Laurent Cognet

Françoise Coussen

Daniel Choquet

Brahim Lounis

Fluorescence microscopy of single autofluorescent proteins for cellular biology

, DsRed. This genetic fusion of naturally fluorescent proteins to a protein of interest ensures a reproducible 1:1 stoichiometry in the cell, without the need for external chemical reactions and with the hope of less interference with the biological function and vitality of the cell.

. Applications of detection of single biomolecules labeled with autofluorescent proteins will then be discussed.

In this paper we review the applicability of autofluorescent proteins for singlemolecule imaging in biology. The photophysical characteristics of several mutants of the Green Fluorescent Protein (GFP) and those of DsRed are compared and critically discussed for their use in cellular biology. The alternative use of twophoton excitation at the single-molecule level or Fluorescence Correlation Spectroscopy is envisaged for the study of individual autofluorescent proteins. Single-molecule experiments performed in live cells using eGFP and preferably eYFP fusion proteins are reviewed. Finally, the first use at the single-molecule level of citrine, a more photostable variant of the eYFP is reported when fused to a receptor for neurotransmitter in live cells.

Key word: single-molecule, GFP, DsRed, fluorescence microscopy, two-photon excitation, fluorescence correlation spectroscopy.

Nous présentons une revue sur l'utilisation des protéines autofluorescentes en microscopie de molécules uniques en biologie. Les caractéristiques photophysiques de plusieurs mutants de la protéine fluorescente verte (la « GFP ») ainsi que celles de la DsRed y sont comparées et discutées de manière critique en vue de leur utilisation dans des cellules vivantes. Des méthodes alternatives d'excitation, telle l'excitation biphotonique, ou d'analyses, telle la méthode de spectroscopie par corrélation de fluorescence sont envisagées. Nous rendons compte d'expériences utilisant la eGFP et préférentiellement la eYFP au niveau de la molécule unique dans des cellules vivantes. Nous reportons enfin, la première utilisation au niveau de la molécule individuelle de la citrine, un mutant de la eYFP plus résistant au photoblanchiment et son application à l'étude de la dynamique de récepteurs de neurotransmetteurs individuels dans la membrane de cellules vivantes.

Mots clés : détection de molécules uniques, GFP, DsRed, microscopie de fluorescence, excitation à deux photons, spectroscopie par corrélation de fluorescence.

Introduction

Single molecule fluorescence detection is successfully obtained when careful control of the fluorescence background is achieved. Indeed, cellular autofluorescence might hinder the weak signal of individual fluorophores. Different techniques are commonly used in conventional fluorescence microscopy to diminish cellular autofluorescence: confocal microscopy or total internal microscopy for instance [START_REF] Lakowicz | Principles of Fluorescence Spectroscopy[END_REF]. Nevertheless, none of those techniques will be presented in this review since they present some disadvantages which are discussed later. Thus, we will address the issue throughout the whole review of the detection of single autofluorescent proteins in live cells using wide field fluorescence microscopy. The basic setup is presented on Fig. 1. It is composed of an inverted microscope equipped with a high NA oil-immersion objective (typ. ×100, NA=1.4). The samples are then illuminated for a few milliseconds by a single line laser (an Ar+ laser for the XFPs and a frequency doubled Nd:YAG laser for DsRed) at an illumination intensity of a few kW/cm 2 . By using an appropriate filter combination for a given fluorophore and highly sensitive CCD camera systems, the total detection efficiency of a typical experimental setup is in the range of 5-10%. Pioneer studies at the level of individual autofluorescent proteins were performed in vitro situation with purified protein immersed in biocompatible matrices [START_REF] Dickson | On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein[END_REF][START_REF] Peterman | The fluorescence dynamics of single molecules of green fluorescent protein[END_REF][START_REF] Jung | Confocal microscopy of single green fluorescent protein[END_REF][START_REF] Garcia-Parajo | Visualising individual green fluorescent proteins with a near field optical microscope[END_REF] or buffer [START_REF] Kubitscheck | Imaging and tracking of single GFP molecules in solution[END_REF]. Those studies have revealed anomalous fluorescence properties. The most striking behavior is the reversible photobleaching as revealed by Dickson and coworkers or "blinking" [START_REF] Garcia-Parajo | Real-time light-driven dynamics of the fluorescence emission in single green fluorescent protein molecules[END_REF], which have remained hidden in previous bulk studies. These phenomenon can be interpreted as a consequence of the presence of different non-fluorescent states. The lifetime and transitions between these states have been revealed by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) [START_REF] Widengren | Photodynamic properties of green fluorescent proteins investigated by fluorescence correlation spectroscopy[END_REF][START_REF] Schwille | Fluorescence correlation spectroscopy reveals fast optical excitation-driven intramolecular dynamics of yellow fluorescent proteins[END_REF]. A noticeable feature concern the broad range of the lifetime of these dark states (from µs to min) which makes difficult dynamic studies using autofluorescent proteins labeling. The photophysical characteristics of these proteins had then to be quantified in the time domain they will be used. More, one had to verify whether their fluorescence is changed from the in vitro to the in vivo case. In general, use of XFPs at the single molecule level aims at getting access to two important pieces of information : the first one is the localization of the protein with possibly dynamic information. The total number of photons a given molecule emits with no intermittence (no blinking) determines both the precision with which it can be localized [START_REF] Schmidt | Characterization of photophysics and mobility of single molecules in a fluid lipid membrane[END_REF] and the number of successive images that can be acquired. The best XFPs should be chosen according to this first parameter. The second piece of information comes from the intrinsic 1:1 labeling ratio of the fusion protein with the autofluorescent molecules. A number of proteins function as oligomers. For instance, in neurons, functional metabotropic glutamate receptors are dimers whereas ionotropic glutamate receptors are likely to be tetramers. Precise visualization of the stoichiometry when dynamical studies of neurotransmitter receptors are performed is then a very valuable added value. This can only be performed by good quantification of the fluorescence signal of the individual XFP.

In-vitro characterization of individual XFPs

The number of photons N det , detected from a single molecule in a given experimental arrangement, depends on the collection time t c , the excitation intensity I, the detection efficiency η det and the photobleaching/blinking yield at saturation ∞ bl τ 1 . It is given by:

⎥ ⎦ ⎤ ⎢ ⎣ ⎡ ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ + - - = ∞ ∞ ∞ ) / 1 ( exp 1 ) , ( det det I I t k t I N S bl c bl c τ τ η
where I S is the saturation intensity, and k ∞ the maximum photon emission rate. The exponential term describes the photobleaching and the blinking influence on the signal. In the case when photobleaching and blinking are negligible (i.e. In order to obtain generalized values that are not dependent on the specific experimental parameters, and hence easily comparable between each particular experiment, one can correct the data for the detection efficiency and illumination time effects. Such a generalized quantity is represented by the fluorescence rate:

+ = + - - + = ∞ ∞ ∞ τ τ η
The mean fluorescence rates (F(I)) of individual eGFP or eYFP have been measured in Harms et al [START_REF] Harms | Autofluorescent proteins in single-molecule research: applications to live cell imaging microscopy[END_REF] with excitation intensities between 0.5 and 20 kW/cm 2 . EGFP was excited at 488nm and eYFP at 514 nm. The values for the maximum emission rate, k ∞, and the saturation intensity, I S , were then deducted. As a result, when studied in polyacrylamide gels, the mean fluorescence rate of individual eGFP and eYFP are mainly identical (k ∞ ~ 3000 photons/ms). Furthermore photobleaching/blinking times are hardly different (τ bl ∞ ~ 3ms) which implies that the maximal number of photons emitted are identical for the two mutants. However, the saturation intensity for YFP is lower (I s = 7±2 kW/cm 2 ) than for GFP (I s = 13±3 kW/cm 2 ). This means that less excitation intensity will be needed to detect eYFP than eGFP. Due to fast photobleaching and poor quantum yield, detection of single fluorescent eCFP is challenging [START_REF] Brasselet | Single-molecule fluorescence resonant energy transfer in Calcium-concentration-dependent cameleon[END_REF] and attempts to fully characterize the fluorescence characteristics of the proteins remained unsuccessful [START_REF] Harms | Autofluorescent proteins in single-molecule research: applications to live cell imaging microscopy[END_REF]. The autofluorescence present in living cells is the major source of background which may prevent single molecules studies in vivo. Flavinoids which are in abundant concentrations in cells (10 6 -10 8 molecules/cell [29]) are the main source of this cellular autofluorescence in the yellow-green region [START_REF] Aubin | Autofluorescence of viable cultured mammalian cells[END_REF][START_REF] Croce | Dependence of fibroblast autofluorescence properties on normal and transformed conditions. Role of the metabolic activity[END_REF]. The spectral comparison of flavinoid and the various autofluorescence proteins shows that the absorption spectrum of flavinoid strongly overlaps with the excitation spectra of eCFP and eGFP, whereas the emission spectrum overlaps most strongly with that of eYFP, and minor with that of eCFP and eGFP. The saturation intensity of flavins has also been measured in bulk studies, and found to be equal to 35±10 kW/cm 2 [START_REF] Harms | Autofluorescent proteins in single-molecule research: applications to live cell imaging microscopy[END_REF]. Different methods can be used to reduce the cellular background and detect single XFPs. Excitation of the fluorescence through total-internal reflection (TIR) significantly reduces the excited volume which is limited to the evanescent wave region [START_REF] Ambrose | Single-molecule detection with total internal reflection excitation: comparing signal-to-background and total signals in different geometries[END_REF][START_REF] Funatsu | Imaging of single fluorescent molecules and individual ATP turnovers by single myosin molecules in aqueous solution[END_REF]. One disadvantage of TIR is the excitation intensity which decreases exponentially with the distance from the glass. Thus, a precise estimation of the intensity at the molecule position is very difficult given that most cells presents a membrane topology with a variance larger than 150 nm [START_REF] Giebel | Imaging of Cell/Substrate Contacts of Living Cells with Surface Plasmon Resonance Microscopy[END_REF]. That might result in more than 95% fluctuation in the excitation intensity of the evanescent field, which renders the analysis of signal amplitude of fluorophores hazardous. A second possibility to reduce background is to perform a short photobleaching treatment with an intense light pulse before the single molecule detection experiment [START_REF] Harms | Single-molecule imaging of ltype Ca 2+ channels in live cells[END_REF]. A third one would be to use confocal scanning microscopy which has the disadvantage to present a slow image acquisition rate in the single molecule configuration. Indeed, the collection time to detect a single XFPs, even at the fluorophore saturation regime can not be arbitrary shortened (typically 1-5 ms is a minimum with a detection efficiency of 5-10%). Parallelism being lost in confocal configuration with respect the use of CCD cameras, acquisition rates of images is limited. A final possibility would be to separated temporally the emission of fluorophores with a long lived excited state from flavins fluorescence by performing a time gated detection technique [START_REF] Wilkerson | Detection and lifetime measurement of single molecules in flowing sample streams by laser-induced fluorescence[END_REF][START_REF] Lacoste | Ultrahigh-resolution multicolor colocalization of single fluorescent probes[END_REF]. Whatever the experimental trick, knowledge of the emission properties of flavins will help to further optimize the experimental conditions. This can be done by optimization of the detection-ratio, R, describing the relative detection yields of the various autofluorescent proteins (XFP) and that of flavinoid (F), ) (

) ( XFP F XFP F XFP XFP XFP R λ σ η λ σ η =
, [START_REF] Harms | Autofluorescent proteins in single-molecule research: applications to live cell imaging microscopy[END_REF], for given detection efficiencies, η, and absorption cross sections σ(λ).

