Je Souhaite Remercier

Frédéric Garabetian

Isabelle Lavoie

Jean-Jacques Bessoule

Philippe Soudant

Sandra Kim-Tiam D'

Agnès Feurtet-Mazel

Chloé Bonnineau

François Delmas

Jean-Jacques Bessoule

Marina Le Guédard

Magalie Baudrimont

Marie Vagner

Martin Laviale

Nicolas Mazzella

Floriane Demailly
email: floriane.demailly@inrae.fr

Imane Elfeky

Laura Malbezin

Mélissa Eon

J.-J Bessoule

J.-J Bessoule

J.-J Bessoule

Patrice Gonzalez

J.-J Bessoule

Jean- Jacques Bessoule

Soizic Morin
email: soizic.morin@inrae.fr

Jean- Jacques Bessoule

Deux articles soumis dans des journaux de rang A

Keywords: Bacillariophyceae, Fatty acid, Herbicides, Toxicity Microalgae, Fatty acids, EPA, Nutritive quality, Diuron, S-metolachlor Microalgae, Diuron, S-metolachlor, Toxicity, Fatty acids, EPA

En premier lieu, je tiens à remercier le LabEx COTE pour le soutien

Impacts de contaminants sur les acides gras des diatomées

Résumé : Les acides gras, principaux composants des lipides de stockage et de structure, sont indispensables au maintien de la fluidité membranaire et au stockage de l'énergie métabolique.

L'impact des pesticides sur les profils d'acides gras ont déjà été étudiés chez les microalgues marines, mais peu d'études se sont intéressées aux réponses des diatomées d'eau douce. De plus, aucune étude n'a porté sur l'impact des herbicides sur leur teneur en lipides. Les principaux objectifs de cette étude étaient : 1) de comparer les profils d'acides gras et les réponses des « descripteurs classiques » afin d'évaluer leur complémentarité, 2) d'estimer l'effet des herbicides sur la composition en lipides d'une diatomée d'eau douce et enfin, 3) d'examiner le potentiel du 20:5n3 en tant que biomarqueur de la pollution en herbicides. Pour ce faire, Gomphonema gracile et Nitzschia palea ont été exposées pendant sept jours au diuron et au Smétolachlore à 10 µg.L -1 .

Le diuron s'est avéré plus toxique par rapport au S-métolachlore à 10 µg.L -1 tout au long de cette étude. Les acides gras ont été impactés par le diuron à l'inverse de la teneur en pigments et ont permis d'informer sur la variation du contenu énergétique des diatomées en réponse à une pollution contrairement aux « descripteurs classiques ». La composition lipidique totale a été impactée par le diuron avec une diminution des lipides de stockage. Le diuron a affecté le contenu en 20:5n3 des lipides impliqués dans la photosynthèse.

Sur la base d'études précédentes et de ces résultats, il est suggéré que la teneur en 20:5n3 dans les diatomées pourrait être un bon biomarqueur de la pollution des eaux par le diuron.

Mots clés : Acide eicosapentaénoïque, Lipide, Toxicité, Herbicides, Diatomées,

Ecotoxicologie microbienne

Impact of contaminants on diatom's fatty acids

Abstract : Fatty acids (FA), which are the main components of storage and structural lipids, are crucial for the maintenance of membrane fluidity and play a central role in metabolic energy storage. Pesticide impacts on FA profiles have been documented in marine microalgae, but remain understudied in freshwater diatoms. In the same way, no study has focused on the impact of herbicides on their lipid content. The main aims of this study were to: 1) compare the responses of FA profiles and "classical descriptors" in order to evaluate their complementarity, 2) estimate the effect of herbicides on lipid content and composition of one freshwater diatom and finally, 3) examine the potential of 20:5n3 as a biomarker of herbicide pollution. To address these issues, Gomphonema gracile and Nitzschia palea were exposed during seven days to diuron and S-metolachlor at 10 µg.L -1 .

The results demonstrated higher toxicity of diuron compared to S-metolachlor at 10 µg.L -1 on all descriptors studied. FA responded to diuron contamination conversely to pigment content and permitted to document energy content variations in diatoms subjected to herbicide stress conversely to "classical descriptors". Total lipid composition was impacted by diuron with a notable decrease of storage lipids. Diuron affected the content of 20:5n3 in lipids involved in photosynthesis.

Based on previous studies and our current findings, it is suggested that 20:5n3 content in diatoms could be a good biomarker of diuron pollution in freshwaters. Je remercie toute ma famille pour votre soutien durant mes études et en particulier durant cette thèse. Merci à mes parents, mon petit-frère, Julie, mes beaux-parents, Justine, Quentin, Noémie et toute ma belle-famille. Je vous remercie pour tout l'Amour que vous m'apportez.

Keywords

Je tiens à remercier en particulier ma petite maman : merci de m'aimer inconditionnellement depuis toujours et de me soutenir dans mes choix professionnels ou personnels. Merci d'avoir le coeur sur la main. Merci d'être toujours là pour moi, tu es une maman EXTRAORDINAIRE, sache-le. Merci pour l'éducation que tu m'as donnée. Si je suis la personne que je suis aujourd'hui c'est grâce à toi petite maman chérie, alors MERCI. Je t'aime.

Pour finir, ces remerciements n'auraient pas lieu d'être, sans toi Maxime. Je te remercie de me soutenir depuis toutes ces nombreuses années. Tu as su me POUSSER quand il le fallait et me faire DECROCHER aussi quand c'était nécessaire.

Je voudrai t'écrire ici que c'est bien grâce à toi que j'en suis là aujourd'hui. Tu as toujours su exprimer les bonnes remarques et faire naître en moi les bons questionnements. MERCI pour ta patience légendaire, car sans celle-ci je crois que tu te serais tiré les cheveux lors de mes périodes d'examen ou bien lors de ces années de thèse pour lesquelles il n'y a pas eu que de bonnes périodes.

Mais, grâce à toi, j'ai eu une vie personnelle durant ce doctorat et pas qu'à moitié même !! On a quand même préparé un mariage puis accueilli un bébé !! Et crois-le, ça n'a pas été de tout repos, mais si cela était à refaire je le referais 1000 fois, car oui, tu m'as appris et m'apprends encore aujourd'hui à profiter de chaque moment et aventure de la vie.

Nous allons débuter un nouveau chapitre de notre vie, ensemble, mais cette fois-ci à 3, et croisle je trépigne d'impatience de voir ce que la vie va nous réserver. Mais qu'importe, nous serons tous ensemble et ça, c'est le principal.

La dernière personne que je souhaite remercier (qui ne sait pas encore lire, mais j'ai l'espoir que ces remerciements soient lus un jour), et finalement à qui je dédicace cette thèse toute entière, c'est toi, mon enfant, ma fille, Loïse, petit être né en Octobre 2019 durant cette thèse.

Tu es bien celle qui a vécu mes ressentis et mes émotions au plus proche de moi durant ce doctorat. Grâce à toi, j'ai appris à vraiment relativiser dans la vie et surtout lors de cette fin de thèse assez particulière (#covid19). Je te remercie pour tous tes petits coups de pied quand j'écrivais cette thèse, ceux-ci m'ont permis de sourire de nombreuses fois et de me sentir moins seule face à cet ordinateur que je voyais plus que ton papa.

Finalement, on l'a écrit à 2 ce manuscrit de thèse, alors dans mon coeur tu es mon petit Docteur à moi et je sais que toi aussi tu as appris plein de choses sur les lipides et les acides gras des diatomées 😊.

Merci pour tout mon enfant que j'aime, le meilleur reste à venir…

Valorisations scientifiques

Séminaire national :

Demailly, F., I. Elfeky, L. Malbezin, M. Le Guédard, M. Eon, J.-J. Bessoule, A. Feurtet-Mazel, F. Delmas, N. Mazzella, P. Gonzalez,S. Morin. (2019, Avril). Impact de contaminants sur les acides gras des diatomées. Journée des Doctorants de l'École Doctorale 2019 (JDED), Talence,

France.

Trois communications par affiche

Demailly, F., M. Le Guédard, S. Morin, B. Delest, N. Mazzella, P. Gonzalez. (2017, Novembre). Impact of three pesticides on Gomphonema gracile's fatty acids. EcotoxicoMic 2017 First International Conference on Microbial Ecotoxicology, Lyon, France.

Demailly, F., I. Elfeky, L. Malbezin, M. Le Guédard, M. Eon, J.-J. Bessoule, A. Feurtet-Mazel, F. Delmas, N. Mazzella, P. Gonzalez, S. Morin. (2018, mai). Impact de trois pesticides sur les acides gras de Gomphonema gracile. Journée des Doctorants de l'École Doctorale 2018 (JDED), Talence, France.

Demailly, F., I. Elfeky, L. Malbezin, M. Le Guédard, M. Eon, J.-J. Bessoule, A. Feurtet-Mazel, F. Delmas, N. Mazzella, P. Gonzalez, S. Morin. (2018, Mai). How can three herbicides impact the fatty acids of the freshwater diatom Gomphonema gracile ? SETAC Europe 28th Annual meeting, Rome, Italie. ). 14:0, 16:0, 18:0 = SFA. 16 [START_REF] Diatomées | Métabolisme des diatomées[END_REF]18:1n9 = MUFA. 16:2n4,16:3n4,16:4n1,18:2n6,18:3n3,18:4n3 = PUFA. 20:4n6,20:5n3,22:5n3,22

Tables des illustrations

Tableaux présentés dans les articles scientifiques

Liste des abréviations

Introduction générale

Les biofilms ou périphyton, représentent d'important producteurs primaires dans les écosystèmes aquatiques [START_REF] Stevenson | Algal ecology: Freshwater benthic ecosystem[END_REF]. Dans les cours d'eau de taille moyenne, ces communautés benthiques sont considérées comme les principaux producteurs primaires [START_REF] Vannote | The river continuum concept[END_REF]. Ces communautés complexes s'intègrent dans une matrice extracellulaire [START_REF] Romani | Freshwater biofilms: Biofouling[END_REF] et sont composées d'organismes :

1) autotrophes tels que les algues et cyanobactéries;

2) hétérotrophes tels que les bactéries, les champignons et les protozoaires.

Parmi les organismes autotrophes tels que les algues, et plus particulièrement les microalgues, les diatomées représentent l'essentiel du périphyton à certaines périodes de l'année [START_REF] Mcintire | Modeling benthic algal communities: an example from stream ecology[END_REF]. Ces diatomées d'eau douce sont les organismes phototrophes dominants et jouent un rôle important dans les processus écologiques tels que la production primaire [START_REF] Potapova | Benthic diatoms in USA rivers: distributions along spatial and environmental gradients[END_REF][START_REF] Rimet | Recent views on river pollution and diatoms[END_REF]. Par ailleurs, les diatomées sont considérées comme des bioindicateurs pertinents en raison de leurs capacités d'adaptation et de leur tolérance aux facteurs environnementaux et à la pollution aquatique [START_REF] Morin | Benthic diatom monitoring and assessment of freshwater environments: standard methods and future challenges, Aquatic Biofilms: Ecology, Water Quality and Water Treatment[END_REF].

La composition biochimique des diatomées comprend quatre groupes de molécules principaux : les protéines, les glucides, les acides nucléiques et les lipides. Les diatomées contiennent des lipides polaires et non polaires constitués principalement d'acides gras saturés ou insaturés [START_REF] Sajjadi | Microalgae lipid and biomass for biofuel production: A comprehensive review on lipid enhancement strategies and their effects on fatty acid composition[END_REF]. Les profils d'acides gras des diatomées se distinguent clairement de ceux des autres groupes de microalgues avec notamment des teneurs plus élevées en acides gras polyinsaturés tels que le 16:2n4, le 16:3n4 et le 16:4n1 [START_REF] Ying | Total lipid and fatty acid composition of eight strains of marine diatoms[END_REF].

De manière globale, les acides gras contribuent à la production, à la fluidité, à la perméabilité des membranes cellulaires et aux réserves d'énergie dans la cellule de chaque organisme jouant ainsi un rôle important dans le transfert d'énergie dans toute la chaine trophique [START_REF] Filimonova | Effects of a herbicide and copper mixture on the quality of marine plankton[END_REF].

L'utilisation intensive de pesticides dans la protection des cultures engendre de nombreux problèmes environnementaux les classant comme polluants majeurs des écosystèmes aquatiques [START_REF] Aydinalp | The effects of pesticides in water resource[END_REF].

En France, de nombreux herbicides sont présents dans les rivières. Par exemple, les affluents du bassin d'Arcachon sont contaminés par divers herbicides, tels que le diuron et le Smétolachlore [START_REF] Fauvelle | Use of Mixed-Mode Ion Exchange Sorbent for the Passive Sampling of Organic Acids by Polar Organic Chemical Integrative Sampler[END_REF]. Néanmoins, ces indices n'ont pas été conçus pour évaluer des altérations toxiques spécifiques (métaux, polluants organiques de synthèse tels que les herbicides) et ne conviennent pas pour un diagnostic sensible de ce type de pollution.

De ce fait, de nombreuses études ont examiné et démontré l'impact des herbicides sur la croissance et la physiologie des diatomées [START_REF] Debenest | Effects of Pesticides on Freshwater Diatoms[END_REF][START_REF] Delorenzo | Toxicity of pesticides to aquatic microorganisms: A review[END_REF].

Néanmoins, il a été mis en évidence que la sensibilité des diatomées benthiques d'eau douce aux herbicides différait d'un taxa à l'autre [START_REF] Kim Tiam | Environmental effects of realistic pesticide mixtures on natural biofilm communities with different exposure histories[END_REF][START_REF] Larras | Using bioassays and species sensitivity distributions to assess herbicide toxicity towards benthic diatoms[END_REF][START_REF] Moisset | Genetic and physiological responses of three freshwater diatoms to realistic diuron exposures[END_REF][START_REF] Roubeix | Variations of periphytic diatom sensitivity to the herbicide diuron and relation to species distribution in a contamination gradient: implications for biomonitoring[END_REF][START_REF] Wood | How benthic diatoms within natural communities respond to eight common herbicides with different modes of action[END_REF].

De nombreuses études ont noté que la modification des profils d'acides gras était un biomarqueur sensible du stress environnemental et chimique chez les organismes aquatiques tels que le zooplancton, les poissons, les crustacés et les diatomées marines [START_REF] Gonçalves | Fatty acid acid profiling reveals seasonal and spatial shifts in zooplankton diet in a temperate estuary[END_REF]Gonçalves et al., 2018a;[START_REF] Maazouzi | Chronic copper exposure and fatty acid composition of the amphipod Dikerogammarus villosus: Results from a field study[END_REF][START_REF] Ramírez | Aquafeed imprint on bogue (Boops boops) populations and the value of fatty acids as indicators of aquacultureecosystem interaction: Are we using them properly?[END_REF][START_REF] Sánchez-Muros | Effects of chemical and handling exposure on fatty acids, oxidative stress and morphological welfare indicators in gilt-head sea bream (Sparus aurata)[END_REF].

Cependant à notre connaissance, aucune étude n'a encore porté sur : Chapitre 1 -Contexte général

Les diatomées a) Définition

Les microalgues sont divisées en plusieurs classes, les Bacillariophycées, les Chlorophycées, les Chlorodendrophycées, les Chrysophycées, etc [START_REF] Guiry | How many species of algae are there?[END_REF].

Les diatomées, appartenant à la classe des Bacillariophycées, correspondent à des microalgues brunes unicellulaires et regroupent plus de 200 000 espèces tous milieux confondus (eaux douces, saumâtres et marines) [START_REF] Damien | La biomasse énergie: Définitions, ressources et modes de transformation[END_REF][START_REF] Guiry | How many species of algae are there?[END_REF].

Ces organismes unicellulaires dont la taille varie de quelques micromètres à plus de 500 µm possèdent une paroi siliceuse, nommée frustule, qui se compose de deux unités imbriquées : l'épivalve (épithèque) et l'hypovalve (hypothèque, qui est de taille plus petite que l'épithèque), reliées par une bande (ou ceinture) : le cingulum (épicingulum et hypocingulum) [START_REF] Round | Diatoms: biology and morphology of the genera[END_REF] (Figure 1). Des questions persistent encore sur le rôle réel du frustule, mais du fait de son architecture, le frustule est extrêmement solide et sa fonction première serait d'assurer une protection externe contre les prédateurs [START_REF] Hamm | Architecture and material properties of diatom shells provide effective mechanical protection[END_REF]. Le frustule est recouvert d'une fine pellicule organique, nommée mucilage, ayant comme fonction l'adhésion éventuelle de la cellule à un substrat ou à d'autres cellules. Celui-ci entre également en jeu dans la mobilité de la cellule [START_REF] Kröger | A new calcium binding glycoprotein family constitutes a major diatom cell wall component[END_REF].

Figure 1 : Schéma du frustule d'une diatomée pennale (Gelabert Alexandre©) Les diatomées sont définies par différentes géométries de leur frustule et sont classées en deux catégories telles que les diatomées pennales ou centrales. La description de ces différentes géométries est réalisée ci-dessous :

1) Les diatomées centrales, à symétrie radiale (Figure 2), sont composées d'un frustule portant des stries, rayonnant depuis un point ou une aréole (n'étant pas obligatoirement disposé au centre de la valve).

2) Les diatomées pennales, à symétrie bilatérale (Figure 3 Les diatomées centrales tendent à être majoritairement planctoniques alors que les diatomées pennales sont recensées de manière plus importante parmi les espèces benthiques [START_REF] Gelabert | Caractérisation physico-chimique des interactions métaux-diatomées[END_REF] c'est-à-dire que celles-ci constituent des colonies accrochées à des supports solides dans le fond des cours d'eau. La production de ces diatomées pennales est souvent plus faible que celle des diatomées planctoniques, de l'ordre de 100 g.m -2 de carbone. Ceci est dû en partie à la forte turbidité de l'eau au niveau des substrats et à l'instabilité de ceux-ci au moment d'événements violents par exemple [START_REF] Hamm | Architecture and material properties of diatom shells provide effective mechanical protection[END_REF].

La géométrie de la diatomée ainsi que l'ornementation du frustule sont utilisées comme critères principaux d'identification [START_REF] Lavoie | Guide d'identification des diatomées des rivières de l'Est du Canada[END_REF] [START_REF] Gelabert | Caractérisation physico-chimique des interactions métaux-diatomées[END_REF]. Les pigments majoritaires des diatomées sont la chlorophylle a et c et des caroténoïdes [START_REF] Roy | Phytoplankton pigments: characterization, chemotaxonomy and applications in oceanography[END_REF].

Enfin, les diatomées peuvent se présenter aussi bien sous forme solitaire, que sous forme de colonie telle que la colonie en zigzag, en ruban, en filament, en éventail et en étoile (Figure 4) [START_REF] Sajjadi | Microalgae lipid and biomass for biofuel production: A comprehensive review on lipid enhancement strategies and their effects on fatty acid composition[END_REF].

b) Métabolisme des diatomées i. La photosynthèse

Les diatomées sont des organismes photo-autotrophes ; à partir de la réduction de dioxyde de carbone et d'une source d'énergie externe, les photons apportés par la lumière, et d'éléments minéraux, celles-ci synthétisent leur propre matière organique : c'est le processus de la photosynthèse [START_REF] Hopkins | Physiologie végétale[END_REF]Karp, 2010;[START_REF] Lance | Respiration et photosynthèse: Histoire et secrets d'une équation[END_REF].

La photosynthèse s'opère dans les chloroplastes de la cellule et plus particulièrement au niveau des membranes thylakoïdales des chloroplastes, nommée membrane thylakoïde (Figure 5).

Cette réaction se déroule en deux étapes :

1) La phase claire correspond à la conversion de l'énergie lumineuse en énergie chimique (le Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate (NADP) et l'Adénosine

TriPhosphate (ATP)) ;

2) La phase sombre correspond à la fixation du carbone (réduction du carbone en glucides).

L'équation globale de la photosynthèse est :

nCO2 + nH2O → (CH2O)n + nO2.

Réaction claire

La réaction claire se déroule comme suit (le PSI, disposant d'une antenne collectrice de photons peut fonctionner indépendamment du PSII) :

1) L'énergie d'excitation, correspondant aux photons apportés par l'énergie lumineuse, est captée par l'antenne collectrice du PSII et transportée jusqu'au centre réactionnel, appelé P680, qui passe à l'état excité : P680* (Figure 5) ;

2) Le P680* transmet un électron à la phéophytine (qui est un pigment) et qui est considérée comme l'accepteur primaire ;

ii. La reproduction des diatomées

Les diatomées ont un cycle de vie assez court, de 3h à 3 jours [START_REF] Baars | Autecological investigations on freshwater diatoms-1. Generation times of some species: Algological Studies/Archiv für Hydrobiologie[END_REF]Morin et al., 2008a) et ont une cinétique de croissance de type exponentiel. Celles-ci possèdent un mode de reproduction spécifique : la reproduction asexuée par bipartition.

Les diatomées alternent phase de reproduction asexuée, qui est la phase majoritaire et privilégiée, et phase de reproduction sexuée [START_REF] Lavoie | Guide d'identification des diatomées des rivières de l'Est du Canada[END_REF]. La multiplication par bipartition est une division cellulaire, et est la méthode de reproduction majoritairement employée par les diatomées. Lors de cette division cellulaire, chaque cellule fille reçoit une des deux thèques de la cellule mère comme épithèque propre et conçoit une nouvelle hypothèque.

Les étapes de cette multiplication par bipartition sont décrites ainsi :

1) Dans un premier lieu, l'hypocingulum (le cingulum est la paroi verticale entourant la valve : Figure 1) est formé pour chacune des deux nouvelles thèques.

2) La division du noyau et du cytoplasme (partie de la cellule qui contient le noyau et divers organites) est réalisée.

3) Les deux hypovalves sont formées.

4) Les deux hypovalves sont silicifiées en 10 à 20 minutes après division.

5) Les frustules sont conçus et les deux cellules se séparent (sauf dans le cas des espèces formant des colonies).

A chaque nouveau cycle de reproduction, une des deux nouvelles cellules filles récupère l'ancienne hypothèque de la cellule mère comme épithèque propre engendrant la diminution de taille d'une des deux cellules filles par rapport à la cellule mère (Figure 6). De ce fait, dans le temps et suite à de nombreuses multiplications, une diminution de la taille d'une partie de la population de diatomées est observée.

Lorsque celles-ci arrivent à leur taille minimale, deux cellules de diatomées débutent un processus de reproduction sexuée permettant de produire à nouveau des cellules de taille normale (Figure 6).

c) Facteurs influençant le développement des diatomées

i. La lumière

Les diatomées sont des organismes photosynthétiques et réagissent directement aux fluctuations de la lumière. La qualité (composition spectrale), la quantité mais également la durée de lumière reçue conditionnent le développement des diatomées [START_REF] Hopkins | Physiologie végétale[END_REF].

Tous les organismes photosynthétiques, et notamment les diatomées, n'utilisent que la lumière visible. La gamme de longueur d'onde de cette lumière s'étend de 400 (violet) à 700 nm (rouge) et correspond aux rayonnements photosynthétiquement actifs (PAR en anglais pour photosynthetically active radiation).

La qualité de l'air, la couverture nuageuse, l'ombrage dû à la présence du couvert végétal et le moment de la journée et de l'année sont des facteurs influençant la qualité et la quantité de la lumière incidente arrivant jusqu'aux eaux de surface [START_REF] Hopkins | Physiologie végétale[END_REF][START_REF] Kirk | Light and photosynthesis in aquatic ecosystems[END_REF].

La quantité de lumière reçue par les diatomées est fonction de la profondeur du milieu ; celleci diminue avec la profondeur en raison de l'absorption de l'énergie lumineuse par les molécules d'eau [START_REF] D D'elbée | Mémento de planctonologie marine[END_REF].

De plus, la pénétration du rayonnement dans l'eau est modulée par les substances chimiques dissoutes et particulaires, et organiques et minérales présentes dans le milieu. En effet, la profondeur de la zone photique (zone euphotique), qui est la zone dans laquelle l'exposition lumineuse est suffisante à la photosynthèse, est conditionnée par les propriétés optiques de ces substances [START_REF] Kirk | Light and photosynthesis in aquatic ecosystems[END_REF]. La zone euphotique correspond à quelques centimètres de profondeur en zone très turbide et à 200 m de profondeur en zone oligotrophe [START_REF] D D'elbée | Mémento de planctonologie marine[END_REF].

Plusieurs études ont montré qu'une variation de ce paramètre environnemental entraînait une modification du développement algal.

Par exemple, il a été observé qu'une intensité trop élevée diminuait le taux de croissance des diatomées alors qu'à plus faible intensité lumineuse la densité de la population réaugmentait [START_REF] Admiraal | Influence of light and temperature on the growth rate of estuarine benthic diatoms in culture[END_REF][START_REF] Admiraal | Influence of seasonal variations of temperature and light on the growth rate of cultures and natural populations of intertidal diatoms[END_REF].

ii. La température

La croissance des diatomées est modulée par la température. En effet, la majorité des réactions biologiques sont catalysées par des enzymes aux optimums thermiques variables. L'amplitude des températures tolérées et l'optimum de croissance sont fonction de l'espèce étudiée [START_REF] Lavoie | Guide d'identification des diatomées des rivières de l'Est du Canada[END_REF][START_REF] Loewe | Combinated effects / Announcement-Implements to the problem[END_REF].

Les diatomées sont fortement présentes dans le milieu aquatique entre 5 et 20 °C [START_REF] Lavoie | Guide d'identification des diatomées des rivières de l'Est du Canada[END_REF]. En raison de ces optimums de température, des concentrations en silice plus élevées en fin d'hiver, et la compétition y étant moindre avec les autres groupes algaux, les diatomées sont retrouvées majoritairement au début du printemps [START_REF] Tilman | Green, bluegreen and diatom algae: taxonomic differences in competitive ability for phosphorus, silicon and nitrogen[END_REF].

De la même manière que pour l'intensité lumineuse, il a été démontré dans plusieurs études qu'une modification de la température modulait le développement des diatomées.

Par exemple, celles-ci ont noté qu'une température trop élevée diminuait le taux de croissance des diatomées alors qu'à plus faible température, la densité de la population réaugmentait [START_REF] Admiraal | Influence of light and temperature on the growth rate of estuarine benthic diatoms in culture[END_REF][START_REF] Admiraal | Influence of seasonal variations of temperature and light on the growth rate of cultures and natural populations of intertidal diatoms[END_REF].

iii. Les sels nutritifs

Outre les conditions favorables de lumière et de température, les diatomées nécessitent un certain nombre de nutriments pour leur croissance tels que l'azote, le phosphore, la silice, des oligo-éléments et des vitamines.

Dans le milieu aquatique, la disponibilité de ces nutriments est contrôlée par divers facteurs comme la localisation, la géologie, la pédologie du site étudié ; par l'anthropisation et également par les saisons et les phénomènes météorologiques [START_REF] Stevenson | Scale-dependent determinants and consequences of benthic algal heterogeneity[END_REF] [START_REF] Coquillé | Influence de la matière organique dissoute naturelle et d'herbicides, seuls et combinés, sur des microalgues marines et d'eau douce[END_REF].

Diverses études ont démontré l'impact de la concentration et de la composition en nutriments sur le développement des diatomées [START_REF] Qiao | Effect of culture conditions on growth, fatty acid composition and DHA/EPA ratio of Phaeodactylum tricornutum[END_REF][START_REF] Valenzuela | Nutrient resupplementation arrests bio-oil accumulation in Phaeodactylum tricornutum[END_REF]

ii. La base des réseaux trophiques aquatiques

Les diatomées sont qualifiées de producteurs primaires du fait de leur propre production de matière organique à partir de matière inorganique. Elles sont à la base des réseaux trophiques et participent au développement des organismes hétérotrophes. Ces derniers consomment de la matière organique (dont les diatomées) du fait de leur incapacité à synthétiser leur propre matière organique à partir de sources inorganiques [START_REF] Amblard | Ecologie microbienne en milieu aquatique: des virus aux protozoaires[END_REF][START_REF] Mostajir | Les réseaux trophiques microbiens des milieux aquatiques et terrestres[END_REF].

e) Les diatomées : organismes bioindicateurs

En raison de leur sensibilité spécifique à la pollution et de leur cosmopolitisme dans les écosystèmes aquatiques, les diatomées représentent de bons indicateurs de la qualité des eaux [START_REF] Round | Diatoms: biology and morphology of the genera[END_REF].

En effet, les diatomées, qui sont des organismes ubiquistes, possèdent un temps de génération court et suivant les espèces étudiées présentent des preferenda environnementaux et des sensibilités aux toxiques variés [START_REF] Kim-Tiam | Effets de mélanges de pesticides sur les biofilms périphytiques d'eau douce[END_REF].

Les assemblages algaux formés par les diatomées benthiques sont composées de dizaines d'espèces différentes ayant chacune ses propres tolérances aux conditions du milieu. Sur la base des préférences de chacune et les proportions relatives de celles-ci dans un écosystème aquatique donné, il est alors possible de déterminer le niveau de pollution du milieu ou de détecter des changements environnementaux [START_REF] Dixit | Diatoms: powerful indicators of environmental change[END_REF].

Parallèlement aux mesures physico-chimiques, ces caractéristiques ont donc conduit à l'utilisation des diatomées dans plusieurs indices rendant compte de la qualité générale des eaux comme par exemple l'Indice Biologique Diatomées [START_REF] Coste | Improvements of the Biological Diatom Index (BDI): Description and efficiency of the new version (BDI-2006)[END_REF]. Malheureusement, ces indices ne sont pas adaptés pour la détection des impacts de la pollution toxique des eaux [START_REF] Kim Tiam | Morphological, physiological and molecular responses of Nitzschia palea under cadmium stress[END_REF][START_REF] Lavoie | Diatom teratologies as biomarkers of contamination: Are all deformities ecologically meaningful?[END_REF].

Diverses études ont démontré le potentiel des diatomées dans l'évaluation des pollutions toxiques, notamment dans le cas des contaminations par les pesticides [START_REF] Coquillé | Influence de la matière organique dissoute naturelle et d'herbicides, seuls et combinés, sur des microalgues marines et d'eau douce[END_REF][START_REF] Coquillé | Use of diatom motility features as endpoints of metolachlor toxicity[END_REF][START_REF] Debenest | Effects of Pesticides on Freshwater Diatoms[END_REF][START_REF] Delorenzo | Toxicity of pesticides to aquatic microorganisms: A review[END_REF][START_REF] Larras | The effect of temperature and a herbicide mixture on freshwater periphytic algae[END_REF][START_REF] Moisset | Genetic and physiological responses of three freshwater diatoms to realistic diuron exposures[END_REF][START_REF] Morin | Linking diatom community structure to pesticide input as evaluated through a spatial contamination potential (Phytopixal): a case study in the Neste river system (South-West France)[END_REF].

Récemment, le potentiel des acides gras des diatomées dans l'évaluation de la pollution des milieux aquatiques a été suggéré [START_REF] Filimonova | Effects of a herbicide and copper mixture on the quality of marine plankton[END_REF]Filimonova et al., 2016b;Filimonova et al., 2016c;[START_REF] Gonçalves | Fatty Acids' Profiles of Aquatic Organisms: Revealing the Impacts of Environmental and Anthropogenic Stressors, Fatty Acids[END_REF][START_REF] Robert | Metolachlor-mediated selection of a microalgal strain producing novel polyunsaturated fatty acids[END_REF].

Les acides gras a) Terminologie

Un acide gras est un acide carboxylique à longue chaîne carbonée (de 4 à 36 carbones). Cette chaîne peut être saturée ou non (Figure 7).

Pour préciser la longueur et le nombre de doubles liaisons d'un acide gras, les notations utilisées sont les suivantes [START_REF] Lehninger | [END_REF] : Le nombre de carbones d'un acide gras est déterminé par l'action de l'enzyme élongase et de l'enzyme acide gras synthase (FAS: fatty acid synthase), qui allonge les chaines d'acides gras par l'ajout de deux atomes de carbone à la fin de l'acide carboxylique.

X : Y (∆ a
La position de la double liaison est quant à elle déterminée par l'activité de l'enzyme désaturase qui introduit les doubles liaisons dans les acides gras, dont la position est indiquée dans la notation Δ(position)-désaturase [START_REF] Gonçalves | Fatty Acids' Profiles of Aquatic Organisms: Revealing the Impacts of Environmental and Anthropogenic Stressors, Fatty Acids[END_REF].

La longueur de la chaîne carbonée et le degré d'insaturation jouent un rôle important dans les propriétés physico-chimiques des acides gras. Par exemple, leur solubilité dans l'eau diminue quand la chaîne carbonée est plus longue et/ou quand le nombre de doubles liaisons diminue [START_REF] Lehninger | [END_REF]. [START_REF] Saito | Characteristics of lipid and fatty acid of marine gastropod Turbo cornutus: high levels of arachidonic and n-3 docosapentaenoic acid[END_REF].

b) Les différentes classes d'acides gras

Les PUFA et HUFA sont surtout présents dans les lipides membranaires intervenant dans la structure des membranes biologiques, tels que les lipides des membranes des thylakoïdes [START_REF] Gonçalves | Fatty Acids' Profiles of Aquatic Organisms: Revealing the Impacts of Environmental and Anthropogenic Stressors, Fatty Acids[END_REF]Li et al., 2014b).

Par exemple, il a été démontré que les acides gras PUFA assurent la fluidité membranaire dans la cellule : en raison de leur géométrie (présence de doubles liaisons carbone-carbone), ces acides gras faiblement condensés augmentent la fluidité de la membrane [START_REF] Sharma | High lipid induction in microalgae for biodiesel production[END_REF].

A faible température, il a été observé qu'en réponse à une diminution de la fluidité membranaire, une adaptation avait lieu par une production accrue d'acides gras insaturés [START_REF] Thompson | Lipids and membrane function in green algae[END_REF].

Quant à eux, les SFA et MUFA sont en proportion importante dans les lipides neutres, jouant un rôle important dans le stockage énergétique [START_REF] Abida | Membrane glycerolipid remodeling triggered by nitrogen and phosphorus starvation in Phaeodactylum tricornutum[END_REF][START_REF] Gonçalves | Fatty Acids' Profiles of Aquatic Organisms: Revealing the Impacts of Environmental and Anthropogenic Stressors, Fatty Acids[END_REF]Li et al., 2014b).

c) Synthèse des acides gras

La biosynthèse des acides gras polyinsaturés dans les cellules eucaryotes implique des étapes consécutives de désaturation et d'allongement de l'acide gras initial, catalysées par un ensemble de désaturases et d'élongases [START_REF] Venegas-Calerón | An alternative to fish oils: metabolic engineering of oil-seed crops to produce omega-3 long chain polyunsaturated fatty acids[END_REF][START_REF] Wallis | Polyunsaturated fatty acid synthesis: what will they think of next?[END_REF].

Les élongases sont des enzymes localisées au niveau du réticulum endoplasmique et des mitochondries, et sont nécessaire à l'allongement des acides gras à 16, 18 et 20 carbones.

Chez les organismes photosynthétiques, et notamment les diatomées, la biosynthèse débute par la production de novo de l'acide palmitique saturé 16:0 ou l'acide stéarique saturé 18:0 (tandis que les cellules animales ont besoin de l'acide gras essentiel acide α-linoléique 18:3 (ALA) en tant que précurseur de la voie) [START_REF] Cook | Enhancing LC-PUFA production in Thalassiosira pseudonana by overexpressing the endogenous fatty acid elongase genes[END_REF].

Les étapes de la biosynthèse de l'acide palmitique 16:0 sont décrites ci-dessous :

1) Celle-ci débute par la formation de malonyl-CoA par carboxylation de l'acétyl-CoA (annexe 1).

2) La malonyl-CoA est condensée avec l'acétyl-CoA et réagit avec l'enzyme acide gras synthase (en anglais FAS : fatty acid synthase) pour former après libération de CO2 une chaîne acyle à deux carbones (groupe acyle saturé) (annexe 2).

3) L'étape précédente est réalisée 8 fois jusqu'à l'obtention d'une chaîne à 16 carbones, l'acide palmitique 16:0 (annexe 3) [START_REF] Lehninger | [END_REF].

Une fois l'acide palmitique synthétisé, celui-ci est modifié par une série d'élongations et de désaturations produisant divers types d'acides gras insaturés (Figure 8) [START_REF] Kelly | Fatty acids as dietary tracers in benthic food webs[END_REF].

Une voie de synthèse caractéristique des diatomées est celle où l'acide gras 16:0 est désaturé en 16:1n7, puis désaturé en 16:4n1. Ces deux acides gras sont couramment utilisés comme indicateurs du groupe des diatomées [START_REF] Dalsgaard | Fatty acid trophic markers in the pelagic marine environment[END_REF].

La conversion du 18:1n9 au 18:2n6 et 18:3n3 nécessite les enzymes désaturases Δ12 et Δ15 retrouvées seulement chez les producteurs primaires. Ces deux PUFA sont nommés acides gras « essentiels », car les animaux doivent les obtenir dans leur régime alimentaire plutôt que de les synthétiser via d'autres acides gras [START_REF] Dalsgaard | Fatty acid trophic markers in the pelagic marine environment[END_REF]. A la suite d'allongements supplémentaires et de désaturations des acides gras 18:2n6 et 18:3n3, d'autres acides gras PUFA, sont formés tels que le 20:4n6, 20:5n3 et 22:6n3 [START_REF] Gurr | Lipid biochemistry[END_REF].

Les organismes tels que les microalgues Euglena gracilis ou Isochrysis galbana contiennent des gènes qui codent pour la ∆9-élongase et la ∆8-désaturase et utilisent la voie dans laquelle l'enzyme élongase elo9 allonge le 18:3n3 pour générer une chaîne 20:3, puis l'enzyme désaturase des8 ajoute la double liaison pour former le 20:4 [START_REF] Cook | Enhancing LC-PUFA production in Thalassiosira pseudonana by overexpressing the endogenous fatty acid elongase genes[END_REF].

d) Localisation des acides gras dans la cellule : les lipides

La composition biochimique des diatomées est représentée par quatre classes de molécules : les protéines, les sucres, les acides nucléiques et les lipides.

Les lipides, composés notamment d'acides gras, constituent un groupe de composés chimiquement diversifiés, dont le trait commun et déterminant est leur insolubilité dans l'eau [START_REF] Lehninger | [END_REF].

Ceux-ci possèdent une variété de rôles dans la cellule mais représentent la principale forme de réserve énergétique. En effet, la classe de molécules la plus riche en énergie est celle des lipides (37,6 kJ.g -1 ), suivi de celle des protéines (16,7 kJ.g -1 ) et celle des sucres (15,7 kJ.g -1 ) [START_REF] Sajjadi | Microalgae lipid and biomass for biofuel production: A comprehensive review on lipid enhancement strategies and their effects on fatty acid composition[END_REF].

Les lipides sont également les constituants majeurs des membranes biologiques. Ces membranes sont constituées d'une bicouche lipidique et protègent la cellule de l'entrée de molécules polaires ou d'ions dans la cellule [START_REF] Lehninger | [END_REF].

Les lipides peuvent être classés en deux catégories :

1) les lipides polaires jouant un rôle dans la structure de la membrane de la cellule (Figure 9) ;

2) les lipides non polaires, appelés lipides neutres, jouant un rôle dans la réserve d'énergie métabolique (Figure 9) [START_REF] Sharma | High lipid induction in microalgae for biodiesel production[END_REF].

Il est intéressant de noter que le taux dans la cellule de ces deux types de lipides varie suivant les stades de croissance des diatomées [START_REF] Sajjadi | Microalgae lipid and biomass for biofuel production: A comprehensive review on lipid enhancement strategies and their effects on fatty acid composition[END_REF] ; très peu de lipides non polaires sont accumulés dans la cellule durant la période exponentielle de croissance mais plutôt lors de la phase stationnaire [START_REF] Berge | Reassessment of lipid composition of the diatom[END_REF][START_REF] Brown | Effects of harvest stage and light on the biochemical composition of the diatom Thalassiosira pseudonana[END_REF][START_REF] Tonon | Long chain polyunsaturated fatty acid production and partitioning to triacylglycerols in four microalgae[END_REF].

i. Lipides polaires

Les membranes biologiques sont composées de lipides polaires. Les lipides composant ces membranes présentent une partie hydrophile, polaire et une partie hydrophobe, apolaire.

Les trois classes de lipides membranaires sont :

1) les phospholipides ;

2) les glycolipides ;

3) et les éthers lipides ; Deux de ces trois classes sont présentées sur la Figure 9 et sont retrouvées chez les diatomées.

Parmi ces trois classes il est possible de dénombrer cinq types de lipides membranaires : les glycérophospholipides, les galactolipides et sulfolipides, les tétraétherlipides, les sphingolipides [START_REF] Lehninger | [END_REF]. Leur structure chimique est décrite ci-dessous :

1) Les glycérophospholipides sont composés d'une partie hydrophobe représentée par deux acides gras liés au glycérol (qui est la partie hydrophile) lui-même relié à une molécule de phosphate et d'un alcool aminé (sérine, choline…) ;

2) Les galactolipides et les sulfolipides contiennent également deux acides gras liés au glycérol mais sont dépourvus du phosphate caractéristique des phospholipides ;

3) Les tétraétherlipides sont composés de deux très longues chaînes alkyles reliées aux deux extrémités par un éther au glycérol ;

4) Les sphingolipides sont composés d'un acide gras associé à une amine grasse, la sphingosine [START_REF] Lehninger | [END_REF].

Chez les diatomées, les lipides constitutifs des membranes sont les phospholipides et les galactolipides. Les phospholipides sont importants dans la structure des membranes cellulaires du fait de leur rôle de barrières perméables [START_REF] Sharma | High lipid induction in microalgae for biodiesel production[END_REF]. 10). Ces lipides sont indispensables à la photosynthèse [START_REF] Mizusawa | The role of lipids in photosystem II[END_REF].

ii. Lipides non polaires, neutres

Les lipides non polaires, ou lipides neutres, jouent un rôle clé dans le stockage d'énergie métabolique.

