Caroline Bosson

John Rendu

Laurent Pelletier

Amandine Abriat

Amandine Chatagnon

Julie Brocard

Jacques Brocard

Dominique Figarella-Branger

Sylvie Ducreux

Fabien Van Coppenolle

Emmanuel Sagui

Isabelle Marty

Nathalie Roux-Buisson
email: nrouxbuisson@chu-grenoble.fr

Julien Faure

Variations in the TRPV1 gene are associated to Exertional Heat Stroke

de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.

Heat Exhaustion; Malignant Hyperthermia; Whole Exome Sequencing; Thermogenesis; In vitro

Contracture Test

Introduction

Exertional Heat Stroke (EHS) is a life-threatening disease that occurs in young individuals who engage in prolonged and strenuous activity [START_REF] Yeo | Heat stroke: a comprehensive review[END_REF] . First cases have been reported in army soldiers 2 but many cases are now described in civilian population. Indeed, the popularity and increased competitiveness in summer road races and pre-season American football are likely associated with the number of EHS in athletics in recent years. The incidence of EHS is around 3 cases/10,000 person-years [START_REF] Sagui | Is There a Link between Exertional Heat Stroke and Susceptibility to Malignant Hyperthermia?[END_REF] but it can reach up to 2/1000 athlete-exposures [START_REF] Demartini | Effectiveness of Cold Water Immersion in the Treatment of Exertional Heat Stroke at the Falmouth Road Race[END_REF] ; it was responsible for 30 deaths over the last 10 years among American football players [START_REF] Kucera | Annual Survey of Football Injury Research n[END_REF] .

EHS is defined by a severe hyperthermia, with a body temperature above 40°C, associated with a sudden neurological dysfunction, observed in healthy individuals exposed to intensive physical exercise [START_REF] Leon | Heat stroke[END_REF] . Ultimately it results in a multiple organ failure leading to a high mortality rate that can be drastically reduced with early and quick cooling of the patient. The pathophysiology of EHS is based on a dysfunction of thermoregulation that leads to an uncontrolled increase of internal heat production exceeding compensation mechanisms. The core body temperature rises continuously and the patient evolves into an uncompensable heat stress state [START_REF] Armstrong | Exertional Heat Illness during Training and Competition[END_REF] . A hypermetabolic state, especially in the skeletal muscle, and the development of a systemic inflammatory syndrome are also part of the pathophysiology [START_REF] Leon | Heat stroke[END_REF] . Extrinsic risk factors such as hot and humid environment have been identified, as well as intrinsic factors such as dehydration or sleep deprivation. Some studies have suggested that the impact of these risk factors could be modulated by training or acclimatization, which should help the patient to adapt to exercise and environment conditions [START_REF] Hosokawa | Is Heat Intolerance State or Trait?[END_REF] . However, several evidence support the existence of inherited genetic mutations that predispose some patients to EHS [START_REF] Roux-Buisson | Identification of variants of the ryanodine receptor type 1 in patients with exertional heat stroke and positive response to the malignant hyperthermia in vitro contracture test[END_REF][START_REF] Tobin | MAlignant hyperthermia and apparent heat stroke[END_REF][START_REF] Fiszer | Next-generation Sequencing of RYR1 and CACNA1S in Malignant Hyperthermia and Exertional Heat Illness[END_REF] , despite these adaptation mechanisms.

EHS shares many clinical and biological similarities with Malignant Hyperthermia (MH) [START_REF] Thomas | Exertional heat stroke, rhabdomyolysis and susceptibility to malignant hyperthermia[END_REF] , a lifethreatening genetic disease triggered by volatile halogenated agents. MH is characterized by a hypermetabolic state in skeletal muscle with hyperthermia and can lead to multiple organ failure [START_REF] Hopkins | Malignant hyperthermia[END_REF] .

MH can be diagnosed by a positive In Vitro Contracture Test (IVCT), which quantifies the excessive contraction of a skeletal muscle biopsy in response to triggering agents, or by genetic testing.

Mutations are detected in the RYR1 gene in 60% of MH cases [START_REF] Robinson | Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease[END_REF] , and rarely in the CACNA1S and STAC3 genes [START_REF] Horstick | Stac3 is a component of the excitation-contraction coupling machinery and mutated in Native American myopathy[END_REF][START_REF] Beam | Pharmacogenetics and pathophysiology of CACNA1S mutations in malignant hyperthermia[END_REF] . All these genes encode proteins that are involved in calcium homeostasis in skeletal muscle. Interestingly, half of EHS patients displays a positive IVCT which evidences a calcium release disorder in these patients [START_REF] Sagui | Is There a Link between Exertional Heat Stroke and Susceptibility to Malignant Hyperthermia?[END_REF] . Contrary to MH, the genetic bases of EHS remain poorly documented. Mutations in RYR1 have been associated with EHS with a much lower prevalence than in MH, estimated at 10% 9 , which suggests the involvement of other genes in the disease.

We report here the genetic study of a cohort of soldiers presenting with an EHS episode in whom mutations in RYR1 had been previously excluded. Whole Exome Sequencing analysis and downstream functional studies led to the identification of TRPV1 as a new gene associated with EHS. TRPV1 encodes a cationic channel implicated in thermoregulation and has been recently associated with MH phenotypes, arguing in favor of an overlap between the two diseases [START_REF] Abeele | TRPV1 variants impair intracellular Ca 2+ signaling and may confer susceptibility to malignant hyperthermia[END_REF] .

Methods

Samples were obtained from EHS soldiers of the French national cohort recruited between January 2004 and December 2006 by the Military Hospital Lavéran reference center for EHS. EHS occurred during or immediately after a military exercise consisting in a timed race (8-km running with boots and combat jacket) or a commando race (8-km running with complete battle dress, including an 11-kg combat rucksack and weapon). These exercises were part of soldiers' sessional exams. Patients were included on the basis of a characterized EHS crisis with 1) body temperature ≥ 39°C recorded at the time of the crisis either rectally or, when not possible in the field, by ear (less accurate method), and 2) neurological dysfunction such as mental confusion or loss of consciousness [START_REF] Abriat | Etude descriptive de 182 coups de chaleur d'exercice survenus chez des militaires[END_REF] . The temperature threshold used to defined a crisis was 39°C in this study in order to increase diagnostic sensitivity, because of the inevitable delay between the crisis and the temperature measurement in the field and to anticipate care of patients with neurological dysfunction with hyperthermia 2 . All selected patients displayed a positive In Vitro Contracture Test according to the European Malignant Hyperthermia Group (EMHG) guidelines. IVCT was considered positive when contraction was equal to or above 0,2g at 2% halothane concentration or 2 mM caffeine. Genetic analyses were performed after written informed consents were obtained. Whole Exome Sequencing (WES) was performed (n=15) using Illumina HiSeq © 2000/2500 technology (Illumina, USA). The Ingenuity © software (Qiagen, Germany) was used to filter the variations. Based on the estimated prevalence 3 of EHS, variants with an allele frequency of at least 0.1% in common controls databases (ExAC and gnomAD) were excluded and only missense, frameshift (indels) or splice site variations were analyzed. Because our cohort consisted of sporadic cases, WES data analysis was performed with either autosomal recessive or dominant mode of inheritance hypotheses. Genes with 1at least two patients harboring a variant matching with previous criteria and 2-a tissue expression in the skeletal muscle, were further analyzed. Variants were confirmed by Sanger sequencing. Segregation studies were not performed because relatives clinical evaluation and paraclinical assessment could not be performed and DNAs were not available. Additional EHS probands (n=45) were analyzed by Sanger sequencing for the TRPV1 (NM_018727.5) candidate gene.

In vitro functional studies of TRPV1 variations identified by WES were performed with a plasmid containing the human TRPV1 sequence in fusion with the mCherry tag that has already been described [START_REF] Abeele | TRPV1 variants impair intracellular Ca 2+ signaling and may confer susceptibility to malignant hyperthermia[END_REF] . The p.Gly684Val and p.Arg772Cys mutations were introduced by site-directed mutagenesis, following the instruction of the QuickChange XL Site-Directed Mutagenesis kit (Agilent, USA). Plasmids encoding the Wild-Type or a mutant TRPV1 were transfected in HEK-293 cells according to the DharmaFECT Duo Transfection Reagent protocol (Dharmacon, USA). Cells were cultured in standard conditions and experiments were performed after 48h of TRPV1 expression.

To evaluate the calcium release in the cytoplasm after TRPV1 activation, cells were loaded with Fluo-4 AM dye for 30 min at 37°C and next maintained in a calcium-free medium containing 1 mM EGTA, what allowed to assess exclusively calcium release from intracellular stores. The stimulation with the agonist (capsaicin 20 µM, Merck, Germany) was performed at room temperature and the emission of fluorescence of the Fluo-4 AM dye was followed by microscopy on a DMI6000 Leica FRAP (Leica Microsystems) with a 10x objective. Images were taken every second during 80 sec and stimulation was performed at 10 sec. Data were analyzed with the ImageJ software to select regions of interest and acquire the fluorescence intensity that was normalized to baseline fluorescence (F0). An average of 20 cells was analyzed for each condition and experiments were repeated 3 times.

