappa,	2011	Pagnussatt et al.,	2014	Bollina &	Kushalappa,	2011	Pagnussatt et al.,	2014	Gauthier et al.,	2016		Pani et al., 2014			Atanasova-	Pénichon	et al., 2014	Bavaro et al.,	2016	(Continues)
		Liquid MM		Solid PDA		Liquid MS			Liquid MS			Liquid PDB			Solid PDA		Liquid PDB			Solid PDA		Liquid MS			Vogel's	liquid	medium	Liquid	GAYEP	Solid PDA
		FGI: no significant	difference	Increase of mycelial	growth	IC 50 : 7.3-8.8 mM a			FGI: no significant	difference		FGI: 35%			FGI: no significant	difference	FGI: 35%			FGI: no significant	difference	IC 50 : 8.8 → 10 mM a			FGI: no significant	difference		FGI: no significant	difference	Increase of mycelial	growth
		85%		83%		47%-100% a			52%-88%			85%			86%-100% a		94%			90%-100% a		65%-100% a			97%			76%	83%
		1.67		0.55		0.5			0.5			2.5			0.17		2.5			0.17		0.5			1			0.5	0.55
		OTA		AFB1		DON, 3ADON,	15ADON,	NIV, FUS-X	DON, 15ADON			DON			3ADON		NIV					DON, 3ADON,	15ADON,	NIV, FUS-X	4ADON			FB1, FB2, FB3	AFB1
		A. carbonarius		A. flavus		F. graminearum																F. culmorum						F. verticillioides	A. flavus
	TA B L E 2 (Continued)	Caffeic acid
																													27

Antimycotoxin properties Phenolic compound Fungal species Mycotoxins Compound concentration (mM) Mycotoxin inhibition Antifungal activity in vitro system Reference

		Boonmee et al.,	2020	Boonmee et al.,	2020	Ferrara et al.,	2015	Ferrochio et al.,	2013	Bollina &	Kushalappa,	2011	Oufensou et al.,	2020	Pani et al., 2014			Pani et al., 2014			Pani et al., 2016			Ferruz et al.,	2016	Schöneberg	et al., 2018	Ferruz et al.,	2016	(Continues)
		Liquid ME		Liquid ME		Liquid MM		Solid maize	mixture	Liquid PDB			Solid FMM		Vogel's	liquid	medium	Vogel's	liquid	medium	Vogel's	liquid	medium	Liquid MS	Sterilized	oat	Liquid MS
		FGI: no significant	difference	FGI: no significant	difference	FGI: no significant	difference	Inhibition of fungal	growth	FGI: 56%			FGI: no significant	difference	FGI: no significant	difference		FGI: no significant	difference		FGI: no significant	difference		23% of fungal	biomass increase	FGI: no significant	difference	17% of fungal	biomass increase
		70%		35%		93%		95% a		100%			30%		55%			80%			66%			26%	44%	23%
		0.5		0.5		3.96		20		1.76			0.5		0.5			1			0.5			0.5	0.52	0.5
		OTA		OTA		OTA		FB1, FB2		DON, 3ADON			DON		3ADON			DON						T2	T2, HT2	T2
		P. verrucosum		A. westerdijkiae		A. carbonarius		F. proliferatum		F. graminearum					F. culmorum									F. langsethiae	F. sporotrichioides
	TA B L E 2 (Continued)	Ferulic acid

Antimycotoxin properties Phenolic compound Fungal species Mycotoxins Compound concentration (mM) Mycotoxin inhibition Antifungal activity in vitro system Reference

		Bollina &	Kushalappa,	2011	Kulik et al., 2017			Kulik et al., 2017			Gauthier et al.,	2016		Kulik et al.,	2017b		Gauthier et al.,	2016		Kulik et al.,	2017b	Ferruz et al.,	2016	Atanasova-	Pénichon	et al., 2014	Atanasova-	Pénichon	et al., 2014	(Continues)
		Liquid PDB			Solid YES			Solid YES			Liquid MS			Solid YES			Liquid MS			Solid YES		Liquid MS	Liquid	GAYEP	Liquid	GAYEP
		FGI: 48%			n.m.			n.m.			IC 50 : >10 mM a			n.m.	n.m.	n.m.	IC 50 : >10 mM a			n.m.	n.m.	25% of fungal	biomass increase	FGI: no significant	difference	FGI: no significant	difference
		100%			92%-96% a		96%-99% a	37%-98% a		88%-99% a	53%-100% a			45%	93%	88%	35%-100% a			20%-42% a	76%	23%	36%-92% a	30%-99% a
		1.74			1.8		3.6	1.8		3.6	0.5			0.3	0.3	1.1	0.5			1.1	0.3	0.5	0.5	0.5
		DON, 3ADON			DON, 3ADON,	15ADON,	NIV, 4ANIV	DON, 3ADON,	15ADON,	NIV, 4ANIV	DON, 3ADON,	15ADON,	NIV, FUS-X	NIV	DON, 3ADON	DON, 15ADON	DON, 3ADON,	15ADON,	NIV, FUS-X	DON, 3ADON	NIV, 4ANIV	T2	FB1, FB2, FB3	FB1, FB2, FB3
		F. graminearum						F. culmorum			F. graminearum						F. culmorum					F. langsethiae	F. verticillioides	F. proliferatum
	TA B L E 2 (Continued)	Sinapic acid									Chlorogenic acid
																							29

Antimycotoxin properties Phenolic compound Fungal species Mycotoxins Compound concentration (mM) Mycotoxin inhibition Antifungal activity in vitro system Reference Hydroxybenzoic acid derivatives

		Ponts et al., 2011		Schöneberg	et al., 2018	Pagnussatt et al.,	2014	Romero et al.,	2010		Gomaa & El	Nour, 2014	Qi et al., 2012					Schöneberg	et al., 2018	Wang et al., 2015		De Rossi et al.,	2012	Sobolev et al.,	2018	Sobolev et al.,	2018	Sobolev et al.,	2018	(Continues)
		Solid PDA		Sterilized	oat	Solid PDA		Solid CYA			Liquid CDY		Liquid	GYEP	then	liquid	Myro	Sterilized	oat	Liquid	A&M	Liquid CDY	Solid PDA	Solid PDA	Solid PDA
		FGI: no significant	difference	FGI: no significant	difference	FGI: no significant	difference	Significant	inhibition of	fungal growth	FGI: no significant	difference	Inhibition of fungal	growth				FGI: no significant	difference	FGI: no significant	difference	n.m.	Not obvious	difference	Obvious difference	Obvious difference
		>66%		80%		79%-100% a	59%-100% a	Marked effect			100%		83%					80%		47%		Significantly	inhibited	75%-80%	>98%	>50%
		0.5		0.72		0.18		0.59			0.5		0.5					0.59		0.13		0.1	0.3	0.3	0.3
		DON, 15ADON		T2, HT2		DON	NIV	OTA			AFB1, AFB2,	AFG1, AFG2	15ADON					T2, HT2		AFB1 and	AFB2	OTA	AFB1	AFB1	AFB1
		F. graminearum		F. langsethiae		F. graminearum		A. carbonarius			A. flavus		F. graminearum					F. langsethiae		A. flavus		A. carbonarius	A. flavus	A. flavus	A. flavus
	TA B L E 2 (Continued)	p-Hydroxybenzoic	acid			Gallic acid							Salicylic acid					Vanillic acid	Stilbenes	Resveratrol			Arachidin-1	Arachidin-3	Chiricanine A

Antimycotoxin properties Phenolic compound Fungal species Mycotoxins Compound concentration (mM) Mycotoxin inhibition Antifungal activity in vitro system Reference Lignans Pinoresinol

	F. graminearum DON 0.003 97%-99% a FGI: 17%-39% a Solid YES Kulik et al., 2014	3ADON 0.003 90%-99% a FGI: 17%-39% a	NIV 0.003 82%-97% a FGI: 15%-27% a	4ANIV 0.003 78%-79% a FGI: 15%-27% a	Secoisolariciresinol F. graminearum DON 0.003 41%-92% a FGI: 8%-11% a Solid YES Kulik et al., 2014	3ADON 0.003 44%-99% a FGI: 8%-11% a	NIV 0.007 70%-85% a FGI: 27%-30% a at	0.003 mM	4ANIV 0.007 51%-60% a FGI: 27%-30% a at	0.003 mM	Magnolol F. culmorum 3ADON 0.25 100% FGI: 79% Vogel's Pani et al., 2014	liquid	medium	F. graminearum DON 0.25 >95% Inhibition of fungal Solid FMM Oufensou et al.,	growth 2020	Abbreviations: 15ADON, 15-acetyl-deoxynivalenol; 3ADON, 3-acetyl-deoxynivalenol; 4ADON, 4-acetyl-deoxynivalenol; 4ANIV, 4-acetyl-nivalenol; AFB1, aflatoxin B1; AFB2, aflatoxin B2; AFG1, aflatoxin G1; AFG2,	aflatoxin G2; CDY, Czapek Dox plus Yeast agar medium; CYA, Czapek Yeast Agar medium; DON, deoxynivalenol; FB1, fumonisin B1; FB2, fumonisin B2; FB3, fumonisin B3; FGI, fungal growth inhibition; FMM,	Fusarium Minimal Medium; FUS-X, fusarenon X; GAYEP, Glucose Amylopectin Yeast Extract & Peptone medium; GYEP, Glucose Yeast Extract & Peptone medium; HT2, HT-2 toxin; IC 50 , half maximal inhibitory	concentration; ME, Malt Extract medium; MEA, Malt Extract Agar medium; MIC, minimum inhibitory concentration; MM, Minimal Medium; MS, Mycotoxin Synthetic medium; NIV, nivalenol; n.m., not mentioned;	OTA, ochratoxin A; PAT, Patulin; PDA, Potato Dextrose Agar medium; PDB, Potato Dextrose Broth; SD, Sabouraud Dextrose medium; T2, T-2 toxin; YES, Yeast Extract with Supplements medium; ZEA, zearalenone.

a According to different fungal isolate.

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Table S2 :

 S2 Major mycotoxins and associated commodities contaminated for the period 2017 and 2021.