Ces lipides sont représentés par des triglycérides ou triacylglycérols (TAG), des diglycérides (DAG), des monoglycérides (MAG), des acides gras libres (FFA = Free Fatty Acids) et des pigments [START_REF] Sajjadi | Microalgae lipid and biomass for biofuel production: A comprehensive review on lipid enhancement strategies and their effects on fatty acid composition[END_REF].

Les TAG sont composés de trois acides gras reliés chacun à un même glycérol par une liaison ester. Naturellement, les triacylglycérols sont mélangés ; ils sont composés de deux ou plusieurs acides gras différents. Dans le but de les nommer sans ambiguïté, il est nécessaire de spécifier le nom et la position de chaque acide gras [START_REF] Lehninger | [END_REF]) (Figure 11).

Chez les diatomées ces TAG sont stockés de différentes manières suivant l'espèce étudiée mais également suivant la phase de croissance de l'organisme et des paramètres environnementaux [START_REF] Sajjadi | Microalgae lipid and biomass for biofuel production: A comprehensive review on lipid enhancement strategies and their effects on fatty acid composition[END_REF]. Ceux-ci peuvent représenter jusqu'à 80 % de la composition en lipides et 25 % de leur biomasse [START_REF] Zulu | Current trends to comprehend lipid metabolism in diatoms[END_REF]. et al., 2004).

e) Acides gras majoritaires chez les diatomées

La composition en acides gras des diatomées est caractérisée par une abondance en acides gras à 14, 16 et 20 carbones, notamment les acides gras 14:0, 16:0, 16:1n7 et 20:5n3 (acide eicosapentaénoïque : EPA) [START_REF] Taipale | Fatty acid composition as biomarkers of freshwater microalgae: analysis of 37 strains of microalgae in 22 genera and in seven classes[END_REF]. Il a été démontré dans une étude que les quatre acides gras cités précédemment représentaient entre 62 et 70 % de la composition totale en acides gras [START_REF] Volkman | Fatty acid and lipid composition of 10 species of microalgae used in mariculture[END_REF].

Parmi ces quatre acides gras majoritaires, l'EPA est un acide gras oméga-3 (acide gras essentiel) et est présent en forte proportion chez les diatomées mais n'est pas présent chez d'autres classes de microalgues comme les chlorophycées par exemple [START_REF] Hu | Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances[END_REF].

En dehors des acides gras majoritaires des diatomées,

f) Importance des acides gras des diatomées dans le réseau trophique

Les acides gras représentent un des groupes les plus importants de molécules transférées de la plante à l'animal (Filimonova et al. 2016). Les acides gras essentiels tels que l'EPA ou l'acide docosahexaénoïque (DHA) ne peuvent être synthétisés de novo par les animaux ou en proportion trop faible pour le bon fonctionnement de l'organisme, d'où leur importance dans le transfert trophique. Ils sont synthétisés par les microalgues et s'accumulent le long de la chaîne trophique (Filimonova et al., 2016b;[START_REF] Gonçalves | Fatty Acids' Profiles of Aquatic Organisms: Revealing the Impacts of Environmental and Anthropogenic Stressors, Fatty Acids[END_REF]. [START_REF] Brett | The role of highly unsaturated fatty acids in aquatic foodweb processes[END_REF][START_REF] Taipale | Fatty acid composition as biomarkers of freshwater microalgae: analysis of 37 strains of microalgae in 22 genera and in seven classes[END_REF].

Cependant, une variation des proportions en acides gras chez les diatomées en condition de stress est susceptible de modifier la qualité nutritive de ces organismes et donc d'impacter tout le réseau trophique.

g) Variabilité de la composition en acides gras

Il a été observé que les composés lipidiques étaient très sensibles aux facteurs environnementaux de stress [START_REF] Gonçalves | Fatty acid acid profiling reveals seasonal and spatial shifts in zooplankton diet in a temperate estuary[END_REF][START_REF] Saito | Characteristics of lipid and fatty acid of marine gastropod Turbo cornutus: high levels of arachidonic and n-3 docosapentaenoic acid[END_REF].

En effet, lors de conditions environnementales défavorables ou de stress, certaines microalgues sont capables de modifier leurs voies de biosynthèse lipidique vers la formation et l'accumulation de lipides neutres, principalement sous forme de TAG, permettant aux microalgues de supporter les effets de ces conditions défavorables [START_REF] Sharma | High lipid induction in microalgae for biodiesel production[END_REF].

Par ailleurs, plusieurs études ont montré que la composition lipidique et notamment la composition en acides gras, pouvait être utilisée comme bioindicateur d'un stress ou biomarqueur d'une contamination (Filimonova et al., 2016b;[START_REF] Taipale | Fatty acid composition as biomarkers of freshwater microalgae: analysis of 37 strains of microalgae in 22 genera and in seven classes[END_REF].

Certains facteurs biotiques et abiotiques, primordiaux pour l'étude en conditions contrôlées et modulant la composition en acides gras sont décrits ci-dessous.

i. Stade de croissance

Il a été constaté que le profil d'acides gras des diatomées était modulé suivant le stade de croissance de l'organisme [START_REF] Boelen | Growth phase significantly decreases the DHA-to-EPA ratio in marine microalgae[END_REF][START_REF] Brown | Effects of harvest stage and light on the biochemical composition of the diatom Thalassiosira pseudonana[END_REF][START_REF] Huerlimann | Effects of growth phase and nitrogen starvation on expression of fatty acid desaturases and fatty acid composition of Isochrysis aff[END_REF]Ying et al., 2002). Li et al. (2014b) ont noté cette variabilité avec l'accumulation de lipides neutres riches en SFA (14:0, 16:0) et MUFA (16:1) pendant la phase de croissance stationnaire. Ces types de lipides sont utilisés pour stocker l'excès de carbone accumulé pendant la photosynthèse. Les composés de structure étant nécessaires à la croissance, l'accumulation de lipides neutres a diminué durant la phase de croissance exponentielle. Enfin, la proportion de PUFA et de HUFA, qui sont des acides gras des lipides membranaires et composants structurels, sont augmenté au cours de la phase de croissance exponentielle (Kates and Volcani, 1966a).

Par exemple, chez la diatomée marine Thalassiosira pseudonana une augmentation des SFA et des MUFA a été observée ainsi qu'une diminution des PUFA entre la phase exponentielle et stationnaire [START_REF] Brown | Effects of harvest stage and light on the biochemical composition of the diatom Thalassiosira pseudonana[END_REF].

ii. Variabilité interspécifique

Les profils d'acides gras des diatomées se distinguent clairement de ceux des autres groupes de microalgues :

1) les diatomées ont des teneurs plus élevées de 16:2n4, 16:3n4 et 16:4n1 que celles des autres groupes de microalgues [START_REF] Ying | Total lipid and fatty acid composition of eight strains of marine diatoms[END_REF] ;

2) presque toutes les diatomées contiennent des proportions élevées d'acides gras 14:0, 16:0, 16:1n7 et 20:5n3 ;

3) les PUFA et les HUFA à 18 et 22 atomes de carbones sont des constituants mineurs par rapport aux autres microalgues [START_REF] Volkman | Fatty acid and lipid composition of 10 species of microalgae used in mariculture[END_REF].

De nombreuses études ont montré des différences de profils d'acides gras entre des espèces de diatomées [START_REF] Boelen | On the potential application of polar and temperate marine microalgae for EPA and DHA production[END_REF][START_REF] Dunstan | Essential polyunsaturated fatty acids from 14 species of diatom (Bacillariophyceae)[END_REF][START_REF] Pratoomyot | Fatty acids composition of 10 microalgal species[END_REF][START_REF] Ying | Total lipid and fatty acid composition of eight strains of marine diatoms[END_REF] et dans les teneurs en EPA et DHA entre et au sein des classes d'algues [START_REF] Brown | Effects of harvest stage and light on the biochemical composition of the diatom Thalassiosira pseudonana[END_REF][START_REF] Guschina | Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae[END_REF][START_REF] Lv | Variations in lipid yields and compositions of marine microalgae during cell growth and respiration, and within intracellular structures[END_REF]. [START_REF] Dunstan | Essential polyunsaturated fatty acids from 14 species of diatom (Bacillariophyceae)[END_REF] ont observé différents profils d'acides gras selon les espèces de diatomées considérées, en particulier avec l'espèce

Fragilaria pinnata dont les teneurs plus faibles en 22:5n6 et de DHA que les autres espèces étudiées.

iii. Température

La température s'est révélée avoir un effet majeur sur la composition en acides gras des microalgues [START_REF] Guschina | Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae[END_REF][START_REF] Morgan-Kiss | Adaptation and acclimation of photosynthetic microorganisms to permanently cold environments[END_REF]. L'augmentation des acides gras insaturés en parallèle de la baisse de la température et l'augmentation des acides gras saturés avec l'augmentation de la température a été observée chez de nombreuses microalgues et cyanobactéries [START_REF] Lynch | Low temperature-induced alterations in the chloroplast and microsomal membranes of Dunaliella salina[END_REF][START_REF] Murata | Relationships between the transition of the physical phase of membrane lipids and photosynthetic parameters in Anacystis nidulans and lettuce and spinach chloroplasts[END_REF][START_REF] Renaud | Effect of temperature on growth, chemical composition and fatty acid composition of tropical Australian microalgae grown in batch cultures[END_REF][START_REF] Sato | Temperature shift-induced responses in lipids in the blue-green alga, Anabaena variabilis: the central role of diacylmonogalactosylglycerol in thermoadaptation[END_REF].

Dû à leur géométrie, les acides gras insaturés, composés alors de doubles liaisons carbonecarbone, ne peuvent pas être aussi compactés que les acides gras saturés ; augmentant ainsi la fluidité des membranes. Au vu de la diminution de la fluidité membranaire à des températures plus basses, une augmentation des acides gras insaturés permet donc une adaptation de la cellule à cette modification [START_REF] Sharma | High lipid induction in microalgae for biodiesel production[END_REF].

Par exemple, chez Chlorella vulgaris et Botryococcus braunii, l'augmentation de la température entraîne une diminution de la teneur relative en acides gras insaturés [START_REF] Sushchik | A temperature dependence of the intra-and extracellular fatty-acid composition of green algae and cyanobacterium[END_REF].

iv. Intensité lumineuse

La lumière, l'un des facteurs environnementaux les plus importants des écosystèmes aquatiques, module la croissance et l'accumulation des acides gras dans les microalgues.

En règle générale, une faible intensité lumineuse induit la formation des lipides polaires, en particulier les lipides polaires membranaires associés aux chloroplastes, tandis qu'une intensité de lumière élevée diminue la teneur totale en lipides polaires avec une augmentation simultanée de la quantité des lipides de stockage (neutres) et principalement les TAG [START_REF] Brown | Effects of harvest stage and light on the biochemical composition of the diatom Thalassiosira pseudonana[END_REF][START_REF] Khotimchenko | Lipid composition of the red alga Tichocarpus crinitus exposed to different levels of photon irradiance[END_REF][START_REF] Napolitano | Changes in Periphyton Fatty Acid Composition in Chlorine-Polluted Streams[END_REF][START_REF] Orcutt | Effect of light intensity upon lipid composition of Nitzschia closterium (Cylindrotheca fusiformis)[END_REF]. Une exposition élevée à la lumière diminue la teneur totale en phospholipides et augmente le niveau de lipides non polaires (à savoir TAG) dans l'algue verte filamenteuse Cladophora sp. [START_REF] Napolitano | Changes in Periphyton Fatty Acid Composition in Chlorine-Polluted Streams[END_REF].

La production de TAG dans des conditions de luminosité élevée pourrait être un mécanisme de protection de la cellule. Dans des conditions de forte luminosité, la quantité d'accepteurs d'électrons nécessaires à la photosynthèse peut être appauvrie et l'augmentation de la synthèse des acides gras (stockés sous forme de TAG) aide potentiellement la cellule à recréer son taux d'accepteurs d'électrons [START_REF] Sharma | High lipid induction in microalgae for biodiesel production[END_REF].

v. Concentrations en nutriments

La disponibilité des nutriments a un impact significatif sur la croissance des microalgues mais aussi sur leur composition lipidique et en acides gras.

En condition de stress environnemental, lorsque les teneurs en nutriments sont limitées, une baisse du taux de division cellulaire est remarquée. Étonnamment, la biosynthèse des acides gras est maintenue chez certaines espèces d'algues à condition que les quantités de lumière et de CO2 disponibles pour la photosynthèse soient suffisantes [START_REF] Thompson | Lipids and membrane function in green algae[END_REF].

Lorsque la croissance des algues ralentit, la synthèse de nouveaux composés membranaires n'est pas nécessaire augmentant ainsi la proportion des TAG dans la cellule. Dans ces conditions, la production de TAG pourrait servir de mécanisme de protection. [START_REF] Hu | Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances[END_REF][START_REF] Thompson | Lipids and membrane function in green algae[END_REF].

Par exemple, lorsque la culture de diatomée Stephanodiscus minutulus a été cultivée avec des teneurs en silice, azote et phosphore faibles, une augmentation de l'accumulation de TAG et une diminution des lipides polaires ont été constatées [START_REF] Lynn | Effect of nutrient availability on the biochemical and elemental stoichiometry in the freshwater diatom Stephanodiscus minutulus (Bacillariophyceae)[END_REF]. Chez l'algue verte

Chlamydomonas moewusii, une limitation en nutriments entraîne une diminution des teneurs en PUFA 16:3, 16:4 et 18:3 alors que les acides gras 16:1 et 18:1 sont augmentés [START_REF] Arisz | Polar glycerolipids of Chlamydomonas moewusii[END_REF].

vi. Contamination aux pesticides

Une contamination des eaux par les pesticides peut induire une modification dans le profil des acides gras des diatomées [START_REF] De Hoop | Modeling toxic stress by atrazine in a marine consumer-resource system[END_REF][START_REF] Filimonova | Effects of a herbicide and copper mixture on the quality of marine plankton[END_REF][START_REF] Gonçalves | Fatty Acids' Profiles of Aquatic Organisms: Revealing the Impacts of Environmental and Anthropogenic Stressors, Fatty Acids[END_REF][START_REF] Neves | Biochemical and populational responses of an aquatic bioindicator species, Daphnia longispina, to a commercial formulation of a herbicide (Primextra® Gold TZ) and its active ingredient (S-metolachlor)[END_REF][START_REF] Robert | Metolachlor-mediated selection of a microalgal strain producing novel polyunsaturated fatty acids[END_REF][START_REF] Trenkamp | Specific and differential inhibition of verylong-chain fatty acid elongases from Arabidopsis thaliana by different herbicides[END_REF]. Robert et al. ont démontré en 2007 que la diatomée Melosira moniliformis exposée au métolachlore racémique, qui est un herbicide inhibiteur de l'élongation des acides gras et plus particulièrement des acides gras à très longues chaînes, montrait une diminution en acides gras saturés (14:0, 16:0 et 18:0) et en acide gras essentiel EPA, tandis qu'une augmentation de l'acide gras monoinsaturé 16:1 et des acides gras polyinsaturés à 16 et 18 carbones ont été observés [START_REF] Robert | Metolachlor-mediated selection of a microalgal strain producing novel polyunsaturated fatty acids[END_REF]. De la même manière, une étude du profil d'acides gras de la diatomée marine Thalassiosira weissflogii a montré qu'une exposition au mélange commercial Primextra® (mélange de terbuthylazine et de métolachlore) induit une diminution des HUFA et notamment une diminution des acides gras essentiels (Filimonova et al., 2016b).

Les pesticides a) Définition

Un pesticide (de l'anglais "pest" signifiant nuisible et du latin "caedere" signifiant frapper, abattre, tuer) est une substance (ou mélange de substances) chimique ayant comme fonction de repousser, contrôler ou détruire tout organisme considéré comme nuisible [START_REF] Fao | International code of conduct on the distribution and use of pesticides[END_REF].

Un pesticide est constitué d'une ou plusieurs substances actives (molécules qui sont recherchées dans l'environnement), d'adjuvants pour faciliter ou accélérer l'action toxique des substances actives sur les organismes ciblés et d'un diluant généralement inerte [START_REF] Lipok | The toxicity of Roundup® 360 SL formulation and its main constituents: glyphosate and isopropylamine towards non-target water photoautotrophs[END_REF].

Il existe deux grandes classifications de pesticides ; ces substances peuvent être regroupées par famille chimique ou par cible.

1) La classification en famille regroupe des composés ayant des groupements fonctionnels identiques. Il est alors possible de noter parmi les grandes familles chimiques les organophosphorés, les organochlorés, les carbamates et thiocarbamates et les pyréthroïdes de synthèse.

2) La classification par cible se présente en trois catégories principales : les herbicides, les fongicides et les insecticides. Il est possible de noter la présence d'autres catégories comme les rodonticides, les nématicides, les molluscicides ou les corvicides (Tableau 2).

Tableau 2 : Classes de pesticides et leurs cibles associées. Les classes soulignées représentent les trois catégories principales de pesticides retrouvées.

Classe de pesticide Cible

Herbicides

Mauvaises herbes

Fongicides Champignons

Insecticides Insectes

Rodonticides Rongeurs

Nématicides Nématodes

Molluscicides

Limaces, escargots

Corvicides

Corbeaux

b) Sources et état des lieux de la contamination aquatique en France

En France, environ 95 % de la consommation en pesticides concernent des usages agricoles (d'après l'union des entreprises pour la protection des jardins et des espaces publics (UPJ)).

Ainsi 5 % de la consommation en pesticides correspond à des usages non agricoles tels que l'entretien des espaces publics et de la voirie, le jardinage et les campagnes de luttes contre les insectes nuisibles. Malgré ce faible pourcentage, ces derniers usages peuvent engendrer jusqu'à 50 % de la contamination aquatique en pesticides, du fait des taux de transfert plus élevés (surfaces urbaines imperméabilisées, transfert direct vers les eaux de surface, faible dégradation biologique).

Par exemple, [START_REF] Blanchoud | Contribution by urban and agricultural pesticide uses to water contamination at the scale of the Marne watershed[END_REF] ont noté que malgré des quantités appliquées cent fois plus faibles les usages non agricoles sur le bassin versant de la Marne participaient de manière similaire aux usages agricoles à la contamination de la rivière en pesticides [START_REF] Blanchoud | Contribution by urban and agricultural pesticide uses to water contamination at the scale of the Marne watershed[END_REF].

Concernant les sources de pollution, il est possible de distinguer les contaminations ponctuelles et les contaminations diffuses.

1) Les contaminations ponctuelles sont majoritairement accidentelles ou dues à des « bonnes pratiques phytosanitaires » non respectées. Ces rejets peuvent se présenter de manière chronique mais sont de plus en plus rares et localisés grâce à la création de circuits de récupération des résidus de pesticides [START_REF] Aubertot | Pesticides, agriculture et environnement. Réduire l'utilisation des pesticides et en limiter les impacts environnementaux[END_REF].

En 2014 les dix pesticides les plus quantifiés sont retrouvés dans 60 % des cours d'eau contaminés et se présentent tous comme des herbicides à savoir : l'AMPA (acide aminométhylphosphonique), la déséthyl atrazine, le glyphosate, le métolachlore, le 2-hydroxy atrazine, l'isoproturon, l'atrazine, le diflufénicanil, la DEDIA (déséthyldéisopropylatrazine) et la bentazone.

c) Facteurs de transfert des pesticides dans l'environnement aquatique

Les facteurs présentés ci-dessous influencent le type de composés chimiques retrouvés dans le milieu aquatique ainsi que leurs concentrations.

1) Des propriétés intrinsèques des composés : leur caractère dégradable (temps de demivie) et leur caractère dispersif (processus de sorption/désorption, volatilité, caractère hydrophile) [START_REF] Alix | Devenir et transfert des pesticides dans l'environnement et impacts biologiques: Pesticides, agriculture et environnement[END_REF][START_REF] Aubertot | Pesticides, agriculture et environnement. Réduire l'utilisation des pesticides et en limiter les impacts environnementaux[END_REF][START_REF] Gao | Environmental fate and transport of pesticides: Pesticides-evaluation of environmental pollution[END_REF][START_REF] Lundberg | Pesticides et eaux de surface : Etude sur la situation concernant la pollution des eaux de surface par des résidus de pesticides dans les pays nordiques, en Allemagne et aux Pays-Bas, et les problèmes associés à la contamination par des pesticides[END_REF] ;

2) Du mode d'application : un composé dispersé par voie aérienne, sous forme de granulés ou de peinture (antifouling) est plus facilement susceptible de contaminer le milieu aquatique qu'un composé injecté [START_REF] Aubertot | Pesticides, agriculture et environnement. Réduire l'utilisation des pesticides et en limiter les impacts environnementaux[END_REF][START_REF] Van Der Werf | Evaluer l'impact des pesticides sur l'environnement[END_REF] ;

3) Des conditions climatiques lors de l'application et après celle-ci : la présence de vent fort, de brouillard, de pluie, ou de très fortes températures augmente la dispersion des pesticides. Après l'application, les conditions météorologiques affectent le transport des composés chimiques dans l'environnement aquatique par des phénomènes de volatilisation, drainage, ruissellement, lessivage des sols, lixiviation, érosion des sols [START_REF] Aubertot | Pesticides, agriculture et environnement. Réduire l'utilisation des pesticides et en limiter les impacts environnementaux[END_REF][START_REF] Van Der Werf | Evaluer l'impact des pesticides sur l'environnement[END_REF] ; 4) De la fragilité du milieu : la nature du sol (caractéristiques géologiques et pédologiques), sa pente, les systèmes de culture [START_REF] Alix | Devenir et transfert des pesticides dans l'environnement et impacts biologiques: Pesticides, agriculture et environnement[END_REF][START_REF] Aubertot | Pesticides, agriculture et environnement. Réduire l'utilisation des pesticides et en limiter les impacts environnementaux[END_REF][START_REF] Gao | Environmental fate and transport of pesticides: Pesticides-evaluation of environmental pollution[END_REF][START_REF] Van Der Werf | Evaluer l'impact des pesticides sur l'environnement[END_REF].

5) De la structuration du paysage : la présence de zones d'habitation, de zone tampons, de champs agricoles, de communautés urbaines, le type de cours d'eau concerné [START_REF] Alix | Devenir et transfert des pesticides dans l'environnement et impacts biologiques: Pesticides, agriculture et environnement[END_REF].

d) Toxicité des pesticides

Une fois dans l'environnement, les substances actives des pesticides sont dissociées des adjuvants, et peuvent présenter une toxicité moindre par rapport au produit en formulation commerciale [START_REF] Lipok | The toxicity of Roundup® 360 SL formulation and its main constituents: glyphosate and isopropylamine towards non-target water photoautotrophs[END_REF]. Cependant, la toxicité des substances actives demeure et provoque des effets nocifs et indésirables sur les écosystèmes.

i. Mode d'action des pesticides

Les pesticides sont conçus pour provoquer des effets toxiques sur des organismes vivants cibles et suivant leurs catégories leurs effets ne sont pas similaires (Tableau 2). Les trois classes de pesticides les plus retrouvées sont les herbicides, les fongicides et les insecticides (Tableau 2).

Les insecticides peuvent agir sur le système nerveux (neurotransmission), la respiration ou sur la mue. Les fongicides impactent la respiration, la biosynthèse (stérols, ARN, mélanine), la croissance ou la perméabilité cellulaire. Enfin les herbicides réagissent sur la photosynthèse (photosystèmes I et II), sur la synthèse des lipides et des acides aminés, sur la division cellulaire ou sur la croissance.

Les substances actives interviennent donc sur des processus métaboliques fondamentaux, et leur potentiel toxique est effectif à la fois sur les espèces ciblées et sur les autres espèces présentes dans les écosystèmes contaminés par leur transfert [START_REF] Fauvelle | Evaluation de la contamination en pesticides des tributaires du bassin d'Arcachon et développement d'un échantillonneur passif spécifique des herbicides anioniques[END_REF].

Les modes d'action des familles de pesticides les plus représentées sont décrits dans le Tableau 3.

ii. Impact des pesticides sur les écosystèmes

Plusieurs études ont démontré la toxicité des pesticides sur la faune et sur la flore [START_REF] Brakes | Exposure of non-target small mammals to rodenticides: short-term effects, recovery and implications for secondary poisoning[END_REF][START_REF] Moreby | Influence of autumn applied herbicides on summer and autumn food available to birds in winter wheat fields in southern England: Agriculture[END_REF][START_REF] Prosser | Assessing potential exposure of birds to pesticide-treated seeds[END_REF][START_REF] Wilson | A review of the abundance and diversity of invertebrate and plant foods of granivorous birds in northern Europe in relation to agricultural change: Agriculture[END_REF] ; les herbicides impactant directement la flore naturelle [START_REF] Fletcher | Potential environmental risks associated with the new sulfonylurea herbicides[END_REF].

Par exemple, les biofilms des cours d'eau, notamment constitués de diatomées, peuvent être affectés par des contaminations en pesticides avec des impacts physiologiques structurels, tant au niveau individuel qu'à l'échelle de la communauté [START_REF] Dorigo | Lotic biofilm community structure and pesticide tolerance along a contamination gradient in a vineyard area[END_REF][START_REF] Duong | Seasonal effects of cadmium accumulation in periphytic diatom communities of freshwater biofilms[END_REF][START_REF] Morin | Recovery potential of periphytic communities in a river impacted by a vineyard watershed[END_REF].

e) Caractéristiques et toxicité des pesticides sélectionnés pour cette étude

Ces travaux de thèse s'intéressent à une contamination par deux herbicides : le diuron et le Smétolachlore, ayant des modes d'action différents et impactant des cibles cellulaires distinctes.

La concentration testée est de 10 µg.L -1 , soit une concentration relativement au-dessus de la concentration environnementale qui est de 1 µg.L -1 [START_REF] Coquillé | Use of diatom motility features as endpoints of metolachlor toxicity[END_REF][START_REF] Moisset | Genetic and physiological responses of three freshwater diatoms to realistic diuron exposures[END_REF] mais du même ordre de grandeur que celles utilisées dans d'autres études écotoxicologiques [START_REF] Coquillé | Use of diatom motility features as endpoints of metolachlor toxicity[END_REF]Debenest et al., 2009a;[START_REF] Moisset | Genetic and physiological responses of three freshwater diatoms to realistic diuron exposures[END_REF].

Les caractéristiques des deux pesticides sont présentées dans le Tableau 4.

Tableau 3 : Mode d'action des familles de pesticides les plus représentées. D'après [START_REF] Fauvelle | Evaluation de la contamination en pesticides des tributaires du bassin d'Arcachon et développement d'un échantillonneur passif spécifique des herbicides anioniques[END_REF]. [START_REF] Coquillé | Influence de la matière organique dissoute naturelle et d'herbicides, seuls et combinés, sur des microalgues marines et d'eau douce[END_REF].

Familles de pesticides

Des études bibliographiques ont montré que les CE50 du diuron basées sur la croissance de la microalgue dulçaquicole Raphidocelis subcapitata étaient de 0,7 µg.L -1 [START_REF] Ma | Toxicity assessment of 40 herbicides to the green alga Raphidocelis subcapitata[END_REF] à près de 6,6 µg.L -1 [START_REF] Okamura | Phytotoxic effects of antifouling compounds on nontarget plant species[END_REF].

Cet herbicide inhibe la photosynthèse en agissant au niveau de l'appareil photosynthétique et particulièrement au niveau du photosystème II (PS II).

Le PS II est un des deux complexes protéines-cofacteurs présents au niveau de la membrane des thylakoïdes, le second étant le PS I (Mizusawa and Wada, 2012) (Figure 12). L'herbicide se lie à la protéine D1 du PSII, ce qui bloque le transfert d'électrons de la quinone A à la quinone B. L'inhibition du transport d'électrons peut en plus entraîner une formation d'espèces réactives de l'oxygène qui endommagent les pigments, les protéines et les lipides autour de l'appareil photosynthétique [START_REF] Chalifour | Temperature-dependent sensitivity of growth and photosynthesis of Scenedesmus obliquus, Navicula pelliculosa and two strains of Microcystis aeruginosa to the herbicide atrazine[END_REF][START_REF] González-Barreiro | Atrazine-induced chlorosis in Synechococcus elongatus cells[END_REF].

Par exemple, une étude déterminant l'impact de cet herbicide à une concentration de 10 µg.L -1 sur trois espèces de diatomées d'eau douce a montré une diminution d'environ 50 % du rendement quantique optimal du photosystème II [START_REF] Moisset | Genetic and physiological responses of three freshwater diatoms to realistic diuron exposures[END_REF].

De plus, Troton et al. ont démontré en 1986 que le diuron diminuait la teneur des acides gras polyinsaturés par l'inhibition du processus de désaturation lors de la synthèse des acides gras [START_REF] Troton | Modifications of thylakoid lipids in Euglena gracilis during diuron-adaptation[END_REF]. ii. S-métolachlore

L'herbicide S-métolachlore (2-Chloro-N-(2-éthyl-6-méthylphényl)-N-[(1S)-2-méthoxy-1-
méthyléthyl] acétamide) appartient quant à lui à la famille des chloroacétamides et est l'isomère du métolachlore autorisé sur le marché. La Figure 13 montre la structure des quatre énantiomères du métolachlore. Les énantiomères d'un même pesticide possèdent des propriétés physico-chimiques identiques mais peuvent se comporter différemment dans l'environnement [START_REF] Lefrancq | Transport and attenuation of pesticides in runoff from agricultural headwater catchments: from field characterisation to modelling[END_REF]. La littérature a montré que la plage des CE50 du S-métolachlore basées sur la croissance des microalgues couvraient une gamme allant de 68 µg.L -1 pour l'espèce dulçaquicole Chlorella pyrenoidosa [START_REF] Liu | Comparative toxicity of racemic metolachlor and S-metolachlor to Chlorella pyrenoidosa[END_REF] à près de 2300 µg.L -1 pour l'espèce Scenedesmus vacuolatus [START_REF] Vallotton | S-metolachlor pulse exposure on the alga Scenedesmus vacuolatus: effects during exposure and the subsequent recovery[END_REF].

Cet herbicide est un inhibiteur de la synthèse des acides gras à très longues chaînes [START_REF] Liu | Comparative toxicity of racemic metolachlor and S-metolachlor to Chlorella pyrenoidosa[END_REF] car il est capable de se lier aux élongases [START_REF] Götz | The very-long-chain fatty acid synthase is inhibited by chloroacetamides[END_REF]. Cette inhibition entraîne notamment un déséquilibre dans la composition des acides gras des lipides membranaires, engendrant une perte de la rigidité et de la perméabilité des parois de la membrane [START_REF] Böger | Mode of action for chloroacetamides and functionally related compounds[END_REF][START_REF] Schmalfuss | Chloroacetamide mode of action, I: Inhibition of very long chain fatty acid synthesis in Scenedesmus acutus[END_REF] Lors d'une augmentation trop importante de la concentration de polluant ou de la durée d'exposition par exemple, des réactions sont mises en place par l'organisme afin de combattre et de limiter les effets toxiques des polluants. Ces réactions peuvent avoir comme finalité de dégrader ou de détoxifier la cellule et permettent de réduire l'effet toxique des contaminants. [START_REF] Depledge | The rational basis for the use of biomarkers as ecotoxicological tools: Nondestructive biomarkers in vertebrates[END_REF].

Or, lorsque les concentrations de polluants sont trop élevées ou que l'exposition est trop longue, ces réactions ne suffisent plus à limiter les effets des toxiques, les capacités de défense de l'organisme étant dépassées. A ce stade, les effets des polluants pouvant être irréversibles, l'état de santé de l'organisme se dégrade de manière fatale à plus ou moins long terme, même lorsque l'exposition aux contaminants redevient nulle [START_REF] Depledge | The rational basis for the use of biomarkers as ecotoxicological tools: Nondestructive biomarkers in vertebrates[END_REF][START_REF] Lagadic | Biomarqueurs en écotoxicologie: principes et définitions[END_REF].

De plus, la spécificité du biomarqueur pour certaines classes de polluants permet de révéler leur présence et leurs effets précoces sur les organismes [START_REF] Amiard | Les biomarqueurs parmi les méthodes d'évaluation de la qualité de l'environnement: Utilisation de biomarqueurs pour la surveillance de la qualité de l'environnement[END_REF]. Par exemple, les pesticides inhibiteurs du photosystème II tel que le diuron vont inhiber l'activité photosynthétique, ou bien, les inhibiteurs de la synthèse des acides gras à très longues chaînes, tel que le S-métolachlore, vont diminuer les proportions d'acides gras PUFA ou HUFA dans la cellule.

Il est intéressant de noter par ailleurs que la surveillance de la pollution aquatique, par l'utilisation des biomarqueurs, peut s'effectuer à différents niveaux d'organisation, allant de l'individu jusqu'au niveau de la communauté [START_REF] Lagadic | Biomarqueurs en écotoxicologie: principes et définitions[END_REF] ii

. Exemples appliqués au diuron et au S-métolachlore

De nombreuses études ont relevé la toxicité des pesticides sur les microalgues et notamment sur les diatomées de par l'utilisation de biomarqueurs.

La toxicité du diuron et du S-métolachlore a pu être observée, comme décrits dans le Tableau 5, à différents niveaux cellulaires tels que :

1) L'expression de gènes d'intérêt (seulement diuron) ;

 Sous ou sur-expression de certains gènes d'intérêt face à une contamination au diuron.

2) La concentration en pigments (chlorophylle a, c et carotène par exemple) ;

 Diminution de la concentration en pigments face à une contamination au diuron et au S-métolachlore.

3) L'activité photosynthétique ;

 Diminution de l'activité photosynthétique après contamination par le diuron et le Smétolachlore.

4) La croissance ;

 Diminution du taux de croissance après contamination au diuron et au Smétolachlore.

Ces biomarqueurs seront considérés comme « classiques » tout au long de ces travaux de thèse. Pour répondre à ces objectifs de travail, la toxicité des deux pesticides a été étudiée vis-à-vis de deux espèces de diatomées d'eau douce, Gomphonema gracile et Nitzschia palea.

Les descripteurs dits « classiques » ont été analysés tels que l'inhibition de la croissance, de la photosynthèse, la concentration en chlorophylle a et caroténoïdes, l'induction et/ou la répression de gènes d'intérêt. Enfin, la réponse des profils d'acides gras des deux diatomées a été observée.

Dans le but de comprendre au mieux les effets biologiques notés, une caractérisation de l'environnement chimique a également été réalisée au travers de la mesure des concentrations en pesticides et celle en sels nutritifs.

Matériels biologiques

Deux espèces de diatomées dulçaquicoles ont été étudiées lors de ces travaux de thèse, Gomphonema gracile et Nitzschia palea. Ces espèces ont été choisies au vu de leur sensibilité différente face aux contaminations (parties suivantes).

Celles-ci, non axéniques, ont été cultivées en milieu Dauta stérile [START_REF] Dauta | Conditions for phytoplankton development, a comparative study of the behaviour of eight species in culture. I. Determination of growth parameters in relation to light and temperature[END_REF] dans des erlenmeyer de 1 L (annexe 4) à deux températures différentes 17,5 °C et 20,5 °C. Les deux températures ont été sélectionnées vis-à-vis de précédentes études réalisées au laboratoire et des préférendums thermiques de ces espèces.

Une armoire de culture thermostatées (610 XAP, LMS LTD®, UK) a été employée pour la température de 17,5 °C, sous une intensité lumineuse de consigne de 45 µmol.m -2 .s -1 avec un cycle jour : nuit de 16h : 8h.

Concernant la culture à 20,5 °C, celle-ci a été réalisée dans une salle climatisée sous un dispositif composé de néon de manière à obtenir une photopériode et une intensité lumineuse identiques à celles retrouvées dans les armoires de cultures.

Chaque semaine, les cultures ont été renouvelées avec un nouveau milieu stérile Dauta dans le but de maintenir les diatomées dans une phase de croissance exponentielle.

Les travaux présentés dans les chapitres de résultats de la thèse concernent les expériences réalisées à une température de 20.5 °C mais les résultats obtenus à partir des manipulations faites à une température de 17.5 °C seront discutés dans la partie perspectives de ce manuscrit.

a) Gomphonema gracile Ehrenberg, 1838

Gomphonema gracile (GGRA) est une diatomée benthique pennée de la famille des

Gomphonematacées. Celle-ci possède des valves striées et hétéropolaires et avec un stigma dans l'aire centrale. Les valves ont une longueur de 20 à 80 µm et une largeur de 4,5 à 9 µm [START_REF] Reichardt | Gomphonema gracile Ehrenberg sensu stricto et sensu auct. (Bacillariophyceae): A taxonomic revision[END_REF]. GGRA peut être mobile ou fixée au substrat par un pédoncule et vivre seule ou regroupée au sein d'une matrice, préférant les eaux légèrement acides.

GGRA est retrouvée dans diverses zones du monde [START_REF] Germain | Flore des diatomées : eaux douces et saumâtres[END_REF][START_REF] Verma | Pennate diatoms Gomphonema Ehrenberg from the Vindhya (Central Highland) and the Himalaya[END_REF][START_REF] Villeneuve | Composition diatomifère de quatre sources thermales au Canada[END_REF] et est considérée comme très sensible à différents types de pollution (selon son profil écologique dans l'IBD, [START_REF] Coste | Improvements of the Biological Diatom Index (BDI): Description and efficiency of the new version (BDI-2006)[END_REF].

La souche de GGRA étudiée a été isolée en décembre 2013 à partir d'un échantillon de terrain (prélevé en amont de la rivière Leyre, principal affluent du bassin d'Arcachon (sud-ouest de la

France)) par micromanipulation au microscope inversé [START_REF] Coquillé | Use of diatom motility features as endpoints of metolachlor toxicity[END_REF].

b) Nitzschia palea (Kützing) Smith, 1856

Nitzschia palea (NPAL) est une diatomée benthique pennée de la famille des Bacillariaceae.

Les valves de cette diatomée ont une largeur de 2,8 à 4,5 µm et une longueur de 12 à 43 µm.

Son raphé est situé sur l'extrémité valvaire est n'est pas observable directement par microscopie optique. La densité de stries est de 32 à 47/10 µm [START_REF] Trobajo | Morphological, genetic and mating diversity within the widespread bioindicator Nitzschia palea (Bacillariophyceae)[END_REF].

NPAL est fréquemment retrouvée et est décrite comme relativement tolérante aux pesticides [START_REF] Kim Tiam | Environmental effects of realistic pesticide mixtures on natural biofilm communities with different exposure histories[END_REF][START_REF] Larras | Using bioassays and species sensitivity distributions to assess herbicide toxicity towards benthic diatoms[END_REF][START_REF] Moisset | Genetic and physiological responses of three freshwater diatoms to realistic diuron exposures[END_REF].

La souche lotique d'eau douce utilisée dans cette expérience a été fournie par la collection de cultures de l'INRA de Thonon (numéro de référence de la souche TCC583).

Préparation des solutions de pesticides et conditions générales d'exposition a) Préparation des solutions de pesticides

Pour chaque pesticide, une solution mère de 1 mg.L -1 a été préparée à partir d'eau Milli-Q ultrapure.

Le S-métolachlore se présente sous forme de liquide d'une pureté de 98 % et le diuron sous forme de poudre d'une pureté de 98,8 %. Ces deux pesticides ont été achetés chez le fournisseur CIL.

La solubilité dans l'eau du diuron étant faible, 42 mg.L -1 à 25 °C, la solution a été passée aux ultrasons puis chauffée dans le but de solubiliser la poudre dans l'eau. La solubilité du Smétolachlore dans l'eau étant de 490 mg.L -1 à 25 °C, cette solution a été préparée de manière ordinaire en diluant le pesticide dans de l'eau Milli-Q ultrapure.

Les solutions ont été préparées la veille de chaque manipulation.

b) Conditions générales d'exposition

Trois expériences indépendantes ont été réalisées à 20,5 °C.

La durée des expérimentations était de sept jours pour les deux espèces de diatomées, GGRA et NPAL. Celles-ci ont été réalisées dans des ballons en verre borosilicaté (V = 100 mL) préalablement calcinés à 450 °C pendant 4 heures. Pour l'ensemble des expériences, le volume expérimental était de 80 mL. Pour chaque expérience, l'impact du diuron et du S-métolachlore vis-à-vis des deux espèces de diatomées à une concentration de 10 µg.L -1 a été observé.

Pour ce faire, une semaine avant la contamination, les ballons ont été inoculés avec 40 mL de culture mère de diatomées en phase de croissance exponentielle et 40 mL de milieu Dauta. Cette étape a permis l'adaptation durant une semaine des diatomées dans les ballons écartant ainsi l'effet contenant.

Après une semaine d'adaptation, la contamination a été réalisée. Les ballons ont été inoculés à 300 000 cell.mL -1 pour les trois manipulations. Ceux-ci ont été inoculés avec les cultures adaptées aux ballons et du milieu de culture Dauta (Vexp = 80 mL).

Trois traitements (chaque traitement était répliqué quatre fois) ont été employés pour les deux espèces de diatomées cultivées de manière indépendante :

1) Les traitements témoins avec l'absence de pesticide ;

2) Les traitements diuron à une concentration nominale de 10 µg.L -1 ;

3) Les traitements S-métolachlore à une concentration nominale de 10 µg.L -1 .

Pour les deux premières expériences, quatre ballons supplémentaires ont été utilisés pour l'analyse à T0 de la concentration en sels nutritifs, de la concentration en pigments et de celle des profils d'acides gras.

Au cours des trois expérimentations, des prélèvements ont été effectués pour les analyses biologiques et chimiques.

Les paramètres chimiques suivis ont été les suivants :

1) les concentrations en sels nutritifs (nitrates, orthophosphates et silicates), mesurées le premier jour (T0) (sur un ballon supplémentaire pour les manipulations 1 et 2) et le dernier jour (T7) sur l'ensemble des traitements de chaque condition et de chaque espèce ;

2) les concentrations en pesticides, mesurées au début (T0), le premier jour (T1), le troisième jour (T3) et le dernier jour (T7) des expérimentations.

