T Ayadi

L Debbichi

M Badawi

M Said

D Rocca

S Lebègue

An ab initio study of the electronic properties of the ferroelectric heterostructure In 2 Se 3 /Bi 2 Se 3

Using ab initio calculations, we have investigated the electronic properties of the bidimensional ferroelectric heterostructure In 2 Se 3 /Bi 2 Se 3 . Depending on the direction of the polarization vector of the In 2 Se 3 layer, we found that the In 2 Se 3 /Bi 2 Se 3 heterostructure can have either a direct or an indirect bandgap, with values of 0.67 or 1.00 eV obtained with the GW approximation. Also this material presents a type II band alignment and appears to be a promising system for electron-hole separation. Finally, we found that an external electric field can be used to control not only the electronic gap but also the band offsets and the type of band alignment, which is very promising for certain applications in electronic and optoelectronic.

I. INTRODUCTION

The increasing progress of nanotechnology in recent years has motivated the scientific community to study materials with improved or even new properties, including twodimensional (2D) materials [START_REF] Castro Neto | The electronic properties of graphene[END_REF][2][START_REF] Debbichi | Two-Dimensional Indium Selenides Compounds: An Ab Initio Study[END_REF][START_REF] Geng | Recent Advances in Growth of Novel 2D Materials: Beyond Graphene and Transition Metal Dichalcogenides[END_REF][START_REF] Kavitha | Noble metal deposited graphitic carbon nitride based heterojunction photocatalysts[END_REF][START_REF] Zhibin | Synthesis of flower-like MoS2/g-C3N4 nanosheet heterojunctions with enhanced photocatalytic reduction activity of uranium(VI)[END_REF][START_REF] Khan | Recent developments in emerging two-dimensional materials and their applications[END_REF]. The latter, in the form of nanometric objects, have already demonstrated their effectiveness as active elements in various devices capable to meet the current needs. In particular, 2D piezoelectricity and 2D ferroelectricity [START_REF] Wu | The rise of two-dimensional van der Waals ferroelectrics[END_REF][START_REF] Cui | Two-dimensional materials with piezoelectric and ferroelectric functionalities[END_REF][START_REF] Dimuthu | Bandstructure engineering in 2D materials using Ferroelectric materials[END_REF] have attracted tremendous attention due to their large potential for device applications. These properties are exploited for applications as nonvolatile ferroelectric memories [START_REF] Scott | Ferroelectric memories today[END_REF], capacitors [START_REF] Stengel | Origin of the dielectric dead layer in nanoscale capacitors[END_REF], actuators [START_REF] Crawley | Use of piezoelectric actuators as elements of intelligent structures[END_REF], and sensors [START_REF] Wang | Piezoelectric Field Effect Transistor and Nanoforce Sensor Based on a Single ZnO Nanowire[END_REF].

The ability to combine and stack 2D layers has created a new class of materials known as van der Waals heterostructures and has opened the way to design new architectures.

This area has already proven to be fruitful for new properties and various functionalities, different from those of their individual 2D materials and thus created the basis for a variety of devices [START_REF] Wang | Two-dimensional heterostructures: fabrication, characterization, and application[END_REF][START_REF] Novoselov | 2D materials and van der Waals heterostructures[END_REF]. For instance, Zhang et al [START_REF] Zhang | Ultrahigh-gain Photodetectors Based on Atomically Thin Graphene-MoS2 Heterostructures[END_REF] have demonstrated that the photoresponsivity of a photodetector based on graphene/MoS 2 heterostructures is improved by a factor of nine in comparison with a standalone graphene layer. Also, enriching the functionalities of 2D heterostructures with ferroelectric properties would open up new opportunities for their applications [START_REF] Butler | Ferroelectric materials for solar energy conversion: photoferroics revisited[END_REF][START_REF] Grinberg | Perovskite oxides for visiblelight-absorbing ferroelectric and photovoltaic materials[END_REF][START_REF] Morris | Effect of internal electric fields on charge carrier dynamics in a ferroelectric material for solar energy conversion[END_REF].

Obviously the properties of this type of heterostructures are directly linked to the properties of their elementary constituents. Recently, both experiment and theoretical studies [START_REF] Zhou | Out-of-plane piezoelectricity and ferroelectricity in layered -In2Se3 nanoflakes[END_REF][START_REF] Cui | Intercorrelated in-plane and out-of-plane ferroelectricity in ultrathin two-dimensional layered semiconductor In2Se3[END_REF][START_REF] Ding | Prediction of intrinsic two-dimensional ferroelectrics in In2Se3 and other III2-VI3 van der Waals materials[END_REF] on In 2 Se 3 proved that the α phase presents ferroelectric properties with in-and out-of plane polarization, contrary to the β phase which is not ferroelectric. This discovery puts α-In 2 Se 3 under the light to be a useful candidate to form 2D ferroelectric heterostructures with out of plane polarization [START_REF] Shumin | Construction of ultrathin 2D/2D g-C3N4/In2Se3 heterojunctions with high-speed charge transfer nanochannels for promoting photocatalytic hydrogen production[END_REF][START_REF] Guan | Recent Progress in Two-Dimensional Ferroelectric Materials[END_REF]. For example, theoretical studies [START_REF] Ding | Prediction of intrinsic two-dimensional ferroelectrics in In2Se3 and other III2-VI3 van der Waals materials[END_REF][START_REF] Ayadi | An ab initio study of the ferroelectric In2Se3/graphene heterostructure[END_REF] demonstrated that the In 2 Se 3 /graphene heterostructure exhibits a Schottky barrier which can be controlled by the direction of the out-of plane intrinsic dipole of α-In 2 Se 3 . Moreover, a photodetector with outstanding properties, including a photocurrent on/off ratio of 1.24 x 10 5 at room temperature and a maximum photoresponsivity of 26 mAW -1 at 650 nm, based on WSe 2 /α-In 2 Se 3 was fabricated recently [START_REF] Liu | Photodetector based on heterostructure of two-dimensional WSe2/In2Se3[END_REF]. On the other hand, the topological insulator Bi 2 Se 3 [START_REF] Qi | Topological insulators and superconductors[END_REF][START_REF] Fauqué | Magnetothermoelectric properties of Bi 2 Se 3[END_REF][START_REF] Donglin | Ultrahigh thermoelectricity of atomically thick Bi2Se3 single layers: A computational study[END_REF][START_REF] Seungyeon | Growth of Bi2Se3 topological insulator thin film on Ge(111) substrate[END_REF] is a good material to form van der Waals heterostructures with various promising applications: for instance, a high performance photodetector based on SnTe/Bi 2 Se 3 was fabricated which exhibits remarkable properties as a high light responsivity of 145.74 mAW -1 and a maximum detectivity of 1.15x10 10 Jones [START_REF] Hongbin | Near-infrared photodetection based on topological insulator P-N heterojunction of SnTe/Bi2Se3[END_REF]. At the limit of the single layer, Bi 2 Se 3 possesses also great carrier mobilities of electrons and holes which can reach 1.96x10 5 and 3.4x10 4 cm 2 V -1 s -1 , respectively, together with a high optical absorption in the near ultraviolet and visible light regions [START_REF] Li-Bo | Two-dimensional Bi2Se3 monolayer with high mobility and enhanced optical absorption in the UVvisible light region[END_REF]. In addition, Somilkumar et al [START_REF] Rathi | Optimization of In2Se3/si(111) heteroepitaxy to enable Bi2Se3/In2Se3 bilayer growth[END_REF] have used molecular beam epitaxy (MBE) to grow Bi 2 Se 3 /In 2 Se 3 bilayers on Si(111) and they found that In 2 Se 3 is suitable for the subsequent high-quality heteroepitaxy of Bi 2 Se 3 . However, to our knowledge, no theoretical work has studied the electronic properties of the In 2 Se 3 /Bi 2 Se 3 heterostructure and more specifically their band offsets.