One find R = 1.8 for eCFP, R = 8.7 for eGFP, R = 405 for eYFP. Among the different XFPs, the YFP is then confirmed to be far superior to the others for single molecules studies in living cells both from the spectral point of view, and for the emission properties as stated above. It combines a high emission rate and a high detection-ratio with excitation at 514 nm.

In-vitro characterizations of individual DsRed

While the eGFP and its mutants have proved to be suitable for many applications [START_REF] Tsien | The Green Fluorescent Protein[END_REF][START_REF] Zacharias | Recent advances in technology for measuring and manipulating cell signals[END_REF] (see below), the relatively high quantum yield of photobleaching leaves room for improvement in applications which require a large number of emitted photons, such as in single-molecule studies. Also, the most red shifted mutant (eYFP) is not a strong emitter at long (>550 nm) wavelengths, where the interference from flavins is substantially less severe. Considering these issues, the discovery of a highly fluorescent red protein from the Discosoma genus of coral [START_REF] Matz | Fluorescent proteins from nonbioluminescent anthozoa species [In Process Citation[END_REF], DsRed (originally termed drFP583), has aroused intense interest [START_REF] Gross | The structure of the chromophore within DsRed, a red fluorescent protein from coral [In Process Citation[END_REF]. The protein is a superior emitter at long wavelengths when compared with GFP and its mutants, with a monomer molar extinction coefficient of 75000 L mol -1 cm -1 at 558 nm, and a 70% fluorescence quantum yield [START_REF] Baird | Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral [In Process Citation[END_REF]. For example, the detection-ratio criteria R introduced above gives R>10 4 for DsRed. Recent FCS [START_REF] Heikal | Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine)[END_REF] and analytical ultracentrifugation studies [START_REF] Baird | Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral [In Process Citation[END_REF] have provided strong evidence that the protein is tetrameric even at nanomolar concentrations. With wild-type emission at 583 nm, and the possibility to shift the fluorescence to longer wavelengths through strategic mutagenesis, DsRed may become the cellular reporter protein of choice.

Dsred is well excited by the 532 nm laser line of frequency doubled Nd:Yag laser. Harms et al [START_REF] Harms | Autofluorescent proteins in single-molecule research: applications to live cell imaging microscopy[END_REF] measured the saturation intensity of single DsRed when embedded in polyacrylamide gels, and a higher value is found in comparison to XFPs : (I s = 50 ± 10 kW/cm 2 ). Furthermore, DsRed is much brighter and more photostable than XFPs [START_REF] Lounis | Photophysics of DsRed, a Red Fluorescent Protein, from the ensemble to the single-molecule level[END_REF]. However, the photophysics of DsRed appears to be much different from the XFP's one but not less complicated. Indeed, single-molecule time traces of DsRed reveals multi-step photobleaching behaviors as evidenced by Lounis et al [START_REF] Lounis | Photophysics of DsRed, a Red Fluorescent Protein, from the ensemble to the single-molecule level[END_REF]: the intensity dropped either once (~45% of all cases analyzed in [START_REF] Lounis | Photophysics of DsRed, a Red Fluorescent Protein, from the ensemble to the single-molecule level[END_REF]), twice (also ~45%), or three and four times in ~10% of all cases. This behavior is conceptually well consistent with the multimeric character of DsRed. More strikingly, the height of the steps as well as their duration is not independent of the number of the step: the majority of the traces that displayed more than one step typically exhibited a large first drop followed by a period of weaker fluorescence before complete photobleaching to the background level. As proposed by Lounis et al, this emissive behavior may result from the coupling between the four chromophores via dipole-dipole energy transfer. In this model, the first period of high brightness corresponds to the fluorescence of an intact oligomer. After sometime, at least one of the constituent fluorophores bleaches under excitation, and the residual fluorescence from the remaining intact chromophores is either negligible or greatly reduced by trapping on the damaged chromophore(s). The calculated rate of energy transfer between intact fluorophores within a complex is significantly faster than the rate of emission [START_REF] Lounis | Photophysics of DsRed, a Red Fluorescent Protein, from the ensemble to the single-molecule level[END_REF]. Therefore, if the bleached fluorophore still absorbs efficiently but emits poorly, it can act as a trap for the energy of the absorbed photon and provide a suitable pathway for dissipating the energy via means invisible to our detection methods. Similar quenching effects have been observed in electronically coupled system like single-polymer spectroscopy [START_REF] Bout | Discrete Intensity Jumps and Intramolecular Electronic Energy Transfer in the Spectroscopy of Single Conjugated Polymer Molecules[END_REF] and photosynthetic antenna complexes [43]. One can also note that epifluorescence ensemble measurements performed on DsRed exhibits two time scales of photobleaching [START_REF] Lounis | Photophysics of DsRed, a Red Fluorescent Protein, from the ensemble to the single-molecule level[END_REF] which can also be interpreted by the single molecule observations: while the faster rate may represent the photobleaching of the intact protein, the slower rate may denote the bleaching rate for a chromophore that can dissipate its excited-state energy via nonradiative and non-damaging mechanisms.

Two-photon excitation

In order to largely increase the signal-to-background ratio for single-molecule detection of autofluorescent proteins in live cells, one could envisage to further shift the wavelength of the excitation light to the red by using two photon excitation. The basic advantage for using twophoton excitation is resting on the earlier observation that the two-photon absorption crosssection of a variety of fluorescent molecules scales super-linearly with the one-photon absorption cross-section [START_REF] Bubeck | Organic Molecules for Nonlinear Optics an Photonics[END_REF]. Hence, the ratio of the effective excitation rate of a fluorophore with high one-photon absorption cross-section, like the fluorescent proteins, and a fluorophore with a low one-photon absorption cross-section, like flavines, will be largely increased for two-photon excitation.

The second advantage of two-photon excitation is that it constitutes a good method to scan a three-dimensional tissue space with laser excitation configured to excite two (or more) photons at discrete locations in the tissue [START_REF] Denk | Two-photon molecular excitation in laserscanning microscopy[END_REF]. This particular applicability for depth discrimination in thick tissues results from the fact that fluorescence signal intensity is highly dependent on the degree of photon flux, which decreases rapidly as a function of distance from the focal plane. Measurements of the one and two-photon absorption cross-section of XFPs in bulk [START_REF] Blab | Two-Photon Excitation Action Cross-Sections of the Autofluorescent Proteins[END_REF] show a super-linear scaling behavior which has been previously described only for small organic molecules. Furthermore, the two-photon absorption spectra closely follow those measured for one-photon absorption. However, a significant blue shift is found in the two-photon absorption cross-section of the autofluorescent proteins which can be attributed to the participation of a vibrational mode in the two-photon absorption process. In a similar way to the one photon case, one can generalize the excitation-wavelength dependent relative detection yield for the autofluorescence proteins to the two photon case [START_REF] Blab | Two-Photon Excitation Action Cross-Sections of the Autofluorescent Proteins[END_REF]:

) ( ) ( ) ( / λ σ η λ σ η λ flavine flavine TPE OPE R =
where the experimental detection efficiencies for the various fluorophores, η, and the absorption cross-sections, σ OPE and σ TPE , for the one-or two-photon case are considered. In the case of two-photon excitation η/η flavine was close to unity. As a result, One find R = 36 at 860 nm for eCFP, R = 467 at 920 nm for eGFP and R = 566 at 960 nm for eYFP [START_REF] Blab | Two-Photon Excitation Action Cross-Sections of the Autofluorescent Proteins[END_REF]. As predicted, the autofluorescence should not be a limitation to the observation of single autofluorescent proteins in living cells using two photon excitation. In fact, the major limitation is due to fast photobleaching of the autofluorescent proteins. In the one photon case it does not prevent to observe single molecules, but in the two photon case it might be a severe limitation. Indeed, it has been found that the process is enhanced in the two photon case with respect to one photon excitation [START_REF] Chen | High-Order Photobleaching of Green Fluorescent Protein inside Live Cells in Two-Photon Excitation Microscopy[END_REF].

