Monsieur Le Professeur

Vincent Bérézowski

Laurent Puy

Delphine Corseaux

Romain Perbet

Vincent Deramecourt

Charlotte Cordonnier
email: charlotte.cordonnier@univ-lille.fr

Neutrophil extracellular traps (NETs) infiltrate haematoma and surrounding brain tissue after intracerebral haemorrhage: A post-mortem study

Keywords: intracerebral haemorrhage, cerebral edema, MRI, cognition, experimental model, post-mortem

Je tiens à remercier l'ensemble des membres composant le jury de cette thèse qui me font le grand honneur d'avoir accepté de juger ce travail.

Madame le Professeur Charlotte Cordonnier,

Charlotte, sans vous, rien de tout ceci n'aurait été possible. Vous êtes, pour beaucoup, mais pour moi particulièrement une source d'inspiration, d'admiration. Je mesure la chance que j'ai de pouvoir apprendre chaque jour à vos côtés. Je veux aussi vous transmettre ici mon amitié.

Je tiens aussi à remercier:

Juliette, toujours sur le qui-vive de l'Amour, mais à trois cette fois.

Margaux, lorsque tu liras ces lignes tu auras drôlement grandi. Je veux que tu saches que ton père t'aime.

A ma famille à laquelle je tiens tant : mes parents, mon frère et pauline, ma soeur et Thibault, mon neveu Georges et ma future nièce. Je pense également à ma tante et à mes grands-parents dont ma chère mamie Monique. Je pense aussi à ceux de Catalogne.

A ma belle-famille toujours aussi gentille et bienveillante à mon égard.

A mes amis, d'enfance et d'Amiens que j'aimerais voir plus souvent. Merci pour votre amitié, qui dure malgré le temps.

Je remercie également le Professeur Régis Bordet et l'ensemble de l'équipe U1172 ainsi que la team d'imagerie. Grâce à vous j'ai pu m'essayer et prendre gout à la vie de scientifique dans la bonne humeur et la convivialité. Plus qu'un simple travail, j'ai vécu une expérience de vie que je n'oublierai jamais. J'ai une pensée particulière pour Romain et Laura mes co-thésards  et à la Deguil Scale.

Je remercie également Bélinda Duchêne et Marie-Hélène Gevaert pour leur aide précieuse dans ce travail.

Je remercie également le formidable service de neurologie vasculaire dans laquelle je m'épanouis actuellement. Francois, Nelly, Lucie, Marco, Marie, Hilde, Arnaud : c'est un honneur pour moi d'être membre de votre équipe, je continuerai d'apprendre de chacun d'entre vous. Merci également à toute l'équipe paramédicale qui me permet de travailler dans la bonne humeur.

Je remercie aussi ici, chacune des personnes que j'ai eu l'occasion de rencontrer dans mon parcours de médecin et de chercheur.

Encore une fois à toi Juliette parce que, vraiment, tu le mérites. Nos résultats contribuent à affiner notre perception de l'OPH, à renforcer les liens entre recherche clinique et pré-clinique, et, nous l'espérons, à identifier des stratégies thérapeutiques innovantes pour l'HIC.

Mots clefs : hémorragie intracérébrale spontanée ; oedème cérébral ; IRM ; cognition ; modèle expérimental ; post-mortem.

INTRODUCTION GENERALE 1. Hémorragies intracérébrales spontanées

Définition

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) occupent une place importante en matière de santé publique. Ils représentent la première cause de handicap physique acquis de l'adulte, la deuxième cause de troubles cognitifs majeurs et la troisième cause de mortalité (Puy et Cordonnier 2019). Parmi eux, les AVC hémorragiques ou hémorragies intracérébrales (HIC) représentent 15 à 20% de tous les AVC en Europe et ont une part bien plus importante en Asie et en Afrique. Ces hémorragies résultent d'un saignement cérébral intra-parenchymateux en lien avec la rupture de petits vaisseaux généralement touchés par une microangiopathie dont l'origine est intimement liée à la localisation du saignement (Figure 1). ( 1) Les HIC localisées dans les régions profondes du cerveau (dites HIC profondes) sont le résultat de la rupture des petites artères touchant préférentiellement le putamen et le thalamus et sont sous-tendues par une angiopathie des artères perforantes profondes favorisée par l'âge et l'hypertension artérielle [START_REF] Qureshi | Spontaneous Intracerebral Hemorrhage[END_REF]. (2) Les HIC de localisation lobaire (dites HIC lobaires) proviennent de la rupture des artères de petit et moyen calibre perforant le cortex et la substance blanche souscorticale dont la cause principale est l'angiopathie amyloïde cérébrale. Cette angiopathie amyloïde cérébrale provient de l'accumulation progressive de dépôts de peptide amyloïde β dans les petits vaisseaux corticaux et leptomeninges (Puy et Cordonnier 2019).

Une maladie grave

Malgré l'optimisation des traitements de prévention primaire, l'incidence des HIC n'a pas diminué depuis les années 80. Contrairement aux AVC ischémiques, les HIC n'ont pas vu de progrès majeur dans leur prise en charge depuis plus de 25 ans ce qui explique qu'elles gardent un pronostic sombre avec une mortalité précoce (<48 heures) demeurant importante et stable [START_REF] Béjot | Temporal Trends in Early Case-Fatality Rates in Patients with Intracerebral Hemorrhage[END_REF]. La survie à 1 an après une HIC est évaluée à 46% et seulement à 29% à 5 ans [START_REF] Poon | Long-Term Prognosis after Intracerebral Haemorrhage: Systematic Review and Meta-Analysis[END_REF]. Le pronostic à long terme est également sombre : parmi les patients ayant survécu au moins 30 jours après l'HIC, le taux cumulé de survie à 10 ans était de 38% (Pasi et al. 2021).

Au-delà de la mortalité, l'HIC induit un handicap fonctionnel majeur. Une méta-analyse évaluant le pronostic fonctionnel des patients présentant une HIC, révèle seulement 12 à 39% d'indépendance fonctionnelle à long terme (van [START_REF] Asch | Incidence, Case Fatality, and Functional Outcome of Intracerebral Haemorrhage over Time, According to Age, Sex, and Ethnic Origin: A Systematic Review and Meta-Analysis[END_REF]. Ce handicap n'est pas exclusivement moteur puisque le pronostic cognitif des HIC est également mauvais. En effet, parmi les survivants sans trouble cognitif préexistant, l'incidence de la démence est estimée à 14% à 1 an et à 28% à 4 ans (Moulin et al. 2016).

Une maladie dépourvue de traitement spécifique

Toutes les stratégies thérapeutiques (médicaments hémostatiques, évacuation chirurgicale), ayant pour objectif la lutte contre l'expansion de l'hémorragie, ont échoué (Steiner et al. 2014).

Seule la baisse rapide de la pression artérielle < 140/90 mmHg a montré un bénéfice fonctionnel modeste avec cependant la perte de ce bénéfice et la survenue d'effets indésirables si cette baisse descend en dessous des 120 mmHg de pression artérielle systolique [START_REF] Moullaali | Blood Pressure Control and Clinical Outcomes in Acute Intracerebral Haemorrhage: A Preplanned Pooled Analysis of Individual Participant Data[END_REF].

Ce constat d'échec nous oblige à une meilleure compréhension de la cinétique évolutive de l'HIC et de ses conséquences afin d'envisager d'autres cibles thérapeutiques. C'est dans ce contexte que notre attention s'est portée sur la zone péri-hémorragique, communément appelée « oedème péri-hémorragique » (OPH), qui pourrait avoir une implication pronostique donc être une cible thérapeutique. Cependant, peu de données sont disponibles concernant sa physiopathologie, son évolution naturelle et sa valeur pronostique. Nous proposons ici un état des lieux des connaissances actuelles sur l'OPH.

L'oedème péri-hémorragique (OPH)

Le tissu cérébral, siège de la rupture d'un vaisseau et de l'hémorragie initiale, s'expose secondairement à des réactions cytotoxiques et inflammatoires en réponse à l'effet de masse initial ainsi qu'aux composants toxiques des produits de dégradation du sang.

Physiopathologie de la formation de l'OPH

De nombreux acteurs semblent contribuer à la formation de l'OPH. Mais sa physiopathologie ne reste que partiellement comprise. En 2021, trois phases sont décrites (Figure 2) :

(1) Phase précoce (première heure), une composante « mécanique ». L'entrée massive de sang dans le parenchyme cérébral provoque, de manière précoce, une diffusion rapide de plasma dans les tissus environnants [START_REF] Zazulia | Progression of Mass Effect after Intracerebral Hemorrhage[END_REF]. L'accumulation de ce plasma élève la pression osmotique interstitielle et favorise le mouvement des fluides des capillaires vers la zone péri-hémorragique. Enfin, en coagulant, le sang forme un caillot dont la rétraction va également induire une libération de protéines plasmatiques (Xi et al. 1998;[START_REF] Yang | The Effects of Blood or Plasma Clot on Brain Edema in the Rat with Intracerebral Hemorrhage[END_REF]. Ces mécanismes ont été observés dans des modèles d'HIC chez les gros animaux qui présentaient une barrière hémato-encéphalique (BHE) intacte, soulignant le rôle d'un gradient osmotique dans la formation précoce de l'OPH (Richard F. Keep, Hua, et Xi 2012).

(2) Phase intermédiaire (premiers jours), le rôle de la thrombine. La cascade de coagulation s'active dès que le sang pénètre dans le tissu cérébral, et la thrombine joue un rôle identifié [START_REF] Ye | The Role of Thrombin in Brain Injury After Hemorrhagic and Ischemic Stroke[END_REF][START_REF] Negrier | The Central Role of Thrombin in Bleeding Disorders[END_REF]. D'une part, en convertissant le fibrinogène en fibrine, elle participe à la coagulation du sang et à la rétraction du caillot formé. Par ailleurs, la présence de thrombine génère deux effets majeurs : (1) un effet proinflammatoire et (2) une participation à la rupture de la BHE. Elle agit en induisant la libération de divers médiateurs de la réaction inflammatoire (facteur de nécrose tumoral kappa B (NFĸB), interleukine 1β, chimiokines), et diverses enzymes protéolytiques qui dégradent l'interstitium et la matrice extracellulaire : les métalloprotéinases matricielles (MMP). Elle stimule également la voie du complément. Elle active le récepteur PAR-1 (Protease Activated Receptor-1) dont la surexpression est associée à une neurotoxicité et une activation microgliale exacerbée (Zheng et al. 2016). Sous l'effet des PAR et MMP, la thrombine participe à la rupture de la BHE en modifiant les interactions entre cellules endothéliales et matrice extracellulaire [START_REF] Guan | Effect of Thrombin on Blood Brain Barrier Permeability and Its Mechanism[END_REF][START_REF] Liu | Blood-Brain Barrier Breakdown and Repair by Src after Thrombin-Induced Injury[END_REF][START_REF] Bodmer | The Molecular Mechanisms That Promote Edema After Intracerebral Hemorrhage[END_REF]. Tous ces mécanismes thrombine-dépendant amplifient la réponse inflammatoire s'opérant dans la zone autour de l'HIC ce qui contribue au développement de l'OPH (López et al. 2014;[START_REF] Keep | Blood-Brain Barrier Function in Intracerebral Hemorrhage[END_REF]).

(3) Phase tardive (au-delà du 3ème jour), le rôle des produits de dégradation du sang. Après hémolyse et libération de l'hémoglobine (Hb) dans l'espace extra-cellulaire, cette dernière est prise en charge par l'haptoglobine et l'hème libre par l'hémopexine. Cet thème, tout comme le fer à l'état libre, sont de puissants pro-oxydants. Par la réaction de Fenton, le fer héminique s'oxyde, passant de l'état ferreux (2 + ) à l'état ferrique (3 + ), générant la formation d'espèces réactives de l'oxygène (ROS). Les ROS comprennent l'anion radical superoxyde (O2 .-), le peroxyde d'hydrogène (H2O2) qui interagit avec les ions ferreux (réaction de Fenton) pour produire le radical hydroxyl ( . OH), l'espèce radicalaire la plus délétère du stress oxydant (Dixon et Stockwell 2014). Ces réactions d'oxydation concernent principalement les lipides et les lipoprotéines des composants membranaires occasionnant la lyse et la mort cellulaire par cytotoxicité (peroxydation lipidique). Les ROS contribuent aussi à la rupture de la BHE et au développement de l'oedème péri-hémorragique [START_REF] Pun | Involvement of ROS in BBB Dysfunction[END_REF]. Par ailleurs, l'hème libre joue un rôle capital au cours de la réponse inflammatoire en stimulant l'expression endothéliale des molécules d'adhésion ICAM-1, VCAM-1 et sélectine E qui permettent l'extravasation des leucocytes. Enfin, les dépôts de fer exacerbent l'expression de l'Aquaporine-4 (AQP4), hautement impliquée dans l'homéostasie hydrique du tissu cérébral. Ils activent aussi la microglie par la voie du récepteur TLR4 (Toll-like receptor-4) (Zheng et al. 2016). L'organisme dispose de moyens d'élimination de l'hème par le système CD163 / hème oxygénase 1 (HO-1) (Garton et al. 2017, 163;Thomsen et al. 2013;Q.-Q. Li et al. 2018). Le récepteur CD163 permet la capture du complexe hémoglobine/haptoglobine par la microglie et les macrophages recrutés. Puis, après son incorporation, l'Hb est décomposée en Fe2+, CO et biliverdine sous l'action de l'hème oxygénase-1 (HO-1). L'HO-1 a des capacités antioxydantes, anti-inflammatoires et anti-apoptotiques (Campbell, Fitzgerald, et Dunne 2021). Cependant, lorsqu'une hémolyse importante survient au cours d'un état pathologique comme l'hémorragie cérébrale, les capacités d'élimination de l'hème se trouvent dépassées, ce qui conduit aux effets toxiques décrits plus haut.

Réponse inflammatoire et mécanismes de mort cellulaire

La réponse inflammatoire

Le recrutement leucocytaire

Les cellules microgliales sont des cellules dérivées de monocytes sanguins qui résident dans le parenchyme cérébral et constituent 10 % des cellules du SNC (Aguzzi, Barres, et Bennett 2013). CML : cellules musculaires lisses ; MB : membrane basale

La rupture de la barrière hémato-encéphalique (BHE)

La BHE est une interface, un lieu d'échange, entre les capillaires sanguins et le cerveau. Elle comporte des propriétés restrictives exerçant un contrôle strict du passage des nutriments et des éléments passant du sang au cerveau (Figure 4). Il s'agit d'une barrière sélective empêchant le passage non-spécifique de la plupart des molécules hydrophiles par la présence de jonctions serrées intercellulaires [START_REF] Daneman | The Blood-Brain Barrier[END_REF]. Les molécules issues du sang ne peuvent donc la traverser qu'en empruntant les voies transcellulaires spécifiques, c'est-à-dire exigeant une reconnaissance préalable des molécules par les systèmes de transport. De plus, des propriétés de barrière métabolique (enzymes, pompes d'efflux) limitent encore le passage d'un large spectre de molécules hydrophiles comme lipophiles. Ces propriétés de barrière sont entretenues par l'influence des pieds astrocytaires. La persistance de la lésion hémorragique, tout comme l'inflammation prolongée, endommage les astrocytes et donc altère les propriétés sélectives des cellules endothéliales. La perte de sélectivité de cette BHE génère des fuites vers le tissu cérébral avec exsudation du plasma, provoquant un oedème dit vasogénique qui amplifie l'effet indésirable oedémateux de la réponse inflammatoire [START_REF] Beaumont | The Permissive Nature of Blood Brain Barrier (BBB) Opening in Edema Formation Following Traumatic Brain Injury[END_REF]. MAO : monoamine oxydase ; P450 : cytochromes P450 ; γ -GT : gamma-glutamyltranspeptidase ; JS : jonction serrée ; JA : jonction adhérente.

La mort cellulaire dans l'HIC : nécrose, apoptose et ferroptose

L'HIC induit une mort cellulaire par des mécanismes différents et des temps pouvant varier de quelques secondes à plusieurs jours.

La nécrose

Bien qu'il ne représente que 2 % de la masse du corps humain, le cerveau consomme prés de 20% de l'énergie de l'organisme [START_REF] Raichle | Appraising the Brain's Energy Budget[END_REF]. Cette forte consommation, ajoutée à l'absence de réserves, rend le cerveau extrêmement sensible aux variations d'approvisionnement en dioxygène et en substrat énergétique par le sang. La nécrose est une mort cellulaire non programmée, survenant en réponse à une agression exogène, et se manifestant par une perte d'intégrité de la membrane plasmique et un déversement du contenu cellulaire [START_REF] Berghe | Regulated Necrosis: The Expanding Network of Non-Apoptotic Cell Death Pathways[END_REF]. Dans les secondes suivant l'hémorragie, la pression intracranienne va subitement augmenter. Cela a pour conséquence une compression mécanique (i) du tissu neuroglial et son altération physique comprenant de la nécrose cellulaire, et (ii) des microvaisseaux adjacents, réduisant localement la perfusion sanguine et entrainant ainsi une réduction des apports sanguins. Le dioxygène étant l'accepteur final des électrons de la chaîne respiratoire mitochondriale, la diminution de sa concentration réduit les phosphorylations oxydatives, ne permettant plus une production suffisante d'adénosine triphosphate (ATP) au sein des cellules cérébrales. Ce déficit énergétique constitue l'élément déclencheur de multiples réactions cellulaires qui vont conduire à la mort des cellules cérébrales. La glycolyse anaérobie compensatrice mise en place s'accompagne d'une acidification du tissu cérébral par accumulation d'acide lactique et de protons. Cette acidose loco-régionale est à l'origine de nombreuses perturbations comme la formation accrue de radicaux libres à l'origine d'un stress oxydant participant à la mort cellulaire, mais également à la perturbation du fonctionnement de nombreux transporteurs ioniques transmembranaires. La déplétion en ATP compromet l'activité́ de l'échangeur membranaire Na/K -ATPase, ce qui conduit à une augmentation de la concentration intracellulaire en Na + et à une libération accrue de K + . Cette perte de l'homéostasie ionique entraine un gonflement cellulaire qui affecte aussi bien les neurones que les cellules gliales et conduit à la lyse cellulaire [START_REF] Eguchi | Intracellular ATP Levels Determine Cell Death Fate by Apoptosis or Necrosis[END_REF]. Suite au déficit énergétique et à l'altération de l'homéostasie ionique, les neurones et les cellules gliales vont perdre leur potentiel membranaire. Cette dépolarisation, dans le cas des neurones, s'accompagne du relargage de nombreux neuromédiateurs, en particulier le glutamate. Cette libération massive de glutamate au niveau synaptique et extra-synaptique participe à la mort neuronale par "excitotoxicité" [START_REF] Kroemer | Classification of Cell Death: Recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009[END_REF]. Cette mort nécrotique libère des contenus cellulaires toxiques pour les cellules voisines, ce qui propage la nécrose. Enfin, les cellules nécrosantes relarguent des protéases et des DAMPs (Damage/Danger-Associated Molecular Patterns) qui vont être repérés par les cellules microgliales. Ces dernières vont activer in fine la réponse inflammatoire qui vise à éliminer les cellules mortes et leurs débris pour stopper la propagation de la nécrose [START_REF] Roh | Damage-Associated Molecular Patterns in Inflammatory Diseases[END_REF].