To evaluate the resting calcium in the cytosol, cells were loaded with Fura-2 (2.5 µM) for 30 min at 37°C in Tyrode buffer. After loading, cells were washed and maintained in Ca 2+ -free Tyrode buffer. Fura-2 measurements were performed at room temperature using a wide field Leica DMI6000B microscope equipped with a 40x oil-objective and an Orca-Flash4.0 digital camera (HAMAMATSU).

Using a Lambda DG-4+ filter (Sutter instruments), Fura-2 AM was excited at 340 and 380 nm and their respective emitted fluorescence lights were measured at wavelength 510 nm. Images were taken with 5 seconds interval. Fluorescence ratios were analyzed with MetaFluor 6.3 software (Universal imaging).

Data were analyzed with GraphPad Prism 6.0 (USA) using a one-way ANOVA after checking for Gaussian distribution. Normally-distributed data were analyzed through parametric ANOVA followed by Tukey's post-hoc tests while non-normally-distributed data were analyzed through non-parametric Kruskal-Wallis ANOVA followed by Dunn's post-hoc tests. Differences were considered significant 120 when p < 0.05. 121

Results

Among the 15 patients studied by Whole Exome Sequencing (WES), two possibly damaging heterozygous variations were identified in the TRPV1 gene in two patients: the c.2051G>T; p.Gly684Val and the c.2314C>T; p.Arg772Cys variations (table A, figure A). Sequencing of the entire TRPV1 coding sequence in 45 other patients did not reveal additional potentially deleterious variations.

Patients harboring a variation in TRPV1 were young men, with body temperature recorded at the time of the crisis above 40°C. They both presented neurological signs resulting in a loss of consciousness.

Both patients experienced rhabdomyolysis and patient 2 developed hepatorenal failure. Interestingly, patient 2 also harbored elevated CPK at rest (three times the normal level). According to ICVT result, patient 1 was diagnosed as MHS (susceptible to Malignant Hyperthermia) and patient 2 was MHSh (susceptible to Malignant Hyperthermia only to halothane stimulation). The patients did not report any others symptoms. These clinical features were similar to the other patients of the cohort analyzed by WES (table A, supplemental table A). The c.2051G>T; p.Gly684Val variation identified in patient 1 was very rare with a Minor Allele Frequency (MAF) of 0.000004063 in the ExAC database and the c.2314C>T; p.Arg772Cys variation identified in patient 2 was not reported in genomic databases. Both variations were also predicted damaging by four different software (CADD [START_REF] Kircher | A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants[END_REF] , SIFT [START_REF] Sim | SIFT web server: predicting effects of amino acid substitutions on proteins[END_REF] , Polyphen2 21 , Mutation Taster [START_REF] Schwarz | MutationTaster2: mutation prediction for the deepsequencing age[END_REF] ) and modified highly conserved amino acids in functional domains of the protein (table A, figure A).

Mapping of the Glycine 684 onto the crystal structure of TRPV1 (PDB number: 5IRZ, residues 335 to 751 [START_REF] Solinski | Cells and circuits for thermosensation in mammals[END_REF] ) showed that this residue is localized in the critical pore domain of the TRPV1 channel. The in silico structure prediction showed that replacement of the Glycine 684 by a Valine induces a major steric hindrance in the pore of the channel (supplemental figure A).

The p.Arg772Cys variation affects a residue located in a regulatory domain of the C-terminal region of TRPV1, whose structure is so far unavailable.

To further explore the impact of both variations, calcium release of mutated TRPV1 after stimulation with the specific agonist capsaicin was performed. The TRPV1-Arg772Cys mutant induced a modification in the kinetics of calcium release resulting in an increase in the total calcium released as

Discussion

Our work led to the identification of variations in the TRPV1 gene in association with Exertional Heat Stroke phenotype in two patients. The TRPV1 gene encodes a non-selective cation channel with a broad spectrum of tissue expression. In the skeletal muscle, TRPV1 is localized in the sarcoplasmic reticulum membrane and is especially involved in calcium transport [START_REF] Lotteau | Characterization of Functional TRPV1 Channels in the Sarcoplasmic Reticulum of Mouse Skeletal Muscle[END_REF] , which is consistent with the hypothesis of a calcium release disorder in patients who display a positive In Vitro Contracture Tests.

TRPV1 is a nociceptor that can be activated by pungent ingredients like capsaicin, the active molecule of chili pepper, or heat and acidic environment [START_REF] Caterina | The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway[END_REF][START_REF] Solinski | Cells and circuits for thermosensation in mammals[END_REF] , which are produced during exercise and muscle contraction. TRPV1 is also stimulated by halogenated anesthetics [START_REF] Kimball | The Pore Loop Domain of TRPV1 Is Required for Its Activation by the Volatile Anesthetics Chloroform and Isoflurane[END_REF] , and interestingly a recent study reported mutations in the TRPV1 gene in patients with Malignant Hyperthermia [START_REF] Abeele | TRPV1 variants impair intracellular Ca 2+ signaling and may confer susceptibility to malignant hyperthermia[END_REF] .

The two variants that we report present the standard criteria of pathogenicity. They are unreported or very rare (MAF <0.0001%) in control databases while we chose to keep variants with a MAF <0.1%, which is compatible with a rare and triggered disease such as EHS. They are also predicted as pathogenic in silico and located in critical functional domains of the protein. The p.Gly684Val mutation is located in the S6 transmembrane domain (residues 559 to 687 according to Uniprot website: https://www.uniprot.org/uniprot/Q8NER,) which is part of the highly conserved pore domain of TRPV1 and is crucial for the channel function. The region including the pore domain is implicated in selectivity, opening and closure of the channel but is also implicated in conformational change in capsaicin-induced activation and heat-induced desensitization [START_REF] Luo | Molecular basis for heat desensitization of TRPV1 ion channels[END_REF] . The steric hindrance resulting from the replacement of the small amino acid by a larger one in the pore is likely to impact the channel function as shown in X-ray structure (supplemental figure A). The absence of response observed after capsaicin stimulation, as well as its lack of effect on calcium levels at rest, strongly suggest that the p.Gly684Val mutation blocks the channel function of TRPV1. The p.Arg772Cys mutation is located in the C-terminal region of TRPV1 [START_REF] Gao | TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action[END_REF] , which is responsible for the interaction with calcium binding proteins, such as calmodulin and the S100A1 protein. Previous work demonstrated that the Arg772 residue is involved in binding of the S100A1 molecule that plays a role in the regulation of TRPV1, particularly in capsaicin-induced desensitization [START_REF] Lau | Distinct properties of Ca2+-calmodulin binding to N-and C-terminal regulatory regions of the TRPV1 channel[END_REF][START_REF] Grycova | Ca(2+) binding protein S100A1 competes with calmodulin and PIP2 for binding site on the C-terminus of the TPRV1 receptor[END_REF] . Together with our results showing modified kinetics of calcium release in ectopic expression, this strongly suggests that the p.Arg772Cys mutation alters the regulation of the channel function of TRPV1. These data suggest that both variations induce a modification of the function of TRPV1 and classify these variations as likely pathogenic according to the recommendations of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) [START_REF] Richards | ACMG recommendations for standards for interpretation and reporting of sequence variations: Revisions 2007[END_REF] .

Although the pathophysiology of EHS is still largely unclear, results obtained in the recent years on TRPV1 function could provide new research avenues. First, the fact that EHS patients show abnormal response to the MH in vitro contracture test may rely on calcium channel properties of TRPV1 in muscle. Pioneer work demonstrated that heat stress activates TRPV1 and induces calcium accumulation in myocytes during muscle contraction [START_REF] Ikegami | Accumulation of intramyocyte TRPV1-mediated calcium during heat stress is inhibited by concomitant muscle contractions[END_REF] . Recent studies suggested that TRPV1 may crosstalk with RyR1, amplifying calcium release in skeletal muscle [START_REF] Lotteau | Characterization of Functional TRPV1 Channels in the Sarcoplasmic Reticulum of Mouse Skeletal Muscle[END_REF] . Therefore, an abnormal function of TRPV1 could modify calcium release from RyR1, explaining the massive cytosolic calcium release that occurs during an EHS or MH crisis due to TRPV1 mutations. This functional relationship with RyR1 and the demonstrated sensitivity of TRPV1 to halothane 17 may explain the fact that EHS patients with TRPV1 mutations have a positive IVCT. However, this hypothesis may only partially explain our results since the TRPV1 mutant p.Gly684Val does not release calcium after capsaicin stimulation. Further experiments with other stimuli such as halogenated anesthetics, and muscle specific expression system, would help to clarify the patient positive in vitro contracture test. However, RYR1 independent mechanisms could also explain the pathophysiology of EHS due to TRPV1 mutations.

The link between the mutations identified in TRPV1 and EHS could be based on a dysfunction of the thermosensitive role (heat detection) or thermoregulatory role (the control of core body temperature) of TRPV1 during exercise. In vivo, the thermosensitive role of TRPV1 has been largely described with TRPV1-/-mice models presenting reduced sensitivity to noxious heat [START_REF] Marics | Acute heat-evoked temperature sensation is impaired but not abolished in mice lacking TRPV1 and TRPV3 channels[END_REF][START_REF] Caterina | Impaired Nociception and Pain Sensation in Mice Lacking the Capsaicin Receptor[END_REF] . The effect of TRPV1 deficiency on thermoregulation in knock-out mice is more debated, but several studies have demonstrated abnormal thermogenesis in response to the agonist capsaicin [START_REF] Caterina | Impaired Nociception and Pain Sensation in Mice Lacking the Capsaicin Receptor[END_REF][START_REF] Christoph | Investigation of TRPV1 loss-of-function phenotypes in TRPV1 Leu206Stop mice generated by N-ethyl-N-nitrosourea mutagenesis[END_REF] and distinct thermoregulatory phenotypes in terms of behavior and metabolism in mice lacking TRPV1 [START_REF] Garami | Thermoregulatory phenotype of the Trpv1 knockout mouse: thermoeffector dysbalance with hyperkinesis[END_REF] .