Fluorescence Resonance Energy Transfer

For the last three decades, FRET has been extensively used to study intra-and inter-molecular conformational changes as well as to measure distance on the nanometer scale in biological systems. FRET is the nonradiative transfer of electronic excitation energy from donor to acceptor dye molecules by a weak dipole-dipole coupling mechanism. The transfer efficiency was predicted by Förster to decrease with R, the distance between the two dyes, as 1/(1+(R/R 0 ) 6 ) [START_REF] Förster | Decocalized Excitation and Excitation transfer[END_REF]. R 0 , the Förster radius, is the distance corresponding to 50% energy transfer and depends on the photophysical properties of the dyes and their relative orientations. It allows distance measurements on the 2-to 8 nm scale depending on the FRET pair used and hence is well suited to study conformations of biological macromolecules. At the single-molecule level, FRET has first been observed between two dyes on a dry surface [START_REF] Ha | Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor[END_REF] and has been applied to ligand-receptor colocalization on a membrane [START_REF] Schuetz | Direct observation of ligand colocalization on individual receptor molecules[END_REF] and to study immobilized proteins and protein-DNA interactions in solution [START_REF] Ha | Single-molecule fluorescence spectroscopy of enzyme conformational dynamics and cleavage mechanism[END_REF]. All those pioneer studies used rhodamine dyes and Cy5 as a FRET pair. Among the different mutants of the GFP and DsRed, 3 pairs can be used to monitor protein-protein interaction via FRET [START_REF] Pollok | Using GFP in FRET-based applications[END_REF]: the preferred one is eCFP/eYFP, whereas, eGFP with DsRed [START_REF] Mizuno | Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance energy transfer[END_REF] and eBFP (a blue variant of the eGFP excited with UV light) and eGFP can be used. At the single molecule level, the possibility to use single XFPs in FRET studies has been demonstrated in vitro situation using the calcium dependent construct, so-called, cameleon [START_REF] Brasselet | Single-molecule fluorescence resonant energy transfer in Calcium-concentration-dependent cameleon[END_REF][START_REF] Miyawaki | Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons[END_REF]. It contains both one eCFP and one eYFP separated by a calmodulin linker. In a solution calcium free, no FRET is present between the eCFP (the donor) and eYFP (the acceptor) due to a large intra-molecular distance but on calcium binding, the proteins folds in a manner to provoke FRET between the two XFPs. However, up to know, no single molecule experiment has been reported in live cells using the XFPs presumably due to the difficulty to detect single XFPs alone. One can still predict that the better understanding of the photophysical characteristics of the fluorophore and better handling of the cell preparation for single molecule studies will help to go further in that direction. One should also mention that eCFP being difficult to detect, further progress of molecular biology to improve the mutants of the GFP, and the possibility to use DsRed coupled to eGFP for FRET studies [START_REF] Mizuno | Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance energy transfer[END_REF], will help to perform successful single molecule FRET studies using XFPs in live cells.

Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) analyzes the fluctuations in the fluorescence emission of small molecular ensembles in a very small volume. It was first developed as an alternative way of measuring the translational [START_REF] Magde | Thermodynamic Fluctuations in a Reacting System-Measurement by Fluorescence Correlation Spectroscopy[END_REF] and rotational [56] diffusion coefficients and chemical reaction rates of molecules in solution. It can provide information about a multitude of parameters, such as concentrations, molecular mobility or dynamics of fluorescently labeled molecules. Performed within diffraction-limited confocal volume elements, FCS is often proposed to provide a way for determining intracellular mobility parameters of very low quantities of fluorophores [START_REF] Dittrich | Accessing molecular dynamics in cells by fluorescence correlation spectroscopy[END_REF]. It is in fact directly linked to single molecule studies as correlations in the fluorescence signal are best contrasted when the number of fluorophores in the detection volume is in average less or equal to one. However, phenomenon such as photobleaching and intramolecular dynamics, which introduce fluorescence flickering must be carefully controlled when performing FCS studies to avoid unwanted artifacts.

In the general frame of this review, one can ask the question whether combining FCS methods and XFPs would give access to pertinent parameters when used in living cells. The longest correlation time accessible in FCS curves is given by the diffusion time of the molecules through the detection volume providing that the molecule does not photobleach before quitting the detection volume.

For a typical membrane protein, the maximal diffusion coefficient is of the order of D ~ 0.1µm 2 /s and for a typical FCS measurement, the surface in which the protein is illuminated is S ~ 0.1 µm 2 . The time it takes for the molecule to diffuse through the surface is then given by S/4D ~ 250ms. Fig. 2 gives the mean photobleaching time measured for eYFP molecules immobilized in polyacrylamide gels for two different illumination intensities. Photobleaching curves were fitted by : G(t) = N -1 × exp(-t/t f ). One find t f =10 ms for 4KW/cm 2 and 250 ms for 0.6KW/cm 2 . For slowly diffusing proteins, very low illumination intensities should then be used as in [START_REF] Harms | Single-molecule imaging of ltype Ca 2+ channels in live cells[END_REF]. Quantitative analysis of slowly diffusing proteins is then difficult due to poor signal-to-noise [START_REF] Schwille | Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes[END_REF]. It then becomes very difficult to perform accurate measurements on XFPs using FCS alone. FCS could then be more suitable to very fast processes such as fast diffusing

XFPs molecules [START_REF] Schwille | Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes[END_REF] or molecular interactions, providing that the internal photophysics of the chromophores is fully understood. Indeed XFPs themselves produces a high number of dark states present at almost all time scales (microseconds to seconds [START_REF] Widengren | Photodynamic properties of green fluorescent proteins investigated by fluorescence correlation spectroscopy[END_REF][START_REF] Schwille | Fluorescence correlation spectroscopy reveals fast optical excitation-driven intramolecular dynamics of yellow fluorescent proteins[END_REF]). These dark states could then be difficult to distinguish from the physical parameters under study.

Live cells studies

Among the different autofluorescent proteins, eYFP appears to be the best choice to perform single molecule studies in live cells, due to its brightness, spectral separation to flavins and absence of oligomerization. Studies in vitro are however not sufficient to ensure that single eYFP will be detectable in vivo. It is necessary to compare the signal of individual eYFP when fused to a protein expressed in a cell. Fusion of eYFP to pore-forming 1C -subunit of cardiac L-type Ca 2+ channel (eYFP-1C ) in HEK293 cells were studied [START_REF] Harms | Single-molecule imaging of ltype Ca 2+ channels in live cells[END_REF] as well as to metabotropic glutamate receptors for neurotransmettor (mGluR5) in COS-7 cells at the single molecule level (see fig. 3). Single eYFP are detectable with a very good signal to noise ratio (>10 on Fig. 3). Furthermore, we found no noticeable difference in the fluorescence characteristics of single eYFP detected in vitro and in live cells. This indicates that in vitro calibration of the fluorescence eYFPs can be used for in vivo measurements.

Due to the previously outlined difficulties to detect single XFP in cells, few articles relate the study of single XFP-fusion proteins in cells [START_REF] Harms | Autofluorescent proteins in single-molecule research: applications to live cell imaging microscopy[END_REF][START_REF] Iino | Single Molecule Imaging of Green Fluorescent Proteins in Living Cells: E-Cadherin Forms Oligomers on the Free Cell Surface[END_REF][START_REF] Harms | Single-molecule imaging of ltype Ca 2+ channels in live cells[END_REF]. Following the first report of the observation of single autofluorescent protein in a living cell (eYFP-Ni 2+ :NTA:DOGS lipids in the plasma membrane of HASM cells) by Harms et al, Iino et al used eGFP to reveal Ecadherin oligomers in living mouse fibroblast L cells. The choice of the eGFP mutant forced Kusumi's group to excite the fluorophore in total internal reflection. As pointed before, this excitation method, although efficient to remove cellular background might lead to misinterpretation in analyses of signal amplitude. Furthermore, internalization of the membrane proteins by endocytosis can not be distinguished from photobleaching in such a geometry. Stoechiometry is better accessible using wide field excitation which also permit to study proteins in other places than the basal membrane [START_REF] Harms | Single-molecule imaging of ltype Ca 2+ channels in live cells[END_REF]. Indeed, studies of eYFP-1C fusion proteins at the single molecule level in HEK293 cells using wide field imaging has permitted to measure the degree of aggregation of the Ca 2+ channel subunits [START_REF] Harms | Single-molecule imaging of ltype Ca 2+ channels in live cells[END_REF]. Comparison of the intensity distributions of the signals detected in the live cells and that obtained for purified eYFP show that while the intensity distribution obtained for purified eYFP is unimodal (close to a Gaussian curve), that for eYFP-1C expressed in HEK293 cells is multimodal. As a consequence, analysis of the distribution permits to calculate the mean number of proteins in a cluster which is found to be on the order of 40 [START_REF] Harms | Single-molecule imaging of ltype Ca 2+ channels in live cells[END_REF]. The analysis of the diffusion of single biomolecules via autofluorescent proteins even if possible using eYFP [START_REF] Harms | Single-molecule imaging of ltype Ca 2+ channels in live cells[END_REF] is strongly limited to very short trajectories due to photobleaching as described above. We recently tested citrine, a new variant of the eYFP [START_REF] Heikal | Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine)[END_REF][START_REF] Griesbeck | Reducing the Environmental Sensitivity of Yellow Fluorescent Protein[END_REF], which has been reported to be twice as more stable than eYFP in bulk studies [START_REF] Griesbeck | Reducing the Environmental Sensitivity of Yellow Fluorescent Protein[END_REF]. Preliminary results at the single molecule level using eYFP-mGluR5 or Citrine-mGluR5 constructs expressed in COS-7 and PTK2 cells show that the use of citrine could significantly increase the stability of the fluorophores. As an example, Fig. 4 show a typical trajectory of 10 points obtained from a single Citrine-mGluR5 in the plasma membrane of a COS-7 cell. In the same condition (illumination intensity of 4kW/cm 2 at 514 nm during 3ms/point), the typical trajectory length obtained from eYFP would be 3 to 5 points. Complete characterization of the citrine with respect to eYFP is in progress at the single molecule level.

Conclusion

This review proposed a state-of-art of the possibility to detect and image single autofluorescent proteins for studies in living cells. The characterization of different mutants of the GFP and comparison to DsRed in various biocompatible in vitro environments permits to conclude that to date eYFP (or even one of its mutant, citrine) is likely a superior choice for applications in dynamics of individually labeled fluorescent fusion proteins. This is due to its brightness, resistance to photobleaching (especially in the case of citrine), and detection ratio. However, there is still room for improvement as the origin of blinking is not completely elucidated and efforts are being made to optimize the fluorescence of these proteins. The possible advantages of DsRed, which are its long-wavelength emission, its resistance to photobleaching, and high fluorescence quantum yield, are good stimulants for further molecular biology improvement of the chromophore. It suffers still from its tetramerization behavior and multicolor emission [START_REF] Cotlet | Identification of different emitting species in the red fluorescent protein DsRed by means of ensemble and single-molecule spectroscopy[END_REF]61].