						Etat de l'art Etat de l'art Etat de l'art Etat de l'art
		Wheat grains and wheat-Industrial and craft beers Silage Sugarcane juice	FB1 and FB2 DON, 3ADON, 15ADON DON, ZEN, enniatins AFB1 and FB1	FUMs (0.05-18.9 μg/kg) DON+DON3G+3ADON+15ADON: 5.24 to 86.59 µg/L LC-MS/MS LC-MS/MS DON (198 mg/kg); ENB (0.4 mg/kg); ZEN (17 mg/kg); LC-MS/MS Winter season: AFB1 (0.1-3 μg/L); FB1 (2.8-57.9 μg/L) LC-MS/MS	Cendoya et al., 2019 Wall-Martínez, Juan et al., 2020 Abdallah et al., 2020
		based products	and DON-3G (ENB) and beauvericin (BEA) and tentoxin	TENT (30 mg/kg); BEA (0.14 mg/kg) Summer season: AFB1 only (0.3-1.3 μg/L)	GC-MS/MS	Pascari, et al., 2019
	Geographical region South & central America Durum wheat Commodity type Corn tortilla (traditional) Animal feed and maize Wheat, maize, soybean, grapes Fruit commodities (apple, apricot, grape, orange, Mexico Nixtamalized maize Pearl millet (Pennisetum samples Egypt glaucum L.) Tunisian infant foods peach, pear and pineapple) and type of fruit products (cloudy concentrated juice, cloudy single strength juice, concentrated juice, concentrated pulp, single Milk samples Tunisia Maize, commercial feed, (bsissa sample), oat, wheat and raw dairy milk flour, maize, sorghum, North America bsissa, couscous, breakfast cereals and semolina and apricot cereals, biscuits, infant Dried mulberry, date, fig	Mycotoxins DON and DON-3G AFB1, AFB2, AFG1, (TENT) AFB1, ZEA, BEA, DON, T2, HT2, DON, NIV, FUMs, ZEA, AFs, AOH, AME, OTA PAT and OTA AFG2, FB1 and FB2 FB1, FB2 and DON OTA and AFB1 DON-3G, FB1, FB2, FB3, NIV, T2, TEN and ZEN DON and ENB AFM1 AFB1, AFB2, AFG1, and AFG2, OTA and ZEN AFs and OTA	Mean range of these mycotoxins in positive samples DON (50-9480 μg/kg); DON-3G (50-850 µg/kg) AFs (0.17-22.17 μg/kg); FUMs (8.2-526.6 μg/kg) AFB1 (5.3 µg/kg), ZEA (7.3 µg/kg), BEA (6.5 µg/kg), Wheat: T2 (10-70 µg/kg); HT2 (10-30 µg/kg); DON (1000-10000 µg/kg); NIV (100-1000 µg/kg); FUMs (10-1400 µg/kg) PAT (3.0-19622 μg/L); OTA (0.1-3.6 μg/L) FB1 (79-1589 μg/kg); FB2 (24-524 μg/kg); DON (43-658 μg/kg) OTA (24.54 µg/kg); AFB1 (22.72 µg/kg) DON (171 µg/kg), DON-3G (49.4 µg/kg), FB1 (459 µg/kg), FB2 (55.4 µg/kg), FB3 (103 µg/kg), NIV (18.7 µg/kg), T2 (5.8 µg/kg), TEN (2.2 µg/kg) and ZEN (33.2 µg/kg) DON (2 µg/kg); ENB (0.1 µg/kg) AFM1 (0.1-1.27 μg/L) AFB1 (400 µg/kg); ZEN (187-791 µg/kg)	LC-MS/MS LC-FLD LC-MS/MS Analytical method used LC-UV, LC-FLD, ELISA LC-DAD LC-MS/MS LC-FID LC-MS/MS ELISA LC-FLD GC-MS/MS LC-FID	Palacios et al., 2017 Wall-Martínez, Abdallah et al., 2017 Reference Chiotta et al., 2020 Oteiza et al., 2017 Ramírez-Martínez, et al., 2019 Lasram et al., 2020 Gilbert-Sandoval et al., 2020 Oueslati et al., 2018 Quevedo-Garza et al., Abdallah et al., 2019 2018 Heshmati et al., 2017
	Iran	Oat strength pulp and sulphited lactating mothers juice) Breast milk samples of	AOH, AME, ALT, tentoxin 3ADON, culmorin (CUL), (TTX), OTA, DON, AFM1	AOH (6.91-72.4 µg/kg); AME (7.9-98 µg/kg); ALT (62.1 (68-1142 µg/kg); DON-3G (45.6-536 µg/kg); 3ADON µg/kg); TTX (9.4-74.9 µg/kg); OTA (2.7 µg/kg); DON 11.1 to 39.3 ng/L	LC-FLD	Jafari et al., 2017
	Argentina Canada Qatar	Raw wheat, bran and flour TeA Raw barley AOH, AME and TeA HT2, T2, NIV, ZEN BEA, ENN A, ENN A1, ENN B, ENN B1, GB1 Cow's milk samples AFM1 Barely, wheat and corn AFs, OTA FUMs, BEA, Red wines OTA 3ADON, NIV, ZEN, ENB, semolina couscous DON, diacetoxiscyrpenol (DAS), , 15ADON, and cereal-based baby food AFB1, FB2, ZEN and T2 Commercial formula milk AFM1, OTA, DON,	Wheat (5565-92002 µg/kg); bran (6288-82609 µg/kg); flour (3129-17719 µg/kg) AOH (368-1689 μg/kg); AME (384-6812 μg/kg); TeA (628-3678 μg/kg) (110 µg/kg); CUL (33.7 µg/kg), HT2 (51.2-188 µg/kg); 61 ng/L T2 (38.6-72.9 µg/kg); NIV (77.8-232 µg/kg); ZEN (21.-101 µg/kg); BEA (8.7-39.7 µg/kg); ENN A (2.4-4 µg/kg); Wheat: ADON (19.3-153.8 µg/kg); AFB2 (2.5 µg/kg); 0.02 to 0.98 µg/L µg/kg); ZEN (22-132.1 µg/kg) ENN A1 (5.6-18.5 µg/kg); ENN B (15.3-1332 µg/kg); ENN B1 (20.3-163 µg/kg), FB1 (79.2 µg/kg) AFG1 (1-2.5 µg/kg); AFG2 (4.2-8.3 µg/kg); DON (20.6-106.6 µg/kg); NIV (62.4-462.2 µg/kg) ; T2 (5.3-5.8 -	LC-UV LC-DAD ELISA LC-MS/MS LC-MS/MS	Romero Bernal et al., Castañares et al., 2020 Hajmohammadi et al., 2020 Zinedine et al., 2017 2019 Mariño-Repizo et al., 2017
	Brazil Morocco	Wheat flour Malting barley Milk samples (whole, skimmed, semi-skimmed liquids and powders) Maize food and animal Winter wheat	DON DON and NIV AFM1 and AFB1 AFB1, AFB2, AFG1, and OTA, OTB and CIT sterigmatocystin (STC), T2 and HT2	243 µg/kg DON (2,6 mg/kg); NIV (2,36 mg/kg) AFM1 (40-3670 ng/L); AFB1 (40-600 ng/L) AFs (1,3-3,6 μg/kg); FBs (2,9-1500 μg/kg); ZEN (8,7-OTA (14.7 μg/kg); CIT (4.9 μg/kg); OTB (1.2 μg/kg) Barley: ADON (21.6 µg/kg); AFB2 (0.3 µg/kg); AFG1 (1-2.5 µg/kg); AFG2 (1.6-5.5 µg/kg); ENA (15.8 µg/kg); ENA1 (2-48.5 µg/kg); ENB (5.5-70 µg/kg); NIV (182.5-240 µg/kg); ZEN (7.6-543.3 µg/kg)	GC-ECD LC-UV/Vis LC-FLD LC-MS/MS LC-MS/MS	Cirio et al., 2019 Nogueira et al., 2018 Gonçalves et al., 2018 Franco et al., 2019 Limay-Rios et al., 2017
	USA	Healthy and rotten wine grapes feed Raw maize Distiller's dried grains with solubles (DDGS)	TeA AFG2, FB1, FB2, OTA, ZEN and DON FB1, FB2, AFB1, AFG1 AFs, DON, ZEN, FUMs,	Healthy samples (77 μg/kg); rotten samples (10-778 μg/kg) 180 μg/kg); DON (44-79 μg/kg) AFs (0.4-49.9 µg/kg); FB1+FB2 (62.4-66,274 µg/kg); AFs (6.3 µg/kg); DON (3 µg/kg); ZEN (167.6 µg/kg); Corn: ADON (94.8-2174 µg/kg); AFB1 (31.1 µg/kg); AFB2 (2.1 µg/kg); AFG2 (2.8-17.5 µg/kg); ENA (4.6-46 FUMs (1 µg/kg) µg/kg); ENA1 (4.1-67 µg/kg); ENB1 (2.6-47.62 µg/kg); NIV (182.5-240 µg/kg); T2 (5 µg/kg)	LC-UV LC-MS/MS LC-MS/MS	Prendes et al., 2018 Abudabos et al., 2017 Oliveira et al., 2017
			ZEN and DON	ZEN (1.4-5088 µg/kg); DON (41.6-1008 µg/kg)
	Middle East & north Africa
	54 56					53 55

Maize: FUMs (1000-10000 µg/kg); DON (0.1-140 µg/kg), ZEA (0.1-85 µg/kg), AFs

µg/kg) Soybean: AOH (20-200 µg/kg); AME (60-1200 µg/kg); DON (500-5000 µg/kg) Grapes: OTA (0.1-5 µg/kg) LC-MS/MS Tittlemier et al., 2020 Wheat and durum Fusarium and Alternaria mycotoxins South central Manitoba:DON (0.066 to 0.895 mg/kg); Central Alberta: DON (<0.03 to 0.053 mg/kg) LC-MS/MS Tittlemier et al., 2019 Raw barley and derived products (e.g., beer and soup of barley) DON, 15ADON, NEO, NIV, HT2, FB1, OTA, ENA, ENA1, ENB and ENB1 DON (0.8 µg/kg); 15ADON (0.5 µg/kg); NIV (7.5 µg/kg); NEO (4.9 µg/kg); HT2 (6.4 µg/kg); OTA (0.6 µg/kg); FB1 (1.3 µg/kg); BEA (8 µg/kg); ENA (19.3 µg/kg); ENB (18.5 µg/kg); ENB1 (14.7 µg/kg) LC-MS/MS GC-MS/MS Juan et al., 2017 Total AFs: date (2.61 mg/kg), fig (3.43 mg/kg); apricot (2.91 mg/kg); OTA levels in all types of dried fruits were below recommended level in EU regulation (10 μg/kg)

  Vicia and Melilotus plants (least contaminated (53 and 91 µg/kg); Trifolium plants most contaminated by EMO (1284 µg/kg); Lathyrus plant most contaminated by DON (295 µg/kg), DAS (879 µg/kg) and T-2/HT-2 toxins (11 µg/kg); None of the Fusarium mycotoxins were detected in the Vicia sepium samples