Les paramètres biologiques suivis ont été les suivants :

1) la croissance des microalgues, évaluée grâce à la mesure de la concentration cellulaire effectuée tous les jours ;

2) l'efficacité photosynthétique réelle, mesurée tous les jours ouvrés ; L'analyse des lipides et des acides gras, pendant la 3ème expérience, a été réalisée à T0, T3 et T7 sur l'ensemble des traitements de chaque condition.

Le détail des analyses réalisées est décrit dans les parties suivantes.

Paramètres chimiques a) Sels nutritifs

L'analyse des nutriments a été réalisée au début (T0) et à la fin (T7) de chaque manipulation. ii. Silicates

i. Nitrates et phosphates

Paramètres biologiques a) Evaluation de la croissance des diatomées

L'estimation de la concentration cellulaire des diatomées a été réalisée quotidiennement. La mesure de la concentration en chlorophylle a et en caroténoïdes a été réalisée au début (T0) et à la fin (T7) de chaque manipulation.

i. Concentration cellulaire des diatomées

Le taux de croissance a été déterminé par le comptage sous microscope des diatomées sur une cellule de Nageotte (Marienfield, Allemagne). Quotidiennement, 1 mL de chaque échantillon a été fixé dans du Lugol (4 %) puis stocké à 4 °C et à l'obscurité de manière à pouvoir réaliser le comptage ultérieurement. Les échantillons ont été passés au vortex puis homogénéisés par pipetages successifs et éventuellement dilués au besoin selon leur concentration. Un aliquote de 125 µL a été déposé au centre de la cellule de comptage puis a été recouvert par une lamelle planée.

Le nombre de cellules a été déterminé dans 10 champs de la zone quadrillée (1,25 μL chacune, 0,5 mm de profondeur). La distinction entre les cellules vivantes et mortes a été estimée par observation de la turgescence et de la couleur des chloroplastes [START_REF] Morin | Recovery potential of periphytic communities in a river impacted by a vineyard watershed[END_REF].

ii. Analyse transcriptomique

Le protocole suivant a été réalisé à T7 de chaque manipulation et était basé sur celui de [START_REF] Moisset | Genetic and physiological responses of three freshwater diatoms to realistic diuron exposures[END_REF].

Quatre millilitres ont été prélevés puis centrifugés à 1 500 g pendant 5 min dans le but de retirer entièrement le milieu de culture. Deux cent microlitres de tampon RNA later ont été ajoutés au culot dans le but d'écarter la dégradation de l'ARN dans le temps. Les échantillons ont été placés une nuit à 4 °C puis à -80 °C jusqu'à l'analyse génétique.

Extraction des ARNs totaux

Les échantillons de diatomées ont été décongelés à température ambiante quelques minutes, centrifugés à 1 500 g pendant 5 min et le surnageant a été ôté.

Le culot de cellules de diatomées a été remis en suspension dans 1 mL de Trizol (Invitrogen).

Trois cents microlitres de billes de verre (2,5 µm Les tubes ont été centrifugés pendant 1min à température ambiante à 8 000 g.

La quantité et la qualité de l'ARN obtenu après purification ont été évaluées par la mesure de l'absorbance à 260 nm et 280 nm par un spectromètre d'absorption. Le rapport de 260/280 rendant compte de la qualité de l'extraction [START_REF] Lauritano | Key genes as stress indicators in the ubiquitous diatom Skeletonema marinoi[END_REF] devait être supérieur à 1,8 pour une purification correcte.

Le schéma du protocole simplifié des étapes suivantes est représenté sur la Figure 16. La Figure 17 schématise simplement le principe de la réaction de transcription inverse.

PCR quantitative (q-PCR) en temps réel La RT-PCR est une technique qui est utilisée pour quantifier l'expression génique. Il existe deux types de PCR quantitative :

1) la quantification absolue, quantifiant l'expression des gènes d'intérêts via une courbe étalon ;

2) et la quantification relative, utilisée dans cette étude, comparant leur expression à celle de gènes de référence [START_REF] Livak | Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method: Methods[END_REF].

Pour chaque gène, un couple de primers spécifiques et utilisable en q-RT-PCR a été déterminé à l'aide du logiciel LightCycler probe design (Tableau 6).

Chaque mélange réactionnel (20 µL) était composé de 1 μL de tampon d'activité (Syber Green La spécificité de chaque réaction a été déterminée par une analyse de la courbe de dissociation du produit de la PCR. Cette courbe a été obtenue en suivant le niveau de fluorescence du Syber Green pendant un chauffage progressif des produits de la PCR de 60 °C à 95 °C.

La normalisation de la quantification relative du niveau d'expression de chaque gène a été réalisée suivant l'expression de 2 gènes de référence ; la β-actine (β-act) et celui codant pour la protéine ribosomale L7 (RPL7) (Tableau 6). L'expression relative des gènes étudiés a été déterminé à l'aide de la méthode du 2 -ΔΔCT [START_REF] Livak | Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method: Methods[END_REF].

c) Analyse des profils lipidiques et des acides gras des diatomées i. Protocole de l'analyse des profils lipidiques

Le protocole suivant a été réalisé à T1, T3 et T7 pour l'expérience concernant le chapitre 5.

Des cellules de 30 mL de milieu de culture ont été récoltées par centrifugation puis les lipides ont été extraits selon la méthode décrite par [START_REF] Bligh | A rapid method for lipid extraction for use in determining vitamin E} lipid ratios[END_REF] Les lipides ont ensuite été purifiés par chromatographie en couche mince unidimensionnelle sur des plaques de gel de silice préalablement nettoyées avec du chloroforme (VWR, 10x10 cm) en utilisant du chloroforme/n-propanol/acétate de méthyle/méthanol/0,25 % de KCl aqueux (10:10:10:4:1,6) comme solvant. Un développement unidimensionnel de routine a été effectué avec une chambre de développement automatique (ADC2, CAMAG) sous une humidité contrôlée de 33 %.

Les lipides ont ensuite été visualisés avec une solution à 0,001 % (w/v) de primuline dans 80 % d'acétone sous lumière UV. Les zones de gel de silice correspondant à chaque classe de lipides, identifiées grâce aux standards lipidiques déposés simultanément sur la plaque, ont été grattées et transférées dans un tube propre. Ensuite, les profils d'acides gras pour chaque classe de lipide ont été analysés comme décrit ci-dessous.

ii. Protocole de l'analyse des profils d'acides gras Louis, MO, USA).

Analyses statistiques

Différentes analyses statistiques ont été réalisées pour chaque manipulation menée tout au long de ces travaux de thèse.

Un test non paramétrique de Wilcoxon-Mann-Whitney a été effectué en raison de la distribution non normale des données (avec une valeur de p <0,05 considérée comme statistiquement significative) dans le but de détecter des différences significatives entre :

1) le début et la fin de l'expérience (profils d'acides gras) (manipulation 1) ;

2) les réponses des deux espèces de diatomées N. palea et G. gracile à T7 (manipulation 2) ;

3) les différents traitements : cultures témoins et cultures exposées aux herbicides (tous les descripteurs) (manipulations 1, 2 et 3).

Les analyses en composantes principales (ACP), établies à l'aide des packages tidyverse, ade4, FactoMineR et factoextra, ont été réalisées dans le but de mettre en évidence les corrélations entre différentes variables telles que :

1) la teneur en chlorophylle a et en caroténoïdes (manipulations 1 et 2) ;

2) le pourcentage des quatre classes d'acides gras (SFA, MUFA, PUFA et HUFA) (manipulations 1 et 2) ;

3) le pourcentage de chaque acide gras (14: 0, 16: 0, 16: 1, etc.) (manipulations 1 et 2) ; Par ailleurs, il a été démontré dans la littérature que la pollution par les herbicides pouvait avoir une incidence sur la croissance et la physiologie des diatomées [START_REF] Debenest | Effects of Pesticides on Freshwater Diatoms[END_REF][START_REF] Delorenzo | Toxicity of pesticides to aquatic microorganisms: A review[END_REF][START_REF] Moisset | Genetic and physiological responses of three freshwater diatoms to realistic diuron exposures[END_REF].

De plus, de récentes études ont montré que la modification des profils d'acides gras était un biomarqueur précoce et sensible du stress environnemental et chimique du zooplancton, des poissons, des crustacés et des diatomées marines [START_REF] Gonçalves | Fatty acid acid profiling reveals seasonal and spatial shifts in zooplankton diet in a temperate estuary[END_REF]Gonçalves et al., 2018a;[START_REF] Maazouzi | Chronic copper exposure and fatty acid composition of the amphipod Dikerogammarus villosus: Results from a field study[END_REF][START_REF] Ramírez | Aquafeed imprint on bogue (Boops boops) populations and the value of fatty acids as indicators of aquacultureecosystem interaction: Are we using them properly?[END_REF][START_REF] Sánchez-Muros | Effects of chemical and handling exposure on fatty acids, oxidative stress and morphological welfare indicators in gilt-head sea bream (Sparus aurata)[END_REF].

Les acides gras saturés et monoinsaturés sont les principales formes d'énergie emmagasinées [START_REF] Olofsson | Seasonal variation of lipids and fatty acids of the microalgae Nannochloropsis oculata grown in outdoor large-scale photobioreactors[END_REF], alors que les acides gras polyinsaturés (avec > 1 double liaison) et les acides gras hautement insaturés (avec ≥ 20 atomes de carbone et ≥ 3 doubles liaisons) jouent un rôle important dans l'organisme en tant que constituants majeurs des membranes cellulaires [START_REF] Gonçalves | Fatty Acids' Profiles of Aquatic Organisms: Revealing the Impacts of Environmental and Anthropogenic Stressors, Fatty Acids[END_REF]. The aims of this study were to: 1) investigate the impact of diuron and S-metolachlor on "classical descriptors" (photosynthesis, growth rate, pigment contents, and on the expression levels of target genes in freshwater diatoms), 2) examine the impact of these pesticides on diatom fatty acid profiles and finally, 3) compare fatty acid profiles and "classical descriptor" responses in order to evaluate their complementarity and ecological role. To address this issue, the model freshwater diatom Gomphonema gracile was exposed during seven days to diuron and S-metolachlor at 10 µg.L -1 .

G. gracile was mostly composed of the following fatty acids: 20:5n3; 16:1; 16:0; 16:3n4; 14:0 and 20:4n6 and highly unsaturated fatty acids were overall the best represented fatty acid class. S-metolachlor decreased the growth rate and chlorophyll a content of G. gracile and induced the expression of cox1, nad5, d1 and cat genes, while no significant impacts were observed on photosynthesis and carotenoid content. In a more global way, S-metolachlor did not impact the fatty acid profiles of G. gracile. Diuron inhibited photosynthesis, growth rate, chlorophyll a content and induced cat and d1 gene expressions but no significant effect was observed on carotenoid content. Diuron decreased the percentage of highly unsaturated fatty acids but increased the percentage of monounsaturated fatty acids. These results demonstrated that fatty acids responded to diuron conversely to pigment content, suggesting that fatty acids can inform on energy content variation in diatoms subjected to herbicide stress.

Introduction

The intensive use of pesticides for crop protection causes many environmental problems, making pesticides major pollutants of aquatic ecosystems [START_REF] Aydinalp | The effects of pesticides in water resource[END_REF][START_REF] Vidal | Acute and chronic toxicity of Betanal®Expert and its active ingredients on nontarget aquatic organisms from different trophic levels[END_REF]. Indeed, whereas the use of these pesticides takes place in the terrestrial environment, by aerial spraying, leaching, runoff or accidental spills, the final receptacles of these chemicals are aquatic environments [START_REF] Vidal | Acute and chronic toxicity of Betanal®Expert and its active ingredients on nontarget aquatic organisms from different trophic levels[END_REF]. In France, many different herbicides are present in rivers. For example, the tributaries of Arcachon Bay are contaminated by diverse mobile and persistent herbicides, such as diuron and S-metolachlor [START_REF] Fauvelle | Use of Mixed-Mode Ion Exchange Sorbent for the Passive Sampling of Organic Acids by Polar Organic Chemical Integrative Sampler[END_REF].

The herbicide diuron 3-(3, 4-dichlorophenyl)-1, 1-dimethylurea, is a compound of the substituted urea family and is resistant to photolysis and hydrolysis [START_REF] Okamura | Photodegradation of the antifouling compounds Irgarol 1051 and Diuron released from a commercial antifouling paint[END_REF]. This herbicide is an inhibitor of photosystem II (PSII) which inhibits photosynthesis by preventing the electron transport chain [START_REF] Rutherford | Herbicide-induced oxidative stress in photosystem II[END_REF]) and stopping oxygen formation [START_REF] Moisset | Genetic and physiological responses of three freshwater diatoms to realistic diuron exposures[END_REF]. Furthermore, diuron is known to generate reactive oxygen species (ROS) which induce a gap in the balance between prooxidative and antioxidative reactions [START_REF] Geoffroy | Effect of oxyfluorfen and diuron alone and in mixture on antioxidative enzymes of Scenedesmus obliquus[END_REF]. Moreover, it is also demonstrated that diuron inhibits polyunsaturated fatty acid synthesis by inhibiting the desaturation process [START_REF] Troton | Modifications of thylakoid lipids in Euglena gracilis during diuron-adaptation[END_REF]. S-metolachlor is a compound of the chloroacetamides family and is a molecule that is potentially dangerous to the environment [START_REF] Liu | A comparative study of rac-and S-metolachlor toxicity to Daphnia magna[END_REF]. This herbicide was developed in order to control grass weeds following pre-emergence application [START_REF] Neves | Biochemical and populational responses of an aquatic bioindicator species, Daphnia longispina, to a commercial formulation of a herbicide (Primextra® Gold TZ) and its active ingredient (S-metolachlor)[END_REF]. It was shown that this pesticide inhibits synthesis of chlorophyll, proteins, fatty acids, lipids and finally, growth of the organism [START_REF] Fuerst | Understanding the mode of action of the chloroacetamide and thiocarbamate herbicides[END_REF]Rivard, 2003). In fact, S-metolachlor inhibits elongases involved in the elongation of highly unsaturated fatty acid (HUFA) and especially very long-chain fatty acids (VLCFA) [START_REF] Trenkamp | Specific and differential inhibition of verylong-chain fatty acid elongases from Arabidopsis thaliana by different herbicides[END_REF]. Furthermore, its toxicity is linked with the oxidation of components of cells increasing the production of reactive oxygen species (ROS) and starting lipid peroxidation [START_REF] Maronić | S-metolachlor promotes oxidative stress in green microalga Parachlorella kessleri-A potential environmental and health risk for higher organisms[END_REF].

Many microorganisms co-occur in watercourses, especially periphytic communities and particularly diatoms which, at certain times of the year, represent the bulk of periphyton [START_REF] Moisset | Genetic and physiological responses of three freshwater diatoms to realistic diuron exposures[END_REF]. Among primary producers in watercourses, freshwater diatoms are the dominant phototrophic organisms and play an important role in ecological processes such as primary production [START_REF] Potapova | Benthic diatoms in USA rivers: distributions along spatial and environmental gradients[END_REF][START_REF] Rimet | Recent views on river pollution and diatoms[END_REF]. Diatoms are relevant bioindicators because of their adaptation capacities and their tolerance of environmental factors and aquatic pollution [START_REF] Potapova | Benthic diatoms in USA rivers: distributions along spatial and environmental gradients[END_REF].

Several monitoring tools based on diatom community composition (such as the Biological Diatom Index, BDI; [START_REF] Coste | Improvements of the Biological Diatom Index (BDI): Description and efficiency of the new version (BDI-2006)[END_REF] have been developed to assess the ecological quality of watercourses, but unfortunately these indices are not suitable to detect the impacts of water pollution by pesticides on diatoms [START_REF] Dorigo | Seasonal changes in the sensitivity of river microalgae to atrazine and isoproturon along a contamination gradient[END_REF][START_REF] Lenoir | Development of a practical diatom index of overall water quality applicable to the French national water board network: Use of algae for monitoring rivers[END_REF][START_REF] Prygiel | Diatoms and diatom indices in the networks for quality measurement of French watercourses : Short history and future: BFPP[END_REF].

It was shown in the literature that the growth and physiology of diatoms can be impacted by herbicide pollution [START_REF] Debenest | Effects of Pesticides on Freshwater Diatoms[END_REF][START_REF] Delorenzo | Toxicity of pesticides to aquatic microorganisms: A review[END_REF]. Differential gene expression proved to be an early and sensitive biomarker of toxicant exposure [START_REF] Kim Tiam | Development of q-PCR approaches to assess water quality: effects of cadmium on gene expression of the diatom Eolimna minima[END_REF][START_REF] Kim Tiam | Morphological, physiological and molecular responses of Nitzschia palea under cadmium stress[END_REF][START_REF] Moisset | Genetic and physiological responses of three freshwater diatoms to realistic diuron exposures[END_REF], compared to more global endpoints.

Chemical pollution may impact organisms at the biomolecular and biochemical levels being sensitive and quick-responding bioindicators [START_REF] Adams | Ecotoxicological indicators of water quality: Using multi-response indicators to assess the health of aquatic ecosystems: Water[END_REF]. Alteration in FA profiles is a sensitive early bioindicator of environmental and chemical stress in zooplankton, fish, crustaceans and diatoms, as demonstrated by recent studies [START_REF] Gonçalves | Fatty acid acid profiling reveals seasonal and spatial shifts in zooplankton diet in a temperate estuary[END_REF]Gonçalves et al., 2018b;[START_REF] Maazouzi | Chronic copper exposure and fatty acid composition of the amphipod Dikerogammarus villosus: Results from a field study[END_REF][START_REF] Ramírez | Aquafeed imprint on bogue (Boops boops) populations and the value of fatty acids as indicators of aquacultureecosystem interaction: Are we using them properly?[END_REF][START_REF] Sánchez-Muros | Effects of chemical and handling exposure on fatty acids, oxidative stress and morphological welfare indicators in gilt-head sea bream (Sparus aurata)[END_REF].

Fatty acids contribute to the fluidity, production and permeability of cell membranes, and they are the main components of lipids that play multiple roles in the cell. Moreover, saturated and monounsaturated fatty acids (SFA and MUFA) are the principal forms of stored energy [START_REF] Olofsson | Seasonal variation of lipids and fatty acids of the microalgae Nannochloropsis oculata grown in outdoor large-scale photobioreactors[END_REF], whereas polyunsaturated fatty acids (PUFA with > 1 double bonds) and highly unsaturated fatty acids (HUFA) (with ≥ 20 carbons and ≥ 3 double bonds) play a significant role in the organism, being major constituents of cellular membranes (Gonçalves et al., 2017). PUFA and HUFA take part in the regulation of membrane fluidity and serve as precursors of many hormones [START_REF] Brett | The role of highly unsaturated fatty acids in aquatic foodweb processes[END_REF]. PUFA and HUFA are only synthesized by photosynthetic organisms and are thus the most important molecules to be transferred in the trophic chain [START_REF] Allan | Determining spatial changes in the diet of nearshore suspension-feeders along the South African coastline: Stable isotope and fatty acid signatures: Estuarine[END_REF][START_REF] Dalsgaard | Fatty acid trophic markers in the pelagic marine environment[END_REF].

HUFA such as eicosapentaenoic acid (20:5n3, EPA) and docosahexaenoic acid (22:6n3, DHA)

are key nutritional compounds of zooplankton diet because of their energetic efficiency [START_REF] Perhar | Examination of the role of detritus food quality, phytoplankton intracellular storage capacity, and zooplankton stoichiometry on planktonic dynamics[END_REF]. They are used as fuel in all metabolic systems for all organisms, having an important role on physiological response [START_REF] Arts | Lipids in Aquatic Ecosystems[END_REF]. Some studies have demonstrated the impact of pesticides on fatty acid profiles of marine microalgae [START_REF] Filimonova | Effects of a herbicide and copper mixture on the quality of marine plankton[END_REF]Filimonova et al., 2016b;[START_REF] Robert | Metolachlor-mediated selection of a microalgal strain producing novel polyunsaturated fatty acids[END_REF]. For example, Filimonova et al. (2016) observed that exposure to the Primextra® herbicide decreased the percentage of PUFA and particularly of HUFA but increased the percentage of SFA in the marine diatom Thalassiosira weissflogii. Likewise, [START_REF] Robert | Metolachlor-mediated selection of a microalgal strain producing novel polyunsaturated fatty acids[END_REF] demonstrated that the herbicide metolachlor decreased the percentage of HUFA in the microalga Melosira moniliformis.

Moreover, few studies have demonstrated the effect of herbicides on freshwater microalgae, such as green algae [START_REF] Böger | Towards the primary target of chloroacetamides-new findings pave the way[END_REF][START_REF] Chalifour | Combined effect of temperature and bleaching herbicides on photosynthesis, pigment and fatty acid composition of Chlamydomonas reinhardtii[END_REF][START_REF] El-Sheekh | Effect of atrazine herbicide on growth, photosynthesis, protein synthesis, and fatty acid composition in the unicellular green alga Chlorella kessleri[END_REF][START_REF] Weisshaar | Chloroacetamide inhibition of fatty acid synthesis[END_REF]. For instance, an increase of MUFA and a decrease of PUFA and HUFA content were found on the green algae Scenedesmus and Chlamydomonas reinhardtii after respectively chloroacetamide treatment; norflurazon and fluridone exposure [START_REF] Böger | Towards the primary target of chloroacetamides-new findings pave the way[END_REF][START_REF] Chalifour | Combined effect of temperature and bleaching herbicides on photosynthesis, pigment and fatty acid composition of Chlamydomonas reinhardtii[END_REF].

To our knowledge, no study has yet focused on the impact of pesticides on fatty acid profiles of freshwater diatoms, and on the variable impacts of distinctly-acting toxic compounds such as diuron and S-metolachlor. We therefore tested the effects environmentally realistic concentrations of both pesticides (10 µg.L -1 each) [START_REF] Coquillé | Use of diatom motility features as endpoints of metolachlor toxicity[END_REF][START_REF] Moisset | Genetic and physiological responses of three freshwater diatoms to realistic diuron exposures[END_REF] on FA profiles and classical endpoints in the freshwater diatom G. gracile at 20.5°C for seven days. The aims of our study were: 1) to evaluate the impact of these herbicides on "classical" global descriptors such as growth rate, photosynthesis, pigment contents and to investigate the subsequent expression levels of the genes involved in mitochondrial metabolism (cox1 (cytochrome C oxidase subunit I), 12S (mitochondrial ribosomal RNA 12S) and nad5 (NADH dehydrogenase subunit 5)), photosynthetic activity (d1 (D1 protein) and psA (PsaA protein)), oxidative stress response (cat (catalase) and gpx (glutathione peroxidase)) and frustule synthesis (sil1 (silaffin-1 protein)) known to be putatively differentially expressed during pesticide exposure; 2) to explore the impact of two herbicides with contrasting cellular targets (diuron and S-metolachlor) on fatty acid profiles of freshwater diatoms, hypothesizing that diatom fatty acid responses would be similar to those of green algae; and finally, 3) to compare fatty acid profiles and "classical descriptors" responses in order to show their complementarity based on physiological and ecological responses.

Materials and methods

Diatom culture: Gomphonema gracile

G. gracile Ehrenberg (1838) (Bacillariophyceae) is a benthic diatom found preferentially in biofilms from slightly acidic waters [START_REF] Coste | Improvements of the Biological Diatom Index (BDI): Description and efficiency of the new version (BDI-2006)[END_REF]. It is a pennate diatom and has a bidirectional movement, as most raphid species [START_REF] Cohn | Chapter 13 Photo-stimulated effects on diatom motility[END_REF]. According to the Specific Pollution Sensitivity Index [START_REF] Cemagref | Etude des Méthodes Biologiques Quantitatives d'appréciation de la qualité des eaux -Rapport Division Qualité des Eaux Lyon[END_REF], this diatom is considered to be sensitive to macropollutants.

The freshwater diatom culture was isolated in December 2013 from a field sample (collected from an upstream section of the Leyre river, which is the main tributary of Arcachon Bay (South West France)) by micromanipulation under an inverted microscope [START_REF] Coquillé | Use of diatom motility features as endpoints of metolachlor toxicity[END_REF]. The diatom culture was maintained non axenic in the laboratory and was cultured in sterile Dauta medium [START_REF] Dauta | Conditions for phytoplankton development, a comparative study of the behaviour of eight species in culture. I. Determination of growth parameters in relation to light and temperature[END_REF] at 20.5 °C in a thermostatic chamber 610 XAP (LMS LTD®, UK) at 45 µmol photons.m -2 .s -1 with a dark: light cycle of 8:16h, in 1-L erlenmeyers. Every week, the culture was renewed with new sterile Dauta medium for the purpose of keeping diatoms in an exponential growth phase.

Experimental design

The experiment was carried out in round, 100 mL borosilicate sterile glass flasks previously heated to 550°C for 4h. One week before pesticide contamination, glass flasks were inoculated with 40 mL of stock culture in exponential growth phase and 40 mL of Dauta culture medium.

This step allowed a one-week adaptation of the culture to the glass flasks.

The contamination experiment lasted 7 days. For the first day of contamination, glass flasks were inoculated with 300,000 cell.mL -1 using adapted cultures in exponential growth phase and Dauta medium (total volume = 80 mL). Three treatments were run: a control treatment (no pesticide) and two pesticide treatments: diuron and S-metolachlor at 10 µg.L -1 . Controls and herbicide-exposed cultures were carried out in quadruplicate.

Chemical (nutrients and pesticides) analyses were carried out at the beginning (T0) and at the end (T7) of the experiment, following the protocols described in Supplementary Material (SI 1 and 2). Detailed environmental conditions in the cultures are provided in Table 2 SI-1.

Biological parameters

Photosystem II effective quantum yield -Photosynthesis

The analysis of inhibition of photosynthesis was carried out using a PHYTO-PAM (Pulse-Amplitude Modulated (PAM)) (Heinz Walz, GmbH, Germany) every day of the experiment. PHYTO-PAM is a device used to evaluate the physiological state of algae. It is based on the quantitative relationship between the efficiency of photosynthetic energy conversion and chlorophyll fluorescence [START_REF] Corcoll | The use of photosynthetic fluorescence parameters from autotrophic biofilms for monitoring the effect of chemicals in river ecosystems, Emerging and priority pollutants in rivers[END_REF] and its use for determining pesticide effects on photosynthesis [START_REF] Dorigo | A pulse-amplitude modulated fluorescence-based method for assessing the effects of photosystem II herbicides on freshwater periphyton[END_REF].

The PSII effective quantum yield (Φ'M) was determined using PHYTO-PAM with an emitterdetector unit (PHYTO-ED), in the "brown algae" mode. Measurements were performed in 1cmwide quartz cuvettes using 2 mL of diatom culture. Five Φ'M measurements were performed for each condition. Φ'M is described by the following equation [START_REF] Genty | The relationship between the quantum yield of photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence[END_REF]:

Φ'M = (F'M -F)/F

Growth rate

Cellular concentrations of diatoms were quantified every day of the experiment from 1mL of each sample fixed in Lugol (4 %) and stored at 4 °C until counting. Cell density was determined by counting using a Nageotte counting chamber (Marienfield, Germany) and following the protocol below. Each fixed sample was homogenized with a vortex. After homogenization, 125 μL of sample was dropped into the counting chamber. The number of cells was identified, under light microscopy, in ten columns of the counting area (1.25 μL each, 0.5 mm depth). The distinction between live and dead organisms was estimated by the observation of the color of the chloroplasts and by the observation of their turgescence [START_REF] Morin | Recovery potential of periphytic communities in a river impacted by a vineyard watershed[END_REF].

Cellular concentration was noted in number of individuals per milliliter, and then average growth rates were calculated to optimally fit the daily counting over the exponential growth phase, as the slope of the regression line of Ln (cell.mL -1 ) over time (days).

Chlorophyll a and carotenoid contents

Chlorophyll a and carotenoid content analyses were performed at T0 and T7 of the experiment.

An aliquot of 20 mL (T0) and another of approximately 10 mL (T7) of each sample were filtered on Whatman® GF/C filters and frozen at -20 °C until the time of analysis. Samples were then defrosted at room temperature before adding 10 mL of 80 % acetone (v/v). Each tube was wrapped with aluminum (to induce darkness) and shaken. The tubes were placed in a beaker containing water (to ensure stability) and ultrasonicated for 20 min before being left to settle over a 10 min period, in the dark. Each sample was filtered on Whatman® GF/C filters and the filters were recovered in the filter cone. The tubes were rinsed with 80 % acetone and the filters were pressed. The filtrates were collected in the initial tube and the final volume was noted (graduated tube).

Chlorophyll a content was determined with a Shimadzu UV-1800 spectrophotometer (Shimadzu Inc., Kyoto, Japan). Absorbance measurements were made at the following wavelengths: 470 nm, 663.2 nm and 648.8 nm. The chlorophyll a and carotenoid contents were calculated with Lichtenthaler equations [START_REF] Iummato | Effect of glyphosate acid on biochemical markers of periphyton exposed in outdoor mesocosms in the presence and absence of the mussel Limnoperna fortunei[END_REF][START_REF] Lichtenthaler | Determinations of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in different solvents[END_REF]) and expressed as milligrams per liter (mg.L -1 ).

Genetic analyses

Four milliliters, with a cell concentration of 576400 ± 140224 cells.mL -1 , were sampled at T7 and were centrifuged at 1.500 g during 5 min in order to the pellet cells and thus remove culture medium. To avoid degradation of RNA, 200 µL of RNA later buffer were added to the pellet. The level of expression of each gene was determined in relation to that of the reference gene (-actin) whose expression was stable and did not show any variation depending on the experimental treatments applied. Indeed, the reference gene rpl7 was not stable and so was not retained.

The detailed primers for each gene are provided in Table 3 SI1-3.

Fatty acid profiles

Twenty milliliters were sampled for each condition at T0 and T7. In order to remove medium culture samples were centrifuged at 1,500 g for 5 min and then 1 mL of methanol containing 2.5 % H2SO4 (v/v) was added to the pellet. The fatty acid methyl esters were obtained according to the protocol described by Le [START_REF] Le Guédard | Development of a biomarker for metal bioavailability: the lettuce fatty acid composition[END_REF].

Separation of FAMEs was carried out using gas chromatography (Agilent 7890A) on a DB-WAX column (15 m x 1 µm x 0.53 mm, Agilent) and with flame ionization detection. The oven temperature was 150 °C for 1 min, followed by a 5 °C.min -1 ramp to 230 °C. This last temperature was maintained for a further 8min (total run time = 25 min). The limit of detection was 0.25 µg of fatty acid.

Identification of fatty acids was performed by comparing their retention times with PUFA No3 standard (Sigma, Aldrich). For each fatty acids or class of fatty acids (SFA, MUFA, PUFA, HUFA) results were expressed in percentage of total fatty acids.

Statistical analyses

To detect significant differences between the beginning and the end of the experiment (FA profiles), and the control conditions and herbicide-exposed cultures (all descriptors), a nonparametric Wilcoxon-Mann-Whitney test was performed because of the non-normal distribution of the data (with a p-value < 0.05 considered as statistically significant). All statistical analyses were carried out with the R studio software [START_REF] Rstudioteam | RStudio: Integrated Development for R[END_REF].

Principal Component Analyses (PCA) were performed for the purpose of highlighting correlations between different variables such as photosynthesis activity, growth rate, contents of chlorophyll a and carotenoid, the percentage of the four classes of fatty acids (SFA, MUFA, PUFA and HUFA), the percentage of each fatty acid (14:0, 16:0, 16:1 etc.), the repression or induction factor of each gene of interest, nutrient concentrations and treatment with pesticides.

In order to show significant difference between groups of individuals a PERMANOVA test was performed (with a p-value < 0.05 considered as statistically significant) and three confidence ellipses were represented on the PCA plot.

Results

"Classical descriptors"

Cellular concentration, growth rate, photosynthesis and pigment contents

Control cultures grew during the seven days of the experiment with an average growth rate of 0.11 div.day -1 . The cellular concentration increased between T1 and T7 from 373,000 cells.mL - 1 to 576,400 cells.mL -1 . However, the chlorophyll a and carotenoid contents were stable over the time. Chlorophyll a content was in average of 0.84 ± 0.36 mg.L -1 at T0 and 1.49 ± 0.61 mg.L -1 at T7 and carotenoid content was 0.19 ± 0.05 mg.L -1 at T0 and 0.42 ± 0.17 mg.L -1 at T7.

Moreover, the photosynthetic activity was stable over time, with an average effective quantum yield of 0.54 ± 0.01.

S-metolachlor and diuron significantly decreased the growth of G. gracile (p-value < 0.05) with a decrease in growth rate from 0.11 div.day -1 to 0.07 div.day -1 and to 0.02 div.day -1 , respectively. The cellular concentration of G. gracile was significantly lower in both Smetolachlor and diuron-treated cultures than in the controls (p-value < 0.05), being 427,600 ± 26,368 cells.mL -1 and 308,600 ± 57,189 cells.mL -1 , respectively.

No significant difference in photosynthesis was observed between control and S-metolachlor conditions, whereas diuron decreased photosynthesis with an average effective quantum yield of 0.40 ± 0.02 (p-value < 0.05 for all dates). However, it was interesting to note that photosynthesis at T7 under diuron treatment was significantly higher than T1, T2, T5 and T6

with values of 0.37 ± 0.01, 0.37 ± 0.00, 0.36 ± 0.01 and 0.35 ± 0.02, respectively.

Chlorophyll a concentration significantly decreased with the two pesticide treatments from 1.49 ± 0.61 mg.L -1 to 0.80 ± 0.17 mg.L -1 for diuron (p-value < 0.05) and from 1.49 ±0.61 mg.L - 1 to 0.78 ± 0.19 mg.L -1 for S-metolachlor (p-value < 0.05), while carotenoid contents were not impacted by either herbicide.

Genetic analyses

The expression of the photosynthesis gene psaA and the mitochondrial metabolism gene 12s

were identical with that of the control after seven days of exposure to both pesticides (Table 1).

The results of the oxidative stress gene gpx and the frustule gene sil1 were not exploitable in this study.

Conversely, the oxidative stress gene cat and photosynthetic gene d1 were induced by 18.58 and 2.83 respectively with diuron treatment, while S-metolachlor induced the photosynthetic gene d1, the mitochondrial metabolism genes cox1 and nad5 and the oxidative stress gene cat respectively by 6.31, 4.99, 5.08 and 86.57 (Table 1).

Fatty acid profiles

Variability of fatty acid profiles with time

During the seven days of culture without herbicides, changes in the fatty acid composition of diatoms were observed. At the beginning of the experiment (T0), G. gracile was composed mainly of seven fatty acids: EPA (26.17 ± 0.08 %); 16:1 (18.63 ± 0.18 %); 16:0 (17.57 ± 0.22 %); 16:3n4 (9.45 ± 0.06 %); 14:0 (7.14 ± 0.12 %); 18:1n9 (5.71 ± 0.12 %) and 20:4n6

(5.63 ± 0.01 %). At the end of the experiment (T7), the six major fatty acids were 20.5n3 (28.49 ± 0.53 %); 16:1 (18.21 ± 1.99 %); 16:0 (16.57 ± 0.50 %), 16:3n4 (11.16 ± 0.52 %); 14:0 (7.01 ± 0.33 %) and 20:4n6 (5.67 ± 0.27 %). The rest of fatty acids that were not described previously had content lower than 5 %.

The percentage in 16:0 and 18:1n9 significantly decreased (p-value < 0.05) respectively from 17.57 ± 0.22 % to 16.57 ± 0.50 % and from 5.71 ± 0.12 % to 3.11 ± 1.78 % between the beginning and the end of the experiment.

SFA were affected by the seven days of culture with a significant decrease (p-value < 0.05) in their percentage between T0 and T7 from 24.71 ± 0.32 % to 23.58 ± 0.48 %. In the same way, the percentage in MUFA significantly decreased (p-value < 0.05) between T0 and T7 from

Variability of fatty acid profiles with herbicide exposure

Under diuron treatment, the major fatty acid classes were HUFA (31.12 %); MUFA (28.84 %) (Figure 19) and the major fatty acids were EPA (24.88 %); 16:1 (20.64 %); 16:0 (14.97 %); 16:3n4 (12.73 %); 18:1n9 (8.20 %) and 14:0 (6.41 %) (Figure 20). Diuron significantly increased the percentage in MUFA from 21.32 % to 28.84 % and significantly decreased SFA and HUFA percentage from 23.58 % to 21.38 % and from 36.31 % to 31.12 %, respectively (Figure 19). Furthermore, a significant increase in the percentage of 18:1n9, 16:2n4 and 16:3n4 was noted between control and diuron conditions from 3.11 % to 8.20 %, from 3.51 % to 3.86 % and from 11.16 % to 12.73 %, respectively. A significant decrease in the percentage of 14:0, 16:0, 18:2n6, 18:4n3 and EPA was observed from 7.01 % to 6.41 %, from 16.57 % to 14.97 %, from 1.44 % to 0.29 %, from 0.56 % to 0 % and from 28.49 % to 24.88 %, respectively. Moreover, a non-significant decrease in the percentage of 22:5n3 and 22:6n3 was noted between control and diuron treatment from 1.85 % to 0.50 % and from 0.30 % to 0 %, respectively. Also, the percentage of 16:1 increased in a non-significant way from 18.21 % to 20.64 % (Figure 20).

Under S-metolachlor contamination, no significant impact was observed on fatty acid classes.

However, a significant increase in the percentage of 16:0 from 16.57 % to 17.25 % and a significant decrease in the percentage of 18:2n6, 18:4n3 and 20:4n6 from 1.44 % to 1.28 %, from 0.56 % to 0.52 % and from 5.67 % to 5.12 %, respectively, were observed (Figure 21).

Correlations between « classical descriptors » and fatty acid profiles

The results obtained at the end of the experiment (T7) for "classical descriptors" and fatty acid profiles were correlated using a Principal Component Analysis (Figure 22). Percentages of saturated (SFA) and highly unsaturated fatty acids (HUFA), photosynthetic activity (Photo_t7) and growth rate were positively correlated with the axis 1 while monounsaturated fatty acid (MUFA) was negatively correlated with this axis. Control and S-metolachlor treatments were correlated with the axis 1 while diuron treatment was negatively correlated with this axis.

These results permitted to conclude that: 1) SFA, MUFA HUFA, photosynthetic activity and growth rate was impacted by herbicide pollutions conversely to pigment contents; 2) Diuron seemed more impacted on "classical descriptors" previously mentioned, conversely to Smetolachlor; 3) Diuron seemed more toxic than S-metolachlor in this study. The three ellipses correspond to confidence ellipse at 95 %.

Discussion

"Classical descriptors"

With chemical contamination such as pesticides, reactive centers of diatom photosystems are saturated faster, and light is used less efficiently by diatoms. Therefore, potential damages and the physiological state of the organism can be reflected by the effective quantum yield [START_REF] Bonnineau | Light history modulates antioxidant and photosynthetic responses of biofilms to both natural (light) and chemical (herbicides) stressors[END_REF][START_REF] Coquillé | Use of diatom motility features as endpoints of metolachlor toxicity[END_REF][START_REF] Laviale | Effet des polluants sur les communautés périphytiques naturelles: Apport des mesures de fluorescence chlorophyllienne en lumiere modulée (PAM)[END_REF][START_REF] Moisset | Genetic and physiological responses of three freshwater diatoms to realistic diuron exposures[END_REF]. G. gracile cultures exposed to environmental concentration of diuron showed that this herbicide targets photosynthesis and thus cell development. [START_REF] Larras | The effect of temperature and a herbicide mixture on freshwater periphytic algae[END_REF] observed the sensitivity of benthic diatoms to diuron with an establishment of an EC50 value of 9.50 µg.L -1 based on the 96h growth rate of the population. Diuron acts by blocking electron transport between PSII and PSI and as a consequence, it is considered to be one of the most potent photosynthetic inhibitors [START_REF] Hall | An ecological risk assessment for the use of Irgarol 1051 as an algaecide for antifoulant paints[END_REF][START_REF] Thomas | Increased persistence of antifouling paint biocides when associated with paint particles[END_REF].

With S-metolachlor contamination, no impact was observed on photosynthetic activity of G.

gracile culture exposed to environmental concentrations. [START_REF] Coquillé | Use of diatom motility features as endpoints of metolachlor toxicity[END_REF] demonstrated the same result on photosynthetic activity of G. gracile with this pesticide at 1, 10 and 100 µg.L - 1 .

However, environmental concentration of S-metolachlor impacted growth rate of G. gracile.

Previous findings were obtained at 100 µg.L -1 of S-metolachlor [START_REF] Coquillé | Use of diatom motility features as endpoints of metolachlor toxicity[END_REF] and 5

and 30 µg.L -1 (Debenest et al., 2009a) of this pesticide. These observations can be explained by the target of S-metolachlor: Carder and Hoagland (1998) noted that chloroacetamides disrupt fatty acid synthesis and finally inhibit cell division. The inhibition of diatom cell division can result in a decrease of chlorophyll content (Debenest et al., 2009a).

In diatoms, pigment content is also an indicator of cell physiology: in order to estimate the influence of contaminants, many studies use pigment content as a biomarker [START_REF] Geoffroy | Effect of oxyfluorfen and diuron alone and in mixture on antioxidative enzymes of Scenedesmus obliquus[END_REF][START_REF] Teisseire | Effects of the fungicide folpet on the activities of antioxidative enzymes in duckweed (Lemna minor)[END_REF]. [START_REF] Silkina | Antifouling activity of macroalgal extracts on Fragilaria pinnata (Bacillariophyceae): a comparison with Diuron[END_REF] showed a decrease in pigment contents in the diatom Staurosirella pinnata under diuron at 1 mg.L -1 . The results of the present study showed the same observations for chlorophyll a content conversely to carotenoid content. The applied concentration, more environmentally realistic, was 100-fold lower than the abovementioned one and could explain this lack of carotenoid content decrease.

As found here, [START_REF] Coquillé | Use of diatom motility features as endpoints of metolachlor toxicity[END_REF] demonstrated a decrease in chlorophyll a content under Smetolachlor at 100 µg.L -1 .