The viability of single-molecule fluorescence in live cell studies was also presented through different examples. In particular, the possibility to "count" the molecules in a cell is a very promising feature of the use of the autofluorescent proteins in biology. One should mention still that in live cells, experiments with individual autofluorescent proteins are a challenging task and that further research and technological advancements will be needed before the methods is used as a routine in biology laboratories.

Figure 1 :

 1 Figure 1:

Figure 2 :

 2 Figure 2:

Figure 3 :

 3 Figure 3:

Figure 4 :

 4 Figure 4:

Acknowledgments: We wish to warmly thank Thomas Schmidt for helpful discussions and Jacqueline Butter for taking the data on citrine. We thank Françoise Rossignol for help in performing the citrine constructs. This work was supported by grants from the CNRS, the Conseil Régional d'Aquitaine and the Ministère de la Recherche.


Stéphane Berciaud

Laurent Cognet

Gerhard A Blab

Brahim Lounis

Photothermal heterodyne imaging of individual non-fluorescent nano-objects

published or not. The documents may come     Photothermal heterodyne imaging of individual nonfluorescent nanoclusters and nanocrystals.

page 2 of 15 In the fast evolving field of nanoscience, where size is crucial for the properties of the objects, simple and sensitive methods for the detection and characterization of single nano-objects are needed. The most commonly used optical techniques are based on luminescence. Single fluorescent molecules have been studied on their own and are now routinely applied in various research domains ranging from quantum optics 1-3 to life science 4 . Yet, fluorescent molecules allow only for short observation times due to inherent photo-bleaching. The development of brighter and more stable luminescent objects, such as semiconductor nano-crystals 5,6 has remedied some of this shortcoming but this improvement has come at the price of a strong blinking behavior.

An interesting alternative to fluorescence methods relies solely on the absorptive properties of the object. At liquid helium temperatures single molecules were initially detected by an absorption technique owing to the high quality factor of the zero-phonon line which gives a considerable absorption cross-section at resonance 7 (few 10 -11 cm 2 ). Single ions or atoms isolated in rf-traps 8 or high Q cavities 9,10 have been detected by absorption of a probe beam. In general, particles with large absorption cross sections and short time intervals between successive absorption events are likely candidates for detection with absorption methods 8 .

Metal nanoparticles fulfill both of these requirements: excited near their plasmon resonance a nanometer sized gold nanoparticle has a relatively large absorption cross section (~8 10 -14 cm 2 for a 5 nm diameter particle) and a fast electron-phonon relaxation time (in the picosecond range 11 ).

Since luminescence from these particles is extremely weak, almost all the absorbed energy is converted into heat. The temperature rise induced by the heating leads to a variation of the local index of refraction. Previously, a polarization interference contrast technique has been developed 12 to detect this photothermal effect. In that case, the signal is caused by the phase-shift induced between the two spatially-separated beams of an interferometer, where only one of the beams propagates through the heated region, and images of 5nm diameter gold nanoparticles have been recorded with a signal-to-noise ratio SNR ~ 10. Also, the sensitivity of this technique, although high, is ultimately limited by the quality of the overlap of the two arms of the interferometer as well as by their relative phase fluctuations.

In this letter we introduce a new, more sensitive, and much simpler method for detecting non fluorescent nano-objects. It uses a single probe beam which produces a frequency-shifted scattered field as it interacts with time-modulated variations of the refraction index around an absorbing nano-object. The scattered field is detected by its beatnote with the probe field which plays the role of a local oscillator as in heterodyne technique. Because this new method is not subject to the limitations mentioned above, a two orders of magnitude improvement of the sensitivity is achieved compared to the previous photothermal method. This allows for the unprecedented detection of small absorptive objects such as individual metallic clusters composed of 67 atoms.

When a small gold nanoparticle (or any absorbing nano-object) embedded in a homogeneous medium is illuminated with an intensity modulated laser beam, it behaves like a heat point source with a heating power ( ) [ ]

t P heat Ω + ⋅ cos 1
, Ω being the modulation frequency and heat P the average absorbed laser power. It generates a time-modulated index of refraction in the vicinity of the particle with a spatio-temporal profile given by [START_REF] Carslaw | Conduction of heat in solids[END_REF]  

          - Ω + ∂ ∂ = ∆ - th R r th heat e R r t r P T n t r n cos 1 4 ) , ( πκ
,
where r is the distance from the particle, n the index of refraction of the medium,

T n ∂ ∂ its variations with temperature ) 10 (~1 4 - -K , C R th Ω = κ
2 the characteristic length for heat diffusion, κ the thermal conductivity of the medium and C its heat capacity per unit volume. A probe beam interacting with this profile gives rise to a scattered field containing sidebands with frequency shifts Ω. As any heterodyne technique, interference between a reference field E ref (either the reflection of the incident probe at the interface between a cover slip and the sample or its transmission, see figure 1A) and the scattered field produces a beatnote at the modulation frequency Ω which can be easily page 4 of 15 extracted with a lock-in amplifier.

In practice, we overlay a (red) probe beam (720nm, single frequency Ti:Sa laser) and a (green)

heating beam (532 nm, frequency doubled Nd:YAG laser) whose intensity is modulated at Ω (100 kHz to 15 MHz) by an acousto-optic modulator (see figure 1A). Using a high aperture objective (100x, Zeiss, NA=1.4), both beams are focused onto a same spot on the sample. A combination of a polarizing cube and a quarter wave plate is used to extract the interfering reflected field (so-called reference field) and backward scattered field. Optionally, a second microscope objective can be employed to efficiently collect the interfering probe-transmitted and forward-scattered fields. The power of the heating beam ranged from less than 1µW to 3.5 mW (depending on the nanoparticle size to be imaged) at the objective. Reflected or transmitted red beams are collected on fast photodiodes and fed into a lock-in amplifier to detect the beat signal at Ω. Throughout the experiment, we used an integration time of 10 ms. A microscopy image was formed by moving the sample over the fixed laser spots by means of a 2D piezo-scanner.

The samples were prepared by spin-coating a solution of gold nanoparticles (diameter of 1.4nm, 2nm, 5nm, 10nm, 20nm 33nm or 75nm, diluted into a polyvinyl-alcohol matrix, 2% mass PVOH) onto clean microscope cover slips. The dilution and spinning speed were chosen such that the final density of spheres in the sample was less than 1 µm -2 . Application of a silicon oil on the sample insures homogeneity of the heat diffusion. The size distribution of the nanospheres was checked by transmission electron microscopy (data not shown) and was in agreement with the manufacturer's specification.

Figure 1B shows a three-dimensional representation of a photothermal heterodyne image of small gold aggregates of 67 atoms (1.4 nm nanogold). The image shows no background from the substrate, which means that the signal arises from the only absorbing objects in the sample, namely the gold aggregates. They are detected with a relatively small heating power (~3.5mW) and a remarkably large signal-to-noise ratio (SNR >10). We further confirmed that the peaks stem from single particles by generating the histogram of the signal height for 272 imaged peaks (Figure 1C).

We found a monomodal distribution with a width in agreement with the spread in particle size.

In order to estimate the measured signal, we have used the theory of "scattering from a fluctuating dielectric medium" [START_REF] Chu | Laser Light Scattering[END_REF] to calculate the field scattered by the modulated index profile ) , ( t r n ∆

. The beating at Ω between the reference and scattered fields leads to a beating power S at the detector with two terms in quadrature [START_REF] Berciaud | [END_REF] : The magnitude of demodulated signal delivered by the lock-in amplifier is proportional to:

( ) ( ) ( ) ( ) [ ] t g t f C P P I T n n S heat ref inc Ω Ω + Ω Ω Ω ∂ ∂ = sin cos 1 2 κ κ λ α (
( ) ( ) ( ) 2 2 2 1 Ω + Ω Ω ∝ ∝ κ κ g f t S S t dem (2)
The frequency dependence of this signal measured on single particles is presented on figure 2. A good quantitative agreement with the theoretical form of S dem is obtained.

To further ensure the validity of our calculations, we used Eq. 1 to estimate the beating power at the detector. A single 2nm gold nanoparticle has an absorption cross section of ~5.10 -15 cm 2 at 532nm page 6 of 15 and will absorb nW P heat 10 = when illuminated by a laser intensity of 2MW/cm 2 . For a probe incident power P inc =70mW, a frequency Ω/2π =800kHz and a reference power P ref =100µW, Eq. 2

gives the beating power S dem ~5nW. After calibration of the detection chain, we measured a beating power of ~2nW in qualitative agreement with the theoretical prediction.

Figure 3B shows a linear dependence of the signal with heating power. A further increase on the power is not accompanied by saturation but leads to fluctuations in the signal amplitude and eventually irreversible damage on the particle [START_REF] Takami | [END_REF]17 .

As a first application of this method, we studied the size dependence of the absorption cross section of gold nanoparticles (at 532nm, close to the maximum of the plasmon resonance) with diameters ranging from 1.4nm to 75 nm. To do so, we prepared different samples containing nanoparticles of two different (successive) sizes (1.4 & 5nm, 2 & 5 nm, 5 & 10 nm up to 33 & 75 nm). For each sample, a histogram of the signal amplitudes was generated as exemplified on figure 3. All the histograms displayed bimodal distributions and the mean of each population was measured. This allows to report the size dependence of the absorption cross section normalized to that of 10 nm particles (figure 3B). As expected by the Mie scattering theory, we find a good qualitative agreement with a third-order law of the absorption cross-section vs the radius of the particles 17 (solid line on figure 3B). By removing ensemble averaging, this approach opens up the possibility to investigate the size dependent optical material functions of small metal clusters such as the dielectric permittivity [START_REF] Kreibig | Optical Properties of Metal Clusters[END_REF] .