In this work, DFT calculations were performed to investigate the electronic properties of the ferroelectric α-In 2 Se 3 /Bi 2 Se 3 and the non-ferroelectric β-In 2 Se 3 /Bi 2 Se 3 heterostructures. Moreover, we also have investigated their band offsets under electrical field which are important quantities for material and device designs.

II. COMPUTATIONAL DETAILS

Our first principles calculations based on density functional theory were performed using the Vienna Ab Initio Simulation Package (VASP) [START_REF] Kresse | Ab initio molecular dynamics for liquid metals[END_REF] implementing the projector augmented wave method [START_REF] Kresse | From ultrasoft pseudopotentials to the projector augmented-wave method[END_REF]. The exchange and correlation potential was described by the Perdew-Burke-Ernzerhof functional within the generalized gradient approximation [START_REF] Perdew | Generalized Gradient Approximation Made Simple[END_REF]. The weak van der Waals interactions are described by the dispersion correction of Tkatchenko and Scheffler [START_REF] Tkatchenko | Accurate Molecular Van Der Waals Interactions from Ground-State Electron Density and Free-Atom Reference Data[END_REF] with iterative Hirshfeld partitioning [START_REF] Hirshfeld | Bonded-atom fragments for describing molecular charge densities[END_REF] (TS/HI) as implemented [START_REF] Bučko | Extending the applicability of the Tkatchenko-Scheffler dispersion correction via iterative Hirshfeld partitioning[END_REF][START_REF] Bučko | Improved Density Dependent Correction for the Description of London Dispersion Forces[END_REF] in VASP. A 12x12x1 k-mesh was used for the Brillouin zone sampling and the cutoff energy was set to 500 eV. A vacuum of 17 Å along the direction perpendicular to the layers was adopted to ensure decoupling between periodically repeated systems. The convergence parameters were set to 0.01 eV/ Å for the residual forces on ions and to 10 -6 eV for the total energy. Since DFT in the generalized gradient approximation generally underestimates bandgaps, we have used the GW approximation [START_REF] Aryasetiawan | The GW method[END_REF][START_REF]Properties of electron self-energies and their role in electron spectroscopies[END_REF] to obtain realistic bandstructures. The cut-off for the polarizability matrices was set to 150 eV, while the other parameters (k-points, plane wave cut-off) were kept as in the DFT calculations. In 2 Se 3 and Bi 2 Se 3 corresponds to the energy difference between the energy at equilibrium (E 0 ) and the energy when the layers are put at a distance large enough to avoid interlayer interactions (E s ), divided by the number of atoms in the cell (N). These calculated values are found to be in the same range as for other van der Waals heterostructures [START_REF] Ayadi | An ab initio study of the electronic structure of indium and gallium chalcogenide bilayers[END_REF][START_REF] Debbichi | Electronic structure of two-dimensional transition metal dichalcogenide bilayers from ab initio theory[END_REF],

confirming the weak interaction between the layers. Then we have used the PBE and GW approximations to calculate the band structure (see figure 2) and the bandgap for all configurations. With PBE, we found that the valence band maximum (VBM) is along the ΓM direction for the G 1 and G 3 configurations and is along ΓK for the G 2 configuration. Also, we found that the conduction band minimum (CBM) is at the Γ point for both ferroelectric configurations (G 1 and G 2 ), and is at the M point for the non-ferroelectric configuration G 3 .

When the spin-orbit coupling (SOC) is taken into account, the states of the VBM at the Γ point of the G 1 configuration, are shifted up and the CBM is shifted down in energy.

The bandgap is now direct, with a reduction of about 0.3 eV. This value is increased to 0.67 eV when the GW approximation is used. However, when the intrinsic dipole of In 2 Se 3 is in the opposite direction ( the G 2 configuration), the SOC does not change the nature of the bandgap, but a reduction of the gap value of about 0.16 eV is observed. The SOC decreases the electronic gap value up to 0.8 eV with PBE+SOC, but GW+SOC brings it up to 1 eV. For the configuration G 3 , when the SOC is included, we found that there is a small energy variation (of a few meV) at the VBM and CBM levels. The gap is indirect of the order of 0.1 eV with PBE+SOC and the value increases up to 0.54 eV with GW+SOC.

Generally, we observed that there are no major quantitative differences in the dispersion of bands found with GW+SOC compared to those found with PBE+SOC, the main difference being a wideing of the bandgap, as expected with the GW approximation. Due to the important effect of spin-orbit coupling on the electronic structures of the heterostructure

In 2 Se 3 /Bi 2 Se 3 , it will be kept in the rest of our calculations. shows a significant modulation of its electronic gap by E ext . For the G 1 configuration, where the intrinsic dipole P is pointing towards Bi 2 Se 3 , the variation of the band gap under the application of an external electric field is divided into three regions. In the first region, where the external electric field is between -0.8 and -0.5 V/ Å, the gap value tends to be stable and the heterostructure achieves its maximum electronic gap with a value of about 0.51 eV. In the second region, where E ext is between -0.5 and 0.1 V/ Å, the electronic gap decreases lineary with the increase of the electric field. In the third region, where E ext is between 0.1 and 0.8 V/ Å, the heterostructure In 2 Se 3 /Bi 2 Se 3 shows a transition from a semiconductor to a metal. However, when the intrinsic dipole of In 2 Se 3 is in the opposite direction (the G 2 configuration), the observed behavior is different: when a negative electric field is applied, the band gap exhibits a linear increase. Then, when a positive electric field is applied, the variation of the electronic gap under the application of an external electric field is divided into two regions: when E ext is between 0 and 0.2 V/ Å, the value of the gap tends to stabilize as the electric field strength is increased, and when E ext is between 0.4 and 0.8 V/ Å, E g exhibits a linear decreasing behavior as the electric field strength is increased.

Finally, the non-ferrelectric configuration G 3 shows a metallic phase when E ext is between -0.8 and -0.5 V/ Å. Then, when the external electric field is betwen -0.5 and 0.6 V/ Å, the band gap increases with E ext , and when E ext is between 0.6 and 0.8 V/ Å, the gap value tends to stabilize as the electric field strength is increased.