						Etat de l'art Etat de l'art Etat de l'art Etat de l'art
	Benin, Cameroon, Mali and Nigeria Romania Korea	Public drinking water system Cereals (maize, maize Peanuts, peanut oil, maize, beans, sorghum, smoked fish corn flour oil, soybean oil Wheat, buckwheat, rye, oat, barley, rice, millet and Raw cereal, processed cereal, cereal-based food Rice, corn, peanut, barley, sesame oil, olive oil, peanut (Doenjang) Korean soybean saste	DON, 15ADON α-ZEL, FB3, FB1, TeA, 3ADON and AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 and STC ZOL), DON, DON-3G, and 15ADON AFs and OTA DON, AFs, OTA and ZEN DON (82.39 µg/kg) ; AFs (3.85 µg/kg), OTA (2.70, DON (8.4-96.1 ng/L); 3ADON (18.7-145.7 ng/L); 15ADON (15.2-71.6 ng/L) α-ZEL (6.5-70.5 µg/kg) in all matrices Maximum AFT (246.0 µg/kg) Total AFs (56.4 µg/kg) 3522 μg/kg); DON-3G (12-244 μg/kg); 15ADON (188-323 μg/kg); AFB1 (0.53-8.80 μg/kg); OTA (0.46-23.04 μg/kg) µg/kg); ZEN 1.92 µg/kg) AFB1 and OTA Trace analysis to limit exceeding 0.1 ng/g (4.67-95.08 µg/kg); FBs (2.48-68.52 µg/kg) AFs, OTA, ZEN and FBs AFs (0.11-5.43 µg/kg); OTA (0.16-23.27 µg/kg); ZEN	LC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS ELISA MCE-LIF LC-MS/MS	Mhlongo et al., 2020 Tebele et al., 2020 Ingenbleek et al., 2019 Torović, 2018a Gagiu et al., 2018 Xiao et al., 2018 Woo et al., 2019
	Africa Nigeria Somalia Ivory Coast Cape Verde Serbia Czech Republic Japan South Africa Europe Croatia Serbia, Greece and Croatia Russia Burkina Faso Namibia Poland Germany Asia Pakistan Spain India Swiss China Thailand	Casava flour, fufu and gari AFs, OTA and FBs Garlic (Allium sativum L.) AFB1, OTA, FB1, B2, B3, B4, and B6 Maize, sorghum and sheat AFB1 and FB1 ZOL), β-zearalenol (β-pig feed (powder) Kankankan spice powder AFB1 Whole milk powder AFM1 AFG2, AFM1, OTA, OTB, FB1, FB2, FB3, FB4, FA1, FA2, ZEN, ZEN-sulphate (ZEN-S), α-zearalenol (α-breastfeeding Maize AFs Wheat DON, DON-3G, ZEN, ENs, ENNs, NIV and BEA broken rice, rice bran, pig feed (pellet), complete soybean meal, complete samples middlings, wheat flour, samples and formula feed porridge, sorghum and wheat) OTB, DON, OTA, 3ADON, STC, 15ADON, CPA and AFB2 Dairy cattle feeds AFs, FB1, OTA, citrinin (CIT), ZEN, α-ZEL, β-ZEL, DON, 3ADON, 15ADON, HT-2, and BEA South Africa spices (coarse chilli, ground chilli, paprika, ginger, chicken spices, onion spices, beef spices, Mexican chilli, vegetable spice, fruit chutney spices and cheese spices) AFB1, AFG1, OTA, STC, 3ADON, FB1, FB2 and Roquefortine C Maize AFs 142 fruit juices (apple or PAT Raw cereal (maize, wheat, T2 and HT2 Cereals, legumes, potatoes, BEA, ENA, ENA1, ENB, 12 plant species (Galega orientalis, Lathyrus pratensis, Medicago AOH, emodin (EMO), DON, diacetoxyscirpenol (DAS) and T2/HT2 Corn flours and corn flakes ZEN, DON and FUMs B1 and B2 multi-fruit) barley and oat) meats, eggs, aquatic foods, ENB1, AOH, AOH Maize AFB1, AFB2, AFG1 and Maize samples DON Fish feed and fish meat of AFB1, AFB2, AFG1, dairy products, vegetables, monomethyl ether (AME), fruits, sugars, beverages, altenuene (ALT), TENT and alcohol beverages and TeA falcata, Medicago sativa, Melilotus albus, Melilotus officinalis, Trifolium hybridum, T. pratense, T. AFG2 Apple based food PAT common carp (Cyprinus carpio) AFG2, OTA, ZEN, DON, FB1, FB2, HT-2 and T-2 Maize Moniliformin (MON), Wheat-based products DON and ZEN Raw and commercial dairy AFB1 and AFM1 milk repens, Vicia cracca, V. ENs, BEA, and FUS UHT and pasteurized milk AFB1 and AFM1 Different formulations of flour consumed by low weight children (infants formulas) AFs, FUMs and OTA Namibian Traditional Fermented Patulin (PAT), AFB1, AFB2, and AFG2, and FB1, FB2 and FB3, ergot alkaloids, AFs precursors sativa and V. sepium) of six genera from the Fabaceae family Seeds of sunflower, soybean and corn AFB1, ZEN, FB1 and T2 Winter Rye Varieties (cereals) DON, NIV, 3-acetyl-DON, Monoacetoxyscirpenol, DAS, T-2 toxin, HT-2 toxin and ZEN Maize Aspergillus, Fusarium, Pe nicilium, Alternaria and other metabolites 66 samples of dry grain legumes AFB1, AFB2, AFG1, AFG2, OTA, DON, ZEN, T2 and Maize flour AFs and OTA Dairy cow feedstuff HT2 Maize kernels AFB1, AFB2, AFG1 and AFG2, FB1, FB2, OTA, ZEN, DON, 3-DON and 15ADON, T2 and HT2 Wheat samples Alternariol (AOH), Alternariol monomethyl 230 different types of milk AFM1 ether (AME) and samples comprising raw, Tenuazonic acid (TeA) Corn domestic dried AFB₁, ZEN and DON pasteurized and UHT treated milk distillers grains with Raw milk AFM1 Maize AFB1, AFB2, AFG1, Milk, dairy products and AFM1 Swiss oats Trichothecenes (NIV, DON, FUS-X, ADON, NEO, DAS, T2, HT2 and soluble (DDGS DON), imported DDGS corn, bran corn, bran corn germ meal, Rice Grains AFB1 corn gluten meal, wheat ZEN) barley, wheat bran, wheat Corn, soybean meal STC and AFB1	(1.289 µg/kg) AFB1 (5.48 µg/kg); OTA (12.3 µg/kg) μg/kg); α-ZOL (7 μg/kg); β-ZOL (7 μg/kg); DON (84-AFB1 (908 µg/kg); FB1 (17-322 μg/kg) (12-23 μg/kg); ZEN (14-598 μg/kg); ZEN-S (27-906 FB1 (401µg/kg); B2 (491 µg/kg) AFB1 (502 µg/kg) AFM1 (32-2896 ng/L) (0.6-2 μg/kg); OTA (6-53 μg/kg); OTB (5 μg/kg); FB1 (1905-4121 μg/kg); FB2 (431-828 μg/kg); FB3 (183-408 μg/kg); FB4 (146-498 μg/kg); FA1 (6-14 μg/kg); FA2 1.0-111.2 µg/kg DON (66-760 μg/kg); ZEN (115 μg/kg); 3ADON (88 μg/kg); DON-3G (83 μg/kg); ENNs (35-102 μg/kg); NIV (2 μg/kg); BEA (2 μg/kg) 6.7 μg/kg), formula feed (1.6-20 μg/kg) AFB1: corn (3.9-24 μg/kg), soybean meal (1.1-formula feed (0.97-9.1 μg/kg) μg/kg); AFG1 (0.8-10 μg/kg); AFG2 (16 μg/kg); AFM1 Total FBs (2.201 µg/kg); OTA (3.927 µg/kg); Total FUM AFs (0.74-41.27 µg/L); FB1 (3.06 µg/L); ZEN (4.84 µg/L); α-ZEL (4.84 µg/L); β-ZEL (2.40 µg/L); DON (20.40 µg/L); ADONs (2.20 µg/L); HT2 (35.11 µg/L); BEA (8.81 µg/L) AFB1 (3-19 μg/kg); AFG1 (10-11 μg/kg); OTA (4-20 Sample considered as negative (˂2 μg/kg) 4.3 μg/kg T2/HT2: Maize (54,1 µg/kg), wheat (23,0 µg/kg), barley TeA (27.73 µg/kg); TEN (27.53 µg/kg); AME (10.92 Lathyrus plant samples, most contaminated by AOH (694 µg/kg); ELISA LC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS LC-FLD LC-MS/MS LC-MS LC-UV/Vis LC-MS/MS LC-MS/MS ELISA LC-UV ELISA LC-MS/MS ZEN (43.3 μg/kg); DON (322.6 μg/kg); FUMs (323.0 μg/kg) LC-FID/UV (22,6 µg/kg) and oat (87,9 µg/kg) µg/kg); ALT (8.77 µg/kg); ENNs (1.55 µg/kg); Other AFB1 (1.3-88.8 µg/kg); AFB2 (0.60-2.8 µg/kg); AFG1 LC-FID 252.3-9050 μg/kg ELISA AFB1 (0.43 μg/kg); FB1+FB2 (3168.5 μg/kg) ----------mycotoxins are lower than LOD T2: Maize (40,5 µg/kg), wheat (8,7 µg/kg), barley (10,8 LC-MS/MS µg/kg) and oat (23,6 µg/kg); HT2: Maize (77,3 µg/kg), wheat (4,4 µg/kg), barley (8,9 µg/kg) and oat (47,8 µg/kg) (1.8-28.5 µg/kg); AFG2 (2.1-7.5 µg/kg) 30.2 μg/kg LC-UV MON (34.4-576 μg/kg); BEA (1.96-34.8 μg/kg); ENs LC-MS/MS DON (0.121-0.262 μg/kg bw/day); ZEN (0.017-0.050 ELISA AFB1 (30-370 ng/L) and AFM1 (10-430 ng/L) LC-UV μg/kg bw/day) (0.24-9.30 μg/kg); FUS (72.4-12272 μg/kg) AFB1: Maize (33 µg/kg); wheat bran (9.8 µg/kg); peanut LC-UV μg/kg); FB1 (104-591 μg/kg); FB2 (64-5,897 μg/kg) STC (11-18 μg/kg); 3ADON (42-46 μg/kg); Roquefortine C (17-57 μg/kg) AFB1 (3.8 μg/kg); OTA (0.1 μg/kg); FB1 and FB2 (30.3 μg/kg) LC-FLD Omalodu Malts (0.004-20.500 µg/kg); Otombo Malts (0.09-14.900 µg/kg) LC-MS/MS AFB1 not > 0.005 µg/kg; ZEN not > 1.0 mg/kg; T2 not > 0.1000 mg/kg ELISA LC-MS/MS Aspergillus metabolites: Questiomycin A oxaline (18-42 µg/kg); Meleagrin (6-22 µg/kg); Secalonic acid D (39-176 µg/kg); 7-hydroxypestalotin (3-6 µg/kg); Pestalotin (3-6 µg/kg); Roquefortine C (38-137 µg/kg); Flavoglaucin (87.2 µg/kg) Fusarium metabolites: Moniliformin (277-1267 µg/kg); BEA (7-40 µg/kg); Culmorin (1287 µg/kg); 15-hydroxyculmorin (1435 µg/kg); Aurofusarin (10671 µg/kg); Butenolid (1018 µg/kg) LC-MS/MS OTA: White beans (157 μg/kg); green peas (49.4 μg/kg) LC-MS/MS AFs (362.8 μg/kg); OTA (2.14 to 214 μg/kg) LC-FLD cake (47.9 µg/kg); soybean meal (1.7 µg/kg); cottonseed ELISA meal (2.9 µg/kg) AFM1: pasteurized milk (137.4 µg/kg): UHT milk (22.4 FB1 (26.0-50,900 μg/kg); FB2 (12.2-12,100 μg/kg); LC-MS/MS LC-MS/MS µg/kg) AME (1.60-40.9 μg/kg; AOH (16.19-102.38 μg/kg); TeA (10-3634.80 μg/kg) ELISA Raw milk (960 µg/kg); pasteurized milk (850 µg/kg); FB1+FB2 (26.0-21,100 μg/kg); DON (57.3-1737 μg/kg); UHT milk (810 µg/kg) 3-ADON (45.6-104.7 μg/kg); ZEN (55.0-11,300 μg/kg); AFB1 (0.87-124.1 μg/kg); AFB2 (0.31-8.85 μg/kg) ; AFG2 (4.80-5.58 μg/kg); T2 (5.84-13.8 μg/kg); HT2 DON (450.0-4381.5 μg/kg); ZEN (2.3-729.2 μg/kg); LC-FLD Growing Season 2017/2018: DON (9.62 µg/kg); T2 (0.96 (7.08-24.3 μg/kg); T2/HT2 (12.1-26.8 μg/kg) AFB1 (1.3-10.0 μg/kg) 0.917 µg/L ELISA µg/kg); ZEN (0.24 µg/kg) Growing Season 2018/2019: DON 6.21 µg/kg); Other mycotoxins were lower than LOD Period 2012-2015: AFB1 (8-44 μg/kg); AFB2 (2-5 LC-MS/MS Aspergillus metabolites: Kojic acid (108-9586 µg/kg); 3-nitropropionic acid (3-303 µg/kg) Alternaria toxin: Tenuazonic acid (87-230 µg/kg) 2.65 ng/kg bw/day ELISA DON (37.8-87.8 μg/kg); NIV (65.8-163.6 μg/kg); HT2 (140.8-225.5 μg/kg); T2 (36.8-69.3 μg/kg); T2/HT2 (177.5-294.9 μg/kg) LC-MS/MS LC-FLD 5.9 µg/kg LC-MS/MS STC: corn (1.2-6.4 μg/kg); soybean meal (0.63 μg/kg); ELISA	2019 Wielogorska et al., Ariyo et al., 2020 Yapo et al., 2020 Gonçalves et al., 2018 Kos et al., 2018 Sumíková et al., 2017 Apeh et al., 2021 Changwa et al., 2018 Motloung et al., 2018 Savić et al., 2020 Torović et al., 2018 Kiš et al., 2021 Sun et al., 2019 Orina et al., 2020 Torović, 2018b Janić Hajnal et al., Kos et al., 2017 Rokvic et al., 2020 2017 Torović et al., 2017 Xu et al., 2021 Djekic et al., 2019 Jajić et al., 2019 Xiong et al., 2018 Ware et al., 2017 Nafuka et al., 2019 Oleynikova et al., 2020 Kosicki et al., 2020 Janić Hajnal et al., 2020 Kunz et al., 2020 Wajih ul Hassan et al., 2020 Jiang et al., 2020 Tarazona et al., 2020 Patyal et al., 2020a Ma et al., 2018 Patyal et al., 2020b Kos et al., 2020 Radonić et al., 2017 Schöneberg et al., 2018 Shiratori et al., 2017 Nomura et al., 2018
	58					57 59 63

/MS Ul Hassan et al., 2018 Turkey Raw milk, cheese and cheese halva samples AFM1 Raw milk 5.14-78.69 ng/kg); Ezine cheese (19.43-158.3 ng/kg); cheese halva samples (50.25-213.50 ng/kg) ELISA Eker et al., 2019 Growing Season 2016/2017: DON (70.6 µg/kg); T2 (1.64 µg/kg); HT2 (6.59 µg/kg); ZEN (1.82 µg/kg)

Table S3

 S3 Chemical structures of plant phenolic compounds reported in literature between 2010 and 2021 as having potential anti-mycotoxin activity (data listed in Table2). Rut: rutinose; Glu: glucose; Neo: neohesperidoside.