L'apoptose

A contrario de la nécrose, l'apoptose est un mécanisme de mort cellulaire programmée et finement régulé. Outre son rôle dans différents contextes pathologiques (notamment en oncologie), l'apoptose est essentielle au cours du développement [START_REF] Meier | Apoptosis in Development[END_REF].

Son déclenchement repose sur l'activation de protéases spécifiques appelées caspases, qui se chargent de dégrader de façon coordonnée les différentes structures cellulaires (condensation du cytoplasme, condensation de la chromatine, fragmentation de l'ADN...). Cette dégradation progressive en cascade aboutit à la formation de corps apoptotiques constitués de débris des différents organites enveloppés d'une membrane. Ces corps apoptotiques permettent une élimination « propre » des cellules, sans déversement du contenu cellulaire à l'extérieur, et donc sans inflammation majeur. Ces corps apoptotiques seront ensuite éliminés par les macrophages [START_REF] Elmore | Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death[END_REF]. Dans le cadre de l'HIC, cette mort cellulaire est plus tardive que la nécrose et survient dans des zones plus éloignées de l'hématome, et s'applique aux cellules en souffrance afin de prévenir leur nécrose [START_REF] Dirnagl | Pathobiology of Ischaemic Stroke: An Integrated View[END_REF].

La Ferroptose

En 2012, Dixon et al. proposent un nouveau concept de mort cellulaire dépendante du fer, la ferroptose (Dixon et al. 2014). Cette dernière correspond à une mort cellulaire programmée non-apoptotique, déclenchée par le fer, et caractérisée par une accumulation de ROS. Ces ROS sont dérivées du métabolisme du fer, induisant une peroxydation lipidique [START_REF] Mahoney-Sánchez | Ferroptosis and Its Potential Role in the Physiopathology of Parkinson's Disease[END_REF]. Une quantité excessive de fer intracellulaire libre contribue à la ferroptose en produisant des ROS par la réaction de Fenton couplée à la réaction d'Haber-Weiss.

Morphologiquement, la ferroptose est caractérisée par la présence de mitochondries plus petites que la normale avec une condensation des membranes mitochondriales, une réduction ou une disparition des crêtes mitochondriales et une rupture de la membrane mitochondriale externe.

Toutefois, la membrane cellulaire reste intacte, le noyau est de taille normale et il n'y a pas de condensation de la chromatine. Des données in vitro et in vivo confirment l'implication de la ferroptose dans l'HIC [START_REF] Bai | Ferroptosis, a Regulated Neuronal Cell Death Type After Intracerebral Hemorrhage[END_REF]. La ferroptose semble plus tardive que la nécrose et l'apoptose puisque qu'elle survient après la lyse des érythrocytes et la dégradation de l'hémoglobine dont le produit peptidique s'accumule in fine en un complexe d'hémosidérine, qui stocke le fer sous forme d'hydroxyde ferrique.

La plupart des mécanismes physiopathologiques abordés dans cette section ont fait l'objet de pharmaco-modulations, prometteuses en science expérimentale mais non efficaces chez l'Homme. Cela montre que notre compréhension de la physiopathologie de l'ICH est limitée.

Plusieurs raisons sont envisageables dont par exemple, une méconnaissance de la contribution respective et de la cinétique précise de chacun des mécanismes évoqués, un mécanisme prépondérant restant à découvrir, sans oublier les variations interindividuelles liées au terrain des patients victimes d'AVC. Toutes ces incertitudes ont des conséquences pharmacologiques sur le choix de la molécule à cibler, la dose précise à délivrer ainsi que sur le délai, la durée et la biodisponibilité du traitement employé. Avant de concevoir une nouvelle molécule, il semble donc nécessaire de mieux caractériser, ex vivo et in vivo, la chronologie de l'intervention des différents acteurs responsables de l'OPH que ce soit dans les modèles expérimentaux mais également chez l'Homme.

Apport de l'imagerie cérébrale dans l'étude de l'OPH

En préambule de ce travail de thèse, nous avons réalisé une revue systématique de la littérature qui a permis de sélectionner 24 articles pertinents, traitant de la thématique de l'OPH et de son impact pronostic (Table 1).

Des méthodes d'évaluation hétérogènes

En comparant ces différents articles, nous avons mis en évidence une grande hétérogénéité dans les méthodes de mesure de l'OPH :

(1) Le type d'imagerie utilisée (Table 1). En raison de son accessibilité et de sa rapidité d'acquisition, la tomodensitométrie (TDM), où scanner cérébral, est la modalité de neuroimagerie privilégiée pour la quantification de l'OPH. Sur le scanner (Figure 5A), l'OPH se manifeste par une hypodensité dont la densité de signal (en unités de Hounsfield) est similaire au liquide céphalo-rachidien et à certains marqueurs de maladie des petites artères cérébrales (lacune, hypersignaux de substance blanche évolués) ce qui complique la segmentation et le recours aux algorithmes de détection des seuils ou des bords de la lésion [START_REF] Ironside | Fully Automated Segmentation Algorithm for Perihematomal Edema Volumetry After Spontaneous Intracerebral Hemorrhage[END_REF].

Pourtant, l'imagerie par résonnance magnétique (IRM) apparait être un outil plus performant pour la segmentation de l'OPH. Par exemple, la séquence T2 FLAIR permet de délimiter l'OPH, bien visible en hypersignal (Figure 5B). Les études ayant utilisé uniquement l'IRM sont peu nombreuses et ont des effectifs faibles (moins de 60 patients). (2) Des méthodes de mesures variables (Table 1). Certains auteurs étudient le volume absolu de l'OPH, tandis que d'autres utilisent le volume relatif (avec ratio du volume d'OPH sur le volume de l'HIC). Les temps d'analyse varient également d'une étude à l'autre mais se concentrent généralement sur la phase aiguë : nous n'avons identifié que 4 articles ayant étudié le volume d'OPH au-delà du septième jour. Enfin, à l'heure actuelle la segmentation de l'OPH repose essentiellement sur des méthodes manuelles, longues et fastidieuses et qui présentent des taux de variabilité intra et inter-observateurs élevés. Par conséquent, l'optimisation et la normalisation de l'analyse volumétrique de l'OPH sont nécessaires. Certaines équipes ont mis au point des méthodes de segmentation semi-automatiques sur scanner et IRM [START_REF] Ironside | Fully Automated Segmentation Algorithm for Perihematomal Edema Volumetry After Spontaneous Intracerebral Hemorrhage[END_REF][START_REF] Pszczolkowski | Automated Segmentation of Haematoma and Perihaematomal Oedema in MRI of Acute Spontaneous Intracerebral Haemorrhage[END_REF]. Cependant, ces méthodes sont limitées par le manque de validation externe ainsi que par la petite taille des échantillons étudiés. Il n'existe à ce jour aucune méthode de segmentation de l'OPH et de l'HIC pleinement automatisée. Le développement d'une telle technologie est un enjeu de taille car une quantification précise et fiable de l'OPH sera cruciale pour les futurs essais cliniques de l'HIC qui utilisent l'OPH comme biomarqueur de l'efficacité d'un traitement.

Il résulte de cette variabilité méthodologique une hétérogénéité des résultats concernant la description de la cinétique de l'OPH et de son impact pronostique après une HIC.

Une histoire naturelle imprécise

Les études cliniques ont mis en évidence deux phases distinctes dans l'histoire naturelle de l'OPH : une phase initiale de croissance rapide dans les 24 premières heures après l'HIC et une phase de croissance lente s'étendant sur plusieurs jours à semaines. Le pic d'OPH survient classiquement entre la deuxième et la troisième semaine après l'HIC. Ainsi le volume maximal de l'OPH peut être atteint jusqu'à 21 jours suivant l'AVC [START_REF] Wu | Natural History of Perihematomal Edema and Impact on Outcome After Intracerebral Hemorrhage[END_REF][START_REF] Venkatasubramanian | Natural History of Perihematomal Edema after Intracerebral Hemorrhage Measured by Serial Magnetic Resonance Imaging[END_REF]. Néanmoins, les délais varient beaucoup d'une étude à l'autre. Cette variabilité s'explique en partie par des limites méthodologiques incluant des durées de suivi radiologique différentes d'une étude à l'autre, des méthodes de quantification de l'OPH hétérogène ainsi que des effectifs de patients limités (Table 1). Ainsi, d'autres études longitudinales portant sur la caractérisation de l'histoire naturelle de l'OPH sont nécessaires.

L'OPH a une valeur pronostique incertaine

Les données actuelles de la littérature qui ont étudié l'effet propre de l'OPH sur le pronostic des HIC sont discordantes (et sont résumées dans la Table 1). En effet, même si la majorité des études montrent une influence négative de l'OPH sur le pronostic fonctionnel, d'autres rapportent un effet neutre voir même une influence paradoxale positive. Du fait de l'hétérogénéité des études dans la méthode de mesure de l'OPH, seulement 2 études ont pu être incluses dans une méta-analyse récente [START_REF] Yu | Prognostic Role of Perihematomal Edema in Intracerebral Hemorrhage: A Systematic Review[END_REF]. Dans cette méta-analyse, le taux de croissance de l'OPH à 72 heures était indépendamment associé à un moins bon pronostic fonctionnel à 3 mois [odd ratio : 1.62 ; IC 95% 1.27-2.06].

Peu de marqueurs du risque d'extension de l'OPH

Une meilleure compréhension des facteurs de risque qui précipitent l'expansion de l'OPH est très utile pour identifier les patients à risque d'aggravation. Si le volume initial de l'hématome est reconnu comme facteur de risque d'avoir un OPH plus important, nous ne disposons pas de données robustes permettant d'identifier d'autres facteurs de risque. L'hypertension artérielle a fait l'objet d'une attention particulière. Dans l'étude INTERACT (Intensive Blood Pressure Reduction in Acute Cerebral Hemorrhage Trial), incluant 3000 patients, la pression artérielle systolique à l'admission était inversement corrélée à la croissance absolue de l'OPH à 72 heures (P=0,02). En revanche, l'étude ATACH (Antihypertensive Treatment of Acute Cerebral Hemorrhage) n'a pas permis d'établir une association entre un contrôle agressif de la pression artérielle systolique et une réduction de la croissance relative de l'OPH sur 24 heures (risque relatif, 0,74 [START_REF] Zazulia | Progression of Mass Effect after Intracerebral Hemorrhage[END_REF]29]) [START_REF] Yang | Prognostic Significance of Perihematomal Edema in Acute Intracerebral Hemorrhage: Pooled Analysis from the Intensive Blood Pressure Reduction in Acute Cerebral Hemorrhage Trial Studies[END_REF]. En conséquence, les preuves sont insuffisantes pour affirmer que la gestion intensive de la pression artérielle systolique modifie la trajectoire de l'OPH. La topographie (et donc la maladie vasculaire sous-jacente) de l'HIC a également été étudiée, toujours dans l'idée de pouvoir sélectionner des patients éligibles à des thérapeutiques ciblant le développement de l'OPH. Mais, sur les cinq articles ayant évalué l'existence d'une association entre le volume d'OPH et la topographie de l'HIC, aucun d'entre eux ne met en évidence d'association statistiquement significative [START_REF] Yang | Prognostic Significance of Perihematomal Edema in Acute Intracerebral Hemorrhage: Pooled Analysis from the Intensive Blood Pressure Reduction in Acute Cerebral Hemorrhage Trial Studies[END_REF][START_REF] Arima | Significance of Perihematomal Edema in Acute Intracerebral Hemorrhage: The INTERACT Trial[END_REF][START_REF] Staykov | Natural Course of Perihemorrhagic Edema after Intracerebral Hemorrhage[END_REF][START_REF] Appelboom | Volume-Dependent Effect of Perihaematomal Oedema on Outcome for Spontaneous Intracerebral Haemorrhages[END_REF][START_REF] Grunwald | Perihematomal Edema Expansion Rates and Patient Outcomes in Deep and Lobar Intracerebral Hemorrhage[END_REF]. Enfin, des travaux ont montré un effet de certains traitements à l'admission. La prise d'anticoagulant semble être associée à un volume relatif d'OPH plus faible à l'admission (P<0,05), ce qui est cohérent avec les effets facilitateurs de l'activation de la cascade de coagulation sur la formation de l'OPH que nous avons décrit précédemment [START_REF] Levine | Early Edema in Warfarin-Related Intracerebral Hemorrhage[END_REF]. Dans une cohorte de 125 patients HIC, une exposition antérieure aux statines était indépendamment associée à une réduction des volumes absolus (P=0,035) et relatifs (P=0,021) de l'OPH à l'admission [START_REF] Naval | An Association of Prior Statin Use with Decreased Perihematomal Edema[END_REF].

Une deuxième étude prospective portant sur 176 patients, ne confirmait finalement pas cet effet [START_REF] Witsch | Statins and Perihemorrhagic Edema in Patients with Spontaneous Intracerebral Hemorrhage[END_REF]. Aucune étude n'a étudié l'effet des statines sur le taux de croissance de l'OPH. Cette partie démontre nos carences en matière de compréhension des mécanismes à l'origine de l'apparition et du développement de l'OPH. Elle souligne également des faiblesses dans notre approche méthodologique pour étudier in vivo l'OPH et ses effets.

La recherche translationnelle offre des opportunités uniques pour pallier ces manques.

Hémorragie cérébrale et modèles animaux

Malgré certaines limites, les modèles expérimentaux animaux sont des outils indispensables pour appréhender les mécanismes physiopathologiques de l'oedème et établir une corrélation entre des données histologiques, biologiques et d'imagerie cérébrale. Ils sont également essentiels pour la mise au point de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les modèles animaux s'étendent du poisson zèbre (Zebrafish) aux gros mammifères [START_REF] Withers | A Multi-Model Pipeline for Translational Intracerebral Haemorrhage Research[END_REF]. Mais les rongeurs sont les plus couramment utilisés pour étudier l'HIC. Une de leurs limites repose sur la relative rareté de la substance blanche par rapport à l'homme, comme l'illustre la Figure 6.

Les animaux lissencéphales comme les rongeurs ont un ratio substance grise/substance blanche plus élevé, ce qui ne représente pas le ratio chez l'homme [START_REF] Krafft | Etiology of Stroke and Choice of Models[END_REF]. Cette différence peut avoir un impact sur les manifestations lésionnelles et leurs conséquences fonctionnelles car la substance blanche est un constituant majeur et actif du système nerveux central, dont le rôle ne se réduit pas à une simple structure de soutien. Elle permet de lier différentes aires cérébrales entre elles, par le biais de fibres commissurales, associatives et de projection [START_REF] Filley | White Matter and Cognition: Making the Connection[END_REF]. Elle joue également un rôle dans la vitesse de conduction des messages nerveux ainsi que dans l'apprentissage et le contrôle des émotions (Y. Wang et al. 2018). G (grey) : subtance grise ; W (white) : substance blanche.

Différents modèles pour induire une HIC

Il existe différents modèles permettant d'induire une HIC dont la grande majorité ne sont pas spontanés et impliquent des techniques invasives pour générer un saignement, par injection stéréotaxique de sang autologue ou de collagénase, comme décrit ci-dessous.

Modèle d'injection de sang autologue

Le modèle d'injection de sang autologue a été mis au point comme modèle animal contrôlable et reproductible de l'HIC et a fait l'objet de nombreux ajustements depuis sa création en 1982.

Initialement, les auteurs de Ropper et al. avaient utilisé le sang artériel d'un rat donneur injecté dans le striatum droit d'un rat receveur [START_REF] Ropper | Cerebral Blood Flow after Experimental Basal Ganglia Hemorrhage[END_REF][START_REF] Bullock | Intracranial Haemorrhage Induced at Arterial Pressure in the Rat. Part 1: Description of Technique, ICP Changes and Neuropathological Findings[END_REF]. Du fait de la réaction immunitaire provoquée, l'utilisation de sang de donneur est rapidement devenue obsolète, et a été remplacée par l'utilisation de sang autologue. Actuellement, le modèle le plus abouti consiste en une injection stéréotaxique de sang autologue en deux temps dans le striatum [START_REF] Ma | History of Preclinical Models of Intracerebral Hemorrhage[END_REF]. Cette double injection, mise en oeuvre pour la première fois en 1996, a été utilisée pour permettre à une petite quantité de sang de coaguler, afin d'éviter un reflux le long du trajet de l'aiguille, permettant au volume de sang restant d'accentuer l'hématome (Deinsberger et al. 1996). Ce modèle permet de reproduire un saignement unique, facilement reproductible. Il mime un bon nombre des caractéristiques clés observées chez l'homme, tels que l'effet de masse, la formation d'OPH et induit un déficit neurologique significatif [START_REF] Manaenko | Comparison of Different Preclinical Models of Intracerebral Hemorrhage[END_REF]. Cependant, le modèle de sang autologue ne reproduit pas la rupture de vaisseaux responsable du saignement et ne peut pas être utilisé pour étudier l'expansion de l'hématome, qui est présente chez un tiers des patients au cours des 24 heures suivant l'apparition de l'HIC [START_REF] Schlunk | The Pathophysiology of Intracerebral Hemorrhage Formation and Expansion[END_REF]. Par conséquent, l'utilisation principale du modèle de sang autologue est d'étudier les conséquences d'une entrée massive de sang dans le cerveau.

Modèle d'injection de collagénase

Le modèle de collagénase est la technique la plus couramment utilisée pour induire une HIC chez les rongeurs. Il implique l'injection de collagénase, une métalloprotéinase qui dégrade la paroi des vaisseaux en digérant le collagène de leur membrane basale, induisant leur rupture [START_REF] Montfort | The Distribution of Collagenase in Normal Rat Tissues[END_REF]. Ce modèle a été réalisé pour la première fois chez le rat par

Modèles d'hémorragies spontanées

Il existe des modèles de facteurs de risque modifiables et non modifiables (âge, hypertension artérielle, maladie des petits vaisseaux [AAC, COL4A1] afin de mieux comprendre comment l'HIC peut être prévenue dans ces populations [START_REF] Winkler | Spontaneous Hemorrhagic Stroke in a Mouse Model of Cerebral Amyloid Angiopathy[END_REF][START_REF] Gould | Role of COL4A1 in Small-Vessel Disease and Hemorrhagic Stroke[END_REF]. Ces modèles sont particulièrement utiles pour mieux étudier les causes de la rupture spontanée des vaisseaux, mais ils présentent également des inconvénients : la survenue, la taille et la localisation de ces hémorragies sont aléatoires, ce qui rend plus difficile l'étude des conséquences de l'HIC [START_REF] Withers | A Multi-Model Pipeline for Translational Intracerebral Haemorrhage Research[END_REF]).

Utilisation de l'imagerie cérébrale pour l'étude de l'OPH dans les modèles animaux

Dans les modèles expérimentaux d'HIC, l'OPH se développe généralement dans les 2 heures, atteint son pic le troisième jour puis diminue mais persiste jusqu'à 7 jours (Zheng et al. 2016).

