Tasnim Ben Yacoub
email: tasnim.ben-yacoub@inserm.fr

Juliette Wohlschlegel

José-Alain Sahel

Christina Zeitz

Isabelle Audo
email: isabelle.audo@inserm.fr

Ben Tasnim

Yacoub

Equipe S6-Az

CRISPR/Cas9 : de la recherche à l'application thérapeutique CRISPR/Cas9: from research to therapeutic application

Keywords: CRISPR/Cas9, ingénierie du génome, thérapie génique CRISPR/Cas9, genome engineering, gene therapy

Depuis plusieurs décennies, l'ingénierie du génome a suscité l'intérêt de nombreux chercheurs et médecins pour l'étude de pathologies génétiques et leurs traitements. Au dépit de ses prédécesseurs Zinc-Finger Nucleases (ZFN), Transcription activators like effectors (TALEN), Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR/Cas9) demeure actuellement la méthode moléculaire la plus avantageuse pour la modification du génome. Cet outil initialement connu comme un système immunitaire adaptatif bactérien, est capable de couper et modifier une séquence génomique à façon d'un grand nombre d'organismes vivants. De nombreux essais utilisant cette technologie sont développés pour procurer un traitement efficace contre plusieurs pathologies, tels que le cancer, les maladies cardiovasculaires et les maladies ophtalmologiques. Dans le monde de la recherche, cette technologie est de plus en plus utilisée pour la modélisation de maladies génétiques, fournissant des modèles d'études très pertinents ainsi qu'une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques sous-jacents. De nombreux outils moléculaires sont aujourd'hui disponibles pour mettre en pratique cette technique en laboratoire, et malgré les problèmes techniques et éthiques liés à la manipulation du génome, les CRIPSR/Cas9 offrent un nouveau souffle d'espoir à la recherche thérapeutique.

Introduction

Permettre aux patients de maintenir, ou encore de retrouver la vue, tel est le désir et la motivation de nombreux praticiens et chercheurs dans le monde de l'ophtalmologie.

L'avènement de nouvelles technologies scientifiques telles que les thérapies de correction du génome soulèvent beaucoup d'espoir. En effet, le tout premier essai thérapeutique humain utilisant la technologie CRISPR/Cas9 ciblant une mutation spécifique du gène CEP290 conduisant à une forme d'amaurose congénitale de Leber (ACL) a commencé au mois de mars 2020 à Portland dans l'Oregon, au nord-ouest des Etats unis (NCT03872479, https://clinicaltrials.gov/). L'amaurose congénitale de Leber, ainsi que son continuum moins sévère, la dystrophie rétinienne à début précoce, est une pathologie génétique rare affectant la rétine externe.

Décrite en 1869 par Théodore Leber, elle représente aujourd'hui l'une des premières causes de cécité chez l'enfant et le nouveau-né, avec une prévalence de 1/50000 à 1/33000à 1/81000 nouveau-nés atteints chaque année dans le monde [START_REF] Kumaran | Leber congenital amaurosis/early-onset severe retinal dystrophy: clinical features, molecular genetics and therapeutic interventions[END_REF]. L'ACL est un groupe hétérogène de dégénérescence mixte des photorécepteurs (cônes et bâtonnets) avec au moins 25 gènes mutés associés à cette maladie, impliqués dans différentes fonctions cellulaires [START_REF] Thompson | A Mini-Review: Leber Congenital Amaurosis: Identification of Disease-Causing Variants and Personalised Therapies[END_REF]. Les mutations les plus fréquentes à l'origine de cette pathologie sont retrouvées sur 4 gènes principaux : CRB1 (participe au développement normal des photorécepteurs), GUCY2D (essentiel à la phototransduction), RPE65 (important pour la conversion du tout-trans rétinal en 11-cis rétinal) et CEP290 [START_REF] Takkar | Leber's Congenital Amaurosis and Gene Therapy[END_REF]. C'est une mutation sur ce dernier gène qui est la cible de l'essai clinique (NCT03872479) débuté à l'université d'Oregon. Le gène CEP290 code pour la nephrocystine 6, une protéine importante pour le développement et la structure du cil primaire. Cette protéine, entre autre, localisée au niveau du cil connecteur des photorécepteurs, est essentielle pour le maintien de celui-ci et pour le transport des protéines vers l'article externe (4) [START_REF] Bp | CEP290, a gene with many faces: mutation overview and presentation of CEP290base[END_REF]. Elle est donc essentielle pour le bon fonctionnement des photorécepteurs. Plusieurs mutations ont été identifiées sur ce gène, dont une sur l'intron 26 (c.2991+1655A>G), la plus fréquente dans le nord de l'Europe, conduisant à une modification d'épissage et à une protéine plus courte (p.Cys998*) non fonctionnelle. C'est précisément cette mutation qui fait l'objet d'une correction génique par CRISPR/Cas9 dans l'essai débuté à Portland. Depuis son apparition en 2012, l'outil moléculaire des CRISPR/Cas9 représente un véritable tremplin dans l'édition du génome et dans la recherche de traitement (cibles thérapeutiques) [START_REF] Jinek | A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[END_REF]. Cette approche génétique a d'ailleurs été récompensée par le prix Nobel de chimie en 2020. L'apparition de techniques de séquençage haut débit du génome depuis les années 2000, a amélioré l'identification des variants génétiques à l'origine de diverses pathologies ophtalmiques héréditaires rares ; et a ainsi conduit à une meilleure compréhension de ces dernières. Grâce à l'émergence de ces technologies, plusieurs mutations génétiques ont pu être associées à des groupes de maladies monogéniques, telles que la famille des dystrophies rétiniennes héréditaires dans lesquelles on compte aujourd'hui plus de 200 gènes impliqués [START_REF] Valérie | Apport du séquençage haut-débit dans le diagnostic moléculaire de rétinites pigmentaires autosomiques dominantes et liées à l'X: comparaison de quatre stratégies diagnostiques[END_REF]. Ces pathologies conduisent invariablement vers un handicap visuel sévère ou à une cécité, et représentent un réel enjeu pour la recherche thérapeutique. Aux côtés des stratégies de restauration visuelle telle que la rétine artificielle ou la médecine régénérative, la thérapie génique fait l'objet de recherches actives [START_REF] Sahel | Clinical characteristics and current therapies for inherited retinal degenerations[END_REF].

Depuis plusieurs années, les approches de thérapies géniques consistant à introduire du matériel génétique dans la cellule pour soigner une maladie, ont peu à peu vu le jour, et suscitent un grand intérêt dans l'étude des maladies génétiques. Les objectifs peuvent être Cependant, la thérapie par remplacement de gène n'est pas envisageable pour toutes les pathologies génétiques. En effet, certains gènes sont trop volumineux pour être insérés dans un vecteur viral. Cette contrainte physique est imposée par la taille de la capside du virus AVV 2, ne pouvant accueillir un transgène de plus de 4,5 kilo base (kb) [START_REF] Grieger | Packaging Capacity of Adeno-Associated Virus Serotypes: Impact of Larger Genomes on Infectivity and Postentry Steps[END_REF]. La limite de taille rend cette approche thérapeutique impossible pour de nombreux gènes comme CEP290 de trop grande taille (7,4kb) [START_REF] Mookherjee | A CEP290 C-Terminal Domain Complements the Mutant CEP290 of Rd16 Mice In Trans and Rescues Retinal Degeneration[END_REF]. De plus, l'apport d'un gène exogène normal ne permet en théorie que de résoudre les cas où la mutation entraine une perte de fonction de la protéine mutée, mais pas les cas où la mutation entraine un effet 'toxique' (phénotype dominant négatif) sur la cellule. Dans cette situation, un transfert de gène in vivo n'est pas efficace et nécessite l'implication d'autres approches permettant la réparation de la mutation directement au sein du génome. C'est dans ce contexte que l'essor des nouvelles techniques d'ingénierie du génome a apporté un nouvel espoir pour le traitement de ces maladies génétiques et héréditaires. Durant ces vingt dernières années, des ciseaux moléculaires permettant la manipulation du génome in vivo se sont peu à peu développés. Ces techniques reposent toutes sur un système très similaire impliquant des endonucléases qui vont aller créer des cassures au niveau des brins d'ADN. Ces technologies permettent une manipulation directe de n'importe quel gène au sein de toutes les cellules de l'organisme humain.

Stratégies de réparation de l'ADN

L'ADN représente le support de l'information génétique portée par les 23 paires (une copie paternelle, une copie maternelle) de chromosomes chez l'humain. Sa structure en double hélice, constituée de deux brins complémentaires formé chacun d'un enchaînement de base azotés, appelés nucléotides, est nécessaire à la conservation et la transmission de l'information génétique. Trois nucléotides successifs forment un codon qui correspondra à un acide aminé spécifique lors de l'assemblage de la protéine correspondante. La correction via NHEJ va entrainer le plus souvent la suppression de l'expression du gène réparé (génération d'un Knock Out (KO)) car elle entraîne l'insertion ou la délétion de nucléotides de manière aléatoire qui ne sont plus en multiple de trois. Ce genre de délétion ou insertion va donc induire, le plus souvent, un décalage du cadre de lecture des codons durant la traduction en protéine et entraîner soit la formation d'une protéine tronquée, incapable d'exercer sa fonction principale, soit une absence de traduction en protéine.

A l'inverse, la stratégie HDR consiste à corriger la cassure à l'aide d'une recombinaison homologue à partir d'un brin d'ADN non altéré de la chromatine soeur (provenant de l'autre chromosome) servant comme brin matrice à la synthèse de l'ADN réparé [START_REF] Pawelczak | Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering[END_REF].

La stratégie HDR en thérapie génique apparait la méthode de choix car elle permet la correction précise voire l'intégration d'une séquence déterminée et choisie par l'expérimentateur au niveau du gène à modifier. En pratique, il est possible d'associer les ciseaux moléculaires à des oligonucléotides donneurs ssODN (single strand oligonucléotide DNA) homologues à la séquence cible à corriger (à l'exception de la partie modifiée par l'expérimentateur), et qui serviront de matrice de correction pour la recombinaison homologue induite lors du HDR [START_REF] Igoucheva | Targeted gene correction by small single-stranded oligonucleotides in mammalian cells[END_REF].