Tableau 1 :

 1 Référencement des articles publiés qui utilisent le script pour le calcul de score de bioactivité publié par[START_REF] Nothias | Bioactivity-Based Molecular Networking for the Discovery of Drug Leads in Natural Product Bioassay-Guided Fractionation[END_REF] Si la méthode originelle est basée sur le fractionnement d'un extrait d'E. dendroides aux propriétés antivirales par HPLC-préparative, les études suivantes ont pu utiliser d'autres méthodes de fractionnement comme des colonnes ouvertes de gel de silice (J. G.Kim et al., 2022) ou par flash chromatographie sur gel de silice également[START_REF] Valente | Identification of compounds responsible for the anthelmintic effects of chicory (Cichorium intybus) by molecular networking and bioguided fractionation[END_REF]. Cette approche a permis aussi de cribler différents extraits obtenus à partir de différents parties d'une plante ou à partir de différentes espèces. C'est notamment le cas pour les travaux de criblage sur les racines et feuilles de différents cultivars de chicorée (Cichorium intybus) pour leurs propriétés contre des nématodes parasitaires de l'homme et du cochon[START_REF] Peña-Espinoza | Anthelmintic and metabolomic analyses of chicory (Cichorium intybus) identify an industrial by-product with potent in vitro antinematodal activity[END_REF] ou contre des protozoaires parasitaires de l'homme[START_REF] Peña-Espinoza | Anthelmintic and metabolomic analyses of chicory (Cichorium intybus) identify an industrial by-product with potent in vitro antinematodal activity[END_REF]. Cette approche a notamment pu mettre en évidence que des lactones sesquiterpéniques présente dans les racines plutôt que les feuilles étaient plus efficaces pour inhiber la mobilité des nématodes du porc[START_REF] Peña-Espinoza | Anthelmintic and metabolomic analyses of chicory (Cichorium intybus) identify an industrial by-product with potent in vitro antinematodal activity[END_REF].

	Matrice étudiée	Fractionnement	Appareillage analytique	Activité étudiée	Familles chimiques mises en évidence	Référence
	Euphorbia dendroides, latex	HPLC-préparative	LC-MS/MS	Activité antivirale sur la réplication du virus du	Esters de diterpènes, diesters de	Nothias et al.,
			(LTQ-XL Orbitrap)	chikungunya	diterpènes	2018
	Cichorium intybus, co-produits de	Non	LC-MS/MS	Activité anthelminthique/vermifuge/anti-	Lactones sesquiterpéniques et dérivés	Peña-Espinoza
	l'industrie (pulpe de racine) et		(QTOF)	parasitaire contre des nématodes (Caenorhabditis		et al., 2020
	feuilles			elegans et Ascaris suum)
	Fucus vesiculous, algue entière	Chromatographie	LC-MS/MS	Activité antibactérienne sur une souche de	Monogalactosyldiacylglycérol,	Buedenbender
		flash et HPLC-	(QTOF)	Staphylococcus aureus résistante à la méticilline	digalactosyldiacylglycérol, phlorotanins	et al., 2020
		préparative
	Pyrenochaetopsis sp.	HPLC-semi-	LC-MS/MS	Activité anticancéreuse sur 5 lignées cellulaires	Dérivés d'acide	Fan et al.,
		préparative	(QTOF)	cancéreuses	décalinoylspirotétramique	2020
	Quatre espèces d'Alnus sp. (Alnus	Non	LC-MS/MS	Activité antidiabétique par la mesure des	Diarylheptanoïdes, flavonoïdes, tanins	Kang et al.,
	japonica, A. hirsuta, A. hirsuta var		(QTOF)	inhibiteurs de l'α-glucosidase		2020
	sibirica, A. firma), écorces, brindilles,
	feuilles et fruits
	Desmarestia antarctica, algue entière Colonne ouverte	LC-MS/MS	Activité antiparasitaire contre trois parasites	Acides gras saturés*, stérols*, acides	dos Santos et
		(gel de silice)	(QTOF)	(Leishmania amazonensis, Neospora caninum et	dicarboxyliques*, benzofuranes*,	al., 2020
				Plasmodium falciparum)	diterpènes*
	Six espèces de levure du genre	HPLC-préparative	LC-MS/MS	Activité anticancéreuse sur 2 lignées cellulaires	Glycolipides (esters de polyols et	Buedenbender
	Rhodotorula spp.		(QTOF)	cancéreuses	d'acides gras)	et al., 2021
	C. intybus, racines et feuilles	Chromatographie	LC-MS/MS	Activité anthelminthique/vermifuge/anti-	Lactones sesquiterpéniques, flavonoïdes	Valente et al.,
		flash	(QTOF)	parasitaire contre des nématodes (A. suum,		2021
				Teladorsagia circumcincta et Cooperia
				oncophora)

l'utilisation de réseaux moléculaires. Nous pouvons notamment citer les premiers travaux de

[START_REF] Messaili | Combination of molecular network and centrifugal partition chromatography fractionation for targeting and identifying Artemisia annua L. antioxidant compounds[END_REF]

, où un extrait d'Artemisia annua a été analysé par LC-MS/MS afin de générer un réseau moléculaire, puis fragmenté par CPC et chaque fraction a été testée pour sa capacité antioxydante selon différents tests DPPH, ABTS, FRAP, CUPRAC et la chélation du Fer III. Les ions contenus dans la fraction F2, avec le potentiel antioxydant le plus élevé, ont été dérépliqués à partir du réseau moléculaire généré grâce à l'analyse de l'extrait d'Artemisia. Ainsi, une des molécules de la F2 a pu être annotée par déréplication comme étant du chrysosplénol D, un flavonoïde méthylé. Plus récemment, une autre étude a porté sur le fractionnement par CPC d'un extrait de feuilles de Siparuna glycycarpa, un arbuste tropical de la famille des Siparunaceae, pour ses propriétés antivirales contre le virus de la grippe A (H1N1)

[START_REF] Leal | Bioassay-Guided Fractionation of Siparuna glycycarpa n-Butanol Extract with Inhibitory Activity against Influenza A(H1N1)pdm09 Virus by Centrifugal Partition Chromatography (CPC)[END_REF]

. L'extrait et les fractions ont été analysés par LC-MS/MS afin de générer un réseau moléculaire dont les noeuds ont été colorés en fonction de leur distribution dans les fractions actives. Comme dans l'approche de Naman et al. décrite précédemment, les auteurs se sont focalisés sur la déréplication des noeuds et ions qui étaient majoritairement présents dans les fractions actives. Ainsi, ils ont pu annoter plusieurs molécules contenues dans les fractions antivirales comme des alcaloïdes aporphiniques et benzylisoquinoléiques, des dihydrochalcones, ainsi que des dérivés de quercétine et de kaempférol. Ces deux études n'ont toutefois pas utilisé des tests de corrélation pour tenter de déterminer les métabolites corrélés aux activités biologiques ciblées.

  . Cette importante biomasse est très peu valorisée industriellement. Elle est généralement utilisée pour amender le sol ou est brulée.Depuis plusieurs décennies, l'axe MIB étudie les métabolites spécialisés d'origine végétale, notamment ceux de la vigne. Parmi ces composés, les stilbènes présentent des intérêts en santé humaine[START_REF] Aja | Screening of natural stilbene oligomers from vitis vinifera for anticancer activity on human hepatocellular carcinoma cells[END_REF][START_REF] Beaumont | Encapsulation of ε -Viniferin into Multi-Lamellar Liposomes : Development of a Rapid , Easy and Cost-Efficient Separation Method to Determine the Encapsulation Efficiency[END_REF] et végétale(Gabaston et al., 2017;[START_REF] Taillis | A grapevine by-product extract enriched in oligomerised stilbenes to control downy mildews: focus on its modes of action towards Plasmopara viticola[END_REF] et leurs effets vis-à-vis d'agents pathogènes de la vigne tels que P. viticola et B. cinerea sont étudiés au laboratoire.

  Les injections pour le dosage ont été réalisées sur une chaîne HPLC Agilent Technologies 1260 Series (Santa Clara, CA, USA) équipée d'un thermostat, d'un échantillonneur automatique, d'une pompe quaternaire et couplée à un détecteur à barrette de diodes (DAD). Les échantillons ont été injectés sur une colonne de silice Kinetex à polarité de phase inversée XB-C18 (100 Å ; 4,6 × 150 mm, 5 µm) de chez Phenomenex (France) maintenue à 30 °C. La phase mobile a été constituée d'eau milliQ acidifiée par l'acide trifluoroacétique (TFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) à 0,025 % (solvant A) et d'acétonitrile de qualité HPLC (solvant B, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). La séparation chromatographique a été réalisée à un débit 1 mL/min selon le gradient d'élution présenté dans le Tableau 3. Propriétés chromatographiques des stilbènes injectés en HPLC-DAD pour le dosage

	Tableau 3 : Gradient d'élution utilisé pour le dosage des stilbènes par HPLC-DAD
	Temps (min) % de solvant B
	0	15
	3	20
	9	20
	16	26
	21	26
	33	38
	36	50
	37	100
	42	100
	43	15
	48	15
	Chacun des 9 composés standards a été injecté séparément à des concentrations allant de 0,25
	Stilbène	Type	λmax	tR	LOQ	Gamme
		d'oligomère	(nm)	(min)	(µg/mL)	étalon (µg/mL)
	E-Resvératrol (1)	Monomère	306	13,7	1	1 ; 2,5 ; 5 ; 8 ; 10 ; 50 et 100
	E-Picéatannol (2)	Monomère	324	7,9	1	1 ; 2,5 ; 5 ; 8 ; 10 ; 50 et 100
	E-ε-Viniférine (3)	Dimère	324	25,5	2,5	2,5 ; 5 ; 10 ; 15 ; 20 ; 50 et 100
	E-ω-Viniférine (4)	Dimère	312	29,1	1	1 ; 2,5 ; 5 ; 8 ; 10 ; 50 et 100
	Pallidol (5)	Dimère	284	11,2	2	2 ; 5 ; 8 ; 12 ; 20 ; 50 et 100
	Ampélopsine A (6)	Dimère	284	7,5	2	2 ; 5 ; 8 ; 12 ; 20 ; 50 et 100
	α-Viniférine (7)	Trimère	284	29,9	4	4 ; 6 ; 8 ; 10 ; 12 ; 50 et 100
	E-Miyabénol C (8)	Trimère	324	27,9	0,25	2 ; 5 ; 8 ; 12 ; 20 ; 50 et 100
	R-Viniférine (9)	Tétramère	324	34,9	10	10 ; 12 ; 15 ; 18 ; 20 ; 50 et 100

à 100 µg/mL dans un mélange méthanol/eau (50/50, v/v) pour déterminer leur temps de rétention (tR), leur longueur d'onde maximale d'absorption et leur limite de quantification (LOQ) (Tableau 4). Le λmax de chaque stilbène permet de déterminer à quelle longueur d'onde doit être réalisé le dosage de la molécule pour avoir une meilleure réponse du composé. Pour réaliser la gamme d'étalonnage, un mélange de ces 9 stilbènes a été préparé à 7 concentrations différentes allant de la LOQ précédemment déterminée jusqu'à 100 µg/mL. Ainsi, une droite d'étalonnage a été réalisée et une équation de cette droite est obtenue sous la forme : y = ax + b, où y est l'aire du pic de la molécule exprimée en mUA et x est la concentration de la molécule en µg/mL. Tableau 4 :

  Gardiner et de 12 jours pour le milieu MS. Les résultats du dosage des mycotoxines dans le milieu Gardiner ne sont pas présentés ici, car la production des TCTB sur ce milieu est beaucoup plus faible que sur milieu MS. En effet, nous avons dosé 20 fois moins de 15ADON dans les cultures sur milieu Gardiner que sur milieu MS additionnés de 0,5 % d'EtOH.