It is also well-known that pesticides can provoke oxidative stress resulting in DNA breakage, mitochondrial and/or photosynthetic metabolism dysfunction and apoptotic mechanisms induction, leading to the death of the cell [START_REF] Fukuyama | Apoptosis in immunocytes induced by several types of pesticides[END_REF][START_REF] Rutherford | Herbicide-induced oxidative stress in photosystem II[END_REF][START_REF] Slaninova | Reviews Oxidative stress in fish induced by pesticides[END_REF].

ROS are one of the earliest responses to chemical stress. When present in low quantities, ROS are rapidly converted to a less reactive form [START_REF] Lauritano | Key genes as stress indicators in the ubiquitous diatom Skeletonema marinoi[END_REF]. In order to maintain healthy equilibrium of ROS, effective enzymatic mechanisms such as catalase (CAT) were developed by diatoms (Gonçalves et al., 2018a;Gonçalves et al., 2018b). However, at abnormally high quantities, they may provoke an alteration of the normal metabolism of the cell impacting nucleic acids, proteins and photosynthetic pigments resulting in an inactivation of enzymes, membrane damage and lipid peroxidation and affecting diverse physiological processes such as viability of cells [START_REF] Arora | Oxidative stress and antioxidative system in plants[END_REF][START_REF] Jaganjac | Pathophysiology of neutrophilmediated extracellular redox reactions[END_REF]. This could explain differences in results observed between diuron and s-metolachlor used at the same environmental concentration.

Under S-metolachlor contamination, photosynthetic defense mechanism (gene d1) seemed efficient since no impact was noted on photosynthetic activity: D1 protein activity was activated increasing PSII reaction centers and allowed countering toxicant effects of this pesticide. The induction of the genes cox1, nad5 suggests an increase of ATP production to counter the effects of a toxicant [START_REF] Kim Tiam | Development of q-PCR approaches to assess water quality: effects of cadmium on gene expression of the diatom Eolimna minima[END_REF], since these genes are involved in the functioning of the respiratory chain and PS II. Moreover, the increase in ATP demand linked to the significant decrease of growth rate in G. gracile suggests that energy in the cell was reallocated to detoxification mechanisms to fight against the molecular effects of S-metolachlor [START_REF] Kim Tiam | Morphological, physiological and molecular responses of Nitzschia palea under cadmium stress[END_REF].

However, G. gracile culture exposed to diuron showed a lower level of d1 and cat than those exposed at the same environmental concentration to S-metolachlor. The antioxidative defense mechanisms of G. gracile exposed to diuron seem to be not sufficiently effective to protect cells against ROS since, unlike the response with S-metolachlor, a decrease in photosynthesis was observed.

Fatty acid profiles

Variability of fatty acid profiles with time

Culture parameters are important to consider when analyzing biochemical composition of microalgae. It has been demonstrated in many studies that the percentage of fatty acid and particularly EPA content of algal strains is not only associated with heredity, but also influenced by different growing conditions [START_REF] Alonso | Isolation of clones of Isochrysis galbana rich in eicosapentaenoic acid[END_REF][START_REF] Reitan | Effect of nutrient limitation on fatty acid and lipid content of marine microalgae[END_REF][START_REF] Renaud | Effect of light intensity on the proximate biochemical and fatty acid composition of Isochrysis sp. and Nannochloropsis oculata for use in tropical aquaculture[END_REF][START_REF] Renaud | Effect of temperature on the growth, total lipid content and fatty acid composition of recently isolated tropical microalgae Isochrysis sp., Nitzschia closterium, Nitzschia paleacea, and commercial species Isochrysis sp. (clone T.ISO)[END_REF][START_REF] Tan | Screening of diatoms for heterotrophic eicosapentaenoic acid production[END_REF][START_REF] Teshima | Effects of water temperature and salinity on eicosapentaenoic acid level of marine Chlorella [Chlorella saccharophila[END_REF][START_REF] Thompson | Influence of irradiance on the fatty acid composition of phytoplankton 1[END_REF][START_REF] Yongmanitchai | Growth of and omega-3 fatty acid production by Phaeodactylum tricornutum under different culture conditions[END_REF] and by the growth stage of the algae [START_REF] Brown | Effects of harvest stage and light on the biochemical composition of the diatom Thalassiosira pseudonana[END_REF][START_REF] Chu | The fatty acid composition of three unicellular algal species used as food sources for larvae of the American oyster (Crassostrea virginica)[END_REF][START_REF] Fernández-Reiriz | Biomass production and variation in the biochemical profile (total protein, carbohydrates, RNA, lipids and fatty acids) of seven species of marine microalgae[END_REF]. In the present study, the fatty acid profile of G. gracile was modified with the sampling time, especially with a decrease of SFA and MUFA and an increase of PUFA and HUFA. Li et al. (2014b) noted this variability with the accumulation of neutral lipids rich in SFA (14:0, 16:0) and MUFA (16:1) during a stationary growth phase. These types of lipids are used to store excess carbon accumulated during photosynthesis. Since structural components are necessary for the growth, the surplus of neutral lipid accumulation was reduced in diatoms at the exponential growth phase. Finally the proportion of PUFA and HUFA, which are fatty acids of membrane lipids and structural components, are increased in diatoms during the exponential growth phase (Kates and Volcani, 1966a).

Concerning microalgae, it was noted that Cylindrotheca strains accumulated a high proportion of PUFA and HUFA at the exponential phase (29.5 %-42.9 %), particularly EPA and 20:4n6 (Ying et al., 2002). A study carried out on the diatom Thalassiosira pseudonana highlighted that the proportion of total lipid content was higher in the late stationary phase of the culture, whereas PUFA and HUFA decreased during this later phase or in the early stationary phase.

The proportion of PUFA and HUFA was higher in the exponential phase [START_REF] Brown | Effects of harvest stage and light on the biochemical composition of the diatom Thalassiosira pseudonana[END_REF].

Variability of fatty acid profiles with herbicide exposure

Numerous studies demonstrated that marine and freshwater microalgae confronted to acute exposition to pesticides (not only herbicides) responded by a modification of their fatty acid profiles with a decrease of PUFA and HUFA content, particularly EPA and PUFA with 18-C, such as linoleic acid (18:2), linolenic acid (18:3); but also, with an increase of MUFA content with palmitoleic acid (16:1) and oleic acid (18:1) [START_REF] Robert | Metolachlor-mediated selection of a microalgal strain producing novel polyunsaturated fatty acids[END_REF]Sicko-Goad et al., 1989a;Sicko-Goad et al., 1989b).

MUFA

The increase in the percentage of MUFA showed under diuron treatment can be explained by the inhibition of photosynthetic activity by this pesticide. Without stress factors and under normal growth conditions, ATP and NADPH, which are products of photosynthesis, are consumed to generate biomass. Various studies have highlighted that when photosystem II is altered and proliferation is finally inhibited because of stress factors such as a lack of nutrients, photoinhibition, or other sorts of damages, the major electron acceptor for photosynthesis can become depleted and NADPH is consumed in the biosynthesis of fatty acids. The cells deposit fatty acids in triacylglycerol (TAG), which are reserve lipids and contained majority of MUFA, because there is no need to produce new membrane compounds [START_REF] Converti | Effect of temperature and nitrogen concentration on the growth and lipid content of Nannochloropsis oculata and Chlorella vulgaris for biodiesel production[END_REF][START_REF] Hu | Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances[END_REF][START_REF] Thompson | Lipids and membrane function in green algae[END_REF]. Finally, higher neutral lipid content in algae can be a biological reaction to physiological stress and results observed in the present study are likely the result of a modification in lipid metabolism from the synthesis of membrane lipids to storage of neutral of malonyl-CoA and acyl-CoA to produce CO2 and 3-ketoacyl-CoA and impacts fatty acid elongase (FAE) in Melosira cf. moniliformis with the decrease of the fatty acid content of 18:0, 18:1n9, 18:4 and 20:5 [START_REF] Thakkar | Comparative responses of two species of marine phytoplankton to metolachlor exposure[END_REF]. The marine diatom Melosira cf. moniliformis contains a FAE-type that converts 16:0-ACP into 18:0-ACP (ACP: Acyl Carrier Protein is an important compound in the process of fatty acid synthesis (Berg et al., 2008)), and 18:1 acid is then produced by n9-desaturation. Moreover, the inhibition of n3 and n6-desaturation induces a decrease of linoleic and linolenic acids content in diatoms (Filimonova et al., 2016b). In order to confirm these hypotheses, it could be relevant to contrast genetic responses of desaturase and elongase genes at the same time.

Fatty acid relevance as biomarker of water contamination

Complementarity between "classical descriptors" and fatty acid profiles

The induction of the oxidative stress gene cat under diuron treatment suggests that alteration of HUFA content synthesis may be related to ROS production. To respond to oxidative stress, cells can activate enzymatic antioxidants including catalase (CAT), but when antioxidative defenses fail, HUFA are attacked by the free radicals on their bisallylic site resulting in lipid peroxidation [START_REF] Maronić | S-metolachlor promotes oxidative stress in green microalga Parachlorella kessleri-A potential environmental and health risk for higher organisms[END_REF]. Conversely, with S-metolachlor the gene cat was induced much more importantly than diuron and as a consequence HUFA are less impacted, even not impacted. Thus, this response could be explained by the efficiency of the antioxidant mechanism.

Studies on higher plants showed that fatty acids impacted by the organic and inorganic contaminants were the most unsaturated fatty acids and were those present in the chloroplast lipids and necessary for photosynthetic activity. Reductions of these lipids resulted in the dismantling of the photosynthetic membranes and prevented PSI and PSII activity [START_REF] Kobayashi | Role of membrane glycerolipids in photosynthesis, thylakoid biogenesis and chloroplast development[END_REF]. It was shown in the literature that the fatty acids 18:4 and 20:5 were mainly linked with MGDG (monogalactosyldiacylglycerol) and DGDG (digalactosyldiacylglycerols), which are mostly chloroplastic lipids (80 %) [START_REF] Nakamura | Lipids in plant and algae development[END_REF][START_REF] Zulu | Current trends to comprehend lipid metabolism in diatoms[END_REF], which can explain the decline of these fatty acids along with photosynthesis in this study. Finally, a decrease in photosynthesis leads to a reduction of the growth rate, that it is consistent with the ACP results in this study. The decrease of photosynthesis activity despite the induction of d1 gene under diuron treatment could be explained previous by the decrease of HUFA content.

Photosynthetic yield was not impacted by S-metolachlor and this might be the result of the efficiency of the d1 gene against contaminant exposure but also due to very low effect observed on HUFA.

The growth rate was damaged under S-metolachlor treatment but in lower proportion than under diuron stress; it could be explained by the induction of mitochondrial metabolism genes and, at the same time, by the very low effect on HUFA which are membrane structure compounds needful for diatom growth.

Finally, S-metolachlor contamination seemed to be less toxic than diuron at the same environmental concentration. Several hypotheses can be formulated: 1) contrary to other studies, the herbicide was applied alone and without adjuvant, making the toxicity of compounds lower in the present case. Filimonova et al. (2016b) studied the impact on the marine diatom Thalassiosira weissflogii of the commercial compound Primextra® Gold TZ, which is produced by Syngenta AG and is made-up of two main active ingredients: 17.75 % (w/w) of terbuthylazine (TBA) and 30.2 % (w/w) of S-metolachlor; 2) the applied concentration was 10 µg.L -1 , a much lower concentration compared to other studies enabling the defense mechanisms to be efficient. For example, [START_REF] Robert | Metolachlor-mediated selection of a microalgal strain producing novel polyunsaturated fatty acids[END_REF] studied the impact of metolachlor but the concentrations applied were 5.7; 7.09 and 8.5 mg.L -1 ; 3) the high concentrations of nutrients provided by the Dauta medium may have stimulated diatoms metabolism and masked, at least partially, pesticide toxicity (Guasch et al., 1998;[START_REF] Guasch | Phosphate limitation influences the sensitivity to copper in periphytic algae[END_REF]; 4) the species G.

gracile is less sensitive than those used in the previous studies. [START_REF] Wood | How benthic diatoms within natural communities respond to eight common herbicides with different modes of action[END_REF] showed that the mode of action of herbicide did not change the most sensitive benthic diatom response used in their study, except for G. gracile. In fact, G. gracile was the third most sensitive to the PSII inhibitors but was ranked as less sensitive to herbicide with another mode of action. [START_REF] Larras | Using bioassays and species sensitivity distributions to assess herbicide toxicity towards benthic diatoms[END_REF] reported the same results: PSII inhibitors are more phytotoxic to diatoms than herbicides with other modes of action. In the current study, the finding of diuron being more toxic than S-metolachlor could so be an artefact of the test organism G. gracile.

Finally and according to the results of the PCA analysis, it was shown that fatty acid profiles provide complementary information of herbicide pollution compared to pigment content responses where no impacts were found. Conversely, fatty acid profile responses were correlated with photosynthesis and growth rate responses. However, fatty acid profiles give supplementary information of mode of action of herbicide with especially induction of ROS species, conversely to growth rate and photosynthesis descriptors.

Ecological relevance of fatty acid profiles

Fatty acid profiles analyses were often used to identify relationships in trophic chain [START_REF] Allan | Determining spatial changes in the diet of nearshore suspension-feeders along the South African coastline: Stable isotope and fatty acid signatures: Estuarine[END_REF]El-Sabaawi et al., 2009;[START_REF] Kelly | Fatty acids as dietary tracers in benthic food webs[END_REF][START_REF] Van Den Meersche | Autochthonous and allochthonous contributions to mesozooplankton diet in a tidal river and estuary: Integrating carbon isotope and fatty acid constraints[END_REF].

HUFA and especially EPA are necessary in the health and function of all animals at all trophic levels, including plankton invertebrates, fish and humans. Animals are able to convert one form of HUFA to another using elongation and desaturation process but very few can synthesize HUFA de novo [START_REF] Brett | The role of highly unsaturated fatty acids in aquatic foodweb processes[END_REF]. Moreover, it was shown in the literature that Bacillariophyceae as diatoms had high contents of EPA and thus were excellent quality food resources for zooplankton [START_REF] Taipale | Fatty acid composition as biomarkers of freshwater microalgae: analysis of 37 strains of microalgae in 22 genera and in seven classes[END_REF].

However, lipid components and fatty acid profiles are very sensitive to stressors and environmental modifications [START_REF] Arts | Lipids in Aquatic Ecosystems[END_REF]. Filimonova et al. (2016b) noted modifications in the FA profiles of the primary producer T. weissflogii and primary consumers A. tonsa and A. franciscana under Primextra® herbicide treatment with the increase of SFA and decrease of PUFA and especially HUFA contents. Thus, it was suggested that pesticide could affect the nutritive value of primary producers and primary consumers impacting the entire trophic chain.

Conversely to "classical descriptors", FA profiles could provide information of nutritional quality of diatom. In the way where diuron decreased HUFA and especially EPA content of G.

gracile, it could be decreased the nutritional quality of G. gracile and consequently the trophic chain could be impacted, conversely to S-metolachlor where no impact where found on EPA.

In this context, it could be pertinent in future studies to explore the impact of diuron and Smetolachlor at the same concentration on fatty acid profiles of a consumer of G. gracile contaminated by trophic and direct ways.

In summary, while pigment content did not capture pesticide effects at environmentally realistic concentrations, a combination of classical endpoints such as photosynthesis or growth rate reduction and FA profiles is recommended for future studies. The latter endpoints were able to capture pesticide effects on diatoms, with FA profiles yielding additional information on the underlying mode of action (e.g. ROS formation) and the ecological relevance (e.g. trophic impact) of pesticide pollution.

Conclusions

The impact of diuron and S-metolachlor at 10 µg.L -1 was investigated on the freshwater diatom G. gracile. At the same concentration, these two pesticides had different effects on "classical descriptors" of G. gracile. Fatty acid profiles of G. gracile were also affected by these two pesticides, with a considerably stronger response to diuron, suggesting that this pesticide was Table 2 : SI.1 -Mean (± SE) concentration of nitrates (NO3 -), orthophosphates (PO4 -) and silicates (Si) at the beginning (T0) and the end (T7) of the experiment using the taxon Gomphonema gracile in control, diuron and S-metolachlor-treated conditions (n = 4). 1 indicates significant differences between T0 and T7, 2 indicates significant differences between control and contaminated conditions (p-value < 0.05).

SI 2 : Pesticide analyses SI 2-1 : Pesticide analyses protocol

Pesticide analyses were carried out at 4 different times during the experiment: T0, T1, T3 and T7. One milliliter and a half of water was collected for dissolved S-metolachlor and diuron analyses in order to assess real pesticide concentration exposure. A filtration of samples was performed with syringe filters in regenerated cellulose (Spartan®13 mm diameter, pore size 0.45 µm, Whatman®) before storing them in a freezer until HPLC-ESI-MS/MS analyses were performed. Samples were defrosted at room temperature and then preconcentrated 2-fold (evaporation of the 1-mL sample using a RapidVap system and reconstitution of the residue in a 90/10 (v/v) mixture of ultrapure water and acetonitrile before the chromatographic analyses).

Chromatographic separation was carried out with a Gemini-NX C18 3 μm, 110 A, 100 mm×2 mm column equipped with a SecurityGuard from Phenomenex (Le Pecq, France)

and an HPLC Ultimate 3000 (DIONEX, Voisins-le-Bretonneux, France). Quantification was achieved with a triple quadrupole mass spectrometer API 2000 (AB SCIEX, Les Ulis, France).

Sample injection volume was 50 μL. The two eluents were acetonitrile and ultrapure water with 5 mM ammonium acetate at a constant flow rate of 400 μL.min -1 .

SI 2-2 : Pesticide concentration results

Due to analytical problems we were not able to confirm undoubtedly the pesticides concentrations of exposure. However previous experiments with the same protocol have shown a good agreement between exposure (nominal) and measured concentrations (e.g. Coquillé et al. 2018). Interspecific variability in diatom responses to herbicide exposure from molecular to populational scales.

SI 3 : Genetic analyses

Graphical abstract

Highlights

• Interspecific variability of diatom response to herbicides was studied.

• Diuron seems to be more toxic than S-metolachlor at an environmentally realistic concentration.

• Diuron induced global impacts on photosynthesis for both species.

• The two diatoms seemed to have different strategies to counteract toxic effects.

• 18:1n9, 18:4n3 and 20:5n3 fatty acids could be potential biomarkers of diuron pollution.

Introduction

Fatty acids (FA) are important molecules for diatoms particularly for the fluidity, production and permeability of cell membranes. They are the main components of lipids which play numerous roles in the cell and are the principal form of stored energy and major constituents of cellular membranes [START_REF] Pasquaud | Facing the necessity of describing estuarine ecosystems: a review of food web ecology study techniques[END_REF]. Indeed, fatty acids are used as fuel in all metabolic systems for all organisms, having an important role in physiological responses [START_REF] Arts | Lipids in Aquatic Ecosystems[END_REF]. For example, saturated and monounsaturated fatty acids (SFA and MUFA) are the principal form of stored energy [START_REF] Olofsson | Seasonal variation of lipids and fatty acids of the microalgae Nannochloropsis oculata grown in outdoor large-scale photobioreactors[END_REF], while polyunsaturated fatty acids (PUFA with > 1 double bonds) and highly unsaturated fatty acids (HUFA with ≥ 20 carbons and ≥ 3 double bonds) are major components of cellular membranes with an important role in the regulation of membrane fluidity [START_REF] Brett | The role of highly unsaturated fatty acids in aquatic foodweb processes[END_REF]. PUFA and HUFA, especially the 18:4 and 20:5 fatty acids, are mainly linked with MGDG (monogalactosyldiacylglycerol) and DGDG (digalactosyldiacylglycerol). These lipids are mostly chloroplastic lipids (80 %) associated with photosynthetic activity [START_REF] Nakamura | Lipids in plant and algae development[END_REF][START_REF] Zulu | Current trends to comprehend lipid metabolism in diatoms[END_REF].

The fatty acid profiles of diatoms are clearly distinguishable from those of other microalgal groups. The fatty acid fingerprints of diatoms have higher contents of 16:2n4, 16:3n4 and 16:4n1 compared with that in other microalgal groups [START_REF] Ying | Total lipid and fatty acid composition of eight strains of marine diatoms[END_REF]. Almost all diatoms contain high proportions of 14:0, 16:0, 16:1n7 and 20:5n3 (EPA: eicosapentaenoic acid) fatty acids. PUFA and HUFA with 18 and 22 carbons are minor constituents compared to other microalgae [START_REF] Volkman | Fatty acid and lipid composition of 10 species of microalgae used in mariculture[END_REF].

In France herbicides are easily detected in waterways due to agricultural activity and rivers are frequently contaminated by these chemicals [START_REF] Soes | Les pesticides dans les cours d'eau français en[END_REF]. It has been shown in the literature that herbicide pollution can impact the differential gene expressions of diatoms. The following genes; mitochondrial metabolism genes (cox1: cytochrome C oxidase subunit I, 12S: mitochondrial ribosomal RNA 12S and nad5: NADH dehydrogenase subunit 5), photosynthetic activity genes (d1: D1 protein and psaA: PsaA protein), oxidative stress response genes (cat: catalase and gpx: glutathione peroxidase) and a frustule synthesis gene (sil1:silaffin-1 protein) were early and sensitive biomarkers of toxicant exposure [START_REF] Kim Tiam | Development of q-PCR approaches to assess water quality: effects of cadmium on gene expression of the diatom Eolimna minima[END_REF][START_REF] Moisset | Genetic and physiological responses of three freshwater diatoms to realistic diuron exposures[END_REF][START_REF] Kim Tiam | Morphological, physiological and molecular responses of Nitzschia palea under cadmium stress[END_REF]. Their fatty acid profiles were also shown to be especially impacted by a decrease of HUFA under diuron exposure at high [START_REF] Troton | Modifications of thylakoid lipids in Euglena gracilis during diuron-adaptation[END_REF] and environmental concentrations [START_REF] Demailly | Impact of diuron and S-metolachlor on the freshwater diatom Gomphonema gracile: Complementarity between fatty acid profiles and different kinds of ecotoxicological impact-endpoints[END_REF]; and under S-metolachlor at environmental concentrations [START_REF] Demailly | Impact of diuron and S-metolachlor on the freshwater diatom Gomphonema gracile: Complementarity between fatty acid profiles and different kinds of ecotoxicological impact-endpoints[END_REF]Filimonova et al., 2016b). And finally their physiology and growth were also modified [START_REF] Kim Tiam | Development of q-PCR approaches to assess water quality: effects of cadmium on gene expression of the diatom Eolimna minima[END_REF][START_REF] Moisset | Genetic and physiological responses of three freshwater diatoms to realistic diuron exposures[END_REF][START_REF] Kim Tiam | Morphological, physiological and molecular responses of Nitzschia palea under cadmium stress[END_REF]. Diuron is an herbicide which is included in the priority pollutant list of the EU Water Framework Directive (European Commission, 2000). This herbicide is known to generate reactive oxygen species (ROS) that impact proteins, nucleic acids and lipid content [START_REF] Geoffroy | Effect of oxyfluorfen and diuron alone and in mixture on antioxidative enzymes of Scenedesmus obliquus[END_REF] and can also inhibit polyunsaturated fatty acid synthesis by the inhibition of the desaturation process [START_REF] Troton | Modifications of thylakoid lipids in Euglena gracilis during diuron-adaptation[END_REF]. However, its main mode of action is the inhibition of PSII, preventing oxygen production by inhibiting the photosynthetic electron transport chain [START_REF] Rutherford | Herbicide-induced oxidative stress in photosystem II[END_REF].

Herbicides belonging to the chloroacetamide family, especially metolachlor, are also found in watercourses. Its active enantiomer is S-metolachlor and is potentially dangerous to the environment, especially to aquatic ecosystems [START_REF] Liu | A comparative study of rac-and S-metolachlor toxicity to Daphnia magna[END_REF]. Its toxicity is linked to the oxidation of cell components, increasing the production of ROS and setting off lipid peroxidation [START_REF] Maronić | S-metolachlor promotes oxidative stress in green microalga Parachlorella kessleri-A potential environmental and health risk for higher organisms[END_REF]. Its main mode of action, however, is the inhibition of elongases, which are enzymes responsible for the elongation of very long-chain fatty acids (VLCFAs) [START_REF] Trenkamp | Specific and differential inhibition of verylong-chain fatty acid elongases from Arabidopsis thaliana by different herbicides[END_REF]) such as PUFAs and HUFAs. It has also been shown that Smetolachlor inhibits the synthesis of chlorophyll and finally, the growth of organisms [START_REF] Coquillé | Use of diatom motility features as endpoints of metolachlor toxicity[END_REF].

Numerous studies have shown that the sensitivity of freshwater benthic diatoms to herbicides differed between taxa based on biomarkers such as gene expressions [START_REF] Moisset | Genetic and physiological responses of three freshwater diatoms to realistic diuron exposures[END_REF] through to diatom growth [START_REF] Larras | Using bioassays and species sensitivity distributions to assess herbicide toxicity towards benthic diatoms[END_REF][START_REF] Roubeix | Variations of periphytic diatom sensitivity to the herbicide diuron and relation to species distribution in a contamination gradient: implications for biomonitoring[END_REF][START_REF] Wood | How benthic diatoms within natural communities respond to eight common herbicides with different modes of action[END_REF].

However, to our knowledge, scarce studies have focused on the interspecific variability of freshwater diatom responses to herbicide contamination on complementary endpoints ranging from molecular to populational levels, in particular considering their fatty acid profiles.

In this context, this study aimed: 1) to evaluate the interspecific variability of two freshwater diatom species in response to herbicide contamination on "classical" descriptors such as growth rate, cellular concentration, photosynthetic activity and pigment concentrations and to estimate the subsequent induction or repression of genes (cox1, nad5, 12s, d1, psaA, cat, gpx and sil1) known to be putatively differentially expressed during herbicide exposure; 2) to investigate the interspecific variability on fatty acid profiles of two freshwater diatom species with and without contamination; and finally 3) to compare the defense mechanisms of two freshwater diatom species against diuron and S-metolachlor.

Materials and methods

To answer these questions, two model freshwater diatoms, Gomphonema gracile and Nitzschia palea, were exposed to two herbicides, diuron and S-metolachlor, at a high environmental concentration (10 µg.L -1 ) over seven days at 20.5°C. Herbicide effects on diatoms were evaluated with biological parameters and the chemical changes in microcosms were analyzed using nutrient concentrations (nutrient protocol and results, fatty acids percentages and pigment contents results at T0 are presented in Supporting Information 1).

In this study, the growth rate, photosynthetic activity, genetic responses and pigment contents were considered as "classical descriptors".

Diatom cultures

The two cultures of freshwater diatoms were non axenic. They were cultured in sterile Dauta medium [START_REF] Dauta | Conditions for phytoplankton development, a comparative study of the behaviour of eight species in culture. I. Determination of growth parameters in relation to light and temperature[END_REF] at 20.5°C in a thermostatic chamber 610 XAP (LMS LTD®, UK) at 45 µmol photons.m -2 .s -1 with a dark: light cycle of 8:16h. Every week, the cultures were renewed with a new sterile Dauta medium for the purpose of keeping diatoms in an exponential growth phase.

Gomphonema gracile Ehrenberg, 1838

G. gracile is a benthic pennate diatom of the Bacillariaceae family and is found in biofilm in slightly acidic waters [START_REF] Germain | Flore des diatomées : eaux douces et saumâtres[END_REF]. This diatom is considered to be sensitive to macropollutants as described in the Indice de Polluosensibilité Spécifique [START_REF] Cemagref | Etude des Méthodes Biologiques Quantitatives d'appréciation de la qualité des eaux -Rapport Division Qualité des Eaux Lyon[END_REF].

The G. gracile culture was isolated in December 2013 from a field sample (collected from the Leyre river, the main tributary of Arcachon Bay, South West France) by micromanipulation under an inverted microscope [START_REF] Coquillé | Use of diatom motility features as endpoints of metolachlor toxicity[END_REF].

Nitzschia palea (Kützing) Smith, 1856

N. palea is a pennate benthic diatom of the Bacillariaceae family. N. palea is frequently found in watercourses and is described as relatively tolerant to herbicides [START_REF] Larras | Using bioassays and species sensitivity distributions to assess herbicide toxicity towards benthic diatoms[END_REF][START_REF] Moisset | Genetic and physiological responses of three freshwater diatoms to realistic diuron exposures[END_REF].

The freshwater lotic strain used in this experiment was provided by the Thonon Culture collection (strain reference number TCC583).

Experimental design

One week before contamination, round borosilicate 100 mL sterile glass flasks were heated at 550 °C for 5h. Glass flasks were inoculated with 40 mL of Dauta culture medium and 40 mL of stock culture in exponential growth phase. This step was carried out in order to adapt the culture to the glass flasks and lasted 7 days. After these 7 days of adaptation and on the first day of contamination (total of 7 days of contamination), glass flasks were inoculated at 300,000 cell.mL -1 with Dauta medium and adapted cultures in exponential growth phase (total volume = 80 mL).

For each herbicide, a stock solution of 1mg.L -1 was prepared from ultrapure Milli-Q water and herbicides: in the form of a 98 % purity liquid for S-metolachlor and in the form of powder with a purity of 98.8 % for diuron (CAS number: 330-54-1).

Since the solubility in water of the diuron was low, 42 mg.L -1 at 25 °C, the solution was sonicated and then heated in order to solubilize the powder in water. The solubility of Smetolachlor in water was of 490 mg.L -1 at 25 °C, so this solution was prepared in an ordinary manner by diluting the herbicide in ultrapure Milli-Q water.

The solutions being prepared in ultrapure Milli-Q water, these were prepared the day before the experiment and stored in the dark at 4 °C. Finally, three treatments were achieved: a control treatment with no herbicide contamination and two herbicide conditions: 1) diuron and 2) Smetolachlor, both at 10 µg.L -1 concentration. Controls and herbicide conditions were produced in quadruplicate. Table 4 : Ten genes studied in this experiment and their associated functions.

Gene name (abbreviations) Function

Fatty acid profiles

Twenty milliliters of each condition were sampled at T7 and centrifuged at 1,500 g for 5 min in order to remove medium culture samples. One milliliter of methanol containing 2.5 % H2SO4 (v/v) was added to the pellet. The fatty acid methyl esters (FAMEs) were obtained following the protocol described by Le [START_REF] Le Guédard | Development of a biomarker for metal bioavailability: the lettuce fatty acid composition[END_REF].

FAMEs separation was performed with gas chromatography (Agilent 7890A) on a DB-WAX column (15 m x 1 µm x 0.53 mm, Agilent) and with flame ionization detection. The temperature of the oven was 150 °C during 1 min, followed by a 5 °C.min -1 ramp up to 230 °C. This last temperature was maintained for a further 8 min (total run time = 25 min).

Pigment contents

At T7, an aliquot of 20 mL (T0) and approximately 10 mL (T7) of each sample were filtered on Whatman® GF/C filters and frozen at -20 °C until analysis of chlorophyll a and carotenoid contents.

Samples were defrosted at room temperature and 10 mL of 80 % acetone (v/v) were added.

Each tube was wrapped with aluminum foil and shaken before being placed in a beaker containing water and sonicated for 20 minutes. Each tube was stored for 10 min in the dark and was then filtered on Whatman® GF/C filters. The filters were recovered from the filter cone.

The tubes were rinsed with 80 % acetone (v/v) and the filters were pressed. After that, the filtrates were collected in the initial tube and the final volume was noted.

Chlorophyll a concentrations were determined with a Shimadzu UV-1800 spectrophotometer (Shimadzu Inc., Kyoto, Japan). Absorbance measurements were determined using the following wavelengths: 470 nm, 663.2 nm and 648.8 nm.

Chlorophyll a and carotenoid concentrations were calculated using Lichtenthaler equations [START_REF] Lichtenthaler | Determinations of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in different solvents[END_REF] and expressed as milligrams per liter (mg.L -1 ).

Photosystem II effective quantum yield

The PSII effective quantum yield (Φ'M) was established every day by Pulse-Amplitude Modulated (PAM) fluorescence using a PHYTO-PAM (Heinz Walz, GmbH, Germany) with an emitter-detector unit (PHYTO-ED). The "brown algae" mode was employed. Measurements were performed in 1-cm wide quartz cuvettes on 2 mL aliquots of diatom culture. Five measurements were achieved for all replicates of each condition every day of the experiment.

Growth rate

Every day of the experiment, 1 mL of each sample was fixed in Lugol's preservative (4 %) and stored at 4 °C until the determination of the cellular concentration of diatoms. Cell density was determined by counting using a Nageotte counting chamber (Marienfield, Germany) and following the following protocol: 1) Each fixed sample was homogenized with a vortex and 125 μL of sample was dropped into the counting chamber; 2) The number of cells was noted in ten fields of counting area (1.25 μL each, 0.5 mm depth) under light microscopy. The distinction between live and dead organisms was estimated by the observation of the color of the chloroplasts and by the observation of their turgescence [START_REF] Morin | Recovery potential of periphytic communities in a river impacted by a vineyard watershed[END_REF]; 3) Cellular concentration was expressed as the number of individuals per milliliter; 4) Average growth rates of live organisms were calculated to optimally fit the daily counting over the exponential growth phase, as the slope of the regression line of Ln (cell.mL -1 ) over time (days). Control values are therefore control slopes.

Statistical analysis

In order to detect significant differences between: 1) the control treatment and herbicideexposed cultures at T7; and 2) the N. palea and G. gracile conditions at T7; a non-parametric Wilcoxon-Mann-Whitney test was performed using stats package, due to the non-normal distribution of the data (with a p-value < 0.05 considered as statistically significant).

For the purpose of highlighting correlations between different variables, Principal Component Analysis (PCA) was established using tidyverse, ade4, FactoMineR and factoextra packages.

In order to show significant difference between groups of individuals, a PERMANOVA test was performed (with a p-value < 0.05 considered as statistically significant) using vegan and devtools packages and six confidence ellipses were represented on the PCA plot.

All statistical analyses were carried out with the R studio software (RStudioTeam, 2016).

Results

Biological parameters

Genetic analysis

The results of the expression of the gpx and sil1 genes were not exploitable in this study due to an analytical problem.

Diuron treatment induced the photosynthetic gene d1 in both species, with a value of 18.58 for G. gracile and 19.48 for N. palea (Table 5). The mitochondrial metabolism gene nad5 was induced (2.83) in N. palea but not in G. gracile, where the differential expression was similar to the control treatment (Table 5). The cat gene was overexpressed in both species with a significantly (p < 0.05) higher expression in N. palea (25.14) than in G. gracile (2.83) (Table 5).

S-metolachlor induced the cat gene for both species with a significantly (p < 0.05) higher gene induction in N. palea (333) than in G. gracile (86.57) (Table 5). The d1 gene was overexpressed in G. gracile (6.31), while no effect was noted for N. palea (Table 5). An induction was observed for psaA (3.14) in N. palea, whereas no effect was found for G. gracile (Table 5).

Repression of the cox1 (0.22) and nad5 (0.13) genes was noticed in N. palea, whereas an induction was observed in G. gracile (4.99 and 5.08, respectively) (Table 5).

Fatty acid profiles

In control treatments (T7), the three major fatty acids in both species were EPA (G. gracile:

28.49 ± 0.53 %; N. palea: 27.14 ± 1.16 %), 16:1 (G. gracile: 18.21 ± 1.99 %; N. palea: 25.03 ± 1.79 %), and 16:0 (G. gracile: 16.57 ± 0.50 %; N. palea: 16.80 ± 0.25 %) (Table 6). Both species had a similar content of 16:0, 18:1n9, 18:3n3, 20:5n3 (EPA) and PUFA class (Table 6).

However, G. gracile had a significantly (p < 0.05) higher proportion of 14:0, 16:3n4, 20:4n6, SFA and HUFA classes, and a significantly lower proportion of 16:1, 16:2n4, 16:4n1, 22:6n3 With S-metolachlor contamination, no significant difference was found compared to the controls in carotenoid concentrations of the two studied species. Similarly, no significant difference was observed compared to the controls in chlorophyll a concentration of N. palea, while a significant decrease (p < 0.05) was observed (47.58 ± 12.64 % of the controls) for G. gracile.

Photosynthesis

At T7 and in the control treatments, N. palea and G. gracile samples had a similar effective quantum yield with values of 0.52 ± 0.01 and 0.55 ± 0.02, respectively.

Under diuron contamination, the effective quantum yield significantly decreased in the two species: by 49.33 ± 1.12 % from the controls for N. palea and by 26.57 ± 2.91 % from the controls for G. gracile (p < 0.05). Thus, the effective quantum yield of N. palea diuron samples was significantly lower (p < 0.05) compared to G. gracile diuron samples.

With S-metolachlor contamination, no significant difference was found between the control and contaminated treatments in the effective quantum yield of the two studied species.

Growth rate

In the control treatments, N. palea and G. gracile had a similar growth rate with a value of 0.16 ± 0.04 div.day -1 for N. palea and 0.11 ± 0.02 div.day -1 for G. gracile.

With diuron contamination, no significant difference was noted in the growth rate of N. palea, whereas a significant decrease (p < 0.05) in the growth rate of G. gracile was found (by 84.32 ± 25.03 % from the controls).

With S-metolachlor contamination, no significant difference was found between the control and contaminated treatments in the growth rate of N. palea, whereas a significant decrease (p < 0.05) of 29.64 ± 17.59 % from the controls was observed for G. gracile.

Comparison between G. gracile and N. palea responses

"Classical descriptors" and fatty acid profiles were correlated using Principal Component Analysis (Figure 23). The first dimension (Dim1 on the plot) opposed N. palea cultures (individuals NPALCtrl, NPALDiu and NPALSm) containing more 16:1, 16:2n4, 16:4n1 and DHA and G. gracile cultures (individuals GGRACtrl, GGRADiu and GGRASm) containing more 20:4n6, 14:0, 16:3n4.

Photosynthetic activity at T7, percentage of 20:5n3 (EPA) and 18:4n3 were positively correlated with the second dimension (Dim2 on the plot) and negatively correlated with the percentage of the fatty acid 18:1n9. Moreover, both diatom groups contaminated with diuron (GGRADiu and NPALDiu) were separated along the second axis from the control (GGRACtrl, NPALCtrl) and the S-metolachlor treatments (GGRASm, NPALSm) (Figure 23). The cultures exposed to S-metolachlor did not differ much from their respective controls.

The samples contaminated with diuron could be discriminated, with a decrease in the percentage of 20:5n3 (EPA), 18:4n3 and photosynthetic activity at T7 and an increase in the 18:1n9 percentage. The six ellipses correspond to confidence ellipses at 95 %.

Discussion

Interspecific variability of fatty acid profiles without contamination

Numerous studies have shown different fatty acid profiles between diatom species [START_REF] Boelen | On the potential application of polar and temperate marine microalgae for EPA and DHA production[END_REF][START_REF] Dunstan | Essential polyunsaturated fatty acids from 14 species of diatom (Bacillariophyceae)[END_REF][START_REF] Pratoomyot | Fatty acids composition of 10 microalgal species[END_REF][START_REF] Ying | Total lipid and fatty acid composition of eight strains of marine diatoms[END_REF] and different EPA and DHA content between and within algal classes [START_REF] Brown | Nutritional value and use of microalgae in aquaculture: Avances en Nutrición Acuícola VI[END_REF][START_REF] Guschina | Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae[END_REF][START_REF] Lv | Variations in lipid yields and compositions of marine microalgae during cell growth and respiration, and within intracellular structures[END_REF]. [START_REF] Dunstan | Essential polyunsaturated fatty acids from 14 species of diatom (Bacillariophyceae)[END_REF] observed different fatty acid profiles according to the considered diatom species, especially with the tropical species Fragilaria pinnata which lacked both 22:5n6 and DHA. The major HUFA in C-22 were the presumed precursors of these HUFA, 22:4n6 (0.2 %) and 22:5n3 (1 %).

In the current study, N. palea culture was made-up of a higher proportion of DHA than G.

gracile culture. DHA is an essential omega-3 fatty acid with a major role in the maintenance of cell membrane fluidity and is nutritionally important for food webs [START_REF] Nichols | Polyunsaturated fatty acids in Antarctic bacteria[END_REF][START_REF] Nishida | Chilling sensitivity in plants and cyanobacteria: the crucial contribution of membrane lipids[END_REF]. This is reflected in other marine studies that Nitzschia sp was madeup of a higher proportion of DHA compared to other species [START_REF] Pratoomyot | Fatty acids composition of 10 microalgal species[END_REF][START_REF] Ying | Total lipid and fatty acid composition of eight strains of marine diatoms[END_REF]. Moreover, N. palea was made-up in lower proportions of 18:4n3, 20:4n6 and 22:5n3, compared to G. gracile.

Finally, N. palea seemed to have a different functioning in its synthetic route of fatty acids which could be explained by a different functioning of the delta 4 desaturase since it is the enzyme that contributes to the synthesis of DHA [START_REF] Dunstan | Essential polyunsaturated fatty acids from 14 species of diatom (Bacillariophyceae)[END_REF].

Contrasted toxicity responses between herbicide treatments

Table 7 summarizes the principal results of the current study, for both diatom species exposed to herbicides, compared to control treatment at T7.

ROS toxicity on gene expression, fatty acids and pigment contents

It was shown in the literature that reactive oxygen species are one of the earliest impacts of contamination stress [START_REF] Liu | Enantioselective oxidative stress and oxidative damage caused by Rac-and S-metolachlor to Scenedesmus obliquus[END_REF]. ROS are rapidly converted to a less reactive form when they are present in low quantities [START_REF] Lauritano | Key genes as stress indicators in the ubiquitous diatom Skeletonema marinoi[END_REF]. However, when they are present in abnormally high quantities ROS may provoke an alteration of the normal metabolism of the cell [START_REF] Jaganjac | Pathophysiology of neutrophilmediated extracellular redox reactions[END_REF].