-1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.

  III. RESULTS AND DISCUSSIONWhen stacking a Bi 2 Se 3 layer on top of a α-In 2 Se 3 ferroelectric layer, two different arrangements can be obtained, noted hereafter G 1 and G 2 , depending on the direction of the polarization vector: in the G 1 configuration, the spontaneous out-of-plane electric polarization P is pointing towards Bi 2 Se 3 while in the configuration G 2 it is pointing in the other direction. The G 3 configuration is constructed by stacking the Bi 2 Se 3 layer on top of the non-ferroelectric layer β-In 2 Se 3 . The different geometries are shown in figure 1.

FIG. 1 :

 1 FIG. 1: Side view of the different configurations of the heterostructure In 2 Se 3 /Bi 2 Se 3 . The red spheres represent the selenium atoms, while the blue and yellow spheres correspond to indium and bismuth atoms, respectively. The black arrows indicate the direction of the spontaneous electric polarization (P). An electric field (E ext ) is applied perpendicularly to the layers.

FIG. 2 : 3 and Bi 2

 232 FIG. 2: Band structure of the (a) G 1 , (b) G 2 and (c) G 3 configurations of In 2 Se 3 /Bi 2 Se 3 heterostrcuture. The black and red lines represent the PBE and PBE+SOC calculations. The GW+SOC calculations for the last valence band and the first conduction band are shown with blue circles. The Fermi level is set to 0 eV.

2 FIG. 3 : 2 2 2 FIG. 4 :

 232224 FIG. 3: PBE+SOC band structures of (a) G 1 , (b) G 2 and (c) G 3 configurations of the In 2 Se 3 /Bi 2 Se 3 heterostructure. The size of the blue and red circles is proportional to the In 2 Se 3 and Bi 2 Se 3 contributions, respectively. The Fermi level is set to 0 eV. (d) Band alignments of the different configurations of the heterostructure In 2 Se 3 /Bi 2 Se 3 . The relevant electronic parameters (|∆E c | and |∆E v |) are also given in the figure. The red dashed lines are the different Fermi level.

2 FIG. 5 :FIG. 6 :

 256 FIG. 5: Evolution of the band gap of the G 1 , G 2 and G 3 configurations of the In 2 Se 3 /Bi 2 Se 3 heterostructure as a function of strength of the external electric field (E ext ).

  In summary, the electronic properties of In 2 Se 3 /Bi 2 Se 3 heterostructure have been investigated using density functional theory and the GW We have found that the In 2 Se 3 /Bi 2 Se 3 ferroelectric heterostructure is a semiconductor with a direct bandgap. However, when the intrinsic polarization of In 2 Se 3 is reversed, we have found that In 2 Se 3 /Bi 2 Se 3 is a semiconductor with an indirect bandgap. By analysing the electron density, we found that the In 2 Se 3 /Bi 2 Se 3 heterobilayer can be potentially used as an electron-hole charge separator. Our results show also that the In 2 Se 3 /Bi 2 Se 3 heterostructure exhibits a modulation of its band gap and band offsets upon the variation of an external electric field. Also the In 2 Se 3 /Bi 2 Se 3 heterostructure has a type II band alignment but under the application of an external electric field, it experiences a transition from type II to type I band alignment. Overall, the findings obtained in this study provide interesting guidelines for using the In 2 Se 3 /Bi 2 Se 3 system in some electronic or optical devices, and open the path for further experimental and theoretical studies of this system.

TABLE I :

 I

				PBE	PBE+SOC	GW+SOC
	G 1 4.10 2.92	19.70	0.37 (ΓM→Γ)	0.07 (Γ→Γ)	0.67
	G 2	4.10 3.06	17.00	0.54 (ΓK→Γ) 0.38 (ΓK→Γ)	1.00
	G 3	4.06 2.74	20.50	0.16 (ΓM→ M) 0.10 (ΓM→ M)	0.54

Calculated interlayer distance d ( Å), binding energy E b (meV/atom), DFT (with and without spin-orbit coupling), and GW bandgaps of the different configurations of the heterostructure In 2 Se 3 /Bi 2 Se 3 . a ( Å) d ( Å) E b (meV) E g (eV)

1.5

2.5Energy (eV) (a)Γ M K Γ (b) Γ M K Γ


Caroline Lefeuvre

Émilie Przyrowski

Véronique Apaire-Marchais
email: veronique.marchais@univ-angers.fr

Aspects virologiques et diagnostic du coronavirus Sars-CoV-2

Keywords: coronavirus, diagnostic, RT-PCR, SARS-CoV-2, sérologie

T1 Coronavirus SARS-CoV-2

Les coronavirus infectent de nombreuses espèces animales, mais également l'homme.

T2 Classification et taxonomie

TEG1 Les coronavirus appartiennent à la famille des Coronaviridae, qui comprend deux sous-familles, les Coronavirinae et les Torovirinae. Les Coronavirinae sont divisés en quatre genres, appelés Alpha-, Beta-, Gamma-et Deltacoronavirus. Le genre Betacoronavirus est lui-même subdivisé en quatre clades (A, B, C et D). Les coronavirus humains (HCoV) répertoriés en 2020 appartiennent aux Alpha-et aux Betacoronavirus (tableau 1) [START_REF]International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV)[END_REF][START_REF] Mourez | Traité de virologie médicale[END_REF].

TEG1 Les analyses phylogénétiques ont montré que les chauves-souris et les rongeurs sont les réservoirs de la majorité des Alpha-et des Betacoronavirus, tandis que les oiseaux sont les principaux réservoirs des Gamma-et des Deltacoronavirus. Depuis des milliers d'années, les coronavirus ont pu franchir les barrières d'espèces. Il existe un réservoir animal large, notamment chez les mammifères (camélidés, civettes, bovins, etc.) qui peuvent jouer le rôle d'hôtes intermédiaires et d'adaptation à ces virus afin qu'ils infectent ensuite plus efficacement l'homme. Ainsi, des coronavirus ont pu émerger comme pathogènes dans l'espèce humaine [START_REF] Ye | Zoonotic origins of human coronaviruses[END_REF]. TEG1 Le génome des coronavirus est de grande taille, environ 30 kb. Il s'agit d'une molécule d'ARN monocaténaire linéaire non segmentée, de polarité positive. Le génome comprend deux régions non codantes en 5' et en 3'. La partie codante est divisée en plusieurs parties. Les deux premiers tiers du génome sont constitués de deux grandes régions chevauchantes, Open Reading Frame (ORF)1a et ORF1b, codant le complexe de réplication-transcription, dont le gène RNA-dependent RNA Polymerase (RdRp) qui code l'ARN polymérase ARNdépendante. Le dernier tiers du génome code les protéines de structure (S, E, M, N) et des protéines non structurales variables selon les espèces de coronavirus (figure 2) [START_REF] Hulo | ViralZone: a knowledge resource to understand virus diversity[END_REF].

