Chloé Bost
email: bost.c@chu-toulouse.fr

Teoli Jordan
email: jordan.teoli@chu-lyon.fr

Dechomet Magali
email: magali.dechomet@chu-lyon.fr

Fortenfant Françoise
email: fortenfant.f@chu-toulouse.fr

Fabien Nicole
email: nicole.fabien@chu-lyon.fr

Bost Chloé

Dr Nicole Fabien

Anti-ZnT8 autoantibodies: A new marker to be screened in patients with anti-adrenal antibodies

de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.

Introduction

Patients with autoimmune Addison's disease (AAD) have higher susceptibility to develop other autoimmune diseases. Thus, along with the classical markers of AAD (anti-adrenal cortex (ACA) or anti-21-hydroxylase (21-OH) autoantibodies) these patients often display other non-adrenal autoantibodies with a prevalence that could reach 88% [START_REF] Betterle | Autoimmune addison's disease[END_REF][START_REF] Betterle | Addison's disease: A survey on 633 patients in Padova[END_REF][START_REF] Betterle | Epidemiology, pathogenesis, and diagnosis of Addison's disease in adults[END_REF]. Among these non-adrenal autoantibodies, anti-insulin (IAA), anti-insulinoma-associated protein 2 (IA-2A) and anti-glutamic acid decarboxylase (GADA) autoantibodies detected in type 1 diabetes (T1D), have been found in 10% of AAD patients [START_REF] Betterle | Addison's disease: A survey on 633 patients in Padova[END_REF][START_REF] Fichna | Positive autoantibodies to ZnT8 indicate elevated risk for additional autoimmune conditions in patients with Addison's disease[END_REF]. The more recent described autoantibodies in T1D, anti-Zinc transporter 8 protein antibodies (ZnT8A), are present in both juvenile-onset and adult-onset T1D. They are considered to be important biomarkers for predicting the clinical onset of this autoimmune disease especially as they are found in 18 to 30 percent of T1D patients without any other autoantibodies [START_REF] Lampasona | Diabetes antibody standardization program: First proficiency evaluation of assays for autoantibodies to zinc transporter 8[END_REF][START_REF] Lampasona | Zinc transporter 8 antibodies complement GAD and IA-2 antibodies in the identification and characterization of adult-onset autoimmune diabetes: Non Insulin Requiring Autoimmune Diabetes (NIRAD) 4[END_REF][START_REF] Wenzlau | Novel diabetes autoantibodies and prediction of type 1 diabetes[END_REF][START_REF] Wenzlau | SlC30A8 is a major target of humoral autoimmunity in type 1 diabetes and a predictive marker in prediabetes[END_REF]. Among the wellestablished T1D associated autoantibodies, ZnT8A and AAD association is the least studied [START_REF] Betterle | Addison's disease: A survey on 633 patients in Padova[END_REF][START_REF] Fichna | Positive autoantibodies to ZnT8 indicate elevated risk for additional autoimmune conditions in patients with Addison's disease[END_REF][START_REF] Erichsen | Clinical, immunological, and genetic features of autoimmune primary adrenal insufficiency: Observations from a Norwegian registry[END_REF]. Moreover, the ZnT8 protein was found in rat adrenal glands [START_REF] Murgia | Diabeteslinked zinc transporter ZnT8 is a homodimeric protein expressed by distinct rodent endocrine cell types in the pancreas and other glands[END_REF], thus ZnT8A could also be a biomarker of autoimmunity pathogenesis against adrenal tissue.

As T1D is frequently associated with AAD and since ZnT8A are rarely studied in AAD patients, the aim of the present study is to evaluate the prevalence of ZnT8A in patients with positive ACA in order to define the usefulness of ZnT8A for prediabetes screening in AAD.

Material and Methods

Patients

The presence of ZnT8A was investigated in 36 patients positive for ACA from 2 different French hospitals (12 were from Toulouse University Hospital and 24 from Hospices Civils of Lyon). Twenty-six women and 10 men were included of which 19 were children (<18 years). The sera of these patients have been obtained between 2001 and 2019 and kept frozen at -20°C in the immunological laboratories of the 2 hospitals.

Clinical diagnosis was obtained for all patients. Autoimmune Addison's disease was diagnosed according to SFE/SFEDP adrenal insufficiency French consensus criteria [START_REF] Reznik | SFE/SFEDP adrenal insufficiency French consensus: Introduction and handbook Consensus sur l'insuffisance surrénale de la SFE/SFEDP : introduction et guide[END_REF]. Autoimmune Addison's disease was defined by the presence of ACA associated with a panel of non-specific (except melanodermia) clinical signs and symptoms of hypoadrenalism, with low plasma cortisol and increased ACTH levels at 8am and/or an insufficient increase of plasma cortisol after synacthen administration [START_REF] Reznik | SFE/SFEDP adrenal insufficiency French consensus: Introduction and handbook Consensus sur l'insuffisance surrénale de la SFE/SFEDP : introduction et guide[END_REF][START_REF] Bornstein | Diagnosis and treatment of primary adrenal insufficiency: An endocrine society clinical practice guideline[END_REF][START_REF] Husebye | Consensus statement on the diagnosis, treatment and follow-up of patients with primary adrenal insufficiency[END_REF]. Type 1 diabetes was determined by the original clinician according to the latest American Diabetes Association diagnostic criteria recommendations [START_REF]Classification and diagnosis of diabetes: Standards of medical care in diabetes -2019[END_REF] i.e, the presence of multiple autoantibodies with or without hyperglycemia (stage 2 and 3).

Observational studies conducted in France using data obtained from a retrospective study without any additional therapeutic or monitoring procedure do not require informed consent. This was the case herein as autoantibodies were analyzed as part of diagnostic investigation.