Les nouvelles techniques de thérapie génique, mettant en jeu l'action d'endonucléases, reposent sur le principe d'induction d'une DSB à un niveau précis de l'ADN, suivie d'une des stratégies de réparation énoncées précédemment. Ainsi, les endonucléases utilisées en thérapie génique sont toujours formées de deux domaines : un domaine de reconnaissance et de liaison spécifique à la séquence d'intérêt et un domaine de coupure de l'ADN (la nucléase) qui se charge de créer la DSB. Ces ciseaux moléculaires sont donc des protéines chimériques capables de reconnaître et modifier n'importe quelle séquence du génome avec précision.

Nous allons par la suite passer en revue les principales méthodes d'édition du génome.

ZFN : Zinc Finger Nucleases

La capacité des ZFN à modifier le génome a été découverte au milieu des années 90. Cette protéine recombinante est créée par la fusion d'une protéine à doigt de zinc (ZF ; Zinc Finger) qui constitue le domaine de reconnaissance de la séquence d'ADN, avec un domaine de clivage d'une endonucléase particulière la Flavobacterium okeanokoites endonuclease I (Fok1) capable de couper l'ADN [START_REF] Bitinaite | FokI dimerization is required for DNA cleavage[END_REF]. Les protéines à doigt de zinc sont constituées d'environ 30 acides aminés et possèdent une structure en hélice. Chaque ZFN est capable d'identifier et d'interagir avec 3 nucléotides (un codon). La nucléases Fok1 est associée à 6 motifs de protéine en doigt de zinc de type Cys2His2 pour former la protéine chimérique ZFN [START_REF] Kim | Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain[END_REF]. Une ZF ne pouvant reconnaitre que 3 nucléotides sur l'ADN cible, il est nécessaire de créer des constructions constituées d'un enchaînement de plusieurs ZF pour que cette dernière puisse reconnaitre une longue séquence d'ADN (figure 1).

A ce jour, trois essais cliniques ont été mis en place utilisant la méthode ZFN ; l'un d'eux fut réalisé sur des cellules T isolées de patients HIV positifs. Les protéines chimériques ZFN ont été construites de sorte à modifier l'expression des récepteurs aux chemokines CCR5 les rendant résistantes à l'infection par le virus. Ces cellules modifiées sont ensuite transférées chez des patients atteints du VIH dans un but thérapeutique (NCT02388594 ) [START_REF] Wang | The clinical applications of genome editing in HIV[END_REF] [START_REF] Urnov | Genome editing with engineered zinc finger nucleases[END_REF].

Pendant plusieurs années, la technique ZFN était la seule technologie permettant de créer des protéines spécifiques se liant à une région précise du génome et permettant une édition de celui-ci, mais d'autres stratégies plus performantes ont par la suite vu le jour.

TALEN : Transcription activators like effectors

Légendes des figures :

Déclaration des conflits d'intérêts :

Les auteurs déclarent n'avoir aucun lien en relation avec cet article

  d'aboutir à l'insertion d'un nouveau gène (gène médicament ou remplacement d'un gène muté), l'inactivation d'un gène, ou encore à la correction d'une mutation identifiée. La première stratégie développée et destinée aux maladies monogéniques, est l'approche par remplacement de gène. Cette technique consiste à apporter la bonne version d'un gène dans les cellules de l'organe malade d'un individu (approche in vivo) ou dans une cellule qui sera ensuite injectée au malade (approche ex vivo) pour que le gène normal s'exprime de manière active chez l'hôte. Le transfert de gène in vivo est le plus souvent réalisé par l'intermédiaire d'un virus inactivé, contenant la séquence génétique normale et ayant la capacité d'infecter une cellule cible à traiter. Ce transfert de gène ne modifiera pas le gène défectueux, mais permettra uniquement l'expression de la nouvelle séquence génétique normale dans l'organe cible d'un individu. Dans le cas d'une altération de l'expression d'une protéine par exemple, le gène inséré s'exprimera de novo et permettra la restauration de la production de cette protéine dans certaines cellules du patient. Cette technique donne lieu à de nombreux essais cliniques et certains produits ont même atteint le stade de mise sur le marché. On peut citer la thérapie « Glybera® » pour le traitement d'un déficit en lipoprotéine lipase (LPL), ou encore le médicament « Luxturna® », utilisé pour traiter une forme d'amaurose congénitale de Leber causée par des mutations bi-alléliques sur le gène RPE65. Ce dernier fut le fruit d'un essai clinique (NCT00999609) débuté en novembre 2012, impliquant 36 patients âgés de 3 ans et plus, ayant été diagnostiqués pour une mutation biallélique sur le gène RPE65 et ayant une acuité visuelle inférieure ou égale à 20/60. L'essai consistait en l'injection intra-vitréenne, d'un produit contenant un vecteur de thérapie génique viral adéno-associé de type 2 (AVV 2), servant de transporteur pour le gène à intégrer. Suite à cette intervention, Les premières améliorations de la fonction visuelle et rétinienne ont été observées entre 30 et 180 jours après injection (9). Le Luxturna®, initialement développé par l'agence Spark Therapeutics a eu une Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) en novembre 2018 et est commercialisée en Europe par le groupe Novartis depuis janvier 2019. La prise en charge thérapeutique doit être effectuée par un praticien clinicien et nécessite l'injection dans l'oeil.

  Au cours des divisions, les brins d'ADN sont sujet à des lésions telles que les cassures doubles brins (DSB : Double-Strand Break) pouvant affecter la viabilité cellulaire. Après une DBS, la cellule peut mettre en place deux stratégies pour réparer la cassure et assurer son intégrité génétique : la réparation par jonctions d'extrémités non homologues (NHEJ -Non homologous end joining) et la réparation par recombinaison homologue dirigée (HDR-Homology directed repair).