Ces données sont principalement issues de travaux ayant quantifié l'OPH via des méthodes ex vivo, nécessitant l'euthanasie des animaux. Nous avons souhaité faire un état des lieux des connaissances concernant l'utilisation de l'IRM cérébrale pour l'étude de l'OPH en recherche D'après une revue exhaustive de la littérature (numéro CRD42018110204 du registre prospectif international des revues systématiques), il n'existe que 44 études post-mortem qui ont étudié les mécanismes inflammatoires survenant autour de l'hémorragie (Loan et al. 2021). Parmi elles, 21 ont utilisé des données post-mortem (rapportant un total de 373 cas). Le reste des études a utilisé des biospies réalisées en per-opératoire (rapportant un total de 730 cas). La majorité des études s'est focalisée sur la phase hyper-aigüe de l'HIC puisque seulement 14 études ont étudié les changements inflammatoires au-delà des 3 premiers jours. Ce qui est surprenant puisque, d'après les quelques données dont nous disposons, le pic de l'OPH est atteint chez l'Homme bien au-delà du troisième jour [START_REF] Venkatasubramanian | Natural History of Perihematomal Edema after Intracerebral Hemorrhage Measured by Serial Magnetic Resonance Imaging[END_REF][START_REF] Wu | Natural History of Perihematomal Edema and Impact on Outcome After Intracerebral Hemorrhage[END_REF]. Enfin, seulement 2 études ont eu recours à des méthodes permettant une analyse génétique des tissus regroupant 14 cas (Rosell et al. 2011;Carmichael et al. 2008). Les auteurs concluent que « les analyses transcriptomiques sur tissu humain sont une priorité pour identifier des cibles thérapeutiques pertinentes ».

D'autre travaux post-mortem sont donc nécessaires pour mieux comprendre la cinétique des événements s'opérant dans le tissu cérébral chez l'Homme après une HIC.

OBJECTIFS DE LA THESE

Ce travail de thèse est centré sur l'étude de l'OPH. Nos objectifs étaient de mieux comprendre son histoire naturelle, sa physiopathologie et son implication sur le pronostic fonctionnel après une hémorragie cérébrale.

Pour cela, nous avons utilisé un modèle animal d'HIC et des données post-mortem sur tissu humain.

Les méthodes et résultats de ce travail sont présentés en deux parties. La première partie rapporte les données issues du modèle animal. La deuxième partie rapporte les données issues de l'étude post-mortem.

PARTIE I MODELE EXPERIMENTAL Introduction à la partie expérimentale

Nos travaux de recherche expérimentale sont nés d'un constat simple : aucune thérapie ciblée de l'HIC et de l'OPH efficace en pré-clinique n'a démontré son efficacité chez l'Homme.

Nous avons relevé deux principales explications à cet échec :

Status: in preparation Introduction

Intracerebral haemorrhage (ICH) is associated with a dramatic prognosis and remains devoid of specific treatment. Therefore, understanding the mechanisms of ICH pathology and repair is a matter of high priority. 1 Patients who survive the initial injury experience further damage to the brain parenchyma surrounding the site of blood entry, for the ensuing days to weeks. This perihematomal area (PHA) represents a promising surrogate marker of secondary brain injury after ICH and of potential therapeutic intervention. 2 However, to date, observational clinical studies did not validate PHA as a reliable marker for prognosis after ICH. 3 This emphasizes the complexity of PHA and justifies further experimental investigation. In preclinical ICH models, PHA represents the common endpoint of several pathophysiological pathways induced by ICH.

The large majority of these experimental studies uses ex vivo methods to investigate changes in PHA, hampering the monitoring of PHA over time in the same subject and correlation with behavioral assessment. This results in misleading interpretations when comes the time to assess treatment effect. Advances in magnetic resonance imaging (MRI) allow the in vivo study of PHA from animal models to humans. To date, few preclinical studies used MRI to quantify PHA volume and current methods are based on manual segmentation, with inherent bias. 4-15 Beyond quantification, multimodal MRI offers a unique opportunity to assess the nature of changes that occur within the PHA over time, but this approach has rarely been used in the preclinical ICH literature. 13,16-25 Because elucidating pathogenic mechanisms and testing potential therapies are the focus of current preclinical ICH research, it appears important to test clinically relevant MRI parameters to assess the evolution of ICH-induced brain damage and repair in the same subject.

In this study, we aimed at characterizing the changes in PHA status, with related-behavior impact in a rodent ICH model. Over a 7-day period, we used repeated multimodal MRI in healthy male and female ICH rats to characterize the early temporal evolution of PHA volume and components (water content, water mobility, microvascular water mobility, tissue perfusion and iron accumulation). We also investigated the correlation between these MRI features and both histological changes and neurologic deficits.

Methods

Ethical aspects

All experiments were approved by the national Ethical Committee in Animal Experimentation Experiments were reported in accordance with the ARRIVE guidelines for reporting experiments involving animals.

Animals and Study design

We used 12-weeks-old Wistar rats and included both males (280 to 350g) and females (220 to 300 g) to adhere to the standards of good practice in experimental research. We prospectively studied 230 animals: 156 in the ICH group (sex ratio 1:1) and 74 in the sham group (sex ratio 1:1). After surgery, rats were prospectively followed-up for seven days at three time-points: day 0 (D0 = 4±2 hours post ICH), day 3 (D3) and day 7 (D7). Repeated behavioral and MRI measurements were achieved for each rat at each timepoint. A quarter of the animals was euthanized for histological purposes at the end of each time point.

Intracerebral haemorrhage induction: the double injection autologous blood model

Animals were anesthetized with isoflurane (1.5% to 2%) through spontaneous respiration and core temperature was maintained at 36°C to 37°C throughout all surgical procedures. A stereotaxic apparatus was used to position the tip of the needle (26 gauge) at coordinates 0.4 mm anterior, 3.2 mm lateral, and 5.8 mm deep relative to bregma through a 1-mm craniotomy.

ICH was produced by injection of 50 μL of fresh (non heparinized) autologous whole blood into the right striatum at a constant rate of 8 μL/min. After a 10-minute break, other 50 μL of blood were infused at the same rate for a total of 100 μL. The needle was left in place for 10 minutes after the infusion and was then withdrawn and the incision closed with sutures. 26 Rats were randomly assigned to the sham or ICH group. Sham operation was restricted to needle insertion.

In vivo Brain MRI

MRI Acquisition Parameters

All rats underwent a 7-Tesla micro-MRI (7-Tesla; BioSpec 70/ 20, Bruker, Ettlingen, Germany). Animals were anesthetized with isoflurane (1.5% to 2%) through spontaneous respiration and core temperature was maintained at 36°c to 37°c throughout all MRI procedures.

A cylindrical emitter antenna with an inner diameter of 72 mm and a receiving surface head coil both allow data recording. A birdcage radiofrequency coil and a surface coil were used for radiofrequency transmission and reception, respectively. A 3-plane scout imaging sequence was obtained at the start of each MRI session to reproducibly position the animal in the magnet.

The following sequences were performed at each time point (D0, D3, D7) and for each rat: (inversion time [TI] = 35,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100,1200,1300,1400 and 1600 ms, FOV = 4×4 cm, matrix = 108×96, 1 slice).

Anatomic

Image Processing and Analysis

Signal characteristics, hematoma volume and apparent diffusion coefficient (ADC) values were evaluated serially in the course of the study. At each time point and for each sequence, two areas were manually outlined to define regions of interest (ROIs): (1) periphery of the hematoma and (2) healthy contralateral striatal tissue.

ICH and PHA volume assessment ICH and PHA volumes were semi-automatically segmented using Mango © software (nom entreprise, ville/état, pays). In Mango © , prior to any segmentation procedures, all T2-axial images underwent brightness/contrast enhancement using a contrast control tool to increase image quality and enhance background separation as much as possible. Thresholding was then applied, the values were automatically set (using the auto-threshold tool) to include only regions having pixels with high intensity levels, that isolated ICH, PHA and normal parenchyma.

Ellipsoid region of interest (ROI) was then manually defined. Segmentations were independently performed by two experienced operators (L.P and F.A) with excellent interobserver agreement (r=0.92 and 0.82 for ICH and PHA volumes respectively). To ensure that all rats in the ICH group had a significant lesion, we excluded rats with initial ICH volume < 10 mm 3 .

Multimodal PHA characterization

Beyond volumetric analysis, we aimed to investigate the nature of PHA using different sequences. All the parametric maps reconstructions and manual ROIs delineation detail below were performed with ParaVision5.1® (PV5.1) software (Bruker, Biospin, Germany).

ROIs representing the PHA were first segmented from axial T2 sequence and were then coregistered onto the other MRI sequences to ensure that the estimates were taken from the same area with some manual adjustment if needed.

As the absolute values differ in each experimental setup, relative values were calculated for each MRI parameter. To do so, a ratio (r) was calculated between the value of the lesion side (ROI 1) and the healthy side of a corresponding mirror ROI (ROI2). For instance, the ratio (rADC) between the ADC value of the lesion side and the healthy side of a corresponding mirror ROI was calculated as rADC = ADC roi1 / ADC roi2 ).

We investigated five components of the PHA:

Calculation of T2 and T2*: water density and iron accumulation

The T2 relaxation times were calculated by fitting the T2 signal decrease with a monoexponential function. The equation used was as follows:

𝑆(𝑇𝐸) = 𝑆 0 × 𝑒^(-𝑇𝐸/𝑇2)
Where So is the proton density and TE is the echo time. TE is expressed in milliseconds (ms)

Relaxation rates (R2 and R2*) were expressed in Hz and calculated as follow:

𝑅2 𝑜𝑟 𝑅 2 * = 1000 𝑇2 𝑜𝑟 𝑇2 *
We quantified "water density" using R2: rR2 values > 1.1 and < 0.9 indicated an increase and decrease of water density. 27 We quantified iron accumulation using R2*: rR2* > 1 indicated an iron accumulation. 28,29

Calculation of the Apparent Diffusion Coefficient (ADC): parenchymal water mobility

We used ADC values (mm2/s) from diffusion weighted imaging (DWI) sequence to investigate the water mobility in the brain parenchyma. ADC coefficient were calculated by fitting diffusion signal on monoexponential curve. The exponential function used was the following:

𝑆(𝑏) = 𝑆 0 × 𝑒^(-𝑏/𝐴𝐷𝐶)
Where S0 is the signal measured when b = 0, b is the so-called "b factor" S0 is the signal measured when b = 0.

Vasogenic and cytotoxic edema were defined as rADC >1.1 and < 0.9 respectively. Based on our preliminary analysis and previous clinical studies, 30 we hypothesized that both cytogenic and vasogenic oedema can occur concomitantly within the PHA. Hence, we used voxel-based approach rather than the absolute values of the ROI. To do so, we used the Paravision 5.1 software to estimate the number of voxels within ROIs and their respective grey level intensity and build a histogram to represent the distribution of grey level. The 95%IC distribution of voxel within the contralateral ROI was consider as the reference. We stratified voxel within PHA into three categories based on grey level distribution: voxels with ADC < 2.5th and > 97.5th percentile of contralateral voxels indicated hypoADC and hyperADC values, whilst voxels within the 95%IC range were considered normal. The percentage of each category was then calculated.

Calculation of the pseudo-diffusion coefficient (D*): microvascular fluid mobility

We used the DWI sequence to assess variations of water mobility in the microvascular compartment within the PHA. At low b values between 0 and 100 s/mm2, the constraints of water molecules in the microvascular compartment can be evaluated quantitatively by calculating the pseudo-diffusive component D*. 31 The D* value was obtained from a biexponential equation according to Le Bihan et al. 32 corrected and solved on GraphPad Prism (version 7.00 for Mac, GraphPad Software, La Jolla, CA, USA), as follows:

𝑆 𝑆0 = (1 -𝑓). 𝑒 -𝐴𝐷𝐶.𝑏 + 𝑓. 𝑒 -(𝐴𝐷𝐶×𝐷 * ).𝑏 . 𝑒 -( 𝑇𝐸 𝑇2𝑟 )
In this formula, b is the diffusion coefficient, S is the signal measured for a value of b, S0 is the signal measured when b = 0, f is the fraction of the circulating blood volume fixed between 0 and 0.05%, and ADC is the apparent diffusion coefficient. TE is the echo time (21.50 ms), and

T2r the relaxation of brain tissue without diffusion gradients (b = 0). Indeed, considering the edematous nature of PHA during ICH, relaxation times of brain tissue (T2) may have significant differences. We thus included a correction in the data analysis for low b values, the latter being sensitive to T2r. Relative D* (rD*) values > 1.1 accounted for an increased mobility of water molecules in the microvasculature referring to an increased microvascular patency or bloodbrain barrier leakage. 31 In contrast, relative D* values < 0.9 accounted for a decreased mobility of water molecules in microvessels, referring to a decreased microvascular patency.

Calculation of the Cerebral Blood Flow (CBF): brain tissue blood perfusion

The CBF was assessed using the Flow-sensitive Alternating Inversion-Recovery Pulsed Arterial Spin Labelling (FAIR PASL) sequences. 33 ASL uses arterial blood water as an endogenous tracer by inverting the magnetization of the blood using radiofrequency pulses.

After a delay (TI: Inversion Time) allowing to the labelled blood to flow into the brain tissue, "labelled" images are acquired. Separate "control" images are also acquired without prior labelling of arterial spins. The signal difference between "control" and "labelled" images provides a measure of labelled blood from arteries delivered to the tissue by perfusion. CBF calculation was performed using the following formula:

𝐶𝐵𝐹 = λ × 𝑇1 "𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙" 𝑖𝑚𝑎𝑔𝑒𝑠 𝑇1 𝑏𝑙𝑜𝑜𝑑 × ( 1 𝑇1 "𝑙𝑎𝑏𝑒𝑙𝑒𝑑" 𝑖𝑚𝑎𝑔𝑒𝑠 - 1 𝑇1 "𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙" 𝑖𝑚𝑎𝑔𝑒𝑠 )
Where λ is the blood-brain partition coefficient. In our experiences T1blood and λ are equal respectively to 2400 ms and 0,9 mL/g. The unit of CBF is mL/100 g/min. Relative rCBF > 1.1 and < 0.9 indicated a hyper and hypo-perfusion. We hypothesized that both hypo-and hyperperfusion can occur concomitantly within the PHA. Hence, we used voxel-based approach with the same method described for ADC values.

Neurobehavioral Testing

Spontaneous locomotion

Spontaneous locomotor activity was measured using an infrared actimeter (Panlab, Bioseb, Vitrolles, France). The apparatus consisted of a square arena (45 cm in length, 45 cm in width and 35 cm in height) with a black polymethyl methacrylate floor and transparent 34-cm-high polymethyl methacrylate walls. Rats were placed in the center of the arena and allowed to explore freely for 10 min. Activity was recorded by two rows of infrared photocell sensors and processed with Actitrack software (Bioseb). The total distance covered (in cm), the number of rearings (n), the maximum speed recorded (Smax, in cm/second) and the duration of inactivity (resting time, in seconds) were collected at each time-point.

Histopathological correlates: tissue characterisation, neuroinflammation and microvascular changes.

At the end of the protocol, rats were euthanized with an overdose of pentobarbital (200 mg/kg, intraperitoneal). For tissue staining, rats were transcardially perfused with heparinized physiologic saline for 5 min and decapitated. Subsequently, brains were isolated and fixed in methacarn solution (60% methanol-30% chloroform-10% acetic acid) at 4 °C for 1 day, then in 70% ethanol at 4 °C for 1 day, followed by paraffin embedding. Brains were serially sliced at 5μm thickness. All stainings and immunolabellings were performed on serial-sections of 5µm each. Sections of formalin-fixed paraffin embedded tissue were stained routinely with hematoxylin-eosin (H&E) for the identification of ICH and structural analysis of the tissue.

Perls' staining was done to screen for iron deposits using Tissue-Tek Prisma Plus automated Stainer (Sakura). Slides were placed in Potassium Ferricyanide solution (2% Potassium

Ferricyanide -25ml and 2% Hydrochloric acid -25ml) for 20 minutes, and then counterstained in Nuclear fast Red for 5 minutes, rinsed in distilled water, dehydrated and mounted. We used Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and ionized calcium-binding adapter molecule 1 (Iba1) immunolabelling to identify neuroinflammatory cells (active astrocytes and microglia respectively) within the PHA. These markers were immunolabelled using a VENTANA BenchMark GX immunohistochemistry automated staining machine (Roche). The primary antibody was a rabbit polyclonal IgG (Ventana-Roche). We used the i-View DAB detection kit® (Ventana Medicals System, Roche Group) as an indirect biotin streptavidin system for the detection of the primary IgG antibody. Tissue sections were counterstained using bluing reagent solution (Ventana-Roche). The presence of GFAP was assessed by (EP672Y) rabbit monoclonal primary antibody from (Roche). The presence of Iba1 was assessed by a rabbit antimouse IgG antibody (1:500, Wako Chemicals USA, Richmond, VA, USA). Nucleated cells were stained green using a Methyl Green solution (H-3402, Vector Laboratories). For each immunostaining, a tissue section was processed identically except that the primary antibody was omitted as a specificity control and revealed no signal. A brightfield slide scanner (Zeiss Axioscan Z1) digitised the whole tissue section at 20-fold magnification after staining.

Immunolabelled sections were independently analysed by two experienced operators (L.P and V.B). A staining surface ratio ([stacking surface/whole section surface]*10 3 ) was calculated with a semi-automated method using ImageJ software in order to quantify the positively stained or labelled surface in the PHA.

The fluorescence-based visualization of brain microvascular patency as well as BBB integrity was enabled by the observation of both distribution and extravasation of fluorescein isothiocyanate (FITC)-Dextran (2000 kDa, 10 mg.mL-1, Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France) through patent microvessels. A 500 μL volume of FITC-Dextran in physiologic saline solution was injected into the caudal vein of rats. After 2 min, rats were decapitated. Brains were extracted, frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C until use.

Thirty micrometer-slices were coronally cut using a cryostat (Leika), and mounted with Vectashield hardset medium with DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). The resulting slides were scanned in three dimensions using a slide scanner (Zeiss Axio Scan.Z1, Gena, Germany), and post-processed using a 3D data projection method that projects the voxels of maximum intensity of the different slices into a viewing plane (Maximum Intensity Projection).

Statistical Analysis

Distribution of the data was established using the Kolmogorov-Smirnov test. All data are presented as mean ± SD or median [IQR]. Statistical differences in data with normal distribution were analyzed with Student test, others with Mann-Whitney U test. First, we used linear regression model to assess time-effect on each MRI parameters. We estimated the Pearson coefficients to test correlations between the different MRI parameters. We used logtransformation to ease the correlation between MRI parameters and immunolabelling values.

To assess markers associated with PHA progression between D0 and D3, we define a specific variable as follows: PHA = PHA volume D3-PHA volume D0. We used different multivariate linear regression models (adjusted for sex) to test the relation between PHA progression and other MRI features and to assess the relation between radiological features and locomotor performances with adjustment for sex. All statistical tests were 2-sided and a p-value of ≤0.05 was considered as statistically significant.

Results:

Among the 156 ICH animals, 8 died before the first MRI and 19 had a baseline ICH volume < 10 mm 3 . Therefore, 74 shams and 129 ICH animals were included in the study.