Patient records and information was anonymized and de-identified prior to analysis. The study was approved by the institutional review board and the ethics committee of the Hospices Civils de Lyon and the ethic committee of Southwest and overseas II.

Anti-adrenal cortex autoantibodies detection

The presence of ACA has been analyzed using indirect immunofluorescence technique on primate adrenal tissue (INOVA Lite Adrenal primate IFA, Werfen, Le Pré-Saint-Gervais, France) according to the manufacturer's recommendations (Figure 1).

As the main target of ACA has been described to be 21-OH [START_REF] Winqvist | Kämpe, 21-Hydroxylase, a major autoantigen in idiopathic Addison's disease[END_REF][START_REF] Colls | Immunoprecipitation assay for autoantibodies to steroid 21-hydroxylase in autoimmune adrenal diseases[END_REF], 22 out of 24 patients from Hospices Civils of Lyon were also analyzed for anti-21-OH autoantibodies in the initial diagnostic investigation using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique (21-OH-AB ELISA, RSR, Cardiff; United Kingdom) or a radio-immunological assay (RIA) (21-OH-AB, RSR, Cardiff; United Kingdom); the cut-off for positivity was chosen according to the manufacturer's recommendations at 0.4 U/mL or 1.1 U/mL respectively. The 2 techniques have been shown to give comparable sensitivity with 87% of concordance on 30 patients in Lyon immunological laboratory (personal data not shown).

Anti-ZnT8 autoantibodies detection

ZnT8A were analyzed using 2 ELISA techniques (ZnT8/96D Elisa, RSR, Cardiff, United Kingdom or Medizym®, Medipan, Dahlewitz, Germany). The cut-off for positivity was chosen according to the manufacturer's recommendations at ≥15 IU/ml in both assays. These two ELISA tests have been compared in Toulouse immunological laboratory and showed the same performance on 32 patients with 100% of concordance between the 2 assays (personal data not shown).

Anti-IA2 and anti-GAD autoantibodies detection assays

In 22 patients, IA-2A and GADA were also analyzed at the time of diagnosis or retrospectively when testing for ZnT8A. IA-2A were detected using 2 ELISA kits (ELISA RSR IA-2 Ab, Cardiff, United Kingdom and Medizym®, Medipan, Dahlewitz, Germany).

The cut-off for positivity was chosen according to the manufacturer's recommendations at ≥7.5 U/mL or ≥10 U/mL, respectively. For GADA detection, 2 ELISA kits were used (ELISA RSR GADAb, RSR, Cardiff, United Kingdom and Medizym® anti GAD, Medipan, Dahlewitz, Germany) with the same cut-off of positivity at ≥5 U/mL. The 2 techniques for both IA2A and GADA antibodies have been shown to give comparable sensitivity and specificity according to the results of Diabetes Antibody Standardization Program [START_REF] Törn | Diabetes Antibody Standardization Program: Evaluation of assays for autoantibodies to glutamic acid decarboxylase and islet antigen-2[END_REF]. When IA-2A and GADA were explored at time of diagnosis a radioimmunoassay could have been employed (cut off positivity at ≥30cpm) (1 patient).

Statistical analysis

All data are reported as the means ± sem. Sex of patients involved in this study are indicated in the tables but are not included in statistical analysis of the data. Comparisons between groups were performed using Wilcoxon rank sum test or two-sided Fisher's Exact test as appropriate. A p-value <0.05 was considered significant. All data were analyzed using the R software (v3.6.3).

Results

Clinical data and anti-adrenal cortex autoantibodies

The cohort included a total of 36 patients (19 children and 17 adults) with an average age of 21.6 years (mean  sem: 21.6  years) Thirty-one of 36 patients displaying ACA were diagnosed to suffer from AAD. Most of them were newly diagnosed; indeed the mean time between AAD diagnosis and ZnT8A detection was 1.7 years (median of 2 months). Among the 36 positive ACA patients, 22 patients were analyzed for anti-21-OH autoantibodies and were all positive for these autoantibodies (16 using RIA, mean  sem: 959,6  534,7 and 6 using ELISA, mean  sem : 71,715,7 U/mL).

For 5 out of 36 patients, Addison's disease diagnosis was not retained; there were 4 children (10, 12, 14 and 15-years-old) and 1 young adult (26 years-old). All 5 patients had other autoimmune disorders: 3 T1D (with one of them associated with ZnT8A and anti-TPO autoantibodies, and one of them associated with only ZnT8A) and 2 hypoparathyroidisms (with one suffering of an autoimmune polyendrocrine syndrome (APS) type 1). Three of these 5 patients displayed anti-21-OH autoantibodies with significant titers above the cut-off of positivity (31 and >100 U/mL using ELISA and 17 U/mL using RIA). Data on anti-21-OH autoantibodies titers for the remained 2 patients were not available.

Concerning T1D status, 27.8% (10 patients out of 36) and 22.6% (7 patients out of 31) within positive ACA patients and AAD cohort suffered from T1D respectively (Table 1, Figure 2) .

Prevalence of ZnT8A

Seven (4 children and 3 adults) of 36 patients (19.4%) had ZnT8A (Table 1). ZnT8A was observed in 5 patients out of 31 with AAD (16.1%) and in 2 patients out of 5 with no AAD (40.0%) (Figure 2) but no statistically significant difference was noticed in prevalence of ZnT8A in AAD versus no AAD patients (p-value = 0.244). Among the 7 positive ZnT8 patients, 71.4% (3 children, 2 adults) suffered from T1D at the time of ZnT8A detection (Table 1, Figure 2). The titers of ZnT8A, when positive, were higher for the T1D patients but there was no statistical difference when compared with patients with no T1D (mean  sem : 348.84 U/mL 170.8, n=5 versus 33.5 U/mL  2.5, n=2, p-value = 0.381 with Wilcoxon rank sum test).