  De la même façon que la protéine chimérique ZFN, la méthode TALEN est basée sur le principe d'une protéine recombinante constituée d'un domaine de liaison à l'ADN nommé TALE et de l'endonucléase Fok1 (l'enzyme de clivage). Découverte en 2009, TALE (Transcription activator-like effectors) est une protéine naturellement sécrétée par une protéobactérie, nommée Xanthomona et qui infecte un certain nombre d'espèces végétales telles que la plante de riz[START_REF] Scholze | Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors[END_REF]. Chez les végétaux, TALE agit en s'intégrant au noyau de la cellule hôte et mime l'action d'un facteur de transcription pour modifier l'expression des gènes et ainsi induire une modification dans le développement de la plante[START_REF] Erkes | Evolution of Transcription Activator-Like Effectors in Xanthomonas oryzae[END_REF]. Ce facteur est constitué d'un domaine central composé de séquences répétées en tandem (de 7 à 30 répétitions). Ces répétitions peuvent être choisies et conceptionnées en laboratoire de sorte de pouvoir se lier à n'importe quelle séquence d'ADN (figure2). Un essai clinique d'immunothérapie utilisant la méthode TALEN pour traiter la leucémie lymphoblastique aiguë de type B, est actuellement en cours à New York depuis 2018 (NCT04150497). Malgré une relative efficacité des ciseaux moléculaires de types ZFN et TALEN, ces techniques demeurent complexes, peu flexibles en terme de choix de séquence d'ADN cible, assez coûteuses, et longues à mettre au point. La nouvelle technique CRISPR/Cas9 permet de remédier à certaines de ces contraintes. Son efficacité, et surtout sa simplicité d'utilisation en font le choix par excellence pour l'ingénierie du génome. CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) Historique et fonctionnement En 1987, des chercheurs japonais remarquent la présence de séquences d'ADN particulières en aval du gène iap au sein de la bactérie Escherichia coli (20). Ces séquences sont composées de courtes régions d'ADN (~21-40 pb) répétées en tandem (repeats) et régulièrement espacées par des séquences uniques (~ 20-58 pb) appelées « espaceurs » (spacers). Ces loci particuliers ont été définis par la suite sous le nom de « CRISPR » (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) ce qui signifie « courtes régions palindromiques régulièrement espacées ». Ces CRISPR ont été retrouvées chez plus de 50 % des bactéries et 90% des archées (anciennement appelés archéobactéries) (21)(22). Ultérieurement, il a été découvert que les « spacers » séparant les séquences répétées d'origine bactérienne n'appartenaient pas au génome bactérien, mais dérivent de séquences préexistantes provenant d'un génome étranger. Il s'agirait plus spécifiquement de séquences d'origine virale issues de précédentes infections par des bactériophages. Ces CRISPR furent décrites par Barrangou et al., comme conférant une résistance des procaryotes contre les bactériophages (23)(24). Ils représentent une sorte d'immunité adaptative permettant à la bactérie infectée de retenir en mémoire les infections précédentes pour se défendre et mieux résister à une infection ultérieure par un virus identique. En effet, au cours d'une première infection par un virus, l'ADN viral est intégré au génome de l'hôte au niveau des spacers des séquences CRISPR, la mémoire immunologique est ainsi stockée dans ces sites, qui seront par la suite transcrits en ARN CRISPR (crARN). Lors d'une seconde infection par un bactériophage, un processus de reconnaissance et de défense contre ce dernier se met en place. Ce processus a lieu en 3 étapes (Figure 3) : 1) une phase d'acquisition (ou adaptation), durant laquelle les nouvelles séquences « espaceur », qui proviennent de l'ADN invasif, vont s'insérer entre les séquences répétées du locus CRISPR. 2) une phase de biogenèse, impliquant la transcription de la séquence CRISPR ainsi que celle d'autres gènes nécessaires à la reconnaissance et au clivage de l'ADN viral. 3) une phase d'interférence, durant laquelle la séquence d'acide nucléique étrangère est ciblée et dégradée (figure 3). Classification Chaque endonucléase est composée d'un domaine effecteur, permettant l'interaction entre le crARN et la cible, un domaine de clivage, ainsi qu'un domaine impliqué dans l'insertion des spacers (Figure 4). Au sein de cette immunité adaptative bactérienne CRISPR, on retrouve plusieurs familles distinctes en fonction du type de protéine Cas mise en jeu. Les gènes Cas ne sont retrouvés que chez les espèces dotées du système CRISPR et sont souvent localisés proche d'un locus répété. Il existe une grande diversité de protéines Cas associées aux CRISPR et au moins 45 gènes Cas différents sont dénombrés aujourd'hui, intégrés dans une classification particulière (25)(26). Le système CRISPR chez les procaryotes renferme également une grande diversité de formes et de fonctions qui ont été regroupées dans deux classes distincte : la classe 1, renfermant trois sous-types (type I, type III et type IV). Dans ce groupe, l'enzyme effectrice est formée de l'assemblement de plusieurs sous-unités Cas ; la classe 2 (composée du type V, type VI et type II), qui ne fait intervenir qu'une seule Cas, large protéine capable de se coupler au crARN (figure 4). Selon le type de Cas et les sous-unités impliquées, la maturation du pre-crARN en crARN se fait à travers des mécanismes différents. Au sein du système de type II CRISPR/Cas9, ce mécanisme est parfaitement connu et nécessite l'implication de l'ARN transactivateur tracrARN. De par sa pertinence, ce type II a suscité beaucoup d'intérêts pour l'édition du génome et a fait l'objet de nombreuses recherches in vitro sur des cellules animales et humaines. Le CRISPR/Cas 9 est aujourd'hui, le type de système CRISPR le plus utilisé dans la recherche thérapeutique. CRISPR/Cas9 Actuellement, les travaux génétiques des chercheuses Jennifer Doudna (professeur à l'université de Californie -Berkeley-Etats-Unis) et Emmanuelle Charpentier (directrice de l'institut Max Planck -Berlin-Allemagne), ont pour la première fois démontré que le système CRISPR/Cas pouvait être programmé pour le clivage d'un ADN cible in vivo, et pour l'édition du génome (6). Cette découverte révolutionnaire, leur a permis la mise au point de cette technique pour n'importe quel organisme vivant, et leur a valu le prix Nobel de chimie 2020. Cet outil est composé de deux éléments nécessaires à la modification du génome ; une enzyme Cas9 ayant la fonction d'endonucléase composée de deux sites de clivage, qui va permettre la formation d'une cassure des doubles brins de l'ADN, ainsi qu'un ARN guide (ARNg) qui condense les deux ARNs crRNA et tracrRNA, choisi pour guider spécifiquement la Cas9 jusqu'au site de clivage. Cet ARN est composé d'une séquence variable de 20 nucléotides complémentaires à la séquence du gène ciblé et d'une séquence constante de 42 nucléotides servant pour la fixation à la Cas9. Les 20 nucléotides sont choisis à proximité du motif PAM (3 nucléotides en amont). A l'état libre, la Cas9 s'auto-inhibe et n'est donc pas capable de se fixer à la séquence cible pour assurer sa fonction d'endonucléase. Suite à la fixation de l'ARN guide sur celle-ci, la Cas9 va subir un réarrangement physique et ainsi adopter une conformation rendant possible sa fixation sur l'ADN cible. Le motif PAM est nécessaire à la fixation de la Cas9. Une fois le complexe Cas9/ARNg fixé sur l'ADN, les sites catalytiques RuvC et HNH de la Cas9 vont induire le clivage de chaque brin d'ADN (Figure 6). Ceci va déclencher une succession d'évènements et le recrutement de la machinerie cellulaire pour mettre en place un mécanisme de réparation. Dans un premier temps, la cassure sera détectée par des complexes protéiques qui recruteront à leur tour des enzymes (glycosylases, endonucléases et exonucléases) permettant un réarrangement nucléotidique nécessaire à la réparation (figure 5). Une ADN polymérase sera par la suite recrutée pour ajouter des nucléotides de manière aléatoire dans le cas de la stratégie NHEJ ou synthétiser un brin d'ADN à partir d'un brin matrice (brin d'ADN complémentaire ou donneur simple brin exogène ssODN) dans le cas de la stratégie HDR. L'induction de la réparation par recombinaison homologue dirigée peut conduire à l'invalidation d'un gène ou à la correction d'une mutation délétère. Dans ce contexte, le brin donneur ssODN, synthétisé de manière exogène, doit contenir des séquences de nucléotides homologues à celles qui précèdent et suivent le site de coupure. Entre ces séquences, le brin donneur peut contenir une séquence de nucléotides permettant de modifier le gène cible, à savoir corriger une mutation, introduire des exons manquants, diminuer l'expression d'un gène ou l'inhiber. Application in vivo et in vitro dans le monde de la recherche Au vu de ses atouts considérables, le système CRISPR/Cas représente aujourd'hui un outil moléculaire incontournable pour la compréhension des mécanismes physiologiques, la modélisation des maladies et la recherche thérapeutique. Cette technique s'est en effet beaucoup imposée : il est aujourd'hui possible de modifier le génome à faible coût en quelques jours, ce qui prenait plusieurs semaines voire plusieurs mois quelques années auparavant avec les techniques TALEN et ZFN. Les chercheurs sont, en effet, capables aujourd'hui de générer un nombre considérable de modifications avec précision (modifier le gène, corriger une mutation, induire une mutation…) sur des cellules en cultures ou dans des modèles animaux. Selon la question scientifique étudiée, plusieurs manipulations génétiques peuvent être mises en place : l'invalidation génétique, plus communément appelée « Knock out » (KO), permet de supprimer l'expression d'un gène au sein d'un type cellulaire ou d'un organisme, de façon permanente. Il est également possible de réduire l'expression du gène par répression et interférence (CRISPRi) ou au contraire d'en augmenter l'expression par activation (CRIPSRa) sans modifier de façon permanente le génome de la cellule. Enfin, il est possible de modifier spécifiquement une séquence génomique pour induire ou corriger une mutation par édition. Le système CRISPR/Cas9 peut être introduit au sein d'un organisme pour modifier l'expression génique de certaines de ses cellules. En effet, de nombreuses recherches visent à modéliser des pathologies en utilisant des modèles animaux, pour mieux comprendre les mécanismes présents chez l'homme. Elles ont pour but d'induire la mutation causale afin d'étudier les conséquences physiologiques liées à cette dernière ou encore, de corriger la mutation causale pour générer un contrôle de la maladie en question. Un exemple de maladie rare d'origine génétique depuis longtemps modélisée par la stratégie CRISPR/Cas9 est la dystrophie musculaire de Duchenne, un syndrome qui apparait chez le jeune enfant et qui provoque une dégénérescence progressive de l'ensemble des muscles du corps. Elle est principalement causée par deux mutations sur le gène DMD, gène le plus long de l'organisme, et situé sur le chromosome X causant une perte totale de la dystrophine, protéine nécessaire au maintien des fibres musculaires. Plusieurs modèles ont pu être créés pour étudier ce syndrome, un modèle murin de rat pour lequel les chercheurs ont pu cibler spécifiquement les 2 exons du gène Dmd responsables de cette myopathie, ainsi qu'un modèle primate non humain (27)(28). D'autre part, l'apparition des cellules souches pluripotentes induites (iPSCs, induced puripotente stem cells) en 2006, est un atout majeur pour de nombreuses approches d'édition du génome. En effet, Yamanaka et al., avaient découvert une manière d'induire des cellules souches pluripotentes à partir de cellules différenciées (29). On peut aujourd'hui prélever des biopsies de peau de patients, les mettre en culture, et reprogrammer les fibroblastes obtenus en cellules iPS par cette technique. La retouche des gènes de ces cellules par la technologie CRISPR/Cas9 permet d'une part d'obtenir des modèles cellulaires de recherche pour étudier les mécanismes physiopathologiques de maladies génétiques, mais aussi de tenter de corriger la mutation sur le modèle comme outil de validation thérapeutique. CRISPR/Cas9, essais cliniques et utilisation thérapeutique En thérapie génique également, la technologie CRISPR/Cas9 ouvre de nouveaux horizons. En effet si on arrive à déceler le gène incriminé dans une maladie, on peut, à terme, l'éliminer, le corriger ou le modifier au sein de l'organe touché. Suite au succès apporté par l'utilisation de cette technique dans l'univers scientifique de nombreux essais cliniques incluant cette technologie sont actuellement mis en place dans un but curatif. Jusqu'à présent, le système CRISPR/Cas9 n'avait encore jamais été directement injecté chez des patients. En effet les études cliniques mises en place durant ces neuf dernières années consistaient à utiliser des approches thérapeutiques ex vivo, dans lesquelles des cellules du patient sont transfectées/ infectées en laboratoire puis réinjectées dans le tissu du patient. C'est notamment le cas des recherches portées sur le cancer. Ces études consistent à prélever des cellules de patients afin de transformer les cellules T pour les rendre efficaces contre les cellules cancéreuses. Les patients peuvent alors bénéficier de lymphocytes T génétiquement modifiés reconnaissant les cellules tumorales (30)(31). Pour utiliser le système CRISPR, il faut faire exprimer de manière simultanée la Cas9 et l'ARNg au sein de de la cellule cible pour qu'il y ait une modification du génome de cette dernière. Plusieurs formats de construction peuvent être utilisés pour la construction CRISPR/Cas9 (32). Le système CRIPSR/Cas9 peut être délivré à la cellule sous forme de plasmide d'ADN, d'ARNm ou encore de ribonucléoprotéine (RPN), un complexe associant un ARNm avec des protéines. Ces constructions peuvent par la suite être encapsulées dans des vecteurs plasmidiques ou viraux et délivrés chez les patients. La méthode impliquant le plasmide d'ADN est la plus simple et s'utilise à faible coût, mais elle ne révèle pas une efficacité optimale. Le système sous forme d'ARNm présente l'avantage d'être très spécifique et limite ainsi les risques de mutagenèse. L'introduction du matériel sous forme de RPN présente lui aussi une bonne spécificité d'action et a l'avantage d'être très efficace et rapide, cependant, il est peu utilisé du fait de son coût. En mars dernier, le système CRISPR/Cas9 fut pour la première fois injecté chez des patients dans le cadre de l'essai thérapeutique de phase 1/2 sponsorisé par Allergan et Editas Medecine (NCT03872479). Il s'agit d'une étude ouverte non-randomisée qui inclura 18 patients atteints d'amaurose congénitale de Leber, adultes et enfants de 3 ans et plus, porteurs de la mutation c.2991+1655A>G dans l'intron 26 de CEP290. L'essai a débuté en septembre 2019 pour tester le médicament AGN 151587 aussi appelé EDIT101. Cette formulation est un vecteur viral AAV5 contenant la Cas9 dérivée du Staphylococcus aureus (SaCas9), couplée à deux ARN guides permettant la suppression de la mutation c.2991+1655A>G dans l'intron 26 du gène CEP290. L'étude menée dans quatre centres américains (Bascom Palmer Eye Institute Miami, Floride ; Massachusetts Eye and Ear Infirmary Boston, Massachusetts ; W.K. Kellogg Eye Center -Université de MichiganAnnArbor, Michigan ; Casey Eye Institute -OSHU Portland, Oregon), consiste en une injection sous-rétinienne unique d'AGN 151587. Trois doses différentes vont d'abord être testées chez l'adulte avant l'inclusion d'enfants chez lesquels seront testés la dose intermédiaire et la dose la plus élevée. Il s'agit ensuite d'évaluer la tolérance du traitement, de déterminer la dose la mieux tolérée et d'étudier l'efficacité sur des critères fonctionnels (test de mobilité, acuité visuelle, sensibilité aux contrastes, vision des couleurs, micropérimétrie, sensibilité rétinienne évaluée par le Full field light sensitivity threshold (FST), réflexe pupillaire, stabilité du regard sur des vidéos), structuraux avec l'analyse de l'épaisseur maculaire en OCT et sur des questionnaires de qualité de vie des patients traités. Pourquoi CRISPR/Cas 9 ? Jusqu'à l'avènement des technologies CRISPR pour l'édition du génome, les méthodes ZFN et TALEN, du fait de leur précision et leur efficacité de coupure et de modification de l'ADN, étaient de bonnes alternatives aux thérapies par remplacement de gène. Néanmoins, elles comportent un certain nombre d'inconvénients : Ces deux méthodes requièrent la formation d'une protéine, spécifique à la cible souhaitée, ce qui nécessite un travail long et coûteux. La technique ZFN, ne permet pas de cibler toutes les séquences nucléiques existantes, et la construction de la protéine chimérique, permettant le clivage, ne peut pas être effectuée par le chercheur et nécessite un long processus par des prestataires externes. TALEN, de son côté, présente une taille très volumineuse (3kb), ce qui rend très complexe son encapsulation au sein de vecteur de transfection. Cet aspect limite son application en thérapie comparé au ZFN (1kb). A l'inverse la stratégie CRISPR/Cas9 présente l'avantage de pouvoir être dessiné pour reconnaître n'importe quelle séquence d'ADN du génome, grâce à la conception simplifiée d'ARNs guides. Un deuxième atout de CRISPR/Cas9 repose sur la possibilité de rendre la construction multiplex, pour que le système puisse reconnaître et modifier plusieurs sites à la fois. Une seule application pourrait alors permettre simultanément la modification de plusieurs gènes dans la même cellule (33). Problèmes rencontrés lors de l'utilisation de CRISPR/Cas 9 Malgré l'essor du génie génétique CRISPR/Cas9 dans le monde entier, plusieurs problèmes peuvent être rencontrés lors de son utilisation. Plusieurs considérations d'ordre éthique contrôlent notamment son utilisation pour la thérapie génique. En effet, la convention d'Oviedo mise en place depuis 1999 par les pays membres du conseil européen, interdit toute modification génétique qui serait transmissible à la descendance, des précautions doivent alors être prises pour éviter cela lors d'une intervention clinique (34). D'autres états non membres du conseil européen comme le Canada, Les Etats Unis d'Amérique, le Japon ainsi que le Saint-Siège, ont participé à l'élaboration de cette convention. L'utilisation de CRISPR/Cas9 sur des embryons, notamment pour corriger des défauts génétiques transmis par les parents, et pouvant conduire à de graves pathologies, est alors très encadrée tantôt en recherche fondamentale que clinique, pour éviter les risques d'eugénisme. En chine, un essai clinique mené par He Jiankui à malgré tout débuté en 2018, pour modifier le gène du récepteur à C-C chimiokine de type 5 (CCR5) au sein d'embryon humains (35). Des régulations au niveau international seraient donc nécessaires pour assurer une limite éthique à cette pratique dans le monde. Néanmoins, l'utilisation de CRISPR/Cas9 sur des cellules somatiques, comme pour l'essai clinique NCT03872479 sont autorisées puisqu'elles ne modifient pas les cellules germinales mais, sont entourées de précautions méthodologiques. Outre les problèmes éthiques et techniques, les risques liés à la survenue de mutations non attendues dans le génome des patients sont à prendre en considération. En effet, l'utilisation de CRISPR/Cas9 dans n'importe quelle cellule peut conduire à des modifications non spécifiques sur des sites hors cible dans le génome receveur, également appelé sites « offtarget ». Malgré la spécificité avec laquelle est construit l'ARNg et le choix très minutieux des sites PAM, des parties du génome sont susceptibles d'avoir des similitudes avec la/les parties ciblée(s). Ceci risque de conduire à la création de mutations indésirables chez le patient. Afin de réduire ce problème auquel fait face l'utilisation de CRISPR/Cas 9, des innovations et méthodes pour prédire et limiter l'apparition d'effets off-target sont nécessaires pour faciliter l'application clinique de cette technologie. Dans ce sens, pour palier à ces problèmes, de nouvelles techniques moléculaires inspirés de CRISPR/Cas9 font l'objet de recherche. L'équipe de David Liu du Massachusetts Institute of Technology et de l'université Harvard développe depuis 2017 des stratégies permettant de modifier le génome « base par base » connues sous le nom de « base editing » et « prime editing » (36)(37). Conclusion Un outil génétique révolutionnaire pour modifier l'ADN chez les êtres vivants, CRISPR/Cas9 est perçu comme un véritable essor dans le monde du génie génétique. De par son accessibilité et sa simplicité d'utilisation tant dans la recherche fondamentale qu'en médecine, elle demeure de loin, la technique la plus appliquée actuellement pour modifier l'ADN. En dépit des problèmes éthiques et techniques pouvant être rencontrés par son utilisation, cette technologie ouvre de nombreuses portes pour la thérapie génique et les maladies génétiques héréditaires demeurant pour la plupart incurables à ce jour. Le premier essai clinique débuté à l'université d'Oregon, pour soigner l'ACL apporte une lueur d'espoir pour la thérapie des maladies rétiniennes héréditaires et n'est que le point de départ d'une considérable évolution thérapeutique.