As shown in figure 1, we are now able to detect metal nanoparticles as small as 1.4 nm in diameter with a good SNR (>10) which is shot-noise limited. To our knowledge, this is the first time that such small aggregates are being detected with purely optical methods. While the absorption crosssection of these clusters is only of the order of 10 -15 cm 2 , comparable to that of a good fluorophore, or CdSe/ZnS nanocrystals [START_REF] Lounis | [END_REF]20 , their relaxation times are very short. In contrast, luminescent semiconductor nanocrystals or fluorescent molecules have radiative relaxation times in the page 7 of 15 nanosecond range, which renders them difficult to be detected by their absorption. However, at relatively high excitation intensities, semiconductor nanocrystals do no longer exhibit luminescence. Efficient non-radiative relaxation pathways open up with short relaxation times relying on Auger multi-exciton relaxation processes 21,22 which make them detectable by our method. Figure 4a shows a fluorescent image of luminescent colloidal CdSe/ZnS quantum dots (peak emission at 640nm) excited by the heating beam at very low intensities (0.1 kW/cm 2 ). The blinking behavior characteristic of single quantum dot emission, is clearly visible in the image 23 . A photothermal heterodyne image of the same region was recorded afterwards at an excitation intensity of 5MW/cm 2 where quantum dots are no longer luminescent (figure4B). The two images correlate well, ensuring that the spots in the photothermal heterodyne image are indeed individual quantum dots (>90% of the fluorescent spots correlate with a photothermal spot). They do not show any blinking behavior. Interestingly, initially non-fluorescent quantum dots (absent from Figure 4A) are now detected by the photothermal technique.

For biological applications, the temperature rise at the surface of the nanoparticle is an important issue 24 . In the current configuration, a 5 nm gold nanoparticle can be detected with a SNR >100 at a heating power of 1mW. At this power, we estimate a local temperature increase of 4 K in aqueous solutions. As the temperature reduces as the inverse of distance, and most conceivable microscopy applications in biosciences do not require such a high SNR, the method presented in this letter will permit to image small gold particles by inducing a local heating of far less than 1 K above the average temperature in the sample.

The present work demonstrates the advantages of photo-thermal heterodyne detection for absorbing nano-objects. As any far-field optical technique, it has a wavelength limited resolution.

An interesting challenge would now be to combined the unprecedented sensitivity of the method presented here with the sub-wavelength resolution of near-field optical techniques 25

  1) with α a geometry factor close to unity, I inc the incident red intensity at the particle location and P ref the reference (back-reflected) beam power. the modulation frequency and the thermal diffusivity of the medium. The variations of figure 2A for κ/C=2.10 -8 m 2 /s. At low frequencies, the characteristic length of the heat diffusion th R is larger than the probe spot size (~λ/2) and the term ( ) Ω Ω / κ f , in phase with the applied modulation, is preponderant. However, at sufficiently high frequencies such that λ <<

Figure captions:Figure 1 :

 1 Figure captions:

Figure 2 :

 2 Figure 2: (A) Measured dependence of the signal (diamonds) on the modulation frequency Ω measured on a single 5 nm nanoparticle and comparison with theory using equation (2) (solid line). The variations of ( ) Ω Ω / κ f

Figure 3 :Figure 4 : 15 Figure 1 page 13 of 15

 3415115 Figure 3: (A) Signal distribution obtained from a sample containing both 2 nm and 5 nm gold nanoparticles. (B): size dependence of the signal i.e. absorption cross section (circles) deduced from a series of histograms as presented in Figure 3 A, and comparison to the Mie theory (solid line)

Figure 2 page 14 of 15

 215 Figure 2

Figure 3 page 15 of 15

 315 Figure 3

Figure 4

 4 Figure 4

  . The study of page 8 of 15 the physical properties of very small metallic aggregates or non-luminescent semiconductor nanocrystals is now possible at the individual object level. This photothermal method doesn't suffer from the drawbacks of blinking and photobleaching and is immune to the effects of fluorescing and scattering backgrounds. It could be applied to many diffusion and co-localization problems in physical chemistry and material science and to track labeled bio-molecules in cells. A. Hartschuh, E.J. Sanchez, X.S. Xie, et al., Phys. Rev. Lett. 90,09503 (2003).

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Special Issue Science 283 (1999).

Acknowledgement

We wish to thank A. Brisson and O. Lambert for their assistance with electron microscopy experiments, P. Tamarat and O. Labeau for their help with the quantum dots, M. Orrit and D. Choquet for helpful discussions,. GAB acknowledges financial support by FWF (Schrödinger-Stipendium) and the Fondation pour la Recherche Médicale. This research was funded by CNRS (ACI Nanoscience and DRAB), Région Aquitaine and the French Ministry for Education and Research (MENRT).


Michel Rithy Antelme

Joseph Deth Thach

Joseph Deth

Thach Compte

Pinnow, Shorto, Sidwell, Smalley Noss

Vickery Thomas

Lewitz / Pou

Maspero, Ménétrier, Rongier, etc. Martin

N Chiang

Suj Hiang

Sisowath

à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.

langue khmère à un lectorat anglophone non averti, ce qui n'empêche pas l'usage abondant du métalangage linguistique.

Le chapitre 1 porte sur la phonologie et l'orthographe du khmer. Bien que très détaillé, on peut regretter certains oublis. Par exemple, dans son tableau des consonnes (p. 1), Haiman a introduit le /f/ qui est un emprunt à des langues comme le siamois, le français ou l'anglais. Il aurait été alors judicieux d'inclure le /z/, emprunté au français et à l'anglais. Sa transcription des voyelles (p. 1-2, 5-7) est à première vue déroutante. Elle est en fait extrêmement précise et a été assurément conçue pour être « parlante » à un lectorat anglophone natif. Par exemple, la voyelle /ɑ/ est notée aw, et /ɑː/ : aw:. Bien qu'utilisant quelques signes de l'API pour expliquer son système de transcription, le parti pris de l'auteur est de ne pas utiliser l'API, ni des accents, pour s'en tenir au clavier strictement anglo-saxon. Un tel choix est totalement assumé par l'auteur (par exemple, son refus de représenter les deux registres de voix contrairement à certains de ses prédécesseurs, se comprend, car cette distinction a disparu de nombreux parlers dont ceux du centre du Cambodge, pour devenir minoritaire). Cependant, sa transcription au lieu de faciliter la lecture, l'obscurcit. Il faut, par exemple, sans cesse avoir à l'esprit que ee: correspond à /eː/ et e: à /ɛː/, que a correspond parfois à /a/, d'autres fois à un shwa. Le fait de ne pas utiliser l'écriture khmère semble avoir conduit Haiman à faire des erreurs qui portent préjudice à sa description, par exemple, p. 6, en écrivant que : « For example <priap> [priːəp] in written in the "clear register" means "pigeon", and in "breathy register" means "compare", but they are heard as homophones ». Le terme pour « pigeon », brāp en translittération est en effet entendu prononcé comme prīep « comparer » dans de très nombreux parlers, mais le premier terme fait partie du registre de voix soufflée pour les parlers qui ont toujours les deux registres de voix, tandis que le deuxième relève du registre de voix claire. De plus, si oralement la distinction n'est plus faite dans de nombreuses régions du Cambodge, elle s'entend toujours dans la langue parlée de certaines régions comme Battambang ou à Surin, mais par une opposition vocalique et non plus de registre de voix, ce qui aurait permis à l'auteur de comprendre que dans le cas de ces deux mots, il ne s'agit aucunement d'une perte de distinction entre la voyelle īe au registre clair et au registre soufflé. On se trouve en fait en présence d'une ancienne voyelle ā associée à d'anciennes consonnes sonores devenues sourdeslorsque le khmer a été touché il y a quelques siècles par une vague de dévoisement consonantique -, face à la voyelle īe, ainsi qu'en attestent l'orthographe et la prononciation dans certaines régions. Ainsi, à Battambang comme dans des régions khmérophones du sud du Vietnam, « pigeon » est prononcé /preːəp/ alors que « comparer » se dit /priːəp/, tandis que dans les provinces khmérophones de Surin, Buriram et Sisaket en Thaïlande, « pigeon » se dit /priːəp/ et « comparer » : /prɩːp/.

Cette partie phonétique très dense devrait être nuancée, voire rectifiée, à plusieurs endroits qu'il n'est pas possible de tous citer. Par exemple, p. 7, le dérivé de tiay « prédire » donne bien t-umn-iaj [tumniəj] ([tʊmniəj] aurait peut-être été une meilleure représentation), mais Haiman considère que la forme [təmniəj] est impossible alors qu'elle s'entend chez des locuteurs, lors d'une prononciation intermédiaire entre prononciation articulée de lecture et prononciation du parler quotidien, tout comme c-am-rieng [cəmriəŋ] « chanson ». La tentative d'explication de l'auteur sur les dérivés par dissyllabisation de mots de registre de voix claire et de ceux de registre à la voix soufflée est correcte quand on s'en tient à la prononciation de lecture, mais cette distinction n'est plus pertinente dans le parler oral.

De même, la réduction du /r/ initial en l/_C décrite comme optionnel par Haiman dans les mots sesquisyllabiques (p. 16, 22, 114), à savoir qu'il y a lénition du /r/ en /l/ dans certains mots et substitution du /r/ en arrêt glottal dans d'autres cas est en effet tout à fait connue. Cependant, il faut nuancer : ce phénomène ne recouvre pas l'ensemble de l'aire khmérophone. Ainsi, à Surin, raho:t « toujours, jusqu'à » signalé par l'auteur (p. 22) n'est jamais prononcé laho:t dans la langue orale, contrairement à ce que l'on constate dans de nombreuses autres parties de l'aire khmérophone. De même rateh « charrette » (pour suivre le système de transcription de Haiman) (exemple non donné par Haiman) s'y prononcera toujours ainsi et non pas ateh comme on peut l'entendre dans le centre du Cambodge. Par contre ralum « s'effondrer » (exemple non cité par Haiman) qui devient alum dans le centre du Cambodge s'entend prononcer lalum à Surin (et probablement dans certaines parties de Siem Reap), le r initial étant neutralisé par le deuxième /l/ pour devenir également /l/.

Pour un ouvrage d'une telle ampleur sur la langue khmère et qui, malgré son côté se voulant accessible, Haiman avait trois possibilités (qui ne s'excluent pas les unes les autres) : utiliser l'excellente transcription phonétique de Franklin Huffman (Cambodian system of writing and beginning reader, 1970) pour n'en citer qu'une, utiliser le système de translittération scientifique pour les langues indo-aryennes qui a l'inconvénient de ne pas rendre la prononciation du (des) khmer(s) moderne(s) et ajouter en plus de l'un ou l'autre des deux premiers systèmes les exemples en écriture khmère. Le fait de ne pas utiliser la translittération ou l'écriture khmère devient problématique quand il s'agit de parler d'orthographe du khmer, en particulier de celle pour les emprunts au sanskrit et au pāli, où des consonnes ou des voyelles finales ne sont plus prononcées mais toujours écrites, le fait de ne plus les prononcer étant signalé dans de nombreux cas par un signe spécial.