Temporal assessment of ICH and PHA volumes

The natural history of ICH and PHA volume are reported in Figure 1. In the ICH group, D0 hematoma mean volume was 22.28 ± 9.4 mm 3 (Figure 1A). The volume of ICH was similar between D0 and D3 and decreased significantly at D7 (13.10 ± 6.2 mm 3 , p< 0.0001 with D0 as reference). This corresponded to a 40% reduction of the ICH volume. In the ICH group, D0

PHA mean volume was 22.92 ± 7.8 mm 3 (Figure 1A). We observed the PHA volume peak at

Spontaneous locomotor performances

Figure 2 shows the spontaneous locomotion of animals between day 0 and day 7. At day 0, ICH rats showed severe impairment affecting all the parameters of spontaneous locomotion: distance travelled (ICH group vs sham group, p-value: 989±376 vs 2946±255 cm, p<0.0001), number of rearing (3[1-8] vs 56 , p<0.0001), maximum speed recorded (24 ±7 vs 36±5 cm/s, p<0.0001) and resting time (432±81 vs 262±88 sec, p< 0.0001). At day 3, we observed a partial recovery in the ICH group that did not reach yet the sham's performances on three out of the four studied parameters: distance travelled (2875±246 vs 3538±176 cm, p= 0.001), number of rearing (31[17-55] vs 64 , p<0.0001) and maximum speed recorded (33 ±6 vs 38±5 cm/s, p<0.0001). At day 7, ICH rats showed complete recovery of locomotor function (all p-value > 0.1 vs. sham). In multivariate regression model adjusted for sex, spontaneous locomotor performances were associated with the peak of PHA volume at D3 (p< 0.05 for each parameter, see Table 1 for statistic details).

Contribution of multimodal MRI to characterize the PHA

Water content: rR2 was maximal at D0 (1.47 ± 0.24), remained high but slightly decreased at D3 (1.34 ± 0.18) and significantly decreased at D7 (0.86 ± 0.07; p< 0.0001 with D3 as reference) (Figure 3A). At D3, PHA was mostly vasogenic (77% of voxels) (Figure 4B).

Iron

Microvascular Water Mobility Assessment: rD* was 0.69 ± 0.23, 1.16 ± 0.14 (p< 0.0001 with D0 as reference) and 1.11 ± 0.12 at D0, D3 and D7 respectively (Figure 4A). showed that PHA at D0 was mainly hypoperfused (40% and 3% of hypo and hyper-perfused voxels). We then observed at D3 and D7 a normalisation of CBF within the PHA (>80% of voxels in normal values, with contralateral striatum as reference), even if some animals had a hyperperfused zone within their PHA at D3 (Figure 4B).

Whatever the sequences, we did not find substantial changes in relative values in the sham group over time.

Relevant correlation between MRI features and predictors of PHA growth

We

Histopathological correlates

Tissue characterisation with H&E and MSB stainings confirmed the presence of blood within the right striatum of ICH rats. The PHA was characterized by tissue pallor, that was maximal at D3. At D0, we did not observe any activated astrocytes (positive for GFAP) nor microglia (positive for Iba-1) within the PHA (all p=ns vs. sham, Figure 3B). The expression of GFAP and Iba1 slightly increased from D3 (all p< 0.01 vs. D0 as reference, Figure 3B) and reached the peak at D7 (all p< 0.0001 vs. D0 as reference, Figure 3B). Perls' staining (indicative of iron deposition) showed large numbers of iron-positive cells along the inner border of the haematoma from D3 but mostly at D7 (Figure 3B). The sham animals did not exhibit significant astrocytes nor microglia activation.

The expression level of GFAP and IBA1 were negatively correlated with rR2 values (r= -0.95 and -0.83, all p-value < 0.0001). The rR2* values were positively correlated with iron deposition from D3 to D7 (r= 0.82, p-value < 0.0001).

FITC-Dextran was used as a fluorescent tracer for assessing microvascular patency and integrity within the PHA (Figure 4D). At DO, we observed a dramatic decrease of the microvessel density compared to sham, indicating a drop in microvascular patency at this stage of ICH. In contrast, at D3, the tracer was kept in the lumen of tight capillaries, revealing the vascular segments, but diffused out of the leaky capillaries, which were then surrounded by a blurred signal alongside the vascular segments, resulting in an intense fluorescence signal. At D7, we observed a normalization of vascular integrity although some leaky capillaries were still sparsely found in the PHA.

Discussion

Our study based on longitudinal multimodal MR imaging and behavioral and histological correlates in a large cohort of healthy male and female rats offered novel insight on kinetics of natural perihaematomal injuries and repair following ICH.

We first observed that even if all rats exhibited an initial sizable ICH lesion and were severely injured, they had a spontaneous blood resorption (≈ 40% of the initial lesion) and a complete locomotion recovery at D7. This favorable natural evolution demonstrates that spontaneous clearance processes are triggered after ICH. All rats exhibited PHA changes as early as the first four hours, that peaked three days after ICH induction and almost disappeared at D7. Our volumetric measurements of PHA (peak at D3) are consistent with literature in the field that is mainly based on the dry/wet method that require the euthanasia of animals. 34 The peak of PHA volume was predictive for spontaneous locomotor performances at D3 without sex-effect in adjusted analysis.

Beyond volumetric data, we aimed to characterize the longitudinal changes that occur within the PHA using various MRI parameters. The PHA is usually termed "peri-haematomal edema" in the literature this term did not reflect the full extent of phenomena occurring within the PHA. 2,34 Based on our multimodal MRI and histological correlates, we found four distinct components, that contribute to the genesis of peri-ICH tissue injuries: ( 1 We observed that the rR2 value, indicative for water content, peaked as early as four hours after ICH. This early and massive water entry in the ICH surrounding tissue is mainly related to clot formation and extravasation of plasma proteins secondary to clot retraction. 35,36 All these parameters precipitate the early formation of vasogenic edema. We observed the peak of PHA volume at D3 while the excess in water content tended to decrease. This confirms that water content is not the only component of PHA injury. Interestingly, the rR2 value appeared to be negatively correlated to neuroinflammatory cells activation within the PHA over time: At D0, we observed a ≈ 50% (vs. sham) increase of water content without evidence for significant cellular infiltration. By contrast, at D7, we found a ≈ 20% (vs. sham) decrease of water content with a concurrent overexpression of both activated astrocytes and microglia. Haematoma resolution gradually occurs in the first few days after ICH and might contribute to the recovery of neurological function. Microglia and blood-derived macrophages participate in the clearance of apoptotic, dislocated, and damaged cells through phagocytosis. 37 These results suggest that, beyond water content assessment, rR2 might be a reliable in vivo marker of inflammatory cellular activation and infiltration in brain tissue after ICH.

We then assessed water mobility and microvascular changes over time. The mean rADC value at D0 was neither obviously increased nor decreased. Our voxel-based analysis approach showed that both cytotoxic and vasogenic ADC values co-exist within the PHA during the hyperacute phase of ICH. This emphasizes the heterogeneous nature of PHA and decrease the value of overall mean ADC values that is usually used in the current literature. Histological examination confirms the presence of swelling cells, the hallmark of cytotoxic process. The role of this cytotoxic edema in the acute phase after ICH remains unclear in humans 38-40 and whether ischemia occurs in ICH pathophysiology has been a matter of some controversy. 41 Our findings suggested the presence of early hypoperfusion (hypoCBF and cytotoxic ADC on voxel-based analysis) in the few hours following ICH induction. The low values of D* coefficient at D0 indicated that this hypoperfusion occurs at the microvessel level. We suggest that this reversible hypoperfusion is related to the mass effect of clot formation collapsing the microvessels in the vicinity of ICH. Those findings were supported by FITC-Dextran examination that showed a reduced detection of the flurorescent signal in microvessels, evidencing a drop in the patency of the latter. Importantly, longitudinal assessment showed a critical signal inversion of both rADC (almost 80% of voxel in vasogenic values), rCBF and rD* values at D3 with concurrent blood-brain barrier leakage observed on FITC sections. This confirms that the observed hypoperfusion at D0 does not reach the threshold of ischemia and is reversible. 42,43 This also confims that the disruption of the blood-brain barrier occurs after ICH and contributes to PHA formation. Our histologic data showed that microglia and astrocytes activation started at D3 when the ADC signal reached its peak. This suggested that suggested that the high ADC signal observed at edema edge (D3) is related to blood brain barrier disruption and activation of an exacerbated inflammatory process.

Clot-derived factors, including haemoglobin and iron, have been implicated in having a major role in secondary injury. We used R2* map to quantify iron concentration which is a well-admitted robust method. 44 The massive entry of fresh blood was responsible for a diffuse blooming effect that artificially increased the rR2* value within the PHA at D0. One can not rule out that this increase was related to the spread of red blood cells. We did not find any iron deposits at D0. From D3 to D7, we found a strong correlation between rR2* values and histological peri-haematomal iron concentrations.

Most of current experimental studies investigate the PHA with methods that require animal euthanasia and so exclude follow-up behavioral or tissular injuries measurements in the same subject. Ongoing research in ICH and the prospects of therapy have raised the need for a noninvasive method to investigate ICH in rodent models. Whatever the sequence studied, we found throughout our results low standard deviations. The consistent patterns of changes in these parameters and their correlation with terminal histological measures and behaviour promote the use of in vivo markers in experimental models. Longitudinal studies using advanced MRI methods for assessing microvessel injury, BBB disruption, neuroinflammation or iron deposits as presented in this study could be essential for assessing the efficacy of treatments targeting these parameters. Monitoring these in vivo parameters after ICH may be useful for evaluating potential experimental therapies with longitudinal design. Importantly, all the MRI sequences described in this study are already used in human which facilitate the translational pipeline.

Our study has some limits. Although the experimental ICH model used in these studies may not exactly mimic the clinical presentation of ICH, given it does not reproduce the vessel rupture.

Indeed, the primary damage observed might have been under-estimated, but allowed the secondary damage to be observed without extended contribution of the primary damage. It thus provides a reproducible tool for tracking and characterizing ICH-induced tissue changes that may be useful for testing potential therapeutic interventions targeting secondary injury.

Our study has also strengths including the longitudinal design, the large sample size, the inclusion of both male and female rats. To minimize measurement bias and subjectivity of scales, we used fully automated method to assess spontaneous locomotion. Our MRI multimodal approach was strengthened by the use of semi-automated method for volume segmentation and the use voxel-based approach to better reflect the true nature of PHA. Finally, we included both males and females, so our design was consistent with the 'Sex and Gender Equity in Research' guidelines. 45

Conclusion:

Introduction

Spontaneous intracerebral hemorrhage (ICH) is among the most severe forms of stroke, accounting for almost half of stroke-related morbidity and mortality (Poon et al., 2014). Despite a slight improvement in inhospital mortality, disability among ICH survivors remains significant, including one third of them with new onset dementia in the ensuing years (Moulin et al., 2016). Recent data offered a better characterization of cognitive impairment (CI) that affected several cognitive domains, such as language, memory, executive functions, processing speed and and visuo-spatial abilities (Donnellan and Werring, 2020). Understanding the underlying mechanism of ICH-related CI is the next step to improve the prevention and treatment of long-term ICH complications. In clinical setting, disentangling the sole effect of bleeding from the coexisting presence neurodegenerative and/or small vessel diseases (such as cerebral amyloid angiopathy) is impossible (Donnellan and Werring, 2020;Pasi et al., 2021).

Experimental ICH models may therefore be useful but few data on long-term cognition are currently available in the literature (Hietamies et al., 2018).

We aimed to investigate the long-term hippocampal and non hippocampal cognitive effect of ICH in healthy male and female rats, devoided of underlying cerebrovascular disease. To deepen our understanding of ICH-related CI, we concurrently studied the long-term structural (7T-MRI and automated brain atrophy segmentation) and functional ([18F] FDG PET) changes that occur in the rat brain.

Methods

Ethical aspects

All experiments were approved by the national Ethical Committee in Animal Experimentation Experiments were reported in accordance with the ARRIVE guidelines for reporting experiments involving animals.

Animals and study design

We used 12-week-old Wistar rats and included both males (280 g to 350 g) and females (220 g to 300 g). We prospectively studied 114 male and female rats: 74 in the ICH group (sex ratio 1:1) and 40 in the sham group (sex ratio 1:1). After surgery, each rat underwent short-term (day 0, 3 and 7) and long-term (3 and 6 months) behavioral and radiological assessments. Details of the study design are reported in Figure 1.

Intracerebral haemorrhage induction

Animals were anesthetized with isoflurane (1.5% to 2%) through spontaneous respiration and core temperature was maintained at 36°c to 37°c throughout all surgical procedures. A stereotaxic apparatus was used to position the tip of the needle (26 gauge) at coordinates 0.4 mm anterior, 3.2 mm lateral, and 5.8 mm deep relative to bregma through a 1-mm craniotomy.

ICH was produced by injection of 50 μL of fresh (nonheparinized) autologous whole blood into the right striatum at a constant rate of 8 μL/min. After a 10-minute break, other 50 μL of blood were infused at the same rate for a total of 100 μL. The needle was left in place for 10 minutes after the infusion and was then withdrawn and the incision closed with sutures. Rats were randomly assigned to the sham or ICH group. Sham operation was restricted to needle insertion.

Behavioral Testing

Spontaneous locomotion

Spontaneous locomotor activity was measured using an infrared actimeter (Panlab, Bioseb, Vitrolles, France). The apparatus consisted of a square arena (45 cm in length, 45 cm in width and 35 cm in height) with a black polymethyl methacrylate floor and transparent 34-cm-high polymethyl methacrylate walls. Rats were placed in the center of the arena and allowed to explore freely for 10 min. Activity was recorded by two rows of infrared photocell sensors and processed with Actitrack software (Bioseb). The total distance covered (in cm), the duration of inactivity (resting time, in seconds) and the number of rearings were collected.

Anxiety-like behavior

To check whether ICH did not cause alterations in anxiety like behevior, animals were tested using a modified version of the elevated plus maze [START_REF] Pellow | Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat[END_REF]. The apparatus

Working memory

The spontaneous alternation test was performed using a Y-maze (made of black wood) and a closed-circuit video camera (Ethovision XT, Noldus, Wageningen, The Netherlands). The three arms were of the same size (50*15*32 cm) and were oriented at an angle of 120° to each other.

The Y-maze was placed in a room with no environmental cues. The rat was placed at the end of one arm and was allowed to move freely between the maze's three arms for 8 min. A visit to an arm was scored when all four of the rat's paws were within the arm area. The sequence of the arm visits was recorded, and an alternation response was scored when the animal entered the least recently visited arm. The alternation score was calculated as the ratio between actual alternations and possible alternations (defined as the total number of arm visits minus 2), multiplied by 100. This calculation was only performed for rats making more than fifteen arm visits [START_REF] Hidaka | Effects of repeated electroconvulsive seizures on spontaneous alternation behavior and locomotor activity in rats[END_REF].

In Vivo brain MRI

Image Acquisition

All rats underwent a 7-Tesla micro-MRI (7-Tesla; BioSpec 70/ 20, Bruker, Ettlingen, Germany) at day 0, day 3, day 7 and 3 months after ICH induction. Animals were anesthetized with isoflurane (1.5% to 2%) through spontaneous respiration and core temperature was maintained at 36°C to 37°C throughout all surgical and MRI procedures. A cylindrical emitter antenna with a diameter of 72 mm and a cerebral receiving surface antenna both allow data recording. A birdcage radiofrequency coil and a surface coil were used for radiofrequency transmission and reception, respectively. Ear bars and a nose cone, through which the anesthetic gas mixture was supplied, were used to minimize head movement during MRI measurements. A 3-plane scout imaging sequence was obtained at the start of each MRI session to reproducibly position the animal in the magnet. For the current study, we used axial and coronal T2-weighted sequences

Image Processing and Analysis: initial ICH volume and cerebral atrophy assessment

We used MRI data obtained at day 0, day 3 and day 7 to quantify ICH volume. To do so, ICH was semi-automatically segmented using Mango © software. In Mango © , prior to any segmentation procedures, all T2-axial images underwent brightness/contrast enhancement using a contrast control tool to increase image quality and enhance background separation as much as possible. Thresholding was then applied, the values were automatically set (using the auto-threshold tool) to include only regions having pixels with high intensity levels, that isolated ICH, edema and normal parenchyma. Region of interest (ROI) was then manually defined. Segmentations were independently analyzed by two experienced operators (L.P and F.A) with excellent interobserver agreement (r=0.92). To ensure that all rats in the ICH group had a significant lesion, we excluded rats with initial ICH volume < 10 mm 3 .

To study striatal and cerebral atrophy at 3 months, we proceeded as follows. First, bias field inhomogeneity was corrected from T2-weighted images using N4 algorithm. (Tustison et al., 2010) Then, images were denoised with a multiresolution non-local means filter. [START_REF] Coupé | Adaptive multiresolution non-local means filter for three-dimensional magnetic resonance image denoising[END_REF] Brain mask and label segmentation were automatically extracted with ANTS (Advanced Normalization Tools package) and from Cermep atlas. [START_REF] Lancelot | A multi-atlas based method for automated anatomical rat brain MRI segmentation and extraction of PET activity[END_REF] All MRI were visually checked and manually corrected when appropriate by two experienced operators (L.P and C.L). We first checked that there was no difference between Sham and ICH in the analysis with Statistical Parametric Mapping (SPM) was performed using SPM12 (Welcome Department of Imaging Neuroscience, London, UK) and the SAMIT toolbox (Vállez Garcia et al., 2015). For each voxel, two-sample t-tests were performed to compare ICH vs sham animals.

The a-priori hypothesis was that the focal induction of ICH induces a diffuse reduction of cerebral metabolism (decreased cerebral [18F]FDG uptake) compared with the Sham group.

The images generated by this post-treatment are statistical T-maps. They show the significant differences (expressed as T-values) between the two groups (ICH vs sham) for each voxel registered onto a MRI rat brain template (Cermep). T-map data were thresholded at p<0.05

(uncorrected) and an extent threshold of 200 voxels. Clusters with p<0.05 corrected for familywise error (FWE) were considered significant.

Histopathological correlates

At the end of the protocol (i.e. 3 months or 6 months for the sub-group with extended followup), rats were euthanized with an overdose of pentobarbital (200 mg/kg, intraperitoneal). For tissue staining procedure, rats were transcardially perfused with heparinized physiologic saline for 5 min and decapitated. Subsequently, brains were isolated and fixed in methacarn solution (60% methanol-30% chloroform-10% acetic acid) at 4 °C for 1 day, then in 70% ethanol at 4

°C for 1-3 days, followed by paraffin embedding. Brains were serially sliced at 5 μm thickness.

Sections of formalin-fixed paraffin embedded tissue were stained routinely with hematoxylineosin (H&E) for the identification of ICH and structural analysis of the tissue. Perls' staining was done to screen for iron deposits using Tissue-Tek Prisma Plus automated Stainer (Sakura).

Slides were placed in Potassium Ferricyanide solution (2% Potassium Ferricyanide -25ml and 2% Hydrochloric acid -25ml) for 20 minutes, and then counterstained in Nuclear fast Red for 5 minutes, rinsed in distilled water, dehydrated and mounted.

Statistical analysis

Distribution of the data was established using the Kolmogorov-Smirnov test. All data are presented as mean ± SD or median [IQR] as appropriate. Statistical differences in data with normal distribution were analyzed with Student test, others with Mann-Whitney U test. First, statistical analyses were performed on total population (ICH versus sham) and then in sexsubgroup. All statistical tests were 2-sided and a p-value of <0.05 was considered as statistically significant.