The frequency of T1D was significantly different between patients with positive ZnT8A versus patients with negative ZnT8A (71.4% vs 17.2%, p-value = 0.010) (Table 1).

Characteristics regarding ZnT8A frequency, ZnT8A titer and T1D association were the same in both children and adult population (Table 2).

Concerning the frequency of autoimmune diseases associated with positive ACA other than T1D alone, the differences were not statistically significant (42.9% vs 44.8%) (Table 1).

Anti-IA2 and anti-GAD autoantibodies

Twenty two AAD patients were tested for all the T1D associated autoantibodies. Ten patients were positive for one or more autoantibodies and 5 (22.7%), 9 (40.9%) and 2 (9.1%) of them had ZnT8A, GADA and IA-2A respectively. Two patients positive for GADA and IA-2A were also positive for ZnT8A and they suffered from a T1D. Five patients (3 with T1D, one presenting an APS type 1 and one with anti-TPO and anti-TG antibodies) present only GADA. One positive ZnT8A patient (165.1 U/mL) had positive GADA (3667 cpm) but with no IA-2A and had a T1D and anti-TPO. One positive ZnT8A patient (97.5 U/mL) was weakly positive for GADA (5.8 U/mL) but with no IA-2A

(1.4 U/mL) and had a T1D. One positive ZnT8A (31.0 U/mL) patient had neither GADA (1.0 U/mL) nor IA-2A (1.4 U/mL) and did not suffer from a T1D despite having an AAD evolving for 13 years at the time of the sample collection integrating into an APS type 1. Clinicians continue to monitor his glycaemia due to his young age and ZnT8A status.

Twelve patients were negative for all of ZnT8A, GADA and IA-2A; among them only one patient suffered from a T1D.

Discussion

This study confirmed that ZnT8A are present in patients suffering from AAD in both children and adults with an overall prevalence of 19% of the patients tested herein. The presence of ZnT8A in AAD has been demonstrated in other cohorts [START_REF] Fichna | Positive autoantibodies to ZnT8 indicate elevated risk for additional autoimmune conditions in patients with Addison's disease[END_REF][START_REF] Wenzlau | The cation efflux transporter ZnT8 (Slc30A8) is a major autoantigen in human type 1 diabetes[END_REF] although the prevalence was lower with 8% in both studies. It is important to note that the sensitivity of autoantibodies in general varies among reports and this may be mainly explained by differences in the populations studied in terms of age and duration of the disease. An important part of the variation may also be related to the choice of the analytical test for ZnT8A since several ELISA techniques exist; however, this is not the case since all the ELISA techniques have been shown to give comparable performances according to the results of Diabetes Antibody Standardization Program [START_REF] Törn | Diabetes Antibody Standardization Program: Evaluation of assays for autoantibodies to glutamic acid decarboxylase and islet antigen-2[END_REF] and personal data.

The frequency of T1D in our AAD cohort reached 22.6% which is higher than reported in previous studies (ranging from 1.2% to 13% in more recent studies [START_REF] Betterle | Addison's disease: A survey on 633 patients in Padova[END_REF][START_REF] Fichna | Positive autoantibodies to ZnT8 indicate elevated risk for additional autoimmune conditions in patients with Addison's disease[END_REF][START_REF] Erichsen | Clinical, immunological, and genetic features of autoimmune primary adrenal insufficiency: Observations from a Norwegian registry[END_REF][START_REF] Leelarathna | Co-morbidities, management and clinical outcome of auto-immune Addison's disease[END_REF][START_REF] Zelissen | Associated autoimmunity in addison's disease[END_REF]). An interesting issue arising from the present study, which could explain the higher frequency of T1D, is the difference in the population studied particularly the importance of the children population making up more than 50% of our cohort. To the best of our knowledge, the only large AAD cohort reported included few children and did not differentiate them in data interpretation [START_REF] Fichna | Positive autoantibodies to ZnT8 indicate elevated risk for additional autoimmune conditions in patients with Addison's disease[END_REF]. The mean age of 22 years is lower in comparison with other studies with a mean age between 30 and 50 years. The evolution of diagnostic criteria according to the American Diabetes Association classification could also contribute to the higher proportion of T1D observed in our study. Indeed the recent inclusion of latent autoimmune diabetes in adults in T1D [START_REF]Classification and diagnosis of diabetes: Standards of medical care in diabetes -2019[END_REF] and the inclusion of diabetes autoantibodies positivity in diagnostic criteria has modified diabetes classified as T1D and can explain the higher number of T1D patients in comparison to the literature.

The prevalence of ZnT8A has been found to be correlated with the age of diabetes onset in the literature. Anti-ZnT8 autoantibodies seemed to be better markers at diabetes onset between 6 to 17 years of age in comparison with patients of less than 5 years-old and adults [START_REF] Marchand | Very high titres of ZnT8 autoantibodies at type 1 diabetes onset and presence of autoantibodies related to other autoimmune disorders[END_REF][START_REF] Niechcial | Autoantibodies against zinc transporter 8 are related to age and metabolic state in patients with newly diagnosed autoimmune diabetes[END_REF]. This has also been found in other cohorts of patients showing a high prevalence of ZnT8A positive patients between 8-16 years and 10-19 years [START_REF] Salonen | Autoantibodies against zinc transporter 8 are related to age, metabolic state and HLA DR genotype in children with newly diagnosed type 1 diabetes[END_REF][START_REF] Juusola | Positivity for Zinc Transporter 8 Autoantibodies at Diagnosis Is Subsequently Associated with Reduced b-Cell Function and Higher Exogenous Insulin Requirement in Children and Adolescents with Type 1 Diabetes[END_REF][START_REF] Hussein | Zinc transporter 8 autoantibodies assessment in daily practice[END_REF]. We, thus, investigated the age of ZnT8A positive patients but we did not find any statistical difference in comparison with the negative cohort.