TEG1 Les coronavirus présentent une grande diversité génétique liée à la plasticité de leur génome. Ainsi, au cours de leur évolution, ils ont pu acquérir un certain nombre de gènes codant des protéines leur permettant d'enrichir leur potentiel d'adaptation. Cette diversité génétique est liée à plusieurs facteurs : apparition et sélection de mutations lors de la réplication du génome ARN, insertions ou délétions ayant pour conséquence une modification des régions codantes, recombinaisons facilitées par la nature discontinue de la transcription du génome, présence de quasi-espèces. La région du génome qui subit la plus forte sélection est le gène codant la protéine de surface S qui s'attache au récepteur cellulaire et qui est l'épitope des anticorps neutralisants [START_REF] Mourez | Traité de virologie médicale[END_REF][START_REF] Ye | Zoonotic origins of human coronaviruses[END_REF].

T1 Diagnostic virologique du SARS-CoV-2

Le diagnostic virologique du SARS-CoV-2 se réalise soit directement, par transcriptase inverse-réaction en chaîne par polymérase (RT-PCR), soit indirectement, par sérologie.

T2 Détection du génome par RT-PCR T3 À partir de quel prélèvement ?

TEG1 Le Centre national de référence (CNR) des virus des infections respiratoires a étudié différents sites de prélèvement et recommande la réalisation du prélèvement nasopharyngé. Il consiste à insérer profondément un écouvillon dans le nez en suivant le plancher de la fosse nasale et à le tourner pour récupérer des cellules de la muqueuse riches en virus. Il doit être effectué par du personnel formé et expérimenté, doté d'un matériel adéquat [START_REF]Mise au point du CNR sur la réalisation des prélèvements et la sensibilité des tests RT-PCR pour la détection du SARS[END_REF]. D'autres modalités existent, comme l'aspiration nasale, plus adaptée chez les enfants et qui favorise en général une plus grande sécrétion de mucus.

TEG1 En seconde intention, des prélèvements plus profonds peuvent être réalisés, par exemple avec le liquide de lavage broncho-alvéolaire ou via l'aspiration bronchique, si le prélèvement nasopharyngé est négatif et qu'il persiste une forte suspicion clinique [START_REF]Fiche : Gestion des prélèvements biologiques d'un patient suspect ou confirmé de COVID-19 Version 5[END_REF].

T3 L'amplification du génome par RT-PCR

TEG1 Le diagnostic d'infection par le SARS-CoV-2 repose sur une recherche directe qualitative du génome viral par la technique de RT-PCR (figure 3). L'extraction de l'ARN à partir du prélèvement respiratoire précède l'étape de RT-PCR. La Société française de microbiologie (SFM) recommande que ces tests soient réalisés dans des laboratoires de sécurité biologique de niveau 2, avec des équipements de protection spécifiques [START_REF]Fiche : Gestion des prélèvements biologiques d'un patient suspect ou confirmé de COVID-19 Version 5[END_REF].

TEG1 En janvier 2020, le CNR des virus des infections respiratoires (Paris et Lyon) a mis au point la première RT-PCR spécifique du SARS-CoV-2 en France, visant trois cibles du virus : deux présentes dans le gène RdRp (nommées IP2 et IP4), propres au SARS-CoV-2, et une située sur le gène de l'enveloppe (E), retrouvé chez d'autres coronavirus tels que le SARS-CoV. Depuis, de nombreux tests commerciaux ont été élaborés, ils ciblent différents gènes : le gène RdRp, le gène E, mais aussi les gènes N, S ou de l'ORF1 du SARS-CoV-2 (figure 2). TEG1 Le 7 mars 2020, la détection du génome du SARS-CoV-2 par RT-PCR a été intégrée à la nomenclature des actes de biologie médicale [START_REF]Arrêté du 7 mars 2020 portant modification de la liste des actes et prestations mentionnée à l'article L162-1-7 du Code de la sécurité sociale (inscription de la détection du génome du SARS-CoV-2 par RT PCR)[END_REF]. Néanmoins, pour être remboursés, les kits de réactifs produits par les industriels doivent répondre à plusieurs critères. Ils doivent tout d'abord être estampillés "Communauté européenne" ou avoir été évalués par le CNR des virus des infections respiratoires. De plus, en adéquation avec les recommandations de la Haute Autorité de santé (HAS), ils doivent impérativement comporter au moins deux cibles. Une liste des tests répondant à ces critères, régulièrement actualisée, est disponible sur les sites de la SFM et du ministère des Solidarités et de la Santé [START_REF]Plateforme COVID-19[END_REF]. Le délai de rendu du résultat préconisé doit être inférieur à vingt-quatre heures.

TEG1 La RT-PCR s'avère positive chez des individus infectés symptomatiques ou asymptomatiques. Chez la plupart des patients symptomatiques, elle se positive dès le premier jour des symptômes, un pic est observé pendant la première semaine et la détection est possible jusqu'à deux à trois semaines après le début des signes cliniques (chez des patients présentant des formes sévères, l'ARN viral a pu être détecté encore après ce délai). Néanmoins, un test positif ne préjuge pas de la contagiosité du patient, mais seulement de la présence du génome du virus [START_REF] Sethuraman | Interpreting diagnostic tests for SARS-CoV-2[END_REF].

T3 La place de la RT-PCR dans le diagnostic

TEG1 Pendant la phase 3 de l'épidémie et le confinement, les indications de diagnostic prioritaires par RT-PCR ont été énoncées par le Haut Conseil de la santé publique (tableau 2) [START_REF]Coronavirus SARS-CoV-2 prise en charge des personnes à risque de formes graves. 4 avril[END_REF].

TEG1 À la suite du déconfinement, le 11 mai 2020, les indications des tests RT-PCR se sont élargies, le but étant de diagnostiquer toute personne présentant des symptômes évocateurs de la Covid-19 et de pouvoir limiter la chaîne de contamination, notamment dans des lieux d'hébergement collectif ou de prise en charge de personnes fragiles. Les résultats sont communiqués au médecin prescripteur, avec information à la cellule d'intervention de Santé publique France en région, à l'agence régionale de santé et au centre de crise de la Direction générale de la santé. Un dispositif informatique important, appelé contact tracing, a aussi été mis en place afin de pouvoir tracer les cas contacts via le Système d'information de dépistage (SI-DEP) et Contact-Covid. Ainsi, dès la détection d'un nouveau cas positif, les cas contacts doivent être recherchés et dépistés par RT-PCR, qu'ils soient symptomatiques ou non.