Recently, the molecular role of TRPV1 in thermosensation was dissected. In most mammals, the heatinduced activation of TRPV1 is rapidly followed by a desensitization of the channel, in order to protect cells against damages if noxious heat persists [START_REF] Luo | Molecular basis for heat desensitization of TRPV1 ion channels[END_REF] . This desensitization is regulated by the heatinduced interaction between the N and C-terminal regions of TRPV1 which is coupled to the outer pore domain, inducing a conformational change of the channel and closing the pore [START_REF] Luo | Molecular basis for heat desensitization of TRPV1 ion channels[END_REF] . Point mutations in key residues in these regions can abolish this interaction, and the desensitization phenomenon. The p.Arg772Cys mutation we described here is located in the C-terminal region of TRPV1 delineated by the authors of this work and it could alter the physiological interaction between C-and N-terminal parts of TRPV1, thus impacting the desensitization mechanism. This hypothesis fits with the delay observed in the kinetics of calcium release in our calcium imaging experiments with capsaicin stimulation. Inefficient heat-induced inactivation of the TRPV1 channel during a strenuous exercise due to a mutation such as p.Arg722Cys could therefore participate in the pathophysiology of EHS.

The role of TRPV1 in the control of body temperature is less understood. It was evidenced during pharmacological screening to search for new analgesics targeting TRPV1 [START_REF] Caterina | The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway[END_REF][START_REF] Caterina | Impaired Nociception and Pain Sensation in Mice Lacking the Capsaicin Receptor[END_REF] . Clinical trials established that some TRPV1 antagonists tested as analgesics can cause thermogenesis dysfunction (either hyperthermia or hypothermia) in patients, depending on their ability to selectively inhibit capsaicin-, heat-or proton-induced TRPV1 activity. These results suggested that TRPV1 could participate in the regulation of the systemic thermogenesis pathways and reflected the complexity of the thermoregulation function of TRPV1, [START_REF] Garami | Thermoregulatory phenotype of the Trpv1 knockout mouse: thermoeffector dysbalance with hyperkinesis[END_REF][START_REF] Garami | TRPV1 antagonists that cause hypothermia, instead of hyperthermia, in rodents: Compounds' pharmacological profiles, in vivo targets, thermoeffectors recruited and implications for drug development[END_REF] . Interestingly, compounds able to block TRPV1 channel function after any type of stimulation (capsaicin, heat of acidic pH) trigger hyperthermia.

Along with this result, one can hypothesize that a complete block of TRPV1 function by a loss of function mutation such as the p.Gly684Val may also result in an abnormal regulation of thermogenesis during strenuous muscle activity.

Conclusions

In conclusion, our study involves TRPV1 mutations as a new cause of Exertional Heat Stroke. The TRPV1 gene, as well as RYR1, may both be linked to Exertional Heat Stroke and Malignant Hyperthermia, which supports the hypothesis of a continuum between the two diseases [START_REF] Hosokawa | Round Table on Malignant Hyperthermia in Physically Active Populations: Meeting Proceedings[END_REF] . We identified two missense mutations in EHS patients that presented positive IVCT and demonstrated that these mutations impact capsaicin-induced calcium release. However, precise mechanisms by which TRPV1 participates in MH and EHS pathophysiology and alters calcium homoeostasis in muscle inducing altered response in IVCT need further explorations. It is possible that each of the mutations of TRPV1 we describe here impairs one of the functions TRPV1 is involved in, thermosensitivity or whole body thermoregulation.

Nevertheless, mutations found so far in RYR1 and TRPV1 show a low prevalence. It can be first explained by the fact that EHS is a multifactorial disorder, and not solely caused by genetic predispositions. It can also reflect that mutations in other genes may be involved in EHS.

Practical implications

• TRPV1 is a new candidate gene in Exertional Heat Stroke.

• The identification of molecular bases of EHS will help to propose efficient genetic screening to individuals at risk of EHS.

• Because of the identification of variations in TRPV1 and RYR1 genes both in Exertional Heat Stroke and Malignant Hyperthermia, the cross-risk between the two diseases should still be considered.

  compared to TRPV1-WT (figure B.1 and B.2). The TRPV1-Gly684Val mutant did not respond to capsaicin stimulation. Ectopic expression of TRPV1 in HEK-293 cells induced an elevation of the resting cytosolic calcium concentrations even in absence of TRPV1 stimulation (figure B.3) due to a calcium leak from intracellular stores. The expression of the TRPV1-Arg772Cys induced a similar elevation of basal cytosolic calcium concentration (figure B.3). On the contrary, the expression of the TRPV1-Gly684Val mutant did not change the resting concentration of calcium (figure B.3), confirming this mutant channel is not functional. The expression and localization of recombinant TRPV1 in HEK-293 cells were not altered by variations according to Western-Blot and immunofluorescence results (supplemental figure B), and we conclude that both genetic variations alter in vitro the global channel function of TRPV1, at rest or after specific agonist stimulation.

Figure A: 1 . 2 . 3 .

 123 Figure A: 1. TRPV1 sequences with heterozygous c.2051G>T; p.Gly684Val (patient 1) and c.2314C>T;

Figure B : 1 , 2 ,

 B12 Figure B: Calcium imaging studies in HEK-293 cells after TRPV1 mutants expression.

3 ,

 3 Measurement of cytosolic calcium concentration at rest using the fluorescence ratio of the Fura2-AM indicator dye (F340/F380, arbitrary units) (median +/-IQR). Non transfected cells (NT) were used as control. Non parametric ANOVA followed by post-hoc test were performed: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001

  Figure A

Table A :

 A Clinical and genetic features of the patients with variations in the TRPV1 gene. MHS: Malignant Hyperthermia Susceptible with a positive In Vitro Contracture Test to halothane and caffeine. MHSh: Malignant Hyperthermia Susceptible with a positive In Vitro Contracture Test to halothane only. NA: not available.

Acknowledgements:

We thank the APHM CRB-TBM Centre de Ressources Biologiques -Tumorothèque et Banque de Muscles (authorization number: AC-2018-31053; CRB BB-0033-00097) for providing samples and Dr Catherine FOUTRIER-MORELLO for providing the results of the In Vitro Contracture Tests. We thank the Fondation Maladies Rares, France which supported the Whole Exome Sequencing.

Funding:

Whole Exome Sequencing was funded by the Fondation Maladies Rares (grant N° FONDATION_WES-20150602) and functionnal characterisation was supported by grants from INSERM and Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon).

Patients


Marie-Charlotte Trojani

Benoit Le Goff

Echo-anatomie de l'articulation tibio-fibulaire proximale

Du fait d'implications pathologiques variées (traumatologie, arthrose, arthrite, kystes synoviaux) (1), il nous a donc paru intéressant de décrire l'aspect échographique de cette articulation accessible aux infiltrations écho-guidées [START_REF] Smith | Sonographically guided proximal tibiofibular joint injection: technique and accuracy[END_REF]. L'objectif de notre étude était de décrire des coupes standardisées de l'articulation TFP en échographie en partant d'une étude anatomique puis en confirmant la faisabilité de ces coupes sur une série de volontaires sains.