  Nous n'avons pas trouvé dans la bibliographie d'autres extraits issus de bois de vigne avec des activités similaires sur F. graminearum. Mais nous pouvons estimer que ces extraits hydroéthanoliques sont jugés comme très efficaces si nous les comparons avec d'autres matrices végétales riches en composés phénoliques. Parmi les extraits végétaux recensés dans la revue présentée dans l'introduction[START_REF] Ahmed | Naturally occurring phenolic compounds as promising antimycotoxin agents: Where are we now?[END_REF], seulement deux extraits méthanoliques de Spirulina sp. ont présenté des activités antifongiques comparables à des concentrations faibles.

	En effet, 40 mg/L d'extrait de spiruline ont été nécessaires pour inhiber la croissance de la
	souche CML3607 de F. graminearum de 62 % d'après Scaglioni et al. (2019), et seulement
	30 mg/L d'un extrait similaire ont diminué de 50 à 90 % le développement du champignon
	d'après Pagnussatt et al. (2014). Ces données montrent donc le fort potentiel antifongique
	d'extraits issus de co-produits de la vigne.
	Les activités antifongiques les plus élevés ont été mesurés à 125 mg/L. Nous pouvons retrouver
	dans le Tableau 7, les pourcentages d'inhibition de la croissance fongique à 5 jours de culture
	pour les différents extraits testés à cette concentration. Les extraits avec les CI50 les plus faibles
	sont également ceux qui ont les pourcentages d'inhibition les plus élevés à 125 mg/L. C'est le
	cas des 4 extraits les plus efficaces, avec des pourcentages d'inhibition supérieurs à 90 %, tels
	que les ceps de Sauvignon blanc (91 %), les racines de Tannat (96 %), de Cabernet sauvignon
		Merlot	Sauvignon blanc	Cabernet sauvignon	Tannat Artaban
	Sarment -104 %*	36 %*	-17 %	71 %*	-39 %
	Cep	83 %*	91 %*	46 %*	80 %*	n/a
	Racine	100 %*	82 %*	98 %*	96 %*	n/a
	Nous avons pu observer une distribution de l'activité au sein des parties d'un pied de vigne.
	Sauvignon blanc En effet, les extraits avec les activités antifongique les plus élevées correspondent aux extraits Cabernet sauvignon Tannat Artaban issus plutôt des parties basses de la vigne, que ce soit les ceps ou les racines. Les quatre extraits
	Sarment racinaires testés à 125 mg/L ont inhibé d'au moins 82 % la croissance du champignon. Dans -> 125 -89 -
	Cep une moindre mesure, les extraits de ceps ont présenté des activités supérieures à 80 %, excepté 66 25 < CI50 < 50 > 125 73 n/a
	Racine pour l'extrait de Cabernet sauvignon (46 %). A l'inverse, les extraits de sarments de vigne ne 11 50 < CI50 < 100 34 10 < CI50 < 25 n/a
	font pas partie des extraits les plus actifs. En effet, seulement deux des cinq extraits de sarments

(98 %) et de Merlot (100 %). Nous avons pu noter un effet graduel de l'activité en lien avec la concentration de l'extrait, à partir de 25 mg/L et jusqu'à 125 mg/L. En effet, plus un extrait est concentré, plus il est antifongique. Toutefois, il est intéressant de noter qu'aucun des extraits n'a présenté d'activité antifongique à des concentrations testées inférieures ou égales à 10 mg/L. Ces résultats nous ont permis de classer les 13 extraits hydro-éthanoliques en deux groupes : celui des extraits antifongiques (10 extraits), et celui des extraits inefficaces constitués des extraits de sarments de Merlot, Cabernet sauvignon et d'Artaban. inhibent la croissance du champignon, à savoir celui de Sauvignon blanc (36 %) et de Tannat (71 %). Les trois autres extraits se sont avérés inefficaces pour contrôler le développement mycélien, voire même fortement inducteurs, notamment l'extrait de sarment de Merlot.

  pilote, en passant notamment de cellules d'un volume de 100 mL à des cellules de 5 L pour l'extraction de composés phénoliques issus de feuilles de mangue[START_REF] Fernández-Ponce | Pilot-plant scale extraction of phenolic compounds from mango leaves using different green techniques: Kinetic and scale up study[END_REF].

	Au sujet de l'utilisation de l'extraction à l'eau sous-critique, il est nécessaire de s'intéresser à
	la dimension économique de cette méthode en vue d'une potentielle utilisation à l'échelle
	industrielle. Une étude techno-économique comparative entre des extractions de composés
	phénoliques à partir de marc de raisin par des approches à l'eau sous-critique, au CO2
	supercritique et conventionnelle par des solvants organiques a été réalisée (Todd & Baroutian,
	2017). L'étude est basée sur des simulations de processus où quatre thématiques ont été
	comparées pour définir si ces procédés d'extractions étaient durables, à savoir l'aspect
	énergétique, économique, l'efficacité d'extraction et les impacts environnementaux. Les
	auteurs ont pu montrer que les extraits SWE ont un cout de production semblable à une
	extraction conventionnelle (éthanol/eau 75/25), mais nécessitent beaucoup d'énergie pour
	chauffer et maintenir le solvant sous-pression, ce qui a pour conséquence d'annuler les
	avantages environnementaux de cette technique par rapport à une technique conventionnelle.

Si nous prenons du recul sur le but du projet ANR, nous devons également prendre en compte l'aspect écologique et économique de l'obtention des extraits. L'extraction par des méthodes de SWE ou par ASE utilise le même équipement au laboratoire, un appareil automatisé d'extraction accélérée par solvants (ASE 350), par conséquent le coup machine est identique. Des travaux existants ont montré le passage possible des extractions de l'échelle laboratoire à l'échelle En outre, la comparaison des effets antimycotoxine des extraits hydro-éthanoliques et SWE de racine de Merlot révèle que pour une activité semblable (84 % et 93 % d'inhibition, respectivement), 1,6 fois plus de matière première est nécessaire pour l'obtention de la quantité d'extrait SWE. Ce calcul prend en compte le rendement d'extraction et la concentration d'extrait active. De plus, aux concentrations testées, l'extrait hydro-éthanolique est antifongique (CI50 = 11 mg/L), tandis que l'extrait SWE est inducteur de croissance. Ces différents critères ont donc motivé notre choix de se focaliser pour la suite des travaux sur les extraits hydro-éthanoliques.

  Tableau 14 : Tableau de déréplication des métabolites discriminants des extraits antifongiques vis-à-vis de F. graminearum

	ID	tR (min)	pcorr	p	Identification putative (Bibliographie/SIRIUS)	Formule brute	Adduits	m/z (-)-ESI-MS	m/z (-)-ESI-MS 2 (Intensité relative)	Degré d'erreur (Δppm)	Niveau de confiance a	Famille chimique	Standard injecté
		9,31	0,8575	0,1068	Cyphostemmine B	C28H22O6	[M-H]-	453,1347	359,0926 (100); 453,1346 (78,6); 289,0872 (47,9); 93,0332 (16,4); 69,1960 (10); 273,0924 (7,9); 317,0817 (7,9); 343,0970 (7,9); 291,1027 (7,1); 265,0508 (5,7); 315,1028 (1,9)	3,2	1	Stilbène	Oui
									905,2606 (100); 811,2191 (41,4); 359,0926 (19,7); 451,1189 (15,5); 357,0768 (14,1);
		10,40	0,8508	0,1180	Tétramère de stilbène	C56H42O12	[M-H]-	905,2604	799,2188 (11,7); 345,0769 (10); 347,0925 (7,2); 439,1193 (6,9); 333,0770 (6,6); 241,0502	1,3	3	Stilbène	Non
									(5,5); 329,0821 (5,2); 317,0818 (4,8)
									585,1561 (100); 491,1140 (73,8); 384,0639 (44,9); 385,0719 (24,5); 679,1980 (19,7);
		9,74	0,8398	0,0534	Vaticanol G	C42H32O9	[M-H]-	679,1977	197,0601 (16,1); 93,0331 (12,2); 356,0691 (13,6); 479,1134 (7,8); 397,0712 (5,5);	2,1	2	Stilbène	Non
									449,10,36 (4)
		7,04	0,8153	0,0665	Ampélopsine A	C28H22O7	[M-H+HCOOH]-	515,1348	68,9543 (100); 55,2114 (5,3); 424,7327 (5,3); 186,5193 (5,2); 73,5322 (5); 214,8050 (4,5); 312,2195 (4,5); 55,2033 (4,5); 121,5886 (4,5); 221,7918 (4)	2,2	1	Stilbène	Oui
		7,04	0,8087	0,2635	Ampélopsine A	C28H22O7	[M-H]-	469,1293	451,1190 (100); 363,0875 (23,5); 375,0877 (13,3); 93,0330 (9,5); 345,0762 (8,1); 357,0766 (7,1); 423,1218 (7); 469,1276 (5,7);317,0808 (5,2)	2,3	1	Stilbène	Oui
		7,04	0,8013	0,0737	Ampélopsine A (fragment source)	C28H22O7	[M-H-H2O]-	451,1187	451,1189 (100); 423,1240 (10); 357,0768 (8,6); 93,0331 (7,9); 345,07628 (7,9); 317,0818 (7,1); 316,0739 (5,9); 344,0689 (4,3); 381,1140 (4,3); 69,0378 (4); 409,1075 (3,8)	2,5	1	Stilbène	Oui
									903,2446 (100); 357,0769 (83); 265,0508(60,6); 809,2057 (52,9); 715,1641 (22,6);
		10,22	0,7507	0,0690	Miyabénol B	C56H40O12	[M-H]-	903,2453	69,0842 (19,5); 451,1195 (18,9); 449,1031 (18,5); 343,0612 (17,9); 93,0332 (15,1);	1,8	2	Stilbène	Non
									315,0669 (8,2); 329,0826 (5,5); 609,1189 (5,3)
		10,38	0,7219	0,0792	Tétramère de stilbène	C56H42O12	[M-H+HCOOH]-	951,2661	68,9425 (100); 754,8666 (6,4); 312,8869 (5,3); 772,9189 (4,5); 80,338 (4,4); 79,3936 (4,3); 124,1712 (4,3); 94,3739 (4,1); 219,8999 (4,1); 81,1333 (3,9); 76,3712 (3,7)	1,5	3	Stilbène	Non
		10,75	0,7185	0,0741	E-cis-trans-miyabénol C	C42H32O9	[M-H]-	679,1979	679,1974 (100); 585,1558 (20,1); 345,0769 (9,1); 573,1549 (7,3); 451,1232 (7,2); 93,0332 (6,1); 227,0711 (4,2)	2,4	1	Stilbène	Oui
		7,04	0,6855	0,0611	Ampélopsine A	C28H22O7	[2M-H]-	939,2662	451,1184 (100); 469,1289 (32,4); 69,0141 (20,2); 363,0881 (12,6); 375,0877 (9,9); 423,1240 (5,6); 345,0881 (5,4); 357,0767 (5,1)	1,5	1	Stilbène	Oui
		10,22	0,6854	0,0569	Ampélopsine H	C56H42O12	[M-H+HCOOH]-	951,2661	69,1917 (100); 358,0849 (29,8); 265,0508 (28,5); 905,2657 (14,3); 97,1269 (11,3); 219,1194 (9,9); 197,0603 (9,7), 8112198 (5,2); 545,1605 (4,3)	1,4	1	Stilbène	Oui
									905,2606 (100); 811,2197 (40,9); 265,0508 (40,0); 358,0842 (38,3); 359,0926 (38,3);
		10,00	0,6836	0,2041	Isohopéaphénol	C56H42O12	[M-H]-	905,2609	357,0757 (37,0); 197,0600 (30,4); 717,1777 (22,2); 345,0765 (20); 451,1179 (19,6);	1,8	1	Stilbène	Oui
									93,0331 (12,6); 706,1827 (12,2); 264,0430 (11,7); 329,0823 (9,1)
		8,57	0,6829	0,0679	Dimère de stilbène	C28H22O6	[M-H]-	453,1348	265,0506 (100); 359,0925 (95,2); 93,0332 (35,9); 453,1347 (28); 317,0813 (5,0); 221,0606 (4,8); 289,0872 (4,7)	3,3	3	Stilbène	Non
		10,54	0,6795	0,0670	E-cis-cis-miyabénol C	C42H32O9	[M-H]-	679,1977	679,1978 (100); 585,1559 (16,1); 345,0768 (14); 451,1197 (10,7); 573,1558 (16,1); 227,0712 (6,8)	2,1	1	Stilbène	Oui