TEG1 Le collège de la HAS a émis un avis, le 14 mai 2020, sur le dépistage des patients admis en établissements de santé [START_REF]AC/SBPP du 14 mai 2020 du collège de la Haute Autorité de santé portant sur les modalités de dépistage du virus SARS-CoV-2 chez les patients admis en établissement de santé[END_REF]. Outre le diagnostic des sujets symptomatiques et des cas contacts, il recommande un dépistage par RT-PCR dans les vingt-quatre à quarante-huit heures avant l'hospitalisation, au minimum chez les patients à risque de forme grave de la Covid-19 et en cas de chirurgie programmée avec ouverture ou exposition des voies aériennes (chirurgie oto-rhino-laryngologique (ORL), thoracique, de la base du crâne, bronchoscopie ou toute autre situation à risque), de chirurgie générant des aérosols ou de chirurgie majeure à risque opératoire ou postopératoire. De plus, si les capacités diagnostiques le permettent, un dépistage de tout patient avant une hospitalisation programmée est préconisé. Enfin, il est également recommandé avant toute nouvelle entrée dans un établissement hébergeant des personnes âgées. Ces indications sont bien entendu susceptibles d'être modifiées selon l'évolution de la pandémie. TEG1 Différents types de tests sont disponibles actuellement sur le marché : automatisables (de type Enzyme-Linked Immunosorbent Assay [ELISA] ou Chemiluminescence Enzyme Immunoassays [CLEIA], par exemple) ou unitaires (immuno-chromatographiques). Ils ciblent pour la plupart la protéine de structure S ou la nucléoprotéine [START_REF] Sethuraman | Interpreting diagnostic tests for SARS-CoV-2[END_REF] (figure 2). Les Ig totales, ainsi que les IgG seules ou associées aux IgM peuvent être détectées selon les tests utilisés. Ce sont des dispositifs médicaux de diagnostic in vitro (DM-DIV), soumis à la réglementation européenne et à l'obligation de marquage CE pour être commercialisés. Néanmoins, la Commission européenne, dans ses recommandations du 15 avril 2020, a autorisé, à titre exceptionnel et dans l'intérêt de la protection de la santé, la commercialisation de tests ne disposant pas du marquage CE [START_REF]Lignes directrices relatives aux tests de diagnostic in vitro de la COVID-19 et à leurs performances[END_REF].

TEG1 En France, avant leur commercialisation et leur utilisation à large échelle par les laboratoires de biologie médicale (LBM), la HAS a préconisé de faire évaluer les performances de ces tests et leur intérêt par le CNR des virus des infections respiratoires. Les exigences du cahier des charges établi par la HAS sont les suivantes : une sensibilité clinique minimale de 90 à 95 % selon l'usage et une valeur seuil minimale de spécificité de 98 % [START_REF]Cahier des charges définissant les modalités d'évaluation des performances des tests sérologiques détectant les anticorps dirigés contre le[END_REF]. Selon le Journal officiel du 21 mai 2020, les DM-DIV autorisés à être utilisés par les LBM seront ceux validés par le CNR des virus des infections respiratoires et inscrits sur la liste publiée sur le site internet du ministère chargé de la santé et de l'Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé [START_REF]complétant l'arrêté du 23 mars 2020 prescrivant les mesures d'organisation et de fonctionnement du système de santé nécessaires pour faire face à l'épidémie de covid-19 dans le cadre de l'état d'urgence sanitaire[END_REF]. Fin juin 2020, seuls 31 tests sérologiques (automatisés et rapides) parmi 99 tests Covid-19 disponibles étaient autorisés par la HAS [START_REF]Plateforme COVID-19[END_REF]. Les experts du groupe de travail affirment que la pertinence de ces dispositifs est extrêmement liée à leurs performances et à la prévalence de la maladie, qui conditionne la valeur prédictive positive. Néanmoins, les tests disponibles ne permettent pas d'affirmer l'activité neutralisante de ces anticorps, c'est-à-dire leur capacité protectrice, et à neutraliser le virus en cas de réinfection. Ainsi, nous ne savons pas si l'infection, puis la guérison confèrent une immunité durable. De plus, les tests sérologiques ne permettent pas de statuer si la personne est contagieuse ou pas, puisque la séroconversion ne s'accompagne pas d'une baisse de la charge virale.

TEG1 Selon l'avis de la HAS, les indications retenues pour la sérologie par tests automatisables ELISA sont principalement les enquêtes séro-épidémiologiques et les personnes pour lesquelles la RT-PCR n'a pas été effectuée ou pour lesquelles le prélèvement par écouvillonnage nasopharyngé était négatif malgré une forte suspicion clinique, mais d'autres indications existent (tableau 3) [START_REF]Place des tests sérologiques dans la stratégie de prise en charge de la maladie[END_REF].

T3 La place des tests sérologiques rapides

TEG1 La question de la place des tests sérologiques rapides dans la stratégie de prise en charge de la Covid-19 se pose dès lors que l'objectif est de développer le diagnostic sérologique à grande échelle. Ces tests unitaires, bien souvent immuno-chromatographiques et uniquement qualitatifs, sont généralement réalisés sur prélèvement sanguin, par ponction capillaire.

TEG1 Différents types de DM-DIV rapides existent :

• le test de diagnostic rapide (TDR), qui est un examen de biologie médicale réalisé au sein d'un LBM, donc soumis aux mêmes exigences (notamment de traçabilité des résultats) que les tests automatisables ELISA, et qui possède le marquage CE ;

• le test rapide d'orientation diagnostique (TROD), effectué en dehors d'un LBM (cabinets de ville, officines) par des médecins, des pharmaciens non biologistes ou des infirmiers, et sous leur responsabilité ; les TROD ne garantissent pas la traçabilité des résultats, sont soumis à la publication d'un arrêté ministériel et possèdent le marquage CE ;

• l'autotest, utilisé directement par le patient (sans compte rendu de résultats), qui est disponible à l'officine après obtention du marquage CE octroyé par un organisme notifié.

TEG1 Les indications des TDR sont identiques à celles des tests automatisables, à la condition que leurs performances cliniques soient supérieures ou égales à celles définies par la HAS après évaluation par le CNR des virus des infections respiratoires [START_REF]Haute Autorité de santé (HAS). Place des tests sérologiques rapides (TDR, TROD, autotests) dans la stratégie de prise en charge de la maladie[END_REF]. Néanmoins, en LBM, il est recommandé de privilégier le test ELISA, puisqu'il présente l'avantage d'être semiquantitatif et automatisable.

TEG1 Les indications des TROD sont les mêmes que celles des TDR, à l'exception des deux indications relatives aux patients symptomatiques graves hospitalisés et à quelques nuances près (pas d'accès à un LBM pour les patients symptomatiques sans signes de gravité, etc.) [START_REF]Haute Autorité de santé (HAS). Place des tests sérologiques rapides (TDR, TROD, autotests) dans la stratégie de prise en charge de la maladie[END_REF]. Les résultats doivent être tracés au sein des enquêtes séroépidémiologiques. Pour l'heure, les performances cliniques sur sang total des TROD n'ont pas été évaluées. Un résultat positif doit toujours être confirmé par un test sérologique réalisé en LBM.

TEG1 La HAS n'a pas recommandé l'utilisation des autotests sérologiques dans la prise en charge de la Covid-19 compte tenu notamment de leur difficulté d'interprétation par les patients et de l'absence d'évaluation formelle de leurs performances cliniques [START_REF]Haute Autorité de santé (HAS). Place des tests sérologiques rapides (TDR, TROD, autotests) dans la stratégie de prise en charge de la maladie[END_REF].