Results

ICH characteristics and locomotor function at the acute phase

Among the 114 ICH animals, 3 died before the first MRI and 7 had a baseline ICH volume < 10 mm 3 . Therefore, 104 animals (53 males, 64 ICH) were included in the study. In the ICH group, initial mean hematoma volume was 23.35 ± 9.50 mm 3 (Figure 1A). We did not find significant differences between males and females (24.03 ± 9.82 mm 3 versus 22.60 ± 9.23 mm 3 respectively, p= 0.43) (Figure 2A). The ICH volumes were similar at day 0 and day 3 and decreased significantly at day 7 (13.91 ± 0.9 mm 3 , p< 0.0001 with day 0 as reference). The same temporal course was found for both males and females (Figure 2B). Figure 3 shows the spontaneous locomotion of animals (total population and sex-subgroups) between day 0 and day 7. At day 0, ICH rats showed severe locomotor impairment with a significant decrease in the traveled distance (ICH group vs sham group, p-value: 961±69 vs 3168±156 cm, p<0.0001), a lower number of rearings ( 6

ICH induces long-term cognitive impairment

None of the included animals died between ICH induction and the follow-up assessments. At three months, ICH rats had similar spontaneous locomotor performances compared to the Sham rats (ICH group vs sham group, difference between means, p-value; distance traveled: 3646±155 vs 3393±146 cm, 253±228, p= 0.27 / number of rearings: 76.9±3.7 vs 68.4±3.9,

ICH induces long-term structural and metabolic alterations

The ICH group showed a severe ipsilateral atrophy as compared to the sham group (mean index ratio 0.66±0.05 and 0.97±0.02 for ICH and sham group respectively, p < 0.001) (Figure 6A).

Striatal atrophy was observed in both males and females without sex effect (p<0.001).

Histological examination of ICH rats confirmed the severe atrophy of the ipsilateral striatum characterized by a loss of alveolar architecture of the tissue. Perl's staining showed the presence of numerous iron deposits in and around the ICH site (Figure 6C-E).

Brain labels extracted from Cermep atlas showed that atrophy was not restricted to the striatum (Figure 6F). Limbic system structures (hippocampus and amygdala) and cortical areas (temporal, occipital and parietal) were atrophied. In males, atrophy was observed in areas involved in the limbic system ipsilateral amygdala (mean index ratio 0.94±0.02 and 1.00±0.04

for ICH and sham group respectively), hippocampus (mean index ratio 0.96±0.03 and 1.01±0.03 for ICH and sham group respectively) and temporal lobe (mean index ratio 1.05±0.02 and 1.12±0.02 for ICH and sham group respectively), all p-value < 0.05 compared to sham animals (a trend was observed in the frontal lobe: p=0.07). In females, atrophy was observed in temporal (mean index ratio 1.05±0.04 and 1.13 ±0.04 for ICH and sham group respectively), occipital (mean index ratio 0.95±0.03 and 1.00±0.02 for ICH and sham group respectively) and cingulate lobes (mean index ratio 1.08±0.03 and 1.13±0.04 for ICH and sham group respectively), all p-value < 0.05 compared to shams. Regarding the brain metabolic assessment (Figure 7), ICH (males and females) group exhibited a severe decrease in glucose uptake at the ipsilateral striatum compared to the sham group. In the ICH group, the voxel-based analysis also showed that the hypometabolism was not restricted to striatum. Hypometabolism was also observed in adjacent deep basal ganglia (ipsilateral thalamus, hypothalamus, caudate and putamen) as well as ipsilateral parietal, frontal and temporal lobes. Furthermore, in sex subgroup analysis, male ICH rats exhibited a decrease in glucose uptake in the hippocampus whilst ICH females exhibited a hypometabolism in the ispilateral amygdala (see Figure 7 for statistical details).

Discussion

In a large cohort of healthy male and female ICH rats, we show for the first time that: (i) ICH induces long-term cognitive impairment; (ii) a focal striatal lesion induces a long-term diffuse alteration of the brain structure/function network involving the limbic system and cortical areas, and (iii) behavioral and radiological trajectories were similar between males and females despite some sex specificities.

We report for the first time the presence of long-term CI after ICH in rats, including both hippocampal and non-hippocampal aspects of cognition. This point contrasted with both spontaneous early locomotor recovery and significant spontaneous blood resorption (≈ 40% of the initial lesion) during the short-term period (from D0 to D7). Cognitive assessment was not confounded by motor impairment, nor anxiety. In sub-group analyses, we did not observe worsening of cognition between 3 and 6 months after ICH induction. This suggests that, in our model and experimental conditions, ICH itself was responsible for CI, rather than triggering a progressive decline. We aimed to study the specific effect of ICH on cognitive functions.

Therefore, we used healthy rats in the young adult stage, devoid of underlying brain parenchymal or small vessel diseases. Future works are needed to determine to what extent the inclusion of disease-relevant comorbidities and risk factors, such as hypertension and aging, can modify the cognitive trajectory after ICH.

To our knowledge, only two studies have assessed the cognitive functions after ICH in rats [START_REF] Hartman | Assessing functional outcomes following intracerebral hemorrhage in rats[END_REF][START_REF] Maclellan | Assessing cognitive function after intracerebral hemorrhage in rats[END_REF]. In the first one, cognitive tests on learning and memory, including spontaneous alternation, elevated plus maze, open-field, Morris water maze, T-maze and the radial arm maze, were cross sectionally conducted 1-7 months after ICH. [START_REF] Maclellan | Assessing cognitive function after intracerebral hemorrhage in rats[END_REF] In a cohort of 12 rats, no significant learning or memory deficits were observed after ICH. In the second study, investigators found significant learning deficits in a cohort of 17 rats at 2 weeks but not at 8 weeks [START_REF] Hartman | Assessing functional outcomes following intracerebral hemorrhage in rats[END_REF]. These results contrast with ours but some limitations hamper to draw solid conclusion, including the inclusion of males only, the small effective size (n=12 and 17 respectively), the small size of ICH lesions (18.24 ± 1.92 mm 3 and 4.02 ± 2.1 mm 3 ) and heterogeneity in outcome assessment methods.

This highlights the need to develop comprehensive and standardized method to assess cognition in experimental stroke models (Hietamies et al., 2018). Our data from brain atrophy and metabolism measurements contribute to deepen our understanding of the mechanisms involved in ICH-related CI: we found a diffuse alteration of both brain structure and function that went beyond the blood injection site. Focal ICH in the striatum induced a loss of one third of the structure volume, accompanied with severe hypometabolism. Histological examinations showed a loss of volume and architectural integrity of the striatum associated with an abundant sequestration of iron. One can hypothesize a direct involvement of iron neurotoxicity in CI [START_REF] Salvador | Iron and Mechanisms of Neurotoxicity[END_REF]. More strikingly, we found that structural and functional consequences of ICH spread beyond the striatum following a network organization: thalamus, the limbic system (amygdala and hippocampus) and cortical areas (especially the temporal, occipital and parietal lobes). These radiological findings are consistent with our behavioral assessments (impairment of working, spatial, hippocampal and, in a lesser extent, visual memory) but also with previous literature on striatum function and its interaction with other cerebral areas [START_REF] Rolls | Neurophysiology and cognitive functions of the striatum[END_REF][START_REF] Rektor | Cognitive potentials in the basal gangliafrontocortical circuits. An intracerebral recording study[END_REF][START_REF] Groenewegen | The ventral striatum as an interface between the limbic and motor systems[END_REF][START_REF] Provost | Neuroimaging studies of the striatum in cognition Part I: healthy individuals[END_REF]. Taken together, our data confirm that the role of striatum is not limited to motor functions but also plays an integrative role in cognitive processes through extensive connections with key structures involved in the cognitive process.

The design of our study allowed us to study the sex effect. The recent literature on ICH and more generally experimental models reports a sex bias given the under-representation of female animals (Zucker and Beery, 2010;Sugimoto et al., 2019). Even if male and female rats share common outcome trajectories, we observed some differences. First, female rats recovered faster than male rats regarding spontaneous locomotion within the first week following ICH induction. Second, only female rats had alteration of the visual recognition memories. Third, male and female rats share distinct pattern of structural and functional alterations. Indeed, beside the striatum, atrophy and hypometabolism were mostly found in limbic system structures in males and in cortical area in females. To what extent these differences could interfere with the effect of pharmacomodulation is unknown but should be taken into account in preclinical and clinical studies.

Our findings also raise concern regarding assessment of treatments efficacy in ICH models.

Indeed, most of stroke model focused on motor functions in the first month following brain injury in rodents (Hietamies et al., 2018). Given that animals showed an early spontaneous motor recovery, the assessment of a potential drug effect solely based on motor function is questionable and CI assessment should be required.

Our study has limitations. Despite a large panel of behavioral assessments, fine motor alterations (e.g. motor coordination, balance and muscle strength) may have been missed. We did not investigate some cognitive domains such as visuospatial memory, cognitive flexibility or learning. Our study has also strengths. We used a large sample size to ensure a reliable detection of long-term cognitive deficits. The volumes of the ICHs were large enough to mimic bleeding in humans. To minimize measurement bias and subjectivity of scales, we used fully automated method to assess spontaneous locomotion and cognition. We used semi-automated method for volume segmentation and to obtain brain mask atlas. We combined structural and functional data with MRI and 18FDG-TEP to further modelise the structure-function relationship of post-ICH cognitive performance. Finally, to assess sex effect, we included both males and females, so our design was consistent with the 'Sex and Gender Equity in Research'

guidelines (Heidari et al., 2016).

Conclusion

We showed that striatal ICH provokes long term cognitive impairment and distant cortical atrophy and hypometabolism in a young and disease-free rat brain. Our results emphasize the need to screen for long-term cognitive performance in ICH rodent model.

Introduction à l'étude post-mortem

En parallèle de nos travaux sur le modèle animal, nous avons mené une étude post-mortem de

Status: Under review

Introduction

Spontaneous intracerebral hemorrhage (ICH) is a devastating cause of mortality and morbidity devoid of specific treatment. 1 To develop efficient therapeutic strategies for ICH, a deep understanding of its pathophysiology is warranted. The pathological process of ICH includes the primary brain damage resulting from immediate mass effect owing to hematoma formation, and the delayed secondary brain injury occurring in the peri-hematomal area (PHA). In the ensuing days after ICH, the lysis of erythrocytes leads to the release of free hemoglobin (Hb), a major component of these secondary damages. 2 Therefore, the expected benefit of blood evacuation is potentially high. Two therapeutic options to achieve this goal are currently under investigation: a mechanical strategy with minimally invasive surgery, 3 and a pharmacological one, aiming at enhancing the natural clearance of blood. 4,5 The second is of particular interest, but requires a better understanding of the blood clearance process that spontaneously occur in the brain of ICH patients.

One of the primary natural mechanisms protecting the tissue against the deleterious effects of free Hb is ruled by CD163, a monocyte-macrophage scavenger receptor expressed by many cells harboring a phagocytic function such as activated microglia or recruited macrophages. 6 CD163 acts as an endocytic receptor for hemoglobin-haptoglobin (Hb/Hp) complexes and is therefore involved in sequestering toxic hemolysis products. 7,8 After its incorporation, Hb is broken down into Fe2+, CO, and biliverdin via catalysis of heme oxygenase-1 (HO-1), 9 which also has anti-oxydant, anti-inflammatory and anti-apoptotic properties. 10 Therefore, the CD163/HO-1 pathway represents a basic line of defense against Hb neurotoxicity by facilitating its clearance. 11 If it contribution to hematoma clearance is well-established in experimental studies, 12-14 few human data are available. 15-18 In the current study, we investigated spatial and temporal expression of CD163/HO-1 pathway in human brain tissue from patients deceased of ICH. To do so, we performed both histological and transcriptomic analyses. The latter approach additionally brought an insight to a broader spectrum of potential mechanisms that mediate secondary injury and repair after ICH.

Spatial distribution of IBA1, CD163 and HO-1 expression

On visual examination of Iba1 immunolabelled sections, microglia was observed in all cases (n=19/19). Iba1 was mainly expressed within the PHA (Figure 1A), and to a lesser extent in the ipsilateral surrounding brain tissue (0.07 ± 0.007 and 0.04 ± 0.004 respectively; p< 0.0001 and p=0.028 vs. control area). Ramified (resting) microglial cells were seen in locations distant from the hematoma while amoeboid (reactive) microglia cells were observed from 24 h post-ICH at the hematoma border. The CD163 expression level was maximal within the PHA (0.12 ± 0.02, p<0.0001 vs. control area) but also significantly observed in ipsilateral surrounding brain tissue (0.05 ± 0.01, p=0.042 vs. control area) (Figure 1B). In these areas, CD163 positive cells were observed at the border of the ICH core and in perivascular spaces of small vessels within the PHA. There was a trend towards increased CD163 expression in the hematoma core (p=0.07 vs. control area). HO-1 expression was exclusively and differentially increased within the PHA (0.016 ± 0.004, p= 0.002 vs. control area) (Figure 1C). Iron deposits were mostly observed within PHA (0.014 ± 0.003, p= 0.0006 vs. control area) and, in a lesser extent, in the hematoma core (0.005 ± 0.001, p= 0.02 vs. control area) (Figure 1D).

Temporal distribution of reactive microglia, CD163/HO-1 expression and iron deposition within the PHA

Iba1 positive cells were observed in the PHA in the early 72 hours (0.038 [0.030-0.056]) with both ramified and ameboid profile. The Iba1 expression increased from day 3 (0.054 [0.028-0.086]) and peaked from day 7 to 15 (0.11 [0.07-0.15], p=0.028 with T1 as reference) with an exclusively ameboid profile. From day 15, we observed a slight decrease (0.07 [0.06-0.11]).

From 90 days, there was still a substantial expression of Iba1 (0.045 [0.037-0.062], p= 0.019 with control area as reference) (Figure 2A). We found CD163 positive cells in the early 72 hours (0.021 [0.014-0.028]) but the increase in the expression level was exponential from day 7 onwards (0.15 [0.13-0.21]). CD163 expression level reached a peak from day 15 to 90 (0.17 [0.14-0.24]). Beyond 90 days, the expression level of CD163 did not return to baseline levels (0.11 [0.07-0.13], p< 0.0001 with control area as reference) (Figure 2B). We did not find HO-1 positive cells before day 3, when the expression level slightly increased (0.009 [0.005-0.015]).

A surge in HO-1 expression was observed from day 7 (0.023 [0.018-0.036]) while the peak of HO-1 expression was observed from 15 to 90 days (0.030 [0.020-0.048]). Beyond 90 days, the expression level of HO-1 almost returned to baseline (0.005 [0.002-0.008]) (Figure 2C). We did not observe iron deposits before day 7, when they significantly appeared and increased gradually over time with a high gap from day 15 (Figure 2D). On visual examinations we observed a specific spatial organization of immunolabelled cells.

We reported in the Figures 3 to 7 the serial neuropathological observations for each immunolabelling and Perl's staining at the five different time-points.

Gene Expression Profile of Human Perihematomal Tissue

The principal component analysis results did not show any bias towards the conditions or the technique given the clear distinction between both regions of interest PHA and control area (Figure 8A). The number of significantly and differentially expressed genes (under-and overexpressed) with FoldChange variations > 1 for p-adjusted < 6.10 -4 was 13/770. HO-1 was the most differentially up-regulated gene (2.81 ± 0.39, adjusted p-value = 1.11x10 -10 ). Apart from HO-1, CD163 was the sixth overexpressed gene (1.49 ± 0.29, adjusted p-value = 1.68x10 -5 ).

Among the other up-regulated genes, we found TNFRSF1b, MMP14, PTX3, IFI30, LAIR1, SERPINE 1, SPP1 and SOCS3. Three genes were differentially down-regulated: OPALIN, SCL6A1 and GRIN2A (Figure 8B). The detailed statistics are provided in Table 2.

Discussion

Our study provides novel insights into the natural history of blood clearance after ICH in humans, with a predominant role of CD163/HO-1 pathway.

We first compared the stainings in different strategic areas (ICH core, PHA and ipsilateral surrounding brain tissue) and we observed that PHA concentrates most of the activated microglia, recruited monocytes and Hb-scavenging activities. This confirms that PHA is a key area for neuroinflammation and blood clearance after ICH. On visual examination, we observed amoeboid microglia within the PHA, reflecting increased phagocytic activity to clear the brain from toxic components. 22 In a more distant area (ISBT), we observed resting ramified microglia. 23 Basal CD163 expression was extremely low and restricted to perivascular macrophages in contralateral areas. This shows that microglial cells do not express CD163 under physiologic conditions, until free Hb is released in the tissue. 24 The abundant perivascular CD163 positive cells within the ISBT suggests that this area is a support for monocyte recruitment.

We then characterized the microglial and CD163/HO-1 activities over time within the PHA.

Interestingly, we observed a specific organization of phagocytic cells with distinct steps.

Microglia activation (as early as the first 24 hours), encircling of the lesion (from D3), amplification with macrophage recruitment (from D7), continuation and then, resorption. The phase of encircling the lesion suggests a crosstalk between microglia and recruited monocytes to limit the spread of neurotoxic compounds arising from Hb degradation. It also appears to be a critical step in blood clearance process given that we did not find any HO-1 positive cell before this circle formation. The D7-D15 time-window was critical for blood clearance process amplification. HO-1 became therefore much more abundant and was accompagnied by progressive iron accumulation, suggesting the generation of siderophages. Of note, Iba1 and CD163 expression levels remain high several months to years after ICH suggesting a chronic proinflammatory status that might be harmful for the brain tissue.

Since we observed a strategic time-window in blood clearance process, we proceeded to RNA extraction from PHA in patients who deceased around D7 to D15. This transcriptomic analysis confirmed the predominant expression of CD163/HO-1 pathway. To our knowledge, only four studies investigated specifically CD163 and HO-1 expression after ICH in human neuropathological samples. Most of these studies were based on per-operative biopsy and focused on early phase of the disease (< 72h after ICH onset). 15-18 In our study, we also observed CD163 and HO-1 from 24h and 72h respectively, but their expressions became much more abundant from day 7.

The evidence for CD163/HO-1 implication in ICH human tissue justifies experimental research efforts targeting this pathway. Treatments that enhance the phagocytic function of microglia/macrophages may be promising to reduce the toxicity of blood products. It's also noteworthy that soluble CD163 can be monitored in the plasma of patients to predict their clinical and radiological outcome after ICH. 25 One can hypothesize a future personal based medicine to identify which ICH patients are exposed to CD163/HO-1 overwhelming and may benefit from pharmacomodulation.