To respond to oxidative stress, cells can activate enzymatic antioxidants including cat but when antioxidative defenses fail, PUFA and HUFA in organisms are attacked by the free radicals on their bisallylic site resulting in lipid peroxidation [START_REF] Maronić | S-metolachlor promotes oxidative stress in green microalga Parachlorella kessleri-A potential environmental and health risk for higher organisms[END_REF]. Thus, although the induction of the oxidative stress gene cat took place in the two species, the alteration of fatty acids 18:4n3, EPA and HUFA content suggested that diuron-induced production of ROS were not sufficiently contained (Table 7).

In diatoms, pigment content is used as an indicator of cell physiology and as a biomarker of pesticide contaminations [START_REF] Geoffroy | Effect of oxyfluorfen and diuron alone and in mixture on antioxidative enzymes of Scenedesmus obliquus[END_REF][START_REF] Teisseire | Effects of the fungicide folpet on the activities of antioxidative enzymes in duckweed (Lemna minor)[END_REF]. One of the main biological functions of carotenoids is protection against ROS, carried out by quenching of singlet oxygen and the excited states of photosensitizing molecules, and by the scavenging of free radicals [START_REF] Domonkos | Carotenoids, versatile components of oxygenic photosynthesis[END_REF]. In the G. gracile culture, no impact on carotenoid content was noted under diuron treatment, contrary to the N. palea culture, confirming that the neutralization of ROS was less efficient in the latter. However, it is interesting to underline that the carotenoid levels in G. gracile were low even in controls that may also explain there was no detectable difference compared to diuron treatment. Similarly, chlorophyll a content was more impacted in N. palea than in G. gracile.

Finally, these results suggest that the antioxidative defense of the two species was not efficient enough to counteract lipid peroxidation by ROS, especially in N. palea since the cat gene induction, as well as the decrease on EPA and on pigment contents were higher than in G.

gracile (Table 7).

4.2.1.1.2.

Photosynthetic activity and growth rate inhibitions

The potential damages to the physiological state of the organism can be indicated by the effective quantum yield [START_REF] Bonnineau | Light history modulates antioxidant and photosynthetic responses of biofilms to both natural (light) and chemical (herbicides) stressors[END_REF][START_REF] Coquillé | Use of diatom motility features as endpoints of metolachlor toxicity[END_REF][START_REF] Moisset | Genetic and physiological responses of three freshwater diatoms to realistic diuron exposures[END_REF].

Diuron acts by blocking electron transport between PSII and PSI [START_REF] Thomas | Increased persistence of antifouling paint biocides when associated with paint particles[END_REF], impacting photosynthesis in both studied-species. However, a higher inhibition was noted in N. palea culture (Table 7).

The fatty acids 18:4 and EPA are mainly related to the chloroplastic lipids MGDG (monogalactosyldiacylglycerol) and DGDG (digalactosyldiacylglycerol) [START_REF] Zulu | Current trends to comprehend lipid metabolism in diatoms[END_REF]. It was suggested that their decrease resulted in the dismantling of the photosynthetic membranes and prevented PSI and PSII activity [START_REF] Kobayashi | Role of membrane glycerolipids in photosynthesis, thylakoid biogenesis and chloroplast development[END_REF]) (Table 7).

Since the nad5 gene is involved in the functioning of the respiratory chain, its induction in the N. palea culture in response to diuron suggests an increase of ATP production to counter the effects of a toxicant [START_REF] Kim Tiam | Development of q-PCR approaches to assess water quality: effects of cadmium on gene expression of the diatom Eolimna minima[END_REF]. Thus, the impact of diuron on the growth rate of G. gracile could be explained by the fact that the mitochondrial metabolism gene nad5 was not induced, contrary to N. palea, where no impact was evident on this endpoint (Table 7).

4.2.1.1.3.

Conclusion on diuron toxicity

Finally, under diuron treatment, the two studied species seemed to have different defense strategies to counteract toxicant effect: N. palea, compared to G. gracile, seemed to allocate its energy particularly to molecular defense mechanisms to keep a similar growth rate and populational level and counteract ROS effects. However, despite a higher induction of the cat gene than in G. gracile, the antioxidative mechanisms in N. palea appeared not to be sufficiently efficient to counteract diuron toxicity.

Similar toxicity responses between the two species under diuron treatment

Whatever the considered species under diuron treatment, it is interesting to note that EPA, 18:4n3, 18:1n9 and photosynthesis activity fluctuated in the same way as demonstrated by the statistical PCA analysis of the current study (Figure 23). Both diatoms seemed to increase their fatty acids associated with reserve lipids (18:1n9) as a protection mechanism. Indeed, the increase of reserve product accumulation due to toxicant contamination has been reported in many studies [START_REF] Sicko-Goad | Quantitative ultrastructural changes associated with lead-coupled luxury phosphate uptake and polyphosphate utilization[END_REF][START_REF] Smith | Kinetics of intracellular carbon allocation in a marine diatom[END_REF]. Sicko-Goad et al.

(1989b) suggested that cells which had a high content of reserve lipids were less vulnerable to the effects of lipophilic contaminants.

However, to confirm this result, it would be necessary in future studies to assess these potential biomarkers in a higher number of diatoms species. If consistent responses are found, fatty acids analysis would provide a good alternative to current biomarkers of diuron pollution in the field, with an ecosystemic perspective (through food quality aspects).

In the same way, it would be necessary to confirm the results of the current study by field studies because of the complexity of the natural environment compared to laboratory experiments.

Some other limitations inherent to laboratory experiments with single species cultures, in contrast with field collected communities, can be mentioned. It was shown in the literature that the sensitivity of algae to chemicals could be altered by the genetic selection in in vitro culture [START_REF] Peterson | Toxicity of hexazinone and diquat to green algae, diatoms, cyanobacteria and duckweed[END_REF]. Thus, culture responses to herbicide exposure may not be representative of the periphytic algae community responses in the field due to the different sensitivities of species present in algae community [START_REF] Badr | Growth response of freshwater algae to continuous flow of terbutryn[END_REF].

Indeed, natural environments are composed of a mixture of herbicides and not of single substances. Herbicide is mainly found with other contaminants as metallic or nutrient substances [START_REF] Montuelle | The periphyton as a multimetric bioindicator for assessing the impact of land use on rivers: an overview of the Ardières-Morcille experimental watershed (France), Global Change and River Ecosystems-Implications for Structure, Function and Ecosystem Services[END_REF]. Furthermore, the complexity of natural environments can modulate the effects of a pollutant: by synergism, for example between light and pesticides on periphytic algae (Guasch and Sabater, 1998) or antagonism, for example with nutrients which stimulate the growth of periphyton [START_REF] Lozano | Interaction of toxicants and communities: the role of nutrients[END_REF].

Impact of S-metolachlor

ROS toxicity

Under S-metolachlor treatment, the higher induction of the cat gene in the N. palea culture appeared to result in more efficient antioxidative defense mechanisms than in G. gracile (Table 7). In fact, fatty acid profile and carotenoid content in the N. palea culture were not impacted by S-metolachlor suggesting that the toxic impact of ROS was well countered, contrary to G.

gracile where a decrease in 18:4n3 was shown (Table 7). Furthermore, the inhibition of diatom cell division can result in a decrease of chlorophyll content (Debenest et al., 2009a) which is linked with the decrease of the 18:4 content, a fatty acid of chloroplastic lipids, as mentioned above [START_REF] Zulu | Current trends to comprehend lipid metabolism in diatoms[END_REF].

Growth rate, fatty acids and pigment contents inhibitions

Conclusion on S-métolachlore toxicity

Contrary to G. gracile, under S-metolachlor N. palea seemed to allocate its energy to molecular defense mechanisms to counteract ROS impacts and to maintain a similar growth rate and populational level. Thus, defense mechanisms in N. palea appeared different compared to the G. gracile culture.

Nevertheless, at a concentration of 10 µg.L -1 , S-metolachlor seemed to have lower toxicity for the two species compared to diuron. Many studies observed the toxicity of S-metolachlor on photosynthesis and growth at a concentration of the order of milligrams per liter [START_REF] Ma | Toxicity assessment of 40 herbicides to the green alga Raphidocelis subcapitata[END_REF][START_REF] Thakkar | Comparative responses of two species of marine phytoplankton to metolachlor exposure[END_REF]. Debenest et al. (2009b) demonstrated that S-metolachlor at 30 µg.L -1 decreased growth rate and cell density in periphyton. However, the present study used a lower concentration of S-metolachlor which could explain the slight effect observed on classical descriptors of the two species.

Also, it could be hypothesized in the current study that the elevated nutrient concentration in Dauta medium may have stimulated diatom metabolism and masked, at least partially, Smetolachlor effects on both species and especially on the N. palea culture [START_REF] Guasch | Phosphate limitation influences the sensitivity to copper in periphytic algae[END_REF]. [START_REF] Morin | Linking diatom community structure to pesticide input as evaluated through a spatial contamination potential (Phytopixal): a case study in the Neste river system (South-West France)[END_REF] showed that in the Neste system (South-West France), N. palea was found in water with lower pesticide and higher nutrient (nitrate, nitrite, phosphate) concentrations, while G. gracile was observed in water with elevated pesticide inputs and lower nutrient concentrations.However, the effect of nutrient concentration on S-metolachlor exposure in the present study was not observed and finally we can only conclude that nutrient preferences of diatoms may be a stronger parameter on their biological responses.

Conclusion

This study is one of a few to observe the variability of fatty acid profiles between freshwater diatoms with and without herbicide contaminations, namely with diuron and S-metolachlor treatments.

The current results increase knowledge about the defense mechanisms of diatom species against diuron and S-metolachlor contamination at environmental concentrations (10 µg.L -1 ). N.

palea's and G. gracile's defense mechanisms were different under herbicide treatments.

N. palea seemed to preferentially allocate its energy to defense mechanisms in order to maintain a growth rate similar to the controls, unlike G. gracile, for which the growth rate decreased with respect to both herbicide contaminations.

Indeed, genetic analyses demonstrated that:

-The cat antioxidant gene, countering ROS molecules, was overexpressed for both diatom species under herbicide contaminations with, however, a higher overexpression for N. palea.

-The mitochondrial nad5 gene involved in the functioning of the respiratory chain and in the production of ATP was more effective for N. palea than G. gracile.

Finally, we conclude that: 1) without herbicide contamination, fatty acid proportions are different between the two species tested; 2) the proportion of the fatty acids 18:4n3, EPA and 18:1n9 associated with photosynthesis activity could be a potential biomarker of diuron pollution.

Acknowledgements

This study was carried out with financial support from the French National Research Agency (ANR) as part of the Investments for the future Programme, within the Cluster of Excellence COTE (ANR-10-LABX-45).

The silicate concentrations significantly decreased between T0 and T7 for control treatment for NPAL and GGRA control treatments (Figure 26). Under S-metolachlor treatments the silicate concentrations significantly decreased between T0 and T7 for the two species conversely under diuron treatment where no effect was observed. Sous contamination en diuron les proportions en SFA ont diminué chez GGRA contrairement à NPAL où une augmentation a pu être observée.

✓ Les résultats de cette étude ont permis de mieux connaître les mécanismes de défense des espèces de diatomées en réponse à la contamination au diuron et S-métolachlore à des concentrations environnementales, avec nouvelle fois une toxicité plus élevée du le diuron par rapport au S-métolachlore.

✓ NPAL et GGRA ont montré des mécanismes de défenses différents face à la contamination au diuron et au S-métolachlore.

NPAL a semblé allouer préférentiellement son énergie aux mécanismes de défense dans le but de garder un taux de croissance similaire aux témoins contrairement à GGRA pour lequel le taux de croissance a décru face à la contamination aux deux herbicides.

En effet, les analyses génétiques ont notamment démontré que :

-le gène antioxydant cat permettant de combattre les ROS était surexprimé pour les deux espèces de diatomées sous contamination aux herbicides avec cependant une surexpression plus élevée pour NPAL.

-le gène mitochondrial nad5 impliqué dans le fonctionnement de la chaîne respiratoire et dans la production d'ATP était davantage exprimé pour NPAL que GGRA.

✓ Cette étude a également permis de conclure que la proportion des acides gras 18:1n9, 18:4n3 et 20:5n3 associés à l'activité photosynthétique pourrait constituer un biomarqueur potentiel de la pollution au diuron quelle que soit l'espèce étudiée.

✓ Au vu de ces potentiels biomarqueurs de la pollution au diuron déterminés dans la présente étude (acides gras en complément de l'activité photosynthétique), il serait intéressant d'étudier plus en détail l'impact d'une pollution sur la photosynthèse des diatomées et notamment sur les lipides associés aux photosystèmes ; les acides gras étant les principaux composants des lipides polaires (de structure, et par exemple des membranes des thylakoïdes des chloroplastes) et des lipides non polaires (de réserve) [START_REF] Sajjadi | Microalgae lipid and biomass for biofuel production: A comprehensive review on lipid enhancement strategies and their effects on fatty acid composition[END_REF].

Dans le chapitre précédent (chapitre 4), il a été montré que le diuron était plus toxique que le S-métolachlore sur les profils d'acides gras totaux des diatomées d'eau douce GGRA et NPAL après sept jours de contamination à 10 µg.L -1 .

De plus, une diminution de la teneur en acide gras 20:5n3 a été notée en réponse au diuron pour les deux espèces étudiées.

La composition biochimique des microalgues comprend quatre groupes de molécules principaux : les protéines, les glucides, les acides nucléiques et les lipides.

Les microalgues contiennent des lipides polaires et non polaires et les acides gras sont les principaux composants des lipides [START_REF] Sajjadi | Microalgae lipid and biomass for biofuel production: A comprehensive review on lipid enhancement strategies and their effects on fatty acid composition[END_REF].

Certaines études ont démontré l'impact des pesticides sur les profils d'acides gras totaux des microalgues et des diatomées notamment vis-à-vis de l'acide gras 20:5n3 [START_REF] Demailly | Impact of diuron and S-metolachlor on the freshwater diatom Gomphonema gracile: Complementarity between fatty acid profiles and different kinds of ecotoxicological impact-endpoints[END_REF]Filimonova et al., 2016b;Filimonova et al., 2016c;[START_REF] Robert | Metolachlor-mediated selection of a microalgal strain producing novel polyunsaturated fatty acids[END_REF].

Il a été démontré dans la littérature que cet acide gras était principalement lié aux lipides chloroplastiques [START_REF] Nakamura | Lipids in plant and algae development[END_REF][START_REF] Zulu | Current trends to comprehend lipid metabolism in diatoms[END_REF].

Par ailleurs, il est important de souligner que l'acide gras 20:5n3 joue un rôle écologique essentiel du fait de son importance dans la qualité nutritive des diatomées [START_REF] Arts | Lipids in Aquatic Ecosystems[END_REF].

Selon nos connaissances, aucune étude n'a été consacrée à l'effet des herbicides sur la composition lipidique des diatomées d'eau douce et en particulier sur leur teneur en acide gras 20:5n3 dans les différents lipides constitutifs de ces microalgues.

Abstract

Diatoms contain non-polar (storage lipids) and polar lipids (structural lipids). Fatty acids (FA) are the main components of lipids. Many studies have demonstrated an impact of herbicides on total fatty acids of diatoms and especially on eicosapentaenoic acid (EPA) 20:5n3 but no study has focused on the impact of herbicides on their lipid content and composition. This study aimed to: 1) evaluate the effect of herbicides on lipid composition of one freshwater diatom; 2)

determine the impact of herbicides on the 20:5n3 content of each lipid; and 3) examine the potential of 20:5n3 as a biomarker of herbicide pollution. To do so, Gomphonema gracile was exposed during seven days to diuron and S-metolachlor under realistic environmental conditions (10 µg.L -1 ) and sampling was carried-out three times over its growth cycle (on days 1, 3 and 7).

Total lipid composition was impacted by diuron only at the final sampling time, with a notable decrease of non-polar lipids. Diuron affected the content of 20:5n3 in phosphatidylcholine (PC), phosphatidic acid (PA), diacylglycerylhydroxymethyltrimethyl-b-alanine (DGTA) and digalactosyldiacylglycerol (DGDG) consistently from the seven day of the experiment. These lipids are involved in several physiological processes, particularly in photosynthesis. Also, the results demonstrated that EPA content in the lipids PC, PA/DGTA and DGDG provided an earlier response to diuron exposure than total lipid content.

This study demonstrated higher toxicity of diuron compared to S-metolachlor at 10µg.L -1 on the lipid content of G. gracile, especially on EPA.

Based on previous studies and our current findings, it is suggested that EPA content in diatoms could be a good biomarker of diuron pollution in freshwaters.

Introduction

The biochemical composition of microalgae includes four principal molecule groups: proteins, carbohydrates, nucleic acids and lipids. Among lipids, non-polar (neutral) and polar lipids are found in the cell [START_REF] Sajjadi | Microalgae lipid and biomass for biofuel production: A comprehensive review on lipid enhancement strategies and their effects on fatty acid composition[END_REF]).

Non-polar lipids are mainly composed of triacylglycerides (TAG) which act as the main form of energy storage. TAG are easily catabolized to supply the energy to metabolism. They are synthesized under light exposure, accumulated in cytosolic lipid bodies and then reused for the synthesis of polar lipids in the absence of light [START_REF] Dörmann | The role of glycolipids in photosynthesis[END_REF].

Polar lipids are bound to the organelle membranes [START_REF] Shimojima | Biosynthesis and function of chloroplast lipids[END_REF][START_REF] Steffen | Investigations on the reaction pattern of photosystem II in leaves from Arabidopsis thaliana wild type plants and mutants with genetically modified lipid content[END_REF].

The cell membrane protects the cell, maintains its shape and participates directly in membrane fusion events. It is mainly composed of glycolipids and phospholipids [START_REF] Sajjadi | Microalgae lipid and biomass for biofuel production: A comprehensive review on lipid enhancement strategies and their effects on fatty acid composition[END_REF][START_REF] Sakurai | Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II[END_REF].

For example, in the chloroplast, the thylakoid membrane is composed of uncharged lipids including monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) and digalactosyldiacylglycerol (DGDG), and of anionic lipids including sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) and phosphatidylglycerol (PG) (Somerville et al. 2000). These lipids in photosynthetic complexes avoid ion diffusion, allowing the generation of a difference in the electrochemical potential across the membrane, necessary to synthesize ATP [START_REF] Mizusawa | The role of lipids in photosystem II[END_REF].

Phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylethanolamine (PE) are major components of extraplastidial membranes [START_REF] Dorne | Do thylakoids really contain phosphatidylcholine?[END_REF]). It has been shown in the literature that PC and PE contribute to the biosynthesis of EPA because desaturation of fatty acids occurs on fatty acids associated with these phospholipids (Kaye et al. 2015, Schneider and[START_REF] Schneider | Radiolabeling studies of lipids and fatty acids in Nannochloropsis (Eustigmatophyceae), an oleaginous marine alga[END_REF].

Finally, phosphatidic acid (PA) is a signaling molecule and is the common intermediate in the synthesis of all classes of lipids [START_REF] Mizusawa | The role of lipids in photosystem II[END_REF].

Other structural lipids are betaine lipids [START_REF] Cañavate | Exploring occurrence and molecular diversity of betaine lipids across taxonomy of marine microalgae[END_REF][START_REF] Dembitsky | Betaine ether-linked glycerolipids[END_REF]) such as diacylglyceryltrimethylhomoserine (DGTS) and diacylglycerylhydroxymethyltrimethyl-balanine (DGTA). These lipids are assumed to be the phosphorus (P)-free structural counterparts of phospholipids. They are located in extraplastidial membranes (Künzler et al. 1997) and are involved in the transfer of fatty acids from the endoplasmic reticulum to the chloroplasts.

However, lipid composition in microalgae depends on the species, growth phases, but also on the environmental parameters.

It has been shown in the literature that TAG are not related only to energy storage products. For example, an abrupt change in the environmental conditions induces adaptive membrane reorganization: polyunsaturated fatty acids (PUFA)-rich TAG can induce MGDG and other polar lipids with specific acyl groups [START_REF] Sharma | High lipid induction in microalgae for biodiesel production[END_REF].

Moreover, exposure to herbicides can result in a production of reactive oxygen species (ROS).

These highly reactive molecules can interact with cellular components if they are not countered and will thus trigger oxidative stress and finally produce oxidative damage to cellular macromolecules [START_REF] Dayer | The peroxiredoxin and glutathione peroxidase families in Chlamydomonas reinhardtii[END_REF]. ROS can damage or modify lipid components of chloroplast thylakoid membranes; e.g. by the peroxidation of membrane lipids (Almeida et al.

2019).

Fatty acids (FA) are the main components of lipids [START_REF] Sajjadi | Microalgae lipid and biomass for biofuel production: A comprehensive review on lipid enhancement strategies and their effects on fatty acid composition[END_REF]. FA are useful molecules particularly for the production, fluidity and permeability of cell membranes and they are used as fuel in all metabolic systems for all organisms, playing an important role in the physiological response [START_REF] Arts | Lipids in Aquatic Ecosystems[END_REF].

Storage lipids have a high content of saturated and monounsaturated fatty acids (SFA and MUFA) whereas polyunsaturated (PUFA with > 1 double bonds) and highly unsaturated (with ≥ 20 carbons and ≥ 3 double bonds) fatty acids are included in the polar (mainly structural) lipid fraction [START_REF] Block | Preparation and characterization of membrane fractions enriched in outer and inner envelope membranes from spinach chloroplasts[END_REF][START_REF] Sakurai | Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II[END_REF][START_REF] Shimojima | Biosynthesis and function of chloroplast lipids[END_REF]). PUFA and HUFA play an important role in the regulation of cell membrane fluidity [START_REF] Brett | The role of highly unsaturated fatty acids in aquatic foodweb processes[END_REF].

Recent studies have demonstrated the impact of herbicides on total fatty acid profiles of microalgae, including diatoms [START_REF] Demailly | Impact of diuron and S-metolachlor on the freshwater diatom Gomphonema gracile: Complementarity between fatty acid profiles and different kinds of ecotoxicological impact-endpoints[END_REF][START_REF] Filimonova | Effects of a herbicide and copper mixture on the quality of marine plankton[END_REF], Filimonova et al. 2016a, Filimonova et al. 2016b[START_REF] Robert | Metolachlor-mediated selection of a microalgal strain producing novel polyunsaturated fatty acids[END_REF]).

In particular, (Demailly et al. submitted) showed that diuron was more toxic than S-metolachlor on total fatty acid profiles of the freshwater diatoms Gomphonema gracile and Nitzschia palea after seven days of exposure to 10 µg.L -1 . Furthermore, they noted a decrease in the content of eicosapentaenoic acid (EPA: 20:5n3) under diuron contamination for the two species studied.

Diuron is known to inhibit Photosystem II (PSII) activity by displacing a bound plastoquinone from the QB binding site in PSII, blocking the flow of electrons through PSII, and thus indirectly blocking the transfer of excitation energy from chlorophyll molecules to the PSII reaction centre [START_REF] Kleczkowski | Inhibitors of photosynthetic enzymes/carriers and metabolism[END_REF][START_REF] Oettmeier | Herbicides and photosystem[END_REF][START_REF] Trebst | Inhibitors of photosystem II and the topology of herbicide and QB binding polypeptide in the thylakoid membrane[END_REF]. This is consistent with the described location of EPA, mainly linked with the chloroplastic lipids MGDG and DGDG (Nakamura andLi-Beisson 2016, Zulu et al. 2018).

To the best of our knowledge, no studies have yet focused on the effect of herbicides on lipid composition of freshwater diatoms and especially on the EPA content of lipid classes.

In this context, this study aimed to:

1) Determine and quantify which lipid classes of one freshwater diatom are impacted by herbicides ;

2) Observe the impact of herbicides on EPA content of each lipid; and finally, 3) Examine the potential of EPA as a biomarker of herbicide pollution.

Materials and methods

Diatom culture: Gomphonema gracile Ehrenberg, 1838

G. gracile is a benthic pennate diatom of the Bacillariaceae [START_REF] Germain | Flore des diatomées : eaux douces et saumâtres[END_REF] sensitive to herbicide contamination [START_REF] Coquillé | Use of diatom motility features as endpoints of metolachlor toxicity[END_REF].

G. gracile was collected from laboratory monospecific cultures (INRAE, France) [START_REF] Coquillé | Use of diatom motility features as endpoints of metolachlor toxicity[END_REF]Morin 2019). The freshwater diatom culture was non-axenic and was cultured in sterile Dauta medium [START_REF] Dauta | Conditions for phytoplankton development, a comparative study of the behaviour of eight species in culture. I. Determination of growth parameters in relation to light and temperature[END_REF]) in a thermostatic chamber 610 XAP (LMS LTD®, UK) at 20.5 °C and 45 µmol photons.m -2 .s -1 with a dark: light cycle of 8:16 h. In order to keep diatoms in an exponential growth phase, the culture was renewed every week with new sterile Dauta medium.

Experimental design

Round borosilicate sterile glass flasks (100 mL) were heated at 550 °C for 5 h before the experiment. One week before the contamination, glass flasks were inoculated with 40 mL of Dauta culture medium [START_REF] Dauta | Conditions for phytoplankton development, a comparative study of the behaviour of eight species in culture. I. Determination of growth parameters in relation to light and temperature[END_REF]) and 40 mL of stock culture in exponential growth phase.

This step was carried out in order to adapt the culture to the glass flasks for one week.

At the beginning of the experiment (T0), glass flasks were inoculated at 300,000 cell.mL -1 with Dauta medium containing adapted cultures in exponential growth phase (total volume = 80 mL).

A control treatment without herbicide contamination and two herbicide treatments, one with diuron and one with S-metolachlor at 10 µg.L -1 , were achieved at the beginning of the experiment. All treatments were produced in quadruplicate. The experiment lasted seven days, under a nominal temperature of 20.5 °C.

In order to assess the effects of herbicides over time, all biological analyses were performed on the first (T1), third (T3) and last (T7) days of the experiment. Herbicide effects on diatoms were

Fatty acid analyses

The fatty acid methyl esters (FAMEs) from each class of lipids were obtained according to the protocol described by [START_REF] Demailly | Impact of diuron and S-metolachlor on the freshwater diatom Gomphonema gracile: Complementarity between fatty acid profiles and different kinds of ecotoxicological impact-endpoints[END_REF].

The separation of FAMEs was carried out using gas chromatography (Agilent 7890A) on a DB-WAX column (15 m x 1 µm x 0.53 mm, Agilent) and with flame ionization detection. The oven temperature was 150 °C for 1 min, followed by a 5 °C.min -1 ramp to 230 °C. This last temperature was maintained for a further 8 min, bringing the total run time to 25 min.

Statistical analysis

To detect significant differences between the control treatment and herbicide-exposed cultures, a non-parametric Wilcoxon-Mann-Whitney was performed due to the non-normal distribution of the data (with a p-value < 0.05 considered as statistically significant).

In order to detect significant differences in photosynthetic activity between T1, T3 and T7, a non-parametric Kruskal-Wallis test was performed due to the non-normal distribution of the data and followed by a Dunn post-hoc test (with a p-value < 0.05 considered as statistically significant).

In the same way, in order to show the impact of exposure duration on lipid composition, a Principal Response Curve (PRC) was established.

For the purpose of highlighting correlations between different variables, Principal Component Analysis (PCA) was performed. Significant differences between groups of individuals were highlighted with a PERMANOVA test (with a p-value < 0.05 considered as statistically significant). Confidence ellipses (corresponding to 95 %-confidence intervals) were represented on the PCA plot.

All statistical analyses were carried out with the R studio software (RStudioTeam 2016).

Results

Growth rate

For the control treatment, the growth rate of G. gracile was 0.33 ± 0.06 div/day.

With diuron contamination, a significant decrease (p-value < 0.05) in the growth rate was observed (0.23 ± 0.04 div/day).

With S-metolachlor contamination, no significant difference was observed compared to the control treatment (0.30 ± 0.07 div/day).

Photosynthetic activity

In the control treatment, G. gracile had an effective quantum yield of 0.42 ± 0.03, 0.49 ± 0.01 and 0.45 ± 0.04 at T1, T3 and T7, respectively. A significant difference (p-value < 0.05) was noted between the effective quantum yields at T1 and T3.

Diuron contamination significantly decreased (p-value < 0.05) the effective quantum yield whatever the sampling time with values of effective quantum yield of 0.20 ± 0.01, 0.19 ± 0.02 and 0.18 ± 0.01 at T1, T3 and T7, respectively. However, no significant difference was observed for the value of effective quantum yield between the three sampling times. With S-metolachlor contamination, no significant difference was found compared to the control treatment for the effective quantum yield at any time, with values of 0.40 ± 0.02, 0.47 ± 0.04 and 0.46 ± 0.01 at T1, T3 and T7, respectively.

Lipid composition

Total lipid composition

As shown in Table 10, G. gracile in the control treatment was mainly composed of neutral lipids and MGDG at the three sampling times (percentages > 5 %).

The content of DGDG was significantly higher at T7 compared to T1. Conversely, the proportion of neutral lipids decreased significantly between T3 and T7 (Table 10).

Diuron exposure significantly decreased the proportion of neutral lipids at T3 and T7.

Conversely, diuron significantly increased MGDG content at T3, FFA and DGTS content at T3 and T7 and PG and PE content at T7 (Table 10).

Under S-metolachlor contamination, the proportion of SQDG significantly decreased at T1, the content of neutral lipids significantly decreased at T3, the DGDG, PE and DGTS content significantly decreased at T7. Conversely, the content of PA/DGTA significantly increased at T1, DGTS content significantly increased at T1 and T3, MGDG and FFA proportion increased at T3 (Table 10). According to the Principal Responses Curves (Figure 27), the effect of the S-metolachlor on lipids of G. gracile over time did not differ significantly from the control treatment (effect well below 0.5). Conversely, the curve corresponding to diuron contamination showed an unmarked divergence from the control treatment at T7, correlated with increased amounts of PG, PE and DGTS lipids and with a decrease in neutral lipids compared to the control trajectories.

EPA distribution in lipids

As shown in Table 11, EPA in G. gracile in the control treatment was mainly abundant in neutral lipids, MGDG and PC at the three sampling times (percentages > 1%). The Principal Component Analysis biplot (Figure 28) was implemented with EPA proportions of each lipid (Table 10) for all treatments (control, diuron and S-metolachlor) and the three sampling times (T1, T3 and T7). The results were based on the values of variables that were well represented in the PCA statistical plan.

The biplot shows that the variable EPA in DGTS was mostly correlated (positively) with Dim The first dimension (Dim 1) opposed ctrl_t1 (left) and smet_t1 (right), which can be related to an increase of EPA content in DGTS in smet_t1 individual. Furthermore, according to the confidence ellipses, a significant difference between control and s-metolachlor individuals was observed for T1.

The second dimension opposed the ctrl_t7 (up) and diu_t7 (down) individuals, which can be related to the decrease of EPA content in PA/DGTA, PC and DGDG in diu_t7 individual.

Furthermore, the confidence ellipses highlighted a significant difference between control and diuron individuals for T7. The ellipses correspond to 95 %-confidence intervals.

PERMANOVA p value < 0.05.

Discussion

Lipid composition of diatoms

Diatoms contain polar and non-polar lipids and according to their metabolic rate, the proportion of these lipids varies over different growth phases of the organisms. PUFA and HUFA mostly make-up the structural lipid fraction and SFA and MUFA constitute the storage lipid fraction [START_REF] Hu | Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances[END_REF][START_REF] Olofsson | Seasonal variation of lipids and fatty acids of the microalgae Nannochloropsis oculata grown in outdoor large-scale photobioreactors[END_REF][START_REF] Torres | Microalgae-based biodiesel: a multicriteria analysis of the production process using realistic scenarios[END_REF].

The results of the present study agree with those of [START_REF] Opute | Lipid and fatty-acid composition of diatoms[END_REF], who showed that the two freshwater diatoms Nitzschia palea and N. muralis were mainly composed of TAG, PG, PC, PE, MGDG, DGDG, SQDG.

Also, they noted that EPA was mainly found in PC, MGDG and PE in N. palea and in MGDG and TAG in N. muralis. In the current study, EPA in G. gracile was mainly found in neutral lipids but was abundant in MGDG and PC, approaching the results found for N. palea and N.

muralis [START_REF] Opute | Lipid and fatty-acid composition of diatoms[END_REF].

Storage lipids

Non-polar (neutral) lipids play a key role in the storage of energy; as monoacylglycerides (MAG), diacylglycerides (DAG) and triacylglycerides (TAG). TAG are the main storage compounds of diatoms, which have a high content of SFA and MUFA [START_REF] Sajjadi | Microalgae lipid and biomass for biofuel production: A comprehensive review on lipid enhancement strategies and their effects on fatty acid composition[END_REF].

In this study, a significant decrease in neutral lipids between T3 and T7 was highlighted, in line with the knowledge that structural components are needed for growth and the surplus of neutral lipid accumulation was reduced in diatoms during the exponential growth phase (Li et al. 2014).

Moreover, most microalgae preferentially accumulate TAG during the stationary phase [START_REF] Berge | Reassessment of lipid composition of the diatom[END_REF][START_REF] Brown | Effects of harvest stage and light on the biochemical composition of the diatom Thalassiosira pseudonana[END_REF][START_REF] Tonon | Long chain polyunsaturated fatty acid production and partitioning to triacylglycerols in four microalgae[END_REF].

Structural lipids

Polar lipids are structure lipids, like phospholipids and glycolipids. Phospholipids make-up cell membranes and act as a selectively permeable barrier for organelles and cells. Also, they participate in membrane fusion events. Polar lipids can behave as intermediates in cell signaling pathways, contributing to the response to environmental parameter changes [START_REF] Sajjadi | Microalgae lipid and biomass for biofuel production: A comprehensive review on lipid enhancement strategies and their effects on fatty acid composition[END_REF].

According to the nature of their head group, MGDG, DGDG, PG and SQDG play a specific role in photosynthesis [START_REF] Mizusawa | The role of lipids in photosystem II[END_REF]. The main function of MGDG and DGDG is to serve as structural lipids [START_REF] Murata | Lipids in photosynthesis: an overview[END_REF]. DGDG are recognized as important for the proper structure and function of PSII, especially on the donor side [START_REF] Sakurai | Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II[END_REF][START_REF] Steffen | Investigations on the reaction pattern of photosystem II in leaves from Arabidopsis thaliana wild type plants and mutants with genetically modified lipid content[END_REF]). In the current study, an increase of DGDG content was noted during the exponential growth phase and matched with results found in the literature (Kates and Volcani 1966).

Impact of contaminants on lipid composition of diatoms

It is known that herbicides affect cell biological components leading to the deterioration of biological systems [START_REF] Badmus | Lipid peroxidation inhibition and antiradical activities of some leaf fractions of Mangifera indica[END_REF]. Also, it is interesting to note that [START_REF] Dupraz | Microalgal sensitivity varies between a diuron-resistant strain and two wild strains when exposed to diuron and irgarol, alone and in mixtures[END_REF] stressed the relevance of conducting further studies on lipid responses following herbicide contamination, especially to determine and quantify which lipid classes are impacted. In fact, lipid classes could provide additional information about the effects of herbicides on the nutritional quality of diatoms, since they are commonly used in aquaculture [START_REF] Dupraz | Microalgal sensitivity varies between a diuron-resistant strain and two wild strains when exposed to diuron and irgarol, alone and in mixtures[END_REF]).

Storage lipids

In this study, we showed a decrease in the proportion of total neutral lipids after exposure to diuron as well as EPA content in neutral lipids.

Similarly, [START_REF] Dupraz | Microalgal sensitivity varies between a diuron-resistant strain and two wild strains when exposed to diuron and irgarol, alone and in mixtures[END_REF][START_REF] Dupraz | Toxicity of binary mixtures of pesticides to the marine microalgae Tisochrysis lutea and Skeletonema marinoi: Substance interactions and physiological impacts[END_REF] used the green lipophilic fluorochrome BODIPY 505/515 , which colors neutral lipids, and which corresponds to oil droplets accumulated inside cells [START_REF] Hu | Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances[END_REF]. They noted a diuron-induced reduction in the production of storage lipids in the marine microalgae Tisochrysis lutea and Skeletonema marinoi [START_REF] Dupraz | Toxicity of binary mixtures of pesticides to the marine microalgae Tisochrysis lutea and Skeletonema marinoi: Substance interactions and physiological impacts[END_REF]) and in

Tetraselmis suecica [START_REF] Dupraz | Microalgal sensitivity varies between a diuron-resistant strain and two wild strains when exposed to diuron and irgarol, alone and in mixtures[END_REF]).

The decrease observed in storage lipid content could be explained by the decrease of photosynthetic efficiency. In fact, depending on the photosynthesis light phase, many precursors, particularly those used in lipid biosynthesis, are produced by the Calvin cycle [START_REF] Masojídek | Photosynthesis in Microalgae, Handbook of Microalgal Culture[END_REF]). Thus, the decrease of photosynthetic efficiency could impact the production of these precursors and finally, storage lipid content.

On the other hand, microalgae are known to produce storage lipids in response to stressful conditions as a result of reduced cell division; for example, under nitrogen limitation conditions [START_REF] Da Costa | Effects of growth phase and nitrogen limitation on biochemical composition of two strains of Tisochrysis lutea[END_REF][START_REF] Zhu | Strategies for lipid production improvement in microalgae as a biodiesel feedstock[END_REF]).

Structural lipids

It has been shown in the literature that ROS can cause lipid peroxidation in cell membranes [START_REF] Almeida | Oxidative stress potential of the herbicides bifenox and metribuzin in the microalgae Chlamydomonas reinhardtii[END_REF]). An increase in ROS resulted in a significant increase in lipid peroxidation levels and indicated an increase in the production of oxyl-radicals such as HO %, ROO %, RO % and ONOO- [START_REF] Cheloni | Optimization of the C11-BODIPY 581/591 dye for the determination of lipid oxidation in Chlamydomonas reinhardtii by flow cytometry[END_REF]. In photosynthetic organisms, ROS can also damage lipid compounds of chloroplast thylakoid membranes such as MGDG, DGDG, SQDG and PG [START_REF] Almeida | Oxidative stress potential of the herbicides bifenox and metribuzin in the microalgae Chlamydomonas reinhardtii[END_REF].

The elongation of FA and omega 3 and 6 desaturation processes can be inhibited by the production of ROS, impacting HUFA molecules [START_REF] Cohen | Potential use of substituted pyridazinones for selecting polyunsaturated fatty acid overproducing cell lines of algae[END_REF][START_REF] Robert | Metolachlor-mediated selection of a microalgal strain producing novel polyunsaturated fatty acids[END_REF]). In particular, HUFA in lipids are attacked by the free radicals on their bis-allylic site [START_REF] Filimonova | Effects of a herbicide and copper mixture on the quality of marine plankton[END_REF][START_REF] Maronić | S-metolachlor promotes oxidative stress in green microalga Parachlorella kessleri-A potential environmental and health risk for higher organisms[END_REF]).

In the current study, the content of EPA in G. gracile decreased synchronously with photosynthesis activity impairment in the chloroplast lipid DGDG and lipid PA/DGTA, presumably involved in the transfer of fatty acids from the endoplasmic reticulum to the chloroplasts (Sayanova et al. 2017[START_REF] Zulu | Current trends to comprehend lipid metabolism in diatoms[END_REF].

Also, the content of EPA in G. gracile decreased in PC after seven days of diuron contamination. As mentioned previously, PC contributes to the biosynthesis of EPA (Kaye et al. 2015, Schneider and[START_REF] Schneider | Radiolabeling studies of lipids and fatty acids in Nannochloropsis (Eustigmatophyceae), an oleaginous marine alga[END_REF]. The decrease of EPA content in PC could indicate an early response of PC to diuron contamination.

S-metolachlor was found to have impacted total proportion of DGTS, PE and DGDG as well as EPA content on the seven day of the experiment.

As mentioned previously, the thylakoid membrane is composed of uncharged lipids including DGDG, DGTS and PE which are located in extraplastidial membranes (Künzler et al. 1997).

However, as discussed in Demailly et al. (submitted), S-metolachlor seemed to have lower micro-algal toxicity compared to diuron at 10 µg.L -1 . This could result from several factors:

1) S-metolachlor was applied without adjuvant, making the toxicity of compounds lower in the present case (Filimonova et al. 2016a);

2) the applied concentration was quite low, allowing the defense mechanisms to be effective; [START_REF] Robert | Metolachlor-mediated selection of a microalgal strain producing novel polyunsaturated fatty acids[END_REF];

3) the toxicity of the herbicides may have been masked by the high concentrations of nutrients provided by the Dauta medium (Guasch et al. 1998[START_REF] Guasch | Phosphate limitation influences the sensitivity to copper in periphytic algae[END_REF]); 4) the sensitivity of G. gracile to herbicides is lower than other that of the diatom species used in previous studies [START_REF] Wood | How benthic diatoms within natural communities respond to eight common herbicides with different modes of action[END_REF]).

EPA as a biomarker of herbicide pollution

It has been shown in the literature that diatoms have high contents of EPA and are excellent quality food resources for zooplankton [START_REF] Taipale | Fatty acid composition as biomarkers of freshwater microalgae: analysis of 37 strains of microalgae in 22 genera and in seven classes[END_REF]. In fact, EPA is useful in the health and function of all organisms at all trophic levels [START_REF] Brett | Daphnia fatty acid composition reflects that of their diet[END_REF]). However, lipid compounds and fatty acid profiles are sensitive to stressors and environmental modifications [START_REF] Arts | Lipids in Aquatic Ecosystems[END_REF]).

In the current study, conversely to total lipid analysis, a decrease of EPA content was shown mainly in PA/DGTA and PC as well as DGDG after diuron contamination; decreasing photosynthesis and leading to a reduction of the growth rate [START_REF] Demailly | Impact of diuron and S-metolachlor on the freshwater diatom Gomphonema gracile: Complementarity between fatty acid profiles and different kinds of ecotoxicological impact-endpoints[END_REF]) and hinting at the potential of EPA as a biomarker of diuron pollution (Figure 2).

In a previous study, [START_REF] Demailly | Impact of diuron and S-metolachlor on the freshwater diatom Gomphonema gracile: Complementarity between fatty acid profiles and different kinds of ecotoxicological impact-endpoints[END_REF] observed a similarly decrease of the total EPA content in G. gracile after seven days of diuron exposure at 10 µg.L -1 . In the same way, they noted a similar result in N. palea (Demailly et al. submitted).