T3 Le statut sérologique des patients Covid-19

Bien que les tests Elisa IgM et IgG se soient révélés positifs dans certaines études dès le quatrième jour après la survenue des premiers signes évocateurs, les tests sérologiques ne sont pas recommandés dans le cadre du diagnostic précoce de la Covid-19, lors de la première semaine suivant l'apparition des symptômes. La production d'IgM et/ou d'IgG n'est détectable chez les patients symptomatiques à des niveaux élevés qu'à partir de la deuxième semaine (J15).

T1 Conclusion

Actuellement, le diagnostic virologique de la Covid-19 repose sur la mise en évidence du virus SARS-CoV-2 par RT-PCR dès le début des symptômes. Les tests sérologiques (TDR, TROD et ELISA) sont plutôt recommandés en complément de la RT-PCR pour le diagnostic initial ou de rattrapage de la Covid-19, ainsi que dans les études de séroprévalence. Cependant, des inconnues persistent, telles que la durée de l'immunité induite par la maladie et sa capacité à limiter une réinfection.

Points à retenir

• Un test transcriptase inverse-réaction en chaîne par polymérase (RT-PCR) positif ne préjuge pas de la contagiosité du patient, mais seulement de la présence du génome du virus.

• Le diagnostic sérologique permet de mettre en évidence la réponse anticorps au Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2).

• La RT-PCR peut être faussement négative selon la qualité du prélèvement respiratoire et le délai de prélèvement par rapport au début de la maladie.

• Les tests sérologiques ne permettent pas de déterminer si la personne est contagieuse.

• Les autotests sérologiques ne doivent pas être utilisés à ce jour dans la prise en charge de la Covid-19.

Déclaration de liens d'intérêts

Les auteurs déclarent ne pas avoir de liens d'intérêts.

Tableau 1. Classification des sept coronavirus humains et année de leur identification.

Alphacoronavirus Betacoronavirus

HCoV

TEG1

  Actuellement, sept coronavirus sont capables d'infecter l'homme. Quatre sont ubiquitaires et responsables d'infections respiratoires hautes et basses (HCoV), peu sévères en général chez les individus immunocompétents. Deux autres, très pathogènes, ont émergé plus récemment : en 2003, le SARS-CoV associé à un syndrome respiratoire aigu sévère et, en 2012, le Middle East Respiratory Syndrome-Related Coronavirus (MERS-CoV), provoquant le syndrome respiratoire du Moyen-Orient. TEG1 Fin 2019, un nouveau coronavirus, le SARS-CoV-2, responsable de la Covid-19, est apparu en Chine, à Wuhan, puis s'est répandu dans le monde entier. Il s'agit d'un Betacoronavirus (clade B), comme le SARS-CoV (tableau 1). Toutefois, des analyses phylogénétiques récentes ont montré que le SARS-CoV-2 serait plus proche des SARS-like CoV de chauves-souris que des SARS-CoV [4]. T2 Structure du virus et organisation génomique TEG1 Les coronavirus sont des virus enveloppés, plutôt sphériques, d'un diamètre compris entre 80 et 200 nm. Les protéines S (spike) forment une large couronne à leur surface, d'où le préfixe latin corona. Les protéines N, étroitement liées à l'acide ribonucléique (ARN) génomique, forment la nucléocapside. Les protéines M et E constituent la matrice et l'enveloppe (figure 1) [1].

TEG1

  La RT-PCR est une technique présentant une très bonne sensibilité et spécificité, ce qui en fait un outil diagnostique adapté pour la recherche directe du SARS-CoV-2 selon les indications de diagnostic prioritaires énoncées (tableau 2). Cependant, elle peut se révéler négative chez un patient pourtant infecté pour plusieurs raisons : qualité du prélèvement, site anatomique et délai de réalisation par rapport aux symptômes. La sérologie peut alors avoir toute sa place. T2 Diagnostic sérologique T3 La place de la sérologie TEG1 Après une infection par le SARS-CoV-2, la plupart des individus infectés développent une réponse immunitaire adaptative humorale. Les tests sérologiques réalisés sur prélèvement sanguin, généralement par ponction veineuse, permettent de détecter la production d'immunoglobulines (Ig) dirigées contre le virus.

Sur 2 colonnes (ou 1 colonne + marge) Tableau 2. Indications de diagnostic prioritaires selon l'avis du Haut Conseil de la santé public du 31 mars 2020 [11]. Critères Patients concernés et objectifs Critères liés à la gravité des tableaux cliniques

	-229E (1966) HCoV-NL63 (2004) HCoV : coronavirus humains ; SARS : Severe Acute Respiratory Syndrome ; MERS : Middle Clade A HCoV-OC43 (1967) HCoV-HKU1 (2005) Clade B SARS-CoV (2003) SARS-CoV-2 (2019) Clade C MERS-CoV (2012) East Respiratory Syndrome. Patients hospitalisés en réanimation présentant une symptomatologie respiratoire guider le traitement Critères liés à une situation Patients devenant symptomatiques au décours d'une hospitalisation Donneurs d'organes, de tissus ou de cellules souches hématopoïétiques Exploration d'un foyer de cas possibles au sein d'une structure d'hébergement collectif (trois tests par collectivité) Femmes enceintes symptomatiques Critères liés à la présence de comorbidité Personnes à risque de forme grave et présentant des symptômes évocateurs de la Covid-19 Autres critères Personnel de santé ou personnel de structures médico-sociales et d'hébergement présentant des symptômes de la Covid-19 Patients présentant des symptômes évocateurs de la Covid-Suivi des patients Covid-19 graves de réanimation pour Sur 2 colonnes

(ou 2 colonnes + marge) Tableau 3. Principales indications des tests sérologiques automatisables ELISA anti-SARS- CoV-2. Population cible Finalité du test Indications et temporalité de réalisation du test Patients symptomatiques

  Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ; RT-PCR : transcriptase inverse-réaction en chaîne par polymérase.

			Patients sans signe de gravité mais n'ayant
			pas été en mesure de réaliser un test RT-PCR
			avant sept jours
		Diagnostic étiologique à	Confirmation sérologique possible si patient
		distance	uniquement diagnostiqué cliniquement
	Professionnels	Dépistage et détection	Possibilité de sérologie complémentaire
	soignants ou	de personne contact	après une RT-PCR négative, uniquement à
	personnels		titre individuel sur prescription médicale
	d'hébergements
	collectifs non
	symptomatiques
	ELISA : Sur 2 colonnes (ou 2 colonnes + marge)
	Figures
	Apa_fig1
	Figure 1. Structure du SARS-CoV-2.
	© V. Apaire-Marchais/Elsevier Masson SAS
		Diagnostic initial	Patients graves hospitalisés, si tableau
			clinique ou scanographique évocateur et RT-
			PCR négative
			Patients sans signe de gravité suivis en ville si
			tableau clinique évocateur et test RT-PCR
			négatif
		Diagnostic de rattrapage Patients graves hospitalisés mais n'ayant pas
			été en mesure de réaliser un test RT-PCR
			avant sept jours

Sur 1 colonne près de son appel Apa_fig2 Figure

  2. Organisation génomique du SARS-CoV-2. RdRp : gène codant l'ARN polymérase ARN-dépendante ; S, E, M, N : gènes codant les protéines de structure (S [surface], E [enveloppe], M [membrane], N [nucléocapside]). Principe de la RT-PCR. Afin d'amplifier une séquence d'ARN, une étape de reverse transcription de l'ARN en ADN complémentaire est préalablement nécessaire à la PCR. La PCR permet ensuite d'amplifier la séquence spécifique d'ADN complémentaire selon les trois principales étapes (dénaturation, hybridation, élongation) en 2n copies (n = nombre de cycles).