Figure 1 :

 1 Figure 1 : Mode de fixation des ZFN sur les brins d'ADN. Le zinc finger est ici constitué de 3 protéines ZF (ZF1, ZF2, ZF3). Les blocs bleus sont les nucléases Fok1 qui doivent se dimériser pour induire une DBS. Une ZFN est constituée de deux domaines : un domaine formé d'un enchaînement de plusieurs ZF ainsi qu'un domaine codant pour la nucléase fok1. Les deux nucléases se fixent sur les brins opposés de la séquence d'ADN Par conséquent, la dimérisation contribue à cibler avec précision le site de cassure, puisqu'elle n'a lieu qu'au site d'intérêt reconnue par les ZF.

Figure 2 :

 2 Figure 2 : Mode de fixation de la construction TALEN. En bleu foncé, la nucléase Fok1. En bleu clair sont représentés les domaines TALE de liaison à l'ADN (répétitions en tandem). La protéine TALE s'associe à l'ADN en formant une double hélice qui s'enroule autour du brin cible. De la même façon que pour la technique ZFN, la nucléase Fok1 ne peut agir en monomère, et doit se dimériser pour induire un clivage double brin de l'ADN. Ainsi, deux protéines TALEN vont se fixer sur les brins opposés pour permettre une dimérisation de fok1 (38). Chaque monomère va reconnaître une séquence d'une longueur de 14 à 20 paires de base (pb) sur la séquence d'ADN.

Figure 3 :

 3 Figure 3 : Mécanisme de défense des procaryotes contre une infection virale/ immunité adaptative des procaryotes : le système CRISPR (type2). Lors d'une première infection par un virus, ce dernier injecte son ADN dans la bactérie (violet, bleu, vert) qui va intégrer ces séquences en tant que « spacer » au sein de ses locus CRISPR. Lors de la transcription de ce locus, un premier ARN immature, précurseur, va être formé, le pre-crARN. La maturation de ce précurseur se fait par l'ARN transactivateur tracrARN (jaune) qui va cliver le pre-crARN en plusieurs mini crARN. Ces crARN, vont se coupler à une endonucléase Cas (marron) afin de cibler l'ADN étranger et de l'inactiver par coupure par la Cas lors d'une seconde infection (vert).

Figure 4 :

 4 Figure 4 : Classification des différents types de système CRISPR/Cas. Au sein de la classe 1, les sous unités composant la partie effectrice de la protéine sont très variées et différentes selon les types. ss : small subunit (= petite sous unité) plusieurs petites (ss) et grande (Cas) sous unités ayant respectivement un rôle effecteur et de clivage. La classe 2 est caractérisée par une seule grande protéine (la Cas) jouant le rôle d'effecteur et de protéine de clivage.

Figure 5 :

 5 Figure 5 : Interaction du système CRISPR/Cas9 avec les deux brins d'ADN et création d'une DSB. Les sites catalytiques RuvC et HNH clivage de chaque brin d'ADN (Figure 6). Une Cas9 est composée de 6 domaines : RuvC, HNH, REC I, REC II, Helice α et CTD. Les Cas 9 sont composées approximativement de 1400 kb selon le type de Cas9. Elles sont composées de deux domaines de coupure actifs, un pour chaque brin d'ADN. Le domaine de nucléase RuvC (constitué des segments RuvC-I, RuvC-II et RuvC-III) qui cible et coupe le brin non-complémentaire (5'-3'), et le domaine HNH qui coupe le brin complémentaire (3'-5'). Elles possèdent deux domaines de fixation ; un premier domaine, REC I (« Recognition »), permet la fixation de la Cas9 à l'ARN guide. Le deuxième site permet la fixation de la Cas9 sur le brin d'ADN ciblé, il s'agit du domaine C-terminal « CTD » impliqué dans la fixation du motif PAM. L'hélice α est une structure jouant le rôle de pont entre REC I et RuvC, elle permet d'initier le clivage de l'ADN.

Figure 1 :

 1 Figure 1 : Mode de fixation des ZFN sur les brins d'ADN.

Figure 2 :

 2 Figure 2 : Mode de fixation de la construction TALEN.

Figure 3 :

 3 Figure 3 : Mécanisme de défense des procaryotes contre une infection virale/ immunité adaptative des procaryotes : le système CRISPR (type2).

Figure 5 :

 5 Figure 5 : Interaction du système CRISPR/Cas9 avec les deux brins d'ADN et création d'une DSB.


J Girardot

A Coillet

M Nafa

F Billard

E Hertz

P H Grelu

On-demand generation of soliton molecules through evolutionary algorithm optimization

Combining evolutionary algorithm optimization with ultrafast fiber laser technology, we report on the selfgeneration of stable 2-soliton molecules with controllable temporal separations. A fiber laser setup including an adjustable virtual saturable absorber through nonlinear polarization evolution and an intracavity pulse shaper are used to generate 2-soliton molecules with a user-defined 3 ps to 8 ps internal delay.