Méthodes

  Introduction : L'articulation tibio-fibulaire proximale (TFP) est une articulation souvent oubliée, pourtant impliquée dans de nombreux processus pathologiques. Il n'existe pas à notre connaissance d'étude d'écho-anatomie descriptive permettant une standardisation des coupes échographiques de cette articulation. L'objectif de notre étude était de décrire des coupes standardisées de l'articulation TFP en échographie en partant d'une étude anatomique puis en confirmant la faisabilité de ces coupes sur une série de volontaires sains. Méthodes : Le premier temps de l'étude a consisté en la dissection d'articulations TFP sur 3 cadavres. Par la suite, 20 patients volontaires sains ont bénéficié d'une échographie de l'articulation TFP, par un seul opérateur. 3 coupes standardisées ont été réalisées : une coupe transversale antérieure oblique, une coupe coronale, et une coupe transversale postérieure oblique. Les éléments musculo-ligamentaires environnants ont été analysés. Résultats : 20 volontaires sains d'âge médian de 28 ans (minimum 21 ans, maximum 64 ans) ont bénéficié d'une échographie de l'articulation TFP droite. L'interligne articulaire était visualisé dans 100 % des cas sur les 3 coupes. La coupe transversale antérieure oblique a permis d'analyser le ligament tibio-fibulaire proximal antérieur (LTFPA) dans 100 % des cas. La coupe coronale a permis d'identifier les artères géniculées inféro-latérales et récurrentes tibiales postérieures dans 90 et 85 % des cas, et l'insertion distale du ligament collatéral fibulaire dans 100 % des cas. La coupe transversale postérieure oblique a permis de repérer le tendon poplité, le ligament arqué et le ligament tibio-fibulaire proximal postérieur (LTFFP) chez 16 (80 %), 7(35%) et 2 (10 %) patients. Conclusion : Nous avons réalisé une étude en 2 temps : une étude cadavérique puis une étude échographique sur volontaires sains, ayant permis de définir 3 coupes standardisées : une coupe transversale antérieure oblique, une coupe coronale et une coupe transversale postérieure oblique. Il s'agit de la première étude de ce genre à notre connaissance. La mise en place de coupes standardisées et la connaissance de l'aspect échographique de l'articulation tibio-fibulaire proximale en condition physiologique permet son utilisation en pratique clinique quotidienne. Mots clés : Echographie -Tibio-fibulaire -Genou Introduction L'articulation tibio-fibulaire proximale (TFP) est une articulation souvent oubliée, pouvant pourtant être source de douleurs du compartiment latéral du genou du fait de différentes pathologies (kystes, arthrose…) (1). Une communication entre les cavités articulaires de l'articulation TFP et de celle du genou a été mise en évidence dans 10 à 100 % des cas selon les études, menant certains auteurs à considérer cette articulation comme le 4 e compartiment du genou (2). Marchetti et son équipe se sont attachés à décrire le complexe ligamentaire de l'articulation TFP dans des études anatomiques. Ainsi, ils ont pu mettre en évidence un ligament tibio-fibulaire proximal antérieur (LTFPA) pouvant comporter jusqu'à 4 faisceaux, plus volumineux et plus résistant que le ligament tibio-fibulaire proximal postérieur (LTFPP), comportant lui 1 à 3 faisceaux (3) (4). (Fig 1) Le gold standard de l'évaluation morphologique de cette articulation et de son environnement musculo-ligamentaire est l'IRM et peu d'étude à ce jour se sont intéressées à sa description échographique (5) (6). Smith et al ont pu comparer dans leur étude en 2010 une technique d'infiltration échoguidée de l'articulation TFP par rapport à un repérage anatomique, avec 100 % d'infiltrations intra articulaire avec l'échoguidage pour 58 % en repérage anatomique. Cependant, il n'existe pas à notre connaissance d'étude d'écho-anatomie descriptive permettant une standardisation des coupes échographiques de cette articulation.

FiguresFigure 1 :

 1 FiguresFigure 1 : Schéma explicatif de l'articulation tibio-fibulaire proximale avec les principales structures ligamentaires étudiées. A : Vue antérieure de l'articulation tibiofibulaire proximale : (*) tubercule de Gerdy, (1) ligament collatéral fibulaire, (2) tendon du long biceps fémoral. B : Vue postérieure de l'articulation tibio-fibulaire proximale : (1) ligament collatéral fibulaire, (2) ligament fabello-fibulaire, (3) ligament arqué, (4) ligament poplitéo-fibulaire, (5) tendon poplité en section .

Figure 2 :

 2 Figure 2 : Pour chaque coupe standardisée, image représentative d'une coupe échographique avec schéma explicatif correspondant, positionnement de la sonde sur volontaire sain et coupe IRM correspondante. A : coupe transversale antérieure oblique. De haut en bas et de gauche à droite : coupe échographique (*) représente l'interligne articulaire ; Représentation schématique des structures visualisées, (*) représente l'interligne articulaire ; Positionnement de la sonde ; Coupe IRM analogue, en vert, le ligament tibio-fibulaire proximal antérieur. B : coupe coronale. De haut en bas et de gauche à droite : Coupe échographique, (*) représente l'interligne articulaire, les têtes de flèche rouges montrent les artères géniculées inféro-latérale et récurrentes tibiales postérieures ; Représentation schématique des structures visualisées, (*) représentant l'interligne articulaire et (O) les artères géniculées inféro-latérales et récurrentes tibiales postérieures ; Positionnement de la sonde ; Coupe IRM analogue. C : coupe transversale postérieure. De haut en bas et de gauche à droite : Coupe échographique, (*) représente l'interligne articulaire ; Représentation schématique des structures visualisées, (*) représente l'interligne articulaire ; Positionnement de la sonde ; Coupe IRM analogue, en vert, le ligament tibio-fibulaire proximal postérieur.


MD Carole Philipponnet
email: philipponnet@chu-clermontferrand.fr

MD Julien Aniort

MD Cyril Garrouste

MD Jean- Louis Kemeny

Mohammed Hadj-Abdelkader

MD Anne-Elisabeth Heng

Kidney Transplantation With A Sickle Cell Disease Donor

Keywords: kidney transplantation, sickle cell disease, hemosiderin, hemolysis

Kidney transplantation is considered as the best treatment for patients with end stage renal disease. The major factor limiting access to transplantation is the shortage of available kidneys. In the vast majority of cases, deceased sickle cell disease (SCD) patients are excluded from kidney donation because of possible renal damage.

We report a case of kidney transplant recipient with SCD donor and highlight that hemosiderin deposits initially presents in epithelial tubular cells disappear few months after stopping exposure to chronic hemolysis. The patient gave his consent to this publication.

CASE REPORT

A seventeen-year-old patient was admitted to the nephrology department for his first kidney transplantation. His main medical antecedents was end stage renal disease requiring chronic hemodialysis secondary to focal and segmental nephropathy. There were no pre-existing immunization to kidney transplantation and no other comorbidities. The donor was a nine-year-old boy with SCD who died due to a cerebral vaso occlusive crises. He suffered from multiple vaso occlusive crises since the age of one year, and from three acute thoracic syndromes having required exsanguino transfusion. The last crisis was complicated by ARDS on acute thoracic syndrome requiring intubation and occlusion of the basilar trunk. There was no acute kidney injury in this patient, the creatinine was steady at 45µmol/L-eGFR 150 mL/min/1.73m 2 CKD EPI with any proteinuria (0.02 g/L). In order to accept the kidney, a preimplantation wedge biopsy processed as a frozen specimen was obtained (Figure 1). This biopsy showed: 1) glomerular enlargement without global segmental sclerosis, no endocapillary hyperFrreportcellularity and no thrombi; 2) minimal interstitial fibrosis; 3) no abnormalities in vessels. The only remarkable histologic finding was that of widespread haemosiderosis involving the proximal tubular cells that gave a blue tinge to the specimen on application of Perls' Prussian blue stain. Immunofluorescence was negative. The surgery proceeded without complications; with cold ischemia estimated at 34 hours and warm ischemia at 36 minutes. The immunosuppression protocol was as follows: induction by thymoglobulins, mycophelonate mofetil, corticosteroids and delayed use of calcineurin inhibitors. There was no delayed graft function and the kidney function remained steady with creatinine 130µmol/L-eGFR 80 mL/min/1.73 m 2 CKD -EPI and proteinuria 0.3 g/day. A protocol kidney biopsy was performed at 3 months (Figure 2).

In light microscopy, we observed no signs of rejection (no interstitial inflammation, no glomerulitis, and no capillaritis) and haemosiderosis deposits were absent. The immunofluorescence study was negative. One complication occurred during this first year due to a duodenal ulcer. Recipient had a pre-existing iron deficiency at the transplant (ferritin 26 µg/L saturation coefficient 16%). Due to the occurrence of post transplant anemia and gastric bleeding, iron supplementation was introduced allowing correction of the deficiency in two months.

DISCUSSION

Sickle cell disease (SCD) is one of the most frequent hereditary hematologic disease in the world. Its most severe and common form results from homozygosity for the mutant form of the gene that encodes beta-globin (1). Mutant sickle beta-globin results from substitution of valine for glutamic acid at its sixth amino acid. The resulting sickle hemoglobin (HbS) polymerizes when the concentration of its deoxygenated form exceeds a critical threshold (1). The long polymers of deoxygenated HbS distort the red blood cell (RBC) into the characteristic sickle shape, a process that is exquisitely sensitive to the concentration of HbS within the cell. Sickled RBCs have greatly reduced deformability, becoming rigid, which hampers their ability to navigate capillaries and very small blood vessels, leading to occlusion of the microvasculature with subsequent pain, ischemia and organ damage. The pathology of SCD can be directly attributed to HbS polymerization and vaso-occlusion, as well as to secondary effects of chronic hemolysis. In the past few decades, significant advances have been made in our understanding of the complex biochemical and vascular processes that interact with each other to result in vasoocclusion. Intravascular hemolysis and release of free hemoglobin leading to nitric oxide depletion, endothelial dysfunction, and neutrophil and platelet adhesion are all playing an important contributory role to the pathophysiology of SCD (1-2).