Neither age nor sex seemed to influence the frequency of T1D association or ZnT8A positivity in positive ACA patients. This is of particular interest if we take into account that highest prevalence of ZnT8A are mainly reported in T1D children [START_REF] Garnier | Screening of ZnT8 autoantibodies in the diagnosis of autoimmune diabetes in a large French cohort[END_REF]. However, our cohort is too small to reach conclusions with a statistical power.

In ZnT8A-positive patients, we observed a titer about 10 times higher in T1D patients versus no T1D patients. Indeed it was already reported that, at onset of T1D, a high proportion of children who present autoantibodies related to other autoimmune diseases have a very high ZnT8A titer [START_REF] Marchand | Very high titres of ZnT8 autoantibodies at type 1 diabetes onset and presence of autoantibodies related to other autoimmune disorders[END_REF].

In our cohort, most patients with positive ZnT8A had IA-2A and/or GADA and suffered from a T1D. Two patients had ZnT8A with no other autoantibodies or with a low titer of GADA. One of these 2 patients already had T1D, but the remaining patient had to be followed.

Our data also indicate that positive ZnT8A are associated with coexisting T1D in more than 70% of our patients and that by consequence 30% of the population with positive ZnT8A did not suffer from T1D at the time of the study.

The zinc transporter 8 localized on the membrane of insulin containing secretory granules plays an essential role in biosynthesis, storage and release of insulin [START_REF] Seve | In silico identification and expression of SLC30 family genes: An expressed sequence tag data mining strategy for the characterization of zinc transporters' tissue expression[END_REF][START_REF] Chimienti | In vivo expression and functional characterization of the zinc transporter ZnT8 in glucose-induced insulin secretion[END_REF][START_REF] Kambe | Molecular Architecture and Function of ZnT Transporters[END_REF]. A previous report also showed an expression of this protein in rat adrenal endocrine cells [START_REF] Murgia | Diabeteslinked zinc transporter ZnT8 is a homodimeric protein expressed by distinct rodent endocrine cell types in the pancreas and other glands[END_REF]. Therefore, ZnT8A could be a marker of autoimmunity associated to the adrenal gland destruction in AAD, with no development of T1D; a similar event was reported with GADA in some type 1 APS [START_REF] Betterle | Addison's disease: A survey on 633 patients in Padova[END_REF][START_REF] Gylling | Beta-Cell Autoantibodies, Human Leukocyte Antigen II Alleles, and Type 1 Diabetes in Autoimmune Polyendocrinopathy-Candidiasis-Ectodermal Dystrophy[END_REF][START_REF] Söderbergh | Prevalence and Clinical Associations of 10 Defined Autoantibodies in Autoimmune Polyendocrine Syndrome Type I[END_REF]. However, since humoral autoreactivity to ZnT8 has been demonstrated to be an independent marker of disease susceptibility in pre-diabetic patients and associated with faster development of T1D, one third of patients with no T1D have to be followed due to the potential risk of developing T1D [START_REF] Kawasaki | ZnT8 and type 1 diabetes[END_REF].

Other autoimmune disorders classically associated with AAD were present in our cohort.

Autoimmune thyroid disorders were present in 25% of the cases, in lower proportion than already reported [START_REF] Betterle | Addison's disease: A survey on 633 patients in Padova[END_REF][START_REF] Erichsen | Clinical, immunological, and genetic features of autoimmune primary adrenal insufficiency: Observations from a Norwegian registry[END_REF][START_REF] Leelarathna | Co-morbidities, management and clinical outcome of auto-immune Addison's disease[END_REF], certainly due to the age of our patients. Parathyroid disorders or APS were present in 11% of the cases. The frequency of associated autoimmune disorders is higher, although not significantly, in AAD patients with ZnT8A than in patients with no ZnT8A. However, this trend was no longer observed when T1D patients without other associated autoimmune disorders were excluded suggesting that T1D represents the main associated autoimmune disease in ZnT8A-positive AAD patients, as reported in a previous report [START_REF] Fichna | Positive autoantibodies to ZnT8 indicate elevated risk for additional autoimmune conditions in patients with Addison's disease[END_REF].

More than ninety percent of patients with AAD develop anti-21-OH autoantibodies [START_REF] Proust-Lemoine | Group 3: Strategies for identifying the cause of adrenal insufficiency: diagnostic algorithms[END_REF].

In our study, 3 patients with positive anti-21-OH autoantibodies showed no AAD. Those patients were young and should be followed as their titers of anti-21-OH autoantibodies are high and can thus be predictive for the development of AAD [START_REF] Falorni | 21-hydroxylase autoantibodies in adult patients with endocrine autoimmune diseases are highly specific for Addison's disease[END_REF][START_REF] Laureti | Levels of adrenocortical autoantibodies correlate with the degree of adrenal dysfunction in subjects with preclinical Addison's disease[END_REF].

In light of these data and as the onsite implementation of ZnT8A monitoring in the clinical practice for T1D, it should also be included in the screening panel of AAD population. This finding is of importance for clinicians as the presence of ZnT8A can identify subjects at high risk to develop T1D. Further investigation of the role of ZnT8A in AAD with no T1D has also to be performed.