Conclusion

The present study highlighted higher toxicity of diuron compared to S-metolachlor at 10 µg.L - 1 on lipid contents of G. gracile, and especially on EPA content.

According to previous studies and the results of the current study, it is suggested that EPA content in selected lipids (PA/DGTA, DGDG and PC) in G. gracile had earlier responses that total lipid content, making it a relevant biomarker of diuron pollution. In future studies, it will be useful to carry out similar experiments using different herbicides, exposure concentrations, environmental parameters (temperature and light intensity) and other diatom species in order to confirm and consolidate the usefulness of EPA content as a biomarker of herbicide pollution in freshwater diatoms.

Acknowledgments

This study was carried out with financial support from the French National Research Agency

a) Impacts des herbicides sur les lipides et acides gras des diatomées

Il est connu que les herbicides affectent les composants biologiques cellulaires entraînant la détérioration des systèmes biologiques [START_REF] Badmus | Lipid peroxidation inhibition and antiradical activities of some leaf fractions of Mangifera indica[END_REF]. [START_REF] Almeida | Oxidative stress potential of the herbicides bifenox and metribuzin in the microalgae Chlamydomonas reinhardtii[END_REF].

Cependant à l'heure actuelle, peu d'études ont souligné les impacts des herbicides sur le contenu lipidique des diatomées d'eau douce.

Aussi, diverses études ont démontré que les microalgues marines confrontées à une contamination aux pesticides (notamment herbicides) réagissaient par une modification de leurs profils d'acides gras telle qu'une diminution de leur proportion en PUFA et en HUFA, mais aussi, par une augmentation de la teneur en MUFA [START_REF] Robert | Metolachlor-mediated selection of a microalgal strain producing novel polyunsaturated fatty acids[END_REF]Sicko-Goad et al., 1989a;Sicko-Goad et al., 1989b).

Cependant à l'heure actuelle, de la même manière que le contenu lipidique, peu d'études se sont intéressées aux impacts des herbicides sur les microalgues d'eaux douces et particulièrement les diatomées.

i. Diuron

Lipides neutres (de stockage) et MUFA

Ces travaux de thèse ont démontré une diminution de la proportion des lipides neutres totaux chez la diatomée d'eau douce GGRA après exposition au diuron.

Cette diminution a pu être expliquée (chapitre 5, article 3) par la diminution de l'activité photosynthétique. En effet, de nombreux précurseurs, en particulier ceux utilisés dans la biosynthèse des lipides, sont produits par le cycle de Calvin [START_REF] Masojidek | The xanthophyll cycle in green algae (Chlorophyta): its role in the photosynthetic apparatus[END_REF]. Ainsi, la diminution de l'efficacité photosynthétique pourrait avoir un impact sur la production de ces précurseurs et finalement sur le contenu en lipides de stockage.

En parallèle, ces travaux de thèse ont aussi démontré une augmentation du pourcentage total de MUFA sous traitement au diuron. Cette augmentation a pu être expliquée par l'inhibition de l'activité photosynthétique causée par ce pesticide comme il a été discuté dans les chapitres 3 et 4 (articles 1 et 2).

Sans facteurs de stress et dans des conditions de croissance normales, l'ATP et le NADPH, produits notamment de la photosynthèse, sont consommés afin de générer de la biomasse.

Diverses études ont montré que lorsque le photosystème II est perturbé par la présence de facteurs de stress, et finalement la croissance inhibée, le principal accepteur d'électrons de la photosynthèse devient inactif et le NADPH est consommé dans la biosynthèse des acides gras.

La production de composés membranaires n'étant alors pas prioritaire au vu de l'inhibition de la croissance, les acides gras produits sont alloués aux lipides de réserve et notamment le triacylglycérol (TAG), ce lipide contenant particulièrement une forte proportion de MUFA [START_REF] Converti | Effect of temperature and nitrogen concentration on the growth and lipid content of Nannochloropsis oculata and Chlorella vulgaris for biodiesel production[END_REF][START_REF] Hu | Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances[END_REF][START_REF] Thompson | Lipids and membrane function in green algae[END_REF].

Lipides membranaires et HUFA

Lors de ces travaux de thèse, une augmentation de la teneur en lipides membranaires tels que PG, DGTS et PE a pu être observée chez la diatomée GGRA lors de l'exposition au diuron.

Comme il a pu être expliqué dans le chapitre 5 :

• PG est le phospholipide majeur présent dans la membrane des thylakoïdes [START_REF] Block | Preparation and characterization of membrane fractions enriched in outer and inner envelope membranes from spinach chloroplasts[END_REF][START_REF] Dorne | Do thylakoids really contain phosphatidylcholine?[END_REF] et joue un rôle clé dans la photosynthèse [START_REF] Domonkos | Lipid-assisted protein-protein interactions that support photosynthetic and other cellular activities: Progress in lipid research[END_REF][START_REF] Wada | The role of phosphatidylglycerol in photosynthesis[END_REF][START_REF] Wada | The essential role of phosphatidylglycerol in photosynthesis[END_REF].

• PE, quant à lui, du fait de sa composition riche en acides gras désaturés C20, contribue à la biosynthèse de l'acide gras EPA (HUFA) [START_REF] Kaye | Metabolic engineering toward enhanced LC-PUFA biosynthesis in Nannochloropsis oceanica: Overexpression of endogenous Δ12 desaturase driven by stress-inducible promoter leads to enhanced deposition of polyunsaturated fatty acids in TAG[END_REF][START_REF] Schneider | Radiolabeling studies of lipids and fatty acids in Nannochloropsis (Eustigmatophyceae), an oleaginous marine alga[END_REF].

• DGTS est un bétaïne lipide [START_REF] Cañavate | Exploring occurrence and molecular diversity of betaine lipids across taxonomy of marine microalgae[END_REF][START_REF] Dembitsky | Betaine ether-linked glycerolipids[END_REF]. Ce lipide est supposé être un des homologues structurels sans phosphore (P) des phospholipides. Il est situé dans les membranes extraplastidiales (Künzler et al., 1997b) et participe au transfert des acides gras du réticulum endoplasmique aux chloroplastes.

Plus particulièrement, il a été démontré dans ces travaux que parallèlement à l'activité photosynthétique, la teneur en EPA chez G. gracile diminuait dans les lipides membranaires PA/DGTA après sept jours de contamination par le diuron. De la même manière, la diminution de la teneur en EPA a été notée dans les lipides membranaires DGDG et PC.

Comme il a pu être expliqué dans le chapitre 5 :

• PA est une molécule de signalisation et constitue l'intermédiaire dans la synthèse de toutes les classes de lipides [START_REF] Mizusawa | The role of lipids in photosystem II[END_REF] ;

• DGTA joue un rôle dans la photosynthèse du fait de sa présence dans les membranes chloroplastiques ;

• DGDG est un lipide constituant les membranes thylakoïdiennes des chloroplastes [START_REF] Almeida | Oxidative stress potential of the herbicides bifenox and metribuzin in the microalgae Chlamydomonas reinhardtii[END_REF] et est donc associé à la photosynthèse ;

• PC contribue à la biosynthèse de l'acide gras EPA (HUFA) du fait de sa composition riche en acides gras désaturés à 20 atomes de carbone [START_REF] Kaye | Metabolic engineering toward enhanced LC-PUFA biosynthesis in Nannochloropsis oceanica: Overexpression of endogenous Δ12 desaturase driven by stress-inducible promoter leads to enhanced deposition of polyunsaturated fatty acids in TAG[END_REF][START_REF] Schneider | Radiolabeling studies of lipids and fatty acids in Nannochloropsis (Eustigmatophyceae), an oleaginous marine alga[END_REF].

Simultanément, la diminution du pourcentage total de HUFA chez GGRA et NPAL a pu quant à elle être expliquée tout au long de ces travaux par :

1) L'action des ROS sur leur site bis-allylique entraînant une peroxydation lipidique [START_REF] Maronić | S-metolachlor promotes oxidative stress in green microalga Parachlorella kessleri-A potential environmental and health risk for higher organisms[END_REF] ;

2) Et par l'inhibition des processus de désaturation dans le mécanisme de synthèse des acides gras (Filimonova et al., 2016c).

ii. S-métolachlore

Étonnamment, de faibles effets du S-métolachlore à concentration environnementale ont été observés sur les acides gras des deux espèces de diatomées étudiées. Plusieurs hypothèses ont pu être formulées tout au long de ces travaux de thèse (chapitres 3, 4 et 5) :

1) Contrairement à d'autres études, l'herbicide a été appliqué seul et sans adjuvant, ce qui a peut-être permis d'abaisser la toxicité du composé dans le cas présent (en comparaison avec les travaux de Filimonova et al., 2016b;Filimonova et al., 2016c) ;

2) La concentration appliquée était de 10 µg.L -1 , une concentration bien inférieure à celle d'autres études ayant démontré la mise en place des mécanismes de défense [START_REF] Robert | Metolachlor-mediated selection of a microalgal strain producing novel polyunsaturated fatty acids[END_REF] ;

3) Les fortes concentrations de nutriments fournies par le milieu Dauta peuvent avoir stimulé le métabolisme des diatomées et masqué, au moins partiellement, la toxicité du S-métolachlore sur les deux espèces [START_REF] Guasch | Phosphate limitation influences the sensitivity to copper in periphytic algae[END_REF]. Les effets indésirables dans les diatomées sont le plus souvent : des perturbations sur le système photosynthétique [START_REF] Knauert | The role of reactive oxygen species in copper toxicity to two freshwater green algae[END_REF] dégradant par oxydation la protéine D1 [START_REF] Kale | Amino acid oxidation of the D1 and D2 proteins by oxygen radicals during photoinhibition of Photosystem II[END_REF] et entraînant une photoinhibition [START_REF] Cartaxana | Photoinhibition in benthic diatom assemblages under light stress[END_REF] ; des perturbations sur la chaîne de transfert d'électrons entraînant une diminution de la production d'ATP [START_REF] Stohs | Oxidative mechanisms in the toxicity of metal ions[END_REF] ; des dommages à l'ADN affectant la croissance algale [START_REF] Stohs | Oxidative mechanisms in the toxicity of metal ions[END_REF].

Les résultats des profils d'acides gras en complément de ceux de génétique, décrits dans les chapitres 3 et 4 de cette thèse, ont indiqué que :

• L'induction du gène de défense contre le stress oxydatif cat après exposition au diuron suggère que l'augmentation de la dégradation du contenu en HUFA pourrait être liée à la production de ROS.

Dans le but de combattre le stress oxydatif, les cellules peuvent activer des enzymes antioxydantes, notamment la catalase (CAT), mais lorsque celles-ci se voient défaillantes, les HUFA sont attaquées par les radicaux libres situés sur leur site bisallylique entraînant une peroxydation lipidique [START_REF] Maronić | S-metolachlor promotes oxidative stress in green microalga Parachlorella kessleri-A potential environmental and health risk for higher organisms[END_REF]. ii. Rôle écosystémique : qualité nutritive des diatomées L'analyse des profils d'acides gras est régulièrement utilisée dans l'identification des relations dans les chaînes trophiques [START_REF] Allan | Determining spatial changes in the diet of nearshore suspension-feeders along the South African coastline: Stable isotope and fatty acid signatures: Estuarine[END_REF]El-Sabaawi et al., 2009;[START_REF] Kelly | Fatty acids as dietary tracers in benthic food webs[END_REF][START_REF] Van Den Meersche | Autochthonous and allochthonous contributions to mesozooplankton diet in a tidal river and estuary: Integrating carbon isotope and fatty acid constraints[END_REF].

Les HUFA et en particulier l'EPA sont nécessaires au bon fonctionnement de l'organisme de tous les animaux et à tous les niveaux trophiques. Les animaux sont capables de convertir un acide gras HUFA en un autre en utilisant des processus d'élongation et de désaturation, mais très peu sont capables de synthétiser des HUFA de novo [START_REF] Brett | The role of highly unsaturated fatty acids in aquatic foodweb processes[END_REF] Tout au long de ces travaux de thèse l'analyse des profils d'acides gras s'est vue qualitative du fait de la difficulté à obtenir une concentration cellulaire similaire entre chaque réplicat après l'étape de lavage des échantillons.

De plus, suivant la concentration cellulaire de départ, les centrifugations utilisées dans le but de retirer le milieu de culture peuvent ne pas culotter suffisamment les diatomées engendrant alors une perte de cellule lors du retrait du milieu de culture.

Ainsi, lors d'études prochaines il semble intéressant :

1) D'étudier l'impact de la lyophilisation sur les acides gras des diatomées ;

2) Dans le cas où la lyophilisation n'impacterait pas les profils d'acides gras des diatomées, de remplacer les étapes de centrifugations par le procédé de lyophilisation dans le but de conserver des concentrations cellulaires similaires entre chaque échantillon et de s'affranchir de la perte de cellule lors du retrait du milieu de culture.

c) EPA comme biomarqueur potentiel de la pollution toxique des cours d'eau ?

Il a été démontré dans la littérature que les diatomées avaient une teneur élevée en EPA et constituaient une excellente ressource alimentaire pour le zooplancton [START_REF] Taipale | Fatty acid composition as biomarkers of freshwater microalgae: analysis of 37 strains of microalgae in 22 genera and in seven classes[END_REF].

Cependant, les composés lipidiques et les profils d'acides gras répondent sensiblement aux facteurs de stress et aux modifications de l'environnement [START_REF] Arts | Lipids in Aquatic Ecosystems[END_REF]. Les résultats de ces travaux de thèse ont montré que NPAL était composée d'une proportion plus élevée de DHA que GGRA ; le DHA étant un acide gras oméga-3 essentiel dans le maintien de la fluidité membranaire et important sur le plan nutritionnel dans la chaîne trophique [START_REF] Nichols | Polyunsaturated fatty acids in Antarctic bacteria[END_REF][START_REF] Nishida | Chilling sensitivity in plants and cyanobacteria: the crucial contribution of membrane lipids[END_REF].

De nombreuses études ont montré des profils d'acides gras différents entre les espèces de diatomées [START_REF] Boelen | On the potential application of polar and temperate marine microalgae for EPA and DHA production[END_REF][START_REF] Dunstan | Essential polyunsaturated fatty acids from 14 species of diatom (Bacillariophyceae)[END_REF][START_REF] Pratoomyot | Fatty acids composition of 10 microalgal species[END_REF][START_REF] Ying | Total lipid and fatty acid composition of eight strains of marine diatoms[END_REF] et différentes teneurs en EPA et DHA entre et au sein des classes d'algues [START_REF] Brown | Nutritional value and use of microalgae in aquaculture: Avances en Nutrición Acuícola VI[END_REF][START_REF] Guschina | Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae[END_REF][START_REF] Lv | Variations in lipid yields and compositions of marine microalgae during cell growth and respiration, and within intracellular structures[END_REF].

Par exemple, [START_REF] Pratoomyot | Fatty acids composition of 10 microalgal species[END_REF] ii. Facteurs environnementaux

Concentration en nutriments

Les cultures de diatomées ont été cultivées tout au long de ces travaux dans un milieu Dauta, qui est un milieu riche en nutriments et particulièrement plus riche que dans de nombreuses conditions naturelles (Tableau 10). L'analyse des nutriments (chapitres 3, 4 et 5) a permis de confirmer que le milieu s'appauvrissait peu sur la durée totale des expérimentations.

Or il a été observé dans plusieurs études que la composition en nutriments impactait le profil d'acides gras des diatomées [START_REF] Hill | Light, nutrients and the fatty acid composition of stream periphyton[END_REF][START_REF] Huerlimann | Effects of growth phase and nitrogen starvation on expression of fatty acid desaturases and fatty acid composition of Isochrysis aff[END_REF][START_REF] Lin | Effects of fundamental nutrient stresses on the lipid accumulation profiles in two diatom species Thalassiosira weissflogii and Chaetoceros muelleri[END_REF][START_REF] Lynn | Effect of nutrient availability on the biochemical and elemental stoichiometry in the freshwater diatom Stephanodiscus minutulus (Bacillariophyceae)[END_REF][START_REF] Qiao | Effect of culture conditions on growth, fatty acid composition and DHA/EPA ratio of Phaeodactylum tricornutum[END_REF]Sayanova et al., 2017a;[START_REF] Sharma | High lipid induction in microalgae for biodiesel production[END_REF][START_REF] Sitnik | DGAT1 from the arachidonic-acid-producing microalga Lobosphaera incisa shows late gene expression under nitrogen starvation and substrate promiscuity in a heterologous system[END_REF].

Par exemple, chez la diatomée marine Phaeodactylum tricornutum une augmentation de la concentration en silice a provoqué une diminution de la production des HUFA notamment de l'acide gras EPA [START_REF] Meiser | Optimization of eicosapentaenoic acid production by Phaeodactylum tricornutum in the flat panel airlift (FPA) reactor[END_REF]. [START_REF] Qiao | Effect of culture conditions on growth, fatty acid composition and DHA/EPA ratio of Phaeodactylum tricornutum[END_REF] Par ailleurs un herbicide se présente principalement avec d'autres molécules dans les milieux aquatiques naturels tels que des substances métalliques ou nutriments (nitrate, phosphate, silice) [START_REF] Montuelle | The periphyton as a multimetric bioindicator for assessing the impact of land use on rivers: an overview of the Ardières-Morcille experimental watershed (France), Global Change and River Ecosystems-Implications for Structure, Function and Ecosystem Services[END_REF].

Il a été démontré dans la littérature que la complexité des environnements naturels pouvait moduler les effets d'un polluant : par antagonisme, par exemple avec la stimulation de la croissance du périphyton par une forte concentration en nutriments [START_REF] Lozano | Interaction of toxicants and communities: the role of nutrients[END_REF]Morin et al., 2008b). Cependant, il a été démontré dans plusieurs études que la température impactait la composition en acides gras des diatomées [START_REF] Aussant | Impact of temperature on fatty acid composition and nutritional value in eight species of microalgae[END_REF][START_REF] Bojko | Acclimatization of Thalassiosira pseudonana photosynthetic membranes to environmental temperature changes[END_REF][START_REF] Nalley | Temperature effects on growth rates and fatty acid content in freshwater algae and cyanobacteria[END_REF][START_REF] Steinrücken | Comparing EPA production and fatty acid profiles of three Phaeodactylum tricornutum strains under western Norwegian climate conditions[END_REF].

De manière générale, une augmentation de la température engendre une augmentation de la proportion des SFA. A l'inverse, quand la température diminue, une augmentation des PUFA est observée [START_REF] Sharma | High lipid induction in microalgae for biodiesel production[END_REF]. Ces variations sont expliquées par un ajustement de la production de lipides membranaires par la cellule : une surproduction de lipides composés d'acides gras à haut degré d'insaturations permet de compenser la diminution de la fluidité membranaire aux basses températures, l'augmentation de lipides à longue chaîne et composés d'acides gras saturés au contraire rigidifie la membrane en réponse à une augmentation de fluidité produite par une hausse de température (Gonçalves et al., 2018b).

Chez les diatomées benthiques marines, une accumulation en PUFA a été observée à faible température (Li et al., 2014b). Une étude de [START_REF] Jiang | Effects of lowering temperature during culture on the production of polyunsaturated fatty acids in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum (Bacillariophyceae)[END_REF] sur la diatomée Phaeodactylum tricornutum, soumise à différentes températures (25, 20, 15 puis 10 °C) a démontré que le passage de 25 °C à 10 °C s'est marqué par une diminution de 30 % de l'acide gras saturé 16:0 et d'une augmentation de 85 % de l'acide gras polyinsaturé EPA [START_REF] Jiang | Effects of lowering temperature during culture on the production of polyunsaturated fatty acids in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum (Bacillariophyceae)[END_REF].

Il est intéressant de noter que durant ces travaux de thèse, l'impact du diuron et du Smétolachlore sur les profils d'acides gras de GGRA et NPAL a pu être étudié à une température de 17,5 °C.

Les résultats obtenus sont présentés ci-dessous ;

-Témoins :

Les mêmes tendances ont pu être notées entre les deux espèces étudiées ; l'augmentation de la température de 17,5 °C à 20,5 °C a engendré une diminution de la teneur en SFA, MUFA et une augmentation de celle en PUFA et HUFA (Figure 29). Les résultats ainsi observés ne concordent pas avec la littérature évoquée précédemment.

Cependant, une récente étude a étudié l'impact de la température sur les acides gras de huit espèces de microalgues expliquant l'importance de considérer les conditions optimales de croissances sur leur production de lipides [START_REF] Aussant | Impact of temperature on fatty acid composition and nutritional value in eight species of microalgae[END_REF]. Il a été montré que la production maximale d'EPA chez les espèces étudiées a été observée pour les températures optimales de croissance (températures pour lesquelles la croissance cellulaire est maximale).

Cette approche pourrait alors expliquer les résultats obtenus lors ces travaux de thèse. En effet l'augmentation de la température de 17,5 °C à 20,5 °C s'est traduite par l'augmentation de l'activité photosynthétique des diatomées, suggérant une amélioration de leur état physiologique, ainsi que leur proportion en acides gras insaturés et une diminution des proportions en acides gras saturés.

Finalement, il est possible que la variation des acides gras insaturés due à un stress de température soit observée à des températures plus extrêmes.

-Diuron :

Il a été démontré qu'à 17,5 °C la présence de diuron n'a pas entraîné de modifications significatives chez GGRA contrairement à 20,5 °C où une diminution de la teneur en SFA et HUFA et une augmentation en MUFA ont été observées (Figure 30).

Concernant NPAL, à 17,5 °C le diuron a augmenté la proportion de PUFA et diminué celle en SFA. A une température de 20,5 °C, le diuron a augmenté la teneur en SFA et a diminué celle en HUFA (Figure 31).

-S-métolachlore :

Aucune évolution significative n'a été observée pour la composition en acides gras de GGRA et NPAL en réponse à la contamination en S-métolachlore et aux deux températures testées (Figure 32). De ce fait il serait possible de comparer les résultats obtenus avec ceux de ces travaux de recherches et finalement de déterminer l'influence de la température sur les résultats de nos travaux de thèse.

En effet, une étude réalisée sur la diatomée Navicula pelliculosa, soumise à une contamination en atrazine (connue pour inhiber le photosystème II), a montré une modulation possible de la toxicité de l'atrazine par la température [START_REF] Chalifour | Temperature-dependent sensitivity of growth and photosynthesis of Scenedesmus obliquus, Navicula pelliculosa and two strains of Microcystis aeruginosa to the herbicide atrazine[END_REF]. Pour des descripteurs tels que le taux de croissance, la teneur en pigments et la photosynthèse, la diatomée s'est montrée plus sensible à l'atrazine à basse température. D'autres études ont suggéré qu'une température élevée pouvait diminuer la toxicité des herbicides [START_REF] Guasch | Changes in atrazine toxicity throughout succession of stream periphyton communities[END_REF][START_REF] Larras | The effect of temperature and a herbicide mixture on freshwater periphytic algae[END_REF].

Intensité lumineuse

De la même manière que pour la température, lors de ces travaux de thèse GGRA et NPAL Or il a été noté dans plusieurs études que la composition en pigments, la biomasse mais aussi la composition en acides gras des diatomées, étaient modulées par l'intensité lumineuse [START_REF] Admiraal | Influence of seasonal variations of temperature and light on the growth rate of cultures and natural populations of intertidal diatoms[END_REF]Li et al., 2014b).

Pour des intensités lumineuses élevées, un dommage oxydatif des PUFA ainsi qu'une augmentation des lipides neutres de stockage riches en SFA et MUFA sont observés.

Ce stress est utilisé en biotechnologie et particulièrement dans le domaine de la bioénergie, comme technique d'induction des lipides neutres de stockage pour la production de biocarburant. A l'inverse, une faible intensité lumineuse induit la formation de PUFA. Par exemple, des études sur la diatomée marine Phaeodactylum tricornutum ont noté l'augmentation de la production de l'acide gras EPA à faible intensité lumineuse [START_REF] Sharma | High lipid induction in microalgae for biodiesel production[END_REF].

Par ailleurs, l'étude de Bonnineau et al. (2012) portant sur l'impact du glyphosate sur le biofilm à différentes intensités lumineuses a démontré que la lumière modulait la réponse du biofilm au glyphosate, particulièrement au niveau de l'activité photosynthétique. Une autre étude évaluant la toxicité de l'atrazine sur une communauté de périphyton à différentes intensités lumineuses a démontré que l'inhibition de la photosynthèse était plus importante à forte intensité lumineuse [START_REF] Guasch | Changes in atrazine toxicity throughout succession of stream periphyton communities[END_REF].

Il serait alors nécessaire dans des études prochaines de déterminer l'influence de l'intensité lumineuse sur les résultats de ces travaux de thèse. Des expériences similaires à celles de cette thèse pourraient être réalisées en y ajoutant deux intensités lumineuses complémentaires par exemple (plus basse et plus forte que celle utilisée actuellement).

Par exemple, pour le choix de ces intensités lumineuses complémentaires, il pourrait être envisagé de se baser sur les résultats des Rapid Light Curves obtenues par [START_REF] Coquillé | Fitness of teratological morphotypes and heritability of deformities in the diatom Gomphonema gracile[END_REF], qui présentent une valeur d'intensité pour laquelle démarre la saturation lumineuse pour GGRA à 420 µmol photons.m -2 .s -1 .

iii. Contaminants testés

Mélange de composés

Dans ces travaux de thèse, les impacts des deux herbicides isolés ont été observés. Cependant, les milieux aquatiques naturels sont composés de mélange d'herbicides et non de substances isolées.

Il serait ainsi nécessaire dans de futures recherches d'étudier l'impact de mélange d'herbicides sur les profils d'acides gras d'une seule espèce de diatomée pour commencer telle que GGRA, puis sur plusieurs espèces et pour finir sur un biofilm, dans le but de se rapprocher au mieux des conditions environnementales.

Lors d'une première recherche il serait pertinent d'étudier les impacts du mélange diuron et S-métolachlore sur les profils d'acides gras de GGRA. Les concentrations testées pourraient être similaires à celles utilisées dans cette thèse, à savoir 10 µg.L -1 chacun. Finalement il serait approprié de comparer ces résultats avec ceux obtenus lors de ces travaux de thèse dans le but de déterminer si les effets du mélange concordent avec ces travaux de thèse ou si au contraire les effets de ce mélange se présentent comme antagonistes, synergiques ou additifs.

En effet, [START_REF] Dupraz | Toxicity of binary mixtures of pesticides to the marine microalgae Tisochrysis lutea and Skeletonema marinoi: Substance interactions and physiological impacts[END_REF] ont mené une étude sur l'impact de mélanges de pesticides notamment sur la croissance, la photosynthèse et la teneur lipidique des microalgues marines Skeletonema marinoi et Tisochrysis lutea.

Celle-ci a montré :

-Un effet synergique du mélange d'isoproturon et de métazachlore sur l'activité photosynthétique et la teneur lipidique de l'espèce S. marinoi ;

-Le mélange d'isoproturon et de diuron à quant à lui montré un effet additif notamment sur la teneur lipidique des deux espèces de microalgues.

iv. Finalité : application des profils d'acides gras sur le terrain

Finalement, il serait nécessaire de confronter les résultats de ces travaux de thèse ainsi que ceux des études supplémentaires proposées dans les parties précédentes, par des études sur le terrain en raison de la complexité de l'environnement naturel par rapport aux expériences en laboratoire.

Si des réponses cohérentes sont trouvées, l'analyse des acides gras constituerait une bonne alternative aux biomarqueurs actuels de la pollution au diuron sur le terrain, dans une perspective écosystémique (à travers les aspects de la qualité nutritive des organismes dans la chaîne trophique). • Trois gènes codant pour les enzymes ∆5, ∆6 et ∆9 désaturases ;

• Un gène codant pour l'énoyl-ACP-réductase ;

• Et un gène codant pour la 3-oxoacyl-ACP-synthase.

Concernant le clonage de ces gènes, les produits de PCR codant pour la ∆9 désaturase, la 3- Comme ces organismes constituent la base de la chaîne trophique, nous pouvons supposer des effets directs et indirects de la diminution de la qualité nutritionnelle des diatomées pour les maillons supérieurs [START_REF] Filimonova | Effects of a herbicide and copper mixture on the quality of marine plankton[END_REF][START_REF] Gonçalves | Fatty Acids' Profiles of Aquatic Organisms: Revealing the Impacts of Environmental and Anthropogenic Stressors, Fatty Acids[END_REF]Neury-Ormanni et al., submitted).

Il serait finalement intéressant dans de futures recherches d'étudier l'impact de contaminants, et notamment des herbicides pour complémenter ces travaux de thèse, sur les diatomées ainsi que sur un maillon trophique supérieur tel qu'un brouteur, Daphnia magna par exemple [START_REF] Tifnouti | Etude du régime alimentaire de cinq espèces de Cladocères dans la retenue Lalla Takerkoust (Maroc)[END_REF].

Une

  personnes qui m'ont soutenue, Mais surtout, à Maxime et à ma petite fille… vraiment sympa de jouer tous ensemble. Par contre, je suis obligée d'écrire ici que tes demandes pour manger des crêpes ont été un peu trop régulières 😊 ! Mais tu es largement pardonné grâce aux nombreux Schokobons retrouvés sur mon bureau. Merci à toi Thibault pour ta sympathie et ta gentillesse. Tu as été un super colloc de bureau pour mes derniers mois de thèse. Cela a été un réel plaisir de partager toutes ces discussions avec toi. Je te remercie pour tous tes conseils. Je tiens sincèrement et du fond du coeur à te remercier Cathy R pour ta gentillesse, ta bonne humeur, ton sourire, ta douceur et ton humour qui m'ont fait un bien fou à chaque fois que je te voyais. Merci pour toutes les discussions partagées et notamment celles concernant les bébés. Mon planning de vie personnelle n'aurait pas été le même sans toi… 😊 Je souhaite remercier Aurélie et Sylvia pour leur sympathie et pour toutes les discussions et tous les moments partagés. Je vous remercie sincèrement pour tous les trocs de vêtements bébé que l'on a pu faire ! Merci à Nicolas C, Aurélien, Gwilherm et Jacky pour leur bonne humeur, leur sympathie et les discussions partagées. Merci à toi Gwilherm pour les nombreuses fois où tu as fait fonctionner l'autoclave pour moi, je te remercie sincèrement pour ton aide. Enfin je tiens à remercier Marion, Bertille, Julie, Caroline, Léa, Vincent, Christophe, Christian, Nathalie, Cristina et Léna d'avoir croisé mon chemin. A la revoyure ! Je voudrais sincèrement remercier Imane et Laura pour les supers stages effectués. Votre sérieux, votre persévérance (et surtout toi Imane, bravo à toi !) et votre enthousiasme vous ont permis d'obtenir de jolis résultats et d'écrire d'intéressant rapports. Merci à vous, car vous avez largement contribué à ces travaux de thèse. Je vous souhaite plein de réussite et de bonheur pour la suite. Bon courage à toi Laura pour la suite de ta thèse. Je n'ai aucun doute sur ta réussite, alors fonce ! de rigolades, de discussions et pour tous ces travaux réalisés lors du Master. Je vous remercie d'avoir croisé ma route et j'espère vous avoir auprès de moi très longtemps. Merci à Sandra, Eliska et Giovanni pour le superbe stage à la Station Marine. Ces moments resteront gravés dans ma tête et dans mon coeur pour très longtemps… Merci à Emilie et Lise, mes amies d'enfance, mes amies de toujours. Qui l'aurait cru que je deviendrai Docteur ? Même si ce n'est pas toujours évident de comprendre ce que je fais, pas toujours évident de me suivre dans mes études, vous avez toujours cru en moi et m'avez toujours soutenue dans les choix que j'ai pu faire. Merci pour tout ce que vous avez fait et ce que vous faites pour moi. Vous êtes de l'or. Je vous aime.

3 . 4 . 2 . 3 . 5 . 1 .

 342351 g) Variabilité de la composition en acides gras ......................................................................... i. Stade de croissance ............................................................................................................... ii. Variabilité interspécifique ..................................................................................................... iii. Température ...................................................................................................................... iv. Intensité lumineuse ................................................................................................................v. Concentrations en nutriments................................................................................................ vi. Contamination aux pesticides ................................................................................................ Les pesticides ............................................................................................................................ a) Définition............................................................................................................................... b) Sources et état des lieux de la contamination aquatique en France ....................................... c) Facteurs de transfert des pesticides dans l'environnement aquatique ................................. d) Toxicité des pesticides ......................................................................................................... i. Mode d'action des pesticides ............................................................................................... ii. Impact des pesticides sur les écosystèmes ........................................................................... e) Caractéristiques et toxicité des pesticides sélectionnés pour cette étude............................. i. Diuron .................................................................................................................................ii. S-métolachlore ..................................................................................................................... f) Biomarqueurs de toxicité des pesticides .............................................................................. i. Qu'est-ce qu'un biomarqueur ? .......................................................................................... ii. Exemples appliqués au diuron et au S-métolachlore .......................................................... Objectifs de l'étude ................................................................................................................. Chapitre 2 -Matériel et méthode ........................................................................................................ 1. Matériels biologiques .............................................................................................................. a) Gomphonema gracile Ehrenberg, 1838 .............................................................................. b) Nitzschia palea (Kützing) Smith, 1856 ................................................................................ Préparation des solutions de pesticides et conditions générales d'exposition ......................... a) Préparation des solutions de pesticides ............................................................................... b) Conditions générales d'exposition ...................................................................................... Paramètres chimiques .............................................................................................................. a) Sels nutritifs ......................................................................................................................... b) Dosage des pesticides .......................................................................................................... 4. Paramètres biologiques ............................................................................................................ a) Evaluation de la croissance des diatomées ..........................................................................c) Analyse des profils lipidiques et des acides gras des diatomées ......................................... Analyses statistiques ................................................................................................................ Chapitre 3 -Article 1 .......................................................................................................................... Impact de pesticides sur les descripteurs « classiques » et acides gras de la diatomée Gomphonema gracile .................................................................................................................................................. Chapitre 4 -Article 2 .......................................................................................................................... Variabilité interspécifique des profils d'acides gras et de l'impact de pesticides ............................... Chapitre 5 -Article 3 .......................................................................................................................... Impacts des pesticides sur les lipides de la diatomée Gomphonema gracile ......................................Chapitre 6 -Conclusions générales et perspectives ............................................................................ Conclusions générales ............................................................................................................. a) Impacts des herbicides sur les lipides et acides gras des diatomées .................................... i. Diuron ................................................................................................................................. ii. S-métolachlore ..................................................................................................................... b) Apports des profils d'acides gras dans la détermination des impacts d'une pollution toxique en comparaison avec les descripteurs « classiques » utilisés en écotoxicologie ......................... i. Impacts des contaminants.................................................................................................... ii. Rôle écosystémique : qualité nutritive des diatomées ......................................................... iii. Avantages et limites de l'analyse des profils d'acides gras ............................................ c) EPA comme biomarqueur potentiel de la pollution toxique des cours d'eau ? ................... 2. Perspectives ............................................................................................................................. a) Représentativité de ces travaux de thèse ............................................................................. i. Espèces de diatomées étudiées ............................................................................................ ii. Facteurs environnementaux ................................................................................................ iii. Contaminants testés .........................................................................................................iv. Finalité : application des profils d'acides gras sur le terrain ............................................ b) Impacts des herbicides sur les mécanismes de synthèse des acides gras ............................ c) Impacts des herbicides sur la qualité nutritive des diatomées ............................................. Bibliographie ....................................................................................................................................... Annexes ...............................................................................................................................................

Figure 1 :Figure 2 :Figure 3 :Figure 4 :Figure 5 :Figure 6 :Figure 7 :Figure 8 :Figure 9 :Figure 11 :Figure 12 :Figure 13 :Figure 14 :Figure 17 :Figure 18 :Figure 19 :Figure 21 :

 1234567891112131417181921 Figure 1 : Schéma du frustule d'une diatomée pennale (Gelabert Alexandre©) 61 Figure 2 : Diatomées centrales. (a) Melosira : vue de la valve (à gauche) et vue cingulaire d'une colonie (à droite) ; (b) Coscinodiscus : vue de la valve ; (c) Actinoptychus : vue de la valve (à gauche) et valve cingulaire (à droite) ; (d) Thalassiosira : vue de la valve (en haut) et vue cingulaire d'une colonie (en bas). Échelle = 10 µm. (Brasier 1980). ........................................................................ 64 Figure 3 : Diatomées pennales. (a) Pinnularia : vue oblique montrant le raphé ; (b) Fragilaria : valve avec le pseudoraphé (à gauche) et colonie en vue cingulaire (à droite) ; (c) Achanthes : vue de l'hypovalve avec le raphé (à gauche), vue de l'épivalve avec le pseudoraphé (au centre) et vue de la ceinture (à droite) ; (d) détail d'une aréole d'une diatomée. Échelle = 10 µm. (Brasier 1980). .............. 65 Figure 4 : Différentes espèces de diatomées sous formes solitaires et coloniales (Morin, 2006, photos de Jason Oyadomari©). .................................................... 65 Figure 5 : Schéma de la photosynthèse avec la différenciation de la réaction claire et de la réaction sombre (Matthieu Simon ©). .................................................... 68 Figure 6 : Schéma de la reproduction des diatomées d'après Round et al., 1990 (Nhung Nguyen Deroche©). ............................................................................... 70 Figure 7 : Exemple d'un acide gras saturé (acide stéarique, en haut, noté 18:0) et d'un acide gras insaturé (acide oléique, en bas, noté 18:1n9). ............................ 78 Figure 8 : Schéma de la voie de synthèse des PUFA chez les diatomées. Proposé par Li et al. (2014b). ............................................................................................ 81 Figure 9 : Composition des lipides membranaires et des lipides de réserve. D'après Lehninger et al. (2004). Abréviations : Alc = alcool ; Cho = choline ; MS = monosaccharide ; OS = oligosaccharide ; DS = disaccharide. Les sphingolipides appartenant à la classe des phospholipides correspondent aux sphingomyélines. ............................................................................................................................. 83 Figure 10 : Structure chimique des lipides des membranes des thylakoïdes (membranes internes des chloroplastes) (Mizuwa et al., 2012). ......................... 85

Figure 22 :Figure 24 :Figure 26 :Figure 28 : 5 =Figure 31 :Figure 32 :Figure 33 :Figure 34 :

 22242628531323334 Figure 22 : Biplot of Principal Component Analysis for quantitative data performed for all samples with diuron, S-metolachlor and control treatments. Variables correspond to: Chloro = content of chlorophyll a; Carotene = content of carotenoid; Photo_t7 = photosynthetic activity at T7; Growth_rate = growth rate; SFA = percentage of saturated fatty acid; MUFA = percentage of monounsaturated fatty acid; PUFA = percentage of polyunsaturated fatty acid; HUFA = percentage of highly unsaturated fatty acid. Individuals correspond to: Diu = diuron contamination; Sm = S-metolachlor contamination; Ctrl = control condition. ........................................................................................................... 177 Figure 23 : Biplot of Principal Component Analysis for quantitative data performed for the two species on samples with diuron, S-metolachlor and on control treatments at the end of the experiment (T7). ....................................... 221 Figure 24 : Nitrate concentrations for Dauta medium at T0 and NPAL and GGRA treatments at T7. * indicates significant differences between Dauta medium composition at T0 and other conditions (p < 0.05). Ctrl = control treatment, Diu = diuron treatment, Sm = S-metolachlor treatment. .......................................... 232 Figure 25 : Orthophosphate concentrations for Dauta medium at T0 and NPAL and GGRA treatments at T7. * indicates significant differences between Dauta medium composition at T0 and other conditions (p < 0.05). Ctrl = control treatment, Diu = diuron treatment, Sm = S-metolachlor treatment. ................. 232 Figure 26 : Silicate concentrations for Dauta medium at T0 and NPAL and GGRA treatments at T7. * indicates significant differences between Dauta medium composition at T0 and other conditions (p < 0.05). Ctrl = control treatment, Diu = diuron treatment, Sm = S-metolachlor treatment. .......................................... 233 Figure 27 : Diuron and S-metolachlor-induced changes in lipid composition over time, compared to the control treatment (ctrl) as a reference trajectory. The Principal Response Curve displays the effect of diuron (diu) and S-metolachlor

S

  -metolachlor treatments at T1, T3 and T7. The values are given as means (n = 4) ± SE. * bolded text in red: indicates significant differences between control and contaminated treatments (p < 0.05). Ctrl = Control treatment; Diu = Diuron treatment; Smet = S-metolachlor treatment. ..................................................... 261

1

  photosystème II) et le S-métolachlore (usage grandes cultures, inhibiteur des

  ), sont composées d'un frustule allongé présentant des stries disposées autour d'un plan de symétrie bilatérale. De nombreuses diatomées pennales présentent sur ce plan de symétrie une fente nommée raphé qui est interrompue par un nodule de silice central. Le raphé permet une communication avec le milieu extérieur et l'excrétion de mucilage. Si le raphé est atrophié ou peu marqué, celui-ci est renommé pseudo-raphé. Les diatomées pennales sans raphé sont désignées comme diatomées araphidées ou crypto-raphidées.

Figure 2 :

 2 Figure 2 : Diatomées centrales. (a) Melosira : vue de la valve (à gauche) et vue cingulaire d'une

Figure 3 :

 3 Figure 3 : Diatomées pennales. (a) Pinnularia : vue oblique montrant le raphé ; (b) Fragilaria

Figure 4 :

 4 Figure 4 : Différentes espèces de diatomées sous formes solitaires et coloniales(Morin, 2006,

Figure 5 :

 5 Figure 5 : Schéma de la photosynthèse avec la différenciation de la réaction claire et de la

Figure 6 :

 6 Figure 6 : Schéma de la reproduction des diatomées d'après Round et al., 1990 (Nhung Nguyen

  de doubles liaisons ∆ a,b,c.. = la position des doubles liaisons ; de la première double liaison à partir du groupe méthyl.