Renal involvement contributes to the diminished life expectancy of patients with SCD, accounting for 16-18 % of mortality (2). The spectrum of renal diseases during SCD includes various renal manifestations such as impairment of urinary concentratring ability, defect in urine acidification, renal papillary necrosis and glomerular injury (2-3). Endothelial dysfunction related to chronic hemolysis and the relative renal hypoxia cause by vaso occluse sickle red blood cells are probably key factors for SCD's renal complications development (2). A retrospective study conducted by 14 pediatric nephrology centers has collected the cases of the adolescents and children with SCD who had a renal biopsy performed from January 2000 to December 2015 (4). Thirty-six SCD patients (ages 4-19 years) were identified; the indications for biopsy were proteinuria (92%) and elevated creatinine (30%). The histopathological findings were mesangial hypercellularity (75%), focal segmental glomerulosclerosis (30%), membranoproliferative glomerulonephritis (16%), and thrombotic microangiopathy (2%) [START_REF] Zahr | Kidney biopsy findings in children with sickle cell disease: a Midwest Pediatric Nephrology Consortium study[END_REF]. Another recent observational study included 1251 blacks adults patients with sickle cell trait, 230 with sickle cell disease, and 8729 reference patients, with a median follow-up of 8 years [START_REF] Olaniran | Kidney Function Decline among Black Patients with Sickle Cell Trait and Sickle Cell Disease: An Observational Cohort Study[END_REF]. Sickle cell trait and disease are associated with faster eGFR decline in black patients, with faster decline in sickle cell disease [START_REF] Olaniran | Kidney Function Decline among Black Patients with Sickle Cell Trait and Sickle Cell Disease: An Observational Cohort Study[END_REF].

African American donor ethnicity is one of 10 risk factors in calculating the kidney donor profile index used in assessing organ quality. A recent study evaluated outcomes of deceased-donor kidney transplants from African American donors stratified by kidney donor profile index. Inferior graft outcomes in recipients of African American kidneys were limited to those with > 50% kidney donor profile index, probably due to effects of risk factors such as APOL1 risk alleles and sickle cell trait [START_REF] Sureshkumar | Impact of Donor Ethnicity on Long-Term Kidney Transplant Outcomes: Analysis by Kidney Donor Profile Index Categories[END_REF]. Efforts are maded to replace race with APOL1, some recent data suggests a potential interaction with SCD and sickle cell trait.

SCD is viewed as a contraindication to kidney donation. Two kidney transplant recipients from the same SDC donor were recently report [START_REF] Rossidis | Kidney Transplantation From a Donor With Sickle Cell Disease[END_REF]. They both have delayed graft function requiring 3 days of hemodialysis post transplantation but outcome was favorable. Pre implantation biopsy was performed and there was no evidence of glomerular, vascular or interstitial abnormality [START_REF] Rossidis | Kidney Transplantation From a Donor With Sickle Cell Disease[END_REF]. The only abnormality seen is the hemosiderin deposits within some of the tubular epithelial cells [START_REF] Rossidis | Kidney Transplantation From a Donor With Sickle Cell Disease[END_REF].

Intravascular haemolysis is well known to cause kidney injury by several mechanisms [START_REF] Van Avondt | Mechanisms of haemolysis-induced kidney injury[END_REF]. Indeed, intravascular destruction of red blood cells and the resulting accumulation of haemoproteins can induced oxidative stress and cytotoxicity pathways [START_REF] Van Avondt | Mechanisms of haemolysis-induced kidney injury[END_REF].

In 2019, in France, 3,641 kidney transplants were performed, including 508 from living donors. The waiting time on the kidney transplant list is currently estimated between two and five years. In view of this shortage of organs, it was decided to transplant from the kidney of a donor with SCD which is usually excluded from the donation. This decision was adopted in particular in view of the donor's youth and the absence of a history of kidney injury. In order to support this decision, a preimplantation renal biopsy was requested and eliminated damage to the renal parenchyma. Perls staining was subsequently carried out, because the literature reporting an accumulation of iron within the tubular cells of SCD patients.

Of great interest, we were able to obtain a protocol biopsy to asses if there was residual donor derived hemosideri or transplant damage. We report the disapearrance of haemosiderosis deposits in kidney transplant recipient. It is important to note that there were no glomerular or vascular lesions in the preimplantation biosy and despite the hemosiderin deposits there was no interstitial fibrosis or tubular atrophy. Isolated haemosiderosis deposits are reversible condition after stopping exposure to chronic hemolysis. Like the two previous patients reported, the outcome was favorable. It is important to emphasize that the donors, in theses cases, were chidren or young adult. Kidney transplantation with SCD donors seems to be safe with acceptable outcome after a careful examination of donor's clinical history and preimplantation biopsy (Table 1).

Table 1: TEACHING POINTS:

• The spectrum of renal diseases during SCD includes various renal manifestations such as impairment of urinary concentratring ability, defect in urine acidification, renal papillary necrosis and glomerular injury

• Isolated haemosiderosis deposits are reversible condition after stopping exposure to chronic hemolysis.

• Kidney transplantation with SCD donors seems to be safe with acceptable outcome after a careful examination of donor's clinical history and preimplantation biopsy.

DISCLOSURES:

None

REFERENCES:

1-Gravitz L, Pincock S. Sickle-cell disease. Nature. 2014 Nov 13;515(7526):S1.

Figure 1 :

 1 Figure 1: Renal histology (first biopsy)

Figure 2 :

 2 Figure 2: Renal histology (second biopsy)

The authors declare no funding was received for this study.


Jason Hubac
email: jhubac@ch-alpes-leman.fr

Mélanie Gilson

Philippe Gaudin

Marine Clay

Bernard Imbert

Patrick Carpentier

Hubac Jason

de la main et du pied dans la sclérodermie systémique et corrélation avec les caractéristiques de la maladie dont le handicap de la main

ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.

Introduction

Dans la sclérodermie systémique, peu d'études ont montré que l'échographie de la main et du poignet est plus sensible que l'examen clinique pour la détection des synovites et ténosynovites. Encore moins d'études ont évalué l'atteinte échographique du pied et la cheville en échographie. Nos objectifs étaient de décrire la prévalence échographique des synovites et des ténosynovites des mains et des pieds chez des patients atteints de sclérodermie systémique selon les critères ACR/EULAR 2013 et analyser leurs corrélations avec les caractéristiques de la maladie et le handicap de la main. Méthodes Des patients consécutifs atteints de sclérodermie systémique selon les critères ACR/EULAR 2013 étaient inclus dans une étude transversale monocentrique. Ils bénéficiaient d'un examen clinique standardisé et d'une échographie musculo-squelettique des mains et des pieds. Des données cliniques, biologiques et d'imagerie étaient collectées. Résultats 55 patients ont été inclus. L'échographie était plus sensible que l'examen clinique pour détecter au moins une synovite (respectivement 52 % contre 25 %, p = 0,025) et au moins une ténosynovite (respectivement 16 % contre 4 %, p = 0,009). 18 % des patients présentaient une ténosynovite de cheville et 29 % une synovite de cheville ou du pied, principalement localisée aux articulations métatarsophalangiennes (25,5 %). Avoir au moins une synovite des mains en échographie était associée à un indice fonctionnel de la main de Cochin plus élevé (moyenne 25 ± 3 contre 12 ± 2, p = 0,003) et à la forme cutanée diffuse (p = 0,038).

Conclusion

Notre étude montre que l'échographie est supérieure à l'examen clinique pour détecter les synovites et les ténosynovites dans la sclérodermie systémique. L'atteinte du pied est moins fréquente que celle des mains, elle est présente dans un quart des cas, principalement localisée aux métatarsophalangiennes. Enfin avoir une synovite de la main est associée aux formes cutanées diffuses et à un handicap de la main plus élevé.

Mots clés : synovite, ténosynovite, échographie, sclérodermie systémique, handicap La sclérodermie systémique (ScS) est une connectivite au cours de laquelle l'atteinte musculo-squelettique est fréquente, présente dans 46 à 97 % des cas dans la littérature [START_REF] Avouac | Articular involvement in systemic sclerosis[END_REF][START_REF] Varga | Pathogenesis of systemic sclerosis : recent insights of molecular and cellular mechanisms and therapeutic opportunities[END_REF]. Les atteintes musculo-squelettiques principales sont les synovites, les ténosynovites et les ténosynovites scléreuses (TFR). Les tendinopathies et les arthropathies inflammatoires sont persistantes chez de nombreux patients avec une évolution chronique rémittente ou intermittente [START_REF] Avouac | Articular involvement in systemic sclerosis[END_REF][START_REF] Chitale | Magnetic resonance imaging and musculoskeletal ultrasonography detect and characterize covert inflammatory arthropathy in systemic sclerosis patients with arthralgia[END_REF]. À cause de la sclérose cutanée et de la rétraction des doigts en flexion, l'examen clinique manque de sensibilité et de spécificité pour la détection des synovites et des ténosynovites. Récemment, des études ont montré que l'échographie était supérieure à l'examen clinique dans la détection des synovites et des ténosynovites des poignets et des mains dans la ScS (4). Grâce à des études échographiques, on a montré que les TFR sont liées à des dépôts fibrineux à la surface des gaines tendineuses et à la surface des tendons eux-mêmes. L'imagerie par résonance magnétique a montré qu'elles peuvent également être liées à des modifications du tissu conjonctif profond [START_REF] Stoenoiu | Tendon friction rubs in systemic sclerosis : a possible explanation--an ultrasound and magnetic resonance imaging study[END_REF][START_REF] Cuomo | The origin of tendon friction rubs in patients with systemic sclerosis : a sonographic explanation[END_REF]. Les synovites et les TFR prédisent de manière indépendante la progression globale de la maladie [START_REF] Lescoat | Synovial involvement assessed by power Doppler ultra-sonography in systemic sclerosis : results of a cross-sectional study[END_REF][START_REF] Avouac | Characteristics of joint involvement and relationships with systemic inflammation in systemic sclerosis : results from the EULAR Scleroderma Trial and Research Group (EUSTAR) database[END_REF].