Figure 1 :

 1 Figure 1: Anti-adrenal cortex autoantibodies positive sample detected by indirect

Figure 2 :

 2 Figure 2: Flowchart according to the presence of autoimmune Addison's disease, ZnT8A and

Table 1 :

 1 Comparison between the ZnT8A-positive and ZnT8A-negative group among positive anti adrenal cortex autoantibodies patients (mean± sem or effective (percentage of patients).

	ZnT8A-positive group	ZnT8A-negative group	P-value
	Patients' characteristics

Table 2 :

 2 Comparison of children and adult populations, with positive ZnT8A status (mean± sem or effective (percentage of patients)).

		Children <18 years (n=19)	Adults ≥ 18 years (n=17)
		ZnT8A-	ZnT8A-	ZnT8A-	ZnT8A-	P-value †
		positive group	negative group	positive group	negative group
		Patients' characteristics
	n	4 (21.1%)	15 (78.9%)	3 (17.6%)	14 (82.4%)	1.000
	Sex (women/men)	3/1	11/4	2/1	10/4	1.000
	Age (years) at ZnT8A dosage	12.0 ± 2.1	11.9 ± 0.9	28.7 ± 1.5	33.3 ± 3.8	NA
	ZnT8A titer (U/mL)	181.7 ± 110.7	5.3 ± 1.0	361.5 ± 295.2	2.2 ± 0.5	0.629
		Auto-immune diseases
	Addison disease diagnosis at time of ZnT8A dosage	2 (50.0%)	13 (86.7%)	3 (100.0%)	13 (92.9%)	0.429
	Total T1D	3 (75.0%)	3 (20.0%)	2 (66.7%)	2 (14.3%)	1.000
	Total autoimmune disorders associated or not with AAD:	4 (100.0%)	10 (66.7%)	2 (66.7%)	8 (57.1%)	0.429
	T1D alone with or without AAD	2	3	1	2
	Other autoimmune disorders	2 hypothyroidism) (whose 1 T1D +	7	hypothyroidism) + 1 (whose 1 T1D	6

Without other autoimmune disorders associated with AAD 0 (0.0%) 5 (33.3%) 1 (33.3%) 6 (42.9%) 0

  .429 † P-values concerning comparison between ZnT8A-positive group in children versus ZnT8Apositive group in adults.

AAD : autoimmune Addison's disease ; NA: not applicable T1D: type 1 diabetes ; ZnT8A : zinc transporter type 8 autoantibodies.

Acknowledgments

We gratefully acknowledge the patients and the contributions made by the clinicians of the 2 hospitals for the clinical and biological data and especially Prs. M. Nicolino, F. Borson-Chazot, C. Simon, Drs N. Bendelac, F. Tixier, P. Bretones, S. Reffet, L. Parlant-Pinet, J. Vouillarmet, M. Moret, L. Parlant-Pinet, A. Brac-De-La-Perriere (Hospices Civils de Lyon), T.Tabary, S. François, A.Berger, D. Fellmann, E. Comby (Reims, Dijon, Strasbourg, Caen) and A. Bennet, J. Martini (Toulouse University Hospital). We also thank Immunobiotec, CRBSUD, Hospices Civils de Lyon BB003300046 and A. Astier (CPTP research center, Toulouse) for reading the manuscript.

Funding information:

The author received no specific funding for this work.


Dominique Sabouraud-Leclerc

S Bentrad

C Brocart

S Collin

C Pietrement

Cas clinique et revue de la littérature Pea anaphylaxis Clinical case and review

Keywords: allergie alimentaire, anaphylaxie, légumineuses, pois food allergy, anaphylaxis, leguminous plants, peas

de la littérature

Pea anaphylaxis

A clinical case and literature review Résumé Nous décrivons le cas d'un nourrisson de 7 mois ayant présenté une anaphylaxie sévère, de stade 5, à la suite de la consommation de protéines de pois dans un petit pot de légumes. Cette observation illustre la difficulté de reconnaître l'anaphylaxie chez le nourrisson et permet une mise au point sur l'allergie au pois et les risques liés à l'utilisation accrue dans l'alimentation des protéines de pois.

Introduction.

Nous présentons un cas d'anaphylaxie sévère du nourrisson du à des protéines de pois et confondu initialement avec un état de mal convulsif. Ce cas souligne la gravité potentielle de l'allergie aux protéines de pois et la difficulté de reconnaître l'anaphylaxie chez le nourrisson. Le pois devrait être considéré comme un allergène émergent et faire partie de la liste des allergènes à déclaration obligatoire en raison de son utilisation croissante dans l'industrie agro-alimentaire et des risques d'anaphylaxie auxquels il expose.

Cas clinique

Ambre, âgée de 7 mois, présente une gêne respiratoire d'apparition immédiate associée à un oedème des lèvres après prise de 3 cuillères à café d'un petit pot de « légumes verts » contenant également du poulet, des petits pois et des courgettes. L'enfant n'émet plus aucun son : les parents la décrivent comme « présentant un blocage respiratoire ». Apparait ensuite une révulsion oculaire puis l'enfant perd connaissance. Le SAMU est appelé, et arrive au bout de 10 minutes : l'enfant n'est toujours pas consciente. Le médecin diagnostique une « convulsion tonique », il n'y a pas de clonies. Elle bénéficie d'une injection intra-rectale de Valium®, puis 10 minutes après de Rivotril et de Prodilantin® par voie intra-osseuse. Cette « crise » cède au bout de 40 minutes à la fin de l'injection de Prodilantin®. Il n'y a pas de notion de fièvre, ni de traumatisme, ni de prise de toxiques. Elle est alors transférée de Troyes au service de réanimation pédiatrique du CHU de Reims où elle arrive parfaitement consciente avec des constantes hémodynamiques normales. Elle bénéficie dans un premier temps d'un bilan neurologique exhaustif avec ponction lombaire, électro-encéphalogramme, IRM cérébrale, recherche de toxiques et de maladie métabolique. L'ensemble de ces examens est négatif.