Tableau 15 :

 15 Tableau de déréplication des métabolites discriminants des extraits inefficaces vis-à-vis de F. graminearum

	ID	tR (min)	pcorr	p	Identification putative (Bibliographie/SIRIUS/ GNPS)	Formule brute	Adduits	m/z (-)-ESI-MS	m/z (-)-ESI-MS 2 (Intensité relative)	Degré d'erreur (Δppm)	Niveau de confiance	Famille chimique	Standard injecté
	2905	4,44	-0,9573	-0,1506	Epicatéchine		C15H14O6	[M-H]-	289,0719	289,0719-245,0816-109,0281-125,0262-123,0440-203,0707-205,0500-151,0389-137,0233-179,0343-221,0817	3,3		Flavan-3-ol	Oui
	4298	6,39	-0,9450	-0,0517	Astilbine		C21H22O11	[M-H]-	449,1095	151,0024-285,0401-107,0123-178,9979-125,0230-303,0505-449,1092	2,9		Glycoside flavanonol	de	Non
	304	0,66	-0,8776	-0,0808	Raffinose		C18H32O16	[M+Cl-H]-	539,1387	503,1618-539,1387-179,0552-89,0230-221,0660-101,0230-71,0124-161,0444-113,0231-59,0124	2,5		Triholoside	Non
	567	0,68	-0,8772	-0,0541	Acide quinique		C7H12O6	[M-H]-	191,0554	191,0552-85,0280-127,0388-93,0331	1,8		Acide phénolique	Non
	2127	3,97	-0,8601	-0,2177	Catéchine		C15H14O6	[M-H]-	289,0719	289,0717-245,0815-109,0281-125,0231-123,0438-203,0707-205,0499-137,0232-151,0388-179,0341-221,0814	3,2		Flavan-3-ol	Oui
	299	0,66	-0,8530	-0,0526	Inconnu		C5H10O6	[M-H]-	165,0395	75,0072-165,0393-87,0072-105,0179-129,0181-147,0287	0,7
					Acide	9,12,13-
	7634	10,28	-0,8504	-0,0759	trihydroxyoctadeca-	C18H32O5	[M-H]-	327,2177	327,2177-211,1332-229,1439-171,1018-183,1383	3,4		Acide gras	Non
					10,15-diénoique
	14527	14,05	-0,8473	-0,0800	Acide gras		C18H32O3	[M-H]-	295,2280	295,2277-277,2171-195,1382-171,1016-113,0958	4,4		Acide gras	Non
	2219	3,98	-0,8454	-0,2138	Catéchine		C15H14O6	[M-H]-	289,0719	289,0717-245,0815-109,0281-125,0231-123,0438-203,0707-205,0499-137,0232-151,0388-179,0341-221,0814	3,2		Flavan-3-ol	Oui
					Acide	9,12,13-
	7887	10,29	-0,8406	-0,0764	trihydroxyoctadeca-	C18H32O5	[M-H]-	327,2177	327,2177-211,1332-229,1439-171,1018-183,1383	3,5		Acide gras	Non
					10,15-diénoique
	2355	4,03	-0,8283	-0,0628	Procyanidine C		C45H38O18	[M-H]-	865,1993	125,0231-287,0561-161,0233-407,0767-451,1041-243,0299-289,0715-577,1359-695,1407-865,1942	2,1		Trimère flavan-3-ol	de	Non
	2418	4,03	-0,8163	-0,0611	Procyanidine C		C45H38O18	[M-H]-	865,1993	125,0231-287,0561-161,0233-407,0767-451,1041-243,0299-289,0715-577,1359-695,1407-865,1942	2,2		Trimère flavan-3-ol	de	Non
	1894	3,68	-0,8049	-0,0949	Procyanidine B1		C30H26O12	[M-H]-	577,1356	125,0231-289,0718-407,0771-161,0233-425,0874-245,0813-577,1363	2,7		Dimère flavan-3-ol	de	Oui
	8889	10,62	-0,7818	-0,1216	Acide trihydroxylé gras	C18:1	C18H34O5	[M-H]-	329,2335	329,2331-211,1331-229,1438-99,0801-171,1016-183,1380-193,1226	3,4		Acide gras à longue chaine	Non
	2069	3,86	-0,7266	-0,0670	Procyanidine B		C30H26O12	[M-H]-	577,1357	125,0231-289,0717-407,0770-161,0233-245,0813-425,0873-577,1359	2,9		Dimère flavan-3-ol	de	Non
	2207	3,86	-0,7025	-0,0589	Procyanidine B		C30H26O12	[M-H]-	577,1357	125,0231-289,0717-407,0770-161,0233-245,0813-425,0873-577,1359	2,8		Dimère flavan-3-ol	de	Non

Chapitre III : Etude phytochimique d'un extrait de racine de porte- greffe Gravesac aux propriétés antifongique et antimycotoxine 1 Introduction

  Les analyses métabolomiques réalisées en parallèle du criblage des extraits issus de différents cépages et parties de vigne nous ont permis d'avoir un aperçu des composés potentiellement antifongiques contenus dans les co-produits de la vigne. Toutefois, ces analyses se sont révélées moins efficaces pour identifier des déterminants moléculaires impliqués dans l'activité antimycotoxine. Afin de caractériser de manière plus fine quels peuvent être les métabolites responsables des deux activités ciblées, il a été choisi de se focaliser sur un seul extrait pour la suite des expérimentations.Pour cela, l'extrait de racine de Tannat (porte-greffe Gravesac) a été sélectionné pour plusieurs raisons, tout d'abord cet extrait était l'un des plus intéressants en termes d'activité lors du criblage. En effet, avec 96 % d'inhibition de la croissance fongique à 125 mg/L et 98 % d'inhibition de la production de mycotoxine à 25 mg/L, cet extrait s'est avéré être le 3 ème extrait le plus antifongique, et le 1 er en termes d'activité antimycotoxine. Il est ainsi apparu comme un très bon candidat pour isoler des molécules bioactives et valider leurs effets sur le champignon. De plus, nous disposons de suffisamment de matériel végétal disponible pour réaliser des extractions en plus grande quantité.Ce chapitre présente l'extraction suivi du fractionnement bioguidé d'un extrait acétate d'éthyle de racine de Tannat. Les activités antifongique et antimycotoxine ont été évaluées pour chaque fraction, de plus leur composition chimique a été analysée par UHPLC-HRMS/MS. Ensuite, une approche métabolomique similaire à celle réalisée lors du chapitre II a été appliquée pour conforter ou invalider les hypothèses structurales émises dans le chapitre II et cribler plus facilement les métabolites d'intérêt afin de les isoler.

  L'Axe MIB dispose d'un appareil de CPC FCPC 200 de la société Kromaton® (Angers, France) avec un volume de colonne de 200 mL. Il s'agit d'un appareil dont la colonne est un rotor constitué de 20 disques de partition circulaires, contenant au total 1320 cellules de 130 μL chacune. La capacité totale de la colonne est de 204 mL. Cet appareil est équipé d'une pompe isocratique binaire (ECOM, IOTA S100, Tchéquie). L'injection de l'échantillon dans le système est assurée par une vanne d'injection haute pression (Rhéodyne, 3725I-038), équipée d'une boucle d'injection de 20 mL. A la sortie de la colonne, un détecteur UV-Visible multilongueur d'onde (ECOM, Flash 06 DAD, Tchéquie) est utilisé.

  Afin de réaliser la séparation de l'extrait, la CPC est utilisée en mode élution-extrusion. La phase supérieure (composée essentiellement de n-heptane et d'acétate d'éthyle) constitue la phase stationnaire et la phase inférieure (composée essentiellement d'éthanol et d'eau) constitue la phase mobile. Dans un premier temps, la colonne est remplie à l'aide de la phase stationnaire par pompage de 600 mL à un débit de 10 mL/min. La colonne est ensuite mise en rotation (1000 rpm) et équilibrée en pompant la phase mobile à un débit de 3 mL/ min au travers de la phase stationnaire. Dans ces conditions, le volume mort est de 50 mL. L'élution est effectuée en mode descendant.

	. Le nouveau système est un mélange
	d'heptane/acétate d'éthyle/éthanol/eau dans les proportions 4/7/4/7 (v/v/v/v). On remplit une
	ampoule à décanter de 4 L avec : 727 mL de n-heptane ; 1272 mL d'acétate d'éthyle ; 727 mL
	d'éthanol et 1272 mL d'eau milliQ. Après agitation manuelle, les deux phases obtenues
	(environ 2 L de chaque phase) sont séparées par décantation puis dégazées une heure dans un
	bain à ultrasons.

3 Caractérisation des fractions de CPC L

  'objectif du fractionnement par CPC est d'obtenir des fractions différentes à partir d'un extrait complexe afin de pouvoir tester ces fractions sur les cultures de F. graminearum. Nous nous sommes fixés plusieurs contraintes pour le fractionnement par CPC. Tout d'abord, nous souhaitions récupérer des quantités suffisantes de fractions pour pouvoir réaliser les essais en milieu liquide. Toutefois, nous souhaitions obtenir le plus de fractions possibles pour pouvoir obtenir des extraits avec des compositions différentes et donc potentiellement des activités différentes, cela nous permet également d'avoir suffisamment d'individus pour les analyses statistiques.

  Tableau 18 : Quantité récupérée et rendement massique des fractions d'extrait acétate d'éthyle de racine de Tannat après séparation sur CPC

	Fractions	Masse sèche (mg)	Rendement massique (%)
	F1	120,3	12,0
	F2	180,1	17,9
	F3	59,3	5,9
	F4	34,2	3,4
	F5	138,6	13,8
	F6	121,1	12
	F7	19,2	1,9
	Extrusion	100,1	10,0

  Tableau 19 : Tableau de déréplication des métabolites discriminants des fractions CPC de racine de Tannat antifongiques vis-à-vis de F. graminearum Parmi ces composés, nous retrouvons à nouveau la vitisine B (r-viniférine). Ce tétramère de stilbène présent majoritairement dans les racines était déjà apparu comme un métabolite discriminant lors du criblage des extraits antimycotoxine, et le fractionnement par CPC tend à confirmer cette observation. En effet, c'est l'ion situé la plus à droite sur la représentation en S, ce qui témoigne du caractère discriminant de cet ion dans les fractions antifongiques. Deux autres métabolites pouvant correspondre à des tétramères de stilbènes de formule brute C56H42O12 semble être discriminants. L'un d'entre eux pourrait correspondre à la vitisine C d'après son spectre de MS 2 et le fait que ce composé a déjà été dosé dans des extraits obtenus à partir du même lot de racine de porte-greffe[START_REF] Gabaston | Wood and roots of major grapevine cultivars and rootstocks: A comparative analysis of stilbenes by UHPLC-DAD-MS/MS and NMR[END_REF] Néanmoins, l'identification de ce composé dans la fraction n'a pas pu être confirmé par un standard. A notre connaissance, aucuns travaux ne font référence directement à l'activité antifongique de la vitisine C. Toutefois, nous pouvons noter les travauxde Labois et al. (2020) qui se sont intéressés aux marqueurs métaboliques de réponse de deux variétés de vigne à une attaque par Neofusicoccum parvum, un des agents pathogènes responsables de maladies du bois de la vigne. Ils ont notamment pu montrer l'accumulation de vitisine C dans le bois de vigne après contamination par le champignon seulement dans la variété de vigne résistante à la maladie (Vitis vinifera subsp. sylvestris). Ces travaux laissent suggérer que ce métabolite qui a une réponse face à des attaques fongiques chez la vigne, pourrait être potentiellement efficace pour limiter le développement fongique d'autres agents pathogènes.