	Figure 3. © V. Apaire-Marchais/Elsevier Masson SAS
	Sur 1 colonne +
	© V. Apaire-Marchais/Elsevier Masson SAS
	Sur 2 colonnes près de son appel
	Apa_fig3

marge près de son appel


Venera I Tyukmaeva
email: vtyukmaeva@gmail.com

David P Hopkins
email: david.hopkins.boa@gmail.com

Zach Gompert

Jeff Feder

Patrik Nosil
email: p.nosil@sheffield.ac.uk

Functional genomics offers new tests of speciation hypotheses

Keywords: linkage, pleiotropy, reproductive isolation, inversion, CRISPR/Cas9

Speciation is a fundamental process shaping biodiversity. However, existing empirical methods often cannot provide key genetic and functional details required to validate speciation theory. New gene modification technologies can verify the causal functionality of genes with astonishing accuracy, helping resolve questions about how reproductive isolation evolves during speciation.

Genomic tools to study speciation

Understanding the process of speciation is one of the main goals of evolutionary biology.

Theories concerning speciation are among the best developed in biology [e.g. [START_REF] Wolf | Making sense of genomic islands of differentiation in light of speciation[END_REF][START_REF] Campbell | What is Speciation Genomics? The roles of ecology, gene flow, and genomic architecture in the formation of species[END_REF][START_REF] Ravinet | Mechanisms of assortative mating in speciation with gene flow: Connecting theory and empirical research[END_REF], and throughout the -omics (see Glossary) era expectations have been high for validating theories about how reproductive isolation (RI) evolves to create new species. However, while an abundance of empirical work has raised our understanding of various aspects of speciation [START_REF] Campbell | What is Speciation Genomics? The roles of ecology, gene flow, and genomic architecture in the formation of species[END_REF][START_REF] Ravinet | Mechanisms of assortative mating in speciation with gene flow: Connecting theory and empirical research[END_REF], there is still a paucity of experimental studies that explicitly distinguish alternative hypotheses. This is because many studies lack the fine genetic detail, functional link to RI, and direct manipulation experiments to substantiate theory. Motivated by the dawn of a technological revolution in functional genomics (Box1), we outline how testing of classical hypotheses in speciation could benefit from advances in gene modification, and move beyond current 'candidate gene validation' studies, to help spur new research and discovery in the field.

Pleiotropy and tight linkage in speciation studies

One of the main goals of speciation research is to ascertain the genetic basis of RI. Modern approaches utilize methods such as genome scans, QTL mapping, or GWAS to identify the regions of the genome with high population divergence or association with traits causing RI. However, depending on the frequency of recombination and density of markers, such genomic regions can still contain multiple, sometimes hundreds, of genes and regulatory elements. Such low resolution means that distinguishing effects of pleiotropy from those of tight genetic linkage of several genes is difficult [4]. Pleiotropy is relevant for speciation as it explains how multiple traits needed for RI can resist dissociation via recombination. In contrast, models of speciation via genetic linkage require genes to be first positioned correctly in a genome to coordinate their effects and recombination can still dissociate traits controlled by different genes. Accordingly, although pleiotropy and linkage might act similarly over short time scales, both mutation and recombination affect them differently over longer time periods [START_REF] Archambeault | Adaptation via pleiotropy and linkage: Association mapping reveals a complex genetic architecture within the stickleback Eda locus[END_REF].

Distinguishing pleiotropy from linkage is relevant in the "magic traits" concept [4,[START_REF] Archambeault | Adaptation via pleiotropy and linkage: Association mapping reveals a complex genetic architecture within the stickleback Eda locus[END_REF], where RI is generated as a pleiotropic by-product of divergent selection, and is thought to increase the chance of speciation-with-gene-flow [4]. A number of studies suggest putative examples, but very few achieve the genetic resolution to exclude linkage as an alternative [START_REF] Archambeault | Adaptation via pleiotropy and linkage: Association mapping reveals a complex genetic architecture within the stickleback Eda locus[END_REF].

Another classic hypothesis where a single gene enables speciation-with-gene-flow is the one-allele mating mechanism. In this model, RI is achieved in diverging populations via the spread of a single allele (e.g., an allele inducing preference for a self-referenced phenotype or an allele causing individuals to "stay where they were born") [4]. Investigating this concept requires finer mapping of putative RI loci than has been conducted to date. New gene-editing methods provide means to test the aforementioned hypotheses. For example, manipulating candidate loci with knockdown via a temporary suppression of its expression (RNAi or CRISPRa; Box1) or permanent gene knockout with the CRISPR/Cassystem has been shown to work successfully in a variety of organisms [START_REF] Sioud | RNA and CRISPR Interferences: Past, Present, and Future Perspectives[END_REF](Box1). This could be applied to determine if a locus affects one or more traits associated with RI or if different loci have discrete functionality (Fig. 1A).

Inversions

Chromosomal inversions are common and can be involved in local adaptation and speciation because they strongly suppress recombination among blocks of linked genes [START_REF] Faria | Evolving Inversions[END_REF].

For populations diverging-with-gene-flow, recombination suppression presents a powerful mechanism to allow selected and RI genes to be inherited together. Indeed, patterns of heterosis and Dobzhansky-Muller incompatibilities of genes linked by inversions could have important consequences on the likelihood of speciation [START_REF] Faria | Evolving Inversions[END_REF]. In addition, when inversions form, they generate new mutations at their breakpoints that could serve both as a source of genetic variation and a time stamp of the inversion's age. Thus, comparing the age of causal variants to breakpoint mutations could reveal if divergent alleles pre-date the inversion or accumulated after its formation.

Traditional methods, while useful for identifying inversions, are less helpful for resolving their causal genetic relationship to RI. Specifically, inversions suppress the recombination in hybrids that is needed to dissect how the multiple genes they can contain contribute and interact to generate RI (Fig. 1B). As inversions often contain dozens to hundreds of genes, studies of individual loci within inversions are not feasible. Excitingly, CRISPR/Cas9 has been used in both animal and plant models to experimentally create targeted and large inversions [e.g. 8]. In principle, such precise inversion engineering could also be used to reverse an existing inversion. Genetic crossing using this genetically produced "reverted" locus could then be used to create recombinants with a non-inverted variant, thus allowing fine-mapping of traits and their causal loci across the inversion (Fig. 1B). Once the causal variants are identified, their age and their relationships within the inversion could be determined.