Haiman mentionne deux formes de variations non phonémiques : celle correspondant à la lecture (sans tenir compte des variations dialectales) et celle correspondant à une prononciation parlée qu'il appelle « informal » ou « demotic style » (p. 3). Toute personne parlant le khmer connaît en effet bien ces deux formes de prononciation. Il est cependant incorrect de dire que « All literate speakers have at their disposal a written register which they can pronounce in at least two styles, careful and informal. In addition, they can speak the demotic style which they tend to dismiss with some embarrassment. Illiterate speakers have no other style. » Une telle assertion mérite d'être nuancée. Le demotic style est utilisé par tous les Khmers dans leurs conversations, car il n'implique aucune valeur de classe sociale. Certes, dans un discours formel et officiel, le style et la prononciation s'aligneront sur l'orthographe sans amuïssement de la première syllabe des dissyllabes. De tels locuteurs pourront également utiliser des mots du discours qui sont maintenant considérés comme relevant d'un style littéraire. Cependant, même un Khmer illettré, voire analphabète, a connaissance de la prononciation littéraire du khmer et de mots appartenant à la langue littéraire, tout simplement par l'écoute des médias et des chansons. L'auteur cite une jeune femme, « an extremely gifted half-literate consultant, a young woman who spoke both fluent colloquial English and totally colloquial Khmer. Not only could she not recognize a large number of expressions from my written texts […] ». Cette remarque aurait mérité d'être appuyée par des exemples précis afin de mieux comprendre de quel genre d'expressions il s'agit (des expressions obsolètes ?).

De même, à la note n o 3 à la fin de ce chapitre (p. 26), l'auteur déclare : « […] I believe that the vocalic reduction of the initial syllable in the demotic played a central role in the development of both the written and spoken registers […] », ce qui peut faire l'objet de débats. La réduction de la syllabe initiale est connue et comprise de tous les khmérophones (natifs comme apprenants, du moins pour ceux qui entendent parler le khmer en dehors de la classe) et joue assurément un rôle dans le développement du khmer parlé, mais on se demande en quoi elle aurait joué un rôle dans celui du khmer écrit.

Dans le chapitre 1 (p. 3), l'auteur fait une remarque intéressante sur le timbre de voix des jeunes filles qu'il trouve très haut perché (high-pitched) et nasalisé (highly nasalized). Comme il le constate, cela n'a jamais fait l'objet d'études et l'auteur lui-même n'y consacre que 13 lignes.

Cela nous conduit au 2 e chapitre sur la structure des mots. Outre les deux informateurs déjà cités en introduction, Haiman introduit un 3 e locuteur (p. 30) pour appuyer son propos sur la réduction des mots dans la langue parlée (p. 30), qui est « a former undergraduate student aged about twenty when I knew him, spent the first years of his life in a refugee camp in Thailand, emigrated to America as a boy, and uses Khmer to talk to his grandmother, but is illiterate in Khmer. » Il aurait crucial de donner l'origine géographique de la famille de ce locuteur, car les exemples de réduction donnés sont pour certains surprenants et ce locuteur ne semble en fait pas maîtriser le khmer et ne pas être représentatif des locuteurs khmers parlant couramment leur langue, comme si le développement de l'approfondissement et de la maîtrise de son (ancienne) langue maternelle s'étaient arrêtés à la petite enfance (même s'il continue à le parler avec sa grand-mère, mais on peut se demander à quelle fréquence et quelle est la profondeur et la richesse lexicale des échanges entre ces deux personnes). Que des mots comme knjom « je », tralawp « retourner » et kanda:l « milieu » devienne njom, talawp et kada: se constate, pour les deux premiers chez de nombreux locuteurs, quelle que soit leur région d'origine. Quant à kanda:l qui devient kada:, on constate en effet la disparition du /l/ final après des voyelles longues chez certains locuteurs, dont ceux du centre du Cambodge (les îles sur la rive gauche du Mékong en particulier). Par contre, que kmuaj « neveu » devienne muaj, ou krada:h « papier » : kada: (ne se distinguant alors pas de kada: « milieu »), et babaw: « soupe de riz » : baw: ne paraît pas représentatif des locuteurs. De même, que banthaem « ajouter » devienne (p)thaem est possible pour la forme pathaem (/pəthaːɛm/), mais pas sous la forme thaem /thaːɛm/, qui est le verbe-racine. De même que banta:w « continuer (verbe transitif) » devienne par réduction ta:w est étonnant car ta:w est le verbe-racine et ne s'emploie pas dans les mêmes contextes que son dérivé. Soit le locuteur a utilisé avec justesse ces deux soi-disant formes réduites que l'auteur a confondues avec leurs formes dérivées, soit le locuteur en question ne sait pas parler correctement le khmer. Il aurait donc été intéressant de connaître la région d'origine de ce locuteur, tout en ayant plus de précisions sur son parcours. En l'absence de plus de renseignements, on aurait donc tendance à soupçonner qu'il parle le khmer d'un tout petit enfant qui était encore dans sa phase d'apprentissage de la prononciation de sa langue maternelle, avant de se retrouver aux États-Unis et de basculer dans l'usage de l'anglais au détriment de sa langue d'origine.

Pour en revenir au premier chapitre, décrire la phonétique du khmer, qui connaît des variations régionales comme le souligne l'auteur, nécessite non seulement une bonne maîtrise du vocabulaire khmer, mais aussi une bonne connaissance des différences phonétiques des parlers khmers pour éviter des généralisations qui peuvent être vraies pour une région donnée, voire plusieurs, mais pas pour l'ensemble des parlers khmers. Ainsi, p. 11, l'auteur cite : <baok 'ut> "wash + "iron" "launder", mais signale que la plupart des locuteurs prononcent en fait [bao.koə'] ~ [bao.kuə'] ~ [bao.ku'], et d'en conclure que « [n]ot only was the morpheme-initial glottal stop of <'ut> completely elided, resyllabification transferred with the final consonant of the first word to the beginning of the second. » Malheureusement, son interprétation est fausse, le terme /baːɔʔ/ qui signifie « frapper » et par extension « laver (le linge) » garde son arrêt glottal, qui peut ne pas vraiment s'entendre par une oreille non avertie par le fait que le mot suivant commence par un /k/, mais de plus le mot suivant n'est pas la déformation de /ʔut/ « repasser », mais un autre mot /kuəʔ/ (les trois variantes données par Hainam sont des variations régionales) signifiant « frapper, cogner », les deux termes étant tout simplement une autre façon de dire « laver (le linge en frappant) » et non pas « laver et repasser ».

Dans sa partie sur les shwas (p. 13-15), on constate aussi quelques erreurs : le mot sdac « roi » s'entend en effet [sədac] comme le signale l'auteur, par exemple dans la région de Surin où les locuteurs peuvent parfois hésiter entre cette prononciation et celle de [sdac], mais sur l'aire de répartition des parlers khmers, la forme [sdac], qui se rapproche de l'orthographe, est la plus courante. Par contre (p. 13), si la forme [kəlaŋ] est bien attestée à l'oral comme réduction de [kɑmlaŋ] « force », le mot pour « (être) fort » est [khlaŋ] mais ne connaît pas la variante [kəlaŋ] à notre connaissance. P. 14, le mot « kmee:ng » (kmeṅ) « enfant » s'entend prononcer « khmee:ŋ » ou « khmee:ɲ » comme le signale Haiman, mais /k ə meːɲ/ à Surin, conformément à l'orthographe.

Toujours concernant la phonétique, il est dommage que Haiman reprenne, par exemple dans le chapitre 1 sur la phonologie et l'orthographe (p. 23) et dans le chapitre 4 (p. 116) sur les symmetrical compounds, les erreurs de certains auteurs à propos de la prononciation du dialecte de Phnom Penh. Pour ne citer qu'une partie des exemples donnés par l'auteur : rauj et roam (p. 23) ne deviennent pas hauj et hoam, cro:m cre:ng, crul cruah, kria kraw:, praeu prae (erreur pour praeu prah), preum prej, ree: ria et rwang ra:v (p. 116) ne deviennent pas co:m ce:ng, cul cuah, kia kaw:, phaeu phae, pheum phej, hee: hia et hwang ha:v, par simple élision du /r/ vibrant ou par remplacement par un /h/. Le /r/ devient à Phnom Penh une fricative pharyngale voisée qui non seulement modifie dans plusieurs cas la prononciation de la voyelle qui suit, mais entraîne aussi l'apparition d'un ton modulé. La transcription de l'auteur est donc trompeuse, car trop simplifiée, si ce n'est fautive.

De même, concernant le khmer parlé à Surin, Haiman reprend l'erreur d'un de ses prédécesseurs (p. 22). Si « questionner » se dit bien suar /suːər/ à Surin alors qu'en khmer central, le r final ne subsiste qu'à l'écrit, le mot « canard » n'est pas tiar à Surin et tia en khmer central, il est prononcé dans tous les cas tia en syllabe ouverte. La forme tiar /tiːər/ Surin, prononcée tia /tiːə/ dans le centre du Cambodge, correspond à l'écrit dār, signifiant « réclamer ». Cet exemple fautif de Jenner n'est pas cité à la page 63 chez ce dernier comme le note l'auteur, mais à la page 65. D'autre part, la note 18 de fin de texte (p. 28), qui accompagne le sous-titre de la page 63 : « Final <r> is never pronounced in Central Khmer », paraît obscure pour la partie soulignée (par nous) : « It is, as noted, recorded in the Northern dialects, spoken in the Cardamom mountains (Martin 1975), and possibly in the Surin dialects in Thailand (asserted by Gorgoniev 1966b : 11-2, denied by Jenner 1974 : 62-3), as well as in closely related Khmeric languages like Kouy (Rongier 2005, passim. » Qu'a pu récuser Jenner ? Le fait que le <r> final n'existe pas à Surin ? Son article prouve le contraire. Le fait que le <r> final n'est jamais prononcé en khmer central ? La lecture de l'article de Jenner ne nous renseigne pas.