En plus de diminuer la survie, la ScS peut entraîner un handicap avec une incapacité fonctionnelle et une qualité de vie altérée [START_REF] Poole | The use of the Health Assessment Questionnaire (HAQ) to determine physical disability in systemic sclerosis[END_REF][START_REF] Peytrignet | Disability, fatigue, pain and their associates in early diffuse cutaneous systemic sclerosis : the European Scleroderma Observational Study[END_REF][START_REF] Zanatta | Systemic sclerosis : Recent insight in clinical management[END_REF]. Les synovites et les ténosynovites échographiques n'ont pas été corrélées avec des indices de handicap à ce jour. En comparaison avec le poignet et la main, les atteintes de la cheville et du pied ont été peu étudiées dans la ScS. Une étude clinique a montré que l'atteinte de la cheville et du pied dans la ScS est moins fréquente que celle de la main et du poignet, mais peut être invalidante et se manifester plus tardivement [START_REF] Montagna | Foot involvement in systemic sclerosis : a longitudinal study of 100 patients[END_REF]. Peu d'études ont porté sur les synovites et les ténosynovites de la cheville et du pied détectées par échographie ou par imagerie par résonance magnétique dans les cas de ScS classifiées avec les critères de Leroy ou de l'ACR (American college of rheumatology) 1980 [START_REF] Stoenoiu | Tendon friction rubs in systemic sclerosis : a possible explanation--an ultrasound and magnetic resonance imaging study[END_REF][START_REF] Cuomo | The origin of tendon friction rubs in patients with systemic sclerosis : a sonographic explanation[END_REF]

Méthodes Design de l'étude

Nous avons réalisé une étude prospective monocentrique transversale en simple aveugle au Centre Hospitalo-Universitaire Grenoble Alpes (CHUGA).

Sélection des patients

Nous avons inclus des patients consécutifs, adressés par le service de médecine vasculaire, afin d'avoir une expertise rhumatologique dans le cadre de la prise en charge standard des patients de janvier 2018 à juin 2018. Les patients étaient classés comme ScS selon les critères ACR/EULAR 2013 [START_REF] Van Den Hoogen | classification criteria for systemic sclerosis : an American college of rheumatology/European league against rheumatism collaborative initiative[END_REF]. Les patients ayant un syndrome de chevauchement avec une polyarthrite rhumatoïde ont été exclus, les autres syndromes de chevauchement ont été admis.

Données collectées

Au cours d'une consultation médicale standardisée des données ont été recueillies, comprenant : l'âge, le sexe, la durée d'évolution de la maladie depuis le premier symptôme en dehors du syndrome de Raynaud, la forme cutanée limitée ou diffuse de la maladie, le mRSS (Score de Rodnan modifié), l'échelle de la main de cochin (CHFS) [START_REF] Brower | Reliability and validity of the Duruoz Hand Index in persons with systemic sclerosis (scleroderma)[END_REF], la présence d'ulcères digitaux actuels ou passés, les traitements actuels à visée vasculaire ou immunosuppressive.

Les autres données ont été recueillies dans les dossiers des patients dont : la présence d'une hypertension artérielle pulmonaire confirmée par cathétérisme cardiaque droit, une insuffisance cardiaque (fraction d'éjection ventriculaire gauche <50%), les antécédents de crise rénale sclérodermique, la présence d'une pneumopathie interstitielle diffuse sur le scanner thoracique, les résultats des épreuves fonctionnelles respiratoires et le bilan immunologique.

Évaluation clinique

Elle était effectuée de façon prospective par un rhumatologue en aveugle des données de l'échographie. Elle comportait l'examen des articulations et des tendons de la main, du poignet, de la cheville et du pied. Nous avons recueilli le nombre d'articulations gonflées, d'articulations douloureuses, de ténosynovites, de TFR et de rétractions digitales en flexion [START_REF] Steen | The palpable tendon friction rub : an important physical examination finding in patients with systemic sclerosis[END_REF].

Examen échographique

Les échographies ont été réalisées de manière prospective, en aveugle des autres caractéristiques de la maladie, dans la même pièce, au même moment de la journée, à température constante. Chaque échographie était réalisée par le même rhumatologue. L'échographiste avait 3 ans d'expérience et une pratique régulière en échographie musculo-squelettique. Avant de commencer l'étude, ce rhumatologue a effectué un entraînement avec une banque de données d'images échographiques validées [START_REF](Naredo-12) in Patients with Rheumatoid Arthritis in Routine Care [Internet[END_REF][START_REF] Koski | Assessing the intra-and inter-reader reliability of dynamic ultrasound images in power Doppler ultrasonography[END_REF].

Résultats pour les synovites

Globalement, l'examen clinique a été moins sensible que l'échographie pour la détection d'au moins une synovite, respectivement 25 % contre 55 % (OR (Odds ratio) : 0, IC 95 % : 0 à 0,8). L'échographie a également détecté un plus grand nombre de synovites que l'examen clinique : respectivement moyenne de 2,4 ± 2,4 contre 0,5 ± 0,9 (p = 0,017).

Évaluation des corrélations entre les données échographiques et les caractéristiques de la maladie

Avoir au moins une synovite à la main en échographie était associé à un CHFS plus élevé (p = 0,003 ; moyenne de 24,6 ± 3,4 contre 12,2 ± 2,2) et aux formes cutanées diffuses (p = 0,038 ; OR : 9,1, IC 95 % : 1,1 à 104,8). Avoir au moins une synovite de grade 2 ou 3 en mode B était associé à une durée d'évolution de la maladie plus courte (p = 0,044 ; médiane 2,5, IQR : 0,8 à 6,5 contre médiane 8, IQR : 3,0 à 16,5) et à la présence d'ulcères digitaux (p = 0,035 ; OR réciproque : 0, IC 95 % : 0 à 0,7). La présence d'au moins une ténosynovite avec PDS positif était associée à un mRSS ≥14 (p = 0,018 ; OR : 13,5, IQR : 2,1 à 82,6). Nous n'avons trouvé aucune autre corrélation entre les synovites, les ténosynovites ou la présence de PDS avec les autres caractéristiques de la maladie ou les autres atteintes viscérales recueillies, notamment l'hypertension artérielle pulmonaire, l'insuffisance cardiaque, les antécédents de crise rénale sclérodermique, la pneumopathie interstitielle diffuse, les résultats des épreuves fonctionnelles respiratoire et le bilan immunologique. Pour comparaison, la prévalence des synovites des MTP est quasiment deux fois plus élevée dans la polyarthrite rhumatoïde [START_REF] Riente | Ultrasound imaging for the rheumatologist XXXI. Sonographic assessment of the foot in patients with rheumatoid arthritis[END_REF]. Chez des patients présentant une arthrose radiographique du pied, une étude a montré que 50 % des patients présentaient une synovite de la MTP 1 en échographie. Ceci montre que les synovites de la MTP1 ne sont pas spécifiques des rhumatismes inflammatoires, elles sont fréquentes dans l'arthrose, et l'aspect peut être pathologique chez des sujets sains. Ceci explique pourquoi nous avons présenté les résultats avec et sans la MTP1 (nous n'avons pas effectué de radiographie dans notre étude) [START_REF] Annamaria | Ultrasound imaging for the rheumatologist XXXV. Sonographic assessment of the foot in patients with osteoarthritis[END_REF]. Dans notre étude, nous avons constaté que les synovites échographiques de grade 2 et 3 étaient associées aux ulcères digitaux et à une maladie plus récente comme dans d'autres études, et que les synovites échographiques étaient associées aux formes cutanées diffuses [START_REF] Lescoat | Synovial involvement assessed by power Doppler ultra-sonography in systemic sclerosis : results of a cross-sectional study[END_REF][START_REF] Elhai | Ultrasonographic hand features in systemic sclerosis and correlates with clinical, biologic, and radiographic findings[END_REF].

Discussion

Nous n'avons trouvé aucune corrélation avec d'autres atteintes viscérales. Cependant une autre équipe a montré dans une étude clinique avec un plus large échantillon de patients, que les synovites cliniques pouvaient être utiles pour la stratification du pronostic des patients atteints de ScS [START_REF] Avouac | Joint and tendon involvement predict disease progression in systemic sclerosis : a EUSTAR prospective study[END_REF]. De plus une étude portant sur 103 patients atteints de ScS classés selon les critères ACR / EULAR 2013 montrait une association avec la péricardite, les formes cutanée diffuses et les pneumopathies interstitielles [START_REF] Lescoat | Synovial involvement assessed by power Doppler ultra-sonography in systemic sclerosis : results of a cross-sectional study[END_REF]. Il faut prendre en compte la forte prévalence de forme cutanée limitée dans notre étude entrainant une faible prévalence de certaines atteintes viscérales, ceci engendrant un manque de puissance statistique.

Certaines études échographiques transversales n'ont trouvé aucune association entre la présence de synovites ou de ténosynovites et la présence d'érosion, le rétrécissement de l'espace articulaire et la calcinose en radiographie [START_REF] Cuomo | Ultrasonographic features of the hand and wrist in systemic sclerosis[END_REF][START_REF] Lescoat | Synovial involvement assessed by power Doppler ultra-sonography in systemic sclerosis : results of a cross-sectional study[END_REF][START_REF] Thietart | Overview of osteo-articular involvement in systemic sclerosis : Specific risk factors, clinico-sonographic evaluation, and comparison with healthy women from the French OFELY cohort[END_REF], tandis qu'une étude a trouvé une association entre la présence de synovites et les érosion radiographique [START_REF] Elhai | Ultrasonographic hand features in systemic sclerosis and correlates with clinical, biologic, and radiographic findings[END_REF]. Il n'existe actuellement aucune étude longitudinale évaluant la valeur prédictive structurale des synovites en échographie dans la ScS, d'autres études sont nécessaires.