Genes in a genomic context

Above, we discussed how genetic modification methods can used to explore the role of pleiotropy and linkage in RI evolution, however, it could also be used to investigate how genes function in new genomic contexts (i.e., different genetic backgrounds). For instance, genetic modification could be used to test how hybrid dysfunction evolves during speciation; this often involves negative epistatic interactions between genes. Quantifying the strength of epistasis could help validate classical theoretical concepts that remain poorly empirically supported, such as the snowball theory of hybrid incompatibility [START_REF] Wolf | Making sense of genomic islands of differentiation in light of speciation[END_REF], and lead to interesting new routes of research via systems biology approaches [START_REF] Tavassoly | Systems biology primer: The basic methods and approaches[END_REF].

Previously, hybrid dysfunction has proved to be difficult to study because of the numerous gene-gene interactions possible and the multilevel nature of genes-to-phenotype expression. However, making controlled genetic knock-ins (Box1) to swap divergent genes between populations (or knock-outs, in case of gene duplication) could be a first step towards exploring how epistasis in diverging loci functions and evolves. For example, gene knock-ins could be used to quantify exactly how much epistasis results from a specific number of controlled allele swaps. This could provide important extensions to existing results that assume only pairwise gene interactions, likely an underestimation of reality. Knock-ins of candidate RI genes into otherwise identical genomes could also be a way to precisely explore the role of selection in speciation. Such "common genome experiments" could help, for example, distinguish ecological from mutation order speciation [START_REF] Campbell | What is Speciation Genomics? The roles of ecology, gene flow, and genomic architecture in the formation of species[END_REF]. In addition, a critical question concerns how different selected genes may become "coupled" together to accentuate their consequences for RI, accelerating rates of divergence [START_REF] Wolf | Making sense of genomic islands of differentiation in light of speciation[END_REF][START_REF] Butlin | Coupling, reinforcement, and speciation[END_REF].

Knock-ins and knock-outs of candidate RI genes for taxa at various stages of divergence or of different degrees of hybrid ancestry could aid in studying the coupling process and its role in speciation. Notably manipulation of genome structure itself, controlling for gene content, has been shown to cause RI [START_REF] Yadav | Centromere scission drives chromosome shuffling and reproductive isolation[END_REF], demonstrating the need to also consider the structural genetic contexts behind speciation.

Engineering holistic approaches

Advancements in science are often achieved by matching new technology with novel or classic ideas. In this context, now may be a moment when speciation research can be moved forward by cutting-edge molecular methods. However, one should keep in mind that no gene exists in isolation, and while describing the functionality of individual genes is essential, it is important to address how genes evolve in their genomic contexts. Therefore, we expect the future of speciation research to be increasingly holistic and incorporate systems biology approaches, where functional gene manipulation methods could be an important key to unlocking new discoveries and answering seminal questions about the origins of biodiversity.

Box1. Functional genetics manipulation methods

RNA interference

RNA interference (RNAi) is an antiviral eukaryotic cell pathway that after recognizing dsRNA in the cytoplasm, targets and digests the corresponding mRNA strand, therefore temporarily knocking down the gene expression [START_REF] Sioud | RNA and CRISPR Interferences: Past, Present, and Future Perspectives[END_REF]. It is used as a molecular method to alter gene expression by injecting RNA molecules into organisms to neutralize complementary targeted mRNA molecules. RNAi silencing machinery is present in many, though not all, eukaryotic organisms. Major advantages of using RNAi in evolutionary biology applications are: 1) the possibility of studying the functions of essential genes when knock-out causes lethality, and 2) application to study species which are difficult to work with at the embryonic (egg) stage, a prerequisite for some alternative methods (including those discussed below).

CRISPR/Cas9 gene editing

CRISPR/Cas9 is a genome engineering tool adopted from the bacterial immune system which consists of a guide RNA and Cas9 protein (recent ongoing developments utilize various Cas proteins), capable of cleaving double-strand breaks (DSB) at the specified target sites. The produced genetic changes are heritable if they occur in the germline. CRISPR/Cas9 editing toolbox has been used for gene (or nucleotide) insertion and deletion, structural changes, replacement of the genes, precise nucleotide editing and gene regulation (Figure I) [START_REF] Doudna | The promise and challenge of therapeutic genome editing[END_REF].

Figure I. Gene editing toolboxFigure 1 .

 1 Figure I. Gene editing toolbox

Acknowledgements

This work was funded by a grant from the European Research Council (EE-Dynamics 770826, https://erc.europa.eu/).

Glossary

Chromosomal inversion: a structural rearrangement of DNA sequence where the inverted sequence is reversed relative to the collinear sequence.

Coupling: collective effects of different traits or factors involved in reproductive isolation, which strengthen the barrier to gene flow between the diverging populations.

Dobzhansky-Muller incompatibilities: negative epistatic interactions between different genes, often in hybrids.

Ecological speciation: evolution of RI between populations as a result of ecologicallybased divergent natural selection.

Epistasis: a phenomenon in which the effect of an allele at one locus is dependent on an allele (or alleles) at one or more other loci (i.e., a between-locus interaction). Genetic linkage: a non-random association of alleles at different loci. Also, a term used by classical geneticists to refer to genes that reside on the same chromosome.

Genome scans: method of comparison between populations/species across the genome to identify differentiated genetic regions across the genome.

Genome-wide association studies (GWAS): studies associating genotypic and phenotypic variation, generally using segregating natural genetic variation.

Heterosis: hybrid vigor, or a phenomenon of enhanced function of a trait in hybrids.

Indel: insertion or deletion of nucleotides in the genome sequence

Knockdown: artificial reduction of gene expression by blocking its transcription or breaking down mRNA.

Knock-in: artificial insertion of the nucleotide sequence into a genome.

Knock-out: artificial permanent deactivation of the gene with loss of its functionality.

Magic traits: a trait subject to divergent ecological adaptation which has a pleiotropic effect causing premating isolation.

Mutation order speciation: accumulation of different incompatible mutations in separate populations subject to the same selective regime.

-omics: fields of biology that names end in -omics and that aim to collect large data sets of biological molecules that translate into the structure, function, and dynamics of an organism. Examples include genomics, transcriptomics, proteomics or metabolomics.

One-allele mating mechanism: a scenario when RI forms due to the same allele spreading in both diverging populations (e.g., a single allele that induces assortative mating with a self-referenced phenotype).

Pleiotropy: a phenomenon when a gene affects more than one phenotype.

Quantitative trait loci (QTL) mapping: a statistical method of associating genetic and phenotypic variation via establishing sets of recombinants via genetic crosses.

Reproductive isolation (RI): genetically-based barriers to gene flow between populations/species.

Snowball theory: a speciation theory predicting that number of genetic incompatibilities that reduce hybrid fitness grows at a faster than linear rate over time (i.e., snowballs).