La reprise de l'interrogatoire des parents montre : i)l'association d'une gêne respiratoire (avec oedème aigu laryngé probable puisque l'enfant n'avait plus de voix), à un oedème des lèvres et une urticaire du cou d'apparition immédiate suite à la prise du petit pot, association évocatrice d'anaphylaxie ii) le type des symptômes (il n'existe pas de convulsion « tonique » à cet âge de la vie). Cela permet de réorienter le diagnostic vers une anaphylaxie de stade 5 avec perte de connaissance, signes cutanés et détresse respiratoire et cela d'autant plus que, une semaine auparavant, l'enfant avait consommé un petit pot contenant des pois avec apparition immédiate d'une urticaire généralisée, régressive en quelques heures.

Le père et la mère présentent un asthme allergique et de l'eczéma. Ambre est une première enfant, née au terme d'une grossesse normale. Elle n'a pas été allaitée, quelques coliques du nourrisson. Un eczéma sévère est apparu dès l'âge de 1 mois sur peau sèche, persistant et très probablement insuffisamment traité. La diversification alimentaire a commencé à l'âge de 4 mois, l'enfant tolère le blé, elle a déjà mangé des oeufs dans des biscuits, léché des Curlys sans réaction, a déjà goûté du Nutella, mangé des haricots verts sans problème. Elle n'a pas encore eu de lentilles, ni d'autres fruits à coque. L'interrogatoire repère des éternuements fréquents, un prurit oculaire qui peuvent faire évoquer une rhino-conjonctivite allergique. Aucun signe d'hyper réactivité bronchique, pas d'antécédents de bronchiolite. Nous avons réalisé des tests cutanés. Ceux-ci sont négatifs pour le soja, les pois, les lentilles, l'arachide, le poulet, les courgettes, la morue. Ils sont discrètement positifs pour le blanc et le jaune d'oeuf, négatifs pour les acariens, poils de chat, pollens de graminées avec un témoin positif histamine à 4 mn Le dosage des IgE sériques spécifiques (IgEs) est positif pour les protéines de pois (4,42 UA/ml) et les lentilles (8,65 UA/ml). Il n'y a pas d'IgEs vis-à-vis du soja et de ses recombinants. Des IgEs sont présentes (0,5 UA/ml) vis-à-vis de l'arachide mais pas de ses allergènes recombinants (h1, h2, h3 et h6). , dont 314 cas vis-à-vis de légumineuses chez les individus âgés moins de 18 ans (sur un total de 457 cas). Chez l'enfant, les pois ne constituent que 9 cas d'anaphylaxie alimentaire (5 fois pour le petit pois, 3 fois pour le pois blond, 1 fois pour le pois-chiche), soit 0,4% de l'ensemble des cas. Cela représente 2,9% de l'ensemble des légumineuses chez les moins de 18 ans (314 cas dont l'arachide (245 cas), le soja (20 cas), le lupin (16 cas), les 16 lentilles (16 cas), les fèves (3 cas), le fénugrec (3 cas) et le haricot blanc (1 cas). Aucun enfant allergique au pois n'est âgé de moins de 1 an dans la série du RAV. Chez l'adulte, il n'y a que 2 cas d'allergie aux pois. Notre observation semble donc assez exceptionnelle du fait de l'âge de l'enfant, de sa gravité et de la difficulté à reconnaître l'anaphylaxie.

Pouessel et coll [3] ont étudié les caractéristiques des cas d'anaphylaxie alimentaire déclarés au RAV, entre 2002 et 2018 chez 61 nourrissons de moins d'un an, en les comparant aux 386 déclarations concernant des enfants de moins de 6 ans, pendant la même période. Chez ces 61 nourrissons, il existait des antécédents de dermatite atopique dans 31% des cas. Aucune déclaration ne concernait le pois (ni les lentilles). Le lait de vache (59%), l'oeuf de poule (20%), le blé (7%) étaient les premiers allergènes et l'arachide concernait 2 enfants (3% des cas). Pouessel et coll. (3), montraient que le mode de présentation de l'anaphylaxie était différent chez les nourrissons comparés aux enfants plus agés avec plus de symptômes cutanés et digestifs, suivis par des symptômes cardiovasculaires et neurologiques.

Dans cette étude, aucun nourrisson n'avait présenté de crise convulsive. Il existait 10 fois des signes neurologiques (cris persistants, agitation ou hypotonie) et 13 fois un choc anaphylactique dont 12 documentés par une chute de pression sanguine. On notait un blocage respiratoire 5 fois sous forme de dyspnée laryngée. Les auteurs soulignaient que les critères diagnostiques admis pour l'anaphylaxie ne sont probablement pas adaptés à cette tranche d'âge de la vie, comme l'indiquent d'autres publications [START_REF] Greenhawt | Guiding principles for the recognition, diagnosis, and management of infants with anaphylaxis: an expert panel consensus[END_REF]5].