Beyond the genomic evidence for CD163/HO-1 overexpression, our transcriptomic analysis provided valuable informations on peri-hematomal tissues changes. PHA has been reported to suffer from edema, apoptosis, necrosis and inflammatory processes, enhancing the so-called "secondary tissue injuries". However, our secondary results also identified several of upregulated genes that exert a beneficial role aiming at terminating inflammation and enhance tissue repair. TNFRSF1b (Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B, also known as TNFR2) might regulate inflammation by promoting the expression of anti-inflammatory genes in microglia, 26 protect neurons by preventing apoptosis through antioxidative pathways 27 and repair the ICH-damaged tissue by contributing to remyelination. 28 Other genes play an important role in macrophage and microglia polarization by repressing the M1 proinflammatory phenotype: The LAIR1 gene encoding the leukocyte-associated immunoglobulinlike receptor 1 protein, SOCS3, a member of the suppressor of cytokine signaling family and the long pentraxin 3 (PTX3), a member of the pentraxin superfamily of prototypic humoral pattern recognition molecules. These genes coordinate the transition from an acute inflammatory phase to a phagocytic phase promoting hematoma resolution or tissue repair. 29- 31 Among these three genes, PTX3 is of particular interest. Its up-regulation is induced by thrombin supporting a role in ICH. 32 It also contributes to tissue remodeling and repair, through an interaction with fibrinogen/fibrin, collagen and plasminogen, a group of proteins present in the PHA. 33,34 The membrane-type 14 matrix metalloproteinase (MMP-14), expressed by microglia and recruited macrophages, can also act as a negative regulator of inflammation. 35 The IFI30 gene encodes the gamma-interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) enzyme and plays an important role in antigen processing by enhancing the major histocompatibility complex (MHC) class II-restricted presentation. 36 The Secreted Phosphoprotein 1(Spp1) gene, which encodes the osteopontin (OPN) protein. OPN acts as an immune modulator, regulating the expression of interferon-gamma and interleukin-1, and promotes cell survival by inhibiting apoptosis. 37 These gene over-expression suggest that a transition to an anti-inflammatory phase within the PHA provides a suitable microenvironment for the acquisition of Hb-scavenger properties by microglia and macrophages. This is important information for the therapeutic strategy targeting neuroinflammation that should ensure this transition from a pro-inflammatory to an anti-inflammatory status.

In line with previous work, 38 we found an up-regulation of SERPINE 1 that may have a deleterious effect in an ICH setting. This gene encodes a member of the serine proteinase inhibitor superfamily, the principal inhibitor of tissue plasminogen activator (PAI-1). In addition to its role in the regulation of fibrinolysis, PAI-1 is thought to be a pro-inflammatory mediator. 39 Since triggered by hem accumulation, SERPINE1 might precipitate hem-induced neuronal apoptosis and inflammation in an ICH setting. 40 Three genes differentially down-regulated indicated tissular injuries. We found a decrease in expression levels of key genes in myelin assembly such as oligodendrocyte myelin paranodal and inner loop protein (OPALIN), a marker of mature oligodendrocytes. 41 The down-regulation of SLC6A1 (encoding γ-aminobutyric acid (GABA) transporter 1 [GAT-1], one of the major GABA transporters in the brain) and GRIN2A (encoding the N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR) subunit GluN2A) suggests a disturbance in cerebral neurotransmission following ICH. 42 In addition to its role of neurotransmitter and neuronal development, GABA also modulates inflammation and has an inhibitory role in the immune system (decrease of inflammatory cytokine production). 43 According to a recent meta-analysis, only two studies (one post-mortem and one on peroperative biopsy) used transcriptomic methods to assess gene expression within the PHA. 44 Rosell et al. reported transcriptomic analysis from 4 cases who died within four days after ICH. 38 Interestingly, CD163 expression was among the most differentially up-regulated molecules but authors did not report results on HO-1 expression. Carmichael et al. did not find any up-regulation of HO-1 and did not mention CD163. 45 However, their six samples were obtained within the first 24h after ICH while we mostly observed HO-1 positive cells from day 7.

Our study has some limitations. Our study population included elderly patients and sICH were associated with underlying cerebral amyloid angiopathy (CAA) in 18/19 cases. Therefore, age and the type of underlying vessel disease may have contributed to our findings. However, the patient with a deep ICH showed similar histological features as lobar ICH cases at similar timepoints. Of note, except from one patient (deceased 8 months after ICH), neither significant neuroinflammation was found in the contralateral hemispheres, suggesting that the changes observed in this latter case were related to the bleeding event and not to the nature of the underlying vasculopathy. Once recruited monocytes differentiate into brain macrophages, they are nearly indistinguishable from reactive microglia and they both express CD163. Therefore, we can not differentiate the contribution of resident microglia from infiltrating macrophages.

Our study also has strengths. Despite the cross-sectional nature of a histopathological study, we obtained several samples at different important timepoints in the natural history of severe sICH.

We combined neuropathological and genomic explorations to investigate blood clearance mechanisms. We used an immunohistochemistry automated staining machine and semiautomated technique to quantify immunolabelling of the sections, ensuring reproducibility of our results.

In conclusion, we provide histological and genomic-based evidence in humans for the predominant expression of CD163/HO-1 pathway in the PHA, with a strategic time-window: from day 7 to day 15 after ICH. An anti-inflammatory environment seems to be suitable to enhance the natural blood clearance process. Our findings contribute to identify innovative therapeutic strategies for ICH.

I N TR O D U C T I O N

Spontaneous intracerebral haemorrhage (sICH) is the most feared cerebrovascular event because it is associated with a high rate of mortality and morbidity, and devoid of specific treatmen. 1 Unfortunately to date, interventions to enhance haematoma clearance using recombinant tissue-plasminogen activator (rtPA) infusion have failed, as well as promising experimental neuroprotective treatments to reduce secondary brain tissue damage. 2,3 Following the rapid accumulation of blood within the brain parenchyma, neutrophils are the first inflammatory cells to reach the haematoma site. 4,5 In addition to the well-established neurotoxicity attributed to their prolonged activation, 4-7 7), qui pourraient contribuer à l'amplification et la diffusion des réactions inflammatoires selon la théorie de l'avalanche de Fisher [START_REF] Fisher | Pathological Observations in Hypertensive Cerebral Hemorrhage[END_REF]. Cette hypothèse nécessitera la réalisation de travaux dédiés. Enfin, nous avons montré que cette zone péri-hémorragique était une interface indispensable à la résorption de l'hémorragie et à la réparation tissulaire.

2. 5 3 . 36 4 43 Travail 1 : 45 Travail 2 :Travail 2 :Figure 1 .Figure 2 .Figure 3 .Figure 4 .Figure 5 . 27 Figure 6 .Figure 7 .Figure 8 .Figure 9 .

 5336431452212345276789 Figure 1. Localisation de l'hémorragie et microangiopathie cérébrale sous-jacente. Figure adaptée de (Qureshi et al. 2001)……………………………………………………………………16

Figure 1 .

 1 Figure 1. Localisation de l'hémorragie et microangiopathie cérébrale sous-jacente. Figure adaptée de (Qureshi et al. 2001).

Figure 2 .

 2 Figure 2. Hypothèses physiopathologiques des conséquences de l'Hémorragie intracérébrale sur le parenchyme cérébral. Adaptée de (Pétrault et al. 2019). CO : monoxyde de carbone ; Hb : hémoglobine ; HCP-1 : protéine porteuse de l'hème-1 ; H2O2 : peroxyde d'hydrogène ; MRC : chaîne respiratoire mitochondriale ; NO : monoxyde d'azote ; O2 : dioxygène ; O2-: anion superoxyde ; OH . : radicaux hydroxyles ; ROS : espèces réactives de l'oxygène.

  Elles surveillent constamment le microenvironnement cérébral et détectent immédiatement tout type d'agression exogène (agents infectieux) ou endogène (HIC par exemple). L'irruption de sang dans le parenchyme cérébral va induire leur activation. Bien qu'elles prolifèrent rapidement, leur capacité de phagocytose est rapidement dépassée. Elles vont donc adresser, par le biais de cytokines pro-inflammatoires, un signal aux cellules endothéliales afin de déclencher une réponse inflammatoire autorisant un recrutement de phagocytes plus nombreux et plus performants. Celui-ci s'opère au niveau des veinules post-capillaires à travers lesquelles s'infiltrent des leucocytes. Le passage d'un leucocyte à travers l'endothélium se fait en 3 étapes (Carman 2009) : le roulement, la margination et la diapédèse. Les polynucléaires neutrophiles et éosinophiles et/ou les cellules mononucléées (monocytes, lymphocytes) affluent alors sur le site inflammatoire. Les neutrophiles sont les premiers leucocytes recrutés, suivi par les monocytes qui s'activent en macrophages une fois dans le tissu. Ces cellules vont phagocyter les hématies libres ainsi que les débris cellulaires. Enfin, l'infiltrat lymphocytaire va induire la mort par apoptose des cellules en souffrance avant qu'elles ne propagent la nécrose. Pour permettre le recrutement de ces cellules, les cellules endothéliales augmentent leur perméabilité capillaire ce qui autorise l'extravasation (Maślińska et Gajewski 1998). Le plasma et ses constituants vont aussi traverser les parois vasculaires. Ce liquide, nommé « exsudat », contient de nombreuses enzymes, anticorps et diverses molécules qui perturbent l'homéostasie ionique et le fonctionnement cellulaire local, amplifiant également la réponse inflammatoire. L'ensemble du processus de recrutement cellulaire est résumé dans la Figure 3.

Figure 3 .

 3 Figure 3. Mécanismes impliqués dans la neuro-inflammation. Figure adaptée de (Endres et al. 2008).

Figure 4 .

 4 Figure 4. Représentation schématique de la barrière hémato-encéphalique et conséquences de sa rupture. Figure modifiée de (Bérézowski et al. 2012).

Figure 5 .

 5 Figure 5. Différentes modalités d'imagerie cérébrale pour évaluer l'oedème périhémorragique. (A) Scanner cérébral en coupe axiale. L'hémorragie intracérébrale (HIC) se traduit par une hyperdensité spontanée entourée d'une zone hypodense : l'oedème péri-hémorragique (OPH, surligné en bleu. (B) IRM cérébrale en séquence T2-FLAIR, coupe axiale. HIC lobaire pariéto-occipital gauche visible en hyposignal, entouré d'un hypersignal correspondant à l'OPH (surligné en bleu).

Finalement

  , nous ne disposons à ce jour d'aucun marqueur robuste, permettant d'identifier les profils de patients à risque d'aggraver leur OPH et qui pourraient bénéficier d'une thérapie ciblée.

Figure 6 .

 6 Figure 6. Volumes approximatifs des encéphales et ratio substance grise/blanche chez plusieurs espèces en comparaison avec l'homme. Figure adaptée de Krafft et al., 2012 (Krafft et al. 2012).

4 .

 4 expérimentale. Cette revue de la littérature a constitué le mémoire de Master 1, d'Emilien Hourquet, étudiant que j'ai eu l'occasion d'encadrer. Plusieurs points ressortaient de notre stratégie de recherche systématique de la littérature : (1) une sous-utilisation de l'IRM pour quantifier l'OPH (seulement 12 articles) ; (2) des méthodes de segmentation perfectibles et hétérogènes d'une étude à l'autre ; (3) une absence d'étude de l'effet du sexe ainsi que de la corrélation aux données comportementales (notamment cognitives) à long terme. Ce dernier constat est cohérent avec une récente revue systématique sur le mode d'évaluation du comportement dans les modèles pré-cliniques d'AVC. Dans cette revue, Hietamies et al. montrent que 74% des travaux se contentent d'une évaluation motrice à court terme, à l'aide d'échelles subjectives. Par ailleurs, ils soulignent également la sous-représentation des femelles (seulement 16%) (Hietamies et al. 2018). En conclusion, il nous semblait nécessaire de s'intéresser à l'IRM multimodale pour quantifier et caractériser l'OPH, mais également d'approfondir nos connaissances sur les conséquences comportementales motrices et cognitives, à court et à long terme d'une HIC chez le petit animal. Hémorragie cérébrale et études post-mortem Par une rapide évaluation PubMed de la littérature en utilisant les termes de recherche " intracerebral h(a)emorrhage in rats " et " intracerebral h(a)emorrhage in mice " nous avons identifié 1330 études publiées depuis 2010. Parmi elles, plusieurs centaines ont évalué des thérapies candidates prometteuses. Malgré un grand nombre de ces dernières rapportant des effets bénéfiques, aucun des traitements n'a pour l'instant été transposé avec succès en clinique. Sur la base de cette observation, il semble que la démarche translationnelle actuelle ne fonctionne pas. Une des solutions proposées est de vérifier, avant toute tentative de pharmacomodulation, que les observations tissulaires observées dans les modèles expérimentaux le soient également chez l'Homme, dans des cinétiques similaires. Les études neuropathologiques post-mortem chez l'Homme prennent alors toute leur importance. Pourtant, les études ex vivo ayant utilisé des cerveaux de patients décédés d'HIC sont peu fréquentes.

  (a) Premièrement, notre compréhension des mécanismes et des conséquences à court et long terme de l'HIC est insuffisante. (b) La deuxième explication est d'ordre méthodologique. Comme décrit en introduction, la littérature pré-clinique sur l'HIC, se caractérise par une sousutilisation de marqueurs radiologiques in vivo (IRM cérébrale), des tailles d'effectif généralement faibles, une sous-représentation des femelles et des effets fonctionnels pharmacologiques testés exclusivement sur des performances motrices à court terme. A l'aide d'une méthodologie solide, nous avons mis au point un modèle animal pour mieux comprendre les conséquences tissulaires et comportementales de l'HIC. Nous avons ainsi tenté de répondre à deux problématiques : 1. Etudier de manière longitudinale la cinétique et la nature de l'OPH par de l'IRM multimodale avec corrélats histologiques. 2. Etudier les conséquences comportementales à court et à long terme après une hémorragie cérébrale, avec un accent sur les fonctions cognitives.

(

  CEEA, Comité d'Ethique en Experimentation Animale), from the French Ministry for Education and Research (agreement number: APAFIS#14066-2018031312529642v3) and were performed in strict compliance with the European Union Directive 2010/63/EU.

  Axial and coronal T2-weighted spin-echo sequences (repetition time/echo time [TR/TE] = 5000/77 ms, field of view [FOV] = 4×4 cm, matrix = 256×256, slice thickness = 1 mm, no gap, 20 slices) ; Multiecho T2 spin-echo relaxometry (TR/TE = 5000/7, 21, 35, 49 and 63 ms, FOV = 4× cm, matrix = 256×256, slice thickness = 1 mm, no gap, 20 slices) ; Multiecho T2 gradient-echo (TR/TE = 800/3; 7; 11; 16; 20; 24; 28 and 32 ms, FOV = 4×4 cm, matrix = 256×256, slice thickness = 1 mm, no gap, 7 slices) ; Diffusion-weighted imaging (TR/TE = 3000/21.50 ms, b-values = 10, 20, 40, 60, 80, 100, 400, 600, 800 et 1000 s/mm2, FOV = 4×4 cm, matrix = 108×96, slice thickness = 1 mm, no gap, 7 slices) ; Flow sensitive alternating recovery-echo planar imaging (FAIR-EPI) perfusion Arterial-spin labelling (ASL) sequence :

D3 ( 25 .

 25 23 ± 10.1 mm 3 ) and a dramatic decrease at D7 (1.73 ± 1.1 mm 3 ; p< 0.0001 with D3 as reference).

Figure 1 :

 1 Figure 1: Temporal course of ICH and PHA volume in the acute phase.

Figure 2 :

 2 Figure 2: Spontaneous locomotion recovery in the acute phase.

  Accumulation: rR2* was 1.70 ± 0.34 at D0, 1.45 ± 0.26 at D3 and peaked at D7 (2.11 ± 0.46; p< 0.0001 with D3 as reference) (Figure3A).

Figure 3 :

 3 Figure 3: Water content, iron accumulation and neuroinflammation within the PHA

  Tissue perfusion: rCBF was 0.50 ± 0.19, 1.06 ± 0.26 (p< 0.0001 with D0 as reference) and 1.10 ± 0.23 at D0, D3 and D7 respectively (Figure 4A, B). Voxel-based analysis of ADC

Figure 4 :

 4 Figure 4: Water mobility, micro-vascular wter mobility and tissular perfusion within the PHA

  found a positive correlation between rASL and rADC values at each time point but especially at D0 (r=0.47, p<0.0001 for relative values and r=0.62, p<0.0001 for number of voxels in hypo ADC and ASL values). Relative ADC values were positively correlated to PHA volume at D3 (r=0.73, p<0.0001). The rR2* at D7 was positively correlated to ICH and PHA volumes at D0 (r=0.66 and 0.53 respectively, all p-values < 0.001).In linear regression models adjusted for sex, we identified several parameters associated with PHA growth at D3: the proportion of voxels in hypoADC and hypoASL values at D0 (Estimates + 0.16 per-voxel, p=0.003 for hypoADC values and Estimates +0.12 per-voxel, p=0.035 for hypoASL values). Edema growth was also associated with the proportion of hyperASL values at D3 (Estimates +0.25 per-voxel, p=0.005) and hyperADC values (Estimates +0.24 per-voxel, p< 0.0001).

  ) tissular water infiltration; (2) (micro-)vascular changes; (3) neuroinflammatory cells infiltration and (4) iron deposits. They have their own intervention kinetics and we identified three critical phases of ICH natural history that can serve as endpoints for future experimental therapeutic studies: a hyperacute phase of tissular crush and mass-effect (4 hours); a pro-

(

  CEEA, Comité d'Ethique en Experimentation Animale), from the French Ministry for Education and Research (agreement number: APAFIS#14066-2018031312529642v3) and were performed in strict compliance with the European Union Directive 2010/63/EU.

Figure 1 :

 1 Figure 1: Design of the study

  consisted of two open arms (40 cm 20 cm) alternating at right angles with two arms enclosed by 40 cm high walls. The four arms delimited a central area of 20 cm2. The whole apparatus was placed 70 cm above the floor. Rats were placed in the center of the elevated plus maze, facing a closed arm, and were allowed to freely explore the maze for 10 minutes. the percentage of time spent in the open arms were measured.

(

  repetition time/echo time [TR/TE] = 5000/77 ms, field of view [FOV] = 4*4 cm, matrix = 256*256, slice thickness = 1 mm, no gap, 20 slices).

Figure 2 :

 2 Figure 2: Temporal course of intracerebral haemorrhage volume in the acute phase.

  spontaneous locomotor performances comparable to their sham group from day 3 (traveled distance and resting time, p<0.05).

Figure 3 :

 3 Figure 3: Spontaneous locomotion recovery in the acute phase.

8 .

 8 5±5.7, p= 0.13 / resting time: 209±8 vs 230±11 sec, -22±13, p= 0.10) (Figure 4A-C). They also did not exhibit more anxiety-like behavior (% of the time spent in open arm: 13.2±0.8 vs 15.0±1 %, -1.8±1.2, p= 0.14) (Figure 4D). Results were similar in both males and females in sex-subgroup analysis.

Figure 4 :

 4 Figure 4: Long-term spontaneous locomotion and anxiety-like behavior.

Figure 5 (

 5 Figure5 (A,C and E) shows the cognitive impairment at three months (total population and sexsubgroups). The ICH group exhibited a cognitive impairment in several domains. An alteration of the working memory was observed (% of spontaneous alternation: 58.1±1.2 vs 70.7±1.2 %, -12.6±1.8, p< 0.001). Spatial recognition memory was also altered (% of time spent in the novel arm: 48.7±1.9 vs 64±1.8 %, -15.3±2.9, p< 0.001). We did not find any sex effect regarding the working and spatial recognition memory. Regarding visual recognition memory, ICH female rats showed a deficit in visual recognition memory (discrimination index: 0.14± 0.05 vs 0.33± 0.04, -0.19±0.07, p= 0.013). In the subgroup of 24 animals followed up to 6 months, spontaneous alternation test and the Y-maze spatial test were still impaired compared to the 3months assessment (Figure5B, D and F).