Mode-locked fiber lasers constitute a mature technology for numerous applicative fields such as material processing, medicine, sensing, and spectroscopy, with the promise of a steerable source endowed with high beam quality, fired from a compact and cost-effective device [1]. In practice, commercial mode-locked fiber lasers offer a limited pulse output versatility, contrasting with the large range of accessible regimes obtained in labs within most laser architectures [2,3]. One main reason is that shifting from one regime to another usually involves a tedious manual adjustment of the cavity parameters. This is rooted into the complexity of nonlinear laser dynamics, which precludes establishing an analytical relationship between the output pulse profile and the set of cavity parameters. That complexity is exacerbated in multi-pulse regimes, such as in soliton molecules, which are ruled by specific dissipative soliton attractors whose domains of existence are limited in the space of laser parameters and subjected to large hysteretic behaviors [2,4].

In recent years, significant efforts led to self-generation of laser regimes combining a computer control of accessible cavity parameters and the use of a feedback loop fed from measured laser output features. An important step involving artificial intelligence in that process was achieved in 2015, with the implementation of evolutionary algorithms to control the cavity's degrees of freedom according to the user's pre-defined objective [5]. In practice, using nonlinear polarization evolution (NPE) in optical fibers combined with polarization discrimination makes a convenient way to yield an adjustable nonlinear transfer function steered by polarization tuning elements [6]. Successive experimental works have demonstrated the effectiveness of fiber lasers interfaced with genetic or evolutionary algorithm optimization to reach ultrafast regimes of specific interest. In such strategies, optimization is based on a merit score obtained from the measurement of output features such as second-harmonic conversion [5], radiofrequency spectrum [7], optical spectrum and/or optical autocorrelation [8,9]. In a multi-objective optimization, several features are combined [9]. Recently, dispersive Fourier transform (DFT) measurements were used to build multi-objectives optimizations originating from a single oscilloscope [10]. While previous developments tackled a low number of degrees of freedom and targeted the generation of single pulse dynamics, in this Letter, we extend the potential of the evolutionary algorithm approach to the generation of 2-soliton molecules of controllable temporal separation. This is performed through an increase of the number of accessible intracavity parameters, via a computer-controlled free-space pulse shaper allowing to manipulate the spectral transmission of the cavity [11].

An evolutionary algorithm makes a population of "individuals" to evolve so as to optimize a user-defined objective, or merit function [12]. In our context, an individual is a laser regime associated with a given setting of the adjustable parameters of the cavity. These parameters are used as genes of the algorithm. Each individual is tested and ranked through the merit function. Thus, the best individuals are selected as parents of the next generation, and a new population of children is created by crossover and mutation of their genes, keeping a constant population size. The procedure is iterated until convergence of the merit score within a given maximum number of generations. The optimized laser regime is then fully characterized and compared to the expected objectives.

The experimental scheme of the ring laser cavity is presented in Fig. 1(a) and comprises two sections. The fiber section includes a 980-nm-pumped two-stage erbiumdoped fiber (EDF) amplifier allowing high gain to compensate for the extra losses induced by the pulse shaper (5-dB). A polarization-insensitive optical isolator ensures unidirectional lasing in the C+L telecom band. Short lengths of SMF-28 connect the fiber-integrated components. NPE in the optical fibers followed by polarization discrimination yields a virtual ultrafast saturable absorber for modelocking operation. The second cavity section comprises in free space a set of 4 liquid crystal retarders (LC 1-4), a polarizing beam splitter (PBS), and a home-made pulse shaper. Each LC has its axis oriented at 45° from its neighbor, with the following range of accessible phase retardances: 0<φ1,4<π and 0<φ2,3<2π; such a combination allows a full exploration of the transfer function of the saturable absorber [10]. The pulse shaper, see Fig. 1(b), is a 4-f system composed of 2 gratings (G) with a groove frequency of 600 lines.mm -1 , 2 lenses with focal length of 40 cm, and a spatial light modulator (SLM) with a 3.2-cm wide dual mask array of 320 pixels located at the Fourier plane. Owing to a rectangular pixel size of 1.3 cm x 100 µm, we use cylindrical focusing which limits the peak intensity well below the damage threshold of the SLM (4 GW.cm -2 ) for all accessible laser regimes. The setup yields a spectral resolution of 0.39 nm per pixel, giving a temporal window of ± 21.1 ps [13]. A PBS located at the output of the SLM enables the adjustment of both phase and amplitude for each spectral component.

The laser is operated in a slightly normal averageddispersion regime, β2,net = 0.03 ps 2 , owing to the normal chromatic dispersion of the EDF, β2,EDF=0.06 ps 2 .m -1 . The total length of the fiber section is kept within 3 meters to improve the laser stability, such that the fundamental repetition rate of the optical cavity is 40 MHz. We operate in a range of total pump power suitable for the generation of 2-soliton molecules, from 0.8 to 1.2 W. In the following, the total pump power is set to 1 W leading to an average output power around 20 mW in the ultrafast regime. For a complete characterization of the laser output after optimization, we use a fast photodiode plugged on a 6-GHz oscilloscope, an optical spectrum analyzer (OSA) with a resolution of 0.07 nm and an optical autocorrelator based on type-II secondharmonic generation.

From the above experimental configuration, two kinds of adjustable cavity parameters, or genes for the algorithm are distinguished: the 4 LC phase retardances governing the NPE-based nonlinear transmission, and the SLM parameters. Regarding the latter, instead of using all pixels retardances as free parameters, an overall parametric function is used to perform the optimization with a small number of genes. The optical spectrum of a stationary 2-soliton molecule has a periodic modulation Δω that is inversely proportional to the temporal separation τ between the 2 solitons: τ=2π/Δω. Therefore, we anticipate controlling the temporal separation within the self-generated soliton molecule by programming a spectral transmission through the SLM of the form:

𝑇(𝜔) = 1 -(1 -𝑇 !"# ) 𝑐𝑜𝑠 $ ,(𝜔 -𝜔 % ) 𝜏 2
⁄ 0 , where ω0 is the center of the modulation (a dark spectral fringe), and 𝑇 !"# is an imposed minimal intensity transmission, see Fig. 1(c). Precisely, we impose a spectral transmittance amplitude 𝑡(𝜔) = 2𝑇(𝜔) with the phase masks while applying a constant phase profile. The Fourier transform of such transmittance yields a central peak flanked by smaller peaks separated by the required delay, which will anchor the two solitons and form the molecule from the nonlinear dissipative cavity dynamics over successive cavity roundtrips and corresponding passages through the SLM. We first observed that, starting from a given soliton molecule regime, it was not possible to switch to another soliton molecule of different separation τ by the mere application of the corresponding spectral modulation, since such a modification generally disrupted the mode locking operation. We attribute this observation to the fact that 2-soliton molecule dynamics relies on specific dissipative soliton attractors [2,14], which depend on the whole set of cavity parameters in a non-trivial way. Therefore, we tested the use of the evolutionary algorithm to find out a new set of cavity parameters encompassing both the need of a suitable saturable absorption with the φ1-4 genes and spectral transmission modulation with the Δω and ω0 genes, noting that all these genes are interdependent. At first, one could think that Δω shouldn't be a gene, but a fixed parameter calculated from the user-defined target separation τ. However, we found that freezing completely this parameter reduced considerably the success of soliton molecule generation, illustrating further the complex dependence of soliton molecule attractors on laser cavity parameters. Therefore, the spectral period Δω was kept as a gene, but its accessible values were constrained to a small range (±5% typically) around the target value ΔωTarget=2π/τTarget with τTarget being the user-defined internal pulse separation target.

We then need to design a merit function promoting stable mode locking while discriminating cw emission and unstable regimes such as Q-switched mode-locked regimes. The peak power of the radiofrequency (RF) spectrum at the fundamental repetition frequency of the laser cavity is used to that purpose [5]. At 1-W pump power, the experimental runs showed that by applying the maximum spectral modulation contrast (Tmin=0), mode locking only yielded 2soliton molecules. It was therefore not necessary to add a merit function part promoting 2-soliton molecules over single pulse mode locking. To sum up, the optimization is now realized over 6 genes (φ1-4, Δω and ω0): the evolutionary algorithm should find the best set of these 6 parameters to generate the laser regime with the highest RF power, i.e the most stable mode-locked regime with a spectral modulation entailing 2-soliton molecules.

Nevertheless, we found that the success rate of stable 2soliton molecules generation by the algorithm was enhanced by gradually increasing the contrast of the spectral modulation, from a minimal transmission Tmin = 0.3 at the first generation to Tmin = 0 at the last one. This additional procedure ensured a success rate greater than 90%, compared to 60% obtained with Tmin = 0 fixed from the beginning of the algorithm, and a mere 10% when all spectral genes were frozen. To illustrate our experimental results, let us display a test of laser self-generation of a soliton molecule comprising 2 pulses separated by a predetermined delay τ = 4.0 ps. The optimization procedure is limited to a maximum of 15 generations, starting from a random population of 140 individuals.

After testing the first generation, the population is reduced to 20 individuals. Each subsequent generation entails a randomly mutated gene for 70% of the children. The optimization curve in Fig. 2(a) displays the maximum and average merit scores obtained for successive generations. The saturation of the maximum score reflects that our merit function only qualifies mode locking stability. Generation after generation, Tmin is lowered, which imposes a growing constraint on the mode-locked regime, to which the genetic algorithm adapts. At the final generation, a soliton molecule with the required internal separation is obtained. The typical optimization time of the algorithm is 20 minutes. The outcome of such typical optimization leads to the mode-locked regime presented in Fig 2 (b-d). We also checked the long-term stability of the soliton molecule regime, which can be maintained for hours. However, subsequent attempts to tune the internal separation within the soliton molecule through the dynamic alteration of the spectral intensity transmission via the wave shaper led to the disruption of the mode-locked regime. Therefore, to modify the temporal separation between the solitons, a new optimization should be performed. We have checked the consistency of this approach by using a spectral modulation period from 1 to 2.5 nm in wavelength, corresponding to temporal delays ranging from 3 to 8 ps. The optimization process was indeed leading to stable 2-soliton molecules in more than 90% of the runs. This is illustrated in Fig. 3, which displays two other optimization results for different targeted delays. The optimal regimes are stable 2-soliton molecules with an internal separation close to the target value. Again, we note the large spectral width (≈40 nm) and high short and long-term stability associated with the ultrafast regimes. In principle, the range of control over the time separation, here from 3 to 8 ps, could be extended. The present upper temporal separation of 8 ps is technically limited by the resolution of the SLM in the Fourier plane, which is 0.3 nm/pixel and impedes imprinting modulations with a period less than ~1 nm, corresponding to 8 ps. The lower boundary at 3 ps seems associated with the dynamics of the interacting chirped pulses featuring pronounced overlap in some sections of the fiber cavity [14]. This boundary is therefore strongly dependent on the cavity architecture and average dispersion.