Nous n'avons pas trouvé de corrélation entre le PDS des synovites et les caractéristiques de la maladie, contrairement à une autre étude [START_REF] Lescoat | Synovial involvement assessed by power Doppler ultra-sonography in systemic sclerosis : results of a cross-sectional study[END_REF]. Ceci s'explique peut-être par le fait que le PDS était rare dans notre population, en sachant que 35 % de notre population avait un traitement concomitant à visée anti-inflammatoire articulaire.

Comme d'autres études échographiques ayant inclus des patients atteints de ScS classés selon les critères de Leroy, de l'ACR 1980 ou de l'ACR / EULAR [START_REF] Cuomo | Ultrasonographic features of the hand and wrist in systemic sclerosis[END_REF][START_REF] Lescoat | Synovial involvement assessed by power Doppler ultra-sonography in systemic sclerosis : results of a cross-sectional study[END_REF][START_REF] Elhai | Ultrasonographic hand features in systemic sclerosis and correlates with clinical, biologic, and radiographic findings[END_REF][START_REF] Freire | Hand and wrist involvement in systemic sclerosis : US features[END_REF][START_REF] Iagnocco | Power Doppler ultrasound of the hand and wrist joints in systemic sclerosis[END_REF], notre travail montre que la détection des synovites et des ténosynovites est plus sensible en échographie qu'avec l'examen clinique. Cependant, nous avons eu une prévalence plus faible de synovites échographiques avec PDS positif, de ténosynovites et de ténosynovites sclérosantes. Cela peut s'expliquer par la proportion plus élevée de formes cutanées limitées, elle-même liée à notre recrutement original pour une étude rhumatologique : les patients ont effectivement été recrutés dans un centre de médecine vasculaire avec comme porte d'entrée le phénomène de Raynaud, et non dans un centre de rhumatologie, ce qui a limité le biais de sélection des patients sur l'atteinte articulaire.

Enfin, la prévalence de TFR était faible comparée à celle d'autres études échographiques ; elle peut s'expliquer par les points précédents et parce que nous les avons recherchées uniquement aux mains et aux pieds. La prévalence clinique des TFR est hétérogène dans les études échographiques, de 6 % à plus de 22 % et de 11 % dans la base de données EUSTAR [START_REF] Cuomo | The origin of tendon friction rubs in patients with systemic sclerosis : a sonographic explanation[END_REF][START_REF] Avouac | Characteristics of joint involvement and relationships with systemic inflammation in systemic sclerosis : results from the EULAR Scleroderma Trial and Research Group (EUSTAR) database[END_REF][START_REF] Elhai | Ultrasonographic hand features in systemic sclerosis and correlates with clinical, biologic, and radiographic findings[END_REF].

Notre étude présente plusieurs biais. C'était une étude monocentrique transversale, avec un groupe hétérogène de patients concernant les caractéristiques cliniques et les thérapies. Cependant il s'agissait d'une population de patients non sélectionnés et représentatifs de la pratique clinique.

Nous n'avons pas contrôlé les résultats de l'échographie au cours du temps. Cependant, les synovites sont le plus souvent persistantes [START_REF] Avouac | Articular involvement in systemic sclerosis[END_REF][START_REF] Chitale | Magnetic resonance imaging and musculoskeletal ultrasonography detect and characterize covert inflammatory arthropathy in systemic sclerosis patients with arthralgia[END_REF]. Nos résultats doivent être interprétés compte tenu de la forte proportion de LcSSc. De plus nous avions quelques syndromes de chevauchement avec des maladies ayant potentiellement une atteinte articulaire. Nous nous sommes concentrés sur les synovites et les ténosynovites. Mais dans la ScS, il existe d'autres manifestations ostéo-articulaires fréquentes, dont l'enthésite, comme montré récemment [START_REF] Terenzi | Enthesopathy and involvement of synovioentheseal complex in systemic sclerosis : an ultrasound pilot study[END_REF].

De plus les résultats de cette étude ont pu être affectés par la relative inexpérience de l'échographiste, mais avant de commencer l'étude il s'est calibré sur une base de données d'images échographiques afin de limiter ce biais.

La taille de l'échantillon était peu importante, reflétant la rareté de cette pathologie, mais il s'agit à notre connaissance de la plus grande étude échographique réalisée à ce jour portant spécifiquement sur les synovites et les ténosynovites du pied chez les patients atteints de ScS classés selon les critères ACR / EULAR 2013.

Conflits d'intérêt : aucun

L 1 .

 1 'examen a été réalisé avec un échographe Esaote My Lab huit et une sonde linéaire de 6 à 18 Mhz. Les échographies ont été réalisées selon les recommandations de l'EULAR et les définitions de l'OMERACT(Outcome Measures in Rheumatology) pour la présence des synovites, épanchements, ténosynovites et du PDS (signal doppler) (20-23). Les aspects de ténosynovites scléreuses ont été individualisés des autres ténosynovites. Les paramètres du PDS étaient les suivants : fréquence de répétition des impulsions de 750 Hz, gain Doppler à 50 %, filtres bas et fréquence de 10 MHz. L'échographie comprenait un examen bilatéral avec vue longitudinale dorsale, et axiale le cas échéant, des articulations suivantes : radioulnaires distales, radiocarpiennes, médiocarpiennes, métacarpophalangiennes, interphalangiennes distale et proximale, talocrurales, médiopied (comprenant les articulations talonaviculaire, cunéonaviculaire et cunéométatarsienne), MTP (métatarsophalangiennes) et interphalangiennes du pied. Nous avons évalué l'atteinte synoviale des MTP en incluant ou non la MTP1, car elle a souvent un aspect pathologique même chez des sujets sains et car l'arthrose et fréquente à ce niveau (24). Les tendons et les gaines des tendons ont été analysés de manière bilatérale avec une vue axiale, et une vue longitudinale le cas échéant sur les sites suivants : les tendons fléchisseurs et extenseurs au poignet et à la main, les compartiments antérieur, latéral, interne et postérieur de la cheville. Les résultats ont été notifiés sous une forme standardisée. Éthique L'accord du comité d'éthique a été obtenu (CECIC Rhône-Alpes-Auvergne, Clermont-Ferrand, IRB 5891) et la non opposition des patients a été obtenue pour l'utilisation des données après information orale et écrite. Statistiques La prévalence d'au moins une synovite et celle d'au moins une ténosynovite clinique et échographique a été calculée globalement, puis séparément pour ce que nous appellerons ensuite « la main » (comprenant main et poignet) et « le pied » (comprenant pied et cheville). Nous avons utilisé le test du chi 2 ou le test exact de Fisher pour comparer des données qualitatives, et le test de Mann-Whitney ou le test t de Student en fonction de la présence ou non d'une distribution gaussienne pour les données quantitatives. Une valeur de p <0,05 a été considérée comme statistiquement significative. Nous avons utilisé le logiciel GraphPad 7.0 pour l'analyse statistique. Résultats Caractéristiques des patients Cinquante-cinq patients consécutifs ont été inclus de janvier 2018 à juin 2018. Un patient a refusé de participer. Les caractéristiques des patients sont présentées dans le Tableau Nous avions 15 % de syndromes de chevauchement entre la ScS et d'autres connectivites (syndrome de Sjögren n = 4, polymyosite n = 2, lupus érythémateux disséminé n = 1, cholangite biliaire primitive n = 1). Prévalence clinique et échographique des synovites et ténosynovites et détail des observations échographiques Les résultats concernant la prévalence sont présentés dans le Tableau 2. Les résultats détaillés des échographies sont présentés dans le Tableau 3.

  Spécifiquement pour les mains, l'échographie était également plus sensible pour la détection d'au moins une synovite que l'examen clinique (OR : 9,8, IC 95 % : 2,1 à 46,2).Concernant le pied, nous n'avons trouvé qu'une synovite clinique et aucune différence statistique entre l'examen clinique et l'échographie pour la présence d'au moins une synovite à ce niveau.Résultats pour les ténosynovitesL'examen clinique était moins sensible que l'échographie pour la détection d'au moins une ténosynovite (OR : 0, IC 95 % : 0 à 0,2). Six ténosynovites des chevilles, dont deux avec présence d'un PDS, n'ont pas été détectées par l'examen clinique. Trois patients avaient un aspect de ténosynovite sclérosante en échographie (Figure1), deux d'entre eux avaient déjà été détectés par l'examen clinique (TFR). Un patient présentait des troubles statiques majeurs du pied sans rapport avec sa ScS (pied plat) : l'analyse des données en excluant ce patient n'a pas modifié de manière significative les résultats.Corrélation de la présence de synovites cliniques / échographiques et de ténosynovites avec les autres caractéristiques de la maladieÉvaluation des corrélations entre les données cliniques et les caractéristiques de la maladieLa présence d'au moins une synovite clinique de la main était associée à un mRSS plus élevé (p = 0,047 ; médiane 6, IQR (Interquartile) : 3,0 à 17,0 contre médiane 3,5, IQR : 1,3 à 7,0) et à des patients plus jeunes (p = 0,020 ; moyenne 50,8 ± 3,7 ans contre 60,4 ± 1,8 ans). Les TFR étaient associés à un mRSS ≥14 (p = 0,018).