Ainsi, si Haiman dit prudemment (p. 3) que : « A full dialect survey is beyong my competence, and aside from a few references to the Siem Reap patois, Surin Khmer, Kiengang Khmer, and some regionalisms described in the scholarly literature, I will say nothing about local dialects », une vue d'ensemble des différences phonétiques régionales est un prérequis pour mieux comprendre l'évolution phonétique de la langue d'un point de vue historique et sa fragmentation actuelle.

Dans le chapitre 3 sur la dérivation et la formation des mots, l'auteur couvre de façon très satisfaisante les différents procédés : périphrastique avec des composés de mots khmers ou indoaryens et khmers, composés et dérivés exclusivement indo-aryens, etc. Si ce chapitre est satisfaisant, il aurait pu détailler plus la dérivation du terme peu: "act" (frequently "act dumb, feign ignorance") (p. 53) qui donnerait am-peu: "action". Si cette hypothèse a été faite par certains auteurs comme Jenner & Pou, elle ensuite rectifiée (par Saveros Pou elle-même par exemple) pour qui le terme aṃboe (am-peu: chez Haiman, taṃve en vieux khmer) est en fait dérivé de dhvoe (tve ou thve en vieux khmer) « faire ».

Dans le chapitre 4 sur les composés symétriques, l'auteur fait le tour de la question de la façon exhaustive. Il distingue par exemple des semantically motivated compounds (p. 89), des iconically motivated compounds (p. 90), mais également des composés par love of symmetry for its own sake (p. 92 et suivantes) avec des composés qui sont des servant words dont certains sont des pure servant words car sans sens et ne pouvant être utilisés seuls, dans d'autres composés, par contre, les deux mots ont chacun seuls leur sens propres, mais en étant soit synonymes, soit des quasi-synonymes, et dans d'autres cas encore aucun des deux composé ne peut être utilisé seuls. En entrant plus dans les subtilités du système de composition en khmer, pour les quasi-synonymes en khmer, Haiman distingue plusieurs « stratégies », la Conscription strategy, la Procrustean strategy et l'Adam's rib strategy. D'autre part, Haiman postule (p. 131 et suivantes) que certains servant words sont en cours d'émancipation, à savoir que certains termes euphoniques, auparavant utilisés seulement avec un mot principal, ont commencé avec le temps à pouvoir être utilisés d'autres termes et seraient sur le point d'avoir leur propre sens, tout en en reconnaissant qu'ils n'ont peut-être jamais été totalement dénués de sens, puisqu'il donne l'exemple d'un terme principal (teak) qui peut avoir trois servant words, ce qui ne donne pas des composés totalement synonymes. Cette partie peut être discutée et contestée par d'autres chercheurs. Il énonce également des exemples où les deux composés (X + Y) peuvent être séparés dans des expressions, sous la forme AX + YX, procédé déjà analysé ou évoqué par d'autres chercheurs.

Dans son ouvrage, Haiman fait preuve d'un esprit de curiosité remarquable et pose des questions sur tout, tout en enfonçant parfois des portes ouvertes. On peut regretter de multiples erreurs de-ci et de-là. Cela peut être des erreurs d'interprétation des mots. Par exemple, au chapitre 4, p. 106, il s'interroge sur l'origine du 2 e terme dans sdok sdeung « stretched out unconscious » dans une note 7 (p. 138) en se demandant si le terme sdeung ne pourrait pas venir de deung « savoir, connaître » « via the addition of a rare privative s-prefix, possibly attested in words like s-trev "enemy" », alors que strev (satrūv) est la corruption phonétique du sanskrit śatru.

On trouve également des coquilles dans les noms des auteurs qu'il cite : Levitz au lieu de Lewitz (p. xvii), Ieuv-Khoeus au lieu de Ieuv-Koeus (p. 26, correctement orthographié en bibliographie), mais aussi dans les transcriptions des mots khmers ou khmérisés, pour n'en citer que quelques-uns : ko:sah et a'ko:sah au lieu de kho:sah' et akho:sa' (ghosa: et aghosa: (p. 6, 27), awh a:ng au lieu de ah a:ng (p. 8), prambuaj au lien de prambuan (p. 15), nāgara au lieu de nagar (p. 35), cīpara (au lieu de cībara ou cīvara) (p. 15), maur (mara) + phiap (bhāb) au lieu de maraṇabhāb (p. 37), rwang ra:j au lieu de rwang ra:v (p. 105), ejve: ejva:n au lieu de ejvae ejvan (p. 108), khang cralee:t au lieu de kheung cralaot (khịṅ craḷot) (p. 117), cav lu:t au lieu de cav luat (p. 136), etc.

Comme déjà signalé plus haut, Haiman fait parfois de regrettables contresens ou ne comprend pas des mots pourtant courants. Ainsi, p. 298, note 11, à propos de l'auxiliaire du présent progressif kampung (kaṃbuṅ) « être en train de », il donne l'exemple suivant : « ..Srae Cih cia kanlaeng lalauk dado: nej neak kampung », qu'il traduit mot-à-mot ainsi : « S. C. be place ? ? of person hard-working » et ensuite en « bon » anglais par « S. C. is a village of hard-working people », avec neak kampung : « hard-working people », précisant juste avant : « I have encountered a single literary example (Thoo 1965:12) of kampung in what may be a MV function meaning "be busy, work hard" […] If this is acceptable, then kampung is not a dedicated auxiliary, and should not be catalogued in this section ». Haiman n'a pas compris les verbes lalauk dado: (lalak' ṭaṭūr) (absents du dictionnaire khmer de l'Institut bouddhique de Phnom Penh) qui sont dérivés de lak' ṭūr, « vendre [et] échanger », et signifiant « commercer, faire du troc », mais il a aussi confondu kaṃbuṅ « être en train de », avec kaṃbaṅ' « embarcadère, quai, port », car l'auteur cambodgien, chez qui l'exemple a été tiré, a certainement fait une faute d'orthographe (la distinction phonétique entre les deux termes ne se faisant plus dans certaines régions), les neak kampung ('nak kaṃbuṅ) étant en fait des 'nak kaṃbaṅ' (ce qui donnerait neak kampaung dans la transcription de Haiman), c'est-à-dire des gens d'un village fluvial. La phrase signifie, de ce fait : « Srae Cih (toponyme) est un lieu de troc et d'échanges des gens des villages fluviaux ».

On trouve aussi des incohérences par manque de compréhension : alors qu'à la p. 17, il traduit rabeh par « peelings and rubble (?) » (ce terme est un verbe signifiant « se détacher, s'effriter, s'émietter, s'ébouler, s'effeuiller, s'écailler »), dans l'expression kham cee:k rabo:t, kham po:t ra-beh (p. 135-136), il traduit ra-beh (même mot que rabeh) par « ?? pick » et à la note de fin de chapitre n o 20 (p. 140) : « There is no independent word rabeh. If the form is derived from beh, then it is as a servant word. Note, however, that rabeh also occurs as a Procrustean words with rabaoc "peel (bark)" […]. » Si rabeh apparaît, certes, en composé avec rabaoc, le terme peut être tout à fait indépendant.

Le problème qui concerne l'ouvrage tout entier est celui de définir le public cible : il est impossible de savoir si l'auteur s'adresse aux apprenants débutants du khmer, aux linguistes généralistes ne connaissant pas la langue ou aux linguistes qui maîtrisent la langue ; ce dernier cas ne semble pas être celui de l'auteur. Dû à l'incohérence du système de transcription et à la complexité de présentation, l'ouvrage ne peut aider à l'apprentissage de la langue. D'un autre côté, il est de peu d'utilité pour l'analyse de la langue à cause d'innombrables erreurs de données et de traduction, sans compter le manque de rigueur méthodologique dans l'étude sémantique et syntaxique.

Ainsi, lorsque l'auteur affirme à la page 57 « not only can this infix [-am-] create action nominalizations, but it can sometimes have no syntactic (and hardly any semantic) effect at all. It seems to perform a purely decorative function in case like […] » en donnant des exemples tels que ko: s(-am)kau:m pour traduire « skinny cadaverous ox », il se contente d'attribuer une étiquette avec une sonorité linguistique sans effectuer aucun travail d'analyse sémantique et syntaxique au préalable des verbes racines et des dérivés, mais en se basant uniquement sur l'approximation des traductions des séquences sans contexte. Si l'auteur avait une meilleure maîtrise de la langue qu'il étudie ou s'il avait fait ses enquêtes linguistiques de façon plus systématique, il s'apercevrait très vite que dans la phrase comme :

េប អត់ ញា ុ ំ បាយ ្របយ័ ត� ស� ម/ *សម� ម ។ baːə ʔɑt ɲam baːj prɑjat skɔːm / *s-ɑm-kɔːm si nég.
manger riz attention être maigre « Si tu ne manges pas, tu risques de maigrir » il est impossible de remplacer le terme non infixé par le terme infixé. Cet exemple suffit à montrer que l'infixe n'a pas simplement le rôle de 'décoratif', mais introduit bien des variations syntaxiques et sémantiques.

Sans le dire explicitement, vu le recours à toutes les lignes au métalangage, il ne fait aucun doute que l'auteur veut présenter l'ouvrage comme grammaire linguistique s'inspirant des théories linguistiques actuellement répandues : pragmatique et typologie des langues. Les données qui servent de base à ce travail peuvent se révéler parfois intéressantes, car elles soulèvent beaucoup de points grammaticaux non attestés dans les grammaires existantes. Cependant, comme nous venons de le souligner, l'auteur travaille et raisonne non à partir des énoncés en khmer, mais de traductions -qui souvent ne rendent pas compte de la complexité du khmer, lorsqu'elles ne sont pas erronées tel que l'exemple donné à la p. 143 pour illustrer une des constructions de nominal en khmer qui, grammaticalement, est incorrecte : Le groupe de mots rendu par « The whole khmer nation » ne peut pas former un groupe nominal associable à une telle traduction. Il manque un nom à la fin, comme ្របេទស /prɑteːh/ « pays ».

Quant au deuxième groupe de mots, la combinaison kaw: ej /kɑː-ʔəj/ dans ce type d'expression est impossible, mais /ʔəj-kɑː/ ne pose, par contre, aucun problème d'acceptabilité.