Dans notre observation, l'anaphylaxie n'a pas été reconnue par les urgentistes et elle a été confondue avec une crise convulsive tonique. A cet égard, il n'existe pas de crise convulsive tonique à cet âge de la vie et une telle crise ne pourrait durer 40 minutes. L'enfant fut traité par anticonvulsivants par voie rectale puis par voie intra-osseuse ce qui nous fait penser qu'il était difficile de poser une voie veineuse, et par conséquent que l'enfant se trouvait probablement en état de choc. Si l'analyse de la fiche du SAMU donne peu d'informations, par contre, l'interrogatoire des parents, en reprenant précisément les symptômes, nous a permis rétrospectivement d'évoquer une anaphylaxie sévère, de grade 5 selon la classification d'Astier avec perte de connaissance et blocage respiratoire. Sur les constantes relevées par le SAMU, il est cependant difficile d'évoquer un choc anaphylactique (TA systolique supérieure à 70 mn de Hg mais augmentant de 2 points à l'arrivée en service de réanimation, pas de tachycardie franche, mais limite supérieure à 160). Par ailleurs, le blocage respiratoire est bien décrit par les parents mais pas objectivé par le médecin du SAMU qui évoque cependant un angio-oedème laryngé (avec saturation en oxygène conservée !) Goh et coll. [5] ont comparé les manifestations anaphylactiques d'une série de nourrissons (19 de moins de 2 ans) et d'enfants d'âge préscolaire (33 de 2 à 5 ans). Ils montrent que les symptômes cardiovasculaires sont moins fréquents chez les nourrissons et ils suggérent que les nourrissons s'adaptent mieux aux changements hémodynamiques, et qu'ils présentent des signes cardiovasculaires retardés et/ou moins importants.

La gravité du tableau clinique, chez cette enfant à terrain atopique net, après consommation de seulement 3 cuillères d'un petit pot de légumes est également très singulière. Pourquoi une telle réaction? Comment cette enfant a-t-elle été sensibilisée? On peut penser que son eczéma sévère, non contrôlé, a joué un rôle mais est-ce le seul responsable? Il faut aussi noter l'aggravation des symptômes en quelques jours, avec une dose plus faible de protéines (2 à 3 cuillères du petit pot) puisqu'elle avait présenté la semaine précédente une urticaire généralisée après la prise d'un petit pot de légumes entier contenant des petits pois.

Le pois appartient à la famille des Fabacées (ou légumineuses ou Papilionacées), au genre Pisum et à l'espèce Pisum sativum L. et à la sous-espèce Pisum sativum L. sativum. Il existe trois variétés principales de Pisum Sativum L. subsp. Sativum. La variété Arvense est représentée par le pois fourrager, utilisé en alimentation animale. La variété Sativum concerne le pois potager qu'on peut consommer sec : le pois jaune (angl. : dun pea) ou frais : le petit pois. La variété Macrocarpon est représentée par le pois mange-tout. Il existe plus de 170 variétés de pois potagers. Les variétés françaises, anglaises et allemandes ou « cultivars » regroupent le pois à écosser, le pois sans parchemin, le pois à grains ronds, les pois à grains ridés, les variétés à rames, demi-naines ou naines appelées aussi : « Serpette », « Corne de bélier », « pois de Clamart », « Pois de Marly », « Merveille d'Étampes », « Michaux de Nanterre », « pois Téléphone » etc… » [6]. Parmi les pois secs, il faut noter les pois cassés utilisés en soupe ou purée, mais aussi le pois jaune cultivé pour sa teneur élevée en protéines (pois protéagineux, plusieurs variétés dont les Finale, Solara, Yver, Angelus etc…). Le pois jaune a été introduit dans l'industrie agro-alimentaire dans les années 1980 dans le but de réduire l'importation massive du soja pour l'alimentation animale et humaine [START_REF] Richard | Cross-reactivity of a new food ingredient, dun pea, with legumes, and risk of anaphylaxis in legume allergic children[END_REF][START_REF] Dreyer | Consommation croissante d'aliments contenant du pois jaune : un risque d'allergie ?[END_REF]. La France est le premier pays producteur de pois protéagineux en Europe (exploitations situées dans le nord de la France, principalement en Picardie). La production continue d'augmenter en raison de la demande croissante d'aliments sans viande (véganisme, végétarisme).

Les deux allergènes majeurs identifiés dans le pois sont des globulines 7S, protéines de stockage à potentiel anaphylactique fort. Pis s 1 (50 kDa) appartient à la famille des vicilines tandis que Pis s 2 (64 kDa) appartient à la famille des convicilines. Ces 2 protéines partagent 65% d'homologie de séquence. Les autres allergènes sont Pis s 5 (profiline), Pis s 6 (PR10), Pis S3 (LTP), une albumine 2S et une agglutinine [6]. Pis s 1 partage 90% d'homologie avec Len c 1 (90%) de la lentille ce qui explique les sensibilisations et allergies croisées fréquemment observées; 52% avec Lup a 1 (52%) du lupin ; 52% avec Gly m 5 du soja ; 50% avec Ara h 1 de l'arachide. Pour Pis s 2, les homologies sont respectivement de 68%, 44%, 45% et 45% [START_REF] Richard | Cross-reactivity of a new food ingredient, dun pea, with legumes, and risk of anaphylaxis in legume allergic children[END_REF].