	ID	tR (min)	pcorr	p	Identification putative (Bibliographie/SIRIUS)	Formule brute	Adduits	m/z (-)-ESI-MS	m/z (-)-ESI-MS2 (Intensité relative)	Degré d'erreur (Δppm)	Niveau de confiance	Famille chimique	Standard injecté
	7236	10,94	0,988	0,078	Vitisine B	C54 13 C2H42O12	[M-H]-	908,2721		-1,8	1	Stilbène	Oui
	7607	10,96	0,987	0,078	Vitisine B	C54 13 C2H42O12	[M-H]-	908,2721		-1,8	1	Stilbène	Oui
	7606	10,96	0,987	0,348	Vitisine B	C56H42O12	[M-H]-	905,2622		3,2	1	Stilbène	Oui
									905,2618 (100); 359,0930 (29,9); 799,2194 (27,6); 347,0929
	7245	10,94	0,985	0,349	Vitisine B	C56H42O12	[M-H]-	905,2622	(16,1); 333,0776 (13,8); 345,0772 (10,6); 93,0333 (7,5); 811,2197	3,2	1	Stilbène	Oui
									(7,4); 439,1198 (7,2); 545,1615 (6,4)
	6020	10,63	0,984	0,055	Trimère de stilbène type vitisinol F	C41H34O8	[M-H]-	653,2197	653,2196 (100); 93,0333 (12,1); 345,0765 (12,1); 159,0806 (11,4); 547,1769 (10,7); 119,0491 (10); 559,1777 (8,6); 317,0822 (6,8)	4,2	2	Stilbène	Non
	8068	11,24	0,954	0,057	Tétramère de stilbène/Vitisine C	C56H42O12	[M-H]-	905,2601	905,2618 (100); 359,0928 (24,7); 799,2211 (22,4); 69,1469 (15,3); 545,1636 (6,5); 93,0333 (5,8); 811,224 (5,6) 347,0927 (12,9); 333,0767 (10); 345,0776 (9,4); 451,1197 (7,6);	0,9	2	Stilbène	Non
									906,2654 (100); 812,2234 (33); 453,1352 (17,4); 359,0923 (13,3);
	6633	10,74	0,893	0,060	Tétramère de stilbène	C55 13 CH42O12	[M-H]-	906,2661	347,0929 (13,3); 357,0773 (11,5); 358,0833 (10,7); 718,1818	3,9	2	Stilbène	Non
									(10,7); 265,0509 (8,5); 451,1195 (8,5)
	6456	10,69	0,857	0,050	Trimère de stilbène type vitisinol F	C41H34O8	[M-H]-	653,2198	653,2196 (100); 93,0333 (12,1); 345,0765 (12,1); 159,0806 (11,4); 547,1769 (10,7); 119,0491 (10); 559,1777 (8,6); 317,0822 (6,8)	4,3	2	Stilbène	Non
									679,1990 (100); 585,1568 (30,8); 93,0333 (9,5); 345,0769 (3,8);
	6670	10,76	0,844	0,133	Trimère de stilbène	C42H32O9	[M-H]-	679,1988	225,0553 (3,6); 451,1193 (2,8); 227,0710 (2,4); 573,1557 (2,2);	3,7	2	Stilbène	Non
									661,1884 (1,8)
	721	3,68	0,841	0,111	Isomère d'acide hydroxybenzoïque	C7H6O3	[M-H]-	137,0234	137,0234 (100); 108,0204 (3,4); 109,0283 (3,2); 81,0333 (2,3); 93,0332 (1,6); 119,0127 (1,1)	0,8	2	Acide phénolique	Non
	4376	10,15	0,809	0,054	Dimère de stilbène	C27 13 CH22O6	[M-H]-	454,1387	454,1389 (100); 360,0970 (11,9); 93,0334 (8,6), 348,0968 (8,6); 436,01288 (6,9); 247,0906 (6,1); 225,0547 (5,8); 370,1162 (4,7)	4,5	2	Stilbène	Non
									679,1990 (100); 585,1568 (30,8); 93,0333 (9,5); 345,0769 (3,8);
	6383	10,70	0,728	0,074	E-cis-trans-miyabénol C	C42H32O9	[M-H]-	679,1987	225,0553 (3,8); 491,119 (3,6); 451,1193 (2,8); 479,1135 (2,8);	3,6	1	Stilbène	Oui
									357,0790 (2,5)
	4688	10,22	0,722	0,083	Vitisinol C/carasiphénol A	C27H24O5	[M-H]-	427,1557	427,1557 (100); 119,0491 (47,6); 265,0874 (28,6); 307,0978 (7,6); 333,1135 (4,5) (23,3); 145,0286 (12,4); 161,0599 (9); 93,0333 (8,6); 369,1140	4,0	2	Stilbène	Non
	4843	10,22	0,717	0,082	Vitisinol C/carasiphénol A	C27H24O5	[M-H]-	427,1557	427,1557 (100); 119,0491 (89,5); 265,0875 (53,9); 145,0285 93,0333 (13,2); 321,1137 (9,2); 333,1135 (7,4) (38,2); 161,0599 (35,5); 307,0978 (32,9); 159,0443 (15,8);	4,0	2	Stilbène	Non
									453,1353 (100); 225,0555 (26,3); 347,0930 (25,8); 359,0930 (20);
	4477	10,18	0,666	0,218	Dimère de stilbène	C28H22O6	[M-H]-	453,1352	93,0333 (18,9); 119,0491 (13,7); 369,1139 (12,1); 411,1247	4,2	2	Stilbène	Non
									(12,1); 253,0508 (11,6)
									453,1353 (100); 359,0931 (15,9); 93,0333 (10,6); 347,0930 (8,8);
	4989	10,24	0,644	0,236	E-ε-viniférine	C28H22O6	[M-H]-	453,1352	225,0557 (7,6); 411,1245 (5,8); 343,0982 (5,7); 369,1135 (4,8);	4,4	1	Stilbène	Oui
									435,1248 (4,8); 119,0491 (4,5)
	pcorr : valeur de corrélation de la variable ; p : valeur de covariance de la variable ; a: selon les niveaux d'annotation de Viant et al. (2017), métabolite identifié
	par un standard (1), métabolite putativement annoté à l'aide de bases de données spectrales (2), famille du métabolite putativement caractérisée à l'aide de bases
	de données spectrales (3), inconnu (4). En rouge, les doublons de métabolites dérépliqués plusieurs fois (adduits, fragment source, problème de déconvolution)

Trois trimères semblent également être des marqueurs discriminants dans les fractions les plus efficaces. Le E-cis-trans-miyabénol C a pu être identifié à l'aide d'un standard. Les autres trimères correspondent à des métabolites de formule chimique C42H32O9, comme le E-trans-cis-miyabénol C, ou de formule C41H34O8 (m/z 653,2197). A notre connaissance, un seul stilbène est référencé avec une formule chimique similaire, à savoir le vitisinol F isolé dans Vitis thunbergii

[START_REF] Chiou | Oligostilbenes from the roots of Vitis thunbergii[END_REF]

. Au sujet du E-trans-cis -miyabénol C, il faisait également partie des métabolites criblés précédemment dans les extraits antifongiques, et nous avons déjà fait mention de son efficacité face à P. viticola. Nous pouvons noter que des observations similaires à celles sur la vitisine C ont été faites sur le E-trans-cis-miyabénol C dans les travaux

de Labois et al. (2020)

.

  Tableau 20 : Tableau de déréplication des métabolites corrélés positivement à l'activité antifongique dans les fractions CPC de racine de Tannat vis-à-vis de F. graminearum