Figure 5 :

 5 Figure 5: Long-term cognitive impairment after intracerebral haemorrhage induction.

Figure 6 :

 6 Figure 6: Long-term cerebral atrophy and histological correlates after intracerebral haemorrhage.

Figure 7 :

 7 Figure 7: Long-term cerebral hypometabolim after intracerebral haemorrhage.

  patients décédés d'une HIC. Ces échantillons humains sont précieux et offrent de multiples possibilités d'études. Notre constat initial était que la présence de sang libre et en excès dans le parenchyme cérébral devait être toxique pour ce dernier. C'est la raison pour laquelle des thérapies ciblées visant l'évacuation du sang sont développées. La réalité clinique est moins évidente puisque toutes les techniques chirurgicales et pharmacologiques mises au point pour évacuer le sang ne permettent pas d'améliorer le pronostic fonctionnel des patients. A ce jour, ces techniques ne permettent pas une évacuation complète du sang ou au prix de méthodes traumatisantes, mettant elles-mêmes en jeu le pronostic fonctionnel des patients. Nos travaux de recherche ex vivo se sont donc centrés sur la question de la résorption du sang. 1. Un premier travail, s'intéresse à la résorption naturelle, dont l'OPH constitue une interface clef. 2. Un deuxième travail s'est concentré sur les Neutrophiles Extra cellulaires Traps (NETs) qui pourraient être impliqués dans la physiopathologie de l'HIC et des dommages tissulaires péri-hémorragiques

Figure 1 .

 1 Figure 1. Spatial distribution of Iba1, CD163 and HO-1 positive cells.

Figure 2 .

 2 Figure 2. Temporal distribution of Iba1, CD163 and HO-1 positive cells within the PHA

Figure 3 .

 3 Figure 3. Representative histopathological examination of PHA within 72 hours: Activation phase

Figure 4 .

 4 Figure 4. Representative histopathological examination of PHA from day 3 to day 7: Encircling and induction phase.

Figure 5 .

 5 Figure 5. Representative histopathological examination of PHA from day 7 to day 15: Amplification phase.

Figure 6 .

 6 Figure 6. Representative histopathological examination of PHA from day 15 to day 90: Continuation phase.

Figure 7 .

 7 Figure 7. Representative histopathological examination of PHA above 90 days: Healing phase

Figure 8 .

 8 Figure 8. Transcriptomic study of PHA

Figure 7 .

 7 Figure 7. Microsaignements et microinfarctus aigües dans la zone péri-hémorragique observés sur du tissu cérébral humain

  phagocytose des leucocytes apoptotiques (PNN) après qu'ils aient phagocyté un maximum d'hématies, on parle alors d'efferocytose. Cette dernière inhibe la production de cytokines proinflammatoires[START_REF] Boada-Romero | The Clearance of Dead Cells by Efferocytosis[END_REF].Nous avons montré que la zone péri-hémorragique est une interface nécessaire à la résorption de l'hémorragie cérébrale et des processus de réparation tissulaire. Notre étude sur les monocytes de type M2, exprimant le CD163, démontre leurs effets bénéfiques de façon séquentielle. Dans un premier temps ils exercent un effet paracrine visant à l'enkystement de la lésion hémorragique. Ceci permet de contenir la dispersion des hématies dans le parenchyme cérébral. Puis, dans un deuxième temps, par le biais de la voie CD163/HO-1 ils permettent la phagocytose des hématies et donc, la résorption de l'hémorragie ce qui limite la toxicité de ses composants. Par ailleurs, le CD163 induit la sécrétion de cytokines anti-inflammatoires comme l'IL-10. De manière concomitante à l'expression de CD163/HO-1, nous avons identifié plusieurs gènes surexprimés qui exercent un effet anti-inflammatoire tel que TNFRSF1b (Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B), LAIR1 (leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1 protein), SOCS3 (suppressor of cytokine signaling family-3) et PTX3 (Long pentraxin 3). En résumé, le changement phénotypique d'une polarisation M1 vers une polarisation M2 semble être un élément clé de la terminaison inflammatoire et de la résorption de l'hémorragie, qui dépend elle-même du microenvironnement pro-ou antiinflammatoire local. Il convient de rappeler que tous les patients inclus dans nos études ex vivo sont, par définition, décédés directement ou indirectement de leur HIC. Leurs mécanismes physiologiques de réparation tissulaire ont donc été insuffisants. Et il apparait souhaitable de pouvoir les optimiser pharmacologiquement. Nos travaux suggèrent que plutôt que de limiter le déclenchement et l'intensité de la réaction inflammatoire, mieux vaut stimuler la résolution de cette inflammation en favorisant le passage polarisé d'un état proà anti-inflammatoire. Cette approche physiopathologique ouvre de nouvelles perspectives thérapeutiques dont, par exemple, celle de l'activation de facteurs de transcription comme le PPARγ, récepteur nucléaire clef de la différenciation M2 des macrophages (Chawla 2010; Bernardo et Minghetti 2006). Enfin, une autre piste serait d'intervenir sur le microenvironnement des macrophages favorisant cette transition. En effet, le passage d'un état pro à anti-inflammatoire est un processus très actif sous la dépendance de médiateurs lipidiques dérivés des acides gras insaturés membranaires qu'il serait intéressant d'étudier dans l'HIC (Calder et Grimble 2002).

Figure 8 .

 8 Figure 8. Hypothèses physiopathologiques des mécanismes délétères et protecteurs survenant au sein de la zone péri-hémorragique. Figure inspirée de (Dirnagl, Iadecola, et Moskowitz 1999).

4 .

 4 De l'expérimental à la clinique : l'étude COPITCH Pour compléter notre approche translationnelle de l'HIC et de ses conséquences, nous avons mis en place l'étude clinique CoPITCH (influence of Cerebral Oedema on the Prognosis of InTraCerebral Haemorrhages). Il s'agit d'une étude prospective multicentrique observationnelle longitudinale. L'objectif principal est d'évaluer l'influence de l'OPH sur le pronostic fonctionnel 3 mois après un HIC. Nos objectifs secondaires sont de caractériser l'histoire naturelle de l'OPH en IRM, d'évaluer son effet sur la mortalité et les performances cognitives post HIC et d'identifier les patients à de développer un OPH malin. Pour cela, tous patients âgés de plus de 18 ans admis dans les 24 heures suivant l'apparition de l'hémorragie cérébrale spontanée (i.e. non malformative, non traumatique) sont éligibles. Les critères d'exclusion sont : hémorragie intraventriculaire isolée, HIC en lien avec une malformation vasculaire ou une thrombose veineuse cérébrale, une transformation hémorragique d'un infarctus cérébral. Les patients transférés d'un autre hôpital (induisant un biais de sévérité) ainsi que les patients ayant un handicap fonctionnel pré-existant (score de Rankin modifié pré-existant de 4 ou 5) sont également exclus. Tous les patients sont évalués sur le plan clinique, biologique et neuroradiologique de manière longitudinale, à quatre temps : admission (24 ières heures), 96 heures, 3 mois et 1 an. Evaluation clinique. Les données cliniques et démographiques des patients sont recueillies prospectivement. Les chiffres tensionnels, le score de Rankin pré-admission et le score NIHSS sont notamment collectés à l'admission. Tous les patients sont revus à trois mois et à un an en consultation avec un neurologue vasculaire spécialisé. Le devenir fonctionnel sera évalué par le score de Rankin modifié. L'efficience cognitive globale sera évaluée en utilisant l'échelle MOCA (Nasreddine et al. 2005). L'existence d'un trouble cognitif mineur ou sévère préalable à l'hémorragie sera évalué à l'admission en utilisant la version courte de l'IQCODE (Donnellan et Werring 2020). Nous recherchons également des troubles du comportement en utilisant lEvaluation neuroradiologique. Une IRM cérébrale est réalisée pour chaque patient à chaque temps, sur la même machine en utilisant un protocole spécifique pré-établi. Une analyse neuroradiologique exhaustive sera réalisée avec une mesure du volume de l'HIC, du volume de l'OPH, du volume lésionnel total (défini par la somme des 2), du volume relatif d'OPH (défini par le ratio volume OPH/volume HIC) ainsi que du taux d'expansion de l'OPH. Nous utiliserons un logiciel dédié afin de quantifier de manière semi-automatique ces volumes lésionnels. Un neuroradiologue expérimenté procédera à l'évaluation de chaque IRM Evaluation biologique. Des prélèvements sanguins sont réalisés à l'admission, J4 et 3 mois. Ils sont stockés à -80° et analysés en aveugle des données cliniques et du temps d'évaluation. A l'issue du recrutement, nous analyserons un large panel de biomarqueurs notamment de l'inflammation (tel que le ratio neutrophiles/lymphocytes, facteur de von Willebrand, ICAM-1, MMP-9…), nous étudierons également l'influence du phénotype APOε qui pourrait être associé au pronostic des patients avec HIC (Biffi et al. 2011). En date du 15 Octobre 2021, 15 patients ont été inclus sur les 500 prévus.

Figure 8 .

 8 Figure 8. Design de l'étude COPITCH (influence of Cerebral Oedema on the Prognosis of InTraCerebral Haemorrhages).

Table des matières INTRODUCTION GENERALE……………………………………………………….……………15 1. Hémorragies intracérébrales spontanées…………………………………………………………15

  La réponse inflammatoire…………………………………………...…….…………………..…21 2.2.1.1 Le recrutement cellulaire………………………………...………………….…………………21 2.2.1.2 La rupture de la barrière hémato-encéphalique (BHE)………………………………………..22 2.2.2 La mort cellulaire dans l'HIC : nécrose, apoptose et ferroptose………………………………...23 2.2.2.1 La nécrose…………………………………..………………………………………………….23

	1.1 Définition……………………………………………………………….……………………….…15
	1.2 Une maladie grave…………………………………………………………………………………16
	1.3 Une maladie dépourvue de traitement spécifique…………………………………………………17
	2. L'oedème péri-hémorragique (OPH) ……………………………………………………….……17
	2.1 Physiopathologie de la formation de l'OPH…………….…………………………………………17
	2.2 Réponse inflammatoire et mécanismes de morts cellulaires………………………………………21
	2.2.1 2.2.2.2 L'apoptose……………………………………………………………………………………..24
	2.2.2.3 La Ferroptose…………………………………………………………………………………..25
	2.3 Apport de l'imagerie cérébrale dans l'étude de l'OPH…………………………………………….26
	2.3.1 Des méthodes d'évaluation hétérogènes…………………………………………………………26
	2.3.2 Une histoire naturelle imprécise…………………………………………………………………28
	2.4 L'OPH a une valeur pronostique incertaine………………………………………………….……28

Table 1 . Résumé des études cliniques pertinentes portant sur la relation entre l'OPH et le pronostic clinique après une HIC spontanée

 1

	Etude	Design		Nb	Modalité Temps	de	Méthode de mesure OPH	Critère de jugement	Résultats
				patients		mesure
	(McCarron et al.	Prospectif, 1 centre		102	TDM	Admission		VA	Mortalité intra-hospitalière	↓
	1999)
	(Gebel et al. 2002)	Prospectif, 1 centre		86	TDM	<3 h		VA + VR	Mortalité à 1 mois	VR: mortalité: ↓/handicap: ↔
									mRS score ≥3 à 4 mois	VA: ↔
	(Lauren H. Sansing et	Rétrospectif, 1 centre 80	TDM	Non spécifié	VA	Mortalité intra-hospitalière,	↓
	al. 2003)								mRS score ≥3 à 3 mois
	(Levine et al. 2007)	Rétrospectif, 1 centre 98	TDM	Admission		VA	Mortalité à 3 mois	↑
		Rétrospectif, 1 centre 88	TDM	Non spécifié	VA	mRS score >3 à 7 jours	↔
	(Zubkov et al. 2008)
	(Arima et al. 2009)	Rétrospectif,	>1	270	TDM	Admission, J1-	VA + VR augmentation	mRS score ≥3 à 3 mois	↔
		centre				J3
	(Venkatasubramanian	Prospectif, 1 centre		27	IRM	J2-J7-J14-J21	VA + VR J2	Aggravation à J2	VA à 48h: ↓
	et al. 2011)							Augmentation VA + VR	Handicap à 3 mois	Autres paramètres: ↔
								Pic VR
	(L. H. Sansing et al.	Prospectif, 1 centre		303	IRM	J3		VA	mRS score ≥3 à 3 mois	↓
	2011)
	(Staykov et al. 2011)	Rétrospectif, 1 centre 219	TDM	J1, 2, 3, 4-6,	Pic VA + VR	Mortalité intra-hospitalière	Augmenation VA J1-J3: ↓
						7-11, 12-16, 17-21, >22	Augmentation VA + VR J1-J3		Autres paramètres: ↔
	(N. Li, Worthmann, et	Prospectif, 1 centre		59	IRM	Admission, J3 VA	mRS score ≤3 à 3 mois	VA à 3 jours: ↓
	al. 2013)							Composante cytotoxique		Autres paramètres: ↔
	(N. Li, Liu, et al.	Prospectif, 1 centre		21	IRM	Admission, J3,	VA		↓
	2013)					J7		Composante cytotoxique

2.6 Échec des thérapies ayant ciblées l'OPH

	En préambule de ce travail de thèse, nous avons analysé les perspectives des nouvelles thérapies
	ciblées sur l'inflammation et/ou l'oedème à la phase aiguë de l'HIC au travers des bases de
	données disponibles (Ovid MEDLINE, base de données de recherche sur les AVC [DORIS,
	www.askdoris.org], et la plate-forme internationale de registre des essais cliniques [ICTRP] de
	l'OMS). Plusieurs molécules visant l'OPH ont été expérimentées dans le cadre d'essais
	contrôlés et randomisés. L'antagoniste de la glycine, gavestinel R ; le NXY-059 (agent
	neuroprotecteur antagoniste de la Citicoline, piégeur de radicaux libres) ; le Celecoxib
	(inhibiteur sélectif de la cyclo-oxygénase 2) (Lee et al. 2013); le mannitol et le glycérol (Y. L.
	Yu et al. 1992; Misra et al. 2005); un agoniste du récepteur de sphingosine-1-phosphate, le
	Fingolimod R (Fu et al. 2014); et l'agoniste du récepteur PPAR-γ, Pioglitazone R (Gonzales et al.
	2013). Toutes ces molécules ont présenté une balance bénéfice/risque peu concluante. Pour
	résumer, aucun traitement ciblant l'installation et l'expansion de l'OPH n'est à ce jour validé
	en pratique courante.

Table 1 . Association between PHA peak and spontaneous locomotion performances

 1

	Parameters	Estimates	p-values*
	Distance traveled (cm)	-33.69	0.0061
	Number of rearing (n)	-0.72	0.0089
	Maximum speed (cm/sec)	-0.20	0.0013
	Resting time (sec)	+2.66	0.0079
	Legend. The statistical data comes from a multivariate regression model adjusted for sex. The
	PHA peak estimates suggest that for every 10 mm 3 increase in PHA volume, holding other
	predictor (sex) constant, one can expect a significant decrease of -34*10 = -340 ; -0.7*10 = -
	7 and -0.2*10 = -2 in the distance traveled (cm), number of rearings (n) and maximum
	recorded speed (cm/sec), and an average increase of +2.6*10=26 seconds in the resting time.

Table 1 . Characteristics of the study population.

 1

	Legends: ¶ CAA: Neuropathologic diagnosis was confirmed, after Congo Red staining and Amyloid β40
	immunolabelling, by an experienced neuropathologist (V.D).
	* Cases used for Nanostring transcriptomic analysis.
	sICH: spontaneous intracerebral hemorrhage; F: female; M: male; PHA: peri-hematomal area; CAA: cerebral
	amyloid angiopathy; HTN-SVD: hypertensive small vessel disease

Table 2 . Main results from Nanostring transcriptomic analysis

 2

				Adjusted p-
	Gene	log2FoldChange	lfcSE	values
	Upregulated genes
	HO-1	2.811	0.385	1.11E-10
	IFI30	2.494	0.453	4.81E-06
	SPP1	2.126	0.454	1.81E-04
	MMP14	1.758	0.315	4.73E-06
	TNFRSF1B	1.682	0.230	1.11E-10
	SERPINE1	1.539	0.313	6.72E-05
	CD163	1.491	0.285	1.68E-05
	PTX3	1.168	0.211	4.81E-06
	SOCS3	1.113	0.251	5.30E-04
	LAIR1	1.056	0.212	5.13E-05
	Downregulated genes
	GRIN2A	-1.021	0.217	0.0002
	OPALIN	-1.637	0.253	2.62E-08
	SLC6A1	-1.825	0.348	1.68E-05
	Legends: lfsSE, logfoldchange standard error.
	A positive and negative log2FoldChange indicates an increase and a decrease gene expression.

Une avancée dans la manière de penser l'OPH

  De façon générale, nous avions émis l'hypothèse que des mécanismes de protection naturelle existent mais sont insuffisants pour prévenir le risque vital et fonctionnel.Dans ce contexte, nous avons dans un premier temps étudié, dans un modèle de rat sain, dépourvu de toute pathologie cérébro-vasculaire, la réaction du cerveau à une entrée massive de sang. Puis, au travers de nos travaux ex vivo, nous avons étudié les mécanismes générant conséquences des réaction tissulaires. Cette définition ne rend ainsi pas compte de la complexité des événements survenant dans la zone péri-hémorragique dont les

	DISCUSSION GENERALE
	mouvements	liquidiens	n'en	sont	que	la	résultante.
	Lorsqu'un vaisseau intracérébral se rompt, l'irruption et les lésions tissulaires Tout d'abord, nous avons montré qu'il n'existait pas un mais des oedèmes pouvant coexister
	réactionnelles menacent le pronostic vital et fonctionnel de l'Homme ou de l'animal. L'échec ensembles avec une composante cytotoxique et vasogénique. La phase hyperaigüe (premières
	clinique des traitements neuroprotecteurs ou visant à évacuer le sang rend compte de la heures) est une phase de sidération, marquée par un phénomène d'écrasement des
	méconnaissance des mécanismes impliqués dans l'évolution des dommages péri-microvaisseaux et des cellules au contact de la masse hémorragique, responsable d'une
	hémorragiques parenchymateux. Nos travaux s'ancrent dans cette problématique dont les hypoperfusion et de nécrose se traduisant par un oedème cytotoxique. Nous avons par ailleurs
	objectifs consistaient à approfondir nos connaissances sur les cascades d'événements qui montré que cette hypoperfusion était transitoire, ne donnant qu'un rôle négligeable à l'ischémie
	surviennent dans le parenchyme cérébral en réponse à l'hémorragie et sur ses conséquences. dans la genèse de l'OPH. Dans un second temps (premiers jours), la phase d'activation
	inflammatoire se caractérise par une importante activation gliale dont le rôle est de contenir la
	lésion hémorragique et stimuler le recrutement de cellules inflammatoires systémiques
	(polynucléaires neutrophiles et macrophages) qui infiltrent massivement la zone lésionnelle.
	l'inflammation	et	participant	à	la	résorption	de	l'hémorragie.
	Étudier la dynamique aiguë, subaiguë et chronique des réactions tissulaires survenant autour
	d'une HIC est un enjeu de taille pour développer une future thérapie ciblée. Ces réactions font
	l'objet de deux idées reçues : (1) elles sont généralement résumées à un « oedème » et (2), elles
			K E Y W O R D S
	Stroke, intracerebral haemorrhage, post-mortem, neutrophils, neutrophil extracellular traps sont considérées comme délétères. Nos travaux montrent une réalité plus complexe et
	participent à la redéfinition de la zone péri-hémorragique.
	1.1 Un oedème, des mécanismes
	extensive data from ischaemic stroke studies demonstrate a direct action of neutrophils Un « oedème » se définit par un gonflement d'un tissu dû à une accumulation ou un excès intra-

Methods: From 2005 to 2019, all sICH patients who came to autopsy within the first month after stroke were included and grouped according to the timing of death: 72 h, 4-7 days, 8-15 days and >15 days after ICH onset. Paraffin-embedded tissue was extracted from four strategic areas: haematoma, peri-haematomal area, ipsilateral surcitrulline were immunolabelled to detect neutrophils and NETs respectively.