Bernhisel-Broadbent et Sampson [START_REF] Bernhisel-Broadbent | Cross-allergenicity in the legume botanical family in children with food hypersensitivity. II. Laboratory correlates[END_REF] ont montré, chez 62 enfants ayant une allergie à au moins une légumineuse, que 79 % avaient des IgEs à plus d'une légumineuse et que 37 % avaient des IgEs pour les 6 légumineuses étudiées [START_REF] Dreyer | Consommation croissante d'aliments contenant du pois jaune : un risque d'allergie ?[END_REF][START_REF] Bernhisel-Broadbent | Cross-allergenicity in the legume botanical family in children with food hypersensitivity. II. Laboratory correlates[END_REF]. Cette forte sensibilisation croisée entre les légumineuses, mise en évidence par les prick tests et le dosage des IgEs n'est cependant pas forcément corrélée à une allergie croisée [8, 9 ,10] et seul le test de réintroduction orale permet de confirmer ou non une allergie croisée [START_REF] Dreyer | Consommation croissante d'aliments contenant du pois jaune : un risque d'allergie ?[END_REF][START_REF] Ibáñez | Legume cross-reactivity[END_REF]. En Espagne, les légumineuses arrivent au 5 è rang des allergies alimentaires des enfants de moins de 5 ans [START_REF] Martinez | Clinical features of legume allergy in children from a Mediterranean area[END_REF]. Les allergies croisées y sont fréquentes tandis qu'aux USA et dans le reste de l'Europe, elles sont beaucoup plus rares [START_REF] San Ireneo | In vitro and in vivo cross-reactivity studies of legume allergy in a Mediterranean population[END_REF]. L'allergénicité du pois augmente avec le stade de maturation de la graine [START_REF] Dreyer | Consommation croissante d'aliments contenant du pois jaune : un risque d'allergie ?[END_REF]. Le petit pois est cueilli immature alors que le pois jaune l'est à maturité. Le petit pois contient environ 8% de protéines. Elles sont plus labiles à la cuisson que d'autres légumineuses. Leur allergénicité est diminuée lors d'un chauffage à 120°C dans un autoclave alors qu'elles le sont moins lors d'une ébullition à 100°C [START_REF] Dreyer | Consommation croissante d'aliments contenant du pois jaune : un risque d'allergie ?[END_REF].

Les protéines de pois se trouvent donc dans l'alimentation sous forme de petit pois, pois chiches, pois cassés mais aussi, de plus en plus, transformées et incorporées à de nombreuses denrées de l'industrie agro-alimentaire. Les pois protéagineux sont ainsi transformés en fibres de pois, isolats de pois et/ou de farine de pois, pour être utilisés dans l'alimentation animale (farines riches en protéines et amidon données aux veaux et porcs) ou dans l'alimentation humaine. Les isolats de pois contiennent 85 à 90% de protéines. Ils sont largement utilisés en raison de leurs propriétés fonctionnelles (émulsifiants, gélifiants, solubilisants) et de leur richesse en protéines. On en trouve ainsi dans de nombreux produits : préparations à base de viande, poissons et charcuteries(saucisses), sauces et plats cuisinés mais aussi dans des produits laitiers, glaces, produits diététiques pour les sportifs, produits de renutrition etc… Le pois jaune est également de plus en plus souvent utilisé pour fabriquer des substituts de viande (steaks) à l'intention des consommateurs végans et végétariens. Ainsi, pour obtenir la même quantité de protéines qu'un cordon bleu ou steak haché contenant 20 grammes d'isolats de pois, il faudrait manger 360 grammes de petit pois [START_REF] Dreyer | Consommation croissante d'aliments contenant du pois jaune : un risque d'allergie ?[END_REF]. Le pois ne fait pas partie de la liste des allergènes à déclaration obligatoire contrairement au lupin. Les industriels de l'agro-alimentaire en ont donc conclu que les protéines de pois étaient sans risque allergique, ce qui n'est évidemment pas vrai pour nos patients à risque atopique. Les protéines de pois doivent être théoriquement indiquées comme pois dans la composition des produits alimentaires mais il arrive qu'elles soient uniquement indiquées comme « protéines végétales » : les allergiques aux pois doivent donc lire très attentivement les étiquettes [START_REF] Richard | Cross-reactivity of a new food ingredient, dun pea, with legumes, and risk of anaphylaxis in legume allergic children[END_REF][START_REF] Kyprianou | Commission Directive 2007/68/EC of 27 November 2007 amending Annex IIIa to Directive 2000/13/EC of the European Parliament and of the Council as regards certain food ingredients[END_REF]. A notre avis, du fait de son potentiel fortement allergisant, le pois , utilisé largement dans l'industrie agroalimentaire devrait faire partie de la liste des allergènes à déclaration obligatoire.

Conclusion

  Une trousse d'urgence a été prescrite avec un stylo auto-injecteur d'adrénaline (Anapen®) accompagnée d'un plan d'action et encadré par une séance d'éducation thérapeutique. Cette enfant a donc présenté une anaphylaxie de grade 5 aux petits pois selon la classification d'Astier et est sensibilisée aux lentilles et à l'arachide [1]. L'éviction des pois et des lentilles a été recommandée. Discussion Entre 2002 et fin 2019, 2165 cas d'anaphylaxie alimentaire ont été rapportés au Réseau d'Allergovigilance (RAV) [2]

  Cette observation illustre d'une part, la difficulté de reconnaître l'anaphylaxie chez le nourrisson, et d'autre part, le caractère fortement allergisant du pois. L'utilisation grandissante des protéines de pois dans l'alimentation nous fait craindre une augmentation des cas d'anaphylaxie sévère aux pois. Il paraît donc nécessaire d'obtenir que l'allergène « pois » rentre dans la liste des allergènes à déclaration obligatoire. Conflits d'intérêt. Les auteurs n'ont pas de conflit d'intérêt dans le cadre de la réalisation de cet article Références bibliographiques [1] Astier C, Morisset M, Roitel O, Codreanu F, Jacquenet S, Franck P. Predictive value of skin prick-tests using recombinant allergens dor diagnosis of peanut allergy. J Allergy Clin Immunol 2006 ; 118 : 250-6 [2] Réseau d'allergo-vigilance : www. allergo-vigilance.com [3] Pouessel G, Jean-Bart C, Deschildre A, Van der Brempt X, Tanno LK, Beaumont P,