To summarize, we have illustrated further the potential of evolutionary algorithms to generate complex but welldefined multi-soliton regimes. Using a laser setup combining computer-controlled intracavity polarization and pulse shaping, we generated on demand 2-soliton molecules, with a pre-determined temporal separation from 3 to 8 ps. The prospect of this work is to explore other possible self-generation of on-demand pulse profiles and complex dynamics, moving further the capacities of smart ultrafast lasers [15][16][17].

Fig 1 .

 1 Fig 1. (a) Schematic of the fiber laser setup. EDF: erbium-doped fiber; LC: liquid crystal retarder; PBS: polarizing beam splitter (PBS); coll: collimator. (b) Schematic of the homemade pulse shaper, containing 2 gratings (G), 2 cylindrical lenses (L) and a dual-mask SLM in the Fourier plane. (c) Graph presenting a typical spectral intensity transmission induced by the pulse shaper for the generation of 2-soliton molecules.

Fig 2 .

 2 Fig 2. (a) Optimization curve displaying the merit score versus the generation number (see text). Optical characterization of a selfgenerated soliton molecule obtained after optimization, with a 4ps separation target: (a) Optical autocorrelation, (b) averaged optical spectrum, (c) DFT trace displaying 20000 consecutive single shot optical spectra, highlighting stationary mode locking.

The 3 -

 3 peaked autocorrelation trace in Fig. 2(b) is the signature of a molecule consisting of two identical solitons bound together, with lateral peaks having an amplitude half of the central one. The two solitons are separated by a delay of 3.93 ps, which represents a 2% difference with the target. That temporal delay matches the 2.05-nm spectral modulation period shown in Fig 2 (c). Each pulse duration is estimated to be 150 fs from the autocorrelation trace. Since the emission spans over a broad 40-nm bandwidth, the Time Bandwidth Product (TBP) is 0.75 indicating some frequency chirp. The stationary soliton molecule generation is attested by the DFT trace recorded over 20000 successive roundtrips, shown in Fig 2(d), which presents nearly identical shot-to-shot spectra over a 1-ms lapse of time.

Fig 3 .

 3 Fig 3.(a) and (c) Optical auto-correlation traces of self-generated soliton molecules obtained after optimization, with internal separation targets τtarget = 7.62 ps and 5.33 ps, respectively. (b) and (d): corresponding averaged optical spectra.

Funding. Région Bourgogne Franche-Comté, European Regional Development Fund (FEDER), EUR EiPhi Graduate School (contract ANR-17-EURE-0004), French "Investissements d'Avenir" program: project ISITE-BFC (contract ANR-15-IDEX-0003).

Data availability. Data underlying the results presented in this paper

are not publicly available at this time but may be obtained from the authors upon reasonable request.

Disclosures.

The authors declare no conflicts of interest.


Catherine Baroin

A brief history of a neo-traditional form of chieftaincy and its

Introduction

Van Rouveroy van Nieuwaal has repeatedly emphasised that African traditional chiefs often play a hybrid role: they are caught between on the one hand the state and its government, whose policies and legislation they are supposed to enforce, and, on the other hand, the people over whom they preside and whoseoccasionally conflicting -interests they are meant to represent. Even when they don't turn out to be mere government puppets, or when a socio-political situation generally allows for more flexibility, chiefs are often stuck in this inescapable, ambiguous position.

Until the early 1950s, the chiefs of the Rwa of Mt. Meru in Northern Tanzania experienced such an ambiguous situation. However, a land conflict with the British colonial administration created such turmoil, that the ruling traditional Rwa chief was rejected by his people and that new political institutions, including a different conception of chiefaincy, were put in his place. Subsequently, the role of the former traditional chief was split between two persons, both of which had very clear-cut positions: on the one hand there was the former official chief (Mangi), who was backed by the colonial administration, but who in reality had very little authority; on the other hand there was the chief (Nshili Nnini), who presided over tribal issues and, relying on a new constitution, became the unofficial but true guarantor of the Rwa identity and customs. The present article describes these rather peculiar political institutions, which the Rwa adapted to modern times, and which until today play an important role in the Rwa's public and private life.

A historical background (1947)(1948)(1949)(1950)(1951)(1952)(1953) Traditionally, the Rwa have been Bantu-speaking farmers who cultivated the rich southeastern slopes of Mt. Meru (4585 m), some 50 kms away from their betterknown eastern neighbours, the Chagga of Kilimanjaro. Like the Chagga, the Rwa mainly used to grow bananas and coffee, combined with maize and beans, which were also cultivated on the dry plains below the mountain. During the 1930s and 1940s, the Rwa experienced great population growth, which resulted in both local and colonial concern with regard to increasing pressure on land. The situation was aggravated by the fact that many White settlers had set up large and profitable coffee plantations, forming a circle around Mt. Meru, which prevented the Rwa from expanding down the mountain and from taking their herds to the low pastures and watering points.

In Northern Tanganyika, the British administration tried to find a permanent solution to the recurring conflicts between the White settlers and the indigenous Rwa, by commissioning an expert, Justice Wilson, to investigate the situation. Based on his belief that Africans should only carry out subsistence farming and provide labour for other economic sectors, whereas the White settlers should specialise in commercial farming on large-scale coffee plantations, Wilson advocated homogenisation and extension of the White settlers' areas by expropriating the Rwa pastures and a few farms to the east of Mt. Meru. The Rwa, who already felt congested on the mountain and wished to expand their own coffee production, resolutely opposed the trimming of their tribal land. Resistance against colonial expansion was mostly led by young, educated, dynamic, Christian coffee growers, who had learned to read and write at the Lutheran mission schools, had started growing coffee for cash after getting acquainted with this new plant on the mission fields, and were eager for more social influence.

During the late 1940s, Tanganyika had a rather anomalous position in the British Empire: it was Mandated Territory, which after the defeat of Germany at the end of World War I had been administered by the United Kingdom under the loose supervision of the League of Nations. Britain thus had 'full powers of legislation and administration', but was bound to promote 'the material and moral well-being and the social progress of the inhabitants'. According to this mandate, the British attempted to carry out a new policy, under which the former tribal Native Authorities -a creation of Indirect Rule -were transformed into more modern and democratic Local Governments. It was thus decided that, in accordance with the colonial administration, local chiefs were to be elected and should rule in keeping with a written tribal constitution, which would combine local practices with modern principles, such as the separation of executive and legislative functions.

In 1948, talks about the creation of a tribal constitution started. As a result of the growing unrest on Mt. Meru however, the Rwa refused to collaborate. They boycotted their traditional chief, the Mangi, because they felt he was supporting the colonial administration on the expropriation scheme, and they demanded his resignation. The British tried to suppress the rebellion by deporting its most outspoken leaders, but unintentionally made matters worse. As the Mangi maintained his position, turmoil grew bigger and hundreds of Rwa joined the Kilimanjaro Citizens' Union (KCU), a new political party that had been set up by the Chagga the previous year and that was aimed at eroding the standing of local Chagga traditional Chiefs. Despite this immense Rwa opposition, the constitution was created nonetheless; it was, however, never carried out, although the Rwa readily admitted 'the excellence of its underlying principles', as the British administrator bitterly noted.

The year 1951 is still remembered by the Rwa as a most dramatic year in their history. It was the year that the forced land eviction took place and that the British even went as far as to burn down the local Lutheran church, which was a great sacrilege for the, by then, devoutly Christian Rwa. Other less dramatic, but equally significant, events also took place in 1951, and they were to have more continuing effects.

On 1 January, the Rwa rebellion thus organised itself in an independent political party, the Meru Citizens' Union (MCU), splitting from the Kilimanjaro Citizens' Union. This party was to play a leading role at a later stage when dealing with the British administration and setting up an independent coffee co-operative.

On 24 February, the Rwa elected their first Paramount Chief, in parallel with the pro-British Mangi. They gave this new chief a new title, Nshili Nnini, meaning 'big leader', using the same word, nshili, that was used to refer to a clan leader, Nshili wa Ufwari. While the election of a Paramount Chief in a comparable situation had been quite official -the Kilimanjaro Citizens' Union had campaigned for the election of a Paramount Chief for all Chagga, and the first Chagga Paramount Chief, Thomas Marealle, had been elected on Mt. Kilimanjaro one year later --the election of the Rwa's Nshili nnini was never acknowledged by the British administration. His election was for instance never even reported in the District Commissioner's (DC) annual report, which was not surprising: his authority had been bitterly challenged by the Rwa. Although their confrontation remained non-violent, it took all sorts of administrative and legal forms, and extensive international contacts were set up in order to have the Rwa case known all over the world. The DC was not inclined to praise the organisational abilities of such a trouble-making tribe.

Subsequently, the Rwa hired a lawyer and filed a suit against the British, the Meru Land Case, which was heard by the Trusteeship Council of the United Nations Organisation (UNO) -the legal successor of the League of Nations -in New York, in 1952. It was the first time a small African tribe challenged colonial domination on the international scene, and as such it became a well-known episode in the African struggle against colonialism. However, the new political institutions that the Rwa created in the wake of the Meru Land Case, have never been mentioned, nor reported, in the Colonial Archives and hardly received any attention in later studies. They remained underground, but nevertheless playedand still play -a significant role in the Rwa's central political system. In fact, the unacknowledged character of the Rwa's alternative political institutions is the reason that they remained in place after traditional chiefdoms were abolished in Tanzania in 1963 in the first place. When chieftaincy was abolished, the Nshili Nnini was left as the sole representative of tribal identity.

The new political institutions

The new political system created by the Rwa in 1951 was made of three parts: i. i.

the Nshili Nnini, or head leader ii. ii.

the kamati, or tribal council iii. iii.

the tribal constitution.

The duty of these institutions has been to rule local affairs and to enforce moral and social order, completely independent from the national political system. The British colonial administration, and later the Tanzanian State administration, never interfered with these internal matters. Let us take a closer look at these three-fold new institutions.