							Chapitre III : Etude phytochimique d'un extrait aux propriétés antifongique et antimycotoxine
										905,2618 (100); 359,0928 (24,7); 799,2211 (224); 69,1469 (15,3);
	8068	2	11,24	0,853	3,20E-06	Tétramère de stilbène	C56H42O12	[M-H]-	905,2601	347,0927 (12,9); 333,0767 (10); 451,1197 (7,6); 93,0333 (5,8);	0,9	3	Stilbène	Non
										317,0828 (5,8); 811,2224 (5,6); 225,0554 (5)
										905,2603 (100); 69,7026 (40,9); 359,0927 (30,9); 799,2153 (15,5);
	ID 8578	Cluster Non	tR (min) 12,00	r 0,852	p-value 3,27E-06	Identification putative (Bibliographie/SIRIUS) Tétramère de stilbène	Formule brute C56H42O12	Adduits [M-H]-	m/z (-)-ESI-MS 905,2626	m/z (-)-ESI-MS 2 (Intensité relative) 93,0332 (8,3) 333,0774 (13,6); 347,0934 (13,6); 811,2148 (12,7); 451,1176 (8,6);	Degré d'erreur (Δppm) 3,7	Niveau de confiance a 3	Famille chimique Stilbène	injecté Standard Non
		2 10 r : coefficient de corrélation de Pearson; p-value : valeur p-value de la correction de Bonferonni ; a : selon les niveaux d'annotation de Viant et al. (2017), (1) 11,33 0,967 1,63E-12 Pentamère de stilbène C70H50O15 [M-H]-1129,3097 1129,3096 (100); 583,140 (30,5); 1023,2672 (20,5); 333,0772 (6,5); 2,0 2 Stilbène 439,1196 (5,5); 489,0977 (4,7); 93,0333 (4,6); 545,1614 (4) 11,05 0,964 1,90E-12 693,1781 (100); 675,1677 (12,6); 345,0765 (8,1); 684,1695 (7,4); Trimère de stilbène/ Grandiphénol C/D C42H30O10 [M-H]-693,1773 344,0687 (7); 646,1566 (6,3); 333,0769 (5,2); 359,0923 (5,2); 225,0558 (4,8); 361,0724 (4,8); 121,0824 (4,1) 2,6 2 Stilbène métabolite identifié par un standard, (2) métabolite putativement annoté à l'aide de bases de données spectrales, (3) famille du métabolite putativement	Non Non
		269,0825 (100); 241,0872 (55,5); 69,0236 (40,9); 405,1347 (33,6); caractérisée à l'aide de bases de données spectrales, (4) inconnu. En rouge, les doublons de métabolites dérépliqués plusieurs fois (adduits, fragment source,
		5 problème de déconvolution) 10,32 0,952 4,25E-11	Isoflavonoïde	C24H22O6	[M-H]-	405,1350	239,0710 (23,6); 272,0689 (9); 97,1309 (8,5); 69,0195 (7,4); 375,1253 (7,3)	4,2	3	Isoflavonoïde	Non
										405,1351 (100); 375,0880 (64,7); 390,1117 (52,9); 331,0984 (17,1);
		Non	10,31	0,951	4,59E-11	Isoflavonoïde	C24H2O6	[M-H]-	405,1351	347,0928 (8,5); 275,1084 (8,2); 319,0981 (5,6); 303,1029 (5);	4,5	3	Isoflavonoïde	Non
										329,0831 (4,4); 357,0761 (4,4); 389,1041 (2,9)
										679,1990 (100); 345,0775 (24,1); 281,0457 (22,1); 69,5608 (14,8);
		8	9,95	0,945	1,65E-10	Inconnu	C43H36O10	[M-H]-	711,2258	573,1568 (14,1); 93,0334 (13,4); 263,1076 (13,1); 333,0767 (12,4); 387,0880 (11); 635,2083 (9); 451,0379 (8,6); 585,1577 (7,9);	4,7	4	Inconnu
										227,0711 (7,6); 545,1629 (6,9); 289,0875 (5,5)
										165,0549 (100); 150,0312 (93,8); 525,1984 (75); 163,0392 (59,4);
		1	11,33	0,929	2,33E-09	Arctignane D/E/G/H	C40H44O13	[M-H]-	731,2729	145,0284 (52,5); 119,0490 (48,7); 731,2724 (40); 195,0658 (23,7);	4,2	2	Néolignane	Non
										683,2494 (8,1)
										693,1776 (100); 69,0841 (55); 675,1684 (18,3); 243,0658 (17,5);
		Non	11,01	0,888	3,32E-07	Trimère de stilbène/ Grandiphénol C/D	C42H30O10	[M-H]-	693,1770	93,0330 (10); 344,0687 (10); 345,0772 (10); 241,0512 (9,2); 343,0610 (9,2); 239,0710 (6,1); 449,1042 (5,6); 225,0572 (4,9);	2,2	2	Stilbène	Non
										69,0808 (4,3)
		Non	10,15	0,881	4,97E-07	Inconnu	C27H22O6	[M-H]-	441,1355	441,1353 (100); 333,0772 (23,6); 383,0935 (16); 68,9113 (13,8); 279,0671 (8,6); 305,0815 (8,3); 119,0490 (6,9); 291,0671 (6,4); 335,0926 (5,7); 265,0874 (4,5)	0,9	3	Hydroxyflavonoïd e	Non
										677,1832 (100); 583,1411 (22,5); 571,1407 (7,7); 541,1301 (4,7);
		6	11,32	0,878	6,38E-07	Trimère de stilbène	C42H30O9	[M-H]-	677,1833	624,1609 (4,7); 477,0984 (4,1); 570,1321 (3,9); 630,16,16 (3,8);	3,9	2	Stilbène	Non
										225,0553 (3,2);
										653,2199 (100); 93,0333 (13,3); 345,0778 (11,1); 159,0807 (10,9);
		4	9,71	0,876	7,21E-07	Inconnu	C41H34O8	[M-H]-	653,2202	69,3840 (10,4); 547,1762 (10); 559,1776 (8) 119,0490 (7,6);	4,9	3	Phenylpropanoïde	Non
										317,0825 (7,6)
										145,0285 (100); 119,0461 (70); 163,0392 (55); 150,0314 (52,5);
		1	11,68	0,871	9,66E-07	Lignane	C49H52O16	[M-H]-	895,3203	165,0549 (47,5); 895,3188 (37,5); 699,2468 (23,5); 357,1345 (20,5);	3,5	3	Lignane	Non
										847,2988 (19); 193,0499 (12); 753,2584 (9)
										677,1830 (100); 571,1425 (5,3); 633,1935 (5,3); 93,0333 (4,5);
		Non	10,84	0,865	1,38E-06	Trimère de stilbène	C42H30O9	[M-H]-	677,1834	570,1313 (2,9); 659,1735 (2,7); 583,1427 (2,2); 223,0765 (1,5);	4,1	2	Stilbène	Non
										265,0511 (1,5)
		9	9,72	0,857	2,57E-06	Inconnu	C41H34O8	[M+HC OOH]-	699,2246	68,9251 (100); 653,2208 (13,2); 186,3938 (5,2); 106,3316 (5,1); 241,5402 (5,1)	3,1	3	Phenylpropanoïde	Non
										729,2668 (100); 193,0503 (72,9); 134,0364 (62,5); 150,0313 (45,8);
		1	11,79	0,855	2,87E-06	Lignane	C50H54O17	[M-H]-	925,3312	165,0548 (44,8); 175,0394 (40,6); 357,01355 (21,9); 925,3272	3,8	3	Lignane	Non
										(13,5); 503,1712 (11,5); 72,0143 (10,4); 877,3032 (10,4)
		3	9,82	0,855	2,87E-06	Malibatol A	C28H20O7	[M-H]-	467,1147	373,0724 (100); 279,0303 (39,3); 251,0352 (32); 467,1163 (25,3); 93,0333 (18,7); 69,0490 (17,3); 345,0766 (5,9)	4,6	2	Stilbène	Non
		166

  Tableau 21 : Tableau de déréplication des métabolites discriminants des fractions CPC de racine de Tannat antimycotoxine vis-à-vis de F. graminearum

	ID	tR (min)	pcorr	p	Identification putative (Bibliographie/SIRIUS)	Formule brute	Adduits	m/z (-)-ESI-MS	m/z (-)-ESI-MS2 (Intensité relative)	Degré d'erreur (Δppm)	Niveau de confiance a	Famille chimique	Standard injecté
									903,2461 (100); 355,0616 (68,9); 197,0774
	6739	10,80	0,842	0,063	Tétramère de stilbène (Vitisifurane A ou B)	C56H40O12	[M-H]-	903,2467	(21,3); 449,1040 (15,1); 327,0658 (7,6); 705,1773 (4,4); 311,0728 (4,2); 359,0912 (4); 343,0625 (6,7); 93,0332 (6,2); 345,0779 (5,6);	3,5	2	Stilbène	Non
									451,1214 (3,8); 809,2077 (2,7)
									908,2705 (100); 802,227 (17,2); 814,2319
	7236	10,94	0,671	0,056	Vitisine B	C52 13 C4H42O12	[M-H]-	908,2721	(13,3); 347,0921 (12,2); 360,0969 (11,7); 359,0931 (10); 454,1387 (10); 93,0333 (9,4);	8,7	1	Stilbène	Oui
									453,1357 (8,9); 333,0769 (5,6); 225,0551 (5,1)
									905,2618 (100); 359,0390 (29,9); 799,2194
									(27,6); 347,0929 (16,1); 333,0776 (13,8);
	7245	10,94	0,607	0,250	Vitisine B	C56H42O12	[M-H]-	905,2622	345,0772 (10,6); 93,0333 (7,5); 811,2197 (7,4);	3,2	1	Stilbène	Oui
									439,1198 (7,2); 545,1615 (6,4); 279,1036 (5,1);
									253,0509 (4,9); 451,1206 (4,9)
									453,1353 (100); 225,0555 (26,3); 347,0930
	4761	10,24	0,528	0,273	E-ε-viniférine	C28H22O6	[M-H]-	453,1352	(25,8); 359,0930 (20); 93,0333 (18,9); 119,0491 (13,7); 369,1139 (12,1); 411,1247 (12,1);	4,3	1	Stilbène	Oui
									253,0508 (11,6)
									453,1353 (100); 359,0931 (15,9); 93,0333
	4989	10,24	0,536	0,271	E-ε-viniférine	C28H22O6	[M-H]-	453,1352	(10,6); 347,0930 (8,8); 225,0557 (7,6); 411,1245 (5,8); 343,0982 (5,7); 369,1135 (4,8); 435,1248	4,4	1	Stilbène	Oui
									(4,8); 119,0491 (4,5)
									905,2619 (100); 359,0391 (25,5); 799,2198
									(25,5); 347,0927 (13,2); 333,0772 (11,5);
	7606	10,96	0,549	0,227	Vitisine B	C56H42O12	[M-H]-	905,2622	345,0778 (7,9); 811,2204 (7,2); 93,0333 (6,8);	3,2	1	Stilbène	Oui
									545,1608 (5,7); 317,0819 (4,9); 439,1196 (4,9);
									253,0506 (4,7); 451,1196 (4,3); 279,1025 (3,8)
									453,1353 (100); 225,0555 (26,3); 347,0930
	4477	10,18	0,422	0,146	Dimère de stilbène	C28H22O6	[M-H]-	453,1352	(25,8); 359,0930 (20); 93,0333 (18,9); 119,0491 (13,7); 369,1139 (12,1); 411,1247 (12,1);	4,2	2	Stilbène	Non
									253,0508 (11,6)
	4800	10,25	0,468	0,115	E-ε-viniférine	C28H22O6	[M+HCOOH]-	499,1407	69,0983 (100); 186,3504 (14,3); 114,2362	4,0	1	Stilbène	Oui
									(10,3); 355,6858 (10); 318,0567 (9,7)

  . Les paramètres d'extraction comme le pourcentage d'éthanol et la température pourront être optimisés dans le but d'améliorer le rendement d'extraction des métabolites potentiellement bioactifs (stilbènes, néolignanes) et de diminuer celui des composés inactifs (flavan-3-ols). D'autres approches d'extraction industrialisable pourraient être envisagées. Le procédé d'extraction à l'eau sous-critique mis enplace dans ces travaux de thèse n'a pas permis d'aboutir à des extraits antifongiques aux concentrations testées, mais il est concevable de réaliser des extractions au CO2 supercritique qui n'utilise pas de solvant organique, ou à un faible pourcentage. Ce procédé a d'ores et déjà été expérimenté pour extraire des stilbènes dont le E-resvératrol, la E-ɛ-viniférine et la vitisine B à partir de sarments de vigne[START_REF] Zachová | Combining high-pressure methods for extraction of stilbenes from grape cane[END_REF]. L'efficacité des extraits devra être testée à une échelle plus grande, notamment par des essais in planta sur du blé contaminé par F. graminearum. L'étude des mécanismes d'actions et les connaissances sur les propriétés physico-chimiques des métabolites bioactifs permettront d'orienter la formulation. Le formulant devra faciliter la solubilisation de l'extrait, son application, favoriser son adhésion sur la plante et surtout le protéger du rayonnement UV. En effet, les stilbènes sont des composés photosensibles, les monomères comme le E-resvératrol et le E-picéide ont tendance à être photoisomérisés. Des transformations de type hydroxylations, oxydations et le clivage de la double liaison entre les deux cycles phénoliques entrainent la formation de quinones et de phénanthrènes[START_REF] Latva-Mäenpää | Stability and photoisomerization of stilbenes isolated from the bark of norway spruce roots[END_REF]

Tableau 7 : Pourcentage d'inhibition de la croissance fongique de F. graminearum des extraits éthanoliques de co-produits de la vigne à 125 mg/L après 5 jours de culture *Différence significative en comparaison avec les conditions témoins (Milieu Gardiner + 0,5 % EtOH) à une p-value < 0,05 par le test de Kruskal-Wallis. n/a condition non testée. Contrôle positif, TEB 0,1 µM = 34 % d'inhibition.

Figure 43 : Structures possibles pour certains composés corrélés à l'activité antifongique dans les fractions de racine de Tannat via les scores de bioactivité.

Remerciements

Tout d'abord, je tiens à remercier les membres du jury, le Pr. Mehdi Beniddir de l'Université de Paris-Saclay, le Dr. Séverine Derbré de l'Université d'Angers, le Pr. Emilie Destandau de l'Université d'Orléans, le Dr. Olivier Puel, de l'INRAE Toulouse et le Dr. David Touboul du CNRS Ile-de-France, qui ont accepté d'évaluer mes travaux de thèse.

Un grand merci à mes encadrants, le Pr. Pierre Waffo-Téguo, directeur de cette thèse, le Dr. Caroline Rouger, co-encadrante, tout d'abord pour m'avoir donné l'occasion de réaliser ce travail pendant un peu plus de trois ans. J'ai beaucoup appris grâce à vous et à votre complémentarité. Merci de m'avoir octroyé votre confiance, et pour votre soutien qui a su me remotiver quand il le fallait.

Etat de l'art

Etat de l'art

Funding information

Project StilDeTox, Grant/Award Number: N • ANR-19-CE21-0007-

Tableau 22 : Tableau de déréplication des métabolites corrélés positivement à l'activité antimycotoxine dans les fractions CPC de racine de Tannat vis-à-vis de F. graminearum r : coefficient de corrélation de Pearson; p-value : valeur p-value de la correction de Bonferonni ; a: selon les niveaux d'annotation de Viant et al. (2017), métabolite identifié par un standard (1), métabolite putativement annoté à l'aide de bases de données spectrales (2), famille du métabolite putativement caractérisée à l'aide de bases de données spectrales (3), inconnu (4). En rouge, les doublons de métabolites dérépliqués plusieurs fois (adduits, fragment source, problème de déconvolution).

Conclusion générale & perspectives