Force est de reconnaître qu'il est difficile de valider des hypothèses fondées sur des données erronées.

Dans cet ouvrage, Haiman traite énormément de points de la langue khmère sans jamais prendre le temps d'étudier vraiment chacun des points pour apporter des réponses à un lecteur averti. Par exemple, les deux unités ej /ʔəj/ et na: /naː/, comme parmi tant d'autres unités grammaticales, ne bénéficient pas d'une description détaillée ; elles sont seulement caractérisées comme « indefinite pronoun » (p. 233, 260, 366). Rien n'est dit sur les différences entre ej /ʔəj/ et avej /ʔ ə vəj/ ou entre na: /naː/ nominal et na: /naː/ discursif. Cependant, il est intéressant de noter que -sans donner aucune explication sur leur emplois ni leur sémantique -l'auteur mentionne à plusieurs reprises les emplois discursifs de ces deux unités dans les exemples, lorsque ej /ʔəj/ est associé à kom /kɔm/ « négation modale » pour exprimer le contrefactuel (p. 227) ou lorsque ej /ʔəj/ et na: /naː/ sont employés avec kaw: /kɑː/ -traduit par « also, then » (idem : pp. 328-340).

Les imprécisions dans l'analyse sémantique et syntaxique proviennent des exemples décontextualisés qui laisse ainsi l'auteur toute la latitude d'interprétation pour étayer ses affirmations. Prenons le cas de kaw: /kɑː/ que nous venons de mentionner, l'auteur identifie huit fonctions associées à cette unité : 8), l'auteur ne donne aucun exemple, mais uniquement des traductions. Il s'agit d'une construction de type /jaːŋ naː kɑː daːɔj/, que nous venons de voir dans l'exemple précédent, rendue par « anyhow, be that as it may, in any event… ».

1. « Consequence » េន េពល េយ ង េដ រ មក ដល់
Sans rentrer dans le détail, signalons seulement que pour l'exemple de l'emploi (1) n'importe quel khmérophone s'aperçoit immédiatement que la traduction proposée par l'auteur est erronée. Sans aucune raison, l'auteur traduit /muːəj/ « un » par l'article défini « the », et de surcroît le premier évènement est bien terminé, et non en cours, lorsque le deuxième évènement commence. La traduction la plus proche de la phrase khmère serait « Alors que nous étions arrivé à pied dans un village, soudain, une grande tempête se leva ».

De même dans l'emploi (2), la traduction est problématique dans le cadre de l'analyse de l'unité en question. L'énoncé signifie « Qu'est-ce qu'elle est méchante cette personne ! » ou « qu'est-ce qu'ils sont méchants, ces gens ! ». L'énoncé correspond donc à une valeur singulière et non générique : la ou les personnes sont bien identifiées, valeur que ne permet pas d'entendre la traduction de l'auteur.

Lorsque nous regardons de près l'analyse de cette unité, nous ne pouvons que constater que toutes les valeurs que l'auteur associe à /kɑː/ sont uniquement des valeurs locales, repérées à partir des traductions qui sont parfois erronées (premier exemple pour la valeur « consequence »). Il convient de remarquer que dans la plupart des exemples, /kɑː/ n'est pas employé seul, mais combiné à d'autres mots grammaticaux tels que /ʔəj /, /naː/, /daːɛ/, /tuəh/ etc. Il est donc impossible de savoir, et l'auteur n'a pas du tout montré, si la valeur, ou plutôt la traduction, viendrait de /kɑː/ ou des interactions entre /kɑː/ et ces autres mots grammaticaux. Dans le dernier cas, il conviendrait de montrer la part du « travail » de chacun dans la construction d'un sens ou d'un autre (interprétation). Dans l'emploi dit « exclamatif », rien ne justifie d'associer une telle valeur à /kɑː/, dans la mesure où /m ə lɛh/ (déictique) seul suffit à faire de la séquence un énoncé exclamatif. Quant aux traductions assignées à l'emploi 8 recensé par Haiman, elles ne rendent compte en aucune manière de l'apport sémantique de /kɑː/.

Par le principe de grammaticalisation, l'auteur démontre que sept des fonctions dérivent de la première, qui est celle de « conséquence », sans fournir aucune justification, et en se basant uniquement sur les traductions en anglais de différentes fonctions.

Devant cette grande diversité d'emplois et de valeurs, Haiman ne propose à aucun moment une hypothèse sémantique qui permettrait de comprendre la cohérence d'ensemble de ces variations. Pourtant, ces associations entre différents emplois mettent bien en évidence un continuum sémantique de /kɑː/, non en termes de dérivation avec un sens premier et des sens dérivés, mais en tant que différents redéploiements d'une caractérisation sémantique abstraite de ce marqueur, qui intègre toutes ces variations.

Pour conclure, nous sommes en présence d'un livre qui cherche à couvrir de façon exhaustive la description des mécanismes régissant la phonétique et la syntaxe des parlers khmers. Cette description, qui s'adresse à un public profane, révèle une réelle curiosité de l'auteur qui décrit son intérêt sincère pour la langue khmère et sa découverte de cette langue. L'auteur s'est appuyé pour cela sur ses nombreuses lectures. On peut cependant regretter de ses lectures l'absence d'un ouvrage tel que le Khmer (Surin)-Thai-English Dictionary de Dhanan Chantrupanth et Chartchai Phromjakgarin publié en 1978, ou encore l'article fondamental de Michel Ferlus, « Essai de phonétique historique du khmer (Du milieu du premier millénaire de notre ère à l'époque actuelle », Mon-Khmer Studies n o 21, 1992, p. 57-89, qui lui auraient permis de mieux comprendre l'évolution phonétique du khmer et les prononciations régionales actuelles. D'autre part, pour pouvoir rédiger ce livre, ainsi que signalé plus haut, l'auteur s'est appuyé sur deux informateurs principaux (au États-Unis) et des informateurs occasionnels au États-Unis ainsi qu'au Cambodge lors de deux brefs séjours sur place. Haiman (p. XVII) affirme que : « All native speakers own their language and the native speakers of Khmer I acknowledge here can no more increase their ownership by knowing Khmer philology than English speakers can or need increase their ownership of the English language by majoring in English literature. […] At its very best, all that philology can do is heighten their appreciation of all that it means to feel at home in their language. This birthright is unattainable to even the most dedicated outsider » et parlant d'un L2 learner claiming to be a specialist on a language like Khmer : « If s/he had a dozen lifetimes, s/he would still not achieve this ersatz mastery : every year of study would make it ever clearer that even a false philological ownership of the language is forever out of the question. » Ces deux assertions peuvent, certes, être vraies, mais être simplement locuteur natif n'implique pas forcément d'être capable d'analyser sa langue, de comprendre l'étymologie des mots de connaître l'histoire de la langue, de connaître les variations dialectales de manière exhaustive et de ne pas dire des énormités. Des locuteurs natifs peuvent avoir une maîtrise et une connaissance de leur langue qui divergent d'un individu à l'autre. Il est vrai que certaines expressions ou certains composés peuvent ne pas être connus par certains pour des raisons de variations dialectales ou d'obsolescence -le vocabulaire du khmer continuant à évoluer d'une génération à une autre comme toute autre langue. Il aurait été ainsi judicieux que l'auteur de ce livre s'entoure de plus d'informateurs proches. Par exemple, on nepeut qu'être surpris (p. 128-129), quand l'un des informateurs ne connaît pas thau:n thian (à corriger en thaun thian) « ressources », peut-être parce que ce dernier a quitté le Cambodge il y a plusieurs décennies, car ce composé s'entend très fréquemment à la radio et à la télévision cambodgiennes, ou encore ne connaisse pas neuk nia « miss, long for », que tout Khmer éduqué ayant appris sa littérature nationale connaît, et ce alors que cet informateur est décrit par l'auteur comme ayant été formé en tant qu'enseignant de littérature khmère à l'Institut pédagogique de Phnom Penh. On est également surpris que son deuxième informateur ne connaisse pas thom thee:ng « big », pourtant à la fois d'usage courant et abondamment attesté dans la poésie et les chansons. On peut donc se poser des questions sur l'étendue de la connaissance de leur langue maternelle ou sur la bonne perception de la prononciation du khmer de l'enquêteur, en l'occurrence l'auteur de cet ouvrage. Autrement dit il ne suffit pas de travailler avec des informateurs, mais encore faut-il avoir des informateurs initiés -non pas à la linguistique -, mais à la réflexion sur la langue. Par ailleurs, il ne suffit pas de poser les questions aux locuteurs, mais il faut se donner des moyens de contrôle des données et des réponses qui passent par une maîtrise suffisante de la langue étudiée.

La rencontre entre un étranger ayant les outils pour analyser une langue étrangère et des locuteurs natifs de ladite langue peut être fructueuse et ce livre, qui d'après l'auteur (p. XVI) « […] is to my knowledge […] the first reference grammar of Khmer to be written in English », aurait pu devenir une référence. Il pose ou repose de nombreuses questions pertinentes, et contient des tentatives de réponses qui peuvent être discutées de manière constructive, par exemple son interprétation de termes euphoniques en voie d'émancipation (p. 131-136). Il donne des éléments souvent oubliés des grammaires traditionnelles comme les interjections (p. 367-369). Néanmoins, cet ouvrage est entaché de trop nombreuses erreurs qui auraient pu être évitées par une relecture attentive, ou d'erreurs qui sont des erreurs d'interprétation ou basées sur des données erronées. On peut espérer qu'une version révisée à l'avenir correspondra aux attentes et aux objectifs que se fixe l'auteur.

  Ou encore, l'exemple (25b) p. 336 que l'auteur donne pour illustrer un des emplois de la particule

	ជាតិ	ែខ� រ	ទូ	ទំ ង
	ciat	kmae	tu:	teang
	ciːət	k h maːɛ	tuː	teəŋ
	nation	khmer	entire	all
	« The	whole	khmer	nation »
	(traduction de J. Haiman)
	ក៏	អី	ស � ត	េម� ៉ ះ !
	kaw:	ej	s'a:t	mleh
	kɑː	ʔəj	sʔaːt	m ə lɛh
	so	what	clean	how.much
	« How pretty ! »

ក៏ kaw: /kɑː/ :

P. 329, exemple (9). Retranscription par nous, mais traduction de l'auteur.