(i) The Nshili Nnini wa Varwa, the Paramount Chief of the Rwa, is the tribe's moral leader. In Swahili, his title is translated either as Mwenyekiti wa koo zote Meru (Chairman of all Meru clans), or Mwenyekiti wa Jadi na Mila za Wameru.

The Rwa themselves translate this latter formula into English as 'Chairman of taboo and Meru traditions'. This Chief's role is thus to enforce customary law according to the tribe's constitution and wishes. He does not make decisions alone: a global consensus is always looked for, and all matters of general concern are discussed within the tribal council or in general meetings.

The first Nshili Nnini, who was elected 24 February 1951, was Tobia Nassari Ayo, the former leader of the Ayo clan. His clan was a commoner one, and Tobia was chosen not for any prominent position or wealth, but for his personal qualities: he was a gentle and quiet man, who listened to people and spoke eloquently. He had strong moral standards and knew the Rwa traditions and culture well. He remained Nshili Nnini for 25 years, until 1976, when he resigned because of old age. The next Nshili Nnini was Yesaya Lemera Kaaya, the former Nshili's long-term and experienced assistant. He, in turn, resigned because of old age in 1984. Moses Isacki Nnko, the former leader of the Nnko clan, succeeded Isaya after being formally installed in January 1986. He resigned because of ill health in 1994, and his assistant, Bethuel Paulo Kaaya, took over.

The Nshili Nnini and the clan leaders have no special dress. They wear western clothes like all other men nowadays. However, when on duty, chiefs can be recognised by the special sacred stick they carry with them. Each chief has his own stick, ndata, which is about 50 cm long and ends up in a sphere about the size of a fist on the one end. It is carved out of a very hard and dark wood, from a tree called senefu. The Nshili holds his stick right below the sphere, vertically. No one else should touch the stick, and although the chief can curse a person by pointing it at him, or by turning it upside down in front of this person, he should never use it to kill another human being. The supernatural power of ndata is such that it also stops fights: the chief only needs to raise it above the belligerents, and they will stop immediately.

(ii) The Nshili nnini presides over a council of elders called the kamati. This council is composed of about 15 to 20 members, which include the leaders of the main clans and older age groups, together with a few respected old men. The secretary, katibu, of the kamati convenes meetings and writes letters decided upon by the council. The Nshili Nnini also has an assistant (ivele or ngoviri). This man, because of the experience he normally accumulates in performing this duty, usually succeeds the Nshili Nnini.

The council holds regular meetings, two or three times a month, to discuss a variety of tribal affairs. Most of its activity pertains to general matters (the Meru Land Case for example, before it was settled), policies and contributions to be collected for development and it functions as a supreme court, settling disputes for which no solution has been found at the lower level.

When an ordinary dispute arises, the matter is first discussed at the local level, i.e. within the family if it is a family problem, or within the lineage or clan if that is appropriate. If two clans are involved, leaders and members of these clans will meet in order to settle the dispute. Only when no agreement is reached at a lower level, is the matter sent to the level above. When a family conflict cannot be settled by the head of the family, it is thus discussed by the lineage; if the lineage in turn does not succeed to arbitrate the case, members of the whole clan will try to find a proper solution. In former times, a plaintiff who asked for the arbitration of his lineage or clan had to provide beer for the elders. Only then would they meet and discuss the issue. But as beer consumption has dropped heavily as a result of Lutheran influence, the elders' demand for beer dropped, and plaintiffs are supposed to provide others drinks or cash when they ask the elders to meet and consider their case.

Besides general issues pertaining to the whole tribe, the cases that are finally brought up to the kamati usually stem from daily controversies that families or clans are not able to solve. Many cases relate to land issues, which are normally of clan concern: inheritance, lending or selling of land, and boundary marking (when a farmer unduly displaces a field limit, encroaching onto his neighbour's land). Family and matrimonial problems also take up much time on the council agenda: conflicts between a man and his wife, between brothers, parents and children, or decisions as to the fate of a widow and orphans. All of these are not personal matters but legitimate group concerns. Compensation for theft, injury or murder may also be brought to the kamati, since they are also matters that the lineage or clan are normally involved with. Such is also the case with controversies relating to women (if, for example, a man takes somebody else's wife), or with contracts on animal lending, which entail arrangements that are defined by customary law.

Before the whole council meets to discuss a problem, a simpler solution may be looked for. For example, one or a few members of the council will be asked, personally, to arbitrate a specific dispute in which the parties involved have not been able to come to an agreement on their own. It is hoped that the wisdom and influence of an elder will help find a settlement. If this does not suffice, the whole council will meet to discuss the issue, and the decision will settle the matter once and for all, no appeal being allowed within the traditional system.

In most cases, people bow to the kamati's decision, and only seldom does someone decide to take his case further to the local Primary Court. A Primary Court judgment, if contrary to traditional customs, can be reversed by the kamati, and the latter's verdict will usually prevail because it stems from a collective agreement that the individual is bound to accept. Moore's keen remarks on Chagga law apply here as well: she rightfully notes that official Tanzanian law, which is enforced in Primary Courts, and local customary law rely on opposite conceptions of society. Official law is strongly influenced by European ideas, which look at societies as 'only a great sea of individuals (…) [where] clans and families [are] not (…) given serious official attention'. Yet it is quite clear that both in Chagga and in Rwa society today, clan and family interests prevail over the individual. Clans and families remain the basic operating social units, the concerns of which customary law (whether Chagga or Rwa) deals with. Because they address the appropriate issues in a suitable manner, the clan or the council usually succeeds in settling matters.

There is one final important field that falls within the competence of the tribal council: decisions pertaining to ordeals. Ordeals indeed set up a threat not only for individuals, but for the social group (family or clan) as a whole, which is why they are of family or clan concern. The procedure to which the Rwa resort is called 'to break the pot', and it is still used in present Rwa's daily life, as a manner to solve some problems for which no other solution has been found. If some damage has been done -somebody's barn is burned down, a cow is stolen, a piece of property (in one case from 1997, a radio) is stolen from a house -and despite extensive searches and inquiries, no thief or wrongdoer can be found, and thus nobody can be held responsible, there is only one sure way for the victim to secure compensation or revenge. He (she) will launch a supernatural procedure, called 'to break the pot'. First it is publicly announced, some two weeks in advance, that the pot will be broken for this specific case. The announcement is meant to give the person at fault a further opportunity to report himself (herself) before it is too late. If he does not show up, a specialist of pot-breaking will be called for. This specialist uses a small clay pot shaped as a feminine figure with two breasts, puts some specific plants inside it and lays a curse, by saying: 'If the person who burned this barn (or stole this cow, or stole this radio) does not report himself, let him be cursed'.

The threat is such that the wrongdoer usually prefers to report himself straight away. Then, in order to 'cool down the curse', yorisa kidengo, i.e. to free himself from it, he must compensate the victim, pay for the pot procedure and pay a fine, as soon as possible. If he fails to do so, the curse sooner or later will bring endless misfortunes upon him, his family, his clan, his descendants and/or his property. He may get sick or die, his family or clan members may get sick or die, he may have no offspring himself, his children may die, his cattle may die or have no offspring, or his crops may not ripen. Everybody is so deeply convinced that such disasters are bound to occur, that breaking the pot is a very efficient way to force a wrongdoer to come to the fore, and thus to solve this kind of problem.

Another occasion for breaking the pot arises if a series of misfortunes strike a family or a clan, and people start looking for an explanation. They will agree that some family or clan member did something wrong, possibly a long time ago, that he never paid for. Maybe somebody fell short in his duty of honouring a particular ancestor, and the latter is now seeking revenge; maybe he killed somebody or stole something, and never acknowledged his deed after the pot was broken. The problem therefore is to find out who is responsible, and what misdeed explains the ill fate now beleaguering the group.

Because the curse endangers the wrongdoer's whole clan, no one is allowed to undertake the breaking of the pot without the approval of his clan: the risk would be that the wrongdoer belongs to the same clan as the victim, in which case the procedure would backfire and turn the curse against all clan members. The clan of the victim therefore first inquires and debates among its members in order to make sure that no one within the clan is responsible for the offence, before allowing the procedure to take place. In the late 1980s, the Rwa decided to add one more guarantee against the deadly risks involved in breaking the pot: only the tribal council could from then on be entitled to decide about letting somebody break the pot.

Most Rwa today agree that the social benefit of this procedure is that it provides strong incitement for people to behave. But members of the Pentecostal church, which influence is growing on Mount Meru, refuse to participate in laying any curse. They consider it a sin, and claim that breaking the pot amounts to calling the devil upon fellow Christians.

(iii) As mentioned before, the idea of a tribal constitution was first put forward by the British administration in 1948, but could not be enforced because of local Rwa rebellion. After the land case had been settled, and the Mangi had resigned in 1952, talks about a constitution resumed between the British and representatives of the Rwa people, including members of the Meru Citizens' Union:

'After twelve such meetings, the new constitution was written up and circulated throughout the tribe; it was discussed at village meetings and finally accepted on May 27, 1953. The more prominent features of the new constitution were the decision to elect the Mangi by secret ballot, the separation of the executive and the judiciary at all levels, and the setting up of sub-committees of the tribal council to deal with specific services.'

After the new constitution was approved, a new Mangi, Sylvanos Kaaya, was elected. He dealt with all administrative matters in relation to the colonial power, while the Nshili Nnini remained in charge of internal affairs. When in 1963, shortly after the establishment of independence, the Mangiship was abolished, together with all traditional chieftainships in Tanzania, the 1953 constitution also ceased to exist. The text completely disappeared, and is not even clear whether it was ever enforced after Kaaya's election. However, the concept of a constitution remained and lived on in the political system of the Nshili Nnini, who continued to perform his duties: he could not be abolished, since he had never been officially accepted in the first place.

After the initial abolishment of all traditional polities, the Nshili Nnini and his council dealt with tribal affairs and cases on an oral basis, according to customary law. It was, on Mt. Meru as elsewhere, a set of unwritten rules, of which the elders were knowledgeable with regard to traditional local affairs and that they could judge cases. It was only much later, apparently, that the tribal council decided to write down the customary law. They wrote a document that they themselves referred to as their 'constitution', using the same word that the British had introduced in 1948. However, the content of this document was quite different from that of a constitution in the English sense.