Results: Neutrophils were present in the brains of the 14 cases (4 men, median age: 78 years) and NETs were found in 7/14 cases. Both neutrophils and NETs were detected within the haematoma but also in the surrounding tissue. The appearance of neutrophils and NETs was time-dependent, following a two-wave pattern: during the first 72 h and between 8 and 15 days after ICH onset. Qualitative examination showed that neutrophils and NETs were mainly located around dense fibrin fibres within the haematoma.

Conclusions

: These observations provide evidence for NETs infiltration in the brain of patients who die from sICH. NETs might interact with early haemostasis within the haematoma core, and with the surrounding neuroinflammatory response. These findings open research perspectives for NETs in the treatment of sICH injuries. Notre démarche expérimentale, combinant des approches animales in vivo et humaine ex vivo, nous a permis de dégager certains concepts pour une meilleure compréhension mécanistique et pour le développement futur de nouvelles stratégies thérapeutiques. 1. tissulaire de liquide dans le milieu interstitiel. Dans l'HIC, ce terme oedème est employé avant tout pour des raisons techniques : les modalités d'imageries utilisées actuellement (essentiellement le scanner cérébral) ne permettent pas d'étudier les mécanismes mais seulement les Au niveau du micro-vaisseaux, l'écrasement des parois laisse place à une dilatation, une fragilité de la BHE qui devient perméable et fuit. Il en résulte la formation d'un oedème vasogénique. Plus tardivement, nous avons observé que, contrairement à ce que l'on pouvait imaginer, les dépôts de fer siègent préférentiellement dans la zone péri-hémorragique et non pas dans le coeur de l'hémorragie. Nous avons également observé que la zone périhémorragique était le siège de lésions micro-vasculaires tels que les microsaignements et microinfarctus (Figure

  Au décours d'une HIC, les effets pro/anti-inflammatoires sont principalement orchestrés par les monocytes résidents (microglie) et recrutés (macrophages périphériques). De par leur plasticité phénotypique et fonctionnelle, ils jouent un rôle déterminant dans le signal déclencheur de l'inflammation, puis dans sa terminaison et enfin de la restauration de l'homéostasie tissulaire.

	transitoire,	le	temps	de	la	résolution	de	la	lésion.
	Ces phagocytes adaptent leur phénotype au microenvironnement qui contribue à les différencier
	et à les activer. Une polarisation phénotypique génère principalement des macrophages de type
	I (M1 pro-inflammatoire) et de type 2 (M2 anti-inflammatoire). Les M1 initient la réponse
	inflammatoire via l'activation de différentes voies de signalisation (STAT1, NF-κB et MAP
	kinases), ils activent la production de cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, l'IL1-β, et l'IL-6)
	et sont aussi capables de produire des molécules cytotoxiques comme les ROS (Biswas et
	Mantovani 2010; Gordon et Martinez 2010). Les M2 sont eux caractérisés par leur capacité à
	produire des médiateurs anti-inflammatoires, ils déclenchent la terminaison de l'inflammation
	et préparent la réparation tissulaire. L'un des principaux rôles des M2 est leur contribution à la
	molécules neuroprotectrices prometteuses chez l'animal n'ont pas montré d'efficacité chez
	l'Homme (Xue et Yong 2020; Mracsko et Veltkamp 2014). Nos observations suggèrent une
	contribution de l'inflammation plus complexe à la physiopathologie de l'HIC, moins
	destructrice et plus protectrice que prévue, à l'instar de ce que nombre de travaux en
	immunologie ont	pu		démontrer	(Figure		8).
	Rappelons qu'en temps normal la réponse inflammatoire a une vertu protectrice. Son rôle est

1.2 Une manière différente d'appréhender l'inflammation

Lorsqu'une hémorragie cérébrale survient, l'agression tissulaire initiale est telle que la réponse inflammatoire proportionnelle risque de porter préjudice à l'intégrité tissulaire cérébrale. Cette agression est d'autant plus sévère qu'elle survient sur un cerveau vieillissant et exposé à une microangiopathie, deux éléments qui amplifient en intensité et en durée la réponse inflammatoire. C'est pourquoi, pour la majorité des neurologues cliniciens, l'inflammation est perçue comme un phénomène délétère (Figure

8

). En conséquence, de nombreux travaux à visée thérapeutique ont été menés pour l'interrompre ou en limiter les effets mais les diverses de permettre l'infiltration leucocytaire pour initier les mécanismes immunitaires de défense de l'organisme contre une agression microbienne, ou comme dans notre étude, une lésion. L'oedème provoqué par cette phase inflammatoire est un effet indésirable qui a vocation à rester

Rosenberg et ses collègues en 1990[START_REF] Rosenberg | Collagenase-Induced Intracerebral Hemorrhage in Rats[END_REF]). Le saignement est observé à partir de 10 minutes après l'injection, le volume de l'hématome étant corrélé à la concentration de collagénase utilisée. Si ce modèle reproduit bien la rupture de vaisseaux, il présente également des inconvénients. L'enzyme possède des propriétés pro-inflammatoires, ce qui induit un biais dans l'étude des réactions tissulaires autour de l'hémorragie[START_REF] Andaluz | Experimental Animal Models of Intracerebral Hemorrhage[END_REF]. Les études comparatives entre le modèle « sang autologue » et le modèle « collagénase » ont permis de dégager plusieurs conclusions essentielles. L'injection de collagénase produit une lésion primaire plus importante, très probablement attribuable à l'expansion de l'hématome qui peut se produire dans ce modèle. Il est intéressant de noter que, bien que le sang autologue génère un volume sanguin plus concentré et un effet de masse initial plus important, le modèle à la collagénase induit toujours plus de mort cellulaire, d'oedème et d'inflammation[START_REF] Manaenko | Comparison of Different Preclinical Models of Intracerebral Hemorrhage[END_REF]. La littérature est contradictoire en ce qui concerne l'atteinte neurologique, qui serait plus durable dans le modèle à la collagénase, ce qui le rendrait avantageux lorsque l'observation des déficits à long terme de l'HIC est souhaitable[START_REF] Manaenko | Comparison of Different Preclinical Models of Intracerebral Hemorrhage[END_REF] MacLellan et al. 2008).En définitive, le choix du modèle dépend de la question de recherche posée. Dans le cadre de notre travail, nous avons opté pour le modèle de double injection de sang autologue, limitant ainsi le risque d'inflammation induite par la collagenase.

1

Thèse réalisée au sein du laboratoire de recherche Inserm U1172 « LilNCog »

Remerciements

remerciements. L'éclairage

Funding information

This work was supported by the Fondation Recherche sur les Accidents Vasculaires Cérébraux (project FRAVC180713012), the Fondation I-SITE ULNE (fellowship L.P).

Our current study shows that multimodal MRI is a reliable tool to track the dynamic progression of peri-haematomal injuries (water content, microvascular changes, neuroinflammatory cells infiltration and iron deposition) that could be widely uses to monitor therapeutic interventions in preclinical ICH models.

Abstract

The mechanisms underlying intracerebral haemorrhage (ICH) -related cognitive impairment (CI) remain unclear. We aimed to investigate the long-term cognitive effect of ICH induction in rats. We concurrently studied the long-term structural and functional changes that occur in the rat brain. We led a prospective study with 114 healthy male and female Wistar rats. We induced ICH using the double autologous blood injection method. After surgery, each rat underwent short-term (onset, 3 and 7 days) and long-term (3 and 6 months) radiological assessment and behavioral tests exploring spontaneous locomotion, anxiety-like behavior and working, spatial recognition and visual recognition memories. We used FDG PET to semi-automatically segment ICH volumes and study long-term cerebral atrophy and metabolism. Mean initial hematoma volume was 23.35 ± 9.50 mm 3 . We found early spontaneous locomotor recovery and significant spontaneous blood resorption (≈ 40% of the initial lesion) from day 0 to day 7. At 3 and 6 months, the ICH group exhibited CI in several domains as compared to the sham group (working memory: 58.1±1.2 vs 70.7±1.2 %, p< 0.001; spatial recognition memory: 48.7±1.9 vs 64±1.8 %, p< 0.001 and visual recognition memory: 0.14± 0.05 vs 0.33± 0.04, p= 0.013, in female only). Concomitantly, ICH rats had a diffuse cerebral atrophy and hypometabolism of ipsilateral striatum, thalamus, limbic system and cortical areas (temporal and parietal lobes). This work demonstrates that a deep ICH provokes long term cognitive impairment and distant cortical atrophy and hypometabolism in a young and disease-free rat brain.

Key words: Stroke; Experimental ICH; cognitive impairment; MRI; Positron Emission

Tomography

Spatial recognition memory

Discrimination of novelty versus familiarity can be studied by comparing exploring behavior in the three arms of Y-maze test. Each of the three arms was 35 cm long, 8 cm wide and 15 cm high. To differentiate the arms, three distal cues were placed on the walls around the Y-maze in the testing room and were kept in place throughout the behavioral testing period. Spatial memory was evaluated in a two-trial procedure with an inter-trial interval of one hour. Three arms were designated: the starting arm, in which the rat started to explore (always open), the novel arm (which was closed in the first trial but open in the second trial) and the other arm (always open). The first trial (training session) lasted 10 min and enabled the rat to explore two arms of the maze (the start arm and the other arm). After a 1 h inter-trial interval, the second trial (test session) was performed; the rat was placed in the Y-maze in the same starting arm, with free access to all three arms for 5 min. Behavior was recorded with a video tracking system (Ethovision Noldus, The Netherlands) designed to automate testing in behavior experiments.

The tendency to ignore the novel arm was determined by the percentage of time spent in the novel arm over those values in the two other arms during 2nd trial of the Y-maze test. A spontaneous tendency of animals to explore a novel environment as determined by the Y-maze test is generally regarded as a measure of spatial memory [START_REF] Dellu | A two-trial memory task with automated recording: study in young and aged rats[END_REF].

Visual recognition memory

The novel object recognition test is based on the tendency of rats to explore a novel object rather than a familiar one. Rat were habituated to a square arena (50*50*25 cm) for 10 min on the first day. On day 2, rats were exposed to the arena containing two identical objects. On day 3, rats were exposed, in a first phase ("sample phase"), to two novel and identical objects for 15 min. After a 1 h resting time in their cage, they were placed back in the testing arena for 5 min ("test phase"), but a novel object had previously replaced one of the familiar objects.

Performance of the rat was video recorded (Ethovision XT, Noldus, Wageningen, The Netherlands). Exploratory behevior was defined as the animal directing its nose toward the object at a distance below 2 cm. Any subject that failed to complete a minimum of 10 s of exploration during the sample phase was excluded from the analysis. The discernment index was calculated as the subtraction of the time spent exploring the novel object and the familiar object divided by the total time exploring either object [START_REF] Antunes | The novel object recognition memory: neurobiology, test procedure, and its modifications[END_REF]. contralateral areas (see Figure 1 in supplementary material). The measurement was expressed as a ratio of the ispilateral volumes divided by the contralateral volumes for each ROI. http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/). PET and CT images were rigidly co-registered with SPM 12. All CT scans were registered to an in-house CT template and brain masks were extracted and applied to PET images with ANTS (Advanced Normalization Tools package). PET images were registered with ANTS to their own T2-weighted image which were registered to Cermep rat atlas [START_REF] Lancelot | A multi-atlas based method for automated anatomical rat brain MRI segmentation and extraction of PET activity[END_REF]

Supplementary material -

PARTIE II ETUDE POST-MORTEM

Abstract:

Background and purpose: Enhancing the blood clearance process is a promising therapeutic strategy for ICH. We aimed to investigate the natural kinetic of this process after ICH in human brain tissue with a focus on the monocyte-macrophage scavenger receptor (CD163)/hemoxygenase-1 (HO-1) pathway. 13 days). The PHA concentrated most of reactive microglia, CD163/HO-1 activities and iron deposits. We found a surge in the blood clearance process from day 7 to day 15 after ICH onset. Transcriptomic analysis showed that HO-1 was the most differentially upregulated gene (2.81 ± 0.39, adjusted p-value = 1.11x10 -10 ) and CD163 the sixth (1.49 ± 0.29, adjusted p-value = 1.68x10 -5 ). We also identified several up-regulated genes that exert a beneficial role aiming at terminating inflammation and enhancing tissue repair.

Methods

Conclusion:

We provide histological and genomic-based evidence in humans for the predominant expression of CD163/HO-1 pathway in the PHA, with a strategic time-window: from day 7 to day 15 after ICH. An anti-inflammatory environment seems to be suitable to enhance the natural blood clearance process. Our findings contribute to identify innovative therapeutic strategies for ICH.

Key words: ICH ; peri-hematomal area ; CD163 ; hemoxygenase-1 ; post-mortem ; transcriptomic analysis

Methods:

Standard protocol approvals, registration, and patient consents.

Human brains were obtained from the Lille Neurobank (CRB/CIC1403 Biobank, BB-0033-00030, agreement DC-2008-642), which fulfils the criteria of the local laws and regulations on biological resources with donor consent, data protection, and ethical committee review.

Human brain sampling

We included all consecutive cases (2005-2019) from the Lille University Hospital brain bank (Lille Neurobank, France) of sICH patients who came to autopsy. 19 Post-morterm examination and brain sampling methods are reported elsewhere. 20 To assess the potential spreading of CD163 and HO-1 expressions within ICH core and surrounding tissue, paraffin-embedded tissue blocks were analysed from four distinct areas: (1) Within the hematoma, ( 2) within the peri-hematomal area (PHA), ( 3) next to the PHA within ipsilateral surrounding brain tissue (ISBT). Lastly, a fourth control contralateral area was analysed.

Staining and immunohistochemistry.

Sections of formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue were stained with hematoxylineosin (H&E) for a global identification and structural analysis of the tissues. To investigate hematoma clearance process, we used ionized calcium-binding adapter molecule 1 (Iba1), CD163 and hemoxygenase-1 (HO-1) immunolabellings to assess microglial activation, scavenging and hemoglobin degradation activities. As a result of hematoma clerance, we used a Perl's staining to quantify iron accumulation.

All stainings (H&E, and Perl's) and all immunolabellings (Iba1, CD163 and HO-1) were performed on serial-sections of 5µm each with an automated method (details are available in supplementary materials). Details of Immunolabellings were performed with a VENTANA BenchMark GX immunohistochemistry automated staining machine (Roche). The primary antibody was a rabbit polyclonal IgG (Ventana-Roche kit for CD163, [1:500, Wako Chemicals USA, Richmond, VA, USA] for Iba1 and [1:400, Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, USA] for HO-1). We used the i-View DAB detection kit® (Ventana Medicals System, Roche Group) and nucleated cells stained blue using bluing reagent solution (Ventana-Roche). For each immunolabelling, a tissue section was processed identically except that the primary antibody was omitted as a specificity control, and revealed no signal. A brightfield slide scanner (Zeiss Axioscan Z1) digitised the whole tissue section at 20-fold magnification after staining.

Immunolabelled sections were independently analysed by two experienced operators (L.P and V.B). A staining surface ratio ([stacking surface/whole section surface]) was calculated with a semi-automated method using ImageJ software in order to quantify the positively stained or labelled surface in each area (i.e., hematoma core, PHA, ISBT and control area).

Nanostring and gene identifications

Sample preparation and RNA extraction

FFPE tissue samples were collected from 6 representative patients for RNA extraction. These 6 patients died between day 6 and day 17 after ICH. Two experienced investigators (L.P and R.B) examined the specimen on H&E stained slides and annotated a 0.25cm² area of interest (AOI). The tissue of the AOI was then scraped off on serial slides. For each patient, perihematoma tissue and a reference contralateral tissue of the same Brodmann area were selected.

RNA was prepared according to the manufacturer's instructions using the Qiagen RNeasy Micro RNA kit (Cat# 74004; Qiagen, Courtaboeuf, France). The purified RNA was eluted in RNase-free water. Quantitation was performed using the NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Quality of RNA was assessed with a bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA).

Gene expression profiling

NanoString nCounter RNA expression profiling was performed according to the manufacturer's instructions with 261 to 526 ng RNA input to adapt to the quality of RNA and using the nCounter Neuroinflammation Panel (NanoString, Seattle, WA) on 6 relevant cases. Output RCC file and QC was performed using nSolver Analysis Software (version 4.0; NanoString, Seattle, WA) to generate RAW counts data. Further analysis including normalization and differential expression were done with R (https://www.R-project.org) and DESeq2 package. 21 Normalisation was performed using the 13 housekeeping genes included in the commercial design. Differentially expressed gene was define by the association of an adjusted p-value (BH) < 6x10 -4 (i.e p-value < 1x10 -5 ) and Log 2 Fold change > 1 or < -1.

Statistical analysis

Continuous, ordinal and categorical variables were expressed as the mean ± SEM, the median [interquartile range] or the number (percentage), respectively. We first compared the expression levels of Iba1, CD163 and HO-1 between areas of interest (hematoma core, PHA, ISBT versus contralateral area as reference). We then compared expression level between different timepoint. To do so, sICH cases were grouped according to the time of death: 72 hours (n=2), from day 4 to day 7 (n=4), from day 7 to day 15 (n=5), from day 15 to day 90 (n=4) and >90 days (n=4). We used a Kruskal-Wallis with Tukey post hoc tests to compare the different area of interests and timepoints. GraphPad Prism software was used to perform the statistical analysis, with the p-value considered as significant when <0.05.

Results

Study population

Between 2005 and 2019, 22 patients with sICH came to autopsy. Among them, three sICH were due to an underlying vascular malformation (arteriovenous malformation, n=2 and cavernous malformation, n=1

Comment améliorer le pipeline translationnel de l'animal à l'Homme ?

Malgré des données qui semblaient encourageantes chez l'animal, aucun traitement neuroprotecteur, c'est-à-dire visant à protéger les neurones de la mort cellulaire, n'est recommandé dans la prise en charge de l'HIC. Pourtant, les modèles animaux avaient permis des avancées majeures dans la compréhension des mécanismes physiopathologiques en neurologie-vasculaire ainsi que dans le développement de nouvelles thérapies ciblées.