Figure 7 :

 7 Figure 7 : Exemple d'un acide gras saturé (acide stéarique, en haut, noté 18:0) et d'un acide gras

Figure 8 :

 8 Figure 8 : Schéma de la voie de synthèse des PUFA chez les diatomées. Proposé par Li et al.

Figure 9 :

 9 Figure 9 : Composition des lipides membranaires et des lipides de réserve. D'après Lehninger et al. (2004). Abréviations : Alc = alcool ; Cho =

Figure 10 :

 10 Figure 10 : Structure chimique des lipides des membranes des thylakoïdes (membranes internes

Figure 11 :

 11 Figure 11 : Exemple d'un triacylglycérol (TAG) composé de trois acides gras différents reliés

Figure 12 :

 12 Figure 12 : Impact du diuron sur le photosystème II des organismes photosynthétiques. Issu

Figure 13 :

 13 Figure 13 : Structures des quatre stéréoisomères du métolachlore. Par Kabler et Chen (2006).

Tableau 4 :

 4 photolyse

Tableau 5 :

 5 Photosynthèse

3 )

 3 la concentration en chlorophylle a et en caroténoïdes effectuée (sur le ballon supplémentaire pour les manipulations 1 et 2) au début (T0) et à la fin (T7) sur l'ensemble des traitements de chaque condition et de chaque espèce ; 4) la répression et/ou l'induction de gènes d'intérêt effectuée à la fin (T7) de l'expérimentation ; 5) l'analyse des profils d'acides gras effectuée au début (T0) (sur le ballon supplémentaire pour les manipulations 1 et 2) et à la fin (T7) sur l'ensemble des traitements de chaque condition et de chaque espèce.

L

  'analyse des nitrates et des phosphates a été réalisée à partir de 15 mL d'échantillon filtré et dilué deux fois avec de l'eau ultra pure avant injection (100 µL). L'analyse a été effectuée par chromatographie ionique avec suppression chimique (COMPACT 881 IC Pro, Metrohm, Suisse) et avec un détecteur de conductivité Metrohm 850 IC. La séparation a été exécutée avec une pré-colonne Metrosep A Supp 4/5 Guard/4.0 suivie d'une colonne échangeuse d'anions Metrosep A sup 5 -250/4.0. L'éluant était une solution de 3,2 mM Na2CO3 et 1 mM NaHCO3, et la suppression chimique était une solution de 10 mM H2SO4.

L

  'analyse des silicates a été effectuée sur 20 mL d'échantillon. Les concentrations en silicates solubles ont été déterminées par colorimétrie à l'aide d'un spectrophotomètre Shimadzu UV-1800 (Shimadzu Inc., Kyoto, Japon) en suivant la norme française NF T90-007 (AFNOR, 2001). b) Dosage des pesticides L'échantillonnage de l'eau a été effectué au début (T0), à un jour (T1), à trois jours (T3) et à la fin (T7) de chaque manipulation. Un millilitre et demi d'eau a été prélevé pour l'analyse de la concentration en S-métolachlore et en diuron dans l'eau dans le but de déterminer la concentration réelle d'exposition des diatomées aux pesticides. Les échantillons ont été filtrés à l'aide de seringues composées de filtres en cellulose régénérée (Spartan® diamètre 13 mm, taille des pores 0,45 µm, Whatman®) avant de les stocker à -20 °C jusqu'à l'analyse par chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse en tandem (HPLC-ESI-MS/MS). Pour le dosage, les échantillons ont été décongelés puis pré-concentrés deux fois (évaporation de 1 mL à l'aide d'un système RapidVap puis dilution des résidus dans un mélange d'eau ultrapure et acétonitrile 90/10 (v/v)) avant l'analyse par chromatographie. L'analyse chromatographique a été réalisée avec une colonne Gemini-NX C18 3 μm, 110 A, 100 mm × 2 mm équipée d'une SecurityGuard de Phenomenex (Le Pecq, France) et d'une chaîne HPLC Ultimate 3000 (DIONEX, Voisins-le-Bretonneux, France). La quantification des pesticides est faite par un spectromètre de masse à triple quadripôle API 2000 (AB SCIEX, Les Ulis, France). Le volume d'injection était de 50 μL. Les deux éluants étaient l'acétonitrile et une solution d'eau ultrapure et d'acétate d'ammonium à 5 mM avec un débit constant de 400 μLmin -1 .

  photosynthétiques transformant l'énergie lumineuse en énergie chimique dans le but de

Figure 14 :

 14 Figure 14 : Schéma de la technique de mesure de l'émission de la fluorescence modulée de la

Figure 16 :

 16 Figure 16 : Schéma du protocole simplifié de la RT-PCR employé dans cette étude.

I

  (Roche), Taq Polymerase, dNTP), 2 μL du couple de primers spécifiques de chaque gène à une concentration finale de 300 nM, 3,2 μL de MgCl2 [25mM], 1 μL d'ADNc et 12,8 μL d'eau traitée au diéthyl pyrocarbonate (DEPC). La PCR en temps réel a été réalisée avec un LightCycler (Roche) avec 1 cycle à 95 °C pendant 1 min et 50 cycles d'amplification à 95 °C pendant 5 s, 60 °C pendant 5s et 72 °C pendant 20 s.

Figure 17 :

 17 Figure 17 : Schéma simplifié de la réaction de transcription inverse (RT).

  . Deux millilitres de chloroforme/méthanol (2:1, v/v) ont été ajoutés et les échantillons ont été stockés à 4 °C jusqu'à leur analyse. Cinq cents microlitres d'eau ont ensuite été ajoutés à chaque échantillon. Ils ont été vortexés et centrifugés pendant 10 min à 3 800 tr.min -1 . Après centrifugation la phase organique a été récupérée et transférée dans un tube propre. Les lipides restants de la phase aqueuse ont été extraits en ajoutant à nouveau deux millilitres de chloroforme et en agitant. Après centrifugation pendant 10 min à 3 800 tr.min -1 , les phases organiques ont ensuite été regroupées et évaporées à sec sous courant d'azote. Les lipides ont ensuite été remis en suspension dans 70 µL de chloroforme/méthanol (2:1, v/v) puis ont été vortexés avant d'être conservés à -20 °C jusqu'à l'analyse.

L

  'analyse des profils d'acides gras a été réalisée au début (T0) et à la fin (T7) des manipulations concernant les chapitres 3 et 4 et à T1, T3 et T7 pour l'expérience du chapitre 5. Le protocole d'analyse était basé sur celui de Le Guédard et al. (2008). Vingt millilitres ont été prélevés pour chaque échantillon pour cette analyse. Après l'ajout d'un millilitre dans chaque échantillon de méthanol contenant 2,5 % H2SO4 (v/v), les tubes ont été chauffés à 80 °C pendant 1 h et ont été finalement refroidis à température ambiante pendant 10 min. Les esters méthyliques d'acides gras (en anglais = FAMEs : fatty acid methyl esters) ont été obtenus par transestérification (Figure 18) avant l'analyse par chromatographie en phase gazeuse (CPG). Cette transestérification permet de synthétiser des esters méthyliques d'acides gras (FAMEs) ayant des points d'ébullition moins élevés que les acides gras. L'analyse par CPG a pu ainsi être effectuée à des températures plus basses compatibles avec la résistance de la colonne.

Figure 18 :

 18 Figure 18 : Réaction de transestérification en catalyse acide.

4 )

 4 le facteur de répression ou d'induction de chaque gène d'intérêt (manipulations 1 et 2) ; 5) les concentrations en nutriments et le traitement avec des pesticides (manipulations 1 et 2) ; 6) la teneur en acides gras totaux dans chaque lipide (manipulation 3) ; 7) la teneur en acide gras 20:5n3 dans chaque lipide (manipulation 3) ; 8) l'activité de photosynthèse (manipulations 1, 2 et 3) ; Chapitre 3 -Article 1 Impact de pesticides sur les descripteurs « classiques » et acides gras de la diatomée Gomphonema gracile En France, les pesticides sont régulièrement détectés dans les cours d'eau en raison des activités agricoles (SOeS, 2015) et les rivières sont fréquemment contaminées par ces produits chimiques. En effet, leur utilisation s'effectue en milieu terrestre mais par le biais des pulvérisations aériennes, du lessivage, du ruissellement ou des déversements accidentels, les réceptacles finaux de ces composés deviennent les milieux aquatiques[START_REF] Vidal | Acute and chronic toxicity of Betanal®Expert and its active ingredients on nontarget aquatic organisms from different trophic levels[END_REF].

  Cependant à notre connaissance, aucune étude n'a encore porté sur l'impact des herbicides sur les profils d'acides gras des diatomées d'eau douce.Dans ce contexte, l'effet de deux herbicides, le diuron et le S-métolachlore, à concentration environnementale (10 µg.L -1 )[START_REF] Coquillé | Use of diatom motility features as endpoints of metolachlor toxicity[END_REF][START_REF] Moisset | Genetic and physiological responses of three freshwater diatoms to realistic diuron exposures[END_REF] aAbstractFatty acids (FA) are crucial for the maintenance of membrane fluidity and play a central role in metabolic energy storage. Polyunsaturated fatty acids play an essential ecological role since they are key parameters in the nutritional value of algae. Pesticide impacts on fatty acid profiles have been documented in marine microalgae, but remain understudied in freshwater diatoms.

  'M With: -F being the minimum fluorescence determined after exposure to a weak far red modulated light -F'M being the maximum level of fluorescence measured during a saturating white light pulse

  Samples were stored one night at 4 °C and then at -80 °C until the genetic analysis. The protocols of RNA extraction, Reverse Transcription of RNA and Real-Time q-PCR were based on the protocol of Kim Tiam et al. (2012) and carried out at the end of the experiment. Ten genes were studied; three involved in mitochondrial metabolism (cox1 (cytochrome C oxidase subunit I), 12S (mitochondrial ribosomal RNA 12S) and nad5 (NADH dehydrogenase subunit 5)), two involved in photosynthetic activity (d1 (D1 protein) and psA (PsaA protein)), two involved in oxidative stress (cat (catalase) and gpx (glutathione peroxidase)

Figure 19 :

 19 Figure 19 : Percentage in SFA, MUFA, PUFA and HUFA for the species Gomphonema gracile

Figure 20 :

 20 Figure 20 : Fatty acid profiles (% of fatty acid) in the species Gomphonema gracile at T7 for

Figure 21 :

 21 Figure 21 : Fatty acid profiles (% of fatty acid) in the species Gomphonema gracile at T7 for

Figure 22 :

 22 Figure 22 : Biplot of Principal Component Analysis for quantitative data performed for all

chapitre 3 ✓

 3 Photosynthetic activityPsaA protein (psaA) HM 449705

  Photosynthetic activity

Figure 23 :

 23 Figure 23 : Biplot of Principal Component Analysis for quantitative data performed for the two

  Photosynthesis---= =

  Contrary to N. palea, the significant decrease in the growth rate of G. gracile could be linked to an increase in ATP demand in G. gracile since the energy in the cell could be reallocated to detoxification mechanisms to fight molecular effects of S-metolachlor (as shown by Kim Tiam et al., 2018 for cadmium).[START_REF] Coquillé | Use of diatom motility features as endpoints of metolachlor toxicity[END_REF] observed a decrease in cell concentrations of G. gracile with S-metolachlor contamination at 100 µg.L -1 .

Figure 24 :

 24 Figure 24 : Nitrate concentrations for Dauta medium at T0 and NPAL and GGRA treatments at

Figure 25 :

 25 Figure 25 : Orthophosphate concentrations for Dauta medium at T0 and NPAL and GGRA

Figure 26 :

 26 Figure 26 : Silicate concentrations for Dauta medium at T0 and NPAL and GGRA treatments

A retenir de ce chapitre 4 ✓

 4 Cette étude est l'une des rares à observer la variabilité des profils d'acides gras entre les diatomées d'eau douce, avec ou sans contamination au diuron et S-métolachlore. Par exemple, sans contamination, les proportions en SFA et en HUFA étaient plus importantes et celles en MUFA et DHA moins importantes chez GGRA que NPAL.

Figure 27 :

 27 Figure 27 : Diuron and S-metolachlor-induced changes in lipid composition over time,

Figure 28 :

 28 Figure 28 : Biplot of Principal Component Analysis for quantitative data performed for G.

( 5 ✓✓Chapitre 6 -

 56 photosynthèse(DGTA et DGDG).

  Il a été démontré dans la littérature qu'un toxique entrant dans une cellule pouvait générer une accumulation de ROS[START_REF] Wang | Cadmium inhibits the electron transfer chain and induces reactive oxygen species[END_REF]. Les ROS sont connus pour avoir différentes cibles cellulaires (noyau, mitochondries et chloroplastes) et en excès ceux-ci peuvent être toxiques pour la cellule.

  En effet, ces travaux de thèse (chapitres 3 et 4) ont démontré une diminution de la teneur totale en EPA chez GGRA et NPAL après sept jours d'exposition au diuron à 10 µg.L -1 . Dans le chapitre 5, contrairement à l'analyse lipidique totale, une diminution de la teneur en EPA a été mise en évidence principalement pour les lipides PA/DGTA, DGDG et PC après contamination par le diuron. Aussi, contrairement à l'analyse des lipides totaux, la durée d'exposition n'a pas eu d'incidence sur la réponse du contenu en EPA dans les lipides sous traitement au diuron (à partir de T3), suggérant une stabilité de la réponse de l'EPA au diuron en faveur de son utilisation comme biomarqueur. Cependant, afin de confirmer cette hypothèse il serait nécessaire dans des études futures de réaliser des expériences similaires avec d'autres herbicides, concentrations d'exposition, paramètres environnementaux (température et intensité lumineuse) et autres espèces étudiées, afin de prouver la pertinence du contenu en EPA en tant que biomarqueur de la pollution par certaines classes d'herbicides. a) Représentativité de ces travaux de thèse i. Espèces de diatomées étudiées Nombre d'espèces étudiées Lors de ces travaux de thèse, les réponses de deux cultures monospécifiques de diatomées d'eau douce ont été analysées. Ces deux espèces ont été sélectionnées sur la base de leurs écologies très différentes et de leurs réponses contrastées à une exposition aux herbicides, de manière à couvrir une gamme de réponses possibles larges. En effet, Morin et al. (2009) avaient montré que les abondances relatives élevées de NPAL étaient plutôt associées à des concentrations de pesticides faibles in situ, tandis que les abondances de GGRA étaient plus importantes dans les sites présentant des apports de pesticides élevés. A l'inverse, Larras et al. (2012) ont montré, à partir de courbes d'écotoxicité basées sur la croissance algale en 96 h, que NPAL faisait partie des espèces de diatomées les moins sensibles à l'atrazine, au terbutryne, au diuron et à l'isoproturon parmi une sélection de 11 espèces de diatomées d'eau douce. Wood et al. (2016) ont quant à eux démontré, à partir de l'état général de la cellule (les cellules intactes contenant des chloroplastes étaient considérées comme saines, alors que les cellules vides, cassées, déformées était considérées comme en mauvais état), que GGRA était la troisième espèce la plus sensible aux herbicides inhibiteurs du photosystème II, tel que le diuron, parmi une sélection de huit espèces de diatomées d'eau douce. GGRA a été cependant classée comme une des espèces les moins sensibles aux herbicides ayant une cible cellulaire différente au photosystème II.Cependant, par analogie aux résultats obtenus lors de ces travaux de thèse, les données citées précédemment sont issues d'études n'observant la réponse que d'un seul descripteur suite à une contamination en herbicides. En effet, une espèce peut paraître sensible sur un paramètre, tel que la photosynthèse par exemple, mais peut allouer en parallèle toute son énergie plutôt à la croissance et donc au maintien de sa population.

  ont démontré qu'une limitation en nitrate augmentait les SFA et MUFA mais diminuait les PUFA. Hill et al. (2011) ont quant à eux noté une diminution des SFA et MUFA et une augmentation des PUFA avec un enrichissement du milieu en phosphate.

1 ) 4 )

 14 En effet, ces travaux de thèse n'ont pas démontré d'impacts importants du S-métolachlore sur les paramètres biologiques étudiés tels que les profils d'acides gras. Plusieurs hypothèses ont pu être formulées pour expliquer ces résultats, notamment celle stipulant que les fortes concentrations en nutriments présentes dans le milieu Dauta (surtout nitrate et phosphate) auraient pu masquer partiellement les effets de ce pesticide. Il serait donc intéressant dans une future étude d'étudier l'impact de ces fortes concentrations en nutriments, et notamment les ratios N/P (nitrate/phosphate) sur la toxicité du S-métolachlore et du diuron sur les profils d'acides gras de G. gracile. Pour ce faire G. gracile pourrait être exposée à des traitements similaires à ceux utilisés lors des recherches actuelles mais en y ajoutant : Un témoin avec une concentration plus faible en nitrate et un second avec une concentration plus faible en phosphate dans le but de modifier le ratio N/P (divisé par 2) ; 2) De la même manière que précédemment, un témoin avec une seconde concentration plus faible en nitrate et un second avec une concentration plus faible en phosphate (divisée par 10) ; 3) Un traitement S-métolachlore et un traitement diuron, mélangés au milieu Dauta composé d'une concentration plus faible en nitrate puis en phosphate (divisée par 2) ; Un traitement S-métolachlore et un traitement diuron, mélangés au milieu Dauta composé d'une seconde concentration plus faible en nitrate puis en phosphate (divisée par 10). Tableau 10 : Concentrations moyennes en nitrate, phosphate et silice (mg.L -1 ) dans le milieu Dauta utilisé dans ces travaux en comparaison aux concentrations moyennes (mg.L -1 ) retrouvées dans les bassins versant de la Garonne, Seine, Loire et du Rhône (données issues de l'étude de Leboucher et al. (submitted) pour la période Avril -Novembre), et en comparaison aux valeurs de concentrations moyennes (mg.L -1 ) de nutriments (2009-2015) retrouvées dans les cours d'eau français et issues d'une base de données de paramètres physico-chimiques accessible dans la base Pandore. ou soumis issus de ces travaux de thèse portent sur l'exposition des cultures de diatomées à une seule température, qui a été sélectionnée en fonction de recherches bibliographiques et d'études déjà réalisées au sein du laboratoire. La température alors choisie a été celle de 20,5 °C représentant la température optimale de croissance des cultures étudiées.

Figure 29 :

 29 Figure 29 : Pourcentages d'acides gras chez GGRA (à gauche) et NPAL (à droite) aux deux

Figure 30 :

 30 Figure 30 : Pourcentage d'acides gras de GGRA sans et avec contamination en diuron aux deux

Figure 31 :

 31 Figure 31 : Pourcentage d'acides gras de NPAL sans et avec contamination en diuron aux deux

Figure 32 :

 32 Figure 32 : Pourcentage d'acides gras de GGRA (à gauche) et de NPAL (à droite) sans et avec

  n'ont été exposées qu'à une seule intensité lumineuse, choisie à partir d'expériences précédentes réalisées au sein du laboratoire et pour laquelle la croissance des diatomées paraissait optimale pour l'espèce GGRA. Cette intensité était de 45 µmol photons.m -2 .s -1 . Pour des raisons logistiques et pratiques et dans le but d'avoir des paramètres environnementaux similaires entre les deux espèces de diatomées étudiées, l'intensité lumineuse appliquée pour l'espèce NPAL a été la même que celle appliquée pour GGRA.

  Des recherches précédentes réalisées au laboratoire Irstea ont permis de développer un système d'encagement (Vincent Roubeix, Irstea) composé d'un tube en plastique obturé par des membranes dont la porosité permet le transfert de substances dissoutes uniquement et permettant ainsi le passage des expérimentations aux conditions environnementales parfaitement maitrisées utilisant des cultures mono-ou plurispécifiques à des expositions in situ d'organismes "encagés" (Figure33). L'impact uniquement des conditions abiotiques du milieu sur les profils d'acides gras et lipidiques des diatomées serait alors envisageable via ce système (encagement de populations par exemple) tout en s'affranchissant de la variabilité de réponses inter-espèces.Le transfert de substances au travers de la membrane composant ce système a pu être étudié et validé lors du stage de Audrey Lasserre (2016) offrant ainsi des perspectives prometteuses à ce type d'encagement pour l'exposition semi-contrôlée de populations aux mélanges réels de contaminants présents in situ.

Figure 33 :

 33 Figure 33 : Système d'encagement sans renouvellement d'organismes développé par Vincent

  oxoacyl-ACP-synthase et l'énoyl-ACP-réductase ont été envoyés au séquençage. Parmi les séquences obtenues, seule la ∆9 désaturase s'est montrée exploitable ; elle est composée de 494 nucléotides. Une interrogation de banque de donnée via l'algorithme Blast a montré que cette séquence code pour une protéine de 164 acides aminés possédant de fortes homologies avec des ∆9 désaturases. Finalement, en plus des dix gènes d'intérêt de ce travail, il serait intéressant d'étudier la réponse du gène ∆9 désaturase obtenue lors de la recherche de gènes, face à une contamination aux herbicides. Il serait donc pertinent de réaliser des études complémentaires en y insérant la réponse de ce gène face à une contamination et notamment aux herbicides afin de compléter ces travaux de thèse. De même, il serait intéressant de poursuivre la recherche des gènes codant pour la 3-oxoacyl-ACP-synthase et l'énoyl-ACP-réductase et de les intégrer dans le cas de résultats positifs dans des études complémentaires. L'étude de la réponse de ces gènes permettrait de renseigner sur les effets des herbicides (ou autres contaminants) au niveau des voies de synthèse des acides gras. En comparant les niveaux d'expression induits par les herbicides et les profils d'acides gras obtenus, il serait ainsi possible d'obtenir des informations supplémentaires sur le mode d'action de ces contaminants. Aussi, il serait intéressant de coupler des analyses transcriptomiques (RNAseq) à des analyses protéomiques haut débit dans le but d'observer la corrélation des réponses, face à une contamination, des étapes de transcription et de traduction réalisées pour la synthèse des acides gras. De plus, il serait envisageable de coupler ces analyses à des analyses de métabolomiques qui permettraient d'obtenir une vision plus exhaustive de la réponse des diatomées face à une contamination et ainsi d'observer des modifications de certaines voies de synthèse comme celle des lipides par exemple.c) Impacts des herbicides sur la qualité nutritive des diatoméesCes travaux de thèse ont démontré que le diuron diminuait les proportions d'EPA chez les diatomées d'eau douce GGRA et NPAL.

1 )

 1 future recherche pourrait avoir l'objectif d'étudier les impacts directs et indirects de deux contaminants : le S-métolachlore et le diuron sur une chaîne trophique simplifiée. Celle-ci permettrait d'évaluer l'ampleur des impacts directs et trophiques de ces polluants à deux concentrations distinctes, une environnementale et une élevée. Ces deux concentrations seraient choisies à partir des valeurs d'écotoxicité (CE50) retrouvées dans la littérature pour les daphnies et les diatomées (Tableau 12). Tableau 12 : CE50 -CL50 du diuron et du S-métolachlore pour les daphnies et les diatomées. Dans un premier temps, l'impact de la contamination directe serait étudié dans deux expériences à court terme sur une diatomée d'une part et sur un brouteur d'autre part (Figure 34). a) D'une part, la diatomée d'eau douce GGRA serait exposée seule pendant sept jours à ces contaminants ; ❖ Chaque jour, l'inhibition de la croissance serait déterminée par un comptage quotidien des cellules sur cellule de Nageotte et l'activité photosynthétique à l'aide d'un fluorimètre PHYTO-PAM. ❖ La bioaccumulation des contaminants dans GGRA serait déterminée à T1 et T7 suivant le protocole de Coquillé et al. (2015). ❖ Après 7 jours d'exposition, le profil lipidique et le profil d'acides gras (notamment EPA) de GGRA seraient analysés. b) D'autre part, le brouteur Daphnia magna (nourri quotidiennement par une culture non contaminée de GGRA) serait exposé pendant sept jours avec les mêmes contaminants et les mêmes concentrations que l'expérience sur GGRA. ❖ Chaque jour, la survie et l'immobilisation de Daphnia magna seraient déterminées. ❖ La bioaccumulation des contaminants serait également étudiée à T1 et T7. ❖ Après les 7 jours d'exposition, le profil lipidique et le profil en acides gras (notamment EPA) du brouteur seraient analysés. ❖ Entre T0 et T7, des comptages de diatomées serait réalisés pour chaque traitement dans le but de connaître la quantité de diatomées ingérées par Daphnia magna sans et avec contamination ; le prélèvement pour le comptage étant réalisé avant l'ajout quotidien de nourriture.

Figure 34 :

 34 Figure 34 : Design expérimental de l'expérience en contamination directe de GGRA et D. magna par le diuron et le S-métolachlore.

Figure 35 :Annexe 2 :

 352 Figure 35 : Design expérimental de l'expérience en contamination indirecte (voie trophique) de D. magna par GGRA contaminée en diuron et S-métolachlore.

Tableau 1 :

 1 Acides gras majoritaires et biomarqueurs chez les Bacillariophyceae (diatomées). Extrait de Taipale et al. (2013). ...................................................... 87 Tableau 2 : Classes de pesticides et leurs cibles associées. Les classes soulignées représentent les trois catégories principales de pesticides retrouvées. ............... 98 Tableau 3 : Mode d'action des familles de pesticides les plus représentées. D'après Fauvelle (2012). ................................................................................................. 103 Tableau 4 : Caractéristiques des deux pesticides sélectionnés -T1/2 correspond au temps de demi-vie de la molécule. LogKow correspond au coefficient de partage octanol / eau de la molécule. ................................................................ 107 Concentration en sels nutritifs dans les échantillons témoins à T0 aux deux températures testées. ................................................................................. Tableau 12 : CE 50 -CL 50 du diuron et du S-métolachlore pour les daphnies et les diatomées. ..........................................................................................................

Tableau 5 : Précédentes recherches étudiant la réponse de biomarqueurs considérés ici comme « classiques » à différents niveaux cellulaires vis-à-vis de la toxicité du diuron et du S-métolachlore. ....................................................... 110 Tableau 6 : Numéros d'accession et couples de primers spécifiques aux 10 gènes de GGRA et NPAL utilisés dans ces travaux de thèse. Abréviations : a Amorce sens. b Amorce anti-sens. .................................................................................... 142 Tableau 7 : Liste non exhaustive des avantages et des limites de l'analyse des profils d'acides gras des diatomées. .................................................................. 287 Tableau 8 : Durée approximative de l'analyse de 10 échantillons pour les différents descripteurs étudiés dans ces travaux de thèse. ................................ 290 Tableau 9 : Acides gras majoritaires et typiques de chaque classe d'algue. Extrait de Taipale et al. (2013). ..................................................................................... 300 Tableau 10 : Concentrations moyennes en nitrate, phosphate et silice (mg.L -1 ) dans le milieu Dauta utilisé dans ces travaux en comparaison aux concentrations moyennes (mg.L -1 ) retrouvées dans les bassins versant de la Garonne, Seine, Loire et du Rhône (données issues de l'étude de Leboucher et al. (submitted) pour la période Avril -Novembre), et en comparaison aux valeurs de concentrations moyennes (mg.L -1 ) de nutriments (2009-2015) retrouvées dans les cours d'eau français et issues d'une base de données de paramètres physico-chimiques accessible dans la base Pandore. ....................................................................... 303 Tableau 11 :

Table 1 :

 1 Differential gene expression as compared to β-actin for the taxonGomphonema gracile exposed to diuron and S-metolachlor (Mean (± SE); n = 4).

	Only factors showing significant differences (p-value < 0.05) are shown in this
	table. Significant induction (> 2, grey square) are indicated by values, compared
	to the respective controls. / : expression identical to control levels. ................. 172
	Table 2 : SI.1 -Mean (± SE) concentration of nitrates (NO3 -), orthophosphates
	(PO4 -) and silicates (Si) at the beginning (T0) and the end (T7) of the experiment
	using the taxon Gomphonema gracile in control, diuron and S-metolachlor-treated

conditions (n = 4). ............................................................................................. 189

Table 3 :

 3 SI.3 -Ten genes studied in this experiment and their associated functions.

........................................................................................................................... 191

Table 4 :

 4 Ten genes studied in this experiment and their associated functions.211

Table 5 :

 5

Differential gene expression as compared to β-actin in G. gracile and N. palea exposed to diuron and S-metolachlor (Mean; n = 4) at the end of the experiment (T7). Only factors showing significant differences between control and contaminated conditions (p-value < 0.05) are shown in this table. Significant induction factors (> 2, grey square) and repression factors (< 0.5, hatched square) are indicated compared to the respective controls. /: expression identical to control levels. a indicates a significant difference between G. gracile and N. palea. ... 215 Table 6 : Fatty acid profiles (%) of G. gracile and N. palea for control, diuron and S-metolachlor treatment (T7). The values are given as means ± SE (n = 4). a indicates significant differences between control and contaminated treatments (10 µg.L -1 ) at T7, b indicates a significant difference between G. gracile and N. palea at T7 (p < 0.05). ................................................................................................. 217

Table 7 :

 7 Summary table (based on percentage of inhibition compared to control .......................................................................................................................... 223

treatment) of diuron and S-metolachlor-induced damage on N. palea and G.

gracile. -: decrease in studied descriptor; --: greater decrease in studied descriptor than other species considered (p < 0.05); +: increase in studied descriptor; ++ greater increase in studied descriptor than other species considered (p < 0.05).

.

Table 8 :

 8 Percentage of fatty acids for G. gracile and N. palea at T0. ............. 234

Table 9 :

 9 Pigment concentrations for G. gracile and N. palea at T0. ............... 235

	Table 10 : Proportion of total FA in each lipid (%) in control, diuron and S-
	metolachlor treatments at T1, T3 and T7. The values are given as means (n = 4) ±
	SE. a bolded text in orange: indicates significant differences between control
	treatment at T7 and the other sampling times (T1 and/or T3) (p < 0.05). * bolded

text in red: indicates significant differences between control and contaminated treatments (p < 0.05). Ctrl = Control treatment; Diu = Diuron treatment; Smet = S-metolachlor treatment. ................................................................................... 258

Table 11 : Proportions of EPA (%) in each lipid (Table 10) in control, diuron and

  En collaboration avec les agences de l'eau et les services du Ministère de l'environnement, l'Irstea a mis au point plusieurs indices basés sur les diatomées dans le but d'estimer la qualité

écologique des cours d'eau. L'Indice Biologique Diatomées a notamment été créé (IBD, Coste et al., 2009) et est utilisé en routine dans plusieurs pays européens pour la surveillance de la qualité des cours d'eau.

Rôle des diatomées dans l'écosystème aquatique

  . Par exemple, Qiao et al. ont démontré en 2016 qu'une faible concentration en nitrates provoque un stress chez Phaeodactylum tricornutum avec une diminution du taux de croissance.

	i. Production d'oxygène
	Les diatomées étant des organismes photosynthétiques, celles-ci synthétisent de l'oxygène et
	des sucres à partir de dioxyde de carbone et de molécules d'eau (section 1-b-i). Celles-ci
	peuvent fixer jusqu'à 20 % du CO2 global, qui est alors converti en hydrates de carbone ou en
	lipides (Zulu et al., 2018). De plus, environ 20 % de la production d'oxygène atmosphérique
	est assurée par ces organismes unicellulaires (Lavoie, 2008) malgré le fait que ceux-ci
	représentent moins de 1 % de la biomasse végétale (d'Elbée, 2016).

d)

Groupe de phytoplancton Acides gras majoritaires Biomarqueurs

		Taipale et al. ont démontré en 2013 que
	d'autres acides gras, présents en plus faibles proportions, pouvaient être utilisés en tant que
	biomarqueurs comme indiqué sur le Tableau 1.
	Tableau 1 : Acides gras majoritaires et biomarqueurs chez les Bacillariophyceae (diatomées).
	Extrait de Taipale et al. (2013).
		16:2n7 ; 16:2n4 ; 16:3n4 ;
	Bacillariophyceae	16:1n7 ; 20:5n3 ; 16:0 ; 14:0
		16:4n1 ; 18:4n4

  Dans des conditions de croissance normale, l'ATP et le NADPH produits par la photosynthèse sont consommés en générant de la biomasse, avec éventuellement ADP et NADP + à nouveau disponibles comme accepteurs d'électrons lors de la photosynthèse. Lorsque la croissance et la prolifération cellulaires sont altérées en raison du manque de nutriments, la quantité du principal accepteur d'électrons de la photosynthèse, le NADP + , peut être diminué. Puisque la

photosynthèse est principalement contrôlée par l'abondance de lumière et ne peut pas être complètement stoppée, le NADPH produit est consommé pour la biosynthèse des acides gras (TAG) et réapprovisionne ainsi la quantité de NADP +

  de diamètre, Sartorius AG) ont été ajoutés aux échantillons. Les diatomées ont été broyées par passage dans un appareil MPFastPrep (40 s à 6 m.s -1 ). Le surnageant a été placé dans un bain-marie à 37 °C pendant 5 min. Deux cents microlitres de chloroforme RECTAPUR (VWR) ont été ajoutés et l'échantillon a été vortexé Les colonnes ont été transférées dans des tubes propres. Afin de récupérer les ARNs totaux, 30 µL de tampon d'élution à 60 °C ont été ajoutés aux tubes.

pendant 10 s. Après homogénéisation, l'échantillon a été placé dans un bain-marie à 37 °C pendant 2 min. Après une centrifugation de 5min à température ambiante et à 8 000 g, la phase aqueuse, contenant les acides nucléiques, a été transféré dans des tubes propres.

Selon les instructions du fabricant du kit Absolutely RNA Miniprep (Stratagene), 550 µL d'éthanol à 75 % ont été ajoutés à la phase aqueuse ; l'échantillon a été mélangé et transféré sur des colonnes d'affinité. L'échantillon a été centrifugé pendant 1 min à température ambiante à 8 000 g. Une fois les filtrats éliminés, 600 µL de tampon de lavage à faible teneur en sel ont été placés sur la colonne et centrifugés pendant 2 min à température ambiante à 8 000 g. Afin d'éliminer toute trace d'ADN génomique, la colonne a été placée dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 min après l'addition d'un mélange contenant 5 µL de DNase I [1 U], 5 µL de MgCL2 [25 mM] et 40 µL de tampon d'activité (Yellow core buffer). Après l'ajout de 600 µL de tampon de lavage à forte teneur en sel, la colonne a été centrifugée pendant 1 minute à 8 000 g. Enfin, 300 µL de tampon de lavage à faible teneur en sel ont été ajoutés à la colonne qui a alors été centrifugée pendant 2 min à 8 000 g.

  Numéros d'accession et couples de primers spécifiques aux 10 gènes de GGRA et NPAL utilisés dans ces travaux de thèse. Abréviations : a Amorce sens. b Amorce anti-sens.

	Nom du gène (Abréviations)	Numéro d'accession	Primer (5' -3')	Fonction
	β-actine	HM	CGACAGGACGGCCTGGATG TT a
	(β-act)	449707	CCAACCGCGAGCGCATGAC G b	Gènes de
	Protéine ribosomale L7 (RPL7)	CM 000639	ATTTTCAAGCGCGCGCGGAG AAGTA a CGTAGCCGCGCTTGTAGATG AGCTC b	référence
		HM 449704
	Sous-unité 1 de la		CAGTAATTCTCACTGCCCAG
	cytochrome C oxydase		C a
	(cox1)		CCGTGTACCCACCGTTTG b
		HM 449710
	ARN ribosomal mitochondrial 12S (12S)		CGCGGTAATACGGAGGATG C a AGTGCCTTCGCCATCGG b	Métabolisme mitochondrial
	Sous-unité 5 de la	HM 449708	TCAACTTGGTTTGCATACAT
	NADH		GGC a
	déshydrogénase		TTGAACTAATCCTGTTGTGG
	(nad5)		AAGC b
	Protéine D1	HM 449711	ACCACCAAATACACCAGCA AC a
	(d1)		GCGTCCTTGGATTTTCGTAG C b	Activité
	Protéine psaA (psaA)	HM 449705	CATAAAGCGGCACCCAAAC a CTTGGATATAACTGACTCAT TAACTCAGG b	photosynthétique
	Catalase	XM	GTTGATGATTCGGTTGGCTT GGC a
	(cat)	002182918	AGTTGAGAGGTGCAAGACG
			GATG b
		NC		Réponse au stress
	Glutathion peroxidase	011678	CAAAGGCGACGTGCTATGC GTC a	oxydant
	(gpx)		GGCTCCTGAGCTCCAAACTG
			ATT b
	Protéine silaffin-1
	(sil1)

Source : http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/ressources/apects_techniques/rtpcr/rtpcr02.htm Tableau 6 :

Table 1 :

 1 Differential gene expression as compared to β-actin for the taxon Gomphonema gracile exposed to diuron and S-metolachlor (Mean (± SE); n = 4). Only factors showing significant differences (p-value < 0.05) are shown in this table. Significant induction (> 2, grey square) are indicated by values, compared to the respective controls. / : expression identical to control levels.

		Exposed to	Exposed to
	Genes
		diuron	S-metolachlor
	psaA	/	/
	d1	18.58	6.31
	cox1	/	4.99
	nad5	/	5.08
	12s	/	/
	cat	2.83	86.57

Table 3 :

 3 SI.3 -Ten genes studied in this experiment and their associated functions.

	Gene name (Abbreviation)	Accession number	Primer (5' -3')	Function of gene
	β-actin (β-act)	HM	CGACAGGACGGCCTGGATGTT a
		449707	CCAACCGCGAGCGCATGACG b	Reference
	Ribosomal protein	CM	ATTTTCAAGCGCGCGCGGAGAAGTA a	genes
	L7 (rpl7)	000639	CGTAGCCGCGCTTGTAGATGAGCTC b
		HM 449704
	Cytochrome C		CAGTAATTCTCACTGCCCAGC a
	oxidase subunit I (cox1)		CCGTGTACCCACCGTTTG b
		HM 449710		Mitochondrial
	Mitochondrial			metabolism
	ribosomal RNA
	12S (12S)

Abbreviations: a Upward primer. b Forward primer.

Table 5 :

 5 Differential gene expression as compared to β-actin in G. gracile and N. palea exposed to diuron and S-metolachlor (Mean; n = 4) at the end of the experiment (T7). Only factors showing significant differences between control and contaminated conditions (p-value < 0.05) are shown in this table. Significant induction factors (> 2, grey square) and repression factors (< 0.5, hatched square) are indicated compared to the respective controls. /: expression identical to control levels. a indicates a significant difference between G. gracile and N. palea.

		Exposed to diuron	Exposed to S-metolachlor
	Genes	G. gracile	N. palea	G. gracile	N. palea
	psaA	/	/	/	3.14
	d1	18.58	19.48	6.31	/
	cox1	/	/	4.99	0.22
	nad5	/	2.83	5.08	0.13
	12s	/	/	/	/
	cat	2.83	25.14 a	86.57	333 a

Table 6 :

 6 Fatty acid profiles (%) of G. gracile and N. palea for control, diuron and S-metolachlor treatment (T7). The values are given as means ± SE (n = 4). a indicates significant differences between control and contaminated treatments (10 µg.L -1 ) at T7, b indicates a significant difference between G. gracile and N. palea at T7 (p < 0.05).

					Exposed to	Exposed to
			Control
					diuron	S-metolachlor
			G. gracile	N. palea	G. gracile	N. palea	G. gracile	N. palea
		14:0	7.01 ± 0.33	4.72 b ± 0.12	6.41 a ± 0.08	5.46 a ± 0.10	6.83 ± 0.28	4.95 ± 0.22
	SFA	16:0	16.57 ± 0.50	16.80 ± 0.25	14.97 a ± 0.29 19.94 a ± 0.89 17.25 a ± 0.23 17.40 ± 0.57
	(%)	18:0	0	0.19 ± 0.13	0	0.08 ± 0.16	0	0.22 ± 0.02
		Total	23.58 ± 0.48	21.71 b ± 0.40	21.38 a ± 0.35 25.48 a ± 0.88 24.08 ± 0.14 22.57 ± 0.80
	MUFA	16:1	18.21 ± 1.99	25.03 b ± 1.79	20.64 ± 0.55	24.93 ± 2.43 17.88 ± 0.65 26.29 ± 1.47
	(%)	18:1n9	3.11 ± 1.78	2.18 ± 0.11	8.20 a ± 0.92	4.94 a ± 1.35	4.53 ± 0.23	1.42 ± 0.91
		Total	21.32 ± 1.21	27.21 b ± 1.81	28.84 a ± 1.36	29.87 ± 3.49 22.41 ± 0.65 27.71 ± 0.78
		16:2n4	3.51 ± 0.09	6
	PUFA
	(%)

.23 b ± 0.33 3.86 a ± 0.07 4.89 a ± 0.54

		20:4n6	5.67 ± 0.27	1.25 b ± 0.07	5.74 ± 0.33	0.78 a ± 0.52	5.12 a ± 0.30	1.25 ± 0.07
	HUFA	20:5n3 28.49 ± 0.53	27.14 ± 1.16	24.88 a ± 0.10 22.11 a ± 1.29 28.34 ± 0.50 26.15 ± 1.21
	(%)	22:5n3	1.85 ± 0.20	0.59 b ± 0.04	0.50 ± 1.00	0.58 ± 0.39	1.91 ± 0.24	0.59 ± 0.02
		22:6n3	0.30 ± 0.60	4.08 b ± 0.12	0	4.72 a ± 0.29	0	4.19 ± 0.07
		Total	36.31 ± 1.13	33.06 b ± 1.20	31.12 a ± 0.86 28.19 a ± 2.24 35.37 ± 0.93 32.18 ± 1.24
		3.1.3. Pigment concentrations
							3.52 ± 0.13	6.02 ± 0.14
		16:3n4 11.16 ± 0.52	4.47 b ± 0.26	12.73 a ± 0.34	4.52 ± 0.41	10.65 ± 0.81	4.20 ± 0.28
		16:4n1	1.73 ± 0.15	6.25 b ± 0.33	1.51 a ± 0.07	6.00 ± 0.47	1.77 ± 0.12	6.28 ± 0.04
		18:2n6	1.44 ± 0.05	0.24 b ± 0.01	0.29 a ± 0.57	0.23 ± 0.15	1.28 a ± 0.05	0.23 ± 0.02
		18:3n3	0.37 ± 0.25	0.51 ± 0.04	0.28 ± 0.56	0.78 ± 0.52	0.38 ± 0.26	0.53 ± 0.04
		18:4n3	0.56 ± 0.03	0.33 b ± 0.05	0.00 a ± 0.00	0.05 a ± 0.10	0.52 a ± 0.01	0.28 ± 0.02
		Total	18.77 ± 0.94	18.03 ± 0.86	18.67 ± 0.87	16.47 ± 2.05 18.12 ± 0.95 17.54 ± 0.41

At the end of the experiment (T7) and in control treatments, N. palea had significantly higher chlorophyll a and carotenoid concentrations (p < 0.05) than G. gracile. N. palea's chlorophyll a and carotenoid concentrations were 5.56 ± 1.80 mg.L -1 and 2.42 ± 1.03 mg.L -1 , respectively, while those of G. gracile were 1.49 ± 0.61 mg.L -1 and 0.42 ± 0.17 mg.L -1 , respectively. At T7 and under diuron treatments, N. palea's chlorophyll a and carotenoid concentrations decreased significantly (p < 0.05) (89.23 ± 2.29 % and 89.77 ± 4.39 % of the controls, respectively). Chlorophyll a concentrations in G. gracile decreased significantly (p < 0.05) (46.05 ± 11.62 % of the controls). Contrary to N. palea, no significant difference in carotenoid concentrations was observed compared to the controls in G. gracile after exposure to diuron.