The document, written in Swahili, has had many shapes and forms. In the course of four stays on Mount Meru, I collected four successive versions of it, spanning over a time of ten years, from 1985 to 1995:

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The earliest written document I came across dates from 1985. It is a six-page, typed manuscript in Swahili, entitled Decisions of the Assembly of Traditional Leaders of the Meru (Rwa) people -Phase Three -1985. This document first indicates the names of the 14 members of the tribal council who enacted the 66 laws that follow (sheria zilizowekwa, 'the laws that have been changed'). It is signed by three persons: Yesaya Lemera Kaaya, who was the ruling President of the council, his successor Moses Isacki Nnko, and the secretary of the tribal council.

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The next available document is written in English and is dated December 1986. It is called Meru traditional regulations, and starts with the same list of 14 people, followed by a greater number of paragraphs. The previous 66 are extended to 74, and they are divided into a number of subheads: regulations concerning marriage, injury or murder, stealing animals or food, rites concerning death and inheritance, and general regulations.

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The third document corresponds to 'phase 4' of the 1985 constitution. It is written in Swahili, and dated 1989. This time, it comprises a list of 81 different 'laws' (sheria) decided upon by a list of 16 council members.

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The latest document was agreed upon in 1995 by a council of 20 members. The 1989 draft of 12 pages developed into a neatly typed document of 25 pages, where the same 81 points are given a more detailed phrasing. The obvious concern is to avoid ambiguity in interpreting the law. The title is also more elaborate: Laws of Meru traditions and customs as decided upon in the general meeting of all leaders (Mringaringa) on 28 January 1995. At the bottom of the front page it is written: Zimetungwa na halmashauri kuu ya jadi na mila za Wameru, meaning 'Compiled by the Head Council of Tradition and Customs of the Meru people'.

These four documents clearly demonstrate that, in recent times at least, the Rwa have paid much attention to their laws. From one to the next, the constitution has become more complete and longer. Comparing the first and last version (1985 and 1995) enables us to draft the general contents of the constitution, and to analyse the global trend of its evolution.

Fitting to modern times

Both documents share the enumeration of long series of fines that are due in various circumstances. The first 18 articles deal with marriage payments. They give a long list of animals, cash and other gifts that the bridegroom has to give to various members of his bride's family, before and after the wedding. No mention is made, however, of the time when these gifts should be given. Another long list of articles indicates which fines must be paid, depending on a great number of possible damages: injuries of different kinds, murder, helping with abortion, impregnating girl, thefts of all sorts (stock, agricultural products, honey or beehives). Other important topics that the two documents are concerned with are inheritance, selling or lending of a field, or other economical regulations such as those to be followed when someone keeps somebody else's animal.

A full analysis of all these laws, which the Rwa consider as the cornerstone of their tradition, would involve a detailed description of their social customs and rituals, which is beyond the scope of the present article. It will suffice here to highlight the most significant changes that were introduced in the last constitution, as compared to the one written ten years earlier, as they provide evidence about the social changes which took place lately in Rwa society:

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From one document to the other, rules are reordered in a more logical way and fifteen new points are introduced, thus turning the last constitution into a lengthier (from 66 articles to 81) and more detailed document. Many rules are phrased more explicitly ways and examples are introduced in order to avoid ambiguity. This concern for more logic and more precision is, again, a clear signs of the people's interest in these laws.

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Another obvious basic concern is to adapt rules to modern times. This can be seen in one striking difference between the two documents; namely, the updating of fines. Their increase is not a mere consequence of inflation. It also demonstrates the people's understanding of inflation and their desire to deal with its effects.

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Another sign of the Rwa's concern for modernity is the introduction of a new clause: the obligation for parents to send their children to primary and secondary or technical schools. Indeed, the general concern for providing education has continued to grow on Mt. Meru, keeping pace with demographic pressure and land shortage. These factors in turn make it necessary to look for other sources of income, which better education is likely to make available.

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Land pressure on Mt. Meru also led people to keep and breed less livestock. It is thus not surprising that many fines that were valued in kind (cattle or small stock) in 1985, have been given cash equivalents in the updated constitution. Few people would be able to pay these fines in kind nowadays.

• Again, the Council's desire to adapt customary law to the changing conditions of life is demonstrated in a new article: it formally states which rules should apply in case of a car accident. Such occurrences are indeed on the rise, due to the ever-increasing traffic on the Arusha-Moshi tarmac road, right to the South of Mt. Meru.

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But other new developments in the 1995 document result from more fundamental changes in the Rwa's mores and mentalities. Children are for instance increasingly born out of wedlock, and the new constitution takes this new social trend into consideration by providing them with rights they did not have previously. Such children and their mothers used to be social outcasts, but they became so numerous that they cannot be simply discarded anymore. A new attitude has developed, partly as a result of church influence, and the general feeling today is that these mothers and children should be given a minimum social recognition and economic support. One new article in the constitution thus stipulates that, if a man is proved to be the father of a child whose mother he refuses to marry, he must still provide for the child's upbringing, pay for his school fees as a married father does, and give him a share of inheritance.

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Moreover, a number of new rules specifically deal with various cases of sexual intercourse outside wedlock, and a new article has been introduced that allows daughters to inherit land from their fathers, 'in case they do not live in their husband's homestead' (a euphemistic way of saying that they are not married). The new constitution not only tries to make good the damage on the side of the mother and the child; it also punishes the wrongdoer by prescribing heavier fines on a man who impregnates a girl and subsequently refuses to marry her. This harsher punishment is another indication of the growing general concern for what has come to be a big moral and social problem.

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Married women as well are endowed with increasing rights. For example, a new article states that a woman who is expelled by her husband has a right to cultivate a field that her husband's clan will provide her with. This is a way to provide her with personal means of subsistence and with the right to stay with her children in the area. A heavier fine is also levied upon a husband who injures his wife and breaks one of her bones: an extra ewe is added to the previous fines.

Where some of the articles in the Rwa's constitution thus demonstrate their concern for adapting to modern times, others remain very much in line with tradition. Thus, the custom of 'breaking the pot' is introduced, by stipulating that it is prohibited to break the pot without kamati permission. However, the purpose of this article is not to officially acknowledge a custom that everybody takes for granted; it is to rule and control the handling of this very dangerous procedure.

In all successive versions of this document, land clearly remains a basic issue. The latest version introduces two additional articles regarding land. One stipulates what should be done in case one unduly moves the boundary mark of his field (not a rare occurrence), and the second expressly prohibits mortgaging a field. This article can be considered as an attempt by the clan elders (who are strongly represented within the kamati) to safeguard their main source of power, namely control of land, since mortgaging a field can be an indirect way to sell it without clan permission, i.e. to escape the traditional obligation to ask for the clan elder's permission in order to sell a plot of land.

Further articles have been added which relate more closely to constitutional rights proper. They describe how chiefs should be elected, and stipulate that no cumulation of offices is allowed: a clan chief can thus not be an age-group leader or a church leader. These three basic sources of power are thus clearly differentiated.

One final striking feature of the 1995 document is the obvious demonstration of the need for outside recognition. The final article, after listing the names of the 20 members of the constitutional committee who drafted and agreed upon the text, entails one sentence for government approval: 'as approved by the Chief Lawyer of the Government'. A blank space is left for this person's signature.

This document, as I was told, was the result of the following steps:

• The new constitution had been prepared by the council of elders whose names are listed at the end; • Then it had been discussed and approved on a wider scale, by the clan leaders and age-group leaders; • Then it had been sent for approval to the Tanzanian government, as the final sentence of the 1995 document testifies.

The Rwa indeed felt they could not officially approve their own constitution if any of its articles was in contradiction with the Tanzanian State Laws. This position exemplifies the strength of the national feeling in Tanzania, which is a prevailing attitude throughout the country. The Rwa, somehow, consider themselves to be Tanzanians before being members of their own tribal community. At the time of my fieldwork, they were waiting for a positive answer from the government, before organising a general meeting with the purpose of approving their new constitution officially. Only then would they use it as their new legal basis. With such a purpose in mind, it is quite clear that no other language could be used but Swahili, together with English the official language, and by far the most widespread in Tanzania.

Conclusion

The Rwa constitution provides an interesting picture of what the Rwa consider to be the core of their social laws. However, these laws are the ones that the Rwa want to apply to themselves, or feel they should apply to themselves. They may not fully correspond to what actually takes place. As Moore commented with regard to Chagga customary laws: '… fixity of rule statement is frequently found coupled with flexibility of practise.' For example, the livestock that a Rwa bridegroom is supposed to give to his in-laws is sometimes paid years later, if ever. One elderly informant once proudly told me that he had just recently paid the bride price on behalf of his own father, who had died before he had finished paying it. Despite the fact that some rules are thus not given much notice, it is important to keep them in mind: when a crisis occurs, the reason for ongoing misfortunes may be attributed to the fact that these rules were ignored.

The constitution not only provides some insight as to how the Rwa view their own culture. In addition, it is a form of political manifesto. By stating in writing the tribe's 'traditional' institutions, Rwa identity is shaped and strengthened. From a historical point of view, the tribal institutions described in this article were created to resist British colonial dominance in the wake of the Meru Land Case. But they can also be understood as a broader consequence of indirect rule, and of the 'creation of tribes' that went with it: Iliffe thus states that, with regard to Tanganyika, the British -in an oversimplification -only viewed Africans as belonging to tribes, and so Africans created tribes in order to function within the colonial framework.

The Rwa political institutions clearly demonstrate their desire to regard themselves as a united and operational tribal group, and in this respect one should not be surprised that they went as far as to adapt their institutions to modern times, making them one further example of neo-traditional bricolage, for which Africans have demonstrated so much talent. However, tribal unity was greatly jeopardised in the early 1990s by a violent conflict that erupted among the Rwa over the control of the Lutheran diocese on Mt. Meru. A lingering dispute followed between the authorities of the official Lutheran church on the one hand, and the 'rebels' who started a new independent church on the other hand. It resulted in so much social disruption that development projects could no longer be implemented, and the proper working of the Rwa's political institutions was greatly hindered. In Rwa society today, the neo-traditional tribal institutions compete with two additional sources of power: the churches and the state administration.

  van ROUVEROY van NIEUWAAL, E.A.B. 1999. Chieftaincy in Africa: Three facets of a hybrid role. In: van DIJK, R. & van ROUVEROY van NIEUWAAL, E.A.B. (eds), African chieftaincy in a new socio-political landscape. Hamburg/Münster: LIT Verlag, 21-47.