À

  notre connaissance, il s'agit de la première et de la plus grande étude échographique portant spécifiquement sur la détection des synovites et des ténosynovites du pied, et de la deuxième plus large étude échographique sur les synovites et les ténosynovites des mains chez les patients atteints de ScS classés selon les critères ACR / EULAR 2013. Un quart des patients avaient au moins une synovite des pieds en échographie, principalement localisée aux articulations MTP. Cela semble cohérent avec la prévalence observée dans d'autres connectivites. Dans une étude d'échographie, 20,9 % des lupus érythémateux disséminés avaient une atteinte synoviale des MTP (MTP1 incluse) (25).

L

  'échographie des pieds était plus sensible que l'examen clinique pour détecter au moins une synovite et détecter au moins une ténosynovite. Mais ces deux résultats n'étaient pas statistiquement significatifs, probablement du fait d'un manque de puissance dans notre étude en raison de la faible prévalence clinique des synovites et ténosynovites du pied dans la ScS. Dans la plus grande étude antérieure évaluant cliniquement le pied chez 100 patients atteints de ScS, 10 % des patients avaient des TFR à la cheville (les ténosynovites n'étaient pas individualisées dans cette étude), ce qui concorde avec la faible prévalence de notre étude. Bien que l'atteinte des pieds dans la ScS soit moins fréquente que celle des mains, l'échographie semble être un outil d'imagerie intéressant pour compléter l'examen clinique, le pied étant considéré comme complexe à évaluer cliniquement[START_REF] Montagna | Foot involvement in systemic sclerosis : a longitudinal study of 100 patients[END_REF][START_REF] Prevoo | Validity and reproducibility of selfadministered joint counts. A prospective longitudinal followup study in patients with rheumatoid arthritis[END_REF].Fait intéressant, les synovites des mains en échographie étaient associées à un handicap de la main plus élevé évalué par le CHFS, confirmant l'important impact de l'atteinte rhumatologique dans le pronostic fonctionnel de la ScS. À notre connaissance, il s'agit de la première étude comparant la synovite échographique avec le CHFS. D'autres études échographiques ont évalué le handicap avec le HAQ, le HAQ DI (Health assessement questionnaire disability index), le scleroderma HAQ ou le European Scleroderma Study Group activity index, mais aucune corrélation n'avait alors pu être constatée[START_REF] Cuomo | Ultrasonographic features of the hand and wrist in systemic sclerosis[END_REF][START_REF] Elhai | Ultrasonographic hand features in systemic sclerosis and correlates with clinical, biologic, and radiographic findings[END_REF].Dans une autre étude, une forte corrélation a été trouvée entre l'épaisseur de la poulie A1 et le test HAMIS (Hand Mobility in scleroderma test), un autre indice de handicap[START_REF] Tagliafico | The thickness of the A1 pulleys reflects the disability of hand mobility in scleroderma. A pilot study using high-frequency ultrasound[END_REF]. Nous n'avons trouvé aucune corrélation entre le CHFS et la présence de ténosynovites échographique, peut-être en raison de la faible prévalence des ténosynovites dans notre étude.Dans la littérature, un CHFS plus élevé reflète un handicap fonctionnel plus important lié aux mains, et est associé aux arthrites des mains (diagnostiquées cliniquement et non par échographie), aux rétractions digitales en flexion, aux ulcères digitaux, à un mRSS plus élevé et à la fibrose pulmonaire ; le handicap a également été associé aux TFR et aux douleurs articulaires[START_REF] Poole | The use of the Health Assessment Questionnaire (HAQ) to determine physical disability in systemic sclerosis[END_REF][START_REF] Peytrignet | Disability, fatigue, pain and their associates in early diffuse cutaneous systemic sclerosis : the European Scleroderma Observational Study[END_REF].

Figure 1 :

 1 Figure 1: Vue axiale en échographie de la face dorsale du poignet : extenseurs communs des doigts avec ténosynovite sclérosante (flèches)

  Tableau 2 : Prévalence de la présence d'au moins une synovite ou ténosynovite à l'examen clinique et en échographie

		Tableau 1 : Caractéristiques des patients
		Age en années, moyenne (DS)		Nombre de	58 (13) Nombre
		Sexe féminin, n (%)		patients (%)	48 (87) d'articulations
		Durée d'évolution de la maladie en années, moyenne (DS) Synovite Synovites des mains et poignets	10 (9) Ténosynovite
		mRSS, moyenne (DS) PDS 1 0	Clinique≥1 25 (45,4) US≥1	6 (7) Clinique≥1 55	US≥1
	mRSS ≥14, n (%) Main et poignet, n PDS 1	14*	5 (9,1)	29*	8 (15) 7	2	9
	CHFS, moyenne (DS) Main et poignet, % PDS 2 or 3	25	0 (0)	52	18 (16) 4 0	16
	Ulcères digitaux, n (%) Pied et cheville, n IPD 2	1	3 (5,4)	16	32 (58) 4 3	10
	FEVG<50%, n (%) Pied et cheville, % IPP 3	2	11 (20,0)	29	1 (2) 18		7	18
	Total, n	PID au scanner thoracique, n (%) MCP 4	14*	11 (20,0)	30*	16 (29) 6* 20	15*
	Total, %	HTAP, n (%) Poignet 5	25	16 (29,1)	55	1 (2) 20	11	27
	CVF <75%, n (%) 1 Signal Doppler positif, n Épanchement seul	na		6	9 (16) na 34	5
	DLCO <60 %, n (%) 1 Signal Doppler positif, % Ténosynovites des mains et poignets	na		11	13 (27) na	9
	Antécédent de CRS, n (%) TFR (clinique)/TeSy sclérosante (US), n PDS positif	na	1 (1,8)	na	1 (2) 2		2	3
	Forme cutanée : TFR (clinique)/TeSy sclérosante (US), % Aspect sclérosant	na	3 (5,4)	na	6		4	6
		LcScS, n (%) Extenseurs		8 (14,5)		45 (82) 10
		DcScS, n (%) Fléchisseurs		1 (1,0)		9 (16) 2
		Sine scleroderma, n (%) Synovites des pieds et chevilles				1 (2)
		Traitements : PDS 0		16 (29,1)		64
		Corticoïdes et traitements immunosuppresseurs 2 , n (%) PDS 1 1 (1,8)		21 (38) 1
		Corticoïdes seul, n (%) PDS 2 or 3		1 (1,8)		10 (18) 8
		Dose de prednisone en mg, moyenne (DS) MTP 6	14 (25,5)		6 (3) 39
		Traitement à visée articulaire, n (%) MTP excepté la MTP1		9 (16,3)		19 (35) 23
		Vasodilatateurs, n (%) IPP		4 (7,2)		33 (60) 5
		Bilan immunologique : Médiopied		3 (5,4)		4
		Anticorps anti-topoisomerase-1, n (%) Cheville		2 (3,6)		21 (38) 2
		Anticorps anti-centromère, n (%) Épanchement seul		25 (45,5)		21 (38) 134
		Présence d'autres auto anticorps 4 , n (%) Ténosynovites des chevilles			13 (27)
		PDS positif		5 (9,1)		11
		Aspect sclérosant		1 (1,8)		3
		Compartiment antérieur		2 (3,6)		2
		HTAP: hypertension artérielle pulmonaire, CVF: capacité vitale forcée, DLCO: capacité de Compartiment latéral 7 (12,7) 13
		diffusion du dioxyde de carbone, CRS: crise rénale sclérodermique, LcScS: Sclérodermie systémique Compartiment médial 6 (10,1) 8
		cutanée limitée, DcScS: Sclérodermie systémique cutanée diffuse 1 Nous avions 2 patients avec des données manquantes pour les épreuves fonctionnelles Compartiment postérieur 0 (0) 0
		respiratoires, les tests manquants ont été considérés comme normaux pour l'analyse.
		1. Signal Doppler puissance, 2. Interphalangiennes distales, 3. Interphalangiennes proximales 4.

n : nombre de patients, CHFS: Échelle fonctionnelle de la main de Cochin, mRSS: Score de Rodnan modifié, FEVG: fraction d'éjection du ventricule gauche, PID: pneumopathie interstitielle diffuse,

2

Hydroxychloroquine, méthotrexate, corticoïdes, mycophénolate mofetil, rituximab, leflunomide

3

Hydroxychloroquine, méthotrexate, corticoïdes, rituximab, leflunomide 3 PmSCL :1, NOR 90 : 1, ARN polymerase-3 : 1, Ku : 2, Ro52 : 10, anticorps anti nucléaires négatifs : 4, anticorps anti nucléaires sans spécificité : 2. Sept patients avaient une double spécificité. TeSy: ténosynovite, TFR: crépitation tendineuse, US: en échographie, n: nombre de patients, na: non adapté * p<0.05 entre la détection clinique et échographique Tableau 3: Résultats échographiques détaillés Metacarpophalangiennes, 5. Comprenant radioulnaire distale, radiocarpienne et médiocarpienne, 6. Métatarsophalangiennes