Table 7 :

 7 Summary table (based on percentage of inhibition compared to control treatment) of diuron and S-metolachlor-induced damage on N. palea and G. gracile. -: decrease in studied descriptor; --: greater decrease in studied descriptor than other species considered (p < 0.05);

	+: increase in studied descriptor; ++ greater increase in studied descriptor than other species
	considered (p < 0.05).
	Diuron	S-metolachlor
	G. gracile N. palea G. gracile	N. palea

Table 8 :

 8 Percentage of fatty acids for G. gracile and N. palea at T0.

		T0 : control treatment
	Fatty acids (%)	G. gracile	N. palea
	14:0	7.14 ± 0.12	5.10 ± 0.08
	16:0	17.6 ± 0.22	18.1 ± 0.45
	16:1	18.6 ± 0.18	28.2 ± 1.07
	16:2n4	3.61 ± 0.03	5.44 ± 0.08
	16:3n4	9.45 ± 0.06	3.40 ± 0.11
	16:4n1	1.72 ± 0.02	5.62 ± 0.28
	18:0	0.00 ± 0.00	0.04 ± 0.09
	18:1n9	5.71 ± 0.12	3.33 ± 0.15
	18:2n6	1.64 ± 0.02	0.26 ± 0.00
	18:3n3	0.00 ± 0.00	0.41 ± 0.01
	18:4n3	0.00 ± 0.00	0.29 ± 0.00
	20:4n6	5.63 ± 0.01	0.86 ± 0.02
	20:5n3	26.2 ± 0.08	23.4 ± 1.11
	22:5n3	2.42 ± 0.04	0.70 ± 0.02
	22:6n3	0.29 ± 0.58	4.87 ± 0.20
	SFA	24.7 ± 0.32	23.3 ± 0.49
	MUFA	24.3 ± 0.25	31.5 ± 1.19
	PUFA	16.4 ± 0.12	15.4 ± 0.32
	HUFA	34.5 ± 0.63	29.8 ± 1.32

Table 9 :

 9 Pigment concentrations for G. gracile and N. palea at T0.

	T0 : control treatment
	Pigment concentrations (mg.L -1 )	G. gracile	N. palea
	Chlorophyll a	0.84 ± 0.36	2.19 ± 0.15
	Carotenoid	0.19 ± 0.05	0.55 ± 0.17

Table 10 :

 10 Proportion of total FA in each lipid (%) in control, diuron and S-metolachlor treatments at T1, T3 and T7. The values are given as means (n = 4) ± SE. a bolded text in orange: indicates significant differences between control treatment at T7 and the other sampling

	times (T1 and/or T3) (p < 0.05). * bolded text in red: indicates significant differences between
	control and contaminated treatments (p < 0.05). Ctrl = Control treatment; Diu = Diuron
	treatment; Smet = S-metolachlor treatment.
			T1			T3			T7
	Lipids
		Ctrl	Diu	Smet	Ctrl	Diu	Smet	Ctrl	Diu	Smet
	Neutrals	59.01 ± 3.44	55.80 ± 2.02	53.72 ± 5.20	70.38 ± 1.20	66.66 ± 2.99*	66.08 ± 0.93*	54.27 ± 3.27 a	42.07 ± 11.75*	56.42 ± 14.39
	MGDG	9.19 ± 6.04	13.79 ± 9.93	11.52 ± 3.95	9.67 ± 1.21	11.55 ± 0.50*	11.49 ± 0.98*	18.86 ± 1.76	23.12 ± 6.22	21.19 ± 14.73
	FFA	2.96 ± 0.76	3.78 ± 1.97	3.42 ± 2.13	1.91 ± 0.35	3.23 ± 1.01*	2.78 ± 0.47*	3.23 ± 0.27 a	5.85 ± 1.39*	3.51 ± 0.58
	DGDG	2.67 ± 0.65	2.75 ± 0.28	6.76 ± 3.61	3.11 ± 0.96	3.21 ± 0.79	2.89 ± 0.61	4.92 ± 1.67 a	3.92 ± 0.80	3.29 ± 0.28*
	SQDG	8.19 ± 0.55	6.50 ± 1.84	5.77 ± 1.67*	3.78 ± 0.54	3.96 ± 0.92	4.23 ± 0.31	4.94 ± 0.82 a	3.85 ± 1.82	4.76 ± 1.04
	PG	2.92 ± 0.10	2.80 ± 1.08	2.04 ± 0.51	1.55 ± 0.11	1.39 ± 0.38	1.94 ± 0.15	1.28 ± 0.74	4.71 ± 2.52*	1.27 ± 0.18
	PE	4.27 ± 0.61	2.37 ± 0.70*	3.30 ± 1.30	1.68 ± 0.17	2.26 ± 0.20	2.19 ± 0.68	2.35 ± 0.43 a	5.25 ± 1.99*	1.74 ± 0.28*
	DGTS	1.24 ± 0.49	1.67 ± 0.49	2.11 ± 0.41*	0.81 ± 0.06	1.13 ± 0.24*	1.19 ± 0.23*	1.34 ± 0.35	2.66 ± 1.15*	0.60 ± 0.09*
	PA/DGTA	2.54 ± 1.43	3.82 ± 1.51	5.91 ± 1.99*	2.85 ± 0.38	2.85 ± 0.55	3.24 ± 0.26	3.53 ± 0.44	3.46 ± 1.37	3.19 ± 0.31
	PC	7.00 ± 2.43	6.72 ± 2.00	5.45 ± 1.19	4.26 ± 0.80	3.76 ± 0.77	3.96 ± 0.30	5.29 ± 0.48	5.11 ± 1.19	4.02 ± 1.46

Table 11 :

 11 Proportions of EPA (%) in each lipid (Table10) in control, diuron and S-metolachlor treatments at T1, T3 and T7. The values are given as means (n = 4) ± SE. * bolded text in red:

	indicates significant differences between control and contaminated treatments (p < 0.05). Ctrl
	= Control treatment; Diu = Diuron treatment; Smet = S-metolachlor treatment.
	EPA in		T1			T3			T7
	Lipids	Ctrl	Diu	Smet	Ctrl	Diu	Smet	Ctrl	Diu	Smet
	Neutrals	2.36 ± 0.15	3.24 ± 0.63*	2.87 ± 0.22*	3.56 ± 0.39	3.44± 0.67	3.59 ± 0.30	3.35 ± 0.11	2.57 ± 0.67*	3.03 ± 1.09
	MGDG	1.27± 0.75	1.51 ± 0.48	2.17 ± 0.69	1.97 ± 0.25	2.28± 0.55	2.39 ± 0.28*	3.49 ± 0.44	2.79 ± 0.65	2.82 ± 1.16
	FFA	0.33± 0.07	0.36 ± 0.24	0.40 ± 0.28	0.19 ± 0.03	0.33 ± 0.12*	0.32 ± 0.07*	0.52 ± 0.06	0.61 ± 0.23	1.23 ± 1.65
	DGDG	0.64± 0.13	0.54 ± 0.16	1.70 ± 1.02*	0.79 ± 0.25	0.79± 0.28	0.77 ± 0.13	1.33 ± 0.37	0.71 ± 0.23*	0.86 ± 0.09*
	SQDG	0.49± 0.12	0.33 ± 0.14	0.32 ± 0.11	0.21 ± 0.02	0.25 ± 0.05	0.30 ± 0.02*	0.41 ± 0.09	0.37 ± 0.09	0.33 ± 0.06
	PG	0.29 ± 0.09	0.26 ± 0.16	0.24 ± 0.05	0.28 ± 0.03	0.26 ± 0.02	0.26 ± 0.02	0.20 ± 0.12	0.81 ± 0.42*	0.24 ± 0.05
	PE	0.23 ± 0.04	0.15 ± 0.04*	0.24 ± 0.08	0.11 ± 0.01	0.18 ± 0.03	0.18 ± 0.05	0.20 ± 0.04	0.31 ± 0.18	0.08 ± 0.01*
	DGTS	0.15 ± 0.02	0.24 ± 0.09	0.29 ± 0.04*	0.13 ± 0.01	0.16 ± 0.02	0.12 ± 0.02	0.13 ± 0.03	0.26 ± 0.14	0.09 ± 0.01*
	PA/DGTA	0.71 ± 0.51	1.20 ± 0.36	2.06 ± 0.55*	1.06 ± 0.18	0.81 ± 0.22	1.17 ± 0.18	1.35 ± 0.22	0.90 ± 0.30*	1.18 ± 1.20
	PC	1.26± 0.30	1.56 ± 0.83	1.56 ± 0.45	1.32 ± 0.29	0.84 ± 0.32	1.18 ± 0.10	1.80 ± 0.23	1.14 ± 0.17*	1.24 ± 0.46

  significatives ont été notées sous contamination au diuron contrairement au Smétolachlore.Comme il a pu être évoqué dans le chapitre 3 et discuté dans le chapitre 5, des études sur les plantes supérieures ont montré que les acides gras impactés par les contaminants organiques et inorganiques étaient les acides gras les plus insaturés et étaient ceux présents dans les lipides du chloroplaste et nécessaires à l'activité photosynthétique. Ainsi, la réduction de ces lipides a entraîné une perturbation de la structure des membranes photosynthétiques et a empêché l'activité du PSI et du PSII[START_REF] Kobayashi | Role of membrane glycerolipids in photosynthesis, thylakoid biogenesis and chloroplast development[END_REF]. Finalement, une diminution de la photosynthèse a conduit à une réduction du taux de croissance.

	• A l'inverse, après exposition au S-métolachlore, le gène cat a été induit de manière
	beaucoup plus importante que pour le diuron, résultant finalement d'un impact moins
	important (voire nul) sur les HUFA.
	Ainsi, l'absence d'impact sur les HUFA peut être expliquée ici par l'efficacité des
	mécanismes antioxydants.
	Ces travaux de thèse (chapitres 3, 4 et 5) ont démontré que les résultats des analyses des profils
	d'acides gras et lipidiques de GGRA étaient corrélés à ceux de l'activité photosynthétique
	et du taux de croissance.
	En effet, le taux de croissance de GGRA a été inhibé après l'exposition au S-métolachlore, mais

Finalement, ces travaux de recherches ont démontré que l'analyse des profils d'acides gras (et particulièrement celle du contenu en HUFA) associée aux résultats de génétique (et notamment la réponse du gène de la catalase cat), contrairement aux descripteurs classiques utilisés en écotoxicologie tels que l'inhibition de croissance ou de la photosynthèse, sont en mesure d'apporter des informations complémentaires sur l'impact cellulaire des contaminants tels que la production excessive de ROS. b. Inhibition de l'activité photosynthétique, du taux de croissance et du contenu en pigments de manière moins importante qu'avec le diuron. Ces résultats sont corrélés à ceux de l'activité photosynthétique et des profils d'acides gras (notamment HUFA et EPA) où les diminutions les plus De plus, il a été montré dans le chapitre 3 que les profils d'acides gras étaient des indicateurs plus sensibles vis-à-vis de l'impact du diuron et du S-métolachlore à 10 µg.L -1 sur les diatomées d'eau douce par rapport aux teneurs en pigments pour lesquelles aucun impact n'a été constaté.

  . De plus, il a été démontré dans la littérature que les diatomées avaient une teneur élevée en EPA et constituaient donc une excellente ressource alimentaire pour le zooplancton[START_REF] Taipale | Fatty acid composition as biomarkers of freshwater microalgae: analysis of 37 strains of microalgae in 22 genera and in seven classes[END_REF]. À l'inverse des « descripteurs classiques », les profils d'acides gras pourraient alors fournir des informations supplémentaires notamment sur la qualité nutritive des diatomées. De la même manière que le diuron a diminué la teneur en HUFA et en particulier en EPA des deux espèces 'induction du gène de défense contre le stress oxydatif cat après exposition au diuron suggère que l'altération de la synthèse du contenu en HUFA, présents dans les lipides de la membrane du chloroplaste, pourrait être liée à la production de ROS. Ainsi, la réduction de ces lipides a entraîné une perturbation de la structure des membranes photosynthétiques et a empêché l'activité du PSI et du PSII[START_REF] Kobayashi | Role of membrane glycerolipids in photosynthesis, thylakoid biogenesis and chloroplast development[END_REF]. Finalement, une diminution de la photosynthèse a conduit à une réduction du taux de croissance. Tout d'abord, le temps de ce type d'analyse peut être présenté comme une première limite. Le Tableau 8 présente la durée approximative de l'analyse de 10 échantillons.Cependant il est nécessaire de souligner que la méthode analytique utilisée pour ces travaux de thèse était la méthode existante du laboratoire (LBM) prenant en compte le plus d'acides gras possible. Il aurait été intéressant d'optimiser la méthode dans le but de diminuer le temps d'analyse de ces présentes études.Tableau 8 : Durée approximative de l'analyse de 10 échantillons pour les différents descripteurs étudiés dans ces travaux de thèse.Dans le cas d'études sur le terrain, l'analyse des profils d'acides gras nécessite donc de prélever une quantité de biomasse importante et donc d'appréhender en amont toutes les analyses à effectuer sur ces échantillons dans le but d'avoir une quantité suffisante de biomasse.

	iii. Avantages et limites de l'analyse des profils d'acides gras
	Le Tableau 7 présente un résumé non exhaustif des avantages et des limites de l'analyse des
	profils d'acides gras des diatomées ; Contrairement à celles des descripteurs étudiés classiquement en écotoxicologie tels que
	de diatomées, leur qualité nutritive pourrait être diminuée et, par conséquent, la chaîne l'activité photosynthétique, le taux de croissance, la concentration en pigments, le temps de Durée approximative de l'analyse de 10 échantillons
	trophique pourrait être affectée, contrairement au S-métolachlore où aucun impact n'a été Tableau 7 : Liste non exhaustive des avantages et des limites de l'analyse des profils d'acides préparation des échantillons et le temps d'analyse est beaucoup plus important pour les profils Analyse génétique 4 h 30 Pour finir, une limite intéressante à souligner est celle concernant la nécessité de disposer d'une
	constaté dans ces conditions expérimentales. gras des diatomées. d'acides gras (Tableau 8). En effet pour 10 échantillons la durée approximative de l'analyse concentration cellulaire similaire entre les réplicats si l'objectif est de réaliser une analyse
	Concentration en pigment	1 h 30
	Dans le but de pallier la diminution de la qualité nutritive des diatomées, leur consommateur Avantages Limites (préparation comprise) est de 6h30 pour les profils d'acides gras contre 1h,1h30 et 3h30 pour quantitative des acides gras.
	pourrait augmenter sa quantité d'algues ingérées, ou diversifier (voire modifier complètement) l'activité photosynthétique, la concentration en pigments et le taux de croissance Activité photosynthétique 1 h
	son régime alimentaire (Neury-Ormanni et al., submitted). En effet, si la nourriture est Apport d'informations complémentaires sur Analyse plus longue et plus onéreuse que respectivement.
	disponible et diversifiée les consommateurs sélectionneraient préférentiellement des aliments les cibles intracellulaires des contaminants celle des descripteurs « classiques » Taux de croissance 3 h 30
	de haute qualité composés d'une teneur en lipides élevée ; à l'inverse les consommateurs Acides gras 6 h 30
	Apport d'informations écologiques	Nécessité d'un volume d'échantillon plus
	pourraient se voir devenir opportunistes (Vos et al., 2000).
	Neury-Ormanni et al. (submitted) ont également montré que la contamination au diuron complémentaires (qualité nutritive des important que celui nécessaire pour les
	diatomées)	« descripteurs classiques »
	conduisait les chironomidés à augmenter leur consommation d'algues afin de compenser la
	Analyse des acides gras réalisable à perte nutritionnelle probable (Ruiz et al., 2018). Dans le cas des composés bioaccumulables, Nécessité de peser l'échantillon ou de
	différentes échelles d'organisation biologique cette augmentation est susceptible d'impacter la quantité de toxiques ingérés pouvant résulter disposer d'une concentration cellulaire exacte
	(de l'individu à la communauté), et sur tous en une biomagnification des composés le long de la chaîne trophique. pour l'analyse quantitative des acides gras
	types d'êtres vivants
	En comparaison aux volumes d'essai nécessaires pour l'analyse des descripteurs « classiques »
	Finalement les profils d'acides gras ont permis de noter les impacts des herbicides sur les tels que l'activité photosynthétique où seulement 2 mL d'échantillon sont nécessaires (et
	Avantages : diatomées, en fournissant des informations sur leurs mécanismes d'action et la réponse des potentiellement utilisables par la suite pour d'autres analyses, la mesure étant non destructive)
	Comme présenté tout au long de ces travaux de thèse, les profils d'acides gras ont permis algues (par exemple, la formation des ROS et leur gestion) mais également sur leurs effets ou 1 mL pour le taux de croissance, l'analyse des profils d'acides gras contraint à limiter les
	écologiques (par exemple, l'impact trophique). d'apporter des informations complémentaires sur les cibles intracellulaires des contaminants, Limites : analyses de descripteurs dans le cas d'expérimentations au laboratoire ou bien à utiliser des
	tels que le diuron et le S-métolachlore à concentration environnementale. En effet, grâce à Malgré les avantages les plus importants des profils d'acides gras relevés dans la section unités expérimentales avec un volume plus important que les 80 mL utilisés tout au long de ces
	travaux de thèse.

l'étude des acides gras, une échelle d'organisation biologique intermédiaire et complémentaire entre l'induction/répression de gènes (réponse "potentielle") et des réponses "réalisées" aux niveaux fonctionnel (photosynthèse) et populationnel (taux de croissance) a pu être mis en place. LDe plus, les profils d'acides gras ont permis d'apporter des informations écologiques complémentaires notamment sur la qualité nutritive des diatomées, comme il a pu être présenté tout au long de ces travaux de thèse. Les diatomées contiennent une teneur élevée en EPA et constituent une excellente ressource alimentaire pour le zooplancton (Taipale et al., 2013). De la même manière que le diuron a diminué la teneur en HUFA et en particulier en EPA des deux espèces de diatomées, leur qualité nutritive pourrait être diminuée et, par conséquent, la chaîne trophique pourrait être affectée. Par ailleurs, il est intéressant de souligner le fait que les teneurs en acides gras peuvent être analysées à différentes échelles d'organisation biologique (de l'individu à la communauté), et sur tous types d'êtres vivants appuyant l'universalité de ce type d'analyse. précédente, il est important de noter différentes limites de ce type d'analyse. Par ailleurs lors des manipulations préliminaires, le volume d'échantillon a pu être déterminé dans le but de posséder une quantité suffisante de biomasse pour que l'analyse des profils d'acides gras soit optimale. Ce volume, correspondant à environ 20 mL tout au long de ces travaux de thèse, peut cependant différer dans d'autres études notamment du fait de la taille de la diatomée étudiée impactant ainsi la biomasse présente.

  Par exemple, il serait pertinent d'étudier en plus de ces deux espèces la réponse d'autres diatomées pennées mais également de diatomées centriques afin d'élargir nos connaissances sur les réponses des profils d'acides gras des diatomées d'eau douce vis-à-vis d'une contamination ; et d'évaluer la généricité des réponses des profils d'acides gras observées dans la classe des diatomées. En effet, Larras et al. (2014) ont relevé le lien entre la phylogénie des diatomées et leur sensibilité aux herbicides et notamment à quatre herbicides inhibiteurs du photosystème II tels que l'atrazine, le terbutryne le diuron et l'isoproturon. Parmi les 14 espèces de diatomées sélectionnées, les diatomées centriques et pennées araphides se sont vues plus sensibles aux herbicides que les diatomées pennées. Lors de cette étude aucune différence n'a été notée dans les lipides de stockage de GGRA et de Sphaerellopsis ni après une exposition au diuron (0,05 et 0,5 µg.L -1 ) ni après celle au Smétolachlore (0,5 et 5 µg.L -1 ). Il est intéressant de noter que les résultats de ces travaux de thèse ont déjà conduit à des réflexions entre INRAE et des partenaires Québécois (INRS). Les travaux de thèse de Laura Malbezin à l'INRS (2019-…) traiteront notamment ce type d'approche globale de la composition en acides gras des biofilms, et de son évolution en contexte de pollution agricole.

	réponse à une contamination aux herbicides dans le but d'évaluer la généricité de ces
	descripteurs.
	A l'échelle de la communauté : groupes algaux et biofilm De plus, Taipale et al. (2013) ont montré des différences entre les profils d'acides gras de
	Lors de ces travaux de thèse, les réponses de deux cultures monospécifiques de diatomées plusieurs classes d'algues. Le Tableau 9 présente ces résultats ; par exemple les Chlorophyceae
	face à la contamination aux herbicides ont été étudiées. Cependant, certaines limitations liées sont composées majoritairement d'acides gras 18:3n3, 16:0, 18:1n9 et 18:2n6 tandis que les Tableau 9 : Acides gras majoritaires et typiques de chaque classe d'algue. Extrait de Taipale et
	aux expériences de laboratoire avec des cultures monospécifiques, par opposition aux Bacillariophyceae sont quant à elles composées en majorité d'acides gras 16:1n7, 20:5n3, 16:0 al. (2013).
	communautés, peuvent être mentionnées : et 14:0. Par ailleurs, les acides gras typiques de la classe des Bacillariophyceae ont été notés Classes d'algues Acides gras Acides gras typiques de
	comme étant les 16:2n7, 16:4n1 et 18:4n4. majoritaires	la classe d'algues
	Chlorophyceae	18:3n3, 16:0, 18:1n9,	/
		18:2n6
	Trebouxiophyceae	18:3n3, 16:0, 18:1n9,	/
		18:2n6
	Cryptophyceae	18:3n3, 16:0, 18:4n3	/
	Synuraphyceae	18:4n3, 14:0, 18:3n3,	/
		16:0
	Il a été observé dans le chapitre 4 que GGRA et NPAL présentaient des réponses similaires vis-2007). Les espèces hétérotrophes et appartenant à la guilde « motile » (espèces pouvant se Ocromonadales 16:1n7, 16:0, 18:2n6, /
		18 :1n7
	à-vis de la contamination aux herbicides mais des différences d'intensité de réponse ont pu être déplacer au sein du biofilm) étaient plus tolérantes aux inhibiteurs du PSII alors que les espèces Raphidophyceae 16:0, 20:5n3, 18:4n3, 16:3n4
	également relevées. autotrophes et appartenant à la guilde « low profile »n(espèces adhérentes au substrat vivant En effet, une étude préliminaire réalisée au sein du laboratoire par Sandra Kim-Tiam (2014, 18:3n3
	En effet, la réponse de certains gènes d'intérêt s'est présentée de manière plus intense pour dans les couches inférieures du biofilm) et « high profile » (espèces érigées formant des non publiée), a révélé des changements sur les profils d'acides gras (notamment en effectuant Bacillariophyceae 16:1n7, 20:5n3, 16:0, 16:2n7, 16:4n1, 18:4n4
		14:0
	NPAL (notamment le gène antioxydant cat) que pour GGRA. Malgré cette intensité différente, colonies leur permettant d'atteindre les couches supérieures du biofilm) étaient les plus Il serait pertinent dans une future recherche de comparer les réponses des différents groupes le ratio 20:5/16:0) des biofilms exposés à des mélanges de pesticides dominés par les Euglenophyceae 16:0, 18:3n3, 20:5n3, 15:3n3, 17:2n2, 17:2n7
	les profils d'acides gras et particulièrement le contenu en HUFA chez les deux espèces de sensibles (Larras et al., 2012) ; NPAL étant classée comme hétérotrophe et « motile » et GGRA algaux, par exemple en choisissant en plus des diatomées des modèles d'algues vertes et de chloroacétanilides. Aucune modification n'avait été notée sur l'activité photosynthétique. A 22:6n3
	diatomées se sont vu modifiés, en particulier pour NPAL. étant classée comme « high profile ». cyanobactéries, face à une contamination au diuron et au S-métolachlore à une concentration l'inverse, des différences sur le nombre de diatomées avaient été relevées à l'aide de comptages
	Ainsi, il semble nécessaire, en plus de la phylogénie, d'ajouter les notions de préférences de 10 µg.L -1 chacun. microscopiques.
	trophiques et de guilde écologique dans l'étude des réponses des profils d'acides gras en

, mais aussi

[START_REF] Ying | Total lipid and fatty acid composition of eight strains of marine diatoms[END_REF]

ont montré que les espèces de diatomée Nitzschia sp. étaient composées d'une proportion plus élevée de DHA par rapport à d'autres espèces, en ligne avec les résultats obtenus dans ces travaux de thèse.

Ainsi dans de futures recherches il serait nécessaire de tester un nombre plus important d'espèces de diatomées d'eau douce afin de confirmer les résultats de ces travaux de recherches. Cependant, Larras et al. (2014) ont noté l'importance de considérer les préférences trophiques des diatomées (autotrophes ou hétérotrophes) en complément de la phylogénie pour expliquer au mieux les différences de sensibilité des diatomées. Larras et al. (2012) ont effectivement observé que la sensibilité des diatomées aux herbicides et notamment aux inhibiteurs du PSII dépendait du mode trophique des espèces mais également de leur guilde écologique (Passy, ✓ Par exemple, il a été démontré dans la littérature que la sélection génétique en culture in vitro pouvait modifier la sensibilité des algues aux produits chimiques (Peterson et al., 1997). ✓ En raison des différentes sensibilités des espèces présentes dans les communautés d'algues, les réponses des cultures face à une contamination aux herbicides peuvent ne pas être représentatives des réactions des communautés d'algues périphytiques (Badr and Abou-Waly, 1997). ✓ De plus, dans le milieux naturel, les interactions des espèces et la sensibilité différentielle des taxons modulent la réponse d'une communauté de diatomées à une perturbation (DeNoyelles et al., 1982). En effet, Coquillé (2017) a mis en évidence un contenu intracellulaire 5 à 8 fois moins important en lipides pour l'algue verte Sphaerellopsis en comparaison à la diatomée GGRA. Par la suite, il serait finalement intéressant, d'analyser les profils d'acides gras d'un biofilm exposé aux herbicides. Dans le but de comparer les résultats obtenus avec ceux de ces travaux de thèse et de l'étude décrite précédemment, la toxicité du diuron et du S-métolachlore pourrait être examinée à une concentration de 10 µg.L -1 . Il serait ainsi possible d'observer la réponse face à une contamination des profils d'acides gras et notamment de l'EPA dans le biofilm dans sa globalité, dans le but de se rapprocher au plus près des conditions environnementales sur le terrain.

2) Les contaminations diffuses sont à l'origine de la pollution généralisée des eaux de surface. En effet, il est considéré que seulement 25 à 80 % des substances actives parviennent jusqu'à leur cible en raison notamment des pertes à l'épandage[START_REF] Aubertot | Pesticides, agriculture et environnement. Réduire l'utilisation des pesticides et en limiter les impacts environnementaux[END_REF]. Depuis plusieurs années, un suivi de la contamination des cours d'eau en France est réalisé et démontre la présence de pesticides et notamment d'herbicides parmi ceux-ci et classant la France 2 ème pays consommateur de pesticide avec 66 659 tonnes (en Europe et d'après des données de 2013 ; l'Espagne étant classé 1 er pays consommateur avec 69 587 tonnes). Cependant, la France est classée au premier rang par la surface agricole utile (29 millions d'hectares) suivie de l'Espagne (24 millions d'hectares). La surface agricole utile de la France est essentiellement exploitée pour la production de : céréales, de betteraves sucrières, d'oléagineux, de pommes de terre, mais également par des vignes, et arbres fruitiers[START_REF] Ecophyto | Plan Ecophyto II, Ministère de l'agriculture, de l'agroalimentaire et de la forêt, Ministère de l'écologie, de développement durable et de[END_REF].

The authors would like to thank Dr Emilie Saulnier-Talbot for English language revision of the manuscript, David Carayon and Marie Wach for their help in statistical analyses and Gwilherm Jan for his help in technical details of the experiment.

financier apporté à ce projet (LIPID, ANR-10-LABX-45).

Je tiens à remercier François Delmas de m'avoir accordé sa confiance pour mener à

Graphical abstract

Highlights

• Fatty acids (FA) are essential for: biological membranes and metabolic energy storage.

• Diuron and S-metolachlor effects on diatom FA and "classic descriptors" were tested.

• Diuron seemed to more toxic than S-metolachlor on all studied endpoints.

• Fatty acid profiles provided additional information on the toxicity of herbicides.

• A complementarity between FA and "classical descriptors" was shown.

Sommaire

Objectifs de l'étude

lipids [START_REF] Hu | Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances[END_REF]. To confirm this explanation, it could be relevant in future studies to carry out lipid measurement in diatoms using TAG dosage [START_REF] Lupette | The architecture of lipid droplets in the diatom Phaeodactylum tricornutum[END_REF] or fluorescent Nile red and BODIPY, for example [START_REF] Rumin | The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae[END_REF].

PUFA and HUFA

With herbicide contamination, it was suggested that the process of fatty acid desaturation is inhibited by the direct inhibition of the desaturase enzymes involved in PUFA and HUFA synthesis (Filimonova et al., 2016a). For example, it was shown in the literature that the substituted pyridazinone herbicide inhibited the desaturation process and especially the synthesis of omega-3 fatty acids, decreasing the 18:3n3 content in the glycolipids of algae. In the same way, the herbicide norflurazon inhibited desaturation system and particularly the omega 6 fatty acids [START_REF] Cohen | Potential use of substituted pyridazinones for selecting polyunsaturated fatty acid overproducing cell lines of algae[END_REF]. Filimonova et al. (2016b) observed a decrease of HUFA content of the marine diatom T. weissfloggi from 16.48 % to 12.32 % under Primextra® herbicide treatment.

Under diuron treatment, the decrease of HUFA in G. gracile can thus be explained by the inhibition of the desaturation process. [START_REF] Troton | Modifications of thylakoid lipids in Euglena gracilis during diuron-adaptation[END_REF] demonstrated identical results on the species Euglena gracilis with the decrease of PUFA induced by 5.8 mg.L -1 of diuron. The authors explained this result by the inhibition of desaturation and the activation of elongation in the process of fatty acid synthesis with diuron contamination. In future studies, it could be relevant to explore genetic responses of desaturase genes concurrent with fatty acid profiles in order to compare their results. Surprisingly, no effect was observed on fatty acid classes under S-metolachlor treatment.

However, a significant decrease of 18:2n6, 18:4n3 and 20:4n6 was observed (p-value < 0.05).

It has been shown that the chloroacetamide herbicide metolachlor modifies the synthesis of very long chain fatty acids by inhibiting the action of the enzyme involved in the condensation more toxic to G. gracile in this study than S-metolachlor. Both pesticides seemed to induce ROS formation but according to impacted fatty acids, it could be possible that diuron also inactivated desaturation enzymes. The low but environmentally realistic concentrations tested in the present study did not allow to show a high effect of S-metolachlor on fatty acid profiles and it is difficult to conclude on its mode of action of G. gracile's fatty acid profiles. However, considering the target specificity of herbicides, the fatty acids profiles used to assess chemical toxicity might provide additional information on the mode of action and as consequence on the type of pesticide studied.

Moreover, this study proves the complementarity between the fatty acid profiles and the "classical descriptors" since FA indicate herbicide effects conversely to pigment contents and provide additional nutritive values involving ecological information particularly on the trophic chain.

Acknowledgements

This study was carried out with financial support from the French National Research Agency (ANR) in the framework of the Investments for the future Program, within the Cluster of Excellence COTE (ANR-10-LABX-45).

The authors would like to thank Dr Emilie Saulnier-Talbot for the correction of the manuscript language.

Supplementary Material

SI 1 : Nutrient analyses SI 1-1 : Nutrient analyses protocol

Nutrient analyses were carried out at the beginning (T0) and at the end (T7) of the experiment. Twenty milliliters were sampled for silicate analyses. Soluble silicate concentrations were determined using the colorimetric method with a Shimadzu UV-1800 spectrophotometer (Shimadzu Inc., Kyoto, Japan) according to the French standard NF T90-007 [START_REF] Afnor | Water quality -Determination of soluble silicates -Molecular absorption spectrometric method -NF T[END_REF].

SI 1-2 : Nutrient concentration results

Nitrate concentrations remained stable throughout the experiment under all conditions, except for the diuron treatment, where a slight increase was noted between T0 and T7 (Table SI 1). By contrast, orthophosphate and silicate concentrations significantly decreased over time under all conditions. The consumption was similar between control and S-metolachlor-treated cultures, whereas it was less marked under diuron treatment (Table SI 1).

Abstract

The aim of this study was to evaluate the interspecific variability of the responses of two freshwater diatoms to herbicide contamination on their commonly used descriptors (photosynthesis, growth rate, pigment content, expression levels of target genes) and fatty acid profiles. The targeted species, Gomphonema gracile and Nitzschia palea, were exposed separately to diuron and S-metolachlor at high environmental concentration (10 µg.L -1 ) over seven days.

Under contaminated treatments, N. palea and G. gracile's defense mechanisms differed: 1) under diuron exposure, a higher induction of the antioxidative gene cat, as well as a decrease of the 20:5n3 and of pigment content and photosynthesis were noted for N. palea compared to G. gracile; 2) with S-metolachlor contamination, N. palea had a higher induction of the cat gene compared to G. gracile. No impact of S-metolachlor was observed on fatty acid profiles, pigment content, photosynthetic activity and growth rate of N. palea as opposed to G. gracile, where a decrease of 18:4n3, chlorophyll a content and growth rate were noted. These results highlight contrasted strategies used by diatoms to cope with pesticide exposure, depending on the species and the toxic mode of action of the chemical.

Despite the different mechanisms of protection involved, global impacts on photosynthetic activity were noted for the two species under diuron contamination.

Finally, the proportions of 20:5n3 and 18:4n3 (decreasing trend) and 18:1n9 (increasing trend) under diuron contamination consistently varied for both species, suggesting they could be potential biomarkers of diuron pollution.

Biological parameters

Genetic analysis

Four milliliters of each replicate were sampled on T7 and were centrifuged at 1.500 g for 5 min in order to remove the culture medium. Two hundred microliters of RNA later buffer were added to the pellet in order to avoid RNA degradation. Samples were stored overnight at 4 °C and then at -80 °C until the genetic analyses were performed.

The protocols for RNA extraction, Reverse Transcription of RNA and Real-Time q-PCR followed that described by Kim Tiam et al. ( 2012).

Ten genes were studied; their functions are summarized in Table 4.

The expression of the reference gene (-actin), which was stable and did not show variation with the applied experimental treatments, was used to determine the level of expression of each gene selected for this study. Relative mRNA expression was generated using the 2 -ΔCT method [START_REF] Livak | Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method: Methods[END_REF]. The expression of the gene rpl7 was not stable in this study and was not retained as a reference gene.

Supplementary Material SI 1-1 : Nutrient contents protocol

Nutrient concentrations were determined at the beginning (T0) and at the end (T7) of the experiment.

Nitrate and orthophosphate concentrations were analyzed using 15 mL (out of 35 mL) of the filtered culture samples diluted 2-fold with ultrapure water. Injection volume was 100 µL.

Analyses were performed using ionic chromatography with chemical suppression (COMPACT 881 IC Pro, Metrohm, Herisau, Switzerland) with a Metrohm 850 IC Conductivity Detector.

The separation was carried out with a Metrosep A Supp 4/5 Guard/4.0 pre-column followed by a Metrosep A sup 5 -250/4.0 anion exchange column. The eluent was a solution of 1 mM NaHCO3 and 3.2 mM Na2CO3. The chemical suppressor was a solution of 10 mM H2SO4.

Twenty milliliters were sampled for the analyses of silicate. Soluble silicate concentrations were determined using colorimetric method with a Shimadzu UV-1800 spectrophotometer (Shimadzu Inc., Kyoto, Japan) according to the French standard NF T90-007 [START_REF] Afnor | Water quality -Determination of soluble silicates -Molecular absorption spectrometric method -NF T[END_REF].

SI 1-2 : Nutrient contents results

Nitrate concentrations significantly decreased for NPAL control treatment between T0 and T7 conversely to GGRA where the nitrate concentration was stable over the time (Figure 24). With S-metolachlor treatment a significant decrease was found between T0 and T7 for NPAL while no difference was noted for GGRA. Under diuron treatment, no significant difference was observed for NPAL while a significant increase was noted between T0 and T7 for GGRA.

Orthophosphate concentrations significantly decreased between T0 and T7 for NPAL and GGRA control treatments (Figure 25). A same tendency was shown between T0 and T7 for Smetolachlor treatments for the two studied species. No difference was found between T0 and T7 for diuron treatment for the two species.

Highlights

• Diatoms contain non-polar (storage lipids) and polar lipids (structural lipids).

• Fatty acids are the main components of lipids.

• The effect of herbicides on diatom's lipid composition was evaluated.

• Diuron decreased storage lipids content.

• Diuron affected 20:5n3 content in lipids involved in photosynthesis. evaluated with biological parameters. Chemical changes in the microcosms were monitored by analyzing nutrient concentrations (Supporting Information 1).

Biological parameters

Photosystem II effective quantum yield

The PSII effective quantum yield, noted Φ'M [START_REF] Genty | The relationship between the quantum yield of photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence[END_REF], was determined by Pulse-Amplitude Modulated (PAM) fluorescence with a PHYTO-PAM (Heinz Walz GmbH, Germany) using an emitter-detector unit (PHYTO-ED), in "brown algae" mode. Measurements were carried out in 1 cm-wide quartz cuvettes filled with 2 mL of diatom culture. Five Φ'M measurements were carried out for each replicate and at each time (T1, T3 and T7).

Growth rate

The cellular concentration of diatoms was quantified, at T1, T3 and T7 of the experiment, from 1 mL of each sample fixed in Lugol (4 %) and stored at 4°C until counting was carried out, following the protocol below.

Each fixed sample was vortexed and 125 μL of the sample was dropped in a Nageotte counting chamber (Marienfield, Germany). The number of cells was determined in ten counting fields (1.25 μL each, 0.5 mm depth) under light microscopy. The difference between live and dead organisms was assessed, as described by [START_REF] Morin | Recovery potential of periphytic communities in a river impacted by a vineyard watershed[END_REF]. Cell concentration was expressed as the number of individuals per milliliter. Growth rate averages (in divisions/day) were determined to optimally fit the daily counting over the exponential growth phase, as the slope of the regression line of Ln (cell. mL -1 ) over time (days). Control values are therefore control slopes.

Lipid composition

The following protocol was performed at T1, T3 and T7 of the experiment. Cells from 30 mL of culture medium were harvested by centrifugation and lipids extracted according to Blight and Dyer (1959). Two milliliters of chloroform/methanol (2:1, v/v) were added and the samples were stored at 4°C until their analysis.

Five hundred µL of water were then added to each sample. They were vortexed and centrifuged for 10 min at 3,800 rpm. A 2-phase system was established, and the organic phase was recovered and transferred to a clean tube. The remaining lipids of the aqueous phase were further extracted by adding two milliliters of chloroform and by shaking. After centrifugation for 10 min at 3,800 rpm, the organic phases were pooled and evaporated to dryness under a stream of nitrogen. The lipids were then resuspended in 70 µL of chloroform/methanol (2:1, v/v) and vortexed before being conserved at -20 °C until separation on TLC plates.

The silica gel zones corresponding to each class of lipid, identified using lipid standards (5 µg of PE, PC, MGDG and SQDG (SIGMA)) and deposited simultaneously on the plate.

The lipids were then purified by one-dimensional thin layer chromatography on 10x10 cm silica gel plates previously cleaned with chloroform (VWR) using chloroform⁄n-propanol⁄methyl acetate⁄methanol⁄0.25 % aqueous KCl (10:10:10:4:1.6) as a solvent. Routine one-dimensional development was carried out with an automatic developing chamber (ADC2, CAMAG) under controlled humidity of 33 %.

The lipids were then visualized with a solution of 0.001 % (w⁄v) primulin in 80 % acetone under UV light.

Each class of lipid on the plate were scraped and transferred to a clean tube. Finally, fatty acid profiles for each lipid were analyzed as described below.

Diuron significantly increased EPA content in neutral lipids at T1, FFA content at T3 and PG proportion at T7. Conversely, a significant decrease in the proportion of EPA in PE was noted at T1 and in neutrals lipids, DGDG, PA/DGTA and PC at T7. The number of lipids containing impacted EPA increased with time under diuron exposure (Table 11).

Under S-metolachlor contamination, the EPA content in neutral lipids and PA/DGTA significantly increased at T1. EPA content in MGDG, FFA and SQDG significantly increased at T3. Conversely, proportions of EPA in PE significantly decreased at T7. EPA content in DGDG and DGTS significantly increased at T1 then significantly decreased at T7 (Table 11).

